KR101627020B1 - 적 백혈병 세포에서 발현되는 icama4를 인지하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ICAM4(intercellular adhesion molecule 4)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 ICAM4에 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 이를 포함하는 적 백혈병 진단용 조성물; 진단키트; 이를 이용한 적 백혈병 마커 검출방법; 이를 이용한 적 백혈병 진단을 위한 정보 제공방법; 이를 포함하는 적 백혈병 치료용 조성물; 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포에 관한 것이다. 본 발명의 단일클론항체는 적 백혈병(erythroleukemia) 세포에서 발현되는 ICAM4에 대해 고도의 특이성과 친화성을 나타냄에 따라 골수성 백혈병의 한 유형인 적 백혈병의 진단에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, ICAM4-발현 적 백혈병 세포의 항체의존성세포독성(ADCC; antibody dependent Cellular cytotoxicity) 및 항체의존성식세포작용(ADCP; antibody dependent Cellular Phagocytosis)을 야기함으로써 적 백혈병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

적 백혈병 세포에서 발현되는 ICAMA4를 인지하는 항체 및 이의 용도{Antibody that recognizes the ICAM4 on erythroleukemia and use of the antibody}

본 발명은 ICAM4(intercellular adhesion molecule 4)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 ICAM4에 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 이를 포함하는 적 백혈병 진단용 조성물; 진단키트; 이를 이용한 적 백혈병 마커 검출방법; 이를 이용한 적 백혈병 진단을 위한 정보 제공방법; 이를 포함하는 적 백혈병 치료용 조성물; 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포에 관한 것이다.

ICAM-4는 CD242라 불리며 Intercellular Adhesion Molecule(ICAM) 단백질 패밀리면서 LW 혈액형 항원(Landsteiner and Weiner blood group antigen)으로 알려져 있다([Daniels, Geoff: Human Blood Groups(2nd ed.). Malden Mass.:Blackwell science ISBN 978-0-632-05646-0, 2002.], [Klein, Harvery G.; Mollison, P.L.; Asnstee, David J.: Mollison's Blood Transfusion in Clinical Medicine(11th ed.). Oxford : Blackwell ISBN 978-0-632-06454-0, 2005]).

ICAM4는 인간 적혈구 막에 발현되어 있는 시알산 잔기가 붙은 40-42kDa의 당 단백질로서, 1940년에 Landsteiner와 Weiner에 의해서 LW 혈액형 항원으로 먼저 알려졌지만, 최근에 와서 ICAM으로서 유사성이 알려지면서 ICAM4로 다시 명명되었다. ICAM4는 Rh 혈액형과도 깊게 연관되어 있는데 Rh- 혈액형보다 Rh+ 혈액형 적혈구에서 월등하게 많이 발현되는 것으로 보고되었다(Cartron, J.-P. : Defining the Rh blood group antigens. Biochemistry and molecular genetics. Blood Rev. 8; 199-212, 1994.).

ICAM4 구조를 자세히 살펴보면, 두 개의 도메인으로 이루어져 있고, 두 개의 도메인 모두 CD11a/CD18(LFA-1), CD11b/CD18(Mac-1) 인테그린 결합부위를 가지고 있다. 최근에는 각 도메인의 아미노산 결손 돌연변이체를 이용한 ICAM-4와 다양한 인테그린 간의 상호작용에 관한 연구가 진행되고 있다.

ICAM4는 노쇠한 적혈구의 선택적 제거하는 기능이 있으며, 겸형 적혈구의 ICAM-4는 정상 적혈구와 달리 인산화되어있는 것으로 보고되었다([Ihanus, E.; Uotila, L.M.; Toivanen, A.; Varis, M.; Gahmberg, C.G. : Red-cell ICAM-4 is a ligand for the monocyte/macrophage integrin CD11c/CD18: characterization of the binding sites on ICAM-4. Blood 109; 802810, 2007]. [Anne Toivanen; Eveliina Ihanus; Minna Mattila; Hans U. Lutz; Carl G. Gahmberg : Importance of molecular studies on major blood groupsIntercellular adhesion molecule-4, a blood group antigen involved in multiple cellular interactions. Biochimica et Biophysica Acta 1780; 456466, 2008]).

한편, 적 백혈병(erythroid leukemia)은 적혈구계의 두드러진 증식(>50%)으로 하는 급성 골수성 백혈병의 한 형태로 전체 급성 골수성 백혈병의 5% 정도를 차지하는 드문 질환이다. 현재 세계보건기구(WHO)에서는 미성숙 적혈구계 및 골수구계 세포가 혼재되어 있는 경우(erythroleukemia)와 적아구(erythroblast)와 전적아구(proerythroblast)의 순수 증식을 보이는 경우(pure erythroid leukemia) 두 가지 아형(subtype)을 구분하고 있다. 대부분의 환자들은 50대 이상의 나이에서 진단을 받으며, 남자에서 약간 더 많이 발병한다고 보고되고 있다. 백혈병 세포의 염색체 이상이 많이 동반되어 있으며, 장기 생존율이 10% 미만에 이를 정도로 급성 골수성 백혈병 중에서도 예후가 나쁜 것으로 알려져 있다. 현재 적 백혈병에 표준 치료제로 사용 될 수 있는 특이적인 약물은 없고, 새로운 약물의 개발이 필요한 상태이다.

이에 본 발명자들은, ICAM4(=CD242)가 T세포 및 B세포계열의 백혈병세포에서는 발현되지 않는 반면 적 백혈병에서는 발현되는 것을 발견하였으며, 이러한 사실에 기초하여 ICAM4(=CD242) 항원결정부위를 특이적으로 인지·결합할 수 있는 단인클론항체를 제조하여, 이들 단일클론항체가 ICAM-4(=CD242)에 대해 고도의 특이성과 친화성을 나타냄과 동시에 ICAM4-발현 적 백혈병 세포의 항체의존성세포독성(ADCC; antibody dependent Cellular cytotoxicity) 및 항체의존성식세포작용(ADCP; antibody dependent Cellular Phagocytosis)을 야기함으로써 적 백혈병을 치료할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

한국공개특허 제10-1999-0022011호 한국공개특허 제10-2003-0076448호

본 발명의 목적은 ICAM4 항원결정부위를 특이적으로 인지하여 결합할 수 있는 단일클론항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는 적 백혈병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는 적 백혈병 진단키트를 제공하는 것이다

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 이용하여 적 백혈병 마커를 효과적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 이용하여 적 백혈병을 효과적으로 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는 정 백혈병 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ICAM4(intercellular adhesion molecule 4)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 1로 정의되는 중쇄 CDR H1; 서열번호 2로 정의되는 CDR H2; 및 서열번호 3으로 정의되는 중쇄 CDR H3을 포함하는 중쇄 가변부위와, 서열번호 4로 정의되는 경쇄 CDR L1; 서열번호 5로 정의되는 경쇄 CDR L2; 및 서열번호 6으로 정의되는 경쇄 CDR L3을 포함하는 경쇄 가변부위를 모두 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 단일클론항체를 포함하는 적 백혈병 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 단일클론항체를 포함하는 적 백혈병 진단키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 단일클론항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 적 백혈병 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항원-항체 복합체 형성은 RIA, ELISA, 면역형광법, 색체입자결합법 또는 화학발광물질결합법으로 검출할 수 있다.

본 발명은 또한, 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; 생물학적 시료에 상기 단일클론항체를 접촉시키는 단계; 단일클론항체에 결합된 ICAM4를 검출하는 단계; 및 검출된 ICAM4 단백질 발현 정도가 정상개체인 대조군에 비해 증가한 개체를 적 백혈병에 걸릴 위험성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 적 백혈병 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 뇨로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 ICAM4-발현 적 백혈병 세포의 항체의존성세포독성(ADCC; antibody dependent Cellular cytotoxicity) 및 항체의존성식세포작용(ADCP; antibody dependent Cellular Phagocytosis)을 야기할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포는 기탁번호 KCLRF-BP-00303일 수 있다.

본 발명의 단일클론항체는 적 백혈병 세포에서 발현되는 ICAM4에 대해 고도의 특이성과 친화성을 나타냄에 따라 골수성 백혈병의 한 유형인 적 백혈병의 진단에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, ICAM4-발현 적 백혈병 세포의 항체의존성세포독성(ADCC; antibody dependent Cellular cytotoxicity) 및 항체의존성식세포작용(ADCP; antibody dependent Cellular Phagocytosis)을 야기함으로써 적 백혈병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 적혈구용해물을 본 발명의 항-ICAM4 단클론항체 1E1로 면역블로팅(immunoblotting)한 결과이다.
도 2는 적백혈병세포주 K562의 세포용해물을 본 발명의 항-ICAM4 단클론항체 1E1로 면역침전(Immunoprecipitation)한 결과이다.
도 3은 적백혈병 세포주 K562 세포 용해물을 본 발명의 항-ICAM4 단클론항체 1E1로 면역침전(Immunoprecipitation)하여 LC질량분석 한 결과이다.
도 4는 적백혈병 세포주 K562 세포 용해물과 상업용 항-ICAM4 다클론항체로 면역침전시킨 후 본 발명의 항-ICAM4 단클론항체 1E1로 면역블로팅한 결과이다.
도 5는 여러 세포주에서 항-ICAM4 단클론항체 1E1의 반응성을 프로파일링 한 표이다.
도 6은 적백혈병 세포주 K562에 대한 항-ICAM4 단클론항체 1E1의 반응성을 측정한 유세포 측정 그래프이다(검은색 선은 음성대조군이며, 붉은색 선 은 1E1 단클론 항체를 나타낸다).
도 7은 항-ICAM4 단클론항체 1E1의 내재화(interalization) 특성을 보여주는 그래프이다.
도 8은 항-ICAM4 단클론항체 1E1의 항체의존성세포독성(ADCC) 효과를 보여주는 그래프이다.
도 9는 항-ICAM4 단클론항체 1E1의 항체의존성식세포작용(ADCP) 효과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 항-ICAM4 단클론항체 1E1의 가변부(variable region) 서열을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 1E1 카이메릭항체를 만든 후 인히비션어세이를 통하여 항-ICAM4 단클론항체 1E1의 가변부(variable region) 서열을 확인한 결과이다.

본 발명은 ICAM4(intercellular adhesion molecule 4)를 선택적으로 인식하며 이의 항원결정부위에 특이적으로 결합할 수 있는 항-ICAM4 항체 또는 이의 단편을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 다클론항체 및 단일클론항체를 모두 포함하는 개념이다. 또한, 상기 용어는 키메라 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "키메라" 항체는 재조합 디옥시리보핵산 기법을 사용하여 유도된 것이 가장 바람직한 항체를 의미하며, 인간(면역학적으로 "유관" 종, 예컨대, 침팬지를 포함) 및 비-인간 성분 둘 모두를 포함한다. 따라서 키메라 항체의 불변 영역은 가장 바람직하게는 실질적으로 천연 인간 항체의 불변 영역과 일치하며; 키메라 항체의 가변 영역은 가장 바람직하게는 비-인간 공급원으로부터 유도되며, 대상 항원(ICAM4)에 대한 소망하는 항원 특이성을 보유한다. 비-인간 공급원은 ICAM4 항원에 대한 항체를 생성하기위하여 사용할 수 있는 모든 척추동물 공급원이 될 수 있다. 이러한 비-인간 공급원은 설치류(예컨대, 토끼, 레트, 마우스, 등; 예를 들면, 미국 등록 특허 번호 4,816,567, 본원에서 참고자료로서 포함됨) 및 비-인간 영장류 (예컨대, 구세계 원숭이, 유인원, 등; 예를 들면, 미국 등록 특허 번호 5,750,105 및 5,756,096; 본원에서 참고자료로서 포함됨)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 “항체 단편”은 표적 항원, 이 경우 ICAM4 또는 이의 특이적인 부분에 결합할 수 있는 항체의 특정 부분을 말한다. 예를 들어, 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab' 및 Fv 단편을 포함한다. 이들은 통상적으로 재조합 DNA 기술로 제조하거나 파파인 또는 펩신으로 항체 단백질을 분해시키는 전통적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, John Wiley and Sons Coliganet al., eds. (1991-1992)).

본 발명에서 사용되는 용어 “단일클론항체”란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.

전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역 (상기 부위는 "도메인"으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, "상보성 결정 영역" (complementarity determining region, 이하, "CDR"이라 함)이라고 불리는 3개의 가변 영역 및 4개의 "구조 영역" (framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

본 발명에서 사용되는 용어 “가변”이란 항체들 간에 특정 영역의 서열이 크게 상이하고 특정 항원에 대해 각각의 특정 항체의 결합 특이성을 나타내는데 사용된다는 것을 일컫기 위해 사용된다. 항체의 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포하는 것이 아니라 CDR에 집중된다. 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 가지며 이들 영역이 ICAM4를 인식함으로써 항원-항체 복합체를 형성한다. 이러한 CDR은 각각의 단일클론항체마다 특징적인 서열을 가지며 하나의 단일클론항체가 특정 에피토프를 인식하기 위해 이들 6개의 CDR의 일부 또는 모두가 상호작용할 수 있다.

본 발명의 항-ICAM4 항체는 ICAM4의 항원결정부위에 특이적으로 결합하는 단일클론항체로서, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 포함할 수 있다.

보다 구체적으로는 단일클론항체의 중쇄 가변부위가 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR 영역 내에서 이러한 서열과의 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게 95% 이상인 서열을 포함하거나; 또는/ 및 그들의 경쇄 가변부위가 서열번호 4 내지 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR 영역 내에서 이러한 서열과의 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 단일클론항체는 서열번호 1로 정의되는 중쇄 CDR H1; 서열번호 2로 정의되는 CDR H2; 및 서열번호 3으로 정의되는 중쇄 CDR H3을 포함하는 중쇄 가변부위와, 서열번호 4로 정의되는 경쇄 CDR L1; 서열번호 5로 정의되는 경쇄 CDR L2; 및 서열번호 6으로 정의되는 경쇄 CDR L3을 포함하는 경쇄 가변부위를 모두 포함할 수 있다.

본 발명자들은 ICAM4(=CD242)가 T세포 및 B세포계열의 백혈병세포에서는 발현되지 않는 반면 적 백혈병에서는 발현되는 것을 발견하였는바, 하기 실험에서는 본 발명에 따른 항-ICAM4 단일클론항체가 실제로 세포에서 발현하는 ICAM4에 특이적으로 결합할 수 있는지를 살펴보기 위하여 적백혈병 세포주 K562를 이용 면역블로팅, 면역침전 및 LC 질량 분석법으로 분석하였으며, 그 결과 본 발명에 따른 단일클론항체가 ICAM4를 인지하는 항체임을 증명할 수 있었다(도 1 내지 도 4 참조).

ICAM4에 대해 특이적인 단일클론항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조). 예를 들어, 본 발명의 단일클론항체는 ICAM4를 면역원으로 하여 동물을 면역화시키고, 면역화된 동물의 비장세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생성하고, ICAM4를 선택적으로 인식하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하며, 선별한 하이브리도마를 배양하고, 하이브리도마의 배양액으로부터 항체를 분리함으로써 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 세포주는 생체 외(in vitro)에서 배양하거나, 생체 내 주입하여 항체를 분리할 수 있다.

상기한 하이브리도마가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리될 수 있다.

하이브리도마를 이용한 단일클론항체의 생산의 일례로, 마우스의 복강 내에 하이브리도마를 삽입하고 복수로부터 분리, 정제한다. 단일클론항체의 분리 및 정제는 배양 상층액 또는 복수를 이온교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항 면역글로불린 칼럼 또는 프로테인 A 컬럼 등의 친화성 크로마토그래피를 이용하여 실시할 수가 있다.

본 발명에 따른 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 ‘1E1-2B2’로 명명하였으며, 한국세포주연구재단에 2013.10.11일자로 기탁하여 2012.10.25일자 기탁번호 KCLRF-BP-00303을 부여받았다.

본 발명은 또한, 상기 단일클론항체를 포함하는 ICAM4의 발현 여부나 발현 정도와 관련된 질환 또는 ICAM4 매개되는 질환에 대한 진단용 조성물, 바람직하게는 적 백혈병 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기한 단일클론항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써, 적 백혈병 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 단일클론항체를 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 ICAM4 단백질을 검출할 수 있다.

본 발명은 또한, 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; 상기 생물학적 시료에 본 발명의 단일클론항체를 접촉시키는 단계; 단일클론항체에 결합된 ICAM4를 검출하는 단계; 및 상기 검출된 ICAM4 단백질 발현 정도가 정상개체인 대조군에 비해 증가한 개체를 적 백혈병에 걸릴 위험성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 적 백혈병 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “생물학적 시료”란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 뇨, 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 ICAM4 단백질의 존재, 적 백혈병의 유무를 확인할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “항원-항체 복합체”란 시료 중의 ICAM4 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.

본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위하여 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 국한되지는 않는다.

검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³+, Eu³+킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함할 수 있으나, 이를 특별히 한정하는 것은 아니다.

바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 상기 단일클론 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 단일클론항체를 포함하는 적 백혈병 진단키트를 제공한다.

본 발명의 적 백혈병 진단키트에 사용되는 단일클론항체는, 이 항체가 ICAM4를 선별적으로 인지할 수 있는 한, 단일클론항체의 단편도 사용할 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 적 백혈병 진단키트에는 ICAM4를 선별적으로 인지하는 단일클론항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다.

면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 검출 방법 및 진단키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다.

본 발명은 또한, 상기 단일클론항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 ICAM4의 발현 여부나 발현 정도와 관련된 질환 또는 ICAM4 매개되는 질환 치료용 조성물을 제공한다. 상기 질환은 바람직하게는 적 백혈병이다.

본 발명의 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 치료용 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 조성물이 제형화되는 경우 항-ICAM4 단일클론항체가 주어진 시점에서 소망하는 생물학적 활성을 보유하도록 고려된다. 그 시간에서의 소망하는 생물학적 활성은 그 시간 내에 나타나는 소망하는 생물학적 활성의 약 30% 이내, 바람직하게는 약 20% 이내인 경우, 약학적 조성물은 소망하는 생물학적 활성에 대한 적합한 분석에서 측정된바 대로 제조된다. 항-ICAM4 단일클론항체의 소망하는 생물학적 활성을 측정하는 측정법은 본원의 실시예에서 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 문헌 Schultze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. ScL USA 92:8200-8204; Denton et al.(1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans et al. (200O) J Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79:439-444; 및 미국 등록 특허 번호 5,674,492 및 5,847,082에 설명된 측정법을 참조하며; 본원에서 참고자료로서 포함된다.

본 발명의 항-ICAM4 단일클론항체는 액체 약학적 제형으로 제형화될 수 있다. 항-ICAM4 단일클론항체는 공지의 모든 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 본 명세서에 개시된 방법을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서, 항-ICAM4 단일클론항체는 하이브리도마 세포 세포주 KCLRF-BP-00303 내에서 재조합적으로 생산되었다.

항-ICAM4 단일클론항체가 이들의 제형화 이전에 저장되는 경우, 이는 동결될 수 있으며, 예를 들면, ≤ -20도℃, 그 다음 추가의 제형화를 위하여 실온에서 해동된다. 액체 약학적 제형은 상기 단일클론항체의 치료적 유효량을 포함할 수 있다. 제형 내에 존재하는 이들의 항체의 양은 투여 경로 및 소망하는 투여 부피를 고려한다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. '약제학적으로 유효한 양'이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료 기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

이 방식에 있어서, 액체 약학적 조성물은 항-ICAM4 단일클론항체를 약 0.1 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 40.0 mg/ml, 약 1.0 mg/ml 내지 약 30.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml 내지 약 25.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml 내지 약 20.0 mg/ml, 또는 약 15.0 mg/ml 내지 약 25.0 mg/ml의 농도로 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 액체 약학적 조성물은 약 0.1 mg/ml 내지 약 5.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml 내지 약 10.0 mg/ml, 약 10.0 mg/ml 내지 약 15.0 mg/ml, 약 15.0 mg/ml 내지 약 20.0 mg/ml, 약 20.0 mg/ml 내지 약 25.0 mg/ml, 약 25.0 mg/ml 내지 약 30.0 mg/ml, 약 30.0 mg/ml 내지 약 35.0 mg/ml, 약 35.0 mg/ml 내지 약 40.0 mg/ml, 약 40.0 mg/ml 내지 약 45.0 mg/ml, 또는 약 45.0 mg/ml 내지 약 50.0 mg/ml의 농도로 항-ICAM4 단일클론항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 액체 약학적 조성물은 약 15.0 mg/ml, 약 16.0 mg/ml, 약 17.0 mg/ml, 약 18.0 mg/ml, 약 19.0mg/ml, 약 20.0 mg/ml, 약 21.0 mg/ml, 약 22.0 mg/ml, 약 23.0 mg/ml, 약 24.0 mg/ml, 또는 약 25.0 mg/ml의 농도로 항-ICAM4 단일클론항체를 포함할 수 있다. 액체 약학적 조성물은 항-ICAM4 단일클론항체 및 약 pH 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0를 포함하며, 다른 이러한 값은 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0의 범위 내에 있는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0의 범위로 제형의 pH를 유지하도록 하는 완충액을 포함할 수 있다. 완충액은 제형의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.5, 약 pH5.0 내지 약 pH 6.0, 약 pH 5.0 내지 약 pH 5.5, 약 pH 5.5 내지 약 7.0, 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.5, 또는 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.0로 유지시킬 수 있다.

전술한 바와 같이 항체의 물리화학적 안정성 및 소망하는 생물학적 활성을 보유하는 한도에서 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0 범위의 액체 항-ICAM4 단일클론항체 제형의 pH를 유지시키는 모든 적합한 완충액은 제형화에 사용될 수 있다.

적합한 완충액은 종래의 산 및 이들의 염을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 여기서, 짝이온은, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 마그네슘이 될 수 있다. 약학적 액체 제형의 완충제로 사용될 수 있는 종래의 산 및 이들의 염의 예는, 숙신산 또는 숙신산염, 시트르산 또는 시트르산염, 아세트산 또는 아세트산염, 타르타르산 또는 타르타르산염, 인산 또는 인산염, 글루콘산 또는 글루콘산염, 글루탐산 또는 글루타메이트, 아스파르트산 또는 아스파르트산염, 말레산 또는 말레산염, 및 말산 또는 말산염 완충액을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 제형 내의 완충액 농도는 약 1 mM 내지 약 50 mM가 될 수 있고, 약 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 50 mM의 범위 내의 다른 값을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 제형 내의 완충액 농도는 약 5 mM 내지 약 15 mM이고, 약 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 15 mM의 범위 내의 다른 값을 포함할 수 있다.

근접 등장성인 액체 약학적 제형이 바람직한 경우, 항-ICAM4 단일클론항체 및 완충액을 포함하는 액체 약학적 제형은 제형에 근접 등장성을 부여하기에 충분한 등장제의 양을 추가로 포함할 수 있다. "근접 등장성"은 수성 제형이 약 240 mmol/kg 내지 약 360 mmol/kg, 바람직하게는 약 240 내지 약 340 mmol/kg, 더 바람직하게는 약 250 내지 약 330 mmol/kg, 더 더욱 바람직하게는 약 260 내지 약 320 mmol/kg, 그보다 더 바람직하게는 약 270 내지 약 310 mmol/kg의 삼투질농도(osmolarity)를 지니는 것을 의미한다. 용액의 등장성을 결정하는 방법은 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 Setnikar et al. (1959) J Am. Pharm. Assoc. 48:628를 참조할 수 있다.

당해 기술 분야의 숙련자는 약학적 조성물 내에 등장성의 제공에 유용한 다양한 약학적으로 허용 가능한 용질을 잘 알고 있다. 등장제는 체액과 동등한 수준으로 본 발명의 액체 약학적 제형의 삼투압을 조절할 수 있는 모든 시약이 될 수 있다. 생리학적으로 허용가능한 등장제를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서 치료적 유효량의 항-ICAM4 단일클론항체 및 완충액을 포함하는 액체 약학적 제형은 등장성을 제공하기 위하여 사용될 수 있는 성분, 예를 들면, 염화 나트륨; 아미노산 예컨대, 알라닌, 발린, 및 글리신; 글루코스, 덱스트로스, 푸룩토오스, 슈크로오스, 말토오스, 만니톨, 트레할로스, 글리세롤, 소르비톨, 및 자일리톨을 포함하나 이에 한정되지 않는 당 및 당 알콜(폴리올); 아세트산, 다른 유기산 또는 이들의 염, 및 상대적으로 소량의 시트르산염 또는 인산염을 추가로 포함할 수 있다. 당해 기술 분야의 숙련자는 액체 제형의 강직성을 제공하기에 적합한 추가적 약제를 인식하고 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 항-ICAM4 단일클론항체 및 완충액을 포함하는 액체 약학적 제형은 등장제로서 염화나트륨을 추가로 포함할 수 있다. 제형 내의 염화나트륨 농도는 강직성에 대한 다른 성분의 기여도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 염화나트륨의 농도는 약 50 niM 내지 약 300 mM, 약 50 mM 내지 약 250 mM, 약 50 mM 내지 약 200 mM, 약 50 mM 내지 약 175 mM, 약 50 mM 내지 약 150 mM, 약 75 mM 내지 약 175 mM, 약 75 mM 내지 약 150 mM, 약 100 mM 내지 약 175 mM, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 약 100 mM 내지 약 150 mM, 약 125 mM 내지 약 175 mM, 약 125 mM 내지 약 150 mM, 약 130 mM 내지 약 170 mM, 약 130 mM 내지 약 160 mM, 약 135 mM 내지 약 155 mM, 약 140 mM 내지 약 155 mM, 또는 약 145 mM 내지 약 155 mM이다.

본 발명의 액체 약학적 제형의 처리과정에서 냉동 해동 또는 기계적 전단에 기한 단백질 분해는 용액-공기 접면에서의 표면 장력을 낮추기 위하여 계면활성제를 제형에 편입시킴으로써 억제될 수 있다. 따라서 본 발명의 일 구체예에서, 액체 약학적 제형은 치료적 유효량의 항-ICAM4 단일클론항체, 완충액을 포함하며, 계면활성제를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 다른 실시 상태에서, 액체 약학적 제형은 항-ICAM4 단일클론항체, 완충액, 등장제를 포함하며, 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.

사용되는 전형적인 계면활성제는 비이온성 계면활성제이며, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 예컨대, 폴리소르베이트 80 (Tween 80) 및 폴리소르베이트 20 (Tween 20); 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 에스테르 예컨대, 플루로닉 F68; 폴리옥시에틸렌 알콜 예컨대, 브리지(Brij) 35; 시메티콘; 폴리에틸렌 글리콜 예컨대, PEG400; 라이소포스파티딜콜린; 및 폴리옥시에틸렌-p-t-옥틸페놀 예컨대, 트리톤 X-100을 포함한다. 계면활성제 또는 에멀젼화제에 의한 전통적인 약제의 안정화는, 예를 들면, 문헌 Levine et al. (1991) J Parenteral Sci. Technol. 45(3):160-165에서 설명하였으며, 본원에서 참고자료로서 포함되어 있다.

계면활성제가 포함되는 경우, 일반적으로 약 0.001 % 내지 약 1.0% (w/v), 약 0.001% 내지 약 0.5%, 약 0.001% 내지 약 0.4%, 약 0.001% 내지 약 0.3%, 약 0.001% 내지 약 0.2%, 약 0.005% 내지 약 0.5%, 약 0.005% 내지 약 0.2%, 약 0.01% 내지 약 0.5%, 약 0.01% 내지 약 0.2%, 약 0.03% 내지 약 0.5%, 약 0.03% 내지 약 0.3%, 약 0.05% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.05% 내지 약 0.2%의 양으로 포함될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 경우, ICAM4 단백질과 강한 친화성을 가진 본 발명의 단일클론항체가 적 백혈병 세포에서 발현되는 ICAM4 단백질에 특이적으로 결합하여 항체의존성세포독성(ADCC) 및 항체의존성식세포작용(ADCP)을 야기함으로써 적 백혈병 세포를 보다 효율적으로 파괴할 수 있다. 한편, 상기 단일클론항체는 적 백혈병 치료 효과를 증진시키기 위하여 독성 물질들과 결합되어 융합단백(fusion protein)을 형성할 수 있다. 독소 단백질로는 리신(ricin), 사포린(saporin), 젤로닌(gelonin), 모로딘(momordin), 디프테리아독소, 또는 녹농균독소(pseudomonas toxin)일 수 있으나, 특별히 그 종류를 제한하는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 적 백혈병의 치료용 의약의 제조를 위한 항-ICAM4 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 적 백혈병의 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 조성물(항-ICAM4 단일클론항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 적 백혈병 치료용 조성물)을 개체에서 투여하는 단계를 포함하는 적 백혈병 치료 방법에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "개체"란 포유동물로서 인간, 말, 개, 고양이, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 원숭이, 기니피그(guinea pigs), 래트, 마우스, 도마뱀, 뱀, 양, 소, 물고기 및 새를 포함하여 임의의 동물(예컨대, 인간)을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 항-ICAM4 단일클론항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물의 투여로 적 백혈병 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 항-ICAM4 단일클론항체는 다양한 목적을 위해 다른 항체, 생물학적 활성을 가지는 제제 또는 물질과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-ICAM4 단일클론항체는 공지의 적 백혈병 억제/치료 약물과도 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

1 E1 단클론 항체 제작을 위한 타겟 부위 설계

본 발명자들은 적백혈병을 용이하고 정확하게 진단할 수 있는 새로운 항체를 제조하기 위해, 인간 적혈구의 신규 표면 단백질을 스크리닝하였다. 그 결과, 적백혈병이 유발된 세포의 표면에 ICAM4가 과다 발현되고 있음을 발견함에 따라 ICAM4에 대한 항체를 제조하기 위해 ICAM4의 유전자 및 단백질 서열을 NCBI BLAST에서 확인하였고, ICAM4의 서열을 기초로 구조적 분석을 통해 ICAM-4에 특이적이면서도 친화성이 높은 부위에 결합할 수 있는 단일클론항체를 하기 실시예와 같은 실험을 통해 제조하였으며, 본 발명에서는 '1E1'로 명명하였다.

< 실시예 2>

하이브리도마 세포 제조 및 이를 통한 1 E1 단클론 항체 생산

<2-1> 하이브리도마 세포 제조

건강한 성인에게서 얻은 혈액을 Ficoll-Hypaque(Pamacia, Sweden : d=1.077)를 이용하여 적혈구세포층을 분리 후 세 번 세척한 후 Balb/c 마우스에 10⁷개의 세포를 2 주 간격으로 3 차례 복강 내에 주사하여 이제 대한 면역반응을 유도하였고 마지막 추가 주사 후 3 일째 비장을 적출하여 세포 부유액을 만들었다. 마우스 비장을 적출하여 지라세포(splenocyte)를 얻었고, polyethyene glycol을 사용해서 DMEM 배양액에 마우스 비장세포 10⁸개와 마우스 골수종 세포주 SP2/O-Ag14 (ATCC, Virginia, USA) 2×10⁷개를 융합시켰다. 8개의 96 웰 플레이트에 융합된 세포가 한 개씩 들어가도록 분주해 넣고 37℃ 5% CO2, HAT 배지(hypoxanthine, aminopterin and thymidine containing media) 조건에서 배양하였다. 집락 형성이 관찰되면 인간 RBC를 샘플로 유세포분석을 통해 반응성을 확인하였다. 인간 RBC와 반응성을 보인 클론 중에서 1번 플레이트의 ㅌ행 1열의 클론을 ‘1E1 클론’이라 명명하고 2 3회 limiting dilution을 진행하여 단클론 하이브리도마로 확립하였다. 한편, 상기 하이브리도마 세포는 한국세포주연구재단에 2013.10.11일자로 기탁하여 2012.10.25일자 기탁번호 KCLRF-BP-00303을 부여받았다.

<2-2> 하이브리도마 세포를 이용한 본 발명의 1 E1 단클론 항체 생산

하이브리도마 배양액은 cell-bag (Xcellerex, Malborough, MA, USA)에서 2주간 배양하여 획득하고, 0.22 um filter로 여과하였다. 준비된 시료는 Histrap Protein G 5 mL column (GE healthcare, Little Chalfont, UK)에 주입하고, 20 mM sodium phosphate (pH 7.2)용액을 10 column volume (50 mL)흘려주어 불순물을 제거한 뒤 20 mM sodium citric (pH 3.0) 5 column volume 으로 용출하여 정제하였다. 정제된 항체는 phosphate buffered saline (pH 7.4)으로 투석한 다음 하기 실험의 시료로 사용하였다.

< 실시예 3>

단클론 항체에 대한 항원 분석

<3-1> 면역블로팅( Immunoblotting )

3-1-1. 적혈구 용해물 제조

사람의 혈액을 채취하여 피콜(ficoll)용액을 첨가 한 후 (혈액:ficoll = 1:2) 2000rpm에 20분간 원심분리하여 얻은 적혈구에 1% NP-40을 넣어 4℃에서 2시간동안 로터(rotor)를 사용해 회전시킨 후 상층액만 원심분리해서 얻었다.

3-1-2. 웨스턴블로팅 수행

마이크로 테스트 튜브(micro test tube) 2개에 상기 적혈구 용해물 40μL씩 넣고 각각 Reducing buffer(5×) 10μL와 Non-Reducing buffer(5×) 10μL를 넣고 10분간 끓였다. 두 샘플을 10% 폴리아크릴아마이드 젤에 protein marker(엘피스바이오텍, Mid-range Pre-stained Marker)와 함께 로딩하고 10mA에서 3시간 전기영동하였다. 정기영동이 끝나면 폴리아크릴아마이드 젤을 니크로셀룰로오스 멤브레인(WHATMAN) 위에 얹고 17V에서 40분간 트랜스포한다. 트랜스포된 멤브레인을 5% 스킴밀크로 1시간동안 블로킹 한 후 1E1 단클론 항체를 1μg/mL 농도로 1시간 반응시켰다. 0.05% PBST로 세척한 후에 HRP가 결합된 이차 항체(항-쥐 면역 글로불린(Dako))를 1μg/mL 농도로 30분간 반응시켰다. 0.05% PBST로 세척한 후에 ECL kit(Amersham GE Healthcare)를 사용하여 가시화하였다.

그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 약 40kDa의 밴드를 확인할 수 있었다.

<3-2> 면역침전( Immunoprecipitation )

3-2-1 적백혈병 세포주 K562의 바이오틴 결합 세포용해물 제조

적백혈병 세포주 K562 세포를 준비하였다(1×10⁸). 세포들을 PBS로 2번 세척한 후, 바이오틴 용액(20mM NaHCO₃ 100μL,150mM NaCl, biotin 100μg) 1mL을 넣고 4℃에서 30분 동안 로터(rotor)를 사용해 회전시킨 후에 10μL FBS 첨가 후 다시 4℃에서 10분 동안 회전시켰다. 이후 PBS로 2번 세척하고, 1% NP-40을 넣어 4℃에서 하룻밤 동안 로터(rotor)를 사용해 회전시킨 후 상층액만을 원심분리해서 얻었다.

3-2-2 면역침전 수행

단백질 G 비드(Protein G bead)를 PBS로 2번 세척해서 준비하였다. 1E1 단클론 항체 5μg과 비드 20μL를 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 로터(rotor)를 사용해 회전시킨 후에 준비된 바이오틴 결합 K562 세포 용해물 500μL넣고, 4℃에서 하룻밤 동안 로터(rotor)를 사용해 회전시켰다. 항체-항원이 결합된 비드를 NaCl 버퍼 1,2,3(NaCl buffer 1; 1%NP40, 1M NaCl, NaCl buffer 2; 0.1%NP40, 0.5M NaCl, NaCl buffer 3; 0.1%NP40, PBS) 번호 순서대로 세척하였다.

3-2-3 웨스턴블로팅 수행

마이크로 테스트 튜브(micro test tube)에 상기 항체-항원이 결합된 비드에 PBS 40μL와 Reducing buffer(5×) 10μL를 넣고 10분간 끓였다. 만들어진 샘플을 10% 폴리아크릴아마이드 젤에 protein marker(엘피스바이오텍, Mid-range Pre-stained Marker)와 함께 로딩하고 10mA에서 3시간 전기영동하였다. 정기영동이 끝나면 폴리아크릴아마이드 젤을 니크로셀룰로오스 멤브레인(WHATMAN) 위에 얹고 17V에서 40분간 트랜스포하였다. 트랜스포된 멤브레인을 5% 스킴밀크로 1시간동안 블로킹 한 후 HRP가 결합된 이차 항체(streptavidin-HRP)를 1μg/mL 농도로 30분간 반응시켰다. 0.05% PBST로 세척한 후에 ECL kit(Amersham GE Healthcare)를 사용하여 가시화하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 약 40kDa의 밴드를 확인할 수 있었다.

<3-3> LC 질량 분석

3-3-1 적백혈병 세포주 K562의 세포용해물 제조

적백혈병 세포주 K562 세포를 준비하였다(1×10⁸). 세포들을 PBS로 2번 세척한 후 1% NP-40을 넣어 4℃에서 2시간 동안 로터(rotor)를 사용해 회전시킨 후 상층액만 원심분리해서 얻는다.

3-3-2 면역침전 수행

단백질 G 비드(Protein G bead)를 PBS로 2번 세척해서 준비하였다. 1E1 단클론 항체 5μg과 비드 20μL를 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 로터(rotor)를 사용해 회전시킨 후에 준비된 K562 세포 용해물 500μL넣고, 4℃에서 하룻밤 동안 로터(rotor)를 사용해 회전시켰다. 항체-항원이 결합된 비드를 NaCl 버퍼 1,2,3(NaCl buffer 1; 1%NP40, 1M NaCl, NaCl buffer 2; 0.1%NP40, 0.5M NaCl, NaCl buffer 3; 0.1%NP40, PBS) 번호 순서대로 세척하였다.

3-3-3 Silver staining 수행

마이크로 테스트 튜브(micro test tube)에 상기 항체-항원이 결합된 비드에 PBS 40μL와 Reducing buffer(5×) 10μL를 넣고 10분간 끓였다. 만들어진 샘플을 10% 폴리아크릴아마이드 젤에 protein marker(엘피스바이오텍, Mid-range Pre-stained Marker)와 함께 로딩하고 10mA에서 3시간 전기영동하였다. 정기영동이 끝난 후 폴리아크릴아마이드 젤을 EZ-Silver Staining kit(바이오세상)를 사용해서 염색하였다. 염색된 젤(gel)에서 1E1 단클론 항체에 대한 밴드로 보이는 약 40kDa위치의 밴드를 슬라이스해서 LC질량분석회사(프로테옴텍)에 의뢰하였다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 약 40kDa의 밴드가 CD242임을 확인할 수 있었다.

<3-4> ICAM4 에 대한 항체 분석

3-4-1 상업용 항체 준비

상업용 항-CD242 다클론 항체를 구매하였다(Abnova H00003386-B01P).

3-4-2 면역침전 수행

단백질 G 비드(Protein G bead)를 PBS로 2번 세척하여 준비하였다. 상업용 항-CD242 다클론 항체 5μg과 비드 20μL를 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 로터(rotor)를 사용해 회전시킨 후에 준비된 K562 세포 용해물 500μL넣고, 4℃에서 하룻밤 동안 로터(rotor)를 사용해 회전시킨다. 항체-항원이 결합된 비드를 NaCl 버퍼 1,2,3(NaCl buffer 1; 1%NP40, 1M NaCl, NaCl buffer 2; 0.1%NP40, 0.5M NaCl, NaCl buffer 3; 0.1%NP40, PBS) 번호 순서대로 세척하였다.

3-4-3 웨스턴블로팅 수행

마이크로 테스트 튜브(micro test tube)에 상기 항체-항원이 결합된 비드에 PBS 40μL와 Reducing buffer(5×) 10μL 넣고 10분간 끓였다. 만들어진 샘플을 10% 폴리아크릴아마이드 젤에 protein marker(엘피스바이오텍, Mid-range Pre-stained Marker)와 함께 로딩하고 10mA에서 3시간 전기영동하였다. 정기영동이 끝나면 폴리아크릴아마이드 젤을 니트로셀룰로어스 멤브레인(WHATMAN) 위에 얹고 17V에서 40분간 트랜스포하였다. 트랜스포된 멤브레인을 5% 스킴밀크로 1시간동안 블로킹 한 후 1E1 단클론 항체를 1μg/mL 농도로 1시간 반응시켰다. 0.05% PBST로 세천한 후에 HRP가 결합된 이차 항체(항-쥐 면역 글로불린(Dako))를 1μg/mL 농도로 30분간 반응시켰다. 0.05% PBST로 세척한 후에 ECL kit(Amersham GE Healthcare)를 사용하여 가시화하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 40kDa의 밴드를 확인할 수 있었다.

상기와 같은 실험결과를 통해 본 발명의 항체가 ICAM4(=CD242)를 인지하는 항체임을 증명하였다.

< 실시예 4>

여러 종양 세포주에서 단클론 항체의 반응성

<4-1> 여러 종양 세포주에서 1 E1 단클론 항체의 반응성 조사

본 실험에서는 1E1 단클론 항체의 여러 종양 세포주에 대한 반응성을 유세포측정법으로 조사하였다.

여러 세포주를 2×10⁵로 준비하였다. 1E1 단클론 항체 1μg을 30분간 4℃에서 반응시킨 후, 차가운 PBS로 세척하고, FITC가 결합된 이차항체(항-쥐 면역 글로불린(다이노나))을 20분간 4℃에서 반응시켰다. 차가운 PBS로 세척하고 FACScalibur를 이용하여 유세포측정을 시행하였다. 염색강도는 형광강도에 대한 log로 측정하고 10승 단위로 표시하였다. 대조군은 1E1 단클론 항체를 제외한 이차 항체만 염색 후 사용하였다. 이 방법으로 측정하여 양성률이 10% 이상인 표본을 양성으로 판정하였다.

그 결과 도 5 및 6에서 나타낸 바와 같이, 적혈구 세포에서 두드러진 양성반응이 확인되었다. 참고로 도 5는 여러 종양 세포주에서의 1E1 단클론 항체의 반응성을 표로 정리한 것이고, 도 6은 도 5에서 결과의 대표적인 예로 적밸혈병 세포주 K562를 나타낸 것이다. 검은색 선은 음성대조군이며, 붉은색 선 은 1E1 단클론 항체로 염색한 그래프이다.

< 실시예 5>

단클론 항체의 특성

<5-1> 내재화( internalization )

1E1 단클론 항체의 내재화 특성을 유세포측정법으로 조사하였다.

자세하게는, 적백혈병 세포주 K562를 마이크로 테스트 튜브(micro test tube) 5개에 2×10⁵개씩 준비하였다. 1E1 단클론 항체 1μg을 시간대별로(0분, 30분, 60분, 90분) 37℃에서 배양하고 1% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시켰다. 차가운 PBS로 세척하고, PE가 결합된 이차항체(항-쥐 면역 글로불린(다이노나))를 20분간 4℃에서 반응시켰다. 차가운 PBS로 세척하고 FACScalibur를 이용하여 유세포측정을 시행하였다. 염색강도는 형광강도에 대한 log로 측정하고 10승 단위로 표시하였다. 이 방법으로 측정하여 양성률을 시간대 별로 그래프로 나타내었다.

그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 1E1 단클론 항체가 적백혈병 세포주에 내재화되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6>

단클론 항체의 적백혈병 치료효과

<6-1> 항체의존성세포독성검사( ADCC )

6-1-1 효과기세포(effector cell) 준비

사람의 혈액을 채취하여 피콜(ficoll)용액을 첨가 한 후 (혈액:ficoll = 1:2) 2000rpm에 20분간 원심분리해서 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 얻었다. 얻은 PBMC를 5% FBS 첨가 RPMI 배지에서 37℃로 보관하였다.

6-1-2 항체의존성세포독성검사

마이크로 테스트 튜브(micro test tube) 4개에 표적세포인 적백혈병 세포주 K562를 5×10⁴씩 준비하였다. 1E1 단클론항체를 각 튜브에 0μg/mL, 0.5μg/mL , 5μg/mL, 50μg/mL이 되도록 첨가하고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 1E1 단클론 항체가 결합된 표적세포(K562)를 96 웰 플레이트에 각 웰(well)당 1×10⁴가 들어가게 분주하고 준비된 효과기세포를 well당 5×10⁵(표적세포의 50배)가 되도록 넣어주고 3시간 이상 37℃에서 배양하였다. 양성대조군으로 용해 버퍼(lysis buffer)를 넣고 추가로 45분간 37℃에서 배양한 후에 2500rpm에서 4분간 원심분리해서 상층액만 수득하였다. 표적세포로부터 용해되어 나온 LDH(lactate dehydrogenase)를 측정해서 세포 용해 정도를 계산하였다(Promega assay kit).

그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 1E1 단클론 항체가 항체의존성세포독성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

<6-2> 항체의존성식세포작용검사( ADCP )

6-2-1 효과기세포(effector cell) 준비

쥐의 복강에 멸균된 PBS 10mL을 넣고 다시 주사기로 뽑아내는 방식으로 쥐의 복강 내에 있는 세포들을 채취하였다. PBS로 2번 세척한 후 10% FBS 첨가 RPMI 배지에서 37℃ 하룻밤 동안 배양하였다. 다음 날 위에 떠있는 세포들은 제거하고 플레이트 바닥에 분화되어 붙어있는 쥐의 대식세포만 걷어서 준비하였다.

6-2-2 항체의존성식세포작용검사

마이크로 테스트 튜브(micro test tube) 3개에 표적세포인 적백혈병 세포주 K562를 1×10⁵씩 준비하였다. 각 튜브에 CFSE를 넣고 37℃에서 15분간 배양하였다. PBS로 세척한 다음, 추가로 37℃에서 15분간 배양하였다. 1E1 단클론 항체와 양성 대조군(대식작용이 일어난다고 알려진 항체) B6H12를 5μg 첨가하고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 반응시킨 항체결합 표적세포를 24 웰 플레이트에 옮기고 효과기세포 쥐 대식세포를 2×10⁵(표적세포의 2배)를 넣어 준 후 2시간 이상 37℃에서 배양하였다. 배양 후 차가운 PBS로 세척하고, PE가 결합된 항 CD11b 항체를 20분간 4℃에서 반응시켰다. 이후 차가운 PBS로 세척하고 FACScalibur를 이용하여 유세포측정을 시행하였다.

그 결과 도 9에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 1E1 단클론 항체가 항체의존성식세포작용을 나타냄을 확인할 수 있었다.

< 실시예 7>

키메릭 항체의 제조

<7-1> 항체 클로닝

1E1 단클론 항체를 생산하는 하이브리드 세포로부터 RNA를 추출하였다(QIAGEN, RNeasy Plus Mini Kit). Mouse Ig-Primer Set(Novagen)을 사용하여 1E1 단클론 항체의 가변영역(variable region, Fv) DNA를 얻을 수 있었으며, 이를 도 10에 나타내었다. 1E1 단클론 항체 가변영역 DNA를 사람 항체 불변영역(constant region, Fc)이 함께 발현되도록 제작된 발현벡터 pOptiVec과 pcDNA3.3 벡터(㈜다이노나)에 옮기고 293T 세포에 도입하였다.

<7-2> 카이메릭 항체 확인

1E1 카이메릭 항체가 제대로 제조되었는지를 유세포측정법으로 조사하였다. 적백혈병 세포주 K562를 마이크로 테스트 튜브(micro test tube)에 2×10⁵개 준비하였다. 1E1 단클론 항체 10μg을 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 차가운 PBS로 세척하고, 상기에서 293T에 1E1 카이메릭 항체 벡터를 도입해 얻은 배양액 100μL를 20분간 4℃에서 반응시켰다. 차가운 PBS로 세척하고, FITC가 결합된 이차항체(항-사람 면역 글로불린(다이노나))을 20분간 4℃에서 반응시켰다. 차가운 PBS로 세척하고 FACScalibur를 이용하여 유세포측정을 시행하였다. 염색강도는 형광강도에 대한 log로 측정하고 10승 단위로 표시하였다.

그 결과 도 11에서 나타낸 바와 같이, 상기 실험으로 제조된 1E1 카이메릭 항체가 1E1 단클론 항체와 가변부위가 같음을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

1E1: 본 발명의 항-ICAM4 단일클론항체
CDR: complementarity determining region
ADCC: antibody dependent Cellular cytotoxicity
ADCP: antibody dependent Cellular Phagocytosis

한국세포주연구재단 KCLRFBP00303 20131011

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> The antibody that recognizes the ICAM4 on erythroleukemia and use of the antibody <130> PN1309-327 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ICAM4 antibody CDR H1 polypeptide sequence <400> 1 Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ICAM4 antibody CDR H2 polypeptide sequence <400> 2 Met Trp Gly Gly Gly Arg Thr 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ICAM4 antibody CDR H3 polypeptide sequence <400> 3 Val Lys Thr Gly Gln Asp Tyr Ala Val Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ICAM4 antibody CDR L1 polypeptide sequence <400> 4 Lys Ser Ile Ser Lys Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ICAM4 antibody CDR L2 polypeptide sequence <400> 5 Ser Gly Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ICAM4 antibody CDR L3 polypeptide sequence <400> 6 Gln Gln His Asn Val Tyr Pro Trp Thr 1 5

Claims (12)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR H1; 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CDR H2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR H3을 포함하는 중쇄 가변부위와, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR L1; 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR L2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR L3을 포함하는 경쇄 가변부위를 모두 포함하는, ICAM4(intercellular adhesion molecule 4)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
2. 삭제
3. 제1항의 단일클론항체를 포함하는 적 백혈병 진단용 조성물.
4. 제1항의 단일클론항체를 포함하는 적 백혈병 진단키트.
5. 제1항의 단일클론항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 적 백혈병 마커를 검출하는 방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 항원-항체 복합체 형성은 RIA, ELISA, 면역형광법, 색체입자결합법 또는 화학발광물질결합법으로 검출하는 것을 특징으로 하는 적 백혈병 마커를 검출하는 방법.
7. 1) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 제1항의 단일클론항체를 접촉시키는 단계;
   2) 제 1항의 단일클론항체에 결합된 ICAM4를 검출하는 단계; 및
   3) 단계 2)에서 검출된 ICAM4 단백질 발현 정도가 정상개체인 대조군에 비해 증가한 개체를 적 백혈병에 걸릴 위험성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 적 백혈병 진단을 위한 정보 제공방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 담, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 뇨로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 적 백혈병 진단을 위한 정보 제공방법.
9. 제1항의 단일클론항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 적 백혈병 치료용 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 단일클론항체는 ICAM4-발현 적 백혈병 세포의 항체의존성세포독성(ADCC; antibody dependent Cellular cytotoxicity) 및 항체의존성식세포작용(ADCP; antibody dependent Cellular Phagocytosis)을 야기하는 것을 특징으로 하는 적 백혈병 치료용 조성물.
11. 제1항의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포.
12. 제11항에 있어서,
    상기 세포는 기탁번호 KCLRF-BP-00303인 것을 특징으로 하는 하이브리도마 세포.

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