KR101578461B1 - 멜라닌 생성억제능의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제, 그를 함유하는 피부 미백용 조성물 및 상기 쿠마린계 화합물의 분리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 멜라닌 생성억제능의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제, 그를 함유하는 피부 미백용 조성물 및 상기 쿠마린계 화합물의 분리방법에 관한 것이다.
본 발명은 당귀추출물로부터 분리된 쿠마린계 화합물이 저농도에서 우수한 멜라닌 생성 억제효과를 구현하고 세포 독성이 없어, 상기 쿠마린계 화합물이 피부 미백제로서 유효하며, 이를 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물, 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용도의 피부외용제 조성물 및 기능성 식품에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

멜라닌 생성억제능의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제, 그를 함유하는 피부 미백용 조성물 및 상기 쿠마린계 화합물의 분리방법{SKIN WHITENING COUMARIN COMPOUND HAVING INHIBITORY ABILITY OF MELANIN SYNTHESIS, COMPOSITION FOR WHITENING SKIN AND PURIFICATION METHOD OF CUMARIN COMPOUND}

본 발명은 멜라닌 생성억제능의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제, 그를 함유하는 피부 미백용 조성물 및 상기 쿠마린계 화합물의 분리방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물이 공지의 멜라닌 생성저해제인 알부틴보다 저농도에서 우수한 멜라닌 생성 억제효과를 구현하고 세포 독성이 없으므로, 쿠마린계 화합물이 피부 미백제로서 유효하며, 이를 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물, 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용도의 피부외용제 조성물과 기능성 식품으로의 용도 및 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물의 분리방법에 관한 것이다.

사람의 피부색을 결정하는 요인으로는 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드, 빌리루빈 등의 인체 내외의 색소 함유 유무를 들 수 있다.

이중에서 인체내의 멜라닌 형성 세포인 멜라노사이트에서 타이로시나제(tyrosinase) 효소 작용으로 인해 생성되는 흑색 멜라닌(melanin) 색소를 가장 중요한 요인으로 들 수 있다.

일반적으로 생성된 멜라닌은 멜라노좀(melanosome) 상태로 주변의 케라티노사이트(keratinocyte)로 이동되며 각질화에 의해 제거되지만, 이러한 과정이 생리적 및 환경적 요인으로 인해 원활히 진행되지 못할 경우 기미, 주근깨, 색소침착 등과 같은 피부색소 침착의 이상 증상이 야기된다.

이에, 피부 미백에 관해 높아지는 관심과 꾸준한 시장 요구에 따라, 천연식물소재로부터 추출된 미백활성성분이 유효성분으로 함유됨으로써, 피부 안정성이 개선하고 피부자극이 없으면서 티이로시나제(tyrosinase) 저해 활성을 가지는 화장료 조성물에 대한 연구 개발이 활발하다.

상기 천연식물소재의 일례로서, 상백피(일본공개특허 소55-44375, 소64-26507, 소64-83009, 평1-25687, 평5-139950, 한국공개특허 제92-002109호, 제97-021273호), 감초(일본공개특허 소60-214721, 소63-23809, 소64-63506, 평1-149706, 한국공개특허 제92-002109호, 제97-025601호) 등의 다수가 타이로시나제 저해 활성에 작용하여 멜라닌 생성을 억제한다고 보고되어 있다. 그러나, 이상의 천연식물소재로부터 추출된 미백 화장료 조성물의 경우, 여전히 안전성, 안정성, 변색 가능성 측면에서 화장품이나 의약품에 유효농도 이상으로 사용하는 데 문제점이 지적되어, 실제 사용시에는 낮은 함량으로 인해 만족할 만한 효과를 내지 못하는 실정이다.

현재 천연식물소재에서 추출되어 티이로시나제(tyrosinase) 저해 활성이 입증된 원료로서, 하이드로퀴논(hydroquinone), 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 아스코르빈산(ascorbic acid) 등이 사용되고 있다. 그러나, 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안정성 문제, 화장료 배합시 제형 및 그 안정성 문제 등으로 인해 사용이 제한되고 있다.

이에, 본 발명자들은 종래 천연식물소재로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백 화장료 조성물의 문제점을 개선하고자 노력한 결과, 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물을 분리하고, 상기 쿠마린계 화합물이 공지의 멜라닌 생성저해제인 알부틴보다 저농도에서 우수한 멜라닌 생성 억제효과를 구현하고 세포 독성이 없음을 확인하여 다양한 피부 미백용도에 적용함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물이 멜라닌 생성 억제능에 따른 피부 미백효능이 확인됨에 따라, 상기 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 멜라닌 생성 억제 및 피부 미백효능을 가지는 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백으로 적합한 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물의 분리방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 당귀추출물로부터 유래된 하기 화학식 1로 표시되는 멜라닌 생성억제능의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 제공한다.

화학식 1

상기 화학식 1에서 R₁은 수소, C₁-C₆의 알킬기, C₁-C₆의 알킬렌기 및 페닐기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.

더욱 바람직하게는 본 발명은 당귀(Angelica gigas NaKai) 뿌리추출물로부터 유래된 하기 화학식 2로 표시되는 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 제공한다.

화학식 2

본 발명은 이상의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 및 미용학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

이때, 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물에서의 상기 쿠마린계 화합물의 함량은 전체 조성물 함량에 대하여, 0.000001 내지 10중량%로 함유되는 것이다.

본 발명의 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물은 크림, 스킨, 로션, 파우더, 스프레이, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼, 클렌징, 비누 및 콘실 스틱으로 이루어진 어느 하나의 제형에 적용되어 제공될 수 있다.

본 발명은 이상의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 0.000001 내지 10중량%를 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 피부외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 이상의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제0.000001 내지 10중량%를 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명은 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물의 분리방법을 제공한다. 구체적으로, 건조된 당귀 뿌리의 분쇄물을 C₁-C₄ 알코올로 추출하여 추출액을 얻는 단계; 상기 추출액을 건조한 후 물에 현탁하고 유기용매를 첨가하여 유기용매 분획물을 수득하는 단계; 상기 수득된 분획물을 농축하여 농축액을 얻는 단계; 및 상기 농축액을 크로마토그래피로 분리 정제하는 단계;로 이루어진 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물의 분리방법을 제공한다.

상기에서, 유기용매는 에틸아세테이트, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산, 시클로헥산 및 석유에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용한다.

본 발명에 의하면, 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물이 저농도에서도 멜라닌 생성 억제 효과가 탁월함을 확인함으로써, 다양한 피부 미백용도에 유용하다.

이에, 본 발명의 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물은 피부 세포의 흑화 방지의 작용이 우수할 뿐 아니라, 물질 자체에 안정성이 우수하여 그 효과가 장기간 유지되며, 피부 자극이 거의 없는 안전성이 우수한 물질로서 이를 함유한 조성물은 피부 미백용 화장료 조성물, 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 피부외용제 조성물 또는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 기능성 식품에 적용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 당귀 뿌리추출로부터 분리 정제된 쿠마린계 화합물의 농도별 세포생존율 결과를 도시한 것이고,
도 2는 본 발명의 당귀 뿌리추출로부터 분리 정제된 쿠마린계 화합물의 농도별 멜라닌 생합성 억제실험 결과를 도시한 것이고,
도 3은 본 발명의 당귀 뿌리추출로부터 분리 정제된 쿠마린계 화합물의 농도별 멜라닌 생성에 영향을 주는 티로시나아제, Trp-1, Trp-2, MITF 발현 억제에 대한 웨스턴 블럿 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 당귀추출물로부터 유래된 하기 화학식 1로 표시되는 멜라닌 생성억제능의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 제공한다.

화학식 1

상기 화학식 1에서 R₁은 수소, C₁-C₆의 알킬기, C₁-C₆의 알킬렌기 및 페닐기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.

더욱 바람직하게는 본 발명의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제는 당귀(Angelica gigas NaKai) 뿌리추출물로부터 분리 정제된 하기 화학식 2로 표시되는 쿠마린계 화합물(7-hydroxy-6-(3-methylbut-2-enyl)chromen-2-one)로 이루어진 것이다.

화학식 2

본 발명의 당귀추출물은 당귀(Angelica gigas NaKai)로부터 추출하여 얻은 것이 바람직하다. 이때, 당귀(Angelica gigas NaKai)는 미나리과에 속하는 다년생 풀로, 한방에서는 그 뿌리를 말린 것이 주로 약제로 이용된다. 맛은 달고 매우며 성질은 따뜻하다. 당귀는 심경, 간경, 비경에 작용하며, 혈액 생성을 촉진시켜 빈혈의 예방 및 치료에 효과적이고, 스트레스로 인한 생리불순에 효과적이며, 보혈, 부인병에 좋은 것으로 알려져 있다. 또한 대변을 통하게 하고 출혈을 멈추게 한다. 약리실험을 통해 진정작용, 진통작용, 강압작용, 억균작용, 약한 이뇨작용, 이담작용 등이 밝혀져 있다.

이에, 대한민국특허 제252194호에서는 당귀의 펙틴질 다당류를 유효성분으로 함유하는 면역 증강제를 보고하고 있으며, 대한민국특허 제336182호에서는 당귀의 히드록시신남산 유도체를 유효성분으로 함유하는 치매 예방 및 치료제 조성물을 공지한 바 있다. 또한, 대한민국 공개특허 제2005-0121324호에서는 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트를 유효성분으로 이용하여 배뇨장애 및 부종 치료제로 보고하고 있고, 대한민국 공개특허 제2006-0078343호 및 대한민국특허 제187881호에서는 항암제 조성물로 보고된 바 있다.

또한, 당귀추출물로부터 분리한 쿠마린계 화합물에 대하여, 대한민국특허 제829122호에서는 폐암 예방 조성물로 보고되어 있으며, 대한민국특허 제1039750호는 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 다약제내성 억제용 약학적 조성물을 보고한 바 있다.

그러나 쿠마린계 화합물, 특히 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물에 대한 멜라닌 생성 억제능에 따른 피부 미백 효능에 대한 보고는 아직까지 없다.

이에, 본 발명은 종래 항암 등의 약학적 기능이 아닌, 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물에 대하여, 멜라닌 합성 유도 자체를 억제하는 물질까지 스크리닝(screening)할 수 있는 쥐의 멜라노마 세포(B16F1 mouse melanoma cell)를 대상으로 실험한 결과, 강력한 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하고, 특히, 공지의 멜라닌 생성저해제인 알부틴(arbutin)보다 저농도에서 멜라닌 생성 억제효과가 높은 결과를 확인함에 따라, 쿠마린계 화합물이 피부 미백효능을 구현하는 유효성분으로서 사용될 수 있음을 제공한다.

또한, 본 발명의 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물은 피부 세포의 흑화 방지의 작용이 우수할 뿐 아니라, 세포 독성이 없어 멜라닌 생성을 억제하므로, 물질 자체의 우수한 안정성으로 그 효과가 장기간 유지되며, 피부 자극이 거의 없어 안전성이 우수하다.

이에, 본 발명은 이상의 당귀추출물로부터 유래된 멜라닌 생성억제능의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 및 미용학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물에서 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제의 함량은 사용목적, 제품의 제형이나 용도에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 전체 조성물 함량에 대하여, 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 0.000001 내지 10중량%, 더욱 바람직하게는 0.0002 내지 2중량%로 함유된다. 이때, 0.000001 중량% 미만으로 함유되면, 멜라닌 생성 억제 효과 및 미백효과를 기대할 수 없고, 10중량%를 초과하면, 안정성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있다. 본 발명의 실시예에서 가장 바람직하게는 0.00025중량%를 사용하여 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하나, 이에 한정되지 않는다.

이에, 본 발명의 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물에 유효성분으로 함유되는 쿠마린계 화합물은 5㎍/㎖ 이하의 농도에서 우수한 세포생존율(%)을 보여, 세포 독성을 나타내지 않으며, 공지의 멜라닌 생성저해제인 알부틴(arbutin) 농도 1 일 때, 쿠마린계 화합물은 0.0025∼0.005 배 낮은 농도에서 우수한 멜라닌 생성 억제효과를 구현한다[표 1 및 표 2].

따라서, 본 발명의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 유효성분으로 함유한 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물은 천연추출물의 안정성 측면에서 높은 농도로 사용할 수 없음을 감안한다면, 낮은 농도에서도 미백효과를 발휘할 수 있으므로, 기미, 주근깨, 일광에 의한 흑화 등의 예방, 개선 및 치료에 유용하다.

본 발명의 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물은 이상의 유효성분인 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 이외에, 미용학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.

그 일례로는 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 등이 있으며, 통상적으로 화장품에 사용되는 임의의 다른 성분을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물에는 상기 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 유효성분으로 함유하되, 주 효과를 손상시키지 않은 범위 내에서, 닥나무추출물, 알부틴, 에틸아스코빌에텔, 유용성 감초추출물, 아스코빌글루코사이드, 나이아신아마이드, 알파-비사볼올, 아스코빌테트라이소팔미테이트 등의 다른 성분 1종 이상을 함유하여, 주 효과에 상승효과를 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서, 피부 미백용 화장료 조성물은 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 제형으로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 제형 형태로도 제조될 수 있다.

구체적으로, 피부 미백용 화장료 조성물은 크림, 스킨, 로션, 파우더, 스프레이, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼, 클렌징, 비누 및 콘실 스틱(conceal stick)으로 이루어진 어느 하나의 제형에 적용될 수 있다.

또한, 본 발명은 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물의 멜라닌 생성 억제능에 따른 피부 미백 효능을 이용하여, 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유하여 피부 과학분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 피부외용제 형태로 제공될 수 있다.

이에, 본 발명은 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 0.000001 내지 10중량%를 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 피부외용제 조성물을 제공한다.

즉, 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물이 피부 세포의 흑화 방지의 작용이 우수할 뿐 아니라, 물질 자체가 안정성이 우수하고 피부 자극이 거의 없는 안전성이 우수한 물질로서, 피부외용 연고 또는 패치제와 같은 약품 조성물에 첨가할 때, 별다른 부작용 없이 강력한 피부 미백효과를 나타낼 수 있다.

상기 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 이외에, 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있으며, 상기의 성분들이 함량 역시 피부과학 분야에서 허용되는 범위의 양으로 도입될 수 있다.

나아가, 본 발명은 당귀추출물로부터 유래된 하기 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물 또는 당귀(Angelica gigas NaKai) 뿌리추출물로부터 유래된 하기 화학식 2로 표시되는 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명에 따른 기능성 식품의 바람직한 제형은 청량음료, 미네랄워터, 알코올음료 등의 음료 제품 또는 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.

본 발명의 쿠마린계 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 함량은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 기능성 식품은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일주스, 과일주스음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명은 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물의 분리방법을 제공한다. 구체적으로는, 건조된 당귀 뿌리의 분쇄물을 C₁-C₄ 알코올로 추출하여 추출액을 얻는 제1단계;

상기 추출액을 건조한 후 물에 현탁하고 유기용매를 첨가하여 유기용매 분획물을 수득하는 제2단계;

상기 수득된 분획물을 농축하여 농축액을 얻는 제3단계; 및

상기 농축액을 크로마토그래피로 분리 정제하는 제4단계;로 이루어진다.

본 발명의 분리방법에서 제1단계에서 사용된 당귀는 식품의약품안전청 공고 제2012 -110호 「생약 등의 잔류ㆍ오염물질 기준 및 시험방법」(식품의약품안전청 고시 제2011-42호, 2011. 8. 22)에 준하는 시험을 진행하여 통과한 약재를 사용한다.

제1단계는 생약재로 시판되는 당귀의 뿌리를 구입하여 잘게 분쇄한 후, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올을 이용하여 환류 냉각기가 달린 추출기에서 50∼100℃로 1∼5시간 가열 추출하여 추출액을 제조한다.

상기 얻은 추출액을 여과포로 여과한 후 잔사를 같은 방법으로 1회 이상 더 추출한 후, 추출액을 합하여 감압 농축한 다음 동결건조 또는 분무건조하여 건조 추출물을 얻는다.

이후 제3단계는 상기의 건조 추출물을 물에 현탁한 후, 동일 부피의 유기용매를 첨가하고 액-액 추출하여 유기용매의 분획물을 얻는다.

이때, 유기용매는 에틸아세테이트, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산, 시클로헥산 및 석유에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용하며, 본 발명의 실시예에서는 디에틸에테르를 사용하여 얻은 분획물을 농축하여 농축액을 수득한다.

제4단계는 상기 농축액을 실리카겔, 활성 알루미나 등을 충진한 컬럼크로마토그래피와 고속액체크로마토그래피(HPLC) 등을 이용하여 분리 정제한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 당귀추출물로부터 쿠마린계 화합물의 분리 및 정제

당귀(Angelica gigas NaKai) 뿌리 500g을 잘게 분쇄한 후에 메탄올 2L를 가하여 항온조에서 3시간 동안 2회에 걸쳐 증류 냉각하였다. 상기에서 증류 냉각시킨 추출액을 실온으로 냉각시키고, 거름종이로 여과 및 감압 농축하여 당귀 뿌리추출물을 수득하였다. 상기에서 수득한 당귀 뿌리추출물을 증류수에 용해시키고 동량의 디에틸에테르를 가하고, 분배하여 최종 디에틸에테르 분획물을 얻었다. 상기 디에틸에테르 분획물을 증발시켜 농축한 후, 디에틸에테르 분획물을 실리카 충진컬럼(silica gel 60(230-400 mash)-merk)을 이용하여 크로마토그래피를 실시하여 분리정제물 170mg을 얻었다. 상기 분리시 용출용매는 노말헥산과 에틸아세테이트의 혼합액을 사용하였다.

< 실험예 1> 구조분석

상기 실시예 1에서 당귀 뿌리추출물로부터 분리정제물을 NMR 분광기(JEOL, ECA-500, JAPAN) 및 고속액체크로마토그래피(Shimadzu, HPLC Prominence, JAPAN)를 이용하여 구조 분석하였다[¹H-NMR(CDCl₃, 500MHz) δ: 1.77, 1.74 (6H,s. gem-(CH₃)₂), 3.36 (2H, d, J=7.2Hz, H-1'), 5.29 (1H, t, J=7.2 Hz, H-2'), 6.21 (1H, d, J=9.5Hz, H-3), 6.89 (1H, s, H-8), 7.17 (1H, s, H-5), 7.61 (1H, d, J=9.5 Hz, H-4), ¹³C-NMR (CDCl₃, 125MHz) δ: 17.9 (C-5′), 25.8 (C-4′), 28.7 (C-1′), 103.3 (C-8), 112.4 (C-10), 112.6 (C-3), 120.9 (C-2′), 125.3 (C-6), 128.4 (C-5), 135.4 (C-3′), 143.9 (C-4), 154.2 (C-9), 158.3 (C-2), 162.0 (C-7)].

이상의 분광학적 결과로부터, 실시예 1에서 당귀 뿌리추출물로부터 분리 정제한 결과, 화학식 2로 표시되는 쿠마린계 화합물(7-hydroxy-6-(3-methylbut-2-enyl)chromen-2-one)을 확인하였다.

화학식 2

< 실험예 2> 세포 독성 시험( NRU assay )

상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물의 세포독성을 측정하였다.

구체적으로는, B16F1(mouse melanoma cell)을 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM/high glucose(Dubeco? Modified Eagle Medium, Hyclone) 배지를 이용하여 96-웰 플레이트에 200㎕씩 나누어 넣고 37℃, CO₂인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 이후 상기 쿠마린계 화합물을 농도별로 처리하여 같은 배양 조건에서 72시간 배양하였다. 상기 배양이 끝난 후 배양액을 제거하고 5㎎/㎖ 중성의 적색 시약을 첨가한 배양액을 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 제거하고 CaCl₂ 용액과 포름알데히드를 처리하고 수분간 400∼500 rpm으로 흔들어 준 뒤 이를 다시 제거하였다.

그리고 1% 아세트산과 에탄올을 각 웰에 처리하고 10분간 잘 흔들어 준 다음 마이크로 플레이트 계수기(Microplate reader)를 이용하여 570nm/655nm의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 기재하였다.

상기 표 1 또는 도 1의 결과로부터, 쿠마린계 화합물 5㎍/㎖ 이하의 농도에서 우수한 세포생존율을 보임으로써, 세포 독성에 안정성을 확인하였다.

< 실험예 3> 멜라닌 생합성 억제 효과 측정

상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물에 대하여, 마우스 유래 B16F1 멜라노마(melanoma) 내 멜라닌(melanin) 생합성을 억제하는 효과를 측정하기 위하여 하기와 같이 실험하였다. 구체적으로는, B16F1(mouse melanoma cell) 세포를 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM/high glucose(Dulbeco's Modified Eagle Medium, Hyclone)에서 배양한 후, 이를 취하여 적정농도의 세포액을 조제하고, 이를 6-웰 플레이트에 분주한 다음, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 배지를 제거하고 α-MSH(Melanocyte stimulating hormone, 멜라닌 세포 자극 호르몬)를 배지에 혼입하여 각 웰에 첨가하고 추출시료인 쿠마린계 화합물을 농도별로 함께 첨가하였다. 이때, 양성대조구는 500㎍/㎖ 농도의 알부틴을 사용하였다.

72시간 배양한 후 각 플레이트 내의 세포 내 멜라닌 생성량을 측정하기 위해 우선 플레이트 내 나머지 배양액을 제거하고, 1×PBS(phosphate buffered saline)로 세척하였다. 티로신(trypsin)을 각 웰에 처리하고 세포를 떼어낸 후, 각 웰에 배양액을 처리하고 2㎖ 마이크로튜브(microtube)로 옮겼다. 이를 10,000 rpm에 수분간 원심분리한 후 튜브 안의 배양액을 제거하고 PBS 처리하고, 다시 원심분리와 제거를 통해 세척하였다. 이후 PBS를 제거하고 건조시켰다. 이에 각각 1N NaOH(10% DMSO)를 처리하고, 다시 70℃에서 수분간 튜브의 뚜껑을 닫은 채 반응시켰다. 반응 후 96-웰 플레이트로 적정량을 분주한 후, 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 490㎚/655㎚에서 흡광도를 측정하였다. α-MSH를 첨가하지 않은 α-MSH(-) 그룹의 흡광도를 1로 놓고, 다른 그룹은 이에 대한 상대적인 비율로 측정하여 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다. 음성대조군(α-MSH(-)로 표시)에는 α-MSH, 쿠마린계 화합물 등을 첨가하지 않았다.

상기 표 2 또는 도 2의 결과에서 확인된 바와 같이, 실시예 1에서 분리정제된 화학식 2로 표시되는 쿠마린계 화합물은 농도 의존적으로 멜라닌 합성 저해능이 향상됨으로써, 미백 효과를 확인하였다.

< 실험예 4> 웨스턴 블럿 실험

B16F1(mouse melanoma cell)을 10% FBS-DMEM에 배양하고 이를 취하여 적정 농도 세포액을 조제하였다. 이를 6-웰 플레이트에 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양시켰다. 24시간 배양 후, 배지 제거 후 배지와 농도별 시료를 적정량 혼합한 뒤, 다시 동일 조건에서 72시간 배양시켰다.

Blank(블랭크)는 배지만을 넣은 대조군이며, 배양 후, 각 플레이트 내의 세포를 회수하기 위하여 티로신-EDTA 용액을 넣고 세포를 분리하여 마이크로튜브에 획득한 후 원심분리하여 상등액을 제거하였다.

분리된 펠렛을 1×PBS(-)로 세척하고 원심분리한 후, 펠렛에 PRO-PREP^TM Protein Extract Solution(Intron, Inc.)을 처리하여 -20℃에서 15분 반응시켰다. 원심분리 진행 후, 상등액을 튜브로 옮겨 -20℃에 보관하였다. 상기 방법으로 정제한 단백질을 8% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 실행하고 이를 PVDF 막으로 이전하였다. 5% 스킴 밀크(skim milk)가 함유된 트리스 완충용액에서 1시간 블로킹(blocking) 과정을 거친 후에 티로시나아제, Trp-1, Trp-2, B-악틴(actin)항체와 각각 반응시켰다. 반응 후, donkey anti-goat lgG-HRP가 결합된 항체를 가하고, Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)를 사용하여 일정 시간 동안 반응시킨 후 현상하였다.

도 3은 본 발명의 당귀추출물로부터 분리 정제된 쿠마린계 화합물에 의한 멜라닌 생성에 영향을 주는 티로시나아제, Trp-1, Trp-2, MITF 발현 억제에 관한 웨스턴 블록 결과이다.

그 결과, 쿠마린계 화합물 5 ㎍/㎖ 농도에서 티로시나아제, Trp-1, Trp-2 및 MITF 발현이 억제되었다. 따라서 쿠마린계 화합물은 멜라닌 생성 단계에 관여하는 효소들의 발현이 억제됨을 확인하였다.

< 처방예 1> 유연화장수의 제조

상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 유연화장수의 처방은 하기 표 3과 같다.

구체적으로, 소듐히알루로네이트는 프로펠러믹서(3000rpm)로 정제수에 분산하여 1% 용액상태로 준비하였다. 소듐히알루로네이트를 제외한 원료 1 내지 8은 프로펠러믹서를 사용하여 수상 용해조에 500rpm으로 균일화시키고 75℃에서 가온하여 완전 용해한 후, 실온으로 냉각하였다. 이후, 별도의 용해조에 원료 9 내지 11을 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하고 교반 혼합하였다. 여기에 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 유연화장수를 제조하였다.

< 처방예 2> 영양화장수의 제조

상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 영양화장수의 처방은 하기 표 4와 같다.

구체적으로, 프로펠러믹서를 이용하여 카보머를 4000rpm으로 분산하여 2% 용액상태로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1 내지 6을 투입하여 호모믹서(2000rpm)로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 7 내지 14을 투입하여 75℃까지 가온 용해하였다. 그 다음 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/5분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 영양화장수를 제조하였다.

< 처방예 3> 에센스의 제조

상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 에센스의 처방은 하기 표 5와 같다.

구체적으로, 소듐히알루로네이트, 히드록시에틸셀룰로이즈는 각각 정제수에 프로펠러믹서(2000rpm)로 분산하여 1중량% 함유용액으로 준비하였다. 또한 카보머는 정제수에 프로펠러믹서(4000rpm)로 분산하여 2중량% 함유용액으로 준비하였다. 한편, 수상 용해조에 원료 1 내지 12를 투입하여 호모믹서(2000rpm)로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하고, 가온된 수상을 다시 실온으로 냉각하였다. 별도의 용해조에 원료 13 내지 15를 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하여 교반 혼합하였다. 이에, 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 에센스를 제조하였다.

< 처방예 4> 영양크림의 제조

상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 영양크림의 처방은 하기 표 6과 같다.

구체적으로, 수상 용해조에 원료 1 내지 8을 투입하여 호모믹서(2000rpm)로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하였다. 별도의 유상 용해조에 원료 9 내지 16을 투입하여 80℃까지 가온 용해한 후 상기 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/10분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 영양크림을 제조하였다.

< 처방예 5> 팩의 제조

상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 팩의 처방은 하기 표 7과 같다.

구체적으로, 별도의 용해조에 원료 1 내지 8을 완전 용해시켜 교반 혼합하고, 여기에 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여 팩을 제조하였다.

< 처방예 6> 연고의 제조

상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 연고의 처방은 하기 표 8과 같다.

< 처방예 7> 패취제의 제조

상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 패취제의 처방은 하기 표 9와 같다.

< 처방예 8> 기능성 음료의 제조

상기 실시예 1에서 수득된 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유한 기능성 음료의 처방은 하기 표 10과 같다.

구체적으로, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 제조된 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물이 멜라닌 생성 억제능에 따른 피부 미백효능이 확인됨에 따라, 상기 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제를 제공하였다.

본 발명의 당귀추출물로부터 유래된 쿠마린계 화합물은 피부 세포의 흑화 방지의 작용이 우수할 뿐 아니라, 물질 자체에 안정성이 우수하여 그 효과가 장기간 유지되며, 피부 자극이 거의 없는 안전성이 우수한 물질로서 이를 함유하여, 피부 미백용 화장료 조성물, 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 피부외용제 조성물 또는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 기능성 식품 분야에 유용하게 적용할 수 있다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (9)

1. 당귀추출물로부터 유래된, 하기 화학식 1로 표시되는 멜라닌 생성억제능의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제:
   화학식 1
   

   

   
   상기 화학식 1에서 R₁은 수소, C₁-C₆의 알킬기, C₁-C₆의 알킬렌기 및 페닐기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.
2. 제1항에 있어서, 당귀(Angelica gigas NaKai) 뿌리추출물로부터 유래된 하기 화학식 2로 표시되는 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제.
   화학식 2
   

   
3. 제1항 또는 제2항의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 및
   미용학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 쿠마린계 화합물이 전체 조성물 함량에 대하여, 0.000001 내지 10중량%로 함유된 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 조성물이 크림, 스킨, 로션, 파우더, 스프레이, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼, 클렌징, 비누 및 콘실 스틱으로 이루어진 어느 하나의 제형에 적용된 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 억제 피부 미백용 화장료 조성물.
6. 제1항 또는 제2항의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 0.000001 내지 10중량%가 유효성분으로 함유되는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 피부외용제 조성물.
7. 제1항 또는 제2항의 쿠마린계 화합물로 이루어진 피부 미백제 0.000001 내지 10중량%가 유효성분으로 함유되는 멜라닌 색소침착 예방 및 개선용 기능성 식품.
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