KR101589153B1

KR101589153B1 - 알코올 내성을 갖는 글루콘아세토박터 사카리보란스 cv1 균주 및 이를 이용한 양조식초의 제조 방법

Info

Publication number: KR101589153B1
Application number: KR1020140027361A
Authority: KR
Inventors: 여수환; 최지호; 최한석; 백성열; 정석태; 박혜영; 권오숙; 김주연; 백창호; 정다희
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2016-02-03
Also published as: KR20150105117A

Abstract

본 발명은 알코올 내성을 갖는 글루콘아세토박터 사카리보란스(Gluconacetobacter saccharivorans) CV1 (KACC 17057) 균주 및 이를 이용하여 양조식초를 제조하는 양조식초의 제조방법에 관한 것이다.

Description

알코올 내성을 갖는 글루콘아세토박터 사카리보란스 CV1 균주 및 이를 이용한 양조식초의 제조 방법{Novel Gluconacetobacter saccharivorans sp. CV1 having Alcohol-Resistance and the Producing Method of a Brewing Vinegar using the Same}

본 발명은 알코올 내성을 갖는 글루콘아세토박터 사카리보란스 CV1 균주 및 이를 이용한 양조식초의 제조 방법에 관한 것이다.

오랜 옛날부터 이용되어온 발효식품인 식초는, 조리 시에 조미료로 사용할 뿐만 아니라, 식품 방부제, 의약용으로 다양하게 이용되고 있다. 식초는 당류나 전분질이 풍부한 곡류, 과실류, 주류 등을 주원료로 하여 미생물로 발효시켜 제조한 것인데, 발효로 만든 양조식초는 원료의 향기와 발효공정 중에 생성된 향기를 가지며 초산 이외에 휘발성 및 비휘발성의 각종 유기산류, 당류, 아미노산류, 에스테르류 등을 함유하고 있다.

일반적으로, 상기 양조식초는 효모(yeast)를 이용하여 당을 알코올로 만들고, 초산균(acetic acid bacteria, Acetobacter 속이 대표적)을 이용하여 알코올을 초산(acetic acid)으로 변화시킨 후, 약 6개월~1년 동안 숙성시켜 제조하며, 예를 들어 한국 공개 특허 제 2000-0058004 호 등에서는 신규한 아세토박터 균주 및 이 균주를 이용한 식초의 제조방법을 개시하고 있다.

하지만, 종래의 발명에서 사용하는 아세토박터(Acetobacter)속의 균주는 고농도의알코올을 초산발효시키는데 한계가 있어, 고농도의 알코올을 초산발효시킬 수 있는 새로운 초산균의 균주의 개발이 필요한 실정이다.

KR 10-2000-0058004 A

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서,

고농도의 알코올에서 초산을 생성하는 능력이 뛰어난 새로운 균주 및 이를 이용하여 양조식초를 제조하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

알코올 내성을 갖는 글루콘아세토박터 사카리보란스(Gluconacetobacter saccharivorans) CV1 (KACC 17057) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배지에서 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 양조식초를 얻는 것을 특징으로 하는 양조식초의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 이용하여 제조된 양조식초를 제공한다.

본 발명에 따른 양조식초를 제조하는 방법에 의하면,

고농도의 알코올에서 초산을 생성하는 능력이 뛰어난 신규한 균주를 이용하기 때문에, 종래의 제조방법에 비하여, 배양온도에 상관없이 15℃에서 37℃까지 모든 구간에서 생육이 가능하며, 다양한 알코올 농도(5-10%)에서 산 생성능을 조사한 결과, 10% 알코올에서 9.3%의 고산도 양조식초를 제조할 수 있다는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 균주를 위상차 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 2는 본 발명의 균주의 알코올 농도에 따른 초산의 생성능력을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 균주의 온도에 따른 초산의 생성능력을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 균주의 pH 값에 따른 초산의 생성능력을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 균주의 염기서열을 나타낸 그림이다.
도 6은 본 발명의 균주의 계통수상 위치를 16S rDNA 유전자 염기서열에 기초하여 나타낸 그림이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 알코올 내성을 갖는 글루콘아세토박터 사카리보란스(Gluconacetobacter saccharivorans) CV1 (KACC 17057) 균주 및 이를 이용하여 배지에서 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 양조식초를 얻는 것을 특징으로 하는 양조식초의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 미생물은 글루콘아세토박터 사카리보란스(Gluconacetobacter saccharivorans) 균주 (이하, CV1 균주)이며, 상기 CV1 균주는 전남 진도의 한 식초 농가에서 분리한 초산균으로 양조식초로부터 본 발명의 발명자에 의하여 동정되었으며, 이는 농촌진흥청 KACC에 기탁되어 있으며, (KACC 17057)의 수탁번호를 부여 받았다. 본 발명에서는 상기 기탁균주를 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 글루콘아세토박터 사카리보란스(Gluconacetobacter saccharivorans) 균주를 배지에서 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 양조식초를 얻는 것을 특징으로 하는 양조식초의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 양조식초 제조방법은 초산발효를 이용하는 것으로서, 공기 중의 산소를 이용하는 초산균의 작용으로 알코올을 호기적으로 산화시켜 아세트알데히드를 거쳐 아세트산을 만드는 것이다. 즉, 상기 초산균이 알코올을 산화하여 아세트산을 생성하는 반응인데, 알코올은 호기적으로 알코올 수소화효소에 의해 아세트알데히드가 되고, 이어서 알데히드 탈수소효소에 의해 아세트산, 즉 식초가 된다.

본 발명의 양조식초의 제조방법에 있어서, 초산균으로는 상기 CV1 균주를 사용하며, 상기 CV1 균주는 알코올 발효물 100중량부에 대하여 (5~10%)중량부의 양으로 접종하는 것이 바람직하다. 상기 CV1 균주의 첨가량이 5% 중량부 이하이면, 발효가 충분히 이루어지지 않고, 15% 중량부 이상이면, 첨가에 따른 효과의 상승이 없고, 경제성이 저조해진다.

본 발명의 양조식초의 제조방법에 있어서, 배양 온도는 15~37℃에서, 바람직하게는 20~30℃로 하고, 10일~20일간 발효시키는 것이 바람직하다. 상기 배양 온도가 15℃ 미만 또는 37℃ 초과이면 초산균의 번식력이 급격히 약해지기 때문에 상기 범위의 온도가 바람직하다.

본 발명의 양조식초의 제조방법에 있어서, 상기 배양은 10 내지 20일간 발효시켜 수행하며, 이 때, 배지의 pH 값은 3 이상인 것이 바람직하다. 상기 pH 값이 3 미만이면 균주의 번식력이 급격히 약해지는 문제점이 있다.

본 발명의 양조식초의 제조방법은, 알코올 농도가 10%인 배지에서 균주를 배양할 수 있다. 종래의 양조식초의 제조방법에서는, 알코올 농도 6% 이상의 범위에서는 초산균의 발육이 어려웠었다. 하지만, 본 발명의 양조식초의 제조방법에 사용되는 상기 CV1 균주는 알코올에 내성을 갖는 균주이므로, 높은 농도의 알코올이 존재하더라도 초산을 생성할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 초산 생성균 분리용 평판배지는 효모 추출물(Yeast extract), 포도당(Glucose), 탄산칼슘(CaCO₃), 한천(Agar), 에탄올(Ethanol)를, 산 생성 배지는 효모 추출물(Yeast extract), 포도당(Glucose), 글리세린(Glycerin), 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O), 에탄올(Ethanol) 및 초산(acetic acid) 등을 포함하는 액체배지에서 수행될 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 CV1 균주는 수크로오스(Sucrose), 자일로오스(Xylose), 락토오스(Lactose), 이노시톨(Inositol), 만노오스(Mannose), 만니톨(Mannitol), 람노어스(Rhamnose), 솔비톨(Sorbitol), 갈락토오스(Galactose), 아라비노오스(Arabinose), 과당(Fructose), 아미그달린(Amygdalin), 말토오스(Maltose), 락테이트(Lactate), 글리세롤(Glycerol), 글루코네이트(Gluconate), 멜리비오스(Melibiose)를 AE액체배지의 탄소원으로 사용할 수 있다.

본 발명의 양조식초는 상기 양조식초의 제조방법에 의하여 제조될 수 있으며, 상기 제조방법에 의하여 배양된 배양액으로부터 양조식초의 회수는 통상의 회수 방법을 이용할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 기초하여 더욱 상세하게 설명하지만, 하기에 개시되는 본 발명의 실시 형태는 어디까지 예시로써, 본 발명의 범위는 이들의 실시 형태에 한정되지 않는다. 본 발명의 범위는 특허 청구범위에 표시되었고, 더욱이 특허 청구범위 기록과 균등한 의미 및 범위 내에서의 모든 변경을 함유하고 있다.

실시예

실험 조건

본 실험에 사용한 양조식초는 전남 진도의 한 농가에서 제조한 양조식초를 수집하여 4℃ 냉장 보관하면서 분석 시료로 사용하였다.

초산 생성균 분리용 평판배지는 고체(solid) 배지(yeast extract 0.5%, glucose 3.0%, CaCO₃ 1.0%, agar 2.0%, ethanol 5.0%)를 사용하였으며, 초산균 분리용 액체배지 (yeast extract 0.5%, glucose 0.5%, glycerin 1.0%, MgSO₄·7H₂O 0.02%, ethanol 5.0%, acetic acid 1.0%)를 사용하였다. 또한 분리 균주의 당 이용성의 유무를 확인하기 위하여 AE배지(yeast extract 0.2%, peptone 0.3%, glucose 0.5%, ethanol 3%, acetic acid 3%)를 사용하였다.

실시예 1. 균주의 분리 및 동정

본 발명의 CV1 균주의 분리는 상기 수집된 식초 100 ㎕를 고체배지에 도말하고 30℃에서 5일간 배양하여 CaCO₃가 용해된 clear zone을 보고 1차적으로 선별하였으며, 동일 배지에 생육하는 초산균의 단일 colony를 계대 배양하여 순수 분리하였다.

상기에서 분리한 CV1 균주의 균학적 동정은 초산균의 형태학적 특성, 생화학적 특성(API 20NE Kit) 등을 조사하여 이루어졌다.

2.1. 균주의 형태학적 특징

CV1 균주의 형태 관찰을 위해 고체배지에 48시간 배양한 균체를 60, 70, 80, 90, 95 및 100% 에탄올로 단계적으로 수분을 제거한 후, 위상차 현미경(×1,000)으로 관찰하였다.

상기 본 발명에서 분리한 CV1 균주의 형태학적 특징을 기존의 균주인 A. pasteurianus 및 G. hansenii와 분석한 결과를 표 1에 나타내었으며, 그람 음성, 비포자 형성과 비운동성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다. 특히, 위상차 현미경으로 검경(×1,000)한 결과, 분리한 CV1 균주 (GYG 한천 배지 에서 30℃에서 2일 동안 배양)는 도 1과 같이 외형이 길쭉한 막대형의 장간균 (long rod)으로, 산소를 많이 필요로 하는 전통양조식초 제조에 사용할 수 있는 초산균으로 확인되었다.

특징	KCTC 12289 A. pasteurianus	KCCM 40230 G. hansenii	Isolated strain CV1
Gram staining	-	-	-
Cell shape	Rod	Long rod	Long rod
Cell size(μm)	0.3-0.4×0.7-0.8	0.6-0.7×1.4-1.8	0.2-0.3×4-6
Motility	-	-	-
Colony characteristics (Solid medium)	-	-	-
Shape	Entire, circular convex to flat	Entire, circular convex to flat	Entire, circular convex to flat
Color	Pale white	Pale white	Pale white
Surface	Smooth to rough	Smooth to rough	Smooth to rough
Transparence	Opacity	Opacity	Opacity

2.2. 균주의 생화학적 특징

분리 균주의 생화학적 특성을 조사하기 위해, API 20NE Kit을 이용하여 실험을 수행하였다. API kit(BioMerieux, France)를 이용한 동정은 배양된 분리균을 API kit에 100 ㎕를 접종하고 30℃에서 24시간 반응시킨 후 biochemical test, assimilation test를 하였다. Biochemical test는 생리식염수에 시험균을 현탁하여 건조된 기질이 들어있는 kit의 cupule에 접종하여 배양 후 발색시약을 첨가하여 물질의 대사유무를 색의 변화로써 판정하였다. Assimilation test는 최소배지에 현탁한 시험균을 탄수화물이 유일한 탄소원으로 들어있는 kit의 cupule에 접종 배양한 후, 시험균이 이들 당을 이용할 수 있는 여부를 탁도 변화로 분석할 수 있다. Cellulose 생성은 30℃, AE 액체배지에서 정치배양하여 이들의 생성 유무를 관찰하였다. 이러한 형태 및 생화학적 특성의 결과들을 토대로 하여 Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology의 기준에 따라 분리된 초산균을 동정하였다.

아래 표 2에 나타낸 것처럼, biochemical test 결과로 분리한 CV1 균주은 Gluconacetobacter 속(genus) 특성보다 Acetobacter 속(genus)의 특성에 유사한 것으로 나타났으며, assimilation test 결과는 초산균의 특징으로 나타난 것과 같은 결과를 보였다.

Characterization		G. hansenii	A. pasteurianus	CV1
Catalase		+	+	+
Nitrate reduction		-	-	-
Indole production		-	+	+
Glucose fermentaion		-	-	-
Arginine dihydrolase		-	-	-
Urease		-	-	-
Escullin hydrolysis		+	+	-
Gelatin hydrolysis		-	-	-
β-glucosidase		-	-	-
Assimilation	D-glucose	-	-	-
	D-arabihose	-	-	-
	D-mannose	-	-	-
	D-mannitol	-	-	-
	N-acetyl-glucosamine	-	-	-
	D-maltose	-	-	-
	Potassium gluconate	-	-	-
	Capric acid	-	-	-
	Adipic acid	-	-	-
	Malic acid	-	-	-
	Trisokium citrate	-	-	-
	Phenylacetic acid	-	-	-

2.3. 분리 초산균으로부터 계통수 분석

분리 초산균의 계통수 (phylogenetic tree)를 작성하기 위하여 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. ASW-YP 액체배지에서 2일간 배양하여 회수된 균체로부터 염색체 DNA (choromosomal DNA)를 gDNA prep kit를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. 이를 주형 (template)으로 universal primer인 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하여 PCR을 수행하여 16S rRNA 단편을 증폭하였다. 증폭된 PCR산물은 전기영동법으로 확인하여 PCR product purification kit (Nucleogene, Korea)으로 정제한 후 ABI BigDye terminator cycle sequencing ready reaction kit V3.1(ABI)를 이용한 cycle sequencing 방법으로 염기서열을 해독하였다 (DNAstar Lasergene 7).

결정된 염기서열의 상동성 검사는 National Center for Biotechnology Information (NCBI; www.ncib.nlm.nih/gov/)에서 제공하는 BLAST search를 통하여 수행하였고, 표준 균주(type strain)들과의 유사성 (similarity) 조사 및 관련된 분류군의 16S rRNA 유전자 염기서열의 확보는 Genebank rebosomal DNA sequence와 비교하였다. 염기서열 간의 상동성은 Clustal W 프로그램을 사용하여 확보된 염기서열들 간의 다중서열정렬(multiple sequence alignment) 검색을 수행하였다. 분리 균주의 계통수는 MEGA 4 프로그램을 사용한 neighbor-joining법과 Kimura-nei 모델을 사용하여 작성되었다. 계통수의 안정성 검사를 위해 1,000번의 bootstrap resampling을 시행하였다.

분리한 CV1 초산균의 계통도를 밝히기 위해, Mega 4 program을 사용한 neighbor-joining법과 Kimura-nei 모델을 사용하여 각 초산균별로 phylogenetic tree를 작성하여 분리 균주가 어디에 속하는지 속(genus)과 종(species)명을 규명하였다. Phylogenetic tree의 안정성 검사를 위해, 1,000번의 bootstrap resampling을 시행한 결과, CV1 초산균의 16S rDNA 염기서열은 총 1,355 bp 구성 되어 있으며, 이를 도 5에 나타내었다. 1,355 bp의 염기서열을 NCBI data bank에 등록된 type strain과 homology를 조사 비교한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Gluconacetobacter 속 균주들과 높은 상동성을 보였으며 특히, Gluconacetobacter saccharivorans LMG 1582와 99% 이상 가장 높은 상동성을 보였다. 따라서 본 발명의 CV1 (유색미초)은 Gluconacetobacter saccharivorans CV1으로 동정하였다.

실시예 2. 분리 균주의 고유기산 생성능 비교 분석

초산균을 분리하여 고체(solid) 배지(yeast extract 0.5%, glucose 3.0%, CaCO3 1.0%, ethanol 5.0%, agar 2.0%)에 백금이로 1 spot 도말한 후, 30?에서 5일간 배양한 후, 형성된 clear zone의 크기를 측정하여 나타내었다. 이 후, 액체배지에 ethanol 함량을 5, 6, 7, 8, 9, 10% 농도로 조정하여 20일간 배양하여, 알코올 내성 및 고유기산 생성능을 확인 하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

또한, 분리한 초산균의 생육 특성을 조사하기 위해, 배양 온도를 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 37℃로 변화시키며 14일간 배양하여, 각 온도에 따른 초산의 생성능력을 확인 하였으며, 660 nm에서 흡광도로 이들의 생육상태를 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

또한, 액체 배지에 배양액의 pH 값을 2.0, 2.4, 2.7, 3.0, 3.4로 변화시키며 14일간 배양하여, 각 pH 값에 따른 초산의 생성능력을 확인하였으며, 660 nm에서 흡광도로 이들의 생육상태를 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

가장 높은 10% 알코올 농도에서도 유기산을 생성하는 초산균은 CV1으로 총산 9.3%로 나타났으며, 배양온도에 상관없이 15℃에서 37℃까지 모든 구간에서 생육이 가능한 것으로 나타났다. pH 값이 3.0 내지 3.4인 경우에는 생육이 왕성한 반면, pH 값이 2.0인 경우에는 전혀 생육하지 못한 것을 알 수 있다.

실시예 3. 분리 균주의 탄소원 이용능 확인

분리한 초산균(Gluconacetobacter saccharivorans CV1)이 다양한 탄소원을 이용할 수 있는지를 조사하기 위해, 각각 2% ethanol과 acetic acid가 첨가된 AE 액체배지에 glucose 대신 lactose, fructose, maltose, mannitol, sucrose, sorbitol, glycerol, lactate 등 다양한 탄소원을 첨가하여 30℃에서 14일 동안 배양하면서 분리 균주가 다양한 탄소원을 이용하는지를 조사한 결과, 아래의 표 3에서와 같이, sucrose, mannose, fructose, glycerol, mannitol에서 우수한 생육을 보인다는 것을 알 수 있었다.

Carbon sources AE(2a/2e) broth - Glucose replaced by	CV1	Carbon sources AE(2a/2e) broth - Glucose replaced by	CV1
Sucrose	+++	Xylose	++
Lactose	++	Inositol	++
Mannose	+++	Mannitol	+++
Rhamnose	++	Sorbitol	++
Galactose	++	Arabinose	+
Fructose	+++	Amygdalin	++
Maltose	++	Lactate	+
Glycerol	+++	Gluconate	+
Melibiose	++

농업생명공학연구원

KACC17057

20121029

Claims

알코올 내성을 갖는 글루콘아세토박터 사카리보란스(Gluconacetobacter saccharivorans) CV1 (KACC 17057) 균주를 포함하는, 10% 이상의 알코올 농도 및 15~37℃ 온도에서 초산 발효가 가능한 초산 발효용 조성물.
글루콘아세토박터 사카리보란스(Gluconacetobacter saccharivorans) CV1 (KACC 17057) 균주로 알코올 농도가 10% 이상인 알코올 발효물을 15~37℃에서 초산 발효시키는 단계를 포함하는 양조식초의 제조방법.
삭제
삭제
청구항 2에 있어서,
상기 알코올 발효물은 pH 값이 3 이상 3.4 이하인 것을 특징으로 하는 양조식초의 제조방법.
청구항 2에 있어서,
상기 균주는 수크로오스(Sucrose), 자일로오스(Xylose), 락토오스(Lactose), 이노시톨(Inositol), 만노오스(Mannose), 만니톨(Mannitol), 람노어스(Rhamnose), 솔비톨(Sorbitol), 갈락토오스(Galactose), 아라비노오스(Arabinose), 과당(Fructose), 아미그달린(Amygdalin), 말토오스(Maltose), 락테이트(Lactate), 글리세롤(Glycerol), 글루코네이트(Gluconate) 및 멜리비오스(Melibiose)로 이루어지는 군에서 선택되는 탄소원을 사용하는 것을 특징으로 하는 양조식초의 제조방법.
청구항 1의 조성물을 이용하여 제조된 양조식초.