KR101571523B1 - 심혈관 질환과 연관된 유전적 감수성 변이 - Google Patents

심혈관 질환과 연관된 유전적 감수성 변이 Download PDF

Info

Publication number
KR101571523B1
KR101571523B1 KR1020097019455A KR20097019455A KR101571523B1 KR 101571523 B1 KR101571523 B1 KR 101571523B1 KR 1020097019455 A KR1020097019455 A KR 1020097019455A KR 20097019455 A KR20097019455 A KR 20097019455A KR 101571523 B1 KR101571523 B1 KR 101571523B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
delete delete
markers
risk
disease
cardiovascular disease
Prior art date
Application number
KR1020097019455A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20090117896A (ko
Inventor
안나 헬가도티어
굿마 쏘어레이프슨
안드레이 마놀레스큐
Original Assignee
디코드 제네틱스 이에이치에프
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 디코드 제네틱스 이에이치에프 filed Critical 디코드 제네틱스 이에이치에프
Publication of KR20090117896A publication Critical patent/KR20090117896A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101571523B1 publication Critical patent/KR101571523B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Abstract

본 발명은 심혈관 질환과 연관된 것으로 확인된 특정한 다형성 마커의 대립형질의 존재 또는 부재를 평가하는 것에 의해, 관상동맥 질환, MI, 복부 대동맥류, 두개내 동맥류 재협착 및 말초 동맥 질환을 포함한 심혈관 질환에 대한 감수성을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그와 같은 마커를 평가하는 시약을 포함하는 키트, 및 그와 같은 마커를 이용하여 치료제 및 치료 방법에 대한 반응의 확률을 평가하는 방법에 관한 것이다.
심혈관 질환, 다형성 마커, 일배체형, 변이.

Description

심혈관 질환과 연관된 유전적 감수성 변이{Genetic susceptibility variants associated with cardiovascular disease}
본 발명은 심혈관 질환과 연관된 것으로 확인된 특정한 다형성 마커의 대립형질의 존재 또는 부재를 평가하는 것에 의해 관상동맥 질환, MI, 복부 대동맥류(abdominal aorta aneurysm), 두개내 동맥류 재협착(intracranial aneurysm restenosis) 및 말초 동맥 질환(peripheral arterial disease)을 포함한, 심혈관 질환에 대한 감수성을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그와 같은 마커를 평가하기 위한 시약을 포함하는 키트, 및 그와 같은 마커를 이용하여 치료제 및 치료 방법에 대한 반응의 확률을 평가하는 방법에 관한 것이다.
관상동맥 질환 및 심근 경색증
관상동맥 질환의 주요한 합병증, 즉, 심근경색증(myocardinal infarction, MI) 및 급성 관상동맥 증후군(Acute Coronary Syndrome, ACS)은 선진국에서 병원 입원의 주요한 원인이다. 심혈관 질환은 지속적으로 미국, 유럽 및 일본에서 주요한 사망 원인이다. 상기 질병의 비용은 유병율 및 사망율 측면 및 , 또한 의료 시스템에 대한 재무적 부담이 높다.
심근경색증은 일반적으로 죽상동맥경화증에 의해 이전에 손상되었던(즉, 관 상동맥 질환을 갖는 개체에서) 관상 동맥의 혈전 폐색 후 관상동맥 혈류의 급격한 감소가 있는 경우 일어난다. 대부분의 경우에, 경색증은 죽상경화성 플라크 (atherosclerotic plaque)가 균열되거나, 파열(rupture)되거나, 또는 궤양화되는 경우 및 상태가 혈전 형성(thrombogenesis)을 촉진하는 경우에 일어난다. 드물게, 경색증은 관상동맥 색전증, 선천성 이상(congenital abnormalities), 관상동맥 연축(coronary spasm), 및 다양한 전신성 질환, 특히, 염증성 질환에 의해 유발된 관상 동맥 폐색에서 기인될 수 있다. MI에 대한 의학적 위험 인자들은 흡연, 당뇨병, 고혈압 및 200 mg/dL를 초과하는 혈청 총 콜레스테롤 수준, 증가된 혈청 LDL 콜레스테롤, 및 낮은 혈청 HDL 콜레스테롤을 포함한다. 심혈관 질환의 과거 이력이 없는 개인에서 발생율(event rate)은 약 1%이다. 혈관 성형술 및 스텐트 삽입을 포함한 최대한의 의료적 관리에도 불구하고, 최초의 MI 또는 ACS를 가졌던 개인에서 1년 내에 재발성 MI의 위험은 10-14%이다.
죽상경화증은 다수의 대동맥과 중동맥(medium artery)에서 혈관상(vascular bed)에 영향을 미칠 수 있다. 심근 경색증 및 불안정 협심증(급성 관상동맥 증후군 (ACS))은 관상동맥 죽상경화증(관상동맥 질환)으로부터 발생하며, 허혈성 뇌졸중은 가장 빈번하게는 경동맥 또는 대뇌 동맥 죽상경화증의 결과이다. 말초 동맥 폐쇄성 질환(peripheral arterial occlusive disease, PAOD)에 의해 유발된 사지 허혈증(Limb ischemia)은 장골 동맥(iliac artery), 대퇴 동맥(femoral artery) 및 오금 동맥(popliteal artery) 죽상경화증의 결과로 일어날 수 있다. 혈전증(아스피린)을 저해하거나, 혈액 중 증가된 콜레스테롤 수준(스타틴), 당뇨병, 또는 고혈 압(이뇨제 및 항-고혈압제)과 같은 의학적 위험 인자들을 치료하는 약제의 광범위한 사용에도 불구하고, 죽상경화성 질환은 여전히 흔하다.
죽상경화성 질환은 동맥 벽 내에 지질의 축적, 특히, 저밀도 지질단백질(LDL) 콜레스테롤의 축적에 의해 개시된다. 포획된 LDL은 산화되고 대식세포에 의해 내재화(internalize)된다. 이는 "거품 세포(foam cell)"라 불리는, 콜레스테롤을 포식한(cholesterol-engorged) 대식세포의 축적을 포함하는 죽상경화성 병변의 형성을 유발한다. 질병이 진행되면서, 평활근 세포가 증식되고 동맥 벽으로 성장하여 지질-풍부, 괴사성 코어(lipid-rick, necrotic core)를 둘러싼 세포외 기질(extracellular matrix)의 섬유성 덮개(fibrous cap)을 형성한다. 대부분의 사람들의 생애 동안 그들의 동맥 벽에 존재하는, 섬유성 죽상경화성 플라크는 비교적 안정하다. 그와 같은 섬유성 병변은 동맥 벽의 광범위한 리모델링을 유발하고 관강 직경(luminal diameter)의 감소 또는 심장으로의 산소 전달에 대한 심각한 영향 없이 외부, 탄성 막을 외향으로 전위시킨다. 따라서, 환자들은 질병 과정의 후기까지 관강의 협착 없이 큰, 섬유성 죽상경화성 병변을 발생시킬 수 있다. 그러나, 관상동맥 관강은 시간의 경과에 따라 점진적으로 협착되고, 일부 경우에, 특히, 운동과 같은 고 요구(high demand) 상태에서 심장으로의 혈류를 저하시킬 수 있다. 이는 가역적 허혈증을 초래하여, 안정 협심증이라 불리는, 휴식에 의해 경감되는 흉통을 유발할 수 있다.
섬유성 죽상경화성 병변의 상대적 안정성과 대조적으로, 심근 경색증 및 불안정 협심증(각각 급성 관상동맥 증후군에 속함)과 연관된 원인 병변(culprit lesion)은 얇은 섬유성 덮개, 큰 지질 코어, 및 T-림프구 및 단핵세포/대식세포와 같은 염증 세포에 의한 침윤을 특징으로 한다. 비-침습적 이미징 기법이 대부분의 MI가 저-등급 또는 중-등급(intermediate-grade) 협착증을 갖는 부위에서 일어난다는 것을 보여주었으며, 이는 관상동맥 폐색은 가장 빈번하게는 원인 병변의 파열 및 이에 따른 혈전 또는 혈병의 형성 때문이고 협착증에 의한 관강 협착에서만 기인되는 것은 아니라는 것을 나타낸다. 플라크 파열은 일반적으로 대식세포가 들어가서 축적되고, 국소 염증 과정에 의해 활성화되는 병변의 가장자리에서, 섬유성 덮개의 침식 또는 불균일한 박화(thinning)에서 기인될 수 있다. 섬유성 덮개의 박화는 활성화된 대식세포로부터 방출된 단백질 분해효소에 의한 세포외 기질의 분해로부터 초래될 수 있다. 플라크 불안정성 및 MI의 위험을 초래하는 이 변화들은 조직-인자 응고촉진제(tissue-factor procoagulant) 및 혈전증의 가능성을 증가시키는 기타 인자들의 생성에 의해 강화될 수 있다.
급성 관상동맥 증후군(ACS)에서, 국소 혈전증을 동반한, 파열 또는 침식을 보이는 원인 병변은 통상적으로 관강 개방(luminal patency)을 유지하기 위해 혈관 성형술 또는 풍선 혈관성형술 및 스텐트 삽입에 의해 치료된다. ACS를 경험하는 환자들은 관상동맥 질환의 복관(multi-vessel) 속성 때문에 이차 관상동맥 사건에 대한 고 위험 상태에 있으며, 발생율(event rate)은 최초 발생 후 12 개월 내 10-14%에 이른다.
MI에 대한 최근의 견해는 이미 존재하는 만성 죽상경화성 병변 상에 있는 동맥 혈관 벽의 염증성 질환으로서, 때때로 원인 병변의 파열을 유발하고 국소 혈전 증 및 뒤이은 심근 경색증을 초래한다는 것이다. 플라크 불안정성을 초래하는 동맥 벽 염증을 유발하고 유지시키는 과정은 알려지 있지 않으나, 상기 과정은 종양 괴사 인자 알파 및 인터루킨-6의 순환으로의 방출을 초래한다. 손상된 혈관 벽으로부터 방출된 이들 및 기타 사이토카인 또는 생물학적 매개체(biological mediator)가 간에서 염증성 반응을 자극하여, C-반응성 단백질을 포함한 여러 비-특이적 전신성 염증 마커(non-specific general inflammatory marker)의 증가를 유발한다. 죽상경화증에 특이적이지는 않으나, 증가된 C-반응성 단백질(CRP) 및 혈청 아밀로이드 A는 아마도 혈관벽 염증에 대한 대리물(surrogate)로서, MI에 대한 위험을 예측하는 것으로 보인다. 다수의 전신성 염증 마커는 관상동맥 심장 질환의 위험을 예측하나, 이 마커들은 죽상경화증에 특이적이지는 않다. 예를 들면, Stein (Stein, S., Am J Cardiol , 87 (suppl):21A-26A (2001))은 관상동맥 심장 질환의 위험을 예측하기 위한 대리물로서 하기를 포함한 혈청 염증 마커의 이용을 검토한다: C-반응성 단백질(CRP), 혈청 아밀로이드 A, 피브리노겐, 인터루킨-6, 조직 괴사 인자-알파, 가용성 혈관 세포 부착 분자(soluble vascular cell adhesion molecules, sVCAM), 가용성 혈관간 부착 분자(soluble intervascular adhesion molecules, sICAM), E-셀렉틴, 매트릭스 메탈로프로테아제 타입(matrix metalloprotease type)-1, 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-2, 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-3, 및 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-9. 이 혈청 염증 마커 중 하나 이상의 증가는 관상동맥 심장 질환에 특이적이지 않으나, 연령의 증가에 따라 또는 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 비-인슐린 의존성 당뇨병(non-insulin dependent diabetes), 골관절염, 세균 감염 및 패혈증과 연관되어 발생한다.
증가된 CRP 또는 다른 혈청 염증 마커는 또한 이전에 심근 경색증을 앓았던 환자에서 제2 심근 경색증의 증가된 위험을 예후한다(Retterstol, L. et al., Atheroscler., 160: 433-440 (2002)).
흡연, 고지혈증, 고혈압, 및 당뇨병과 같은 고전적인 위험 인자들이 관상동맥 심장 질환(Coronary Heart Disease, CHD) 및 MI의 다수의 케이스와 연관되나, 다수의 환자들은 이 위험 인자들과의 관련성을 갖지 않는다. 실제로, 이 위험 인자들 중 하나 이상을 보이는 다수의 환자들은 MI를 발병하지 않는다. 가족력이 오랫 동안 주요한 위험 인자들 중 하나로 인식되어 왔다. MI의 가족적 복합성(familiar clustering) 중 일부가 다른 통상적인 위험 인자들에 대한 유전적 기여를 반영하나, 다수의 연구는 공지된 위험 인자들 외에, 상당한 유전적 감수성 인자들이 있다는 것을 시사했다(Friedlander Y, et al., Br. Heart J. 1985; 53:382-7, Shea S. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 1984; 4:793-801, and Hopkins P.N., et al., Am. J. Cardiol. 1988; 62:703-7). 주요한 유전적 감수성 인자들은 가족성 고콜레스테롤혈증(familial hypercholesterolemia)과 같은 드문 멘델형의 고지혈증에 대해 확인되었다.
집단 내의 개체들 간에 유전자의 미묘한 차이에 의해 유전적 위험이 부여된다. 유전자는 가장 빈번하게는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 때문에 상이하나, 다른 변이들도 중요하다. SNP는 인간 게놈에서 평균 1000개의 bp 당 위치한다. 따라서, 250,000 bp를 포함하는 통상적인 인간 유전자는 250개의 상이한 SNP를 포함 할 수 있다. 소수의 SNP만이 엑손에 위치하고 해당 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시킨다. 대부분의 SNP는 유전자 기능에 대해 거의 또는 전혀 효과를 갖지 않을 수 있으나, 다른 SNP들은 해당 유전자의 전사, 스플라이싱, 번역, 또는 그에 의해 코딩된 mRNA의 안정성을 변화시킬 수 있다. 인간 게놈에서 추가적인 유전적 다형성이 짧거나 긴 길이의 DNA의 삽입, 결실, 전위(translocation), 또는 역전에 의해 유발된다. 따라서, 질병 위험을 부여하는 유전적 다형성은 직접적으로 단백질의 아미노산 서열을 변화시킬 수 있거나, 해당 유전자드로부터 생성된 단백질의 양을 증가시킬 수 있거나, 또는 해당 유전자에 의해 생성된 단백질의 양을 감소시킬 수 있다.
질병의 위험을 부여하는 유전적 다형성이 발견되면서, 그와 같은 위험 인자에 대한 유전적 테스트가 임상 의학을 위해 중요해지고 있다. 예는 알쯔하이머병의 차등적 진단을 위해 치매 환자에서 apoE4 다형성의 유전적 보인자(genetic carrier)를 확인하기 위한 아포리포프로테인 E 테스트, 및 심부정맥 혈전증에 대한 소인을 위한 인자 V 돌연변이(Factor V Leiden) 테스트이다. 보다 중요하게는, 암의 치료에서, 종양 세포 내의 유전적 변이의 진단이 개별 환자를 위한 가장 적합한 치료 방법(treatment regime)을 선택하기 위해 이용된다. 유방암 환자에서, 에스트로겐 수용체 발현 또는 헤레굴린 타입 2(heregulin type 2, Her2) 수용체 티로신 키나아제 발현에서의 유전적 변이가 항-에스트로겐 약물(타목시펜) 또는 항-Her2 항체(헤르 셉틴)이 치료 계획에 포함될 것인지 여부를 결정한다. 만성 골수성 백혈병(CML)에서, Bcr 및 Ab1 수용체 티로신 키나아제를 코딩하는 유전자를 융합하는 필라델피아 염색체 유전적 전위(Philadelphia chromosome genetic translocation)의 진단은 Bcr-Abl 키나아제의 특이적 저해제인 글리벡(STI571)이 상기 암의 치료를 위해 이용되어야 한다는 것을 나타낸다. 그와 같은 유전적 변형을 갖는 CML 환자의 경우, Bcr-Ab1 키타아제의 저해는 종양 세포의 신속한 제거 및 백혈병의 완화를 가져온다.
재협착
관상동맥 풍선 혈관성형술(Coronary balloon angioplasty)은 1970년대 말에 관상동맥 질환 환자의 혈관재형성(revascularization)을 위한 관상동맥 우회 이식술(coronary artery bypass graft, CABG)보다 덜 침습적 방법으로 도입되었다. 그 이후, 제한된 혈류를 갖는 영역에 혈관을 재생하기 위한 새로운 경피 장치(percutaneous device)의 개발에 급속한 발전이 있었다. 그러나, 혈관성형술의 확대된 이용은 동맥이 이 치료법의 성공을 제한하는 증식적 과정에 의해 혈관성형술에 반응한다는 것을 보여주었다. 이 과정은 재협착으로 알려져 있다.
재협착은 동맥의 인접한 정상 세그먼트의 관강의 50% 또는 그를 초과하는, 치료된 세그먼트의 재-협착(re-narrowing)으로 정의된다. 연구 대상 환자 집단에 따라, 재협착율은 풍선 확장술에 의해 치료된 병변의 30% 내지 44%의 범위이다. 이 문제는 재협착의 위험을 최소화하는 개입적(interventional) 기법에 대한 탐색을 촉진시켰다. 여러 임상 시험이 혈관내 스텐트 삽입(endovascular stenting)에 의한 재협착율의 유의성 있는 감소를 보여주었다. 스텐트 삽입(stenting)의 목적은 방사 적 지지(radial support)를 제공하는 스카폴딩 과정(scaffolding process)에 의해 동맥 관강(arterial lumen)을 유지하는 것이다. 통상적으로 스테인레스 스틸로 제조된 스텐트가 자가-확장 메카니즘(self-expanding mechanism)에 의해, 또는 풍선 확장술을 이용하여 동맥에 삽입된다. 그러나, 스텐트내 재협착(in-stent restenosis)이 경피 경관 관상동맥 성형술(percutaneous, transluminal coronary angioplasty, PTCA)의 분야에서 환자가 반복적인 시술 및 수술을 받을 것을 요구하는 주요한 문제로 여전히 남아있다. 재협착은 콜라겐 기질(collagen matrix) 내의 평활근-유사 세포의 조성인 신생혈관 내막(neointima)의 형성의 결과이다. 스텐트내 재협착에 대한 현재의 치료 방식은 반복적 풍선 혈관성형술, 반복적 스텐트 삽입, 절단형 풍선 혈관성형술(cutting balloon angioplasty), 방향성 관상동맥 죽상종 절제술(directional coronary atherectomy), 회전 관상동맥 죽상종 절제술(rotational coronary atherectomy), 근접 치료(brachytherapy), 및 약물-용리형 스텐트(drug-eluting stent , DES) 삽입술을 포함한다. 재협착 문제는 재협착 문제는 국소적 혈관내 방사선 조사(local intravascular irradiation)(관상동맥내 근접치료) 및 DES의 도입에 의해 최소화될 수 있고, 이 치료법들은 스텐트 이식 또는 혈관성형술 후 세포 증식을 성공적으로 방지하는 것으로 입증되었다.
관상동맥내 근접 치료(Intracoronary brachytherapy)는 방사성 물질의 밀봉된 공급원(sealed source)을 죽상경화성 병변 부위에 있는 동맥 관강에 배치하는 것에 의해 매우 짧은 거리에서 방사성을 전달하기 위해 방사성 물질의 밀봉된 공급 원이 이용되는 치료법이다. 근접 치료의 물리적 잇점은 방사성의 투여량이 거의 직접적으로 표적에 전달될 수 있고 주변의 정상 조직으로의 투여량이 매우 빠르게 감소될 수 있다는 것이다. 이 치료법의 이론적 근거는 이온화 방사선이 세포 증식, 이 경우, 신생혈관 내막을 형성하는 경향이 있는 평활근 세포의 증식을 저해하는 능력에 기초한다. 가까운 장래에, 스텐트내 재협착을 가질 위험에 대해 환자들을 분류할 수 있는 것이 중요해질 것이다. 이 분류는 잠재적으로 유전적 위험 인자들에 기초하여 이루어질 수 있다. 상기 분류의 결과는 어느 치료법이 가장 적합한지 여부 및 관상동맥 우회술이 고려되어야 하는 경우를 결정할 수 있다.
동맥류(Aneurysms)
동맥 벽의 퇴행성 변화가 복부 대동맥류(AAA) 및 두개내 동맥류(IA)를 포함한, 동맥의 국소 확장, 또는 동맥류를 유발할 수 있다. 혈관 벽의 죽상경화성 변화가 대동맥벽의 현저한 약화를 초래하는, 만성 감염, 탄성 매질의 파괴적 리모델링(destructive remodelling of elastic media) 및 내측 평활근 세포(medial smooth muscle cell)의 고갈을 조직병리학적 특징으로 하는 대부분의 AAA에서 발견된다. 대조적으로, 두개내 동맥의 딸기형 동맥류(berry aneurysm)는 죽상경화증과 관련되지 않는다. 또한, IA의 조직병리학적 특징은 상이하다. 동맥 분지(arterial bifurcation)에 위치한, 두개내 동맥의 전형적인 딸기형 동맥류는 얇은 매질(media)을 갖거나 또는 매질을 갖지 않고 내부의 탄성 판(elastic lamina)이 없거나 또는 심하게 분절된다.
AAA와 IA는 일반적으로 무증상인 확장을 초래하는 동맥의 퇴행적 과정이며, 자연 경과(natural history)는 치료적 개입 또는 파열에 도달한다. IA의 파열은 지주막하 출혈(subarachnoid hemorrhage)을 초래하고, IA와 AAA의 파열은 높은 이환률 및 사망률을 갖는다. AAA의 경우에, 파열 위험은 성장 속도 및 동맥류의 크기의 증가에 따라 증가한다.
뇌동맥류(cerebral aneurysm 또는 brain aneurysm)로도 불리는, 두개내 동맥류(Intracranial aneurysm. IA)는 뇌동맥 또는 뇌정맥의 벽의 약화가 혈관의 국소적 확장 또는 풍선확장(ballooning)을 유발하는 뇌혈관 질환이다.
뇌동맥류의 일반적인 위치는 윌리스환(Circle of Willis)이라 알려진, 뇌의 기부에 있는 동맥이다. 뇌동맥류의 약 85%가 윌리스환의 앞부분에서 발생하고, 뇌의 앞 섹션과 중간 섹션에 혈액을 공급하는 내부 경동맥 및 그들의 주요 분지를 포함한다. 동맥류는 선천성 결함, 혈압 및 죽상경화증과 같은 기존의 조건, 또는 두부 외상으로부터 유발될 수 있는 것으로 사료된다. 뇌 동맥류는 아동보다 성인에서 보다 흔하게 일어나나, 모든 연령에서 일어날 수 있다.
뇌동맥류는 크기와 형태에 의해 분류된다. 소 동맥류(small aneurysm)는 15 mm 미만의 직경을 갖는다. 더 큰 동맥류(larger aneurysm)는 대형(large)(15 내지 25mm), 특대형(giant)(25 내지 50mm), 및 초특대형(super giant)(50mm 초과)으로 분류되는 동맥류를 포함한다. 낭형 동맥류(saccular aneurysm)는 낭형 돌출(saccular outpouching)을 갖는 동맥류이고 뇌동맥류의 가장 흔한 형태이다. 딸기형 동맥류는 딸기를 닮은 목 또는 줄기를 갖는 낭형 동맥류이다. 방추형 동맥 류(Fusiform aneurysm)는 줄기가 없는 동맥류이다.
소형의, 변하지 않는 동맥류는 증상을 생성하지 않을 것이다. 보다 큰 동맥류 파열 전에, 개체는 급성의 매우 심각한 두통, 오심, 시각 손상, 구토, 및 의식 상실과 같은 증상을 경험할 수 있거나, 개체는 무증상이어서, 증상을 전혀 경험하지 않을 수 있다. 발병은 일반적으로 돌발성이고 경고가 없다. 뇌동맥류의 파열은 위험하고, 일반적으로 수막 또는 뇌 자체로의 출혈을 초래하여, 뇌졸중이 되는 지주막하 출혈(SAH) 또는 두개내 혈종(intracranial hematoma, ICH)을 가져온다. 재출혈, 수두증(뇌척수액의 과도한 축적), 혈관경련(혈관의 경련 또는 협착(narrowing)), 또는 다발성 동맥류가 발생할 수 있다. 비파열 뇌동맥류(unruptured cerebral aneurysm)로부터의 파열의 위험은 동맥류의 크기에 따라 변하며, 그 위험은 동맥류의 크기가 증가되면서 커진다. 동맥류 파열의 전체 발생율(overall rate)은 년간 1.3%로 추정된다. 단기 재-파열(short term re-rupture)의 위험은 동맥류의 출혈 후 크게 증가하며, 약 6주 후에 그 위험은 기준수준(baseline)으로 복귀된다.
파열된 뇌동맥류를 갖는 개체의 응급 치료법은 일반적으로 악화되는 호흡을 회복시키고 두개내 압력을 저하시키는 것을 포함한다. 현재, 뇌동맥류에 대해 두 개의 치료 옵션이 있다: 외과수술에 의한 결찰(surgical clipping) 또는 혈관내 코일링(endovascular coiling). 외과수술에 의한 결찰 또는 혈관내 코일링은 통상적으로 파열된 동맥류를 교합하고 재출혈의 위험을 감소시키기 위해 최초 3일 내에 수행된다.
파열된 뇌동맥류를 갖는 환자의 예후는 동맥류의 정도 및 위치, 환자의 연령, 전반적인 건강, 및 신경학적 상태에 의존적이다. 파열된 뇌동맥류를 갖는 일부개체들은 초기 출혈로 사망한다. 뇌동맥류를 갖는 다른 개체들은 신경학적 결함이 거의 또는 전혀 없는 상태로 회복된다. 결과를 결정하는 가장 중요한 인자는 동맥류의 중증도 및 연령이다.
복부 대동맥류(AAA)는 정상 직경을 50% 이상 초과하는, 복부 대동맥의 국소적 확장이다. 신장하 대동맥(infrarenal aorta)의 정상 직경은 2 cm이다. 이는 대동맥 벽의 퇴행성 과정에 의해 유발된다. 동맥류는 가장 흔하게는 신장하(infrarenally)에 존재하고(90%), 다른 가능한 위치는 신장위(suprarenal) 및 신장주위(pararenal)이다. 동맥류는 장골 동맥 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 대동맥류는 또한 흉곽에서 일어날 수 있다.
AAA는 아프리카인, 아프리카계 미국인, 아시아인 및 히스패닉계의 개인에서는 드물다. 빈도는 여성과 남성 간에 크게 변한다. 최고 발생율(peak incidence)은 남성의 경우 약 70세이고, 60세 이상 남성에서 유병율은 2-6%이다. 빈도는 비흡연자보다 흡연자에서 훨씬 더 높다(8:1). 기타 위험 인자들은 고혈압 및 남성이다. 미국에서, AAA의 발병율은 성인 집단에서 2-4%이다. AAA의 파열은 65세 이상의 남성에서 1-3%이고, 사망율은 70-95%이다.
퇴행성 과정의 정확한 원인은 명확하지 않다. 공지된 위험 인자들은 유전적 인자, 혈류역학적 영향(hemodynamic influence), 죽상경화증, 및 감염, 외상, 결합 조직 장애, 동맥염 등과 같은 다양한 다른 인자들을 포함한다. AAA는 일반적으로 그들의 크기 및 증상에 따라 분류된다. 동맥류는 통상적으로 측정된 외부 대동맥 직경이 3 cm를 넘을때 존재하는 것으로 간주된다(대동맥의 정상 직경은 약 2 cm이다). 자연 경과(natural history)는 시간의 경과에 따라 직경을 증가시키고, 뒤이어 궁극적으로 증상(통상적으로 파열)의 발생으로 이어진다. 외부 직경이 5 cm를 초과하는 경우, 동맥류는 큰 것으로 간주된다. 5 cm 미만의 동맥류의 경우, 파열의 위험이 낮아서, 수술 위험이 통상적으로 파열의 위험을 초과한다. 따라서, 5 cm 미만의 동맥류는 그들이 치료를 정당화하거나, 또는 증상을 발생시킬 정도로 충분히 클 때까지 관리 하에 유지된다. 대다수의 동맥류는 무증상이다. 파열의 위험은 증후성 동맥류(symptomatic aneurysm)에서 높고, 따라서, 수술의 징후로 간주된다. 가능한 증상은 요통(low back pain), 측복부통, 복통, 서혜부 통증(groin pain), 또는 박동성 복부 소괴(pulsating abdominal mass)를 포함한다. 합병증은 파열, 말초혈관 색전증(peripheral embolisation), 급성 동맥 폐색증, 대동정맥루, 또는 대동맥-십이지장루(aortoduodenal fistulae)를 포함한다. 신체 검사 후에, 촉지성 복부 소괴(palpable abdominal mass)가 주목될 수 있다. 신장 동맥 협착증 또는 내장 동맥 협착증의 경우에, 잡음(bruit)이 존재할 수 있다.
무증상 AAA를 위한 주요한 치료 옵션은 궁극적인 치유를 목적으로 한 즉각적인 치유 및 관리(surveillance)이다. 관리는 치유의 위험이 파열의 위험을 초과하는 경우인 소 동맥류(small aneurysm)에 지시된다. AAA가 직경이 증가되면서, 파열의 위험이 증가된다. 전세계적으로 일부 논란이 있으나, 대부분의 혈관 외과의들은 동맥류가 5 cm의 직경에 도달할 때까지는 치료를 고려하지 않는다. 치료를 위한 역치(threshold)는 치료 대비 지속적인 관리를 고려할 때 위험과 잇점의 균형에 따라, 개인간에 약간 다르다. 개인의 원래 대동맥(native aorta)의 크기 및, 수술 위험도(operative risk)를 증가시키거나 또는 기대 수명을 감소시키는 병존이환율(comorbidity)d 이것에 영향을 미칠 수 있다. 현재, AAA를 위한 이용가능한 주요 치료 방식은 OR(open aneurysm repair), 및 혈관내 동맥류 치료(endovascular aneurysm repair, EVAR)이다. 개심 치료(open repair)는 젊은 환자들에서, 또는 성장하는 동맥류, 또는 대형 동맥류(large aneurysm), 징후적 동맥류 또는 파열된 동맥류에서 선택적 시술(elective procedure)로 지시된다. 개심 치료는 1950년대부터 최근까지 개입의 주류였다. 혈관내 치료는 1990년대에 최초로 실용화되었고, 현재 개심 치료에 대한 확립된 대안이나, 그 역할은 명확하게 정의되지 않았다. 혈관내 치료는 일반적으로 개심 치료에 적합하지 않은 보다 장년층의 고-위험 환자들에서 지시된다. 그러나, 혈관내 치료는 동맥류의 형태에 따라, 일부 AAA에만 적용가능하다. 개심 치료 대비 주요 장점은 수술-주위 기간(peri-operative period)이 환자에게 더 적은 영향을 미친다는 것이다.
뇌졸중
뇌졸중은 여러 병태생리적 메카니즘을 포함하는 다양한 질환의 군이다. 뇌졸중의 임상적 표현형은 복합적이나 크게 허혈성 뇌졸중과 출혈성 뇌졸중으로 분류된다. 뇌졸중 사건의 대다수, 약 80%는 대뇌동맥이 완전히 폐쇄되고 뇌의 일부로의 혈액 공급이 (혈전증 또는 색전증 때문에) 완전히 또는 부분적으로 차단되는 때 발생하는 허혈(뇌경색증) 때문이다. 허혈성 뇌졸중은 대동맥 질환(large artery disease, LAA)(주혈관 질환(LVD)로도 지칭됨), 심장색전성 뇌졸중(cardioembolic stroke) 및 소혈관 질환(small vessel disease)으로 더 분류된다. 허혈성 뇌졸중 사건의 약 25%는 뇌에 혈액을 공급하는 두 쌍의 대동맥인 경동맥과 척추동맥의 대-동맥 질환 때문이다. 대-동맥 질환의 가장 일반적인 원인은 죽상경화증이다. 심장색전성 뇌졸중은 심장 내에서 기원하는 색전증에 의해 유발된다. 심장 기원의 색전증이 허혈성 뇌졸둥의 약 1/4을 차지한다. 심장색전증에 의한 뇌졸중은 일반적으로 중증이고 조기 및 장기적 재발생 가능성이 높다. 허혈성 심장 질환, 류마티스성 승모판 협착증, 및 인공 심장판막 삽입물이 심장색전성 뇌졸중의 주요 원인이나, 심방세동이 가장 일반적인 원인이다.
심혈관 질환의 위험(증가된 위험 및 감소된 위험)을 부여하는 유전적 변이를 이해하는 것에 대한 지속적이고 큰 요구가 있다. 본 발명은 MI, 관상동맥 질환(CAD), 두개내 동맥류(IA), 복부 대동맥류(AAA), 말초 동맥 질환(PAD) 및 재협착을 포함한, 심혈관 질환에 대한 감수성과 연관된 것으로 확인된 유전적 변이를 제공한다. 이 변이들은 심혈관 질환의 치료적 개입을 위한 위험 관리 및 방법에서 유용하다.
발명의 요약
본 발명은 관상동맥 질환, 심근 경색증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 재협착, 두개내 동맥류 및 복부 대동맥류를 포함한, 심혈관 질환에 대한 감수성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 심혈관 질환에 대한 감수성과 연관된 것으로 확인된 특정한 다형성 마커 및/또는 일배체형의 평가에 기반한 심혈관 질환에 대한 감수성의 결정에서 유용한 다양한 용도, 키트, 절차 및 장치에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 개인으로부터 수득된 핵산 시료 또는 상기 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트(genotype dataset)에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 개인에서 심혈관 질환에 대한 감수성을 결정하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10에 표시된 마커들 및 이들과 연관 불균형(linkage disequilibrium)인 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립형질의 존재는 심혈관 질환에 대한 감수성을 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재의 결정에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 상기 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재의 결정에 관한 것이다. 유전형 데이터세트는 주형인 특정한 핵산 시료에 대한 정보가 유전적 정보가 유래되는 개인에 대한 것이라는 점에서 상기 개인으로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 개인에서 심혈관 질환에 대한 감수성을 결정하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 LD 블럭 C09 (서열번호 94)와 연관된 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재의 결정이 심혈관 질환에 대한 감수성을 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 3에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된다.
대안적인 양태에서, 본 발명은 개인으로부터 수득된 핵산 시료 또는 상기 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트(genotype dataset)에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 개인에서 심혈관 질환에 대한 감수성을 진단하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 LD 블럭 C09와 연관된 마커들의 군으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립형질의 존재가 심혈관 질환에 대한 감수성을 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 연관 불균형은 특정한 마커가 LD 블럭 C09와 연관된 정도의 정량적 척도로 이용된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트에 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 위험 대립형질(at-risk allele)이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 개인에서 심혈관 질환에 대한 감수성을 결정하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 LD 블럭 C09 (서열번호 94) 내의 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 위험 대립형질의 존재의 결정은 상기 개인에서 심혈관 질환에 대한 증가된 감수성을 표시하는 것인 방법에 관한 것이다.
상기 유전형 데이터세트는 일 구체예에서, 마커 정체성(marker identity), 및 상기 개인의 대립형질 상태(allelic status)에 대한 정보, 즉, 상기 마커에 대해 개인이 가진 두 개의 대립형질의 정체성에 대한 정보를 포함한다. 유전형 데이터세트는 두개 이상의 마커, 세개 이상의 마커, 다섯개 이상의 마커, 백개 이상의 마커 등을 포함한, 하나 이상의 마커에 대한 대립형질 정보(allelic informaton)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 유전형 데이터세트는 수십만개의 마커, 또는 심지어 백만개 이상의 마커를 포함하는 개인의 전체-게놈(whole-genome) 평가로부터의 유전형 정보를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 서열번호 94로 표시된 뉴클레오티드 서열을 갖는, 게놈 세그먼트 LD 블럭 C09 내에 존재한다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs7041637, rs2811712, rs3218018, rs3217992, rs2069426, rs2069422, rs1333034, rs1011970, rs10116277, rs1333040, rs2383207, rs1333050, D9S1814, rs10757278, rs10757274, rs1333049, D9S1870, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs10757278, rs10757274, 및 rs10333049, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 3에 표시된 마커들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커와, 0.8보다 큰 |D'| 및/또는 0.2보다 큰 r2의 수치값에 의해 정의되는 강한 연관 불균형인 하나 이상의 마커를 포함한다. .
일 구체예에서, 심혈관 질환의 감수성을 결정하거나 또는 심혈관 질환의 감수성을 진단하는 방법은 상기 개인에서 하나 이상의 일배체형의 빈도를 평가하는 단계를 더 포함한다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 상기 하나 이상의 일배체형은 게놈 세그먼트 LC 블럭 C09(서열번호 94) 내에 하나 이상의 다형성 마커를 포함하는 일배체형으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 일배체형은 표 3에 표시된 하나 이상의 마커와 연관 불균형인 일배체형으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 일배체형은 rs7041637, rs2811712, rs3218018, rs3217992, rs2069426, rs2069422, rs1333034, rs1011970, rs10116277, rs1333040, rs2383207, rs1333050, D9S1814, rs10757278, rs10757274, rs1333049, D9S1870, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된 하나 이상의 다형성 마커를 포함하는 일배체형으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트에 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 위험 대립형질이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 개인에서 심혈관 질환에 대한 감수성을 결정하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 3에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 위험 대립형질의 존재의 결정은 상기 개인에서 심혈관 질환에 대한 증가된 감수성을 표시하는 것인 방법에 관한 것이다. 상기 유전형 데이터세트는 일 구체예에서, 마커 정체성, 및 상기 개인의 대립형질 상태에 대한 정보, 즉, 상기 마커에 대해 개인이 가진 두 개의 대립형질의 정체성에 대한 정보를 포함한다. 유전형 데이터세트는 두개 이상의 마커, 세개 이상의 마커, 다섯개 이상의 마커, 백개 이상의 마커 등을 포함한, 하나 이상의 마커에 대한 대립형질 정보을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 유전형 데이터세트는 수십만개의 마커, 또는 심지어 백만개 이상의 마커를 포함하는 개인의 전체-게놈 평가로부터의 유전형 정보를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 본 명세서에 표시된 바와 같은 서열번호 94 내에 존재한다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs7041637, rs2811712, rs3218018, rs3217992, rs2069426, rs2069422, rs1333034, rs1011970, rs10116277, rs1333040, rs2383207, rs1333050, D9S1814, rs10757278, rs10757274, rs1333049, D9S1870, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 3에 표시된 마커들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커와, 0.8 보다 큰 |D'| 및/또는 0.2 보다 큰 r2의 수치값에 의해 정의된 강한 연관 불균형인 하나 이상의 마커를 포함한다. 하나의 바람직한 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs10757278, rs10757274, 및 rs1333049, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 마커 rs10757278, rs10757274, 및 rs1333049로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 LD 블럭 C09(서열번호 94)와 연관된 마커들로부터 선택된다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 LD 블럭 C09(서열번호 94) 내의 하나 이상의 다형성 마커와 연관 불균형이다.
일 구체예에서, 심혈관 질환의 감수성을 결정하거나 또는 심혈관 질환의 감수성을 진단하는 방법은 상기 개인에서 하나 이상의 일배체형의 빈도를 평가하는 단계를 더 포함한다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 상기 하나 이상의 일배체형은 표 10에 표시된 하나 이상의 다형성 마커, 및 이들과 연관 불균형인 다형성 마커를 포함하는 일배체형으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 일배체형은 표 3에 표시된 하나 이상의 다형성 마커, 및 이들과 연관 불균형인 다형성 마커를 포함하는 일배체형으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 일배체형은 rs7041637, rs2811712, rs3218018, rs3217992, rs2069426, rs2069422, rs1333034, rs1011970, rs10116277, rs1333040, rs2383207, rs1333050, D9S1814, rs10757278, rs10757274, rs10333049, D9S1870, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된 하나 이상의 다형성 마커를 포함하는 일배체형으로부터 선택된다.
본 발명의 특정한 구체예에서, 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료 내에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 위험 대립형질(at-risk allele)의 존재의 결정은 심혈관 질환에 대한 증가된 감수성을 나타낸다. 일 구체예에서, 상기 증가된 감수성은 1.15 이상의 상대적 위험도(relative risk, RR) 또는 오즈비(odds ratio, OR)를 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 상기 증가 감수성은 1.20 이상의 오즈비(OR) 또는 상대적 위험도(RR)를 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 상기 증가 감수성은 1.30 이상의 오즈비(OR) 또는 상대적 위험도(RR)를 특징으로 한다.
일부 구체예에서, rs7041637 대립형질 A, rs2811712 대립형질 A, rs3218018 대립형질 A, rs3217992 대립형질 A, rs2069426 대립형질 C, rs2069422 대립형질 A, rs1333034 대립형질 A, rs1011970 대립형질 G, rs10116277 대립형질 T, rs1333040 대립형질 T, rs2383207 대립형질 G, rs1333050 대립형질 T, D9S1814 대립형질 0, rs10757278 대립형질 G, rs1333049 대립형질 C, rs10757274 대립형질 G, 및/또는 D9S1870 대립형질 X (2보다 작은 모든 대립형질의 복합 대립형질(composite allele of all alleles smaller than 2))의 존재는 심혈관 질환의 증가된 감수성을 나타낸다.
특정한 구체예에서, 개인으로부터의 핵산 시료에서 하나 이상의 보호성 대립형질(protective allele)의 존재는 심혈관 질환의 감소된 감수성을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 개인으로부터의 핵산 시료에서 하나 이상의 위험 대립형질의 부재는 심혈관 질환의 감소된 감수성을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 양태는 인간 집단에서 심혈관 질환의 증가된 발생과 상관된, 게놈 내의 서열번호 94로 표시된 서열을 갖는 게놈 세그먼트 내의 하나 이상의 다형성 마커 또는 일배체형에 대해 개인으로부터의 핵산을 스크리닝하는 단계를 포함하는, 개인에서 심혈관 질환에 대한 감수성을 평가하는 방법으로서, 상기 핵산에서 상기 하나 이상의 다형성의 위험 마커 대립형질 또는 위험 일배체형의 존재는 상기 개인이 심혈관 질환에 대한 증가된 감수성을 갖는 것으로 확인하고, 상기 핵산에서 상기 하나 이상의 위험 마커 대립형질 또는 위험 일배체형의 부재는 상기 개인이 증가된 감수성을 갖지 않는다는 것을 확인하는 것인 방법에 관한 것이다.
하나의 그와 같은 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커 또는 일배체형은 표 10에 표시된 마커, 및 이들과 연관 불균형인 다형성 마커들로부터 선택된 하나 이상의 다형성 마커를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커 또는 일배체형은 표 3에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 다형성 마커들로부터 선택된 하나 이상의 다형성 마커를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커 또는 일배체형은 마커 rs7041637, rs2811712, rs3218018, rs3217992, rs2069426, rs2069422, rs1333034, rs1011970, rs10116277, rs1333040, rs2383207, rs1333050, D9S1814, rs10757278, rs10757274, rs10333049, D9S1870, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된 하나 이상의 다형성 마커를 포함한다. 특정한 구체예에서, 연관 불균형은 0.8 보다 큰 |D'| 및/또는 0.2보다 큰 r2의 수치값을 특징으로 한다.
본 발명의 특정한 구체예는 LD 블럭 C09 (서열번호 94)와 연관되지 않은 심혈관 질환에 대한 하나 이상의 위험 유전적 변이(at-risk genetic variant)의 존재에 대해 핵산을 스크리닝하는 단계를 더 포함한다. 그와 같은 추가적인 유전적 변이는 특정한 구체예에서 심혈관 질환에 대한 감수성 또는 위험 변이로 확인된 변이를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 심혈관 질환과 연관된 것으로 확인되고, 따라서, 심혈관 질환에 대한 감수성을 결정하는데 유용한 마커 또는 일배체형의 존재는 심혈관 질환의 특정한 치료 방식에 대한 개체의 상이한 반응율(response rate)을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개인에서 심혈관 질환에 대한 감수성을 평가하기 위한 마커를 확인하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
LD 블럭 C09 (서열번호 94) 내의 하나 이상의 마커와 연관 불균형인 하나 이상의 다형성 마커를 확인하는 단계,
심혈관 질환으로 진단되거나 또는 심혈관 질환에 대한 감수성을 갖는 개인의 시료의 유전형 상태(genotype status)를 결정하는 단계, 및
대조군 개인의 시료의 유전형 상태를 결정하는 단계를 포함하고,
상기 대조군 시료에서의 하나 이상의 대립형질의 빈도와 비교하여, 심혈관 질환으로 진단되거나, 또는 심혈관 질환에 대한 감수성을 갖는 개인에서 상기 하나 이상의 다형성의 하나 이상의 대립형질의 빈도의 유의성 있는 차이는 상기 하나 이상의 다형성이 심혈관 질환에 대한 감수성을 평가하기 위해 유용하다는 것을 나타낸다.
일 구체예에서, "유의성(significant)"은 통계적 수단에 의해 결정되며, 예를 들면, 차이가 통계적으로 유의성이 있다는 것이다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 통계적 유의성은 0.05 미만의 P-값을 특징으로 한다. 다른 구체예에서, 통계적 유의성은 0.01 미만, 0.001 미만, 0.0001 미만, 0.00001 미만, 0.000001 미만, 0.0000001 미만, 0.00000001 미만 또는 0.0000000001 미만의 P-값을 특징으로 한다.
일 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 21에 표시된 마커들로부터 선택된 하나 이상의 마커와, 0.2보다 큰 r2 및/또는 0.8 보다 큰 |D'|의 수치값을 특징으로 하는 연관 불균형에 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 마커 rs10757278, rs10757274, 및 rs1333049로부터 선택된 하나 이상의 마커와, 0.2보다 큰 r2 및/또는 0.8 보다 큰 |D'|의 수치값을 특징으로 하는 연관 불균형에 있다.
일 구체예에서, 대조군 시료에서의 하나 이상의 다형성의 하나 이상의 대립형질의 빈도에 비해, 심혈관 질환으로 진단되거나 또는 심혈관 질환에 대한 감수성을 갖는 개인에서 상기 하나 이상의 다형성의 하나 이상의 대립형질의 빈도의 증가는 상기 하나 이상의 다형성이 심혈관 질환에 대한 증가된 감수성을 평가하기에 유용하다는 것을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 대조군 시료에서의 하나 이상의 다형성의 하나 이상의 대립형질의 빈도에 비해, 심혈관 질환으로 진단되거나 또는 심혈관 질환에 대한 감수성을 갖는 개인에서 상기 하나 이상의 다형성의 하나 이상의 대립형질의 빈도의 감소는 상기 하나 이상의 다형성이 심혈관 질환에 대한 감소된 감수성, 또는 심혈관 질환에 대한 보호를 평가하기에 유용하다는 것을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 양태는 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 개인으로부터 수득된 핵산 시료의 유전형을 분석하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 마커는 표 3 및 표 21에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 다형성 마커의 상기 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재의 결정은 심혈관 질환의 감수성을 예측하는 것인 방법에 관한 것이다.
일 구체예에서, 유전형 분석(genotyping)은 상기 하나 이상의 다형성 마커를 포함하는 핵산의 세그먼트를 상기 하나 이상의 다형성 마커를 플랭킹(flanking)하는 뉴클레오티드 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 유전형 분석은 대립형질-특이적 프로브 혼성화, 대립형질-특이적 프라이머 연장(primer extension), 대립형질-특이적 증폭, 핵산 서열결정(nucleic acid sequencing), 5'-엑소뉴클레아제 처리(exonuclease digestion), 분자 표지 분석법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석, 및 단일 가닥 구조 분석(single-stranded conformation analysis)으로부터 선택된 방법을 이용하여 수행된다. 일 구체예에서, 상기 방법은 대립형질-특이적 프로브 혼성화를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 DNA 서열결정을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은:
1) 상기 핵산의 카피를 검출 올리고뉴클레오티드 프로브 및 인핸서 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 올리고뉴클레오티드와 상기 핵산 간의 특이적 혼성화(specific hybridization) 조건 하에 접촉시키는 단계로서,
a) 상기 검출 올리고뉴클레오티드 프로브는 길이가 5 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성되고 하나 이상의 다형성 부위를 포함하는 서열번호 94에 의해 주어진 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 제1 세그먼트에 특이적으로 결합하고,
b) 상기 검출 올리고뉴클레오티드 프로브는 3' 말단의 검출가능한 표지 및 5' 말단의 퀀칭 모이어티(quenching moiety)를 포함하며,
c) 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드는 길이가 5 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성되고 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 5'에 배열된 상기 뉴클레오티드 서열의 제2 세그먼트에 상보적이어서, 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드는 상기 두 개의 올리고뉴클레오티드가 상기 핵산에 혼성화되는 경우 상기 검출 올리고뉴클레오티드에 대해 3' 에 위치하며, 및
d) 상기 제1 세그먼트와 상기 제2 세그먼트 간에 단일 염기 갭(single base gap)이 존재하여, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드 프로브가 모두 상기 핵산에 혼성화되는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드 간에 단일 염기 갭이 존재하는 것인 단계,
2) 상기 검출 프로브가 상기 핵산에 혼성화되는 경우, 상기 검출 프로브의 3' 말단으로부터 상기 검출가능한 표지를 절단하여 유리된 검출가능한 표지를 방출시키는 엔도뉴클레아제로 상기 핵산을 처리하는 단계, 및
3) 유리된 검출가능한 표지를 측정하는 단계로서, 상기 유리된 검출가능한 표지의 존재는 상기 검출 프로브가 상기 핵산의 제1 세그먼트에 특이적으로 혼성화된다는 것을 표시하고, 상기 다형성 부위의 서열이 상기 검출 프로브의 상보체(complement)라는 것을 표시하는 것인 단계를 포함한다.
특정한 구체예에서, 핵산의 카피는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 증폭에 의해 제공된다. 또 다른 구체예에서, 결정된 감수성은 증가된 감수성이다. 또 다른 구체예에서, 증가된 감수성은 감소된 감수성이다.
본 발명의 또 다른 양태는 심혈관 질환과 연관된 증상을 예방 및/또는 개선시키기 위한 치료제에 대한 반응의 확률에 대해 개인을 평가하는 방법으로서, 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 21에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 마커의 상기 하나 이상의 대립형질의 존재의 결정은 상기 심혈관 질환 치료제에 대한 양성 반응의 확률을 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 마커 rs1333040, rs10116277, rs2383207 및 rs10757278, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된다. 일 구체예에서, 상기 치료제는 베타 차단제, 헤파린 및/또는 저분자량 헤파린을 포함한, 항응고제, 클로피도그렐과 같은 항혈소판제, 아스피린, 메토프롤롤(metoprolol) 및 카르베딜롤(carvedilol)을 포함한 베타 차단제, ACE 억제제, 스타틴, 에플레레논(eplerenone)을 포함한, 알도스테론 길항제, 류코트리엔 합성 저해제, 작용제 표(Agent Table) I, 작용제 표 II에 표시된 작용제, (R)-(+)-알파-시클로펜틸-4-(2-퀴놀리닐메톡시)-벤젠아세트산, 아트렐레우톤(atreleuton), 및 DG-051로도 알려진, 4-{(S)-2-[4-(4-클로로-페녹시)-페녹시메틸]-피롤리딘-1-일}-부티라미드로부터 선택된다. 다른 구체예는 심혈관 질환의 치료적 개입(therapeutic intervention)을 위해 유용한 것으로 본 명세서에 기재된 치료제 중 하나 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 심혈관 질환으로 진단된 개인의 예후(prognosis)를 예측하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs1333040, rs10116277, rs2383207 및 rs10757278, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립형질의 존재의 결정은 상기 개인에서 심혈관 질환의 악화된 예후를 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 특정한 구체예에서, 예후는 재발성 MI 사건(event), 재발성 뇌졸중 사건에 대한 감수성, 또는 심혈관 질환과 관련된 기타 합병증에 대한 감수성에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 심혈관 질환의 치료를 받는 개인의 치료의 진행을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs1333040, rs10116277, rs2383207 및 rs10757278, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립형질의 존재의 결정이 상기 개인의 치료 결과를 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 상기 치료는 외과수술적 치료일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 치료는 본 명세서에서 더 설명되는 바와 같이, 생활방식의 변화, 심혈관 질환에 대한 위험 인자들에 대한 환경적 노출의 변화를 선택적으로 포함한, 치료제의 투여에 의한 것이다.
일 구체예에서, 상기 방법은 상기 개인으로부터의 시료에서 하나 이상의 바이오마커를 평가하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 바이오마커는 심장 마커(cardiac marker) 또는 염증 마커(inflammatory marker)이다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 바이오마커는 크레아틴 키나아제, 트로포닌, 글리코겐 포스포릴라아제, C-반응성 단백질(C-reactive protein, CRP), 혈청 아밀로이드 A, 피브리노겐, 인터루킨-6, 조직 괴사 인자-알파(tissue necrosis factor-alpha), 가용성 혈관 세포 부착 분자(soluble vascular cell adhesion molecule, sVCAM), 가용성 혈관간 부착 분자(soluble intervascular adhesion molecule, sICAM), E-셀렉틴, 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-1(matrix metalloprotease type-1), 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-2, 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-3, 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-9, 혈청 sCD40L, 류코트리엔, 류코트리엔 대사산물(leukotriene metabolite), 인터루킨-6, 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase, MPO), 및 N-티로신으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 상기 류코트리엔은 LTB4, LTC4, LTD4 및 LTE4로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 상기 개인의 위험 평가, 진단 또는 예후를 판단하기 위해 비-유전적 정보를 분석하는 단계를 더 포함한다. 일 구체예에서, 상기 비-유전적 정보는 연령, 성별, 민족, 사회경제적 지위, 과거 질병 진단, 개인의 병력(medical history), 심혈관 질환의 가족력(family history), 생화학적 척도, 및 임상적 척도로부터 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, 전체 위험도(overall risk)를 계산하는 추가적인 단계가 이용된다.
본 발명의 또 다른 양태는 개인으로부터 수득된 게놈 DNA를 포함하는 시료 또는 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트를 대상으로 표 10에 표시된 마커와 연관 불균형이 아닌, 심혈관 질환에 대한 하나 이상의 위험 변이의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재에 대해 분석하는 것에 관한 것이다. 따라서, 심혈관 질환과 연관된 것으로 본 명세서에 기재된 변이는 본 명세서에 기재된 마커와 유전적으로 관련되지 않은(즉, 연관 불균형이 아닌), 심혈관 질환에 대한 다른 유전적 변이와 조합될 수 있다. 그와 같은 분석은 본 명세서에 기재된 임의의 방법과 조합되어 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 심혈관 질환과 연관된 것으로 기재된 두개의 마커, 또는 마커 및/또는 일배체형의 조합이 심혈관 질환에 대한 증가된 감수성을 평가하기 위해 조합될 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 구체예에서, 개인의 위험도 평가, 진단, 또는 예후의 판단을 수행하기 위해 비-유전적 정보가 분석된다. 특정 구체예에서, 비-유전적 정보는 연령, 성별, 민족, 사회경제적 지위, 과거 질병 진단, 개인의 병력, 심혈관 질환의 가족력, 생화학적 척도, 및 임상적 척도로부터 선택된다. 통합 위험도(combined risk)를 생성하기 위해, 통합된 유전적 인자 및/또는 유전적 인자와 비-유전적 인자의 조합이 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다.
본 발명은 또한 개인에서 심혈관 질환에 대한 감수성을 평가하기 위한 키트로서, 상기 키트는 상기 개인의 게놈에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재를 선택적으로 검출하는 시약을 포함하고, 상기 다형성 마커는 표 10에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립형질의 존재는 심혈관 질환에 대한 감수성을 나타내는 것인 키트에 관한 것이다.
일 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 서열번호 94로 표시된 서열을 갖는 게놈 세그먼트 내에 존재한다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 21에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들의 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs1333040, rs10116277, rs2383207 및 rs10757278, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 시약은 상기 하나 이상의 다형성 마커를 포함하는 상기 개인의 게놈의 단편에 혼성화하는 하나 이상의 연속된(contiguous) 올리고뉴클레오티드, 완충액 및 검출가능한 표지를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 시약은 상기 개인으로부터 수득된 게놈 핵산 세그먼트의 반대쪽 가닥에 혼성화하는 한 쌍 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 각 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 하나의 다형성 마커를 포함하는 상기 개인의 게놈의 단편을 선택적으로 증폭시키도록 설계되고, 상기 단편은 크기가 30 bp 이상이다. 특정한 구체예에서, 상기 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 상기 개인의 게놈에 완전히 상보적이다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 상기 개인의 게놈에 대해 하나 이상의 불일치(mismatch)를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 약 18개 내지 약 50개의 뉴클레오티드로 구성된 길이이다. 또 다른 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 20 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성된 길이이다.
하나의 바람직한 구체예에서, 상기 키트는,
길이가 5 내지 100 개의 뉴클레오티드로 구성된 검출 올리고뉴클레오티드 프로브; 길이가 5 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성된 인핸서 올리고뉴클레오티드 프로브; 및 엔도뉴클레아제 효소;를 포함하고,
상기 검출 올리고뉴클레오티드 프로브는 하나 이상의 다형성 부위를 포함하는 서열번호 94로 표시된 뉴클레오티드 서열의 핵산의 제1 세그먼트에 특이적으로 혼성화되고; 및 상기 검출 올리고뉴클레오티드 프로브는 3' 말단에 검출가능한 표지를 포함하고 5' 말단에 퀀칭 모이어티를 포함하며; 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드는 길이가 5개 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성되고, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 5'에 배열된 뉴클레오티드 서열의 제2 세그먼트에 상보적이어서, 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드는 상기 두개의 올리고뉴클레오티드가 모두 상기 핵산에 혼성화되는 경우 상기 검출 올리고뉴클레오티드에 대해 3'에 위치하며; 및 상기 제1 세그먼트와 상기 제2 세그먼트 간에 단일 염기 갭이 존재하여, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드 프로브가 모두 상기 핵산에 혼성화되는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드 간에 단일 염기 갭이 존재하며; 및 상기 핵산을 상기 엔도뉴클레아제에 의해 처리하는 단계는 상기 검출 프로브가 상기 핵산에 혼성화된 경우, 상기 검출 프로브의 3'말단으로부터 상기 검출가능한 표지를 절단하여 유리 상태의 검출가능한 표지를 방출시킨다.
본 발명의 또 다른 양태는 개인에서 심혈관 질환에 대한 감수성을 진단 및/또는 평가하기 위한 진단 시약의 제조에서 올리고뉴클레오티드 프로브의 용도로서, 상기 프로브는 하나 이상의 다형성 부위를 포함하는, 서열번호 94에 의해 주어진 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 세그먼트에 혼성화되고, 상기 단편은 길이가 15 내지 500개의 뉴클레오티드로 구성되는 것인 용도에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 다형성 부위는 다형성 마커 rs1333040, rs10116277, rs2383207 및 rs10757278, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 다형성 마커에 대한 식별자(identifier); 심혈관 질환으로 진단된 복수의 개인에서 상기 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 빈도의 지표(indicator); 및 복수의 기준 개인(reference individual)에서 상기 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 빈도의 지표;가 저장되고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10에 표시된 다형성 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 다형성으로부터 선택되는 것인 컴퓨터-판독가능한 매체(computer-readable medium)에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs1333040, rs10116277, rs2383207 및 rs10757278, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태는 개인에서 심혈관 질환(Type 2 diabetes)에 대한 유전적 지표(genetic indicator)를 결정하는 장치로서, 컴퓨터 판독가능한 메모리; 및 상기 컴퓨터 판독가능한 메모리 상에 저장된 루틴(routine)을 포함하고, 상기 루틴은 표 10에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 마커에 대해 하나 이상의 개인의 유전형 및/또는 일배체형 정보를 분석하고, 상기 마커 또는 일배체형 정보에 기반한 결과물(output)을 생성하기 위해 프로세서 상에서 실행되도록 개조되고, 상기 결과물은 상기 개인의 심혈관 질환의 유전적 지표로서 상기 하나 이상의 마커 또는 일배체형의 위험도 척도(risk measure)를 포함하는 것인 장치에 관한 것이다.
일 구체예에서, 상기 루틴은 심혈관 질환으로 진단된 복수의 개인에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질 또는 하나 이상의 일배체형의 빈도의 지표, 및 복수의 기준 개인에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질 또는 하나 이상의 일배체형의 빈도의 지표를 더 포함하고, 위험도 척도는 상기 심혈관 질환으로 진단된 복수의 개인에 대한 상기 하나 이상의 마커 및/또는 일배체형 정보의 빈도의 지표 대비, 상기 개인에 대한 하나 이상의 마커 및/또는 일배체형 상태의 비교에 기반한다.
본 명세서에 기재된 본 발명은 심혈관 질환에 대한 감수성의 결정을 위해 유용한 것으로 본 명세서에 기재된 다형성 마커 중 하나, 또는 이들의 조합을 이용하여 실시될 수 있다. 이는 심혈관 질환과 연관된 것으로 확인된 마커들을 포함하나, 또한 그와 같은 변이와 연관 불균형인 마커들도 포함한다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 표 3, 10, 21 및 26에 기재된 마커들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 표 10에 표시된 마커들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 표 3 및 표 21에 표시된 마커들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 표 3에 표시된 마커들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 표 21에 표시된 마커들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 CDKN2A 및/또는 CDKN2B 유전자와 연관 불균형인 마커들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 마커 rs10811650, rs10116277, rs1333040, rs10738607, rs4977574, rs6475608, D9S1870, rs2383207, rs1333045, rs1333046, rs10757278 및 rs1333048로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 마커 rs1333040, rs10116277, rs2383207 및 rs10757278로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 rs1333040 (서열번호 59)이다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 rs10116277 (서열번호 56)이다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 rs2383207 (서열번호 82)이다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 rs10757278 (서열번호 88)이다. 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 선택적으로, 전술된 마커들 중 하나 또는 하나 이상과 연관 불균형인 마커들로부터 더 선택된다.
방법, 용도, 장치 또는 키트에 대한 본 발명의 다양한 양태에서 심혈관 질환은 일부 구체예에서 동맥 질환이다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 상기 동맥 질환 표현형은 심근 경색증, 급성 관상동맥 증후군(Acute Coronary Syndrome, ACS), 관상동맥 질환, 뇌졸중, 말초 동맥 질환(Peripheral Artery Disease), 재협착, 두개내 동맥류 및 복부 대동맥류, 경피 경관 관상동맥 확장술(Coronary Artery Disease, Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty, PTCA), 및 관상동맥 우회로 조성술(Coronary Artery Bypass Surgery, CABG)로부터 선택된다. 일 구체예에서, 상기 심혈관 질환은 심근 경색증이다. 또 다른 구체예에서, 상기 심혈관 질환은 심근 경색증 또는 관상동맥 질환이다. 또 다른 구체예에서, 상기 심혈관 질환은 심근 경색증, 관상동맥 질환, 복부 대동맥류, 또는 두개내 동맥류이다. 또 다른 구체예에서, 상기 심혈관 질환은 심근 경색증, 관상동맥 질환, 재협착, 복부 대동맥류, 또는 두개내 동맥류이다. 일 구체예에서, 뇌졸중 표현형은 대동맥 죽상경화성 뇌졸중(Large Artery Atherosclerotic Stroke) 및/또는 심장성 뇌졸중(Cardiogenic Stroke)이다. 재협착 표현형은 일 구체예에서, 관상동맥 스텐트내 재협착(Coronary In-stent Restenosis)이다. 일부 구체예에서, 스텐트내 재협착은 순수 금속 스텐트(Bare Metal Stent, BMS) 배치 후 재협착이거나, 또는 약물 용리 스텐트(Drug Eluting Stent, DES)의 배치 후 재협착이다.
본 발명의 마커 및 일배체형과 연관 불균형인 변이(마커 및/또는 다형성 마커를 포함하는 일배체형)도 본 발명의 방법 및 키트를 위해 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 마커 및 일배체혀과 연관 불균형인 마커들에 관한 것이다. 본 발명의 방법, 용도, 장치 또는 키트의 일부 구체예에서, 연관 불균형은 연관 불균형의 정량적 척도에 대한 특정한 컷오프(cutoff) 값을 특징으로 한다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 연관 불균형은 r2에 대한 특정한 컷오프 값을 특징으로 한다. 또 다른 그와 같은 구체예에서, 연관 불균형은 |D'|에 대한 특정한 컷오프 값을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 연관 불균형은 r2 및 |D'|에 대한 특정한 컷오프 값을 특징으로 한다. 하나의 바람직한 구체예에서, 연관 불균형은 0.1보다 큰 r2값을 특징으로 한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 연관 불균형은 0.2보다 큰 r2값을 특징으로 한다. 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99를 포함하나, 이에 한정되지 않는, r2에 대한 다른 컷오프 값도 가능하다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 연관 불균형은 0.5보다 큰 |D'| 값을 특징으로 한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 연관 불균형은 0.8보다 큰 |D'| 값을 특징으로 한다. 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98 및 0.99를 포함하나, 이에 한정되지 않는, |D'|에 대한 다른 컷오프 값도 가능하다. 일부 구체예에서, 연관 불균형은 |D'| 또는 r2에 대한 수치 컷오프 값을 특징으로 한다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 연관 불균형은 0.8보다 큰 |D'| 또는 0.2보다 큰 r2의 수치 컷오프 값, 또는 양자 모두를 특징으로 한다.
본 발명의 방법, 용도, 장치 또는 키트의 특정한 다른 구체예에서, 개체는 특정한 인간 선조(ancestry)로부터 유래한다. 일 구체예에서, 상기 선조는 블랙 아프리카계 선조, 코카서스계 선조 및 중국계 선조로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 선조는 블랙 아프리카계 선조이다. 또 다른 구체예에서, 상기 선조는 블랙 아프리카계 선조이다. 또 다른 구체예에서, 상기 선조는 아프리카계 미국인 선조이다. 또 다른 구체예에서, 상기 선조는 유럽계 선조이다. 또 다른 구체예에서, 상기 조상은 코카서스계 조상이다. 특정한 구체예에서, 선조는 유전적 분석 또는 유전형분석을 받는 개인에 의해 자가-보고된다. 다른 구체예에서, 상기 선조는 개인으로부터의 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질을 검출하는 단계를 포함하고, 상기 대립형질의 존재 또는 부재는 상기 개인의 선조를 나타내는 것인 유전적 결정(genetic determination)에 의해 결정된다.
본 발명의 방법, 용도, 장치 또는 키트의 다른 특정한 구체예에서, 하나 이상의 위험 변이, 즉, 하나 이상의 다형성 마커에서의 위험 대립형질 또는 위험 일배체형의 존재가 심혈관 질환의 조기 발병(early onset)을 나타낸다. 일부 구체예에서, 조기 발병은 70세 전, 65세 전, 60세 전, 55세 전, 50세 전, 45세 전, 또는 40세 전의 발병으로 분류된다. 연령의 모든 정수값을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 발병 연령(age at onset)의 분류(categorization)를 위한 다른 값들도 고려되며, 그와 같은 연령 분류도 본 발명의 범위에 속한다. 일부 구체예에서, 심혈관 질환은 심근 경색증이고, 발병 연령은 남성의 경우 50세 미만이고 및/또는 여성의 경우 60세 미만이다.
발명의 상세한 설명
하기에서 본 발명의 바람직한 구체예가 설명된다.
정의
달리 표시되지 않으면, 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 좌측에서 우측으로 기재된다. 명세서 내에 기재된 수치 범위는 그 범위를 한정하는 수치를 포함하며 정의된 범위 내의 각 정수 또는 비-정수 분수(non-integer fraction)를 포함한다. 달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상적인 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에서, 하기의 용어들은 표시된 바와 같은 의미를 갖는다:
본 명세서에 기재된 바와 같이, 종종 "마커(marker)"로 불리는, "다형성 마커(polymorphic marker)"는 게놈 다형성 부위(genomic polymorphic site)를 의미한다. 각 다형성 마커는 다형성 부위에서 특정한 대립형질에 특징적인 두 개 이상의 서열 변이를 갖는다. 따라서, 다형성 마커에 대한 유전적 연관(genetic association)은 특정한 다형성 마커의 하나 이상의 특정한 대립형질에 대해 연관이 있다는 것을 의미한다. 마커는 SNP, 마이크로새틀라이트(microsatellite), 삽입, 결실, 중복 및 전위(translocation)를 포함한, 게놈에서 발견되는 임의의 변이 형태의 대립형질을 포함할 수 있다.
"대립형질(allele)"은 염색체 상에 있는 주어진 유전자 좌(위치)의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 다형성 마커 대립형질은 따라서, 염색체 상의 마커의 조성(즉, 서열)을 의미한다. 개인으로부터의 게놈 DNA는 각 염색체 상의 마커의 각 카피를 대표하는, 임의의 주어진 다형성 마커에 대해 두 개의 대립형질(예를 들면, 대립형질-특이적 서열)을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 뉴클레오티드에 대한 서열 코드는 A = 1, C = 2, G = 3, T = 4이다. 마이크로새틀라이트 대립형질(microsatellite allele)의 경우, CEPH 표본(Centre d'Etudes du Polymorphisme Humain, genomics repository, CEPH sample 1347-02)이 기준으로 이용되고, 이 표본에서 각 마이크로새틀라이트의 보다 짧은 대립형질은 0으로 설정되고 다른 표본에서 모든 다른 대립형질은 이 기준에 대비하여 번호가 부여된다. 따라서, 예를 들면, 대립형질 1은 CEPH 표본에서의 보다 짧은 대립형질보다 1 bp 더 길고, 대립형질 2는 CEPH 표본에서의 보다 짧은 대립형질보다 2 bp 더 길며, 대립형질 3은 CEPH 표본에서의 보다 짧은 대립형질보다 3 bp 더 길며, 대립형질 -1은 CEPH 표본에서의 보다 짧은 대립형질보다 1 bp 더 짧고, 대립형질 -2는 CEPH 표본에서의 보다 짧은 대립형질보다 2 bp 더 짧다.
본 명세서에 기재된 서열 코뉴클레오티드 중의성(sequence conucleotide ambiguity)은 IUPAC-IUB에 의해 제안된 바와 같다. 이 코드들은 EMBL, GenBank, 및 PIR 데이터베이스에 의해 사용된 코드들과 양립될 수 있다.
IUB 코드 의미
A 아데노신
C 시티딘
G 구아닌
T 티미딘
R G 또는 A
Y T 또는 C
K G 또는 T
M A 또는 C
S G 또는 C
W A 또는 T
B C G 또는 T
D A G 또는 T
H A C 또는 T
V A C 또는 G
N A C G 또는 T (임의의 염기)
집단(자연 집단 또는 인위적 집단, 예를 들면, 합성 분자들의 라이브러리) 내에서 하나 이상의 서열이 가능한 뉴클레오티드 위치가 본 명세서에서 "다형성 부위(polymorphic site)"로 지칭된다.
"단일 뉴클레오티드 다형성(Single Nucleotide Polymorphism)" 또는 "SNP"는 게놈의 특정한 위치에 있는 단일 뉴클레오티드가 종의 멤버 간에 또는 개체 내에서 쌍을 이루는 염색체 간에 상이할 때 나타나는 DNA 서열 변이이다. 대부분의 SNP 다형성은 두 개의 대립형질을 갖는다. 각 개체는 이 경우, 상기 다형성의 하나의 대립형질에 대해 동형접합(즉, 개체의 두 개의 염색체 카피 모두 SNP 위치에서 동일한 뉴클레오티드를 가짐)이거나, 또는 개체는 이형접합이다(즉, 상기 개체의 두 개의 자매 염색체(sister nucleotide)가 상이한 뉴클레오티드를 포함함). 본 명세서에서 보고된 바와 같이, SNP 명명은 NCBI(the National Center for Biotechnological Information)에 의해 각각의 독특한 SNP에 부여된 공식적인 기준 SNP(Reference SNP, rs) ID 식별 택(tag)을 의미한다.
본 명세서에 기재된 "변이(variant)"는 기준(reference) DNA와 상이한 DNA의 세그먼트를 의미한다. 본 명세서에서 정의된 "마커(marker)" 또는 "다형성 마커(polymorphic marker)"는 변이이다. 기준과 상이한 대립형질(allele)은 "변이" 대립형질로 지칭된다.
"마이크로새틀라이트(microsatellite)"는 특정한 부위에 있는 길이가 2 내지 8개의 뉴클레오티드로 구성된 염기의 작은 반복체(repeat)(예를 들면, CA 반복체)를 복수 개 갖는 다형성 마커이며, 전체 집단에서 반복체 길이의 수는 변한다. "indel"은 통상적으로 단지 수개의 뉴클레오티드로 구성된 길이의 작은 삽입 또는 결실을 포함하는 다형성의 일반적인 형태이다.
본 명세서에 기재된, "일배체형(haplotype)"은 세그먼트를 따라 배열된 대립형질의 특정한 조합을 특징으로 하는 게놈 DNA의 세그먼트를 의미한다. 인간과 같은 이배체(diploid) 개체의 경우, 일배체형은 각 다형성 마커 또는 유전자 좌에 대해 대립형질의 쌍 중 하나의 대립형질(one member)을 포함한다. 특정한 구체예에서, 일배체형은 두개 이상의 대립형질, 세개 이상의 대립형질, 네개 이상의 대립형질, 또는 다섯개 이상의 대립형질을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 일배체형은 해당 일배체형에서 마커 명칭 및 상기 마커의 대립형질로 기재되며, 예를 들면, "G rs10757278"은 마커 rs7758851의 대립형질 3이 일배체형에 있다는 것을 의미하고, "rs10757278 대립형질 G"와 동등하다. 또한, 일배체형에서 대립형질 코드는 개별적인 마커에 대한 것과 같고, 즉, 1 = A, 2 = C, 3 = G 및 4 = T이다.
본 명세서에 기재된 용어 "감수성(susceptibility)"은 개체(또는 개체들의 군)이 특정한 상태(예를 들면, 특정한 성향(trait), 표현형 또는 질병)를 발생시키는 경향이 있거나, 또는 평균 개체들보다 특정한 상태에 저항할 수 있는 능력이 약한 것을 의미한다. 상기 용어는 증가된 감수성 및 감소된 감수성을 모두 포함한다. 따라서, 본 발명의 다형성 마커의 특정한 대립형질 및/또는 일배체형은 1보다 큰 상대적 위험도(RR) 또는 오즈비(OR)을 특징으로 하는, 심혈관 질환의 증가된 감수성(즉, 증가된 위험도)을 특징으로 할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 마커 및/또는 일배체형은 1 미만의 상대적 위험도를 특징으로 하는, 심혈관 질환의 감소된 감수성(즉, 감소된 위험도)을 특징으로 한다.
용어 "및/또는"은 본 명세서에서 상기 용어에 의해 연결된 항목들 중 하나 또는 양자 모두가 포함된다는 것을 나타내는 것으로 이해될 것이다. 바꾸어 말하면, 본 명세서에서 상기 용어는 "하나 또는 그 나머지 또는 양자 모두(one or the other or both)"를 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "참조표(look-up table)"는 하나의 형태의 데이터를 또 다른 형태와 상관시키거나, 또는 하나 이상의 형태의 데이터를 상기 데이터가 관련된 예상되는 결과, 예를 들면, 표현형 또는 성향과 상관시키는 표이다. 예를 들면, 참조표는 하나 이상의 다형성 마커에 대한 대립형질 데이터와, 특정한 대립형질 데이터를 포함하는 개체가 표시할 것 같거나, 또는 그 특정한 대립형질 데이터를 갖지 않는 개인보다 표시할 가능성이 더 높은, 특정한 질병 진단과 같은 특정한 성향 또는 표현형 간의 상관관계를 포함할 수 있다. 참조표는 다면적(multidimensional)일 수 있고, 즉, 참조표는 단일 마커들에 대한 복수 개의 대립형질에 대한 정보를 동시에 포함할 수 있거나, 또는 그들은 복수 개의 마커들에 대한 정보를 포함할 수 있고, 그들은 또한 질병 진단에 대한 세부사항, 인종 정보, 바이오마커, 생화학적 측정값, 치료적 방법, 또는 약물 등과 같은 다른 인자들을 포함할 수 있다.
"컴퓨터-판독가능한 매체(computer-readable medium)"는 상업적으로 구매가능하거나 또는 맞춤-제작된(custom-made) 인터페이스를 이용하여 컴퓨터에 의해 접근될 수 있는 정보 저장 매체이다. 대표적인 컴퓨터-판독가능한 매체는 메모리(예를 들면, RAM, ROM, 플래쉬 메모리, 등), 광학적 저장 매체(예를 들면, CD-ROM), 자기 저장 매체(예를 들면, 컴퓨터 하드 드라이브, 플로피 디스크, 등), 천공 카드(punch card), 또는 기타 상업적으로 구입가능한 매체를 포함한다. 목표 시스템(system of interest)과 매체, 컴퓨터간, 또는 컴퓨터와 저장 또는 저장된 정보의 접근을 위한 컴퓨터-판독가능한 매체 간에 정보가 전달될 수 있다. 그와 같은 전송은 전기적이거나, 또는 IR 링크, 무선 연결 등과 같은 다른 이용가능한 방법에 의해 수행될 수 있다.
"핵산 시료(nucleic acid sample)"는 개체로부터 수득된 핵산을 함유하는 시료이다. 특정한 구체예에서, 즉, 특정한 다형성 마커 및/또는 일배체형의 검출에서, 핵산 시료는 게놈 DNA를 포함한다. 그와 같은 핵산 시료는 혈액 시료, 양수 시료, 뇌척수액 시료, 또는 피부, 근육, 볼 점막 또는 결막 점막, 태반, 위장관 또는 기타 기관을 포함한, 게놈 DNA를 포함하는 원천(source)으로부터 수득될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "심혈관 질환 치료제(cardiovascular disease therapeutic agent)"는 심혈관 질환과 연관된 증상을 개선시키거나 또는 예방하기 위해 이용될 수 있는 작용제를 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "관상동맥 질환 치료제(coronary artery disease therapeutic agent)"는 관상동맥 질환과 연관된 증상을 개선시키거나 또는 예방하기 위해 이용될 수 있는 작용제를 의미한다. 그와 같은 작용제는 예를 들면, 스타틴, 베타 차단제, 칼슘 채널 차단제, 심장 글리코시드(cardiac glycoside), 항고혈압제, 이뇨제, 레닌-안지오텐신 시스템(renin-angiotensin system)에 작용하는 작용제, 및 아스피린일 수 있다.
본 명세서에 기재된 용어 "관상동맥 협착증(coronary stenosis)" 또는 "관상동맥 협착증 치료 방법(coronary stenosis therapeutic method)"은 관상동맥 질환과 연관된 증상을 개선시키거나 또는 예방하기 위해 이용될 수 있는 방법을 의미한다. 그와 같은 방법은 풍선 혈관성형술(balloon angioplasty), 스텐트 삽입술(stenting), 절단형 풍선 혈관성형술(cutting balloon angioplasty), 경피경관 관상동맥 성형술(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA), 방향성 관상동맥 죽상종 절제술(directional coronary atherectomy), 회전 관상동맥 죽상종 절제술(rotational coronary atherectomy), 근접 치료(brachytherapy), 약물-용리형 스텐트(drug-eluting stent , DES) 삽입술, 금속 스텐트 삽입술, 또는 관상 동맥 우회 이식술( Coronary Artery Bypass Surgery, CABG)과 같은 관상동맥 수술일 수 있다.
본 명세서에 기재된 용어 "심혈관 질환과 연관된 핵산(cardiovascular disease-associated nucleic acid)"은 심혈관 질환과 연관된 것으로 확인된 핵산을 의미한다. 이는 본 명세서에 기재된 마커 및 일배체형 및 이들과 강한 연관불균형(LD)인 마커 및 일배체형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 기재된, 용어 "LD 블럭 C09(LD Block C09)"는 NCBI (National Center for Biotechnology Information) Build 34, Build 35 및 Build 36의 염색체 9 상에 있는 위치 21,920,147과 22,149,982 사이에 있는 염색체 9 상의 연관 불균형(LD) 블럭을 의미한다. 이 Build들로부터의 LD 블럭 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 94로 표시된다.
본 명세서에 기재된 용어 "심혈관 질환(cardiovascular disease)"은 심장 또는 혈관(동맥 및 정맥)을 포함하는 질병의 종류(class)를 의미한다. 일 구체예에서, 본 발명은 유사한 원인 및 메카니즘을 갖는 것으로 사료되는, 죽상경화성 사건(atherosclerotic event)과 관계된, 동맥 질환에 관한 것이다. 심혈관 질환은 일부 공통된 위험 인자(연령, 흡연, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 비만, 고혈압, 스트레스, 우울증, 심박동 상승, 수면 부족, 환경적 노출)를 갖는다.
본 명세서에 기재된 약어 "PCTA", "CABG", "MI", "PAD", "CAD", "LAA", "IA" 및 "AAA"는 하기를 의미한다: "PCTA"는 경피경관 관상동맥 성형술(Percutaneousrefers to Transluminal Coronary Angiopathy)을 의미하고, "CABG"는 관상동맥 우회 이식술(Coronary Artery Bypass Surgery)을 의미하며, "MI"는 심근 경색증(Myocardial Infarction)을 의미하고, "PAD"는 말초동맥 질환(Peripheral Artery Disease)을 의미하며, "CAD"는 관상동맥 질환(Coronoary Artery Disease)을 의미하고, "LAA 뇌졸중"은 주요 혈관 죽상경화성 뇌졸중(Large Artery Atherosclerotic Stroke)을 의미하며, "IA"는 두개내 동맥류(Intrachranial Aneurysm)를 의미하고 "AAA"는 복부 대동맥류(Abdominal Aortic Aneurysm)를 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "조기 발병(early onset)"은 통상적으로 관찰되는 것보다 더 낮은 연령에서의(lower) 질병의 발병을 의미한다. 본 발명의 대표적인 경우에서, MI 표현형에 적용되는 상기 용어는 남성의 경우 50세 이전의 MI 사건으로 정의되고, 여성의 경우, 60세 이전의 MI 사건으로 정의된다. 본 발명의 대안적인 구체예에서, 상기 용어는 당업자에게 공지되고 본 명세서에서 보다 상세하게 설명되는 대안적인 방식으로 정의될 수 있다.
유전전 변이의 관상동맥 질환에 대한 연관
약 317,000개의 SNP 마커를 포함하는 칩 상에서 SNP 마커들 간의 연관 연구를 통해, 본 발명은 9번 염색체 상에 있는 일부 마커와 심혈관 질환 간의 연관을 확인하였다. 표 1 및 표 12에 예시된 바와 같이, 심근 경색증으로 진단된 환자들로부터의 SNP 데이터의 분석이 수행되었을 때, 최초의 발견이 이루어졌다. 본 명세서에서 LD 블럭 C09로 기재된 영역에 있는 여러 마커들이 1.2의 RR 값으로 MI와 강하게 연관된 것으로 확인되었다. 상기 영역 내의 두개의 마이크로새틀라이트, D9S1814 및 D9S1870도 MI 표현형과 상관되는 것으로 확인되었다. D9S1870의 복합(composite) 대립형질 X (2보다 짧은 모든 대립형질(각각 대립형질, -6, -4, -2 및 0)는 MI와 강하게 연관된 것으로 확인되었다(표 1). 추가적인 조사가 MI와 가장 강한 연관 관계를 갖는 5개의 마커들(rs10116277, rs1333040, rs2383207, D9S1814 및 D9S1870; 표 3 참조)과 강하게 상관된 약 90개의 추가적인 마커들을 확인했다. 따라서, 이 마커들은 상기 5개의 마커들 중 하나에 대한 대리 마커(surrogate marker)로 작용할 수 있으며 따라서 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다.
뒤이어, D9S1870 마커가 추가적인 MI 케이스 및 다른 심혈관 질환 및 수만명의 추가적인 집단 대조군을 포함한 개체들의 매우 큰 표본(70,000명 이상)에서 유전형 분석되었다. 코카서스 기원의 개체들을 포함하는, 미국의 3개의 코호트(cohort)에서의 재현 연구도 수행하였다. 표현형 MI에 대한 이 연구들의 결과는 최초의 발견의 재현을 보여주었고(표 4 및 12-14), 통합된 p-값은 약 10-12였다. 상응하는 집단 기여 위험도(population attributable risk)는 이 변이에 대해 약 17%였다.
이 변이의 추가적 연구는 MI의 발병 연령(age at onset)에 대한 유의성있는 상관 관계를 밝혔다. 남성에 대해 50세 미만 및 여성에 대해 60세 미만인 MI를 자의적으로 조기-발병 MI로 정의하는 것은 모든 MI 케이스에 대한 1.21에 비해, 조기-발병 그룹에서 1.33으로의 증가를 밝혔다. D9S1870의 복합 대립형질 X의 카피 수와 MI의 발병 연령의 다중 회귀 분석은 MI 개체에 의해 보유된 X의 각 카피에 대해 발병 연령의 매우 유의성 있는 감소를 밝혔다(표 8). 이는 남성에 대한 50세의 컷오프 및 여성에 대한 60세의 컷오프와 상이한 MI의 발병 연령의 정의가 X 대립형질에 대한 보인자 상태에서 발병 연령에서 이 경향을 검출하기 위해 이용될 수 있었다.
본 발명은 또한 D9S1870의 X 대립형질을 대리 마커로 이용하여, 다른 심혈관 질환과 LD 블럭 C09 내의 변이들 간의 연관을 확인하였다. 따라서, 말초 동맥 질환(PAD) 코호트로부터 MI로 진단된 개인들을 제거한 후에도, 유의성 있는 연관이 PAD에 대해 확인되었다. 본 발명자들은 또한, 광범위한 표현형인 뇌졸중 및 뇌졸중 서브 표현형인 주혈관 질환(Large Vessel Disease, LVD)의 증가된 위험도를 관찰했다(표 5 및 표 29). 본 발명자들은 또한 위험 변이의 관련된 질환, 말초동맥 질환(PAD) 및 복부 대동맥류(AAA)에 대한 연관관계를 조사했다. 표 29에서 알 수 있는 바와 같이, 이 마커들은 이 관련된 질환들과 연관되었다. 연관은 표 30에 표시된 바와 같이, 이 3개 외에 다수의 마커들에 대해 유의성 있는 연관이 관찰된 AAA에 대해 특히 강하다. 이 결과들은 본 발명의 마커 및 일배체형이 실제로 복부 대동맥류와 같은, 관상동맥 질환, MI 및 스텐트내 재협착증과 관련된 질환을 반영한다는 것을 보여준다.
스텐트내 재협착증의 진단을 받은 개체들의 추가적인 분석을 수행하였다(표 9). 경증 재협착증(mild restenosis)(<50%) 및 중증(severe) 재협착증(>50%)에 대해 유의성 있는 연관이 검출되었다. 이는 본 발명이 어느 개체가 경피 경관 관상동맥 성형술(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)을 수행한 후 스텐트내 재협착증의 증가된 위험을 갖는지를 나타내기 위해 이용될 수 있다는 것을 의미한다.
LD 블럭 C09 내에 위치한 공지된 유전자는 CDKN2A 및 CDKN2B로 불린다. 이 유전자들은 ARF (p19 ARF 및 p14 ARF로도 알려짐), p15 INK4b 및 p16INK4a 로 알려진 세개의 단백질을 코딩하며, 이들 모두는 종양 억제자 단백질(tumor suppressor protein)을 코딩한다. p15 INK4b 는 그의 개방 해독 프레임(open reading frame)을 가지나, p16INK4a 및 ARF는 공통된 제2 엑손 및 제3 엑손에 스플라이싱되는 상이한 제1 엑손을 갖는다. p16INK4a 와 ARF 간의 엑손의 공유에도 불구하고, 상기 단백질들은 상이한 해독 프레임으로 코딩된다. 따라서, p16INK4a 및 ARF는 상동성(homology)을 공유하지 않는 단백질이다. 이 유전자들의 산물은 집중적으로 연구되었고 종양 억제에서 광범위한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 최근 데이터는 ARF, p15 INK4b 및 p16INK4a 유전자 좌(locus)가 또한 세포의 노화, 즉, 자가-재생(self-renewing) 세포의 복제 능력의 감소에서 역할을 갖는다는 것을 시사했다. 여러 그룹이 p16INK4a의 발현이 설치류 및 인간의 다수의 조직에서 노화에 따라 증가한다는 것을 보여주었다. p16INK4a의 발현이 역연령(chronologic age)과 반대로, 생리학적 연령의 바이오마커로서 이용될 수 있다는 것이 제안되었다.
인간의 암은 빈번하게 ARF, p15 INK4b 및 p16INK4a 유전자 좌의 동형접합 결실(homozygous deletion)을 가지며, 상기 세 단백질의 발현 감소, 및 감소된 종양 억제자 활성을 갖는다. ARF, p15 INK4b 또는 p16INK4a 유전자좌에 결함이 있는 마우스의 넉-아웃 연구는 상기 마우스들이 야생형 마우스보다 암에 걸릴 가능성이 더 높다는 것을 보여주었다. 또한, ARF, p15 INK4b 또는 p16INK4a 유전자좌의 과발현을 갖는 마우스는 자발적 암의 발생률의 감소를 보인다. 이 배경에서 암이 마우스의 주요한 사망 원인이기 때문에, ARF, p15 INK4b 또는 p16INK4a 유전자좌를 과발현하는 마우스의 종양 내성은 또한 이 마우스들의 보다 긴 수명을 가져올 것이라는 것을 주장할 수 있다. 그러나, 이 마우스들은 정상적인 수명을 보이기 때문에, 상기는 사실이 아니다. 이는 증가된 ARF, p15 INK4b 또는 p16INK4a 유전자좌 기능 및 감소된 종양 발생률이 죽상경화성 질환과 같은 노화와 관련된 비-악성(non-malignant) 원인(Cell, 127, Oct. 20, 2006)으로부터 발생하는 과다한 사망률 대신에 발생할 수 있다는 것을 시사할 수 있다.
엑손, 엑손-인트론 연접부(exon-intron junction) 및 잠재적 조절 영역을 포함한, CDKN2A 및 CDKN2B 영역의 엑손의 서열결정이 표 12에 표시된 바와 같은 프라이머를 이용하여 수행되어, 표 13에 표시된 바와 같이, 다수의 SNP를 확인시켰다. 상기 SNP 중 3개는 공개 데이터베이스에서 확인되지 않았으나, 이 SNP들의 플랭킹 서열이 표 14에 표시된다. 염색체 9의 이 영역 내에서 MI와 연관된 것으로 확인된 마커들과 LD인 SNP 마커들 또는 다른 다형성이 보다 높은 위험도과 연관을 보이는 것이 가능하기 때문에, 본 발명자들은 표 13에 표시된 바와 같이, 서열결정에 의해 이 추가적인 마커들의 유전형을 분석하였다. 상기 마커들 중 여러개, 특히, 마커 SG09S291 및 rs2069416이 1.7-1.8의 높은 RR 값으로 MI와 연관을 보인다. 따라서, 본 명세서에 개시된 본 발명의 마커들과 LD인 CDKN2A 및 CDKN2B 유전자 내에 있는 이 마커들, 및/또는 다른 마커들이 본 발명의 범위 내에 속하며, 이는 그 마커들이 진정한 질병-유발 변이, 또는 근원적 원인 변이(underlying causative variant)와 강한 LD인 변이를 나타낼 수 있기 때문이다.
rs10757278 변이의 두개내 동맥류에 대한 연관의 조사는 최초의 아이슬란드 코호트, 및 네덜란드 및 핀란드로부터의 독립적인 코호트에서의 재현에서 이 표현형에 대한 유의성 있는 연관을 보여준다(예를 들면, 표 32). 또한, AAA에 대한 연관의 최초의 발견은 벨기에, 캐나다, 미국, 네덜란드, 영국 및 뉴질랜드로부터의 여러 코호트에서 재현되었다(표 32). 이 결과는 rs10757278 마커, 및 이와 LD인 마커는 실제로 심근 경색증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 두개내 동맥류 및 복부 대동맥류보다, 동맥 질환을 포함한 심혈관 질환과 실제로 유의성 있게 연관된다는 것을 보여준다.
염색체 9p21 상의 변이와 본 명세서에 기재된 심혈관 질환 간의 연관의 최초의 발견(또한, Helgadottir, A., et. al., Science 316:1491-3 2007 참조)이 CAD를 갖는 개체 및 대조군의 연구를 포함한 여러 독립적인 연구에서 재현되었다. 코카서스인에서 CAD/MI와의 연관이 PROCARDIS Consortium (Hum Mol Genet. Epub 2007 Nov 29.)의 4,251명의 케이스 및 4,443명의 대조군, 416명의 MI 케이스 및 308명의 대조군을 포함한 이탈리아 집단(J Hum Genet. 2008;53(2):144-50. Epub 2007 Dec 8.), Framingham Heart Study의 참여자 (BMC Med Genet. 2007 Sep 19;8 Suppl 1:S5.), 및 Northwick Park Heart Study II (Clin Chem. Epub 2008 Feb 4 )에서 재현되었다.
rs10757278, 및 다른 상관된 SNP의 CAD와의 연관이 또한 코카서스인에 대해 발표된 것과 유사한 오즈비로 일본 및 한국으로부터의 아시아 집단에서 확인되었다(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008 Feb;28(2):360-5. Epub 2007 Nov 29, 및 J Hum Genet. Epub 2008 Feb 9 참조). 본 명세서에 표시된 데이터와 함께, 이 연구들은 염색체 9p21 상의 LD 블럭 C09 영역 내의 변이가 모든 집단에서 심혈관 질환과 연관된다는 것을 명확하게 보여준다.
마커 및 일배체형의 평가
집단 내의 게놈 서열은 개인들이 비교될 때 동일하지 않다. 오히려, 게놈은 게놈 상의 다수의 위치에서 개인들 간에 서열 변이성(sequence variability)을 보인다. 그와 같은 서열 상의 변이는 일반적으로 다형성(polymorphism)으로 지칭되며, 각 게놈 내에 다수의 그와 같은 부위들이 있다. 예를 들면, 인간 게놈은 평균적으로 500 bp마다 나타나는 서열 변이를 보인다. 가장 일반적인 서열 변이는 게놈 내의 단일 염기 위치에서의 염기의 변화로 구성되고, 그와 같은 서열 변이, 또는 다형성은 일반적으로 단일 뉴클레오티드 다형성("SNP")로 지칭된다. 이 SNP들은 단일 돌연변이 사건에서 일어난 것으로 사료되며, 따라서, 통상적으로 각 SNP 부위에 두 개의 가능한 대립형질들이 있다; 본래의 대립형질과 돌연변이된 대립형질. 자연적인 유전적 부동(genetic drift) 및 또한 가능한 선택적 압력 때문에, 본래의 돌연변이가 주어진 집단에서 그의 대립형질의 특정한 빈도를 특징으로 하는 다형성을 초래했다. 마이크로새틀라이트, 삽입, 결실, 역전 및 카피수 변화를 포함한, 다수의 다른 종류의 서열 변이가 인간 게놈 내에서 발견된다. 다형성 마이크로새틀라이트는 특정한 부위에 복수 개의 짧은 염기 반복체(small repeat of bases)(예를 들면, CA 반복체, 상보성 가닥 상의 TG)를 가지며, 전체 집단에서 반복체 길이의 수가 변화한다. 일반적인 용어로, 다형성 부위에 대한 서열의 각 버전은 상기 다형성 부위의 특정한 대립형질을 나타낸다. 이 서열 변이들은 모두 해당 서열 변이의 특징적인, 특정한 다형성 부위에서 일어나는, 다형성으로 지칭될 수 있다. 일반적인 용어로, 다형성은 임의의 수의 특정한 대립형질을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에서, 다형성은 임의의 주어진 집단에서 둘 이상의 대립형질의 존재를 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 다형성은 세개 이상의 대립형질의 존재를 특징으로 한다. 다른 구체예에서, 다형성은 4개 이상의 대립형질, 5개 이상의 대립형질, 6개 이상의 대립형질, 7개 이상의 대립형질, 9개 이상의 대립형질 또는 10개 이상의 대립형질의 존재를 특징으로 한다. 모든 그와 같은 다형성은 본 발명의 방법 및 키트에서 이용될 수 있고, 따라서, 본 발명의 범위 내에 속한다.
일부 경우에, 기준 대립형질(reference allele)을 선택하지 않고, 다형성 부위에서 상이한 대립형질을 지칭할 수 있다. 대안적으로, 특정한 다형성 부위에 대해 기준 서열이 지칭될 수 있다. 기준 대립형질은 종종 "야생형(wild-type)" 대립형질로 지칭되고, 이는 통상적으로 최초의 서열결정된(first sequenced) 대립형질 또는 "영향받지 않은(non-affected)" 개체(예를 들면, 성향(trait)이나 질병 표현형을 보이지 않는 개체)로부터의 대립형질로 선택된다.
본 명세서에서 지칭되는 SNP 마커에 대한 대립형질은 이용된 SNP 분석법에서 다형성 부위에서 그들이 나타나는 경우, 염기 A, C, G 또는 T로 지칭된다. 본 명세서에서 이용된 SNP에 대한 대립형질 코드는 하기와 같다: 1 = A, 2 = C, 3 = G, 4 = T. 그러나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 반대쪽 DNA 가닥을 분석하거나 또는 판독하는 것에 의해, 각 경우에 상보적 대립형질이 측정될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, A/G 다형성을 포함하는 다형성 부위(다형성 마커)에 대해, 이용되는 분석법은 가능한 두 염기, 즉, A 및 G 중 하나 또는 양자 모두의 백분율 또는 비를 측정할 수 있다. 대안적으로, DNA 주형 상의 반대쪽 가닥을 결정(분석)하는 분석법을 설계하는 것에 의해, 상보적 염기 T/C의 백분율 또는 비가 측정될 수 있다. 정량적으로(예를 들면, 상대적 위험도의 측면에서), 동일한 결과가 각 DNA 가닥(+ 가닥 또는 - 가닥)의 측정으로부터 수득될 것이다. 다형성 부위(다형성 마커)가 치환, 삽입 또는 결실에 근거한 서열의 변화를 가능하게 할 수 있다. 예를 들면, 다형성 마이크로새틀라이트는 반복체(repeat) 길이의 수가 전체 집단에서 변화하는 특정한 부위에서 복수 개의 작은 염기 반복체(예를 들면, CA 반복체)를 갖는다. 다형성 부위에 대한 서열의 각 버전이 다형성 부위의 특정한 대립형질을 나타낸다.
일반적으로, 특정한 서열에 대해 기준 서열이 지정된다. 기준과 상이한 대립형질은 종종 "변이(variant)" 대립형질로 지칭된다. 예를 들면, NCBI Build 34의 염색체 9 상에 있는 위치 21,920,147부터 위치 22,149,982 염기쌍까지의 게놈 DNA 서열("LD 블럭 C09", 서열번호 94)이 기준 서열(reference sequence)을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된, 변이 서열(variant sequence)은 기준 서열과 상이하나, 그 외에는 실질적으로 유사한 서열을 의미한다. 본 명세서에 기재된 일배체형을 구성하는 다형성 유전적 마커의 대립형질은 변이(variant)이다. 추가적인 변이들은 폴리펩티드에 영향을 미치는 변화들을 포함할 수 있다. 기준 뉴클레오티드 서열과 비교한 경우, 서열 차이는 프레임 쉬프트(frame shift)를 초래하는, 단일 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실, 하나보다 많은 수의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실; 코딩된 아미노산의 변화를 초래하는, 하나 이상의 뉴클레오티드의 변화; 조기 종료 코돈(premature stop codon)의 생성을 초래하는, 하나 이상의 뉴클레오티드의 변화; 뉴클레오티드에 의해 코딩된, 하나 이상의 아미노산의 결실을 초래하는, 수개의 뉴클레오티드의 결실; 판독 프레임(reading frame)의 코딩 서열의 중단(interruption)을 초래하는, 불균등 재조합(unequal recombination) 또는 유전자 전환(gene conversion)과 같은, 하나 또는 수개의 뉴클레오티드의 삽입; 전체 서열 또는 일부 서열의 중복; 전위; 또는 뉴클레오티드 서열의 재배열을 포함한다. 그와 같은 서열 변화는 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 핵산 서열의 변화가 프레임 쉬프트를 유발하는 경우, 프레임 쉬프트는 코딩된 아미노산의 변화를 초래할 수 있고, 및/또는 조기 종료 코돈의 생성을 초래하여, 절단된(truncated) 폴리펩티드의 생성을 유발한다. 대안적으로, 관상동맥 질환 및 스텐트내 재협착과 연관되거나, 또는 관상동맥 질환 및 스텐트내 재협착에 대한 감수성과 연관된 자형성은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 동의적 변화(synonymous change)(즉, 아미노산 서열의 변화를 초래하지 않는 변화)일 수 있다. 그와 같은 다형성은 예를 들면, 스플라이싱 부위(splice site)를 변화시키고, mRNA의 안정성 또는 이동에 영향을 미치거나 또는 코딩된 폴리펩티드의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 다형성은 또한 증폭 또는 결실과 같은 구조적 변화가 체세포 수준(somatic level)에서 일어날 가능성을 증가시키도록 DNA를 변화시킬 수 있다. 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드는 특정한 기준 아미노산 서열을 갖는 "기준(reference)" 폴리펩티드이고, 변이 대립형질에 의해 코딩된 폴리펩티드는 변이 아미노산 서열을 갖는 "변이(variant)" 폴리펩티드로 지칭된다.
일배체형은 세그먼트를 따라 배열된 대립형질의 특정한 조합을 특징으로 하는 DNA의 세그먼트를 의미한다. 인간과 같은 이배체 개체의 경우, 일배체형은 각 다형성 마커 또는 유전자 좌에 대한 1쌍의 대립형질 중 하나의 대립형질을 포함한다. 특정한 구체예에서, 일배체형은 두개 이상의 대립형질, 세개 이상의 대립형질,네개 이상의 대립형질, 또는 다섯개 이상의 대립형질을 포함할 수 있고, 각 대립형질은 세그먼트 상의 특정한 다형성 마커에 대응된다. 일배체형은 다양한 다형성 마커의 조합, 예를 들면, 다형성 부위에 특정한 대립형질을 갖는 SNP와 마이크로새틀라이트의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일배체형은 다양한 유전적 마커에서 대립형질의 조합을 포함한다.
특정한 다형성 마커 및/또는 일배체형의 검출은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된, 다형성 부위에서 서열을 검출하는 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, PCR, LCR, 이중 PCR(nested PCR) 및 핵산 증폭을 위한 기타 기법을 이용한, 형광-기반 기법(Chen, X. et al., Genome Res. 9(5): 492-98 (1999); Kutyavin et al., Nucleic Acid Res. 34: e128 (2006)))과 같은, SNP 및/또는 마이크로새틀라이트 마커의 존재에 대한 유전형분석을 위한 표준 기법이 이용될 수 있다. SNP 유전형분석을 위해 이용할 수 있는 특정한 방법들은 TaqMan 유전형 분석법(genotyping assay) 및 SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, 실시간 PCR, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용가능한 다른 방법에 의해, 마이크로새틀라이트, SNP 또는 다른 종류의 다형성 마커를 포함한, 다형성 마커에서의 하나 이상의 대립형질이 확인될 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정한 방법에서, 심혈관 질환에 대한 증가된 감수성(즉, 증가된 위험도)을 갖는 개체는 심혈관 질환에 대해 증가된 감수성을 부여하는 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질 또는 일배체형(즉, 위험 마커 대립형질 또는 일배체형)이 확인된 개체이다. 일 양태에서, 상기 위험 마커 또는 일배체형은 심혈관 질환의 유의성 있는 증가된 위험도(또는 감수성)를 부과하는 마커 또는 일배체형이다. 일 구체예에서, 마커 또는 일배체형과 연관된 유의성은 상대적 위험도(relative risk, RR)에 의해 측정된다. 또 다른 구체예에서, 마커 또는 일배체형과 연관된 유의성은 오즈비(odds ratio, OR)에 의해 측정된다. 또 다른 구체예에서, 유의성은 백분율로 측정된다. 일 구체예에서, 유의성 있는 증가된 위험도는 1.2 이상, 1.3 이상, 1.4 이상, 1.5 이상, 1.6 이상, 1.7 이상, 1.8 이상, 1.9 이상, 2.0 이상, 2.5 이상, 3.0 이상, 4.0 이상, 및 5.0 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 1.2 이상의 위험도(상대적 위험도 및/또는 오즈비)로 측정된다. 특정한 구체예에서, 1.2 이상의 위험도(상대적 위험도 및/또는 오즈비)는 유의성이 있다. 또 다른 특정한 구체예에서, 1.3 이상의 위험도는 유의성이 있다. 또 다른 구체예에서, 1.4 이상의 위험도는 유의성이 있다. 또 다른 구체예에서, 약 1.5 이상의 위험도는 유의성이 있다. 또 다른 추가적인 구체예에서, 약 1.7 이상의 위험도는 유의성이 있다. 그러나, 다른 컷오프, 예를 들면, 1.15, 1.25, 1.35 이상 등이 고려되며, 그와 같은 컷오프도 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. 다른 구체예에서, 위험도의 유의성 있는 증가는 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 및 500%를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 약 20% 이상이다. 하나의 특정한 구체예에서, 위험도의 유의성 있는 증가는 20% 이상이다. 다른 구체예에서, 위험도의 유의성 있는 증가는 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 및 100% 이상이다. 그러나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 본 발명의 특징으로 적합한 것으로 간주되는 다른 컷오프 또는 범위도 고려되고, 그들도 본 발명의 범위 내에 속한다. 특정한 구체예에서, 위험의 유의성 있는 증가는 0.05 미만, 0.01 미만, 0.001 미만, 0.0001 미만, 0.00001 미만, 0.000001 미만, 0.0000001 미만, 0.00000001 미만, 또는 0.000000001 미만의 p-값과 같은 p-값을 특징으로 한다.
본 발명의 위험 다형성 마커 또는 일배체형은 하나 이상의 마커의 하나 이상의 대립형질 또는 일배체형이 건강한 개체(대조군)에서의 존재의 빈도 대비 심혈관 질환에 대한 위험도를 갖는 개체(질병군)에 보다 빈번하게 존재하고, 상기 마커 또는 일배체형의 존재가 심혈관 질환에 대한 감수성을 나타내는 것인 마커 또는 일배체형이다. 일 구체예에서, 대조군은 집단 표본(population sample), 즉, 일반적인 집단으로부터의 랜덤 표본일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 대조군은 질병에 걸리지 않은 개인의 군으로 대표된다. 일 구체예에서, 그와 같은, 질병-불포함(disease-free) 대조군은 하나 이상의 특정한 질병-연관 증상의 부재를 특징으로 할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 질병-불포함 대조군은 하나 이상의 질병-특이적 위험 인자의 부재를 특징으로 한다. 일 구체예에서, 그와 같은 위험 인자는 하나 이상의 환경적 위험 인자이다. 대표적인 환경적 인자들은 특정한 질병 또는 성향을 발현할 위험도에 영향을 미치는 것으로 알려지거나, 상기 위험도에 영향을 미치는 것으로 고려되는 천연 산물, 미네랄, 또는 기타 화학물질이다. 기타 환경적 위험 인자들은 식음습관(food and drink habit), 주요 거주지의 지리적 위치 및 직업적 위험 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 생활방식(lifestyle)과 관련된 위험 인자들이다. 또 다른 구체예에서, 위험 인자는 하나 이상의 유전적 위험 인자를 포함한다.
상관관계에 대한 간단한 검정의 예로서 2 x 2 표(two by two table) 상에서의 Fisher-exact 검정이 있다. 염색체의 코호트가 주어지면, 마커 또는 일배체형을 모두 포함하는 염색체, 마커 또는 일배체형을 중 하나를 포함하고, 나머지 하나는 포함하지 않는 염색체 및 마커나 일배체형 중 어느 것도 포함하지 않는 염색체의 갯수로부터 2 x 2 표가 작성된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 질병 또는 성향에 대한 감소된 감수성(즉, 감소된 위험도)을 갖는 개체는 상기 질병 또는 성향에 대한 감소된 감수성을 부여하는 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 특정한 대립형질 또는 일배체형이 확인된 개체이다. 감소된 위험도를 부여하는 마커 대립형질 및/또는 일배체형은 또한 보호성(protective)인 것으로 표현된다. 일 양태에서, 보호성 마커 또는 일배체형은 질병 또는 성향의 유의성 있는 감소된 위험도(또는 감수성)를 부여하는 마커 또는 일배체형이다. 일 구체예에서, 유의성 있는 감소된 위험도는 0.9 미만, 0.8 미만, 0.7 미만, 0.6 미만, 0.5 미만, 0.4 미만, 0.3 미만, 0.2 미만 및 0.1 미만을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 0.9 미만의 상대적 위험도(또는 오즈비)로 측정된다. 하나의 특정한 구체예에서, 유의성 있는 감소된 위험도는 0.7 미만이다. 또 다른 구체예에서, 유의성 있는 감소된 위험도는 0.5 미만이다. 또 다른 구체예에서, 유의성 있는 감소된 위험도는 0.3 미만이다. 또 다른 구체예에서, 위험도(또는 감수성)의 감소는 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 및 98% 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 20% 이상이다. 하나의 특정한 구체예에서, 위험도의 유의성 있는 감소는 약 30% 이상이다. 또 다른 구체예에서, 위험도의 유의성 있는 감소는 약 50% 이상이다. 또 다른 구체예에서, 위험도의 유의성 있는 감소는 약 70% 이상이다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 본 발명의 특징으로 적합한 것으로 간주되는 다른 컷오프 또는 범위도 고려되고, 그들도 본 발명의 범위 내에 속한다.
본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 연구된 집단에 존재하는 두개의 대립형질을 갖는 마커(예를 들면, SNP)에 대해, 하나의 대립형질이 상기 집단 내에서 성향 또는 질병을 갖는 개인의 그룹에서 대조군 대비 증가된 빈도로 발견되는 경우, 상기 마커의 나머지 다른 대립형질은 상기 성향 또는 질병을 갖는 개인의 그룹에서 대조군 대비 감소된 빈도로 발견될 것으로 이해할 것이다. 그와 같은 경우에, 상기 마커의 하나의 대립형질(상기 성향 또는 질병을 갖는 개인에서 증가된 빈도로 발견되는 대립형질)은 위험 대립형질(at-risk allele)이고, 나머지 다른 대립형질은 보호성 대립형질(protective allele)일 것이다.
질병 또는 성향(예를 들면, 심혈관 질환)과 연관된 유전적 변이가 단독으로 주어진 유전형에 대해 질병의 위험도를 예측하기 위해 이용될 수 있다. SNP와 같은 이대립형질 마커(biallelic marker)의 경우, 3개의 가능한 유전형이 있다: 위험 변이에 대한 동형접합체, 이형접합체(heterozygote), 및 상기 위험 변이의 비-보인자(non-carrier). 복수의 유전자 좌에서의 변이와 연관된 위험도가 전체 위험도를 추정하기 위해 이용될 수 있다. 복수 개의 SNP 변이에 대해, k( = 3 n x 2 p ) 개의 가능한 유전형이 있고; 상기에서 n은 상염색체 유전자좌(autosomal loci)의 갯수이고 p는 성염색체 유전자좌의 갯수이다. 전체 위험도 평가는 통상적으로 상이한 유전적 변의의 상대적 위험도가 곱해진다는 것, 즉, 특정한 유전형 조합과 연관된 전체 위험도(예를 들면, RR 또는 OR)이 각 유전자좌의 유전자형에 대한 위험도 값의 곱이라는 것을 가정한다. 제시된 위험도가 일치된(matched) 성별 및 민족을 갖는 기준 집단 대비 개인, 또는 개인에 대한 특정한 유전형에 대한 상대적 위험도를 나타내는 경우, 통합 위험도(combined risk)는 유전자좌-특이적 위험도 값의 곱이고, 이는 또한 집단 대비 전체 위험도 추정치에 해당한다. 개인에 대한 위험도가 위험 대립형질의 비-보인자에 대한 비교에 근거하는 경우, 통합 위험도는 모든 유전자좌의 유전형의 주어진 조합을 갖는 인간을 상기 유전자좌들에서 위험 변이를 보유하지 않는 개인들의 군에 비교하는 추정치에 해당한다. 위험 변이의 비-보인자들의 그룹은 가장 낮은 추정된 위험도를 가지며 그 자체(즉, 비-보인자)와 비교하여 1.0의 통합 위험도를 가지나, 집단 대비, 1.0 미만의 전체 위험도를 갖는다. 비-보인자 그룹은 잠재적으로 매우 작을 수 있고, 특히, 다수의 유전자좌에 대해 매우 작을 수 있으며, 그 경우, 그의 관련성은 따라서 작다는 것이 주목된다.
승법 모델(multiplicative model)은 일반적으로 복합 성향(complex trait)의 데이터에 합리적으로 잘 맞는 간명(parsimonious) 모델이다. 승법성(multiplicity)으로부터의 편차는 일반적인 질환에 대한 일반적인 변이에서는 드물게 설명되었으며 보고된 경우에도, 제안적인 것에 불과하며, 이는 유전자좌 간의 통계적 상호작용을 입증할 수 있기 위해서는 매우 큰 표본 크기가 통상적으로 요구되기 때문이다.
예로서, 전립선 암과 연관된 것으로 기재된 총 8개의 변이를 고려한다(Gudmundsson, J., et al., Nat Genet 39:631-7 (2007), Gudmundsson, J., et al., Nat Genet 39:977-83 (2007); Yeager, M., et al, Nat Genet 39:645-49 (2007), Amundadottir, L., el al., Nat Genet 38:652-8 (2006); Haiman, C.A., et al., Nat Genet 39:638-44 (2007)). 이 유전자좌들 중 7개는 상염색체 상에 있고, 나머지 유전자좌는 염색체 X 상에 있다. 이 때, 이론적인 유전형 조합의 총수는 37 x 21 = 4374이다. 그 유전형 분류(genotypic class) 중 일부는 매우 드무나, 여전히 가능하고, 전체 위험도 평가를 위해 고려되어야 한다. 복수 개의 유전적 변이의 경우에 적용된 승법 모델은 상기 유전적 변이가 환경적 인자와 명확하게 상관되지 않는다는 것을 가정할 때 비-유전적 위험 변이와의 결합(conjugation)에서 유효할 것으로 보인다. 다시 말하면, 비-유전적 위험 인자와 유전적 위험 인자가 상호작용하지 않는다는 것을 가정할 때, 유전적 변이와 비-유전적 변이는 통합 위험도를 추정하기 위해 승법 모델 하에 평가될 수 있다.
동일한 정량적 접근방법을 이용하여, 본 명세서에 기재된, 심혈관 질환과 연관된 복수 개의 변이와 연관된 통합 위험도 또는 전체 위험도가 평가될 수 있다.
연관 불균형(Linkage Disequilibrium)
각 감수분열 사건 동안 각 염색체 쌍에 대해 평균 1회 일어나는, 재조합의 자연적인 현상은 자연이 서열(및 결과적으로 생물학적 기능)에 변화를 제공하는 한가지 방법이다. 재조합은 게놈에서 랜덤하게 일어나지 않는 것으로 발견되었다; 오히려, 재조합율의 빈도에 큰 변화가 있어서, 높은 재조합 빈도를 갖는 작은 영역(따라서, 재조합 핫스팟(recombination hotspot)으로 불림) 및 일반적으로 연관 불균형(LD) 블럭이라 불리는, 낮은 재조합 빈도의 보다 넓은 영역을 생성한다(Myers, S. et al., Biochem Soc Trans 34:526-530 (2006); Jeffreys, A.J., et al.,Nature Genet 29:217-222 (2001); May, C.A., et al., Nature Genet 31:272-275(2002)).
연관 불균형(Linkage Disequilibrium, LD)은 두 개의 유전적 요소의 비-랜덤 조합(non-random assortment)을 의미한다. 예를 들면, 특정한 유전적 요소(예를 들면, 다형성 마커의 대립형질(allele))가 0.50(50%)의 빈도로 집단에서 일어나고, 또 다른 요소가 0.50(50%)의 빈도로 일어나는 경우, 두 요소를 모두 갖는 개인의 예상되는 발생율은 상기 요소들의 랜덤 분포를 가정하면, 0.25(25%)이다. 그러나, 상기 두 요소들이 0.125보다 더 높은 빈도로 함께 나타나는 것으로 발견되는 경우, 상기 요소들은 연관 불균형에 있다고 하며, 이는 그들이 그들의 독립적인 대립형질 빈도가 예측하는 비율보다 더 높은 비율로 함께 유전되는 경향이 있기 때문이다. 개략적으로, LD는 일반적으로 두 요소간의 재조합 사건의 빈도와 상관관계를 갖는다. 집단에서 대립형질 또는 일배체형 빈도는 집단 내의 개체의 유전형을 분석하고 상기 집단에서 각 대립형질 또는 일배체형의 발생 빈도를 결정하는 것에 의해 결정될 수 있다. 이배체(diploid)의 집단, 예를 들면, 인간 집단의 경우, 개인들은 일반적으로 각 유전적 요소(예를 들면, 마커, 일배체형 또는 유전자)에 대해 두 개의 대립형질 또는 대립형질 조합을 가질 것이다.
다수의 상이한 척도들이 연관 불균형(LD)의 강도를 평가하기 위해 제안되었다. 대부분은 이대립형질(biallelic) 부위의 쌍 간의 연관의 강도를 획득한다. LD의 두 개의 중요한 일대일 척도(pairwise measures)는 r2 (△2으로 표시되기도 함) 및 |D'|이다. 두 척도는 모두 0(불균형 없음) 내지 1('완전한' 불균형)의 범위이나, 그들의 해석은 약간 다르다. |D'|는 가능한 일배체형 중 2개 또는 3개만 존재하는 경우, 그 값이 1이고, 모든 4개의 가능한 일배체형이 존재하는 경우는 그 값이 1보다 작은 것으로 정의된다. 따라서, 1보다 작은 |D'|의 값은 두 부위 간에 과거에 재조합이 일어났을 수도 있다는 것을 나타낸다(재발성 돌연변이(recurrent mutation)는 |D'|가 1보다 작게할 수 있으나, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 경우, 이는 통상적으로 재조합보다 가능성이 낮은 것으로 간주됨). 척도 r2는 두 부위간의 통계적 상관성을 나타내고, 두 개의 일배체형만 존재하는 경우 1의 값을 취한다.
r2와, 감수성 유전자 좌와 SNP 간의 연관성을 검출하기 위해 요구되는 표본 크기 간에 단순한 반비례 관계(inverse relationship)가 있기 때문에, r2 측정값은 이론의 여지는 있지만 연관 맵핑(association mapping)에 대한 가장 적합한 척도이다. 이 척도는 부위의 쌍에 대해 정의되나, 일부 적용의 경우, 다수의 다형성 부위를 포함하는 전체 영역에서 LD가 얼마나 강한지를 결정하는 것이 바람직할 수 있다(예를 들면, LD의 강도가 유전자 좌들 간에 또는 집단 전체에 있어서 유의성 있게 상이한지 여부, 또는 하나의 영역에서 특정한 모델 하에서 예측된 것보다 더 크거나 또는 더 작은 LD가 존재하는지 여부). 한 영역에 대해 LD를 측정하는 것은 간단하지 않으나, 하나의 방법은 집단 유전학에서 개발된, 척도 r을 이용하는 것이다. 개략적으로 말하면, r은 데이터에서 확인되는 LD를 생성하기 위해, 특정한 집단 모델 하에서 어느 정도의 재조합이 요구되는지를 측정한다. 이 종류의 방법은 또한 잠재적으로 LD 데이터가 재조합 핫스팟의 존재에 대한 증거를 제공하는지 여부를 결정하는 문제에 대한 통계적으로 엄격한 방식을 제공할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법의 경우, 유의성 있는 r2 값은 0.1 이상, 예를 들면, 0.1 이상, 0.15 이상, 0.2 이상, 0.25 이상, 0.3 이상, 0.35 이상, 0.4 이상, 0.45 이상, 0.5 이상, 0.55 이상, 0.6 이상, 0.65 이상, 0.7 이상, 0.75 이상, 0.8 이상, 0.85 이상, 0.9 이상, 0.91 이상, 0.92 이상, 0.93 이상, 0.94 이상, 0.95 이상, 0.96 이상, 0.97 이상, 0.98 이상, 0.99 이상일 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에서, 유의성 있는 r2 값은 0.2 이상일 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 기재된 연관 불균형은 0.3 이상, 0.4 이상, 0.5 이상, 0.6 이상, 0.7 이상, 0.8 이상, 0.85 이상, 0.9 이상, 0.95 이상, 0.96 이상, 0.97 이상, 0.98 이상, 0.99 이상과 같은, 0.2 이상의 |D'| 값을 특징으로 하는 연관 불균형을 의미한다. 따라서, 연관 불균형은 별개의 마커들의 대립형질 간의 상관관계를 나타낸다. 연관 불균형은 상관 계수(correlation coefficient) 또는 |D'| (1.0 이하의 r2 및 1.0 이하의 |D'|)에 의해 측정된다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 유의성 있는 연관 불균형은 0.1보다 큰 r2 및 0.8보다 큰 |D'|으로 정의된다. 또 다른 구체예에서, 유의성 있는 연관 불균형은 0.2보다 큰 r2 및 0.9보다 큰 |D'|으로 정의된다. 연관 불균형을 결정하기 위해 r2 및 |D'| 값의 다른 조합 및 변경(permutation)도 고려되며, 본 발며의 범위 내에 속한다. 연관 불균형은 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 하나의 인간 집단에서 결정될 수 있거나, 또는 하나보다 많은 인간 집단으로부터의 개인들을 포함하는 표본의 집합(colleciton)에서 결정될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, LD는 정의된 바와 같은(http://www.hapmap.org), 하나 이상의 HapMap 집단(코카서스인, 아프리카인, 일본인, 중국인)으로부터의 표본에서 결정된다. 하나의 그와 같은 구체예에서, LD는 HapMap 표본의 CEU 집단에서 결정된다. 또 다른 구체예에서, LD는 YRI 집단에서 결정된다. 또 다른 구체예에서, LD는 아이슬란드 집단으로부터의 표본에서 결정된다.
게놈의 모든 다형성이 집단 수준에서 독립적이라면, 모든 상이한 다형성 상태를 평가하기 위해 모든 단일 다형성이 연관(association) 연구에서 조사되어야 할 것이다. 그러나, 다형성 간의 연관 불균형 때문에, 긴밀하게 연관된 다형성들이 강한 상관관계를 가지며, 이는 유의성 있는 연관을 관찰하기 위해 연관 연구에서 조사되어야 하는 다형성의 갯수를 감소시킨다. LD의 또 다른 결과는 이 다형성들이 강한 상관관계를 갖는다는 사실 때문에, 다수의 다형성들이 연관 신호(association signal)를 생성할 수 있다는 것이다.
게놈 LD 맵이 게놈 전체에 대해 생성되었고, 그와 같은 LD 맵이 질병-유전자를 맵핑하기 위한 프레임워크로 작용할 것으로 제안되었다(Risch, N. & Merkiangas, K, Science 273:1516-1517 (1996); Maniatis, N., et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:2228-2233 (2002); Reich, DE et al, Nature 411:199-204 (2001)). 현재, 인간 게놈의 많은 부분들이 수개의 공통된 일배체형을 포함하는 일련의 별개의 일배체형 블럭들로 분류될 수 있다는 것이 확립되었다; 이 블럭들의 경우, 연관 불균형 데이터는 재조합을 나타내는 증거를 거의 제공하지 않는다(예를 들면, Wall., J.D. and Pritchard, J.K., Nature Reviews Genetics 4:587-597 (2003); Daly, M. et al., Nature Genet. 29:229-232 (2001); Gabriel, S.B. et al., Science 296:2225-2229 (2002); Patil, N. et al., Science 294:1719-1723 (2001); Dawson, E. et al., Nature 418:544-548 (2002); Phillips, M.S. et al., Nature Genet. 33:382-387 (2003) 참조). 이와 같은 일배체형 블럭을 정의하는 두 가지 주요한 방법들이 있다: 블럭은 한정된 일배체형 다양성을 갖는 DNA의 영역(예를 들면, Daly, M. et al., Nature Genet. 29:229-232 (2001); Patil, N. et al., Science 294:1719-1723 (2001); Dawson, E. et al., Nature 418:544-548 (2002); Zhang, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:7335-7339 (2002) 참조), 또는, 연관 불균형을 이용하여 확인된, 광범위한 과거의 재조합(extensive historical recombination)을 갖는 이행 구역(transition zone) 간의 영역(예를 들면, Gabriel, S.B. et al., Science 296:2225-2229 (2002); Phillips, M.S. et al., Nature Genet. 33:382-387 (2003); Wang, N. et al., Am. J. Hum. Genet. 71:1227-1234 (2002); Stumpf, M.P., and Goldstein, D.B., Curr. Biol. 13:1-8 (2003) 참조)으로 정의될 수 있다. 보다 최근에, 인간 게놈 전체에 대한 재조합률(recombination rate) 및 상응하는 핫스팟의 상세 맵(fine-scale map)이 작성되었다(Myers, S., et al., Science 310:321-32324 (2005); Myers, S. et al., Biochem Soc Trans 34:526530 (2006)). 상기 맵은 게놈 전체에서 재조합의 엄청난 변이를 보여주며, 재조합률은 핫스팟에서 10-60 cM/Mb로 높았고, 개재 영역(intervening region)에서는 재조합률이 0에 가까워서, 제한적인 일배체형 다양성 및 높은 LD의 영역을 나타낸다. 따라서, 상기 맵은 일배체형 블럭 및/또는 LD 블럭을 재조합 핫스팟에 의해 둘러싸인(flanked) 영역으로 정의하기 위해 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "일배체형 블럭(haplotype block)" 또는 "LD 블럭"은 전술된 특징들에 의해 정의되는 블럭, 또는 그와 같은 영역을 정의하기 위해 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 이용되는 다른 대안적인 방법에 의해 정의되는 블럭을 포함한다. 일배체형 블럭(LD 블럭)은 단일 마커, 또는 복수 개의 마커를 포함하는 일배체형을 이용하여, 표현형과 일배체형 상태 간의 연관을 맵핑하기 위해 이용될 수 있다. 각 일배체형 블럭에서 주요한 일배체형이 식별되고, 그 후, 일련의 "태깅(tagging)" SNP 또는 마커들(일배체형들을 구별하기 위해 필요한 최소 세트의 SNP 또는 마커)이 식별될 수 있다. 이 태깅 SNP 또는 마커들은 표현형과 일배체형 간의 연관을 확인하기 위해, 개체들의 군(group)으로부터의 표본의 평가에서 이용될 수 있다. 필요한 경우, 인접한 일배체형 블럭들 간에는 연관 불균형이 존재할 수 있기 때문에, 이 블럭들이 동시에 평가될 수 있다.
따라서, 게놈에서 다형성 마커에 대한 관찰된 연관에 대해, 게놈 내의 추가적인 마커들이 또한 연관을 보일 수 있다는 것이 명백하다. 이는 재조합률의 큰 변이에서 관찰된 바와 같이, 게놈 전체에서 LD의 불균등한 분포의 당연한 결과이다. 따라서, 연관을 검출하기 위해 이용되는 마커들은 주어진 질병 또는 성향과 연관된 게놈 영역(즉, 일배체형 블럭 또는 LD 블럭; 예를 들면, CO9 LD 블럭)에 대한 "택(tag)"을 나타내고, 따라서, 본 발명의 방법 및 키트에서 사용하기에 유용하다. 하나 이상의 원인이 되는(causative)(기능성) 변이 또는 돌연변이가 상기 질병 또는 성향과 연관된 것으로 확인되는 영역 내에 존재할 수 있다. 그와 같은 변이는 연관을 검출하기 위해 이용되는 태깅 마커에 대해 관찰되는 것보다 더 높은 상대적 위험도(RR) 또는 오즈비(OR)를 부여할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 질병과의 연관을 검출하기 위해 이용되는 마커, 및 상기 마커와 연관 불균형인 마커를 포함한다. 따라서, 본 발명의 특정한 구체예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 본 발명의 마커 및/또는 일배체형과 LD인 마커가 대리 마커(surrogate marker)로 이용될 수 있다. 일 구체예에서, 대리 마커는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 초기에 상기 질병과 연관된 것으로 확인된 마커 또는 일배체형의 경우보다 더 작은 상대적 위험도(RR) 및/또는 오즈비(OR)을 갖는다. 다른 구체예에서, 대리 마커는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 상기 질환과 연관된 것으로 초기에 확인된 마커에 대해 초기에 결정된 RR 또는 OR 값보다 큰 RR 또는 OR 값을 갖는다. 그와 같은 구체예의 예는 본 명세서에 기재된 변이와 같은, 상기 질병과 연관되는 것으로 초기에 확인된 보다 더 일반적인 변이(> 10% 집단 빈도)와 LD인 드물거나, 또는 비교적 드문(< 10% 대립형질의 집단 빈도) 변이일 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명자들에 의해 발견된 연관을 검출하기 위해 그와 같은 마커들을 식별하고 이용하는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있고, 따라서, 본 발명의 범위에 속한다.
일배체형 빈도의 결정
기대값-극대화 알고리즘(expectation-maximization algorithm)을 이용하여 환자군 및 대조군에서 일배체형의 빈도를 추정할 수 있다(Dempster A. et al., J. R. Stat. Soc. B, 39:1-38 (1977)). 결실된 유전형 및 그 상태(phase)에 따른 불확실성을 처리할 수 있는 이 알고리즘의 구현이 이용될 수 있다. 귀무 가설(null hypothesis) 하에서, 환자와 대조군은 동일한 빈도를 갖는 것으로 가정된다. 가능성 방식(likelihood approach)을 이용하여, 본 명세서에 기재된 마커들을 포함할 수 있는, 후보 위험-일배체형이 대조군에서보다 환자에서 보다 높은 빈도를 가지며, 다른 일배체형의 빈도는 양 군에서 동일한 것으로 가정되는 것인 대안적인 가설이 테스트된다. 양 가설 하에 가능성이 각각 극대화되고, 상응하는 1-df 가능성 비 통계값이 통계적 유의성을 평가하기 위해 이용된다.
연관 영역(linkage region) 내에서 위험 마커와 일배체형 및 보호성 마커와 일배체형을 찾기 위해, 예를 들면, 마커들이 실제 영역에 걸쳐있는 경우, 유전형 분석된 마커들의 모든 가능한 조합의 연관이 연구된다. 통합된 환자군과 대조군이 원래의 환자군 및 대조군과 동일한 크기인 두개의 세트로 무작위로 분류될 수 있다. 그 후, 마커 및 일배체형 분석이 반복되고, 기록된 가장 유의성 있는 p-값이 결정된다. 이 랜덤화 체계(randomization scheme)는 p-값의 경험적 분포를 구성하기 위해 예를 들면, 100회 이상 반복될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 0.05 미만의 p-값은 유의성 있는 마커 및/또는 일배체형 연관을 나타낸다.
일배체형 분석
일배체형 분석의 일반적인 방법은 NEsted MOdels에 적용된 가능성-기반 추론(likelihood-based inference)을 이용하는 단계를 포함한다(Gretarsdottir S., et al., Nat. Genet. 35:131-38 (2003)). 상기 방법은 다수의 다형성 마커, SNP 및 마이크로새틀라이트에 대해 이용될 수 있는 프로그램 NEMO에서 구현된다. 상기 방법 및 소프트웨어는 특별히, 상이한 위험도를 부여하는 일배체형 그룹을 식별하는 것을 목적으로 하는 케이스-대조군(case-control) 연구를 위해 설계된다. 상기 방법 및 프로그램은 또한 LD 구조를 연구하기 위한 도구이다. NEMO에서, 관찰된 데이터가 이를 결실-데이터(missing-data) 문제로 처리하기 때문에, EM 알고리즘을 이용하여, 최대 가능성 추정치, 가능성 비(likelihood ratio) 및 p-값이 직접 계산된다.
상태(phase)의 불확실성 및 결실된 유전형에 따른 정보 소실을 반영한, 관찰된 데이터에 대해 직접 계산된 가능성에 기반한 가능성 비 테스트가 유효한 p-값을 제공하기 위해 이용될 수 있으나, 정보의 불완전성 때문에 소실된 데이터의 양을 아는 것이 여전히 유용할 것이다. 일배체형 분석의 정보 척도(information measure)는 Nicolae and Kong (Technical Report 537, Department of Statistics, University of Statistics, University of Chicago; Biometrics, 60(2):368-75 (2004))에서 연관성 분석(linkage analysis)를 위해 정의된 정보 척도의 당연한 연장(natural extension)으로 설명되며, NEMO에서 구현된다.
질병에 대한 단일 마커 연관을 위해, 각각의 개별적인 대립형질에 대해 양측 p-값(two-sided p-value)을 계산하기 위해 Fisher exact 테스트가 이용될 수 있다. 통상적으로, 모든 p-값은 특별히 표시되지 않으면, 다중 비교(multiple comparison)에 대해 조정되지 않은 상태로 제시된다. (마이크로새틀라이트, SNP 및 일배체형에 대해) 제시된 빈도는 보인자 빈도(carrier frequency)와 대립되는, 대립형질 빈도(allelic frequency)이다. 연관 분석을 위한 패밀리로 동원된 환자들의 관련성(relatedness)에 따른 편향을 최소화하기 위해, 환자 목록에서 1촌 및 2촌(first and second-degree) 친척들이 제외될 수 있다. 또한, 혈연관계(sibship)에 대해 Risch, N. & Teng, J. (Genome Res., 8:1273-1288 (1998))에 기재된 분산 조정 절차(variance adjustment procedure), DNA 풀링 (ibid)을 확대하여 일반적인 가족 관계(familial relationship)에 적용될 수 있도록, 상기 테스트가 환자들 간의 잔여 관련성(remaining relateteness)에 대해 보정하기 위해 연관에 대해 반복될 수 있고, 비교를 위해 조정된 p-값 및 조정되지 않은 p-값을 제시할 수 있다. 차이는 예상되는 바와 같이 일반적으로 매우 작다. 복수 회의 테스트에 대해 보정된 단일-마커 연관성의 유의성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 동일한 유전형 데이터를 이용하여 랜덤화 테스트를 수행할 수 있다. 환자와 대조구의 코호트가 랜덤화되고 연관 분석이 복수 회(예를 들면, 500,000회 이하) 재수행되며, 그 p-값은 본 발명자들이 본래의 환자 및 대조구 코호트를 이용하여 관찰한 p-값과 동일하거나 그보다 더 낮은, 일부 대립형질에 대한 p-값을 생성하는 재현의 일부(fraction of replications)이다.
단일 마커 분석 및 일배체형 분석에 대해, 승법 모델(multiplicative model)(일배체형 상대적 위험도 모델), 즉, 한 사람이 갖는 두 개의 대립형질/일배체형의 위험도들이 곱해진다는 승법 모델을 가정하여 상대적 위험도(RR) 및 집단 귀속 위험도(population attributable risk, PAR)가 계산될 수 있다(Terwilliger, J.D. & Ott, J., Hum. Hered. 42:337-46 (1992) and Falk, C.T. & Rubinstein, P, Ann. Hum. Genet. 51 (Pt 3):227-33 (1987)). 예를 들면, RR이 a 대비 A의 위험도라면, 동형접합체 AA를 갖는 사람의 위험도는 이형접합체 Aa의 위험도의 RR배이고, 동형접합체 aa를 갖는 사람의 RR2배일 것이다. 승법 모델은 분석 및 계산을 단순화하는 유용한 특성을 갖는다- 환자 집단(affected population) 및 대조구 집단 내에서 일배체형은 독립적이고, 즉, 하디-와인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)에 있다. 그 결과, 환자(affected)와 대조군 각각의 일배체형 계수(haplotype count)는 다항 분포를 가지나, 대안적인 가설 하에서 상이한 일배체형 빈도를 갖는 다항 분포를 갖는다. 구체적으로, 두개의 일배체형, h i 및 h j 에 대해, risk(h i )/risk(h j ) = (f i /p i )/(f j /p j )이고, 상기에서 f와 p는 각각 환자 집단 및 대조구 집단에서의 빈도를 나타낸다. 실제 모델이 승법성이 아닌 경우, 일부 검정력 손실(power loss)이 있으나, 이 손실은 극단적인 경우를 제외하고는 작은(mild) 경향이 있다. 가장 중요한 것은, p-값은 귀무 가설 하에 계산되기 때문에, 항상 유효하다는 것이다.
NEMO를 이용한 연관 불균형
마커들의 쌍 간의 LD는 D' 및 r2 의 표준 정의를 이용하여 계산될 수 있다(Lewontin, R., Genetics 49:49-67 (1964); Hill, W.G. & Robertson, A. Theor. Appl. Genet. 22:226-231 (1968)). NEMO를 이용하여, 두 마커 대립형질 조합의 빈도가 최대 가능성(maxium likelihood)에 의해 추정되고 연관 균형으로부터의 편차가 가능성 비 테스트(likelihood ratio test)에 의해 평가된다. D' 및 r2의 정의가 한계 대립형질 확률(marginal allele probability)에 의해 가중된 두 마커의 모든 가능한 대립형질 조합에 대해 평균하는 것에 의해 마이크로새틀라이트를 포함하도록 확대된다.
위험도 평가 및 진단
주어진 집단 내에서, 사람이 특정된 기간 동안 특정한 질병 또는 성향을 발생시킬 가능성으로 정의된, 질병 또는 성향을 발생시킬 절대 위험도(absolute risk)가 있다. 예를 들면, 여성의 유방암에 대한 평생 절대 위험도(lifetime absolute risk)는 1/9이다. 즉, 9명의 여성 당 1명은 그들의 일생 중 어느 시점에 유방암을 발병할 것이다. 위험도(risk)는 통상적으로 특정인이 아니라, 매우 많은 수의 사람들을 조사하는 것에 의해 측정된다. 위험도는 종종 절대적 위험도(Absolute Risk, AR) 및 상대적 위험도(Relative Risk, RR)로 제시된다. 상대적 위험도는 두개의 변이와 연관된 위험도, 또는 두개의 상이한 사람들의 그룹의 위험도를 비교하기 위해 이용된다. 예를 들면, 상대적 위험도는 특정한 유전형을 갖는 사람들의 그룹과 다른 유전형을 갖는 또 다른 그룹을 비교하기 위해 이용될 수 있다. 질병에 대해, 2의 상대적 위험도는 하나의 그룹이 나머지 그룹보다 질병을 발병할 가능성이 두배 높다는 것을 의미한다. 제시된 위험도는 일치된 성별 및 민족의 집단 대비, 1인, 또는 1인의 특정한 유전형에 대한 상대적 위험도이다. 동일한 성별 및 민족의 2인의 위험도는 단순한 방식으로 비교될 수 있다. 예를 들면, 집단에 비교되는 경우, 제1 개체는 1.5의 상대적 위험도를 가지며, 제2 개체는 0.5의 상대적 위험도를 가지며, 제2 개체 대비 제1 개체의 위험도는 1.5/0.5 = 3이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 특정한 다형성 마커 및 그와 같은 마커를 포함하는 일배체형이 심혈관 질환, 예를 들면, 동맥 질환, 심근 경색증, 관상동맥 질환, 재협착, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 두개내 동맥류(intracranial aneurysm), 및 복부 대동맥류의 위험도 평가를 위해 유용한 것으로 확인되었다. 위험도 평가는 심혈관 질환에 대한 감수성을 진단하기 위한 마커의 이용을 포함할 수 있다. 다형성 마커의 특정한 대립형질은 심혈관 질환의 진단을 갖지 않는 개체들에서보다, 심혈관 질환의 진단을 갖는 개체들에서 보다 빈번하게 발견된다. 그러므로, 이 마커 대립형질들은 개체에서 심혈관 질환, 또는 심혈관 질환에 대한 감수성을 검출하기 위한 예측적 가치(predictive value)를 갖는다. 본 발명의 마커와 같은, 위험 마커들을 포함하는 일배체형 블럭 또는 LD 블럭 내의 태깅 마커들(tagging markers)이 일배체형 블럭 또는 LD 블럭 내의 다른 마커 및/또는 일배체형에 대한 대리물(surrogate)로 이용될 수 있다. 1의 r 2 값을 갖는 마커들이 위험 변이(at-risk variant)에 대한 완벽한 대리물이고, 즉, 하나의 마커에 대한 유전형이 나머지 마커에 대한 유전형을 완벽하게 예측한다. 1보다 작은 r 2 값을 갖는 마커들도 위험 변이의 대리물일 수 있거나, 또는 대안적으로 그 위험 변이만큼 높거나 또는 그 변이보다 훨씬 더 높은 상대적 위험도 값을 갖는 변이를 나타낸다. 확인된 위험 변이는 그 자체로 기능적 변이가 아닐 수 있으나, 이 경우, 진정한 기능적 변이와 연관 불균형 관계일 수 있다. 본 발명은 본 명세서에 개시된 마커에 대한 그와 같은 대리 마커(surrogate marker)의 평가를 포함한다. 그와 같은 마커들이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 공개 데이터베이스에 설명(annotate)되고, 맵핑되고, 열거되어 있거나, 또는 대안적으로 개체들의 군에서 본 발명의 마커에 의해 확인된 영역 또는 그 영역의 일부를 서열결정하고, 결과적으로 수득된 서열의 군에서 다형성을 식별하는 것에 의해 용이하게 식별될 수 있다. 그 결과, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 용이하게, 과도한 실험 없이 본 명세서에 기재된 마커 및/또는 일배체형과 연관 불균형인 대리 마커들의 유전형을 분석할 수 있다. 검출된 위험 변이와 LD인 태깅 마커 또는 대리 마커도 개인에서 심혈관 질환, 또는 심혈관 질환에 대한 감수성에 대한 연관을 검출하기 위한 예측적 가치를 갖는다. 본 발명의 마커들과 LD인 이 태깅 마커들 또는 대리 마커들은 또한 이들이 유사하게 심혈관 질환에 대한 감수성을 검출하기 위한 예측적 가치를 갖기 때문에, 일배체형들을 구별하는 다른 마커들을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 심혈관 질환과 연관된 것으로 본 명세서에 기재된 변이의 존재에 대해 개인으로부터 유래된 게놈 DNA를 포함하는 시료를 평가하는 것에 의해 실시될 수 있다. 그와 같은 평가는 당업자에게 잘 알려지고 본 명세서에서 더 설명될 방법을 이용하여, 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고, 그와 같은 평가의 결과에 근거하여 시료가 유래된 개인이 심혈관 질환의 증가된 위험도 또는 감소된 위험도(증가된 감수성 또는 감소된 감수성)를 갖는지 여부를 결정한다. 대안적으로, 본 발명은 심혈관 질환과 연관된 것으로 본 명세서에 기재된 하나 이상의 다형성 마커(또는 심혈관 질환과 연관된 것으로 본 명세서에서 입증된 하나 이상의 마커와 연관 불균형인 마커)의 유전형 상태에 대한 정보를 포함하는 데이터세트를 이용하여 실시될 수 있다. 다시 말하면, 그와 같은 유전적 상태에 대한 정보, 예를 들면, 특정한 다형성 마커, 또는 복수 개의 마커에서의 유전형 계수(genotype count)의 형태(예를 들면, 특정한 위험 대립형질의 존재 또는 부재의 표시), 또는 하나 이상의 마커에 대한 실제의 유전형의 형태로 유전적 상태에 대한 정보를 포함하는 데이터세트가 심혈관 질환과 연관된 것으로 본 발명자들에 의해 입증된 특정한 다형성 마커의 특정한 위험 대립형질의 존재 또는 부재를 위해 조사될 수 있다. 본 명세서에서 입증된, 심혈관 질환과 연관된 변이(예를 들면, 마커 대립형질)에 대한 양성 결과는 상기 데이터세트가 유래된 개인이 하나 이상의 심혈관 질환(예를 들면, 동맥 질환, 예를 들면, 심근 경색증, 관상동맥 질환, 재협착증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 두개내 동맥류 및 복부 대동맥류)의 증가된 감수성(증가된 위험도)을 갖는다는 것을 나타낸다.
본 발명의 특정한 구체예에서, 다형성 마커는 다형성 마커에 대한 유전형 데이터를 다형성의 하나 이상의 대립형질과 질환 간의 상관관계를 포함하는 참조표를 참조하는 것에 의해, 심혈관 질환과 상관된다. 일부 구체예에서, 상기 표는 하나의 다형성에 대한 상관관계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 표는 복수 개의 다형성에 대한 상관관계를 포함한다. 두 시나리오 모두에서, 마커와 심혈관 질환 간의 상관관계의 표시를 제공하는 참조표를 참조하는 것에 의해, 심혈관 질환에 대한 위험도, 또는 심혈관 질환에 대한 감수성이 시료가 유래된 개인에서 확인될 수 있다. 일부 구체예에서, 상관관계가 통계적 척도로서 보고된다. 통계적 척도는 상대적 위험도(RR), 절대 위험도(AR), 또는 오즈비(OR)과 같은 위험도 척도로 보고될 수 있다.
본 발명의 마커 및 일배체형, 예를 들면, 표 1 내지 36에 제시된 마커들, 예를 들면, 표 3, 10 및 21에 제시된 마커들은 단독으로, 또는 조합되어 심혈관 질환(예를 들면, 동맥 질환, 심근 경색증, 관상동맥 질환, 재협착, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 두개내 동맥류 및 복부 대동맥류)의 위험도 평가 및 진단적 목적을 위해 유용할 수 있다. 따라서, 개별적인 마커에 의한 위험도의 증가가 비교적 크지 않은 경우, 즉, 10-30%의 수준인 경우에도, 연관은 유의성 있는 영향을 가질 수 있다. 따라서, 상대적으로 일반적인 변이가 전체 위험도에 대해 유의성 있는 기여도를 가질 수 있거나(집단 귀속 위험도(PAR)이 높음), 또는 마커들의 조합이 마커들의 통합된 위험도에 근거하여, 심혈관 질환을 발병할 유의성 있는 통합 위험도(combined risk)를 갖는 개체들의 그룹을 정의하기 위해 이용될 수 있다.
바이오마커
심혈관 질환은 심혈관 질환을 발병할 증가된 위험과 관련된 것으로 사료되는, 여러 공통된 바이오마커들을 갖는 것으로 알려져 있다. 이들은 상승된 피브리노겐, PAI-1, 호모시스테인, 비대칭적 디메틸아르기닌, C-반응성 단백질 및 B-타입 나트륨 이뇨 펩티드(B-type natriuretic peptide, BNP)를 포함한다. 이 공통된 바이오마커들은 심혈관 질환에 대한 공통된 병인을 강조한다. 최근에, 요 펩티드(urinary peptide)가 심혈관 질환, 특히, 관상동맥 질환(CAD)에 대한 유망한 바이오마커인 것으로 확인되었다(Zimmerli, L.U., et al.,Mol Cell Proteomics 7:290-8 (2008)). 이들은 비-침습성이라는 장점을 가져서, 평가될 개체로부터 요 시료만을 요구한다. 일 적용에서, 요 시료 중의 폴리펩티드의 패턴은 CAD의 증가된 위험의 특징이다.
다수의 일반적인 염증 마커들이 CAD 및 MI를 포함한 관상동맥 심장 질환의 위험도를 예측하나, 이 마커들은 죽상경화증에 대해 특이적이지 않다. 예를 들면, Stein (Stein, S., Am J Cardiol , 87 (suppl):21A-26A (2001))은 관상동맥 심장 질환의 위험을 예측하기 위한 대리물로서 하기를 포함한 혈청 염증 마커의 이용을 검토한다: C-반응성 단백질(CRP), 혈청 아밀로이드 A, 피브리노겐, 인터루킨-6, 조직 괴사 인자-알파, 가용성 혈관 세포 부착 분자(soluble vascular cell adhesion molecules, sVCAM), 가용성 혈관간 부착 분자(soluble intervascular adhesion molecules, sICAM), E-셀렉틴, 매트릭스 메탈로프로테아제 타입(matrix metalloprotease type)-1, 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-2, 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-3, 및 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-9.
혈청 중 CRP 수준과 관상동맥 심장 질환에 대한 증가된 위험도 간의 유의성 있는 연관이 Women's Health Study에서 확인되었고, 4.5의 최고 상대적 위험도가 혈청 CRP의 최고 5분위수(quintile)의 여성들에서 관찰되었다(Ridker, P.M. et al., New England. J. Med., 347: 1557-1565 (2001)). 증가된 혈청 CRP와 여성에서 관상동맥 심장 질환 간의 유사한 상관관계가 보고되었다(Ridker, P.M et al., New Engld. J. Med., 342:836-843 (2000); Bermudez, E.A. et .al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 22: 1668-1673 (2002)). CRP와 같은 혈청 염증 마커의 증가와 관상동맥 심장 질환 간의 유사한 상관관계가 남성에 대해 보고되었다(Doggen, C.J.M. et al., J.. Internal Med., 248:406-414 (2000) and Ridker, P.M. et al., New England. J. Med., 336: 973-979 (1997)). 상승된 CRP 또는 다른 혈청 염증 마커들이 또한 과거에 심근 경색증을 앓았던 환자에서 제2 심근 경색증의 증가된 위험도에 대해 예후적이다(Retterstol, L. et al., Atheroscler., 160: 433-440 (2002)). 최근의 증거는 상승된 CRP가 유해한 임상적 결과에 대한 독립적인 위험 인자라는 것을 시사한다. 예를 들면, Ridker et al., N. Engl. J. Med. 352: 1 (January 6, 2005)를 참조한다.
류코트리엔 경로의 최종 산물은 아라키돈산으로부터 유래된 강력한 염증성 지질 매개체(inflammatory lipid mediator)이다. 그들은 지질 산화 및/또는 염증촉진성(proinlammatory) 효과를 통해 잠재적으로 죽상경화증의 발생 및 죽상경화성 플라크의 불안정화에 기여할 수 있고, LTC4, LTD4, 및 LTE4는 혈관수축을 유도하는 것으로 알려져 있다. 반면에, LTB4는 강력한 염증촉진제이다. 따라서, 류코트리엔 경로의 이와 같은 최종 산물들의 증가된 생성은 MI 및 죽상경화증에 대한 위험 인자로 작용할 수 있으며, 염증 및 혈관수축/혈관경련은 MI 및 죽상경화증의 발병기전에서 확립된 역할을 갖는다.
본 발명의 특정한 구체예에서, MI, CAD, AAA, IA, 뇌졸중 및/또는 PAD와 같은 심혈관 질환에 대한 유전적 위험 변이가 하나 이상의 바이오마커와 조합되어 평가된다. 예를 들면, 적합한 테스트 시료(예를 들면, 혈청, 혈장 또는 소변) 중의 염증성 마커의 수준이 측정될 수 있고, 대조군(정상의 질병-불포함(disease-free) 대조군, 또는 집단으로부터의 랜덤 표본) 대비, 시료 중의 바이오마커 수준의 결정이 이루어진다. 전체 위험도를 결정하기 위해, 본 명세서에 기재된 변이에 의해 부여되는 유전적 위험도와 조합되어 상기 분석의 결과가 분석될 수 있다. 대표적인 염증 마커는 C-반응성 단백질(CRP), 혈청 아밀로이드 A, 피브리노겐, 혈청 sCD40L, 류코트리엔(예를 들면, LTB4, LTC4, LTD4, LTE4), 류코트리엔 대사산물, 인터루킨-6, 조직 괴사 인자-알파, 가용성 혈관 세포 부착 분자(soluble vascular cell adhesion molecule, sVCAM), 가용성 혈관간 부착 분자(soluble intervascular adhesion molecule, sICAM), E-셀렉틴, 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-1, 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-2, 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-3, 매트릭스 메탈로프로테아제 타입-9, 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase, MPO), 및 N-티로신을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 마커는 CRP, sCD40L 또는 MPO이다. 바이오마커의 결정은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 표준 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 일 구체예에서, 류코트리엔 대사산물의 생성은 칼슘 이온운반체(ionophore)를 이용하여, 개체로부터의 제1 테스트 시료에서 자극된다. 생성 수준이 대조군 수준과 비교된다. 대조군 수준은 통상적으로, MI, CAD, AAA, IA, 뇌졸중 또는 PAD에 대한 위험을 갖지 않는 개체와 같은 대조군 개체(들)에서 발견되는 수준이다; 대안적으로, 대조군 수준은 보다 높은 밴드의 측정값(예를 들면, 평균 또는 중앙값보다 높은, 제2 사분위, 제3 사분위, 또는 제4 사분위; 제2 오분위(quintile), 제3 오분위, 제4 오분위 또는 제5 오분위) 대비 최저 밴드의 측정값(예를 들면, 평균 또는 중앙값 미만, 최저 사분위 또는 최저 오분위)와 연관된 집단에서의 질병 위험도의 비교에 의해 확인되는 수준이다.
전술된 바와 같이, 인간 게놈의 일배체형 블럭 구조는 질병 또는 성향과 본래 연관된 변이와 연관 불균형인 다수의 변이(마커 및/또는 일배체형)가 상기 질병 또는 성향에 대한 연관을 평가하기 위한 대리 마커로 이용될 수 있다는 효과를 갖는다. 그와 같은 대리 마커의 갯수는 해당 영역에서의 과거 재조합률(historical recombination rate), 해당 영역에서의 돌연변이 빈도(즉, 해당 영역 내의 다형성 부위 또는 마커의 갯수), 및 해당 영역에서 LD의 정도(LD 블럭의 크기)와 같은 인자들에 의존할 것이다. 이 마커들은 통상적으로 본 명세서에 기재된 방법, 또는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 공지된 다른 방법을 이용하여 정의된 것과 같은 해당 LD 블럭 또는 일배체형 블럭의 물리적 경계 내에 위치한다. 그러나, 종종, 마커 및 일배체형 연관은 정의된 일배체형 블럭의 물리적 경계를 넘어서 연장되는 것으로 발견된다. 그와 같은 마커 및/또는 일배체형은 그 경우에 또한 정의된 일배체형 블럭 내에 물리적으로 존재하는 마커 및/또는 일배체형에 대한 대리 마커 및/또는 일배체형으로 이용될 수 있다. 그 결과, 본 발명의 마커 및 일배체형과 LD(일반적으로 0.3보다 큰 r2, 또는 0.4보다 큰 r2을 포함한, 0.2보다 큰 r2과 같은, 0.1보다 큰 r2을 특징으로 함)인 마커 및 일배체형도, 물리적으로 정의된 일배체형 블럭의 경계를 넘어서 존재하더라도, 본 발명의 범위 내에 속한다. 이는 본 명세서에 기재된 마커들(예를 들면, 표 1 내지 36; 예를 들면, 표 3, 10 및 21)을 포함하나, 또한, 표 3, 10 및 21에 표시된 마커들을 포함한, 표 1 내지 35에 열거된 하나 이상의 마커와 강한 LD(예를 들면, 0.2보다 큰 r2 및/또는 |D'| > 0.8을 특징으로 함)인 다른 마커들을 포함한다.
본 명세서에 기재된 SNP 마커의 경우, 환자에서 과량으로 존재하는 것으로 확인된 대립형질(위험-대립형질)에 대한 반대 대립형질(opposite allele)은 심혈관 질환에서 감소된 빈도로 발견된다. 따라서, 이 마커들 및 일배체형은 심혈관 질환에 대해 보호성이고, 즉, 그들은 이 마커들 및/또는 일배체형을 갖는 개인들이 심혈관 질환을 발병할 감소된 위험도 또는 심혈관 질환에 대한 감소된 감수성을 부여한다.
특정한 일배체형을 포함한, 본 발명의 특정 변이들은 일부 경우에, 다양한 유전적 마커들의 조합, 예를 들면, SNP와 마이크로새틀라이트의 조합을 포함한다. 일배체형을 검출하는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려지고 및/또는 본 명세서에 기재된, 다형성 부위에서의 서열을 검출하는 방법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 특정한 일배체형 또는 일련의 마커들과 질병 표현형 간의 상관관계가 표준 기법을 이용하여 검증될 수 있다. 간단한 상관성 테스트의 대표적인 예가 2 x 2 표에서의 Fisher-exact 검정이다.
특정한 구체예에서, 심혈관 질환과 연관된 것으로 확인된 마커 또는 일배체형(예를 들면, 표 3, 표 10 및 표 21에 열거된 마커 대립형질들)은 그 마커 대립형질 또는 일배체형이 건강한 개체(대조군)에서의 그의 존재의 빈도에 비해, 심혈관 질환에 대한 위험을 갖는 개체(예를 들면, 영향받은 사람)에 보다 빈번하게 존재하는 마커 또는 일배체형이고, 상기 마커 대립형질 또는 일배체형의 존재는 심혈관 질환, 또는 심혈관 질환에 대한 감수성을 나타낸다. 다른 구체예에서, 관상동맥 질환 및 스텐트내 재협착(in-stent restenosis)을 포함한 심혈관 질환과 연관된 것으로 확인된 하나 이상의 마커와 연관 불균형인 위험 마커(예를 들면, 표 3, 10 및 21에 열거된 마커)는 건강한 개체(대조군)에서의 그들의 존재의 빈도 대비, 심혈관 질환에 대한 위험도를 갖는 개체(영향받은 개체)에 보다 빈번하게 존재하는 태깅 마커이고, 상기 태깅 마커의 존재는 심혈관 질환에 대한 증가된 감수성을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 심혈관 질환과 연관된 것으로 확인된 하나 이상의 마커와 연관 불균형인 위험 마커 대립형질(즉, 증가된 감수성을 부여하는 대립형질)(예를 들면, 표 3, 10 및 21에 열거된 마커 대립형질, 및 이들과 연관 불균형인 마커)은 건강한 개체(대조군)에서 그들의 존재의 빈도 대비, 심혈관 질환에 대한 위험도를 갖는 개체에 보다 빈번하게 존재하는 하나 이상의 대립형질을 포함하는 마커이고, 상기 마커의 존재는 심혈관 질환에 대한 증가된 감수성을 나타낸다.
연구 집단(study population)
일반적으로, 본 발명의 방법 및 키트는 임의의 원천 및 임의의 개체으로부터의 핵산 물질(DNA 또는 RNA)를 포함하는 시료로부터 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 개체는 인간이다. 개인은 성인, 아동, 또는 태아일 수 있다. 핵산의 원천은 생물학적 시료, 또는 그로부터 유래된 핵산 물질을 포함하는 시료를 포함한, 핵산 물질을 포함하는 시료일 수 있다. 본 발명은 또한, 표적 집단의 구성원인 개체에서 마커 및/또는 일배체형을 평가하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 그와 같은 표적 집단은 다른 유전적 인자, 바이오마커, 생체물리적 인자(예를 들면, 체중, BMD, 혈압), 또는 전반적인 건강 및/또는 생활방식 파라미터(예를 들면, 질병 또는 관련 질병의 병력, 질병의 과거 진단, 질병의 가족력)에 기반하여, 상기 질병을 발병할 위험도를 갖는 개체들의 집단 또는 그룹이다.
본 발명은 40세 이상, 45세 이상, 또는 50세 이상, 55세 이상, 60세 이상, 65세 이상, 70세 이상, 75세 이상, 80세 이상, 또는 85세 이상의 개인과 같은, 특정한 연령 서브그룹으로부터의 개인을 포함하는 구체예를 제공한다. 본 발명의 다른 구체예는 80세 미만, 75세 미만, 또는 70세 미만, 65세 미만, 60세 미만, 55세 미만, 50세 미만, 45세 미만, 40세 미만, 35세 미만, 또는 30세 미만과 같은, 85세 미만의 개인과 같은, 다른 연령군에 관한 것이다. 다른 구체예는 전술된 임의의 연령 범위에 속하는 발병 연령을 갖는 개인에 관한 것이다. 또한, 특정한 구체예에서, 45세를 초과하나, 60세 미만인 발병 연령과 같은 일정 범위의 연령이 관련된 것일 수 있는 것으로 고려된다. 그러나, 앞서 열거된 연령값에 의해 일괄된 모든 연령 범위를 포함한, 다른 연령 범위도 고려된다. 본 발명은 또한 하나의 성별의 개인, 남성 또는 여성에 관한 것이다.
아이슬란드 집단은 북유럽 선조 기원의 코카서스인 집단이다. 아이슬란드 집단에서 유전적 연관(genetic linkage)과 관련성(association)의 결과를 보고하는 다수의 연구가 최근 수년간 발표되었다. 그와 같은 다수의 연구들은 다른 집단에서, 최초에 아이슬란드 집단에서 특정 질환과 연관된 것으로 확인된 변이의 재현을 보여준다(Stacey, S.N., et al., Nat Genet. May 27 2007 (Epub ahead of print; Helgadottir, A., et al., Science 316:1491-93 (2007); Steinthorsdottir, V., et al., Nat Genet. 39:770-75 (2007); Gudmundsson, J., et al., Nat Genet. 39:631-37 (2007); Amundadottir, L.T., et al., Nat Genet. 38:652-58 (2006); Grant, S.F., et al., Nat Genet. 38:320-23 (2006)). 따라서, 아이슬란드 집단에서의 유전적 발견이 아프리카 및 아시아로부터의 집단을 포함한, 다른 집단에서 재현되었다.
심혈관 질환과 연관된 것으로 확인된 본 발명의 마커들은 다른 인간 집단에서 유사한 연관성을 보이는 것으로 사료된다. 따라서, 개별적인 인간 집단을 포함하는 특정한 구체예가 또한 고려되며 본 발명의 범위 내에 속한다. 그와 같은 구체예는 코카서스 집단, 유럽 집단, 미국 집단, 유라시아 집단, 아시아 집단, 중앙/남아시아 집단, 동아시아 집단, 중동 집단, 아프리카 집단, 라틴 아메리카 집단, 및 오세아니아 집단을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 인간 집단으로부터의 인간 개체에 관한 것이다. 유럽 집단은 스웨덴 집단, 노르웨이 집단, 핀란드 집단, 러시아 집단, 덴마크 집단, 아이슬란드 집단, 아일랜드 집단, 켈트(Kelt) 집단, 영국 집단, 스코틀랜드 집단, 네덜란드 집단, 벨기에 집단, 프랑스 집단, 독일 집단, 스페인 집단, 포르투갈 집단, 이탈리아 집단, 폴란드 집단, 불가리아 집단, 슬라브 집단, 세르비아 집단, 보스니아 집단, 체코 집단, 그리스 집단, 및 터키 집단을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명은 또한 반투(Bantu), 만덴크(Mandenk), 요루바(Yoruba), 산(San), 음부티 피그미(Mbuti Pygmy), 오르카디안(Orcadian), 아디겔(Adygel), 러시안(Russian), 사르디니안(Sardinian), 투스칸(Tuscan), 모자비트(Mozabite), 베두인(Bedouin), 드루즈(Druze), 팔레스티니안(Palestinian), 발로치(Balochi), 브라휘(Brahui), 마크라니(Makrani), 신디(Sindhi), 파탄(Pathan), 부루쇼(Burusho), 하자라(Hazara), 위구르(Uygur), 칼라쉬(Kalash), 한(Han), 다이(Dai), 다우르(Daur), 헤젠(Hezhen), 라후(Lahu), 미아오(Miao), 오로켄(Oroqen), 쉬(She), 투지아(Tujia), 투(Tu), 시보(Xibo), 이(Yi), 몽골란(Mongolan), 낙시(Naxi), 캄보디안(Cambodian), 일본인( Japanese), 야쿠트(Yakut), 멜라네시안(Melanesian), 파푸안(Papuan), 카리티아난(Karitianan), 수루이(Surui), 콜럼비안(Columbian), 마야(Maya) 및 피마(Pima)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 특정한 인간 집단에서 실시될 수 있다.
하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 아프리카 후손 또는 계통의 사람을 포함하는 집단과 같은 블랙 아프리카 선조(ancestry)를 포함하는 집단에 관한 것이다. 블랙 아프리가 선조는 흑인(black race)에 속하거나 또는 니그로 인종(negro race)에 속하는, 아프리카계 미국인(African-American), 아프로-아메리칸(Afro-American), 블랙 아메리칸(Black American)으로 자가-보고하는 것에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 아프리카계 미국인 또는 블랙 아메리칸은 북미에 거주하고 아프리카의 흑인군에 속하는 기원을 갖는 사람들이다. 또 다른 예에서, 블랙 아프리카 선조의 자가-보고된 사람은 한 명 이상의 블랙 아프리카 선조의 부모 또는 한 명 이상의 블랙 아프리카 선조의 조부모를 가질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 코카서스 기원의 개인에 관한 것이다.
개체에서 인종적 기여는 또한 유전적 분석에 의해 결정될 수 있다. 선조의 유전적 분석은 Smith et al. (Am J Hum Genet 74, 1001-13 (2004))에 개시된 마커와 같은, 연관되지 않은(unlinked) 마이크로새틀라이트를 이용하여 수행될 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 발명은 앞서 기재된 바와 같이, 특정한 집단에서 확인된 마커 및/또는 일배체형에 관한 것이다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 상이한 집단에 적용되는 경우, 연관 불균형(LD)의 척도는 상이한 결과를 가져올 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이는 특정한 게놈 영역에서 LD의 차이를 초래했을 수 있는 차등적 선택 압력(differential selective pressure) 및 상이한 인간 집단의 상이한 집단 역사 때문이다. 일부 마커들, 예를 들면, SNP 마커들이 상이한 집단에서 상이한 집단 빈도를 가지거나, 또는 하나의 집단에서는 다형성이나, 또 다른 집단에서는 다형성이 아니라는 것이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 입수가능한 방법을 적용하고, 본 명세서에서 고려되는 바와 같이, 임의의 인간 집단에서 본 발명을 실시할 것이다. 이는 특정한 집단 내에서 가장 강력한 연관을 제공하는 마커들을 확인하기 위해, 본 발명의 LD 영역에서 다형성 마커를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 위험 변이는 다양한 인간 집단에서 상이한 일배체형 배경에 상이한 빈도로 존재할 수 있다. 그러나, 당해 분야에서 알려진 방법 및 본 발명의 마커를 이용하여, 본 발명이 임의의 주어진 인간 집단에서 실시될 수 있다.
유전적 검사의 유용성
본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 명세서에 기재된 변이가 일반적으로 그 자체로 특정한 심혈관 질환을 발병할 개인의 절대적 확인을 제공하지 않는다는 것을 고려하고 이해할 것이다. 그러나, 본 명세서에 기재된 변이는 본 발명의 위험 또는 보호성 변이를 갖는 개인이 하나 이상의 심혈관 질환(예를 들면, MI, CAD, IA, AAA, 재협착, 뇌졸중 PAD)과 연관된 증상을 발병할 증가된 및/또는 감소된 가능성을 나타낸다. 그러나, 이 정보는 하기에서 보다 상세하게 요약되는 바와 같이, 그 자체로 매우 유용하며, 이 정보는 예를 들면, 조기 단계에 예방책을 개시하거나, 증상의 진행 및/또는 출현을 모니터링하기 위해 정기적인 신체 및/또는 정신 검진을 받거나, 또는 해당 상태를 확인하기 위해 규칙적인 간격으로 검사를 계획하여, 조기에 치료를 적용할 수 있게 하기 때문이다.
심혈관 질환을 발병할 위험도를 부여하는 유전적 변이에 대한 지식은 상기 질환을 발병할 증가된 위험도를 갖는 개체(즉, 위험 변이의 보인자)와 상기 질환을 발병할 감소된 위험도를 갖는 개체(즉, 보호성 변이의 보인자)를 구별하기 위해 유전적 테스트를 적용할 기회를 제공한다. 상기 언급된 두 그룹에 속하는 개체들에 대해, 유전적 테스트의 핵심 가치는 조기 단계에 질환, 또는 질환에 대한 소인을 진단하고 가장 적절한 치료를 제공할 수 있도록 하기 위해 임상의에게 질환의 예후/공격성(aggressiveness)에 대한 정보를 제공할 수 있는 가능성이다.
유전적 위험 인자의 존재의 지식, 또는 하나 이상의 위험 인자의 보인자일 증가된 위험에 대한 증거는 심혈관 질환에 대한 공지된 환경적 위험 인자들을 피하거나 또는 최소화하는 것에 의해 보다 건강한 생활방식(예를 들면, 체중 감량, 운동 증가, 금연, 스트레스 감소 등)을 구현하기 위한 증가된 동기를 제공할 수 있기 때문에, 심혈관 질환의 가족력을 갖는 개인들 및 위험 변이의 보인자는 유전적 테스트로부터 잇점을 얻을 수 있다. 환자의 유전적 테스트는 또한 심혈관 질환의 일차적 원인에 대한 매우 유용한 정보를 제공할 수 있고 각 개인에 대해 최상의 치료 옵션 및 약물을 선택하는데 있어서 임상의를 보조할 수 있다.
따라서, 본 발명은 개체가 심근 경색증, 관상동맥 질환, PAD, AAA, IA, 뇌졸중 또는 재협착증과 같은 심혈관 질환을 발병할 위험을 갖는지 여부를 진단하는 것을 포함한, 심혈관 질환에 대한 위험 평가를 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 다형성 마커는 심혈관 질환에 대한 개인의 위험도 평가를 위해, 단독으로 또는 조합되어 이용될 수 있고, 또한 공지된 바이오마커를 포함한 다른 마커들과 조합되어 이용될 수 있다. 개인의 심혈관 질환의 발병 위험도에 대한 소인에 영향을 미치는 것으로 알려진 다수의 인자들이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있고 그와 같은 평가를 위해 이용될 수 있다. 이들은 연령, 성별, 흡연 상태, 신체적 활동, 허리-대-엉덩이 둘레 비(waist-to-hip circumference ratio), 심혈관 질환의 가족력, 과거에 진단된 심혈관 질환, 비만, 당뇨병 진단, 스트레스, 우울증, 증가된 심박동, 고중성지방혈증, 낮은 HDL 콜레스테롤, 고혈압, 상승된 혈압, 콜레스테롤 수준, HDL 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 중성지방, 아포리포프로프로테인(apolipoprotein) AI 및 B 수준, 피브리노겐, 페리틴, C-반응성 단백질 및 류코트리엔(leukotriene) 수준을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하기에서 설명되는 다변량 분석법(multivariate analysis) 또는 로지스틱 회귀(logistic regression)를 포함한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법이 그와 같은 평가를 위해 이용될 수 있다.
방법
심혈관 질환의 위험도 평가 방법이 본 명세서에서 설명되고 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 심혈관 질환의 치료제에 대한 반응의 확률에 대해 개인을 평가하는 방법, 및 심혈관 질환의 치료제, 핵산, 폴리펩티드, 및 항체 및 컴퓨터-구현 기능(computer-implemented function)의 효과를 예측하는 방법을 포함한다. 심혈관 질환에 대한 감수성을 검출하기 위해 개체로부터의 시료를 분석하는 키트도 본 발명에 포함된다.
진단 방법
특정한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 심혈관 질환을 갖는 개체 또는 심혈관 질환에 대한 감수성을 갖는 개체에서 보다 빈번하게 나타나는 유전적 마커의 특정한 대립형질을 검출하는 것에 심혈관 질환(예를 들면, MI, CAD, IA, AAA, 뇌졸중, PAD, 재협착), 또는 심혈관 질환에 대한 감수성을 진단하거나 또는 상기 진단을 보조하는 방법에 관한 것이다. 특정한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 다형성 마커(예를 들면, 본 명세서에 기재된 마커)의 하나 이상의 대립형질을 검출하는 것에 의해 심혈관 질환에 대한 감수성을 진단하는 방법이다. 본 발명은 특정한 마커의 특정한 대립형질 또는 일배체형의 검출이 심혈관 질환에 대한 감수성을 나타내는 것인 방법을 기재한다. 그와 같은 예후적 또는 예측적 분석법은 또한 심혈관 질환의 증상의 발생 전에 개체의 예방적 치료를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 의료 전문가에 의해 수행되는 진단과 같은 진단의 임상적 적용 방법에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 일반인(layman)에 의해 수행되는 진단 방법 또는 감수성의 결정 방법에 관한 것이다. Molecular Inversion Probe 어레이 기술 (예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies (예를 들면, Illumina GoldenGate and Infinium assays)와 같은 SNP 마커의 고효율 유전형분석(high-throughput genotyping)을 포함한, 유전형분석 기술에서의 최근의 기술적 진전은 개인들이 그들의 게놈을 백만개 까지의 SNP에 대해 평가받을 수 있게 한다. 결과적으로 수득된, 개인에게 이용가능하게 된 유전형 정보는 다양한 SNP와 연관된 질병 또는 성향 위험도에 대한 공개 문헌으로부터의 정보와 비교될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 질병-연관 대립형질의 진단적 응용은 임상적 테스트의 결과에 근거하여 의료전문가에 의해, 또는 자신의 유저형 데이터의 분석을 통해 개인에 의해 수행될 수 있다. 바꾸어 말하면, 유전적 위험도에 근거한 감수성의 진단 또는 평가가 대상자의 유전형에 대한 정보 및 다양한 위험 인자에 대한 발표문헌에 근거하여, 의료 전문가, 유전학 상담자(genetic counselor), 또는 일반인에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명에서, 용어 "진단하는(diagnosing)" 및 "감수성을 진단하다(dignose a susceptibility)" 및 "감수성을 결정하다(determine a suceptiblity)는 전술된 방법을 포함한, 모든 이용가능한 진단 방법을 의미하도록 의도된다.
또한, 특정한 다른 구체예에서, 본 발명은 심혈관 질환으로 진단되지 않은 개인 또는 일반적 집단에서보다 심혈관 질환으로 진단된 환자에서 덜 빈번하게 나타나는 특정한 유전적 마커 대립형질 또는 일배체형을 검출하는 것에 의해, 심혈관 질환에 대한 감소된 감수성을 진단하거나 또는 상기 진단을 보조하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 기재되고 예시된 바와 같이, 특정한 마커 대립형질 또는 일배체형(예를 들면, 표 3, 10 및 21에 열거된 마커들 및 일배체형 및 이들과 연관불균형인 마커들)이 심혈관 질환과 연관된다. 일 구체예에서, 상기 마커 대립형질 또는 일배체형은 심혈관 질환의 유의성 있는 위험도 또는 그에 대한 감수성을 부여하는 마커 대립형질 또는 일배체형이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 개인에서 심혈관 질환에 대한 감수성을 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 3, 10 및 21에 열거된 다형성 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 표 21에 열거된 하나 이상의 마커 대립형질 또는 일배체형, 또는 이들과 연관 불균형인 마커를 스크리닝하는 것에 의해, 개인에서 심혈관 질환에 대한 감수성을 진단하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 상기 마커 대립형질 또는 일배체형은 건강한 개체(집단 대조군과 같은, 대조군)에서 그의 존재의 빈도에 비해, 심혈관 질환을 갖거나 또는, 심혈관 질환에 대해 감수성을 갖는 개체(영향받은 개체)에서 보다 빈번하게 존재한다. 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커 대립형질 또는 일배체형의 연관의 유의성은 0.05 미만의 p 값을 특징으로 한다. 다른 구체예에서, 연관의 유의성은 보다 작은 p-값, 예를 들면, 0.01 미만, 0.001 미만, 0.0001 미만, 0.00001 미만, 0.000001 미만, 0.0000001 미만, 0.00000001 미만 또는 0.000000001 미만의 p-값과 같은 보다 작은 p-값을 특징으로 한다.
이 구체예들에서, 상기 하나 이상의 마커 대립형질 또는 일배체형의 존재는 심혈관 질환(예를 들면, MI, CAD, IA, 뇌졸중, AAA, 재협착, PAD)의 감수성을 나타낸다. 이 진단 방법들은 심혈관 질환과 연관된 하나 이상의 마커 대립형질 또는 일배체형의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기재된 일배체형은 다양한 유전적 마커(예를 들면, SNP, 마이크로새틀라이트)에서의 대립형질의 조합을 포함한다. 특정한 일배체형을 구성하는 특정한 유전적 마커 대립형질의 검출은 본 명세서에 기재되고 및/또는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 유전적 마커는 핵산 수준에서(예를 들면, 직접적인 뉴클레오티드 서열결정에 의해 또는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에게 공지된 다른 수단에 의해) 또는 상기 유전적 마커가 관상동맥 질환 및 스텐트내 재협착을 포함한, 심혈관 질환과 연관된 핵산에 의해 코딩된 단백질의 코딩 서열에 영향을 미친다면, 아미노산 수준에서(예를 들면, 단백질 서열결정에 의해 또는 그와 같은 단백질을 인식하는 항체를 이용한 면역분석법에 의해) 검출될 수 있다. 본 발명의 마커 대립형질 또는 일배체형은 심혈관 질환과 연관된 게놈 DNA 서열의 단편에 대응된다. 그와 같은 단편은 대상이 되는 다형성 마커 또는 일배체형의 DNA 서열을 포함하나, 또한 상기 마커 또는 일배체형과 강한 LD(linkage disequilibrium)인(예를 들면, r2 및/또는 |D'|의 특정한 값에 의해 결정됨) DNA 세그먼트를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 심혈관 질환에 대한 감수성의 진단이 서던 분석(Southern analysis), 노던 분석(Northern analysis), 및/또는 인-시투 혼성화를 포함하나, 이에 한정되지 않는 혼성화 방법을 이용하여 달성될 수 있다(모든 보충물(supplement)을 포함한, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons 참조). 특정한 마커 대립형질의 존재는 상기 특정한 대립형질에 특이적인 핵산 프로브의 서열-특이적 혼성화에 의해 표시될 수 있다. 둘 이상의 특정한 마커 대립형질 또는 특정한 일배체형의 존재는 각각 특정한 대립형질에 대해 특이적인, 여러 개의 서열-특이적 핵산 프로브를 이용하는 것에 의해 표시될 수 있다. 일 구체예에서, 일배체형은 특정한 일배체형에 대해 특이적인(즉, 상기 일배체형의 특징적인 특정한 마커 대립형질을 포함하는 DNA 가닥에 특이적으로 혼성화하는) 단일 핵산 프로브에 의해 표시될 수 있다. 서열-특이적 프로브는 게놈 DNA, RNA, 또는 cDNA에 혼성화되도록 지시될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, "핵산 프로브(nucleic acid probe)"는 상보적 서열에 혼성화되는 DNA 프로브 또는 RNA 프로브일 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 테스트 시료로부터의 게놈 서열에 특정한 대립형질이 존재하는 경우에만 서열 특이적 혼성화가 일어나도록 그와 같은 프로브를 설계하는 방법을 알 것이다.
심혈관 질환에 대한 감수성을 결정 또는 진단하기 위해, 심혈관 질환과 연관된 핵산을 포함하는 테스트 시료, 예를 들면, 게놈 DNA 시료를 하나 이상의 핵산 프로브와 접촉하는 것에 의해 혼성화 시료가 형성된다. mRNA 또는 게놈 DNA를 검출하기 위한 프로브의 비-한정적인 예는 본 명세서에 기재된 mRNA 또는 게놈 DNA 서열에 혼성화될 수 있는 표지된 핵산 프로브이다. 상기 핵산 프로브는 예를 들면, 전장(full-length) 핵산 분자, 또는 그의 일부, 예를 들면, 적합한 mRNA 또는 게놈 DNA 서열에 엄격한(stringent) 조건 하에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 15개 이상, 30개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 250개 이상, 또는 500개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산 프로브는 선택적으로 명세서에 기재된 마커의 하나 이상의 대립형질, 또는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 일배체형을 포함하는, 본 명세서에 기재된, LD 블럭 C09의 뉴클레오티드 서열(서열번호 94)의 전부 또는 일부를 포함하거나, 또는 상기 프로브는 그와 같은 서열에 상보적인 서열일 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 핵산 프로브는 선택적으로 본 명세서에 기재된 마커의 하나 이상의 대립형질, 또는 하나의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질, 또는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 다형성 마커를 포함하는 일배체형을 포함하는, LD 블럭 C09의 뉴클레오티드 서열(서열번호 94)의 부분이거나, 또는 상기 프로브는 그와 같은 서열의 상보적 서열일 수 있다. 본 발명의 진단 분석법에서 이용하기에 적합한 다른 프로브가 본 명세서에 기재된다. 혼성화는 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다(예를 들면, 모든 보충물을 포함한, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons 참조). 일 구체예에서, 혼성화는 특이적 혼성화, 즉, 불일치를 포함하지 않는 혼성화(정확한 혼성화)를 의미한다. 일 구체예에서, 상기 특이적 혼성화를 위한 혼성화 조건은 높은 엄격성이다.
존재하는 경우, 특이적 혼성화는 표준 방법을 이용하여 검출된다. 핵산 프로브와 테스트 시료 내의 관상동맥 질환 및 스텐트내 재협착 연관 핵산 간에 특이적 혼성화가 일어나면, 상기 시료는 상기 핵산 프로브에 존재하는 뉴클레오티드에 상보적인 대립형질을 포함한다. 본 발명의 다른 마커, 또는 본 발명의 일배체형을 구성하는 마커에 대해, 상기 방법이 반복될 수 있거나, 또는 한번에 하나 이상의 마커 대립형질을 검출하기 위해 복수 개의 프로브가 동시에 이용될 수 있다. 특정한 일배체형의 둘 이상의 마커 대립형질을 포함하는 단일 프로브를 설계할 수 있다(예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 특정한 일배체형을 구성하는 모든 마커에 상보적인 대립형질을 포함하는 프로브). 시료에서 일배체형의 특정한 마커의 검출은 상기 시료의 원천이 특정한 일배체형(예를 들면, 일배체형)을 가지며 따라서, 심혈관 질환(예를 들면, MI, CAD, IA, 뇌졸중, AAA, 재협착, PAD)에 대해 감수성을 갖는다는 것을 나타낸다.
하나의 바람직한 구체예에서, Kutyavin et al. (Nucleic Acid Res. 34:e128 (2006))에 기재된 바와 같이, 그의 3' 말단에 있는 형광 모이어티(fluorescent moiety) 또는 그룹 및 그의 5' 말단에 있는 퀀처(quencher)를 포함하는 검출 올리고뉴클레오티드 및 인핸서 올리고뉴클레오티드를 이용하는 방법이 적용될 수 있다. 형광 모이어티는 Gig Harbor Green 또는 Yakima Yellow, 또는 다른 적합한 형광 모이어티일 수 있다. 검출 프로브는 검출대상 SNP 다형성을 포함하는 짧은 뉴클레오티드 서열에 혼성화되도록 설계된다. 바람직하게는, 상기 SNP는 검출 프로브의 말단 잔기부터 3' 말단으로부터의 -6 잔기까지 중에 존재한다. 인핸서는 검출 프로브에 대해 3'인 DNA 주형에 혼성화되는 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 상기 프로브들은 검출 프로브와 인핸서 뉴클레오티드 프로브가 모두 주형에 결합된 경우, 상기 검출 프로브와 인핸서 뉴클레오티드 프로브 간에 단일 뉴클레오티드 갭이 존재하도록 설계된다. 상기 갭은 엔도뉴클레아제 IV와 같은, 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 합성 탈염기 부위(synthetic abasic site)를 생성한다. 상기 효소는 완전히 상보적인 검출 프로브로부터 염료를 절단하나, 불일치를 포함하는 검출 프로브는 절단할 수 없다. 따라서, 방출된 형광 모이어티의 형광을 측정하는 것에 의해, 검출 프로브의 뉴클레오티드 서열에 의해 정의된 특정한 대립형질의 존재의 평가가 수행될 수 있다.
검출 프로브는 임의의 적합한 크기일 수 있으나, 바람직하게는 프로브는 비교적 짧다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 길이가 5개 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 상기 프로브는 길이가 10개 내지 50개의 뉴클레오티드로 구성되고, 또 다른 구체예에서, 상기 프로브는 길이가 12개 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성된다. 다른 길이의 프로브들도 가능하고 본 발명이 속하는 기술 분야의 평균적인 당업자의 기술의 범위 내에 속한다.
바람직한 구체예에서, SNP 다형성을 포함하는 DNA 주형은 검출 전에 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭된다. 그와 같은 구체예에서, 증폭된 DNA가 검출 프로프 및 인핸서 프로브에 대한 주형으로 기능한다.
검출 프로브, 인핸서 프로브, 및/또는 PCR에 의한 주형의 증폭을 위해 이용되는 프라이머의 특정한 구체예는 변형된 A 및 변형된 G를 포함한, 변형된 염기의 이용을 포함한다. 변형된 염기의 이용은 주형 DNA에 대한 뉴클레오티드 분자(프로브 및/또는 프라이머)의 용융점을 조정하기 위해, 예를 들면, 상보적인 T와 세개의 수소 결합을 형성할 수 있는 능력을 갖는 변형된 A가 이용될 수 있는, 낮은 비율의 G 또는 C 염기를 포함하는 영역에서 용융점을 높이기 위해, 또는 예를 들면, 상보적인 C와 두 개의 수소 결합만을 형성하는 변형된 G 염기를 이용하는 것에 의해, 높은 비율의 G 또는 C 염기를 포함하는 영역에서 용융점을 낮추기 위해 유용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 검출 뉴클레오티드 프로브의 설계에서 변형된 염기들이 이용된다. 당업자에게 알려진 임의의 변형된 염기가 이 방법에서 선택될 수 있고, 적합한 염기의 선택은 본 명세서의 교시 및 당업자에게 알려진 상업적 출처로부터 이용가능한 공지된 염기에 근거하여 당업자의 범위 내에 속한다.
또 다른 혼성화 방법에서, 심혈관 질환과 연관된 다형성의 존재를 확인하기 위해 노던 분석이 이용된다(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons, supra 참조). 노던 분석의 경우, RNA의 테스트 시료가 적합한 수단에 의해 개체로부터 수득된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 개체로부터의 RNA에 대한 핵산 프로브의 특이적 혼성화는 상기 프로브에 상보적인 특정한 대립형질을 나타낸다. 핵산 프로브의 용도의 대표적인 예를 위해, 예를 들면, 미국특허 제5,288,611호 및 제4,851,330호를 참조한다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)이 본 명세서에 기재된 혼성화 방법에서 핵산 프로브에 추가하여, 또는 핵산 프로브 대신에 이용될 수 있다. PNA는 유기 염기 (A, G, C, T 또는 U)가 메틸렌 카르보닐 링커를 통해 글리신 질소에 결합된, N-(2-아미노에틸)글리신 유닛과 같은, 펩티드-유사 무기 백본(peptide-like inorganic backbone)을 갖는 DNA 모방체(mimic)이다(예를 들면, Nielsen, P., et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994) 참조). PNA 프로브는 심혈관 질환과 연관된 하나 이상의 마커 대립형질 또는 일배체형을 포함하는 것으로 사료되는 시료 내의 분자에 특이적으로 혼성화하도록 설계될 수 있다. 따라서, PNA 프로브의 혼성화는 심혈관 질환을 진단할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 개체로부터 수득된 게놈 DNA를 포함하는 테스트 시료가 수집되고 본 발명의 하나 이상의 마커 또는 일배체형을 포함하는 단편을 증폭시키기 위해 중합효소 연쇄 반응(PCR)이 이용된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 심혈관 질환과 연관된 특정한 마커 대립형질 또는 일배체형의 확인은 다양한 방법(예를 들면, 서열 분석, 제한효소 처리에 의한 분석, 특이적 혼성화, SSCP(single stranded conformation polymorphism), 전기영동 분석 등)을 이용하여 수행될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 진단은 정량적 PCR(kinetic thermal cycling)을 이용한 발현 분석에 의해 수행된다. 이 기법은 예를 들면, TaqMan®(Applied Biosystems, Foster City, CA)과 같은 상업적으로 이용가능한 기술을 이용할 수 있다. 상기 기법은 심혈관 질환과 연관된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 스플라이싱 변이(splicing variant)의 발현 또는 조성의 변화의 존재를 평가할 수 있다. 또한, 변이의 발현은 물리적으로 또는 기능적으로 상이한 것으로 정량될 수 있다.
본 발명의 방법의 또 다른 구체예에서, 특정한 대립형질이 기준 서열 대비 제한효소 인식 부위의 생성 또는 제거를 초래하는 경우, 제한효소 처리(restriction digestion)에 의한 분석이 상기 특정한 대립형질을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 게놈 DNA를 포함하는 테스트 시료가 개체로부터 수득된다. 상기 테스트 개체로부터의 테스트 시료에서 심혈관 질환과 연관된 특정한 영역(예를 들면, 표 3, 10 또는 21의 다형성 마커 및 일배체형, 및 이들과 연관 불균형인 마커들)을 증폭하기 위해 PCR이 이용될 수 있다. RFLP(Restriction fragment length polymorphism) 분석은 예를 들면, 전술된 Current Protocols in Molecular Biology에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 관련된 DNA 단편의 제한효소 처리의 결과 패턴(digestion pattern)이 시료 중의 특정한 대립형질의 존재 또는 부재를 나타낸다.
관상동맥 질환 및 스텐트내 재협착을 포함한 심혈관 질환과 연관된 다형성 부위의 특정한 대립형질(예를 들면, 표 3, 10 또는 21의 다형성 마커 및 일배체형, 및 이들과 연관 불균형인 마커)을 검출하기 위해, 서열 분석이 또한 이용될 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 특정한 마커 대립형질 또는 일배체형의 존재 또는 부재의 결정은 서열 분석을 포함한다. 예를 들면, DNA 또는 RNA의 테스트 시료가 테스트 개체로부터 수득될 수 있다. PCR 또는 다른 적합한 방법이 심혈관 질환과 연관된 핵산의 일부를 증폭시키기 위해 이용될 수 있고, 그 후, 특정한 대립형질의 존재가 직접 시료 중의 게놈 DNA의 다형성 부위(또는 복수 개의 다형성 부위들)의 서열을 결정하는 것에 의해 검출될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 개체로부터의 표적 핵산 서열 세그먼트에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브의 어레이(array)가 심혈관 질환과 연관된 핵산에서 다형성을 식별하기 위해 이용될 수 있다(예를 들면, 표 3, 10 및 21의 다형성 마커, 및 이들과 연관 불균형인 마커). 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 어레이가 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 어레이는 일반적으로 상이한 공지된 위치에 있는 기판(substrate)의 표면에 결합된 복수 개의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 이 어레이들은 일반적으로 기계적 합성 방법 또는 포토리소그래피 방법과 고상 올리고뉴클레오티드 합성 방법의 조합을 포함하는 광-지시 합성 방법(light-directed synthesis method)를 이용하여 생산된다(각각의 전체 교시가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Fodor, S. et al., Science, 251:767-773 (1991); Pirrung et al., 미국특허 제5,143,854호(또한, 공개된 PCT 출원 WO 90/15070 참조); 및 Fodor. S. et al., 공개된 PCT 출원 WO 92/10092 및 미국특허 제5,424,186호 참조). 기계적 합성 방법을 이용한 이 어레이들의 합성을 위한 기법들이 예를 들면, 미국특허 제5,384,261호에 기재되며, 그 전체 교시가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 또 다른 예에서, 선형 어레이(linear array)가 이용될 수 있다. 다형성의 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 어레이의 용도의 추가적인 설명이 예를 들면, 미국특허 제5,858,659호 및 제5,837,832호에서 찾을 수 있고, 상기 두 특허의 전체 교시가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
핵산 분석의 다른 방법들이 심혈관 질환과 연관된 다형성 부위에서 특정한 대립형질을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 대표적인 방법들은 예를 들면, 직접적인 수동 서열결정(direct manual sequencing) (Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1991-1995 (1988); Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977); Beavis, et al., U.S. Patent No. 5,288,644); 자동화된 형광 서열결정(automated fluorescent sequencing); 단일가닥 구조 다형성(SSCP) 분석; CDGE(clamped denaturing gel electrophoresis); DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) (Sheffield, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:232-236 (1989)), 운동성 변화 분석(mobility shift analysis)(Orita, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2766-2770 (1989)), 제한효소 분석(Flavell, R., et al., Cell, 15:25-41 (1978); Geever, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:5081-5085 (1981)); 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 분석; 화학적 불일치 절단(chemical mismatch cleavage, CMC) (Cotton, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397-4401 (1985)); RNase 보호 분석(Myers, R., et al., Science, 230:1242-1246 (1985); E. coli mutS 단백질과 같은, 뉴클레오티드 불일치를 인식하는 폴리펩티드의 이용; 및 대립형질-특이적 PCR을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 심혈관 질환 또는 심혈관 질환에 대한 감수성의 진단은 본 발명의 유전적 마커(들) 또는 일배체형(들)이 폴리펩티드의 조성 또는 발현의 변화를 초래하는 경우들에서, 심혈관 질환과 연관된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현 및/또는 조성을 조사하는 것에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 심혈관 질환에 대한 감수성의 진단은 본 발명의 유전적 마커 또는 일배체형이 폴리펩티드의 조성 또는 발현의 변화를 초래하는 경우, 이들 중 하나의 폴리펩티드, 또는 심혈관 질환과 연관된 핵산에 의해 코딩되는 또 다른 폴리펩티드의 발현 및/또는 조성을 조사하는 것에 의해 수행될 수 있다. 심혈관 질환에 대해 연관을 보이는 본 발명의 일배체형 및 마커들은 하나 이상의 인접 유전자(nearby gene)(예를 들면, CDKN2A 및 CDKN2B 유전자)에 대한 효과를 통해 역할을 수행한다. 이 유전자들에 영향을 미치는 가능한 메카니즘은 예를 들면, 전사에 대한 효과, RNA 스플라이싱에 대한 효과, mRNA의 대안적인 스플라이스(alternative splice) 형태의 상대적 양의 변화, RNA 안정성에 대한 효과, 핵으로부터 세포질로의 이동에 대한 효과, 및 번역의 효율성 및 정확성에 대한 효과를 포함한다.
따라서, 또 다른 구체예에서, 심혈관 질환에 대한 연관을 보이는 본 발명의 변이(마커 또는 일배체형)가 인접 유전자(예를 들면, CDKN2A 및 CDKN2B 유전자)의 발현에 영향을 미친다. 유전자 발현에 영향을 미치는 조절성 요소(regulatory element)가 유전자의 프로모터 영역으로부터 멀리 떨어져서, 수십 킬로베이스 또는 심지어 수백 킬로베이스 떨어져서 위치할 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 본 발명의 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재를 분석하는 것에 의해, 따라서, 그와 같은 인접한 유전자의 발현 수준을 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 마커 또는 일배체형의 검출이 하나 이상의 CDKN2A 및/또는 CDKN2B 유전자의 발현을 평가하기 위해 이용될 수 있다.
ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역침전(immunoprecipitation) 및 면역형광(immunofluorescence)을 포함한 다양한 방법들이 단백질 발현 수준을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 개체로부터의 테스트 시료가 심혈관 질환과 연관된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현의 변화 및/또는 그의 조성의 변화의 존재에 대해 평가된다. 심혈관 질환과 연관된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현의 변화가 예를 들면, 정량적인 폴리펩티드 발현(즉, 생성되는 폴리펩티드의 양)의 변화일 수 있다. 심혈관 질환과 연관된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 조성의 변화는 정성적 폴리펩티드 발현의 변화(예를 들면, 돌연변이 폴리펩티드의 발현 또는 상이한 스플라이싱 변이의 발현)이다. 일 구체예에서, 심혈관 질환에 대한 감수성의 진단은 심혈관 질환과 연관된 핵산에 의해 코딩되는 특정한 스플라이싱 변이, 또는 스플라이싱 변이의 특정한 패턴을 검출하는 것에 의해 수행된다.
또한, 그와 같은 변화(정량적 및 정성적 변화)가 모두 존재할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 폴리펩티드(예를 들면, CDKN2A 및/또는 CDKN2B 폴리펩티드) 발현 또는 조성의 "변화(alteration)"는 대조군 시료에서 상기 폴리펩티드의 발현 또는 조성 대비, 테스트 시료 중의 발현 또는 조성의 변화를 의미한다. 대조군 시료는 테스트 시료에 상응하는 시료(예를 들면, 동일한 종류의 세포로부터 유래된 시료)이고, 심혈관 질환에 의해 영향받지 않고 및/또는 심혈관 질환에 대한 감수성을 갖지 않는 개체로부터 유래된다. 일 구체예에서, 대조군 시료는 본 명세서에 기재된 심혈관 질환과 연관된 마커 대립형질 또는 일배체형을 갖지 않는 개체로부터 유래된다. 유사하게, 대조군 시료 대비, 테스트 시료 중에 하나 이상의 상이한 스플라이싱 변이의 존재, 또는 대조군 시료 대비, 테스트 시료 중의 상이한 스플라이싱 변이의 유의성 있게 상이한 양의 존재는 심혈관 질환에 대한 감수성을 나타낼 수 있다. 대조군 시료 대비, 테스트 시료 중의 폴리펩티드의 발현 또는 조성의 변화는 특정한 대립형질이 대조군 시료 중의 기준 대비 스플라이스 위치를 변화시키는 경우, 상기 특정한 대립형질을 나타낼 수 있다. 분광분석법, 비색법(colorimetry), 전기영동, 등전점 전기영동법(isoelectric focusing), 및 면역블롯팅(immunoblotting)(예를 들면, 전술된 바와 같은, Current Protocols in Molecular Biology, 특히, 챕터 10 참조)과 같은 면역분석법(immunoassays)(예를 들면, David et al., 미국특허 제4,376,110호)을 포함한, 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현 또는 조성을 조사하는 다양한 수단이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있고, 이용될 수 있다.
예를 들면, 일 구체예에서, 심혈관 질환과 연관된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드(예를 들면, CDKN2A 및/또는 CDKN2B 폴리펩티드)에 결합할 수 있는 항체(예를 들면, 검출가능한 표지를 갖는 항체)가 이용될 수 있다. 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 완전한 항체, 또는 그의 단편(예를 들면, Fv, Fab, Fab', F(ab')2)이 이용될 수 있다. 프로브 또는 항체에 대해, 용어 "표지된(labeled)"은 검출가능한 물질을 프로브 또는 항체에 결합(즉, 물리적 연결)시키는 것에 의한 프로브 또는 항체의 직접적인 표지화, 및 직접적으로 표지된 또 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적 표지화를 포함하도록 의도된다. 간접적 표지화의 예는 표지된 이차 항체(예를 들면, 형광-표지된 이차 항체)를 이용한 일차 항체의 검출 및 형광-표지된 스트렙타비딘에 의해 검출될 수 있는, 비오틴에 의한 DNA 프로브의 말단-표지화(end-labeling)를 포함한다.
이 방법의 일 구체예에서, 테스트 시료 중의 심혈관 질환과 연관된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드의 수준 또는 양이 대조군 시료 중의 심혈관 질환과 연관된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드의 수준 또는 양과 비교된다. 대조군 시료 중의 폴리펩티드의 수준 또는 양보다 더 높거나 또는 더 낮고, 그 차이가 통계적으로 유의성이 있는, 테스트 시료 중의 폴리펩티드의 수준 또는 양은 상기 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현의 변화를 나타내고 발현의 차이를 유발하는 특정한 대립형질 또는 일배체형의 존재를 나타낸다. 대안적으로, 테스트 시료 중의 폴리펩티드의 조성이 대조군 시료 중의 상기 폴리펩티드의 조성과 비교된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드의 수준 또는 양과 조성이 모두 테스트 시료 및 대조군 시료에서 평가될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 심혈관 질환에 대한 감수성의 진단은 추가적인 단배질-기반 분석법, RNA-기반 분석법 또는 DNA-기반 분석법과 조합하여, 하나 이상의 본 발명의 마커 대립형질 또는 일배체형(예를 들면, 표 3, 10 및/또는 21에 열거된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들의 연관된 대립형질)을 검출하는 것에 의해 수행된다.
키트
본 발명의 방법에서 유용한 키트는 본 명세서에 기재된 방법에서 유용한 성분들, 예를 들면, 핵산 증폭용 프라이머, 혼성화 프로브, 제한효소(예를 들면, RFLP 분석용 제한효소), 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드, 심혈관 질환(예를 들면, MI, CAD, IA, 뇌졸중, AAA, 재협착, PAD)과 연관된 핵산에 의해 코딩된 변화된 폴리펩티드에 결합하는 항체(예를 들면, LD 블럭 C09(서열번호 94), CDKN2A 및/또는 CDKN2B 유전자 또는 그의 단편, 예를 들면, 본 발명의 하나 이상의 다형성 마커 및/또는 일배체형을 포함하는 게놈 단편에 의해 코딩된 폴리펩티드에 결합하는 항체) 또는 심혈관 질환과 연관된 핵산에 의해 코딩된 변화되지 않은(원형의) 폴리펩티드에 결합하는 항체, 심혈관 질환과 연관된 핵산의 증폭을 위한 수단, 심혈관 질환과 연관된 핵산의 핵산 서열을 분석하기 위한 수단, 심혈관 질환과 연관된 핵산에 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 분석하기 위한 수단, 등을 포함한다. 본 발명의 키트는 예를 들면, 필요한 완충액, 본 발명의 핵산(예를 들면, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 다형성 마커를 포함하는 핵산 세그먼트)을 증폭하기 위한 핵산 프라이머, 및 그와 같은 프라이머 및 필요한 효소(예를 들면, DNA 중합효소)를 이용하여 증폭된 단편의 대립형질-특이적 검출을 위한 시약을 포함할 수 있다. 추가적으로, 키트는 본 발명의 방법과 조합되어 이용될 수 있는 분석법을 위한 시약들, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 다른 진단 분석법에서 이용되는 시약을 제공할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 심혈관 질환, 또는 심혈관 질환에 대한 감수성을 검출하기 위해, 개체로부터의 시료를 분석하는 키트로서, 상기 키트는 상기 개체의 게놈에서 본 발명의 하나 이상의 다형성의 하나 이상의 대립형질을 선택적으로 검출하기 위해 필요한 시약들을 포함하는 것인 키트에 관한 것이다. 특정한 구체예에서, 상기 시약은 본 발명의 하나 이상의 다형성을 포함하는 개체의 게놈의 단편에 혼성화하는 하나 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드(contiguous oligonucleotide)를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 시약은 개체로부터 수득된 게놈 세그먼트의 반대쪽 가닥에 혼성화하는 한 쌍 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 각 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 하나의 다형성을 포함하는 개체의 게놈의 단편을 선택적으로 증폭시키도록 설계되며, 상기 다형성은 표 3, 10 및 21에 열거된 다형성 및 이들과 연관 불균형인 다형성 마커로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 단편은 크기가 20 bp 이상이다. 그와 같은 올리고뉴클레오티드 또는 핵산(예를 들면, 올리고뉴클레오티드 프라이머)은 심혈관 질환을 나타내는 다형성(예를 들면, SNP 또는 마이크로새틀라이트)을 둘러싼(flanking) 핵산 서열의 부분을 이용하여 설계될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 키트는 심혈관 질환과 연관된 하나 이상의 특정한 다형성 마커 또는 일배체형을 검출할 수 있는 하나 이상의 표지된 핵산, 및 상기 표지의 검출을 위한 시약을 포함한다. 적합한 표지는 예를 들면, 방사성동위원소, 형광 표지, 효소 표지, 효소 보조-인자(co-factor) 표지, 자성 표지(magnetic label), 스핀 표지(spin label), 에피토프 표지(epitope label)를 포함한다.
특정한 구체예에서, 본 발명의 키트의 시약에 의해 검출될 다형성 마커 또는 일배체형은 표 3, 10 및 21에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로 구성된 군으로부터 선택된, 하나 이상의 마커, 두개 이상의 마커, 세개 이상의 마커, 네개 이상의 마커, 또는 다섯개 이상의 마커를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 검출될 마커 또는 일배체형은 표 3, 10 또는 21에 열거된 마커들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 검출될 마커 또는 일배체형은 rs10757278, rs10116277, rs1333040, D9S1814, D9S1870 및 rs2383207로 구성된 마커들의 군으로부터의 하나 이상의 마커와 0.2보다 큰 r2 값에 의해 정의된 강한 연관 불균형인 마커들의 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 검출될 마커 또는 일배체형은 rs10757278, rs7041637, rs2811712, rs3218018, rs3217992, rs2069426, rs2069422, rs1333034, rs1011970, rs10116277, rs1333040, rs2383207, rs1333050, D9S1814, 및 D9S1870으로 구성된 마커의 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함한다.
하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 마커를 검출하기 위한 키트는 검출될 SNP 다형성을 포함하는 주형 DNA의 세그먼트에 혼성화되는, 검출 올리고뉴클레오티드 프로브, 인핸서 올리고뉴클레오티드 프로브 및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 포함한다. 앞서 설명된 바와 같이, 검출 올리고뉴클레오티드 프로브는 그의 3' 말단에 있는 형광 모이어티 또는 그룹 및 그의 5' 말단에 있는 퀀처를 포함하고, Kutyavin et al. (Nucleic Acid Res. 34:e128 (2006))에 기재된 바와 같은 인핸서 올리고뉴클레오티드가 이용된다. 형광 모이어티는 Gig Harbor Green 또는 Yakima Yellow, 또는 다른 적합한 형광 모이어티일 수 있다. 검출 프로브는 검출대상 SNP 다형성을 포함하는 짧은 뉴클레오티드 서열에 혼성화되도록 설계된다. 바람직하게는, 상기 SNP는 검출 프로브의 말단 잔기부터 3' 말단으로부터의 -6 잔기까지 중에 존재한다. 인핸서는 검출 프로브에 대해 3'인 DNA 주형에 혼성화되는 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 상기 프로브들은 검출 프로브와 인핸서 뉴클레오티드 프로브가 모두 주형에 결합된 경우, 상기 검출 프로브와 인핸서 뉴클레오티드 프로브 간에 단일 뉴클레오티드 갭이 존재하도록 설계된다. 상기 갭은 엔도뉴클레아제 IV와 같은, 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 합성 탈염기 부위(synthetic abasic site)를 생성한다. 상기 효소는 완전히 상보적인 검출 프로브로부터 염료를 절단하나, 불일치를 포함하는 검출 프로브는 절단할 수 없다. 따라서, 방출된 형광 모이어티의 형광을 측정하는 것에 의해, 검출 프로브의 뉴클레오티드 서열에 의해 정의된 특정한 대립형질의 존재의 평가가 수행될 수 있다.
검출 프로브는 임의의 적합한 크기일 수 있으나, 바람직하게는 프로브는 비교적 짧다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 길이가 5개 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 상기 프로브는 길이가 10개 내지 50개의 뉴클레오티드로 구성되고, 또 다른 구체예에서, 상기 프로브는 길이가 12개 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성된다. 다른 길이의 프로브들도 가능하고 본 발명이 속하는 기술 분야의 평균적인 당업자의 기술의 범위 내에 속한다.
바람직한 구체예에서, SNP 다형성을 포함하는 DNA 주형은 검출 전에 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되고, 그와 같은 증폭을 위한 프라이머가 시약 키트에 포함된다. 그와 같은 구체예에서, 증폭된 DNA가 검출 프로프 및 인핸서 프로브에 대한 주형으로 기능한다.
검출 프로브, 인핸서 프로브 및/또는 PCR에 의한 주형의 증폭을 위해 이용되는 프라이머의 특정한 구체예는 변형된 A 및 변형된 G를 포함한, 변형된 염기의 이용을 포함한다. 변형된 염기의 이용은 주형 DNA에 대한 뉴클레오티드 분자(프로브 및/또는 프라이머)의 용융점을 조정하기 위해, 예를 들면, 상보적인 T와 세개의 수소 결합을 형성할 수 있는 능력을 갖는 변형된 A가 이용될 수 있는, 낮은 비율의 G 또는 C 염기를 포함하는 영역에서 용융점을 높이기 위해, 또는 예를 들면, 상보적인 C와 두 개의 수소 결합만을 형성하는 변형된 G 염기를 이용하는 것에 의해, 높은 비율의 G 또는 C 염기를 포함하는 영역에서 용융점을 낮추기 위해 유용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 검출 뉴클레오티드 프로브의 설계에서 변형된 염기들이 이용된다. 당업자에게 알려진 임의의 변형된 염기가 이 방법에서 선택될 수 있고, 적합한 염기의 선택은 본 명세서의 교시 및 당업자에게 알려진 상업적 출처로부터 이용가능한 공지된 염기에 근거하여 당업자의 범위 내에 속한다.
하나의 그와 같은 구체예에서, 상기 마커 또는 일배체형의 존재는 심혈관 질환에 대한 감수성(증가된 감수성 또는 감소된 감수성)을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 상기 마커 또는 일배체형의 존재는 심혈관 질환 치료제에 대한 반응을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 상기 마커 또는 일배체형의 존재는 심혈관 질환의 예후를 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 상기 마커 또는 일배체형의 존재는 심혈관 질환의 치료의 진행을 나타낸다. 그와 같은 치료는 수술, 약물, 또는 기타 수단(예를 들면, 생활방식 변화)에 의한 개입을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 약제학적 팩(키트)이 제공되며, 상기 팩은 치료제, 및 본 명세서에 기재된 바와 같은, 본 발명의 하나 이상의 변이에 대해 진단적으로 테스트된 인간에게 상기 치료제를 투여하는 것에 대한 일련의 설명서를 포함한다. 상기 치료제는 소형 분자 약물(small molecule drug), 항체, 펩티드, 안티센스 또는 RNAi 분자, 또는 다른 치료 분자일 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이의 보인자로 확인된 개체는 치료제의 처방된 투여량을 복용하도록 지시된다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이의 동형접합체 보인자로 확인된 개체는 치료제의 처방된 투여량을 복용하도록 지시된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이의 비-보인자(non-carrier)로 확인된 개체는 치료제의 처방된 투여량을 복용하도록 지시된다.
특정한 구체예에서, 상기 키트는 상기 키트를 포함한 시약을 사용하는 것에 대한 일련의 설명서를 더 포함한다.
치료제
본 발명의 변이(예를 들면, 본 발명의 마커 및/또는 일배체형, 예를 들면, 표 3, 10 및 21에 열거된 마커들)는 심혈관 질환에 대한 신규한 치료제 표적을 확인하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 심혈관 질환과 연관된 변이(마커 및/또는 일배체형)를 포함하는 유전자 또는 상기 변이와 연관 불균형인 유전자, 또는 그들의 산물(예를 들면, CDKN2A 및 CDKN2B 유전자 및 그들의 유전자 산물), 및 이 유전자들 또는 그들의 산물에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 조절되거나 또는 이들과 상호작용하는 유전자 또는 그들의 산물이 심혈관 질환을 치료하거나, 또는 심혈관 질환과 연관된 증상의 발생을 예방 또는 지연시키는 치료제의 개발을 위해 표적화될 수 있다. 치료제는 하나 이상의, 예를 들면, 표적 유전자 또는 그들의 유전자 산물의 기능 및/또는 수준을 조절할 수 있는, 작은 비-단백질 및 비-핵산 분자, 단백질, 펩티드, 단백질 단편, 핵산(DNA, RNA), PNA(peptide nucleic acid), 또는 그들의 유도체 또는 모방체(mimetics)를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 및/또는 변이, 또는 그들의 상보적 서열을 포함하는 핵산이 세포, 조직 또는 기관에서 유전자 발현을 조절하기 위한 안티센스 구조물(antisense construct)로서 이용될 수 있다. 안티센스 기법과 연관된 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, AntisenseDrug Technology: Principles, Strategies, and Applications, Crooke, ed., Marcel Dekker Inc., New York (2001)에서 설명되고 검토된다. 일반적으로, 안티센스 핵산 분자는 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 영역에 상보적이도록 설계되어, 상기 안티센스 분자가 mRNA에 혼성화되고, 따라서, 상기 mRNA의 단백질로의 번역을 차단한다. 절단제(cleaver) 및 차단제(blocker)를 포함한, 여러 종류의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다. 전자, 즉, 절단제는 표적 RNA 부위에 결합하고, 상기 표적 RNA를 절단하는, 세포내 뉴클레아제(예를 들면, RnaseH 또는 Rnase L)를 활성화시킨다. 차단제는 표적 RNA에 결합하고, 리보좀의 입체 장애(steric hindrance)에 의해 단백질 번역을 저해한다. 차단제의 예는 핵산, 모르폴리노 화합물, LNA(locked nucleic acid) 및 메틸포스포네이트를 포함한다(Thompson, Drug Discovery Today, 7:912-917 (2002)). 안티센스 올리고뉴클레오티드는 직접적으로 치료제로서 유용하고, 또한 예를 들면, 유전자 넉-아웃(knock-out) 또는 유전자 넉-다운 실험에 의해, 유전자 기능을 결정하고 검증하기 위해 유용하다. 안티센스 기술은 Lavery et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 6:561-569 (2003), Stephens et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 5:118-122 (2003), Kurreck, Eur. J. Biochem. 270:1628-44 (2003), Dias et al., Mol. Cancer Ter. 1:347-55 (2002), Chen, Methods Mol. Med. 75:621-636 (2003), Wang et al., Curr. Cancer Drug Targets 1:177-96 (2001), 및 Bennett, Antisense Nucleic Acid Drug.Dev. 12:215-24 (2002)에 더 설명된다.
본 명세서에 기재된 변이는 특정한 변이에 특이적인 안티센스 시약의 선택 및 설계를 위해 이용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 변이에 대한 정보를 이용하여, 하나 이상의 본 발명의 변이를 포함하는 표적 mRNA를 특이적으로 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 다른 안티센스 분자들이 설계될 수 있다. 이 방식으로, 본 발명의 하나 이상의 변이(마커 및/또는 일배체형)를 포함하는 mRNA 분자의 발현이 저해되거나 또는 차단될 수 있다. 일 구체예에서, 안티센스 분자는 표적 핵산의 특정한 대립형질 형태(즉, 하나 또는 수개의 변이(대립형질 및/또는 일배체형))에 특이적으로 결합하여, 이 특정한 대립형질 또는 일배체형으로부터 기원된 산물의 번역을 저해하나, 상기 표적 핵산 분자의 특정한 다형성 부위에서 다른 변이 또는 대안적인 변이에는 결합하지 않도록 설계된다.
안티센스 분자는 유전자 발현을 저해하고, 따라서, 단백질 발현을 저해하기 위해 mRNA를 불활성화시키기 위해 이용될 수 있기 때문에, 안티센스 분자는 심혈관 질환과 같은, 질병 또는 장애를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 방법은 mRNA가 번역되는 능력을 약화시키는, mRNA의 하나 이상의 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 리보자임(ribozyme)에 의한 절단을 포함할 수 있다. 그와 같은 mRNA 영역은 예를 들면, 단백질-코딩 영역, 특히, 촉매 활성, 기질 및/또는 리간드 결합 부위, 또는 단백질의 다른 기능성 도메인에 상응하는 단백질-코딩 영역을 포함한다.
C. elegans (Fire et al.,Nature 391:806-11 (1998))에서의 최초의 발견 이후, 지난 10년간 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상이 활발하게 연구되었고, 최근년에, 인간 질병의 치료에서 RNAi의 잠재적 용도가 활발히 탐구되고 있다(reviewed in Kim & Rossi, Nature Rev. Genet. 8:173-204 (2007)). 유전자 침묵(gene silencing)으로도 불리는, RNA 간섭(RNAi)은 특정한 유전자를 중지(turn off)시키기 위해 이중-가닥 RNA 분자(dsRNA)를 이용하는 것에 기반한다. 세포에서, 세포질 이중가닥-RNA 분자(dsRNA)는 세포성 복합체(cellular complex)에 의해 작은 간섭 RNA(siRNA)로 가공된다. siRNA는 단백질-RNA 복합체를 표적 mRNA 상의 특정한 부위로 표적화되게 하여, 상기 mRNA의 절단을 초래한다(Thompson, Drug Discovery Today, 7:912-917 (2002)). siRNA 분자들은 통상적으로 길이가 약 20개, 21개, 22개 또는 23개의 뉴클레오티드로 구성된다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 분리된 핵산 분자, 및 상기 분자들의 RNA 간섭을 위한 용도, 즉, 작은 간섭 RNA 분자(siRNA)로서의 용도에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 길이가 18개 내지 26개의 뉴클레오티드로 구성되고, 바람직하게는 19개 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성되며, 보다 바람직하게는 20개 내지 24개의 뉴클레오티드로 구성되고, 보다 바람직하게는, 21개, 22개 또는 23개의 뉴클레오티드로 구성된다.
RNAi-매개 유전자 침묵을 위한 또 다른 경로는 세포에서 전구체 miRNA(precursor microRNA, pri-miRNA)를 생성하기 위해 가공되는, 내재적으로 코딩된 일차 마이크로RNA(endogenously encoded micorRNA)(pri-miRNA) 전사체에서 기인한다. 이 miRNA 분자들은 핵으로부터 세포질로 유출되고, 세포질에서 성숙 miRNA 분자(mature miRNA)를 생성하기 위해 가공을 거치고, 상기 miRNA는 mRNA의 3' 비번역 영역(untranslated region, UTR) 내의 표적 부위를 인식하는 것에 의해 번역 저해(translational inhibition)를 주도하고, 뒤이어 P-바디(P-body)를 가공하는 것에 의해 mRNA 분해를 주도한다(reviewed in Kim & Rossi, Nature Rev. Genet. 8:173-204 (2007)).
RNAi의 임상적 적용은 바람직하게는 크기가 약 20 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되고, 바람직하게는 2개의 뉴클레오티드로 구성된 3' 오버랩(overlap)을 갖는 것인 합성 siRNA 듀플렉스의 내포(incorporation)를 포함한다. 유전자 발현의 넉다운은 표적 mRNA에 대한 서열-특이적 설계에 의해 확립된다. 그와 같은 분자의 최적 설계 및 합성을 위한 여러 상업적 사이트들이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다.
다른 적용들은 보다 긴 siRNA 분자(통상적으로 25 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성된 길이, 바람직하게는 약 27개의 뉴클레오티드로 구성된 길이), 및 작은 헤어핀 RNA(small hairpin, sh RAN; 통상적으로 약 29개의 뉴클레오티드로 구성된 길이)를 제공한다. 후자는 Amarzguioui et al. (FEBS Lett. 579:5974-81 (2005))에 기재된 바와 같이, 자연적으로 발현된다. 화학적으로 합성된 siRNA 및 shRNA는 인 비보 가공을 위한 기질이며, 일부 경우에, 보다 짧은 설계의 경우보다 더 강력한 유전자 침묵을 제공한다(Kim et al., Nature Biotechnol. 23:222-226 (2005); Siolas et al., Nature Biotechnol. 23:227-231 (2005)). 일반적으로, siRNA의 세포내 농도가 후속 세포 분열에 의해 희석되기 때문에, siRNA는 유전자 발현의 일시적 침묵을 제공한다. 대조적으로, 발현된 shRNA는 shRNA의 전사가 일어나는 동안은, 표적 전사체(target transcript)의 장기적이고 안정적인 넉다운을 매개한다(Marques et al., Nature Biotechnol. 23:559-565 (2006); Brummelkamp et al., Science 296: 550-553 (2002)).
siRNA, miRNA 및 shRNA를 포함하는 RNAi 분자들은 서열-의존적 방식으로 작용하기 때문에, 본 발명의 변이(예를 들면, 표 3, 10 및 21에 표시된 마커 및 일배체형)는 특정한 대립형질 및/또는 일배체형(예를 들면, 본 명세서에 기재된 마커 및 일배체형)을 포함하는 특이적 핵산 분자를 인식하나, 다른 대립형질 또는 일배체형을 포함하는 핵산 분자는 인식하지 않는 RNAi 시약을 설계하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 이 RNAi 시약은 표적 핵산 분자를 인식하고 파괴시킬 수 있다. 안티센스 시약의 경우와 같이, RNAi 시약은 치료제로서(즉, 질병-연관 유전자 또는 질병-연관 유전자 변이의 중지(turnoff)를 위해) 유용할 수 있으나, 또한 유전자 기능을 규명하고 검증하기 위해 유용할 수 있다(예를 들면, 유전자 넉-아웃 또는 유전자 넉-다운 실험에 의해).
RNAi의 전달은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 비-바이러스 전달(non-viral delivery)을 이용하는 방법은 콜레스테롤, 안정한 핵산-지질 입자(stable nucleic acid-lipid particle, SNALP), 중쇄 항체 단편(Fab), 앱타머(aptamer) 및 나노입자를 포함한다. 바이러스에 의한 전달 방법(viral delivery method)은 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus)의 이용을 포함한다. 일부 구체예에서, siRNA 분자는 그들의 안정성을 증가시키기 위해 화학적으로 변형된다. 이는 2'-O-메틸푸린 및 2'-플루오로푸린을 포함한, 리보오스의 2' 위치에서의 변형을 포함하고, 이 변형들은 Rnase 활성에 대한 내성을 제공한다. 다른 화학적 변형이 가능하며 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다.
하기의 참조문헌들이 RNAi, 및 RNAi를 이용한 특정한 유전자의 표적화 가능성의 추가적인 요약을 제공한다: Kim & Rossi, Nat. Rev. Genet. 8:173-184 (2007), Chen & Rajewsky, Nat. Rev. Genet. 8: 93-103 (2007), Reynolds, et al., Nat. Biotechnol. 22:326-330 (2004), Chi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6343-6346 (2003), Vickers et al., J. Biol. Chem. 278:7108-7118 (2003), Agami, Curr. Opin. Chem. Biol. 6:829-834 (2002), Lavery, et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 6:561-569 (2003), Shi, Trends Genet. 19:9-12 (2003), Shuey et al., Drug Discov. Today 7:1040-46 (2002), McManus et al., Nat. Rev. Genet. 3:737-747 (2002), Xia et al., Nat. Biotechnol. 20:1006-10 (2002), Plasterk et al., curr. Opin. Genet. Dev. 10:562-7 (2000), Bosher et al., Nat. Cell Biol. 2:E31-6 (2000), 및 Hunter, Curr. Biol. 9:R440-442 (1999).
심혈관 질환의 발병에 대한 증가된 소인(predispotion) 또는 위험도를 초래하는 유전적 결함, 또는 상기 질환을 유발하는 결함이 상기 결함을 갖는 개체에게 상기 유전적 결함의 부위에 정상/야생형 뉴클레오티드를 공급하는 복구 서열(repair sequence)을 내포하는 핵산 단편을 투여하는 것에 의해 영구적으로 정정될 수 있다. 그와 같은 부위-특이적 복구 서열은 개체의 게놈 DNA의 내재적 복구를 촉진하기 위해 작용하는 RNA/DNA 올리고뉴클레오티드를 포함(concompass)할 수 있다. 복구 서열의 투여는 음이온성 리포좀 내에 캡슐화된, 폴리에틸렌이민과의 복합체, 아데노바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 또는 투여되는 핵산의 세포내 흡수를 촉진하기에 적합한 다른 약제학적 조성물과 같은, 적합한 비히클에 의해 수행될 수 있다. 그 후, 키메라 올리고뉴클레오티드가 개체의 게놈으로 정상적인 서열의 내포를 유도하여, 정상/야생형 유전자 산물의 발현을 유도하기 때문에, 유전적 결함이 극복될 수 있다. 상기 교체(replacement)가 전파되고, 따라서, 질환 또는 상태와 연관된 증상의 영구적인 치유 및 경감을 가능하게 한다.
본 발명은 심혈관 질환을 치료하기 위해 이용될 수 있는 화합물 또는 작용제를 확인(식별, identify)하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 변이는 치료제의 확인 및/또는 개발을 위한 표적으로 유용하다. 특정한 구체예에서, 그와 같은 방법은 작용제 또는 화합물이 본 발명의 하나 이상의 변이(마커 및/또는 일배체형)를 포함하는 핵산(예를 들면, CDKN2A 및 CDKN2B 유전자 중 하나 또는 양자 모두), 또는 상기 핵산의 코딩된 산물의 활성 및/또는 발현을 조절하는 능력을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 또한 코딩된 핵산 산물의 원치않는 활성 또는 발현을 저해 또는 변화시키는 작용제 또는 화합물을 확인하기 위해 이용될 수 있다. 그와 같은 실험을 수행하기 위한 분석법은 당업자에게 공지된 바와 같이, 세포-기반 시스템 또는 세포-불포함 시스템(cell-free system)에서 수행될 수 있다. 세포-기반 시스템은 본래 목적 핵산 분자를 발현하는 세포, 또는 특정한 원하는 핵산 분자를 발현하도록 유전적으로 변형된 재조합 세포를 포함한다.
환자에서 변이 유전자 발현이 변이-함유 핵산 서열의 발현(예를 들면, 하나 이상의 변이를 함유하는 RNA로 전사되고, 뒤이어 단백질로 번역될 수 있는, 본 발명의 하나 이상의 변이를 포함하는 유전자), 또는 정상적인 전사체의 발현 수준 또는 패턴에 영향을 미치는 변이, 예를 들면, 유전자의 조절 또는 제어 영역의 변이에 따른, 정상/야생형 핵산 서열의 변화된 발현에 의해 평가될 수 있다. 유전자 발현에 대한 분석법은 직접적인 핵산 분석법(mRNA), 발현된 단백질 수준에 대한 분석법, 또는 경로, 예를 들면, 신호 경로(signal pathway)에 관여된 부수적(collateral) 화합물의 분석을 포함한다. 또한, 신호 경로에 대응하여 상향-조절 또는 하향-조절되는 유전자의 발현이 분석될 수 있다. 일 구체예는 루시페라아제와 같은 리포터 유전자를 목적 유전자의 조절 영역에 작동가능하게 연결하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 세포가 후보 화합물 또는 작용제와 접촉되고, mRAN의 발현이 결정되는 경우, 유전자 발현의 조절제(modulator)가 확인될 수 있다. 후보 화합물 또는 작용제의 존재 하의 mRNA의 발현 수준이 상기 화합물 또는 작용제의 부재 하의 발현 수준에 비교될 수 있다. 이 비교에 근거하여, 심혈관 질환을 치료하기 위한 후보 화합물 또는 작용제가 변이 유전자의 유전자 발현을 조절하는 화합물 또는 작용제로 확인될 수 있다. mRNA의 발현 또는 코딩된 단백질이 후보 화합물 또는 작용제의 부재시보다 존재 시에 통계적으로 유의성 있게 더 높은 경우, 상기 후보 화합물 또는 작용제는 상기 핵산의 발현의 촉진제 또는 상향-조절제(up-regulator)로 확인된다. 핵산 발현 또는 단백질 수준이 후보 화합물 또는 작용제의 부재시 보다 존재 시에 통계적으로 유의성 있게 더 낮은 경우, 상기 후보 화합물은 상기 핵산의 발현의 저해제 또는 하향-조절제(down-regulator)로 확인된다.
본 발명은 또한 약물(화합물 및/또는 작용제) 스크리닝을 통해 확인된 화합물을 유전자 조절제(즉, 유전자 발현의 촉진제 및/또는 저해제)로 이용한 치료 방법을 제공한다.
치료제에 대한 반응의 확률을 평가하는 방법, 치료의 진행을 모니터링하는 방법 및 심혈관 질환의 치료 방법
본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 개체들은 특정한 치료(예를 들면, 치료제 또는 치료 방법)에 대해 차등적 반응을 가질 수 있다. 약물유전학(Pharmacogenomics)은 유전적 변이(예를 들면, 본 발명의 변이(마커 및/또는 일배체형))가 변화된 약물 소인(drug disposition) 및/또는 약물의 비정상적인 또는 변화된 작용 때문에, 약물 반응에 어떻게 영향을 미치는지의 문제를 다룬다. 따라서, 차등적 반응의 근거(basis)가 부분적으로 유전학적으로 결정될 수 있다. 약물 반응에 영향을 미치는 유전적 변이에 따른 임상적 결과는 일부 개체(본 발명의 유전적 변이의 보인자 또는 비-보인자)에서 약물의 독성, 또는 약물의 치료적 실패(therapeutic failure)를 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명의 변이는 치료제 및/또는 방법이 신체에 대해 작용하는 방식, 또는 신체가 치료제를 대사하는 방식을 결정할 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 본 명세서에 기재된 다형성 부위에서 특정한 대립형질 또는 일배체형의 존재는 심혈관 질환의 특정한 치료 방식(treatment modality)에 대한 상이한 반응, 예를 들면, 상이한 반응률(response rate)을 나타낸다. 이는 심혈관 질환으로 진단되거나 심혈관 질환에 대한 위험도를 가지며, 다형성 부위에 본 발명의 특정한 대립형질 또는 일배체형(예를 들면, 본 발명의 위험 대립형질 및/또는 일배체형)을 갖는 환자가 심혈관 질환을 치료하기 위해 이용된 특정한 치료제, 약물 및/또는 다른 치료법에 대해 보다 유리하게 또는 보다 불리하게 반응할 것이라는 것을 의미한다. 따라서, 상기 마커 대립형질 또는 일배체형의 존재 또는 부재는 환자에 대해 어떤 치료가 이용되어야 하는지를 결정하는데 도움이 될 수 있다. 예를 들면, 새로 진단된 환자의 경우, 본 발명의 마커 또는 일배체형의 존재가 (예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 게놈 DNA를 포함하는 혈액 시료 또는 기타 시료로부터 유래된 DNA의 테스트를 통해) 평가될 수 있다. 환자가 마커 대립형질 또는 일배체형에 대해 양성인 경우(즉, 마커의 하나 이상의 특정한 대립형질 또는 일배체형이 존재하는 경우), 의사는 하나의 특정한 치료(예를 들면, 하나의 특정한 치료제 또는 치료제의 조합)를 권고하고, 환자가 마커의 상기 하나 이상의 대립형질 또는 일배체형에 대해 음성인 경우, 다른 코스의 치료(즉각적인 치료가 아닌, 질병의 진행에 대한 지속적인 모니터링이 수행될 것을 권고하는 것을 포함할 수 있음)가 권고될 수 있다. 따라서, 환자의 보인자 상태가 특정한 치료 방식이 적용되어야 하는지 여부를 결정하는 것을 보조하기 위해 이용될 수 있다. 그 가치는 질병을 조기에 진단하고, 임상의에게 가장 적합한 치료를 적용할 수 있도록 질병의 예후/공격성에 대한 정보를 제공할 수 있다는 가능성에 있다.
일 예로서, 재협착에 대한 유전적 테스트의 적용은 관상동맥 스텐트 시술 후 재협착을 발생시킬 높은 위험을 갖는 개체를 식별할 수 있다. 약물-용리형 스텐트 및 근접 치료를 도입하는 것과 같은, 관상동맥 질환에 대한 일부 치료법은 스텐트내 재협착의 감소된 위험도와 연관된다는 것이 알려져 있으나, 이 방법들의 이용은 경제적 이유를 포함한, 다수의 이유 때문에 제한된다. 관상동맥 스텐트 시술을 받는 개체들의 군 내에서 스텐트내 재협착에 대한 유전적 위험 변이의 보인자인 개체의 확인은 스텐트내 재협착의 감소된 위험도와 연관된 치료법으로부터 가장 크게 혜택을 입을 수 있는 개체들의 표적화를 가능하게 한다.
본 발명은 또한 관상동맥 질환, MI, 뇌졸중, PAD, IA, AAA 및 재협착을 포함한, 심혈관 질환의 치료의 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다. 이는 본 발명의 마커 및 일배체형의 유전형 및/또는 일배체형 상태에 근거하여, 또는 본 발명의 변이(마커 및 일배체형)와 연관된 유전자(예를 들면, CDKN2A 및 CDKN2B)의 발현을 모니터링하는 것에 의해 수행될 수 있다. 위험 유전자 mRNA 또는 코딩된 단백질이 조직 시료(예를 들면, 말초 혈액 시료 또는 생검 시료)에서 측정될 수 있다. 따라서, 치료 효과를 모니터링하기 위해, 발현 수준 및/또는 mRNA 수준이 치료 전 및 치료 동안 결정될 수 있다. 대안적으로, 또는 동시에, 본 명세서에서 제시된 심혈관 질환에 대한 하나 이상의 위험 변이의 유전형 및/또는 일배체형 상태가 치료 효과를 모니터링하기 위해 치료 전 및 치료 동안 결정된다.
본 발명이 관련된 심혈관 질환의 치료 모듈은 심근 경색증 또는 심근 경색증에 대한 감수성을 치료하는 방법; 심근 경색증의 예방적 치료 방법; 일과성 허혈 발작 또는 뇌졸중, 또는 뇌졸중에 대한 감수성을 치료하는 방법; 파행(claudication), PAD 또는 PAD에 대한 감수성을 치료하는 방법; 급성 관상동맥 증후군(예를 들면, 불안정 협심증, 비-ST 상승 심근 경색증(non-ST-elevation myocardial infarction, NSTEMI), 또는 ST-상승 심근 경색증(STEMI))을 치료하는 방법; MI, 뇌졸중, 또는 PAD의 위험도를 저하시키는 방법; 제2의 심근 경색증 또는 뇌졸중의 위험도를 저하시키는 방법; 동맥(관상동맥, 경동맥, 및/또는 대퇴동맥)에서 혈류를 복구하기 위해 치료(예를 들면, 혈관성형술, 스텐트, 혈관재생술)를 필요로 하는 환자를 위한, 죽상경화증을 치료하는 방법; 0.9 미만의 무증상 발목/상완 지수(asymptomatic ankle/brachial index)를 치료하는 방법; 및/또는 (예를 들면, 심근 경색증, 뇌졸중, 또는 PAD의 치료를 위해) 류코트리엔 합성을 감소시키는 방법, 복부 대동맥류를 치료하는 방법, 두개내 동맥류를 치료하는 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
관상동맥 질환 및 MI의 치료는 (i) 예방적 치료(preventive treatment) 및 (ii) 질병 관리로 분류될 수 있다. 후자의 주요 목표는 심장에 대한 손상을 최소화하고 추가적인 합병증을 예방하는 것이다. 질병 관리의 제1 치료법(first line therapy)은 산소, 아스피린, 글리세릴 니트레이트(니트로글리세린), 및 모르핀 또는 관련 약물과 같은 진통제 중 하나 이상의 투여를 포함한다. 일단 MI가 진단되면, 추가적인 치료는 베타 차단제, 헤파린 및/또는 저분자량 헤파린을 포함한 항응고제, 및 가능하게는 클로피도그렐과 같은 항혈소판제를 포함할 수 있다. 이차적 예방(secondary prevention), 즉, 재발성 MI의 위험도의 관리는 통상적으로 하기 중 하나 이상을 포함한다: 아스피린 및/또는 클로피도그렐을 포함한 항혈소판제 약물 요법, 메토프롤롤 및 카르베딜롤을 포함하는 베타 차단제 요법, ACE 저해제 요법, 스타틴 요법, 에프렐레논(eplerenone)을 포함한, 알도스테론 길항제 요법. 또한, 오메가-3 지방산과 같은 식품 보충제의 비-치료적 투여가 유용할 수 있다.
CAD, MI 및 뇌졸중을 포함한, 심혈관 질환을 위한 새로운 예방적 치료법은 플라크의 형성 및/또는 파열에 작용하는 작용제를 포함하고, 또한 포스포디에스테라아제 저해제를 포함한다. 그와 같은 치료제는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법에서 유용하다. 이는 류코트리엔 합성 경로를 표적화하는 작용제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 류코트리엔 합성 저해제는 류코트리엔 합성 경로의 구성물(예를 들면, FLAP, 5-LO, LTC4S, LTA4H, 및 LTB4DH)을 저해하거나 또는 길항시키는 작용제일 수 있다. 예를 들면, 류코트리엔 합성 저해제는 FLAP 폴리펩티드 활성을 저해하거나 또는 길항시키고(예를 들면, FLAP 저해제) 및/또는 FLAP 핵산 발현을 저해하거나 또는 길항시키는(예를 들면, FLAP 핵산 길항제) 작용제일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 류코트리엔 합성 저해제는 류코트리엔 생합성 경로의 또 다른 구성물(예를 들면, LTC4S, LTA4H)의 폴리펩티드 활성 및/또는 핵산 발현을 저해하거나 길항시키거나, 또는 류코트리엔(예를 들면, LTB4DH)의 분해를 증가시키는 작용제이다. 바람직한 구체예에서, 상기 작용제는 FLAP, LTA4H 또는 5-LO의 활성 및/또는 핵산 발현을 변화시킨다. 바람직한 작용제는 본 명세서에서 작용제 표 I에 표시된 것들을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 바람직한 작용제는: MK-0591로도 알려진, 1-((4-클로로페닐)메틸)-3-((1,1-디메틸에틸)티오)-알파,알파-디메틸-5-(2-퀴놀리닐메톡시)-1H-인돌-2-프로판산, BAY-x-1005로도 알려진 (R)-(+)-알파-시클로펜틸-4-(2-퀴놀리닐메톡시)-벤젠아세트산, A-81834로도 알려진, 3-(3-(1,1-디메틸에틸티오-5-(퀴놀린-2-일메톡시)-1-(4-클로로메틸페닐)인돌-2-일)-2,2-디메틸프로피온알데히드 옥심-0-2-아세트산일 수 있거나; 또는, 질레우톤(zileuton), 아트렐레우톤(atreleuton), ZD-2138로도 알려진, 6-((3-플루오로-5-(테트라히드로-4-메톡시-2H-피란-4일)페녹시)메틸)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논, MK-886으로 알려진, 1-((4-클로로페닐)메틸)-3-((1,1-디메틸에틸)티오)-알파,알파-디메틸-5-(2-퀴놀리닐메톡시)-1H-인돌-2-프로판산, CJ-13610으로 알려진, 4-(3-(4-(2-메틸-이미다졸-1-일)-페닐술파닐)-페닐)-테트라히드로-피란-4-카르복시산 아미드일 수 있다. 추가적인 작용제는 Penning et al., Med Chem. 2002 45(16):3482-90, Penning, Curr Pharm Des. 2001, 7(3):163-79 및 Penning et al., J Med Chem. 2000 43(4):721-35에 기재된 것들을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 류코트리엔(예를 들면, LTA4, LTB4, LTC4, LTD4, LTE4, Cys LT1, Cys LT2)의 대사 또는 활성을 변화시키고, 예를 들면, 류코트리엔 길항제 또는 류코트리엔에 대한 항체이며, 류코트리엔 수용체(예를 들면, BLT1, BLT2, CysLTR1, 및 CysLTR2)의 활성을 변화시키는 작용제이다.
다른 바람직한 구체예에서, 작용제는 LTA4H의 활성 및/또는 핵산 발현을 변화시킨다. 바람직한 작용제는 작용제 표 II에 표시된 것들을 포함하나, 하기의 작용제들도 포함한다: 1-[2-[4-(페닐메틸)페녹시]에틸]-2-메틸-4-테트라졸릴피페리딘; 1-[2-[4-(4-옥사졸릴)페녹시)페녹시]에틸]피롤리딘; 3-[메틸[3-[4-(2-티에닐메틸)페녹시]프로필]아미노]프로피온산; 메틸 3-[메틸[3-[4-(2-티에닐메틸)페녹시]프로필]아미노]프로피오네이트; 3-[메틸[3-[4-(3-티에닐메틸)페녹시]프로필]아미노]프로피온산; 메틸-3-[메틸[3-4-(3-티에닐메틸)페녹시]프로필]아미노]프로피오네이트; 3-[메틸[3-[4-(4-플루오로페녹시)페녹시]프로필]아미노]프로피온산; 3-[메틸[3-[4-(4-비페닐옥시)페녹시]프로필]아미노]프로피온산; N-[3-[[3-[4-(페닐메틸)페녹시] 프로필]메틸아미노]프로피오닐]벤젠술폰아미드; 1-[2-[4-(페닐메틸)페녹시]에틸]-2-메틸-4-(1H-테트라졸-5-일)피페리딘; 1-[2-[4-(페닐메틸)페녹시]에틸]-4-(1H-테트라졸-5-일)피페리딘. 또 다른 구체예에서, 바람직한 작용제는 SC-56938로 알려진, 에틸-1-[2-[4-(페닐메틸)페녹시]에틸]-4-피페리딘-카르복실레이트; RP64966으로 알려진, [4-[5-(3-페닐-프로필)티오펜-2-일]부톡시]아세트산; SA6541로 알려진, (R)-S-[[4-(디메틸아미노)페닐]메틸]-N-(3-머캅토-2메틸-1-옥소프로필-L-시스테인일 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에서, 치료제는 DG-051로도 알려진, 4-{(S)-2-[4-(4-클로로-페녹시)-페녹시메틸]-피롤리딘-1-일}-부티라미드일 수 있다.
심혈관 질환을 치료 또는 예방하기 위한 작용제는 단독으로 또는 스타틴과 조합되어 투여될 수 있다. 스타틴은 작용제 로부바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴, 로바스타틴(메볼린으로도 알려짐), 심바스타틴, 프라바스타틴, 피타바스타틴, 메바스타틴, 크레바스타틴, ML-236A, ML-236B, MBV-530A 및 MB-530B를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
앞서 열거된 것들 및 작용제 표 I 및 작용제 표 II에 열거된 모든 작용제들은 또한 그들의 광학적으로 순수한 거울상이성질체, 염, 화학적 유도체, 및 유사체를 포함한다.
작용제 표 I
Figure 112009057317769-pct00001
Figure 112009057317769-pct00002
작용제 표 II
표적 화합물 ID 화합물 명칭 특허/참조
LTA4H
저해제		 SC-57461A 3-[메틸[3-[4-(페닐메틸)페녹시]-프로필]아미노]프로피온산 Penning, T.D. et.al. Bioorg Med. Chem. Letters (2003), 13, 1137-1139.

ibid, (2002), 12, 3383-3386
LTA4H
저해제		 SC-56938 에틸-1-[2-[4-(페닐메틸)페녹시]에틸]-4-피페리딘-카르복실레이트 Penning, T.D. et.al. Bioorg Med. Chem. Letters (2003), 13, 1137-1139.

ibid, (2002), 12, 3383-3386.

US 6,506,87 6A1
LTA4H
저해제		 RP 64966 [4-[5-(3-페닐-프로필)티오펜-2-일]부톡시]아세트산 WO9627585
LTA4H
저해제		 SA 6541 (R)-S-[[4-(디메틸아미노)페닐]메틸]-N-(3-머캅토-2메틸-1-옥소프로필-L-시스테인 WO9809943
LTA4H
저해제 		SA-9499/ SA-6541 (R)-3-(4-디메틸아미노-벤질술파닐)-2-((R)-3-머캅토-2-메틸-프로피오닐아미노)-프로피온산
LTB4
수용체
길항제		 Amelubant/ BIIL-284 카르밤산, ((4-((3-((4-(1-(4-히드록시페닐)-1-메틸에틸)페녹시)메틸)페닐)메톡시)페닐)이미노메틸)- 에틸 에스테르 US 6,576,669
LTB4
수용체
길항제		 BIRZ-227 5-클로로-2-[3-(4-메톡시-페닐)-2-피리딘-2-일-피롤리딘-1-일]-벤조옥사졸 Journal of Organic Chemistry 1998,63:2(326-330).
LTB4
수용체
길항제		 CP 195543 2-[(3S,4R)-3,4-디히드로-4-히드록시-3-(페닐메틸)-2H-1-벤조피란-7 -일]-4-(트리플루오로메틸)벤조산 Process: WO 98/11085 1998, priority US 60/26372 1996; J. Pharamacology and Expert. Therapy, 1998, 285: 946-54
LTB4
수용체
길항제		 Ebselen 2-페닐-밴조[d]이소셀레나졸-3-온 Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 1995, July 2-6 (S162); Drugs of the Future 1995, 20:10 (1057)
LTB4
수용체
길항제		 LTB 019; CGS-25019C 4-[5-(4-카르밤이미도일-페녹시)-펜틸옥시]-N,N-디이소프로필-3-메톡시-벤자미드 말리에이트 ACS Meeting 　1994,　207th:San Diego　 (MEDI 003); International Congress of the Inflammation Research Association 1994, 7th:White Haven (Abs W23)
LTB4
수용체
길항제		 LY 210073 5-(2-카르복시-에틸)-6-[6-(4-메톡시-페닐)-헥스-5-에닐옥시]-9-옥소-9H-크산텐-2-카르복시산 J Med Chem 1993 36 (12) 1726-1734
LTB4
수용체
길항제		 LY 213024 5-(3-카르복시벤조일)-2-(데실옥시)벤젠프로판산 J Med Chem 1993 36 (12) 1726-1734
LTB4
수용체
길항제		 LY 255283 1-[5-에틸-2-히드록시-4-[[6-메틸-6-(1H-테트라졸-5-일)헵틸]옥시]페닐]에타논
EP 276064 B 1990, priority US 2479 1987
LTB4
수용체
길항제		 LY 264086 7-카르복시-3-(데실옥시)-9-옥소-9H-크산텐-4-프로판산 US 4996230 1991, priority US 481413 1990
LTB4
수용체
길항제		 LY 292728 7-카르복시-3-[3-[(5-에틸-4'-플루오로-2-히드록시[1,1'-비페닐]-4-일)옥시]프로폭시]-9-옥소-9H-크산텐-4-프로판산 디소디움 염 EP 743064 A 1996, priority US 443179 1995
LTB4
수용체
길항제		 LY-293111 (VML-295) 벤조산, 2-(3-(3-((5-에틸-4'-플루오로-2-히드록시(1,1'-비페닐)-4-일)옥시)프로폭시)-2-프로필페녹시)- Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 2002, 21:1 (Abs 343) [LY-293111 for Cancer] SCRIP World Pharmaceutical News 　1997,　2272　 (13) [for VML-295]
LTB4
수용체
길항제		 ONO 4057; LB 457 (E)-2-(4-카르복시부톡시)-6-[[6-(4-메톡시페닐)-5-헥세닐]옥시]벤젠프로판산 EP 405116 A 1991
LTB4
수용체
길항제		 PF 10042 1-[5-히드록시-5-[8-(1-히드록시-2-페닐에틸)-2-디벤조푸라닐]-1-옥소 펜틸]피롤리딘 EP 422329 B 1995, priority US 409630 1989
LTB4
수용체
길항제		 RG-14893 8-벤질옥시-4-[(메틸-페네틸-카르바모일)-메틸]-나프탈렌-2-카르복시산 SCRIP World Pharmaceutical News 　1996,　2168　 (20)
LTB4
수용체
길항제		 SB-201993 3-{6-(2-카르복시-비닐)-5-[8-(4-메톡시-페닐)-옥틸옥시]-피리딘-2-일메틸술파닐메틸}-벤조산 WO-09500487
LTB4
수용체
길항제		 SC-52798 7-[3-(2-시클로프로필메틸-3-메톡시-4-티아졸-4-일-페녹시)-프로폭시]-8-프로필-크로만-2-카르복시산 Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 1994,　4:6　 (811-816); Journal of Medicinal Chemistry 1995, 38:6 (858-868)
LTB4
수용체
길항제		 SC-53228 3-{7-[3-(2-시클로프로필메틸-3-메톡시-4-메틸카르바모일-페녹시)-프로폭시]-8-프로필-크로만-2-일}-프로피온산 International Congress of the Inflammation Research Association 　1994,　7th:White Haven　 (Abs W5)
LTB4
수용체
길항제		 WAY 121006 3-플루오로-4'-(2-퀴놀리닐메톡시)-[1,1'-비페닐]-4-아세트산 Drugs under Experimental and Clinical research 　1991,　17:8　 (381-387)
LTB4
수용체
길항제		 ZD-2138 3-아미노-3-(4-메톡시-테트라히드로-피란-4-일)-아크릴산 1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로-퀴놀린-6-일메틸 에스테르 International Symposium on Medicinal Chemistry 　1994,　13th:Paris　 (P 197)
대안적으로, 본 발명의 마커 및 일배체형과 관련된 생물학적 네트워크 또는 대사 경로는 mRNA 및/또는 폴리펩티드 수준을 결정하는 것에 의해 모니터링될 수 있다. 이는 예를 들면, 치료 전과 치료 동안 채취된 시료에서, 상기 네트워크 및/또는 경로에 속하는 여러 유전자들의 발현 수준 또는 폴리펩티드를 모니터링하는 것에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 상기 생물학적 네트워크 또는 대사 경로에 속하는 대사산물은 치료 전 및 치료 동안 결정될 수 있다. 치료의 효과는 건강한 개체로부터의 상응하는 데이터 대비, 치료 동안 발현 수준/대사산물 수준의 관찰된 변화를 비교하는 것에 의해 결정된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 마커는 임상 시험의 검정력(power) 및 효과를 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 위험 변이의 보인자인 개체는 특정한 치료 방식에 반응할 가능성이 더 높을 수 있다. 일 구체에에서, 특정한 치료(예를 들면, 소형 분자 약물, 예를 들면, 전술된 소형 분자 약물, 예를 들면, 작용제 표 I 및 작용제 표 II에 열거된 약물)가 표적화하는 경로 및/또는 대사 네트워크 내의 유전자에 대한 위험 변이를 갖는 개체는 상기 치료에 대해 반응을 보일 가능성이 더 높다. 또 다른 구체예에서, 그 발현 및/또는 기능이 위험 변이에 의해 변화되는 것인 유전자에 대한 위험 변이를 갖는 개체는 상기 유전자, 그의 발현 또는 그의 유전자 산물을 표적화하는 치료 방식에 반응할 가능성이 더 높다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 마커 및 일배체형은 특정한 개인을 위한 약제학적 작용제의 선택을 표적화하기 위해 이용될 수 있다. 치료 방식의 맞춤화된 선택(personalized seleciton), 생활방식 변화(예를 들면, 식단의 변화, 운동, 체중 감량 프로그램, 금연, 스트레스를 저하시킨 생활방식 등) 또는 상기 두가지의 조합이 본 발명의 위험 변이의 이용에 의해 실현될 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정한 마커에 대한 개체의 상태의 지식은 본 발명의 위험 변이에 의해 영향받은 유전자 또는 유전자 산물을 표적화하는 치료 옵션의 선택을 위해 유용할 수 있다. 변이의 특정한 조합이 하나의 치료 옵션의 선택을 위해 적합할 수 있고, 다른 유전자 변이 조합은 다른 치료 옵션을 표적화할 수 있다. 그와 같은 변이의 조합은 임상적으로 신뢰성있는 정확도로 치료 모듈의 선택을 결정하기 위해 필요한 경우, 하나의 변이, 두개의 변이, 세개의 변이, 또는 네개 또는 그 이상의 변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 변이의 진단적 및 치료적 용도 외에, 상기 변이(마커 및 일배체형)는 또한 인간 식별을 위한 유용한 마커일 수 있고, 따라서, 법의학, 친자 감별(paternity testing) 및 생체인식(biometrics)에서 유용할 수 있다. 법의학 목적을 위한 SNP의 특정한 용도가 Gill에 의해 검토된다(Int. J. Legal Med. 114:204-10 (2001)). 개체들 간의 게놈 DNA에서의 유전적 변이가 개체를 식별하고, 생물학적 시료와 개체를 연관시키기 위해 유전적 마커로 이용될 수 있다. SNP 및 마이크로새틀라이트를 포함한 유전적 마커들은 개체들을 구별하기 위해 유용할 수 있다. 보다 많은 마커가 분석될수록, (마커들은 관련없는 것으로, 즉, 마커들이 완전한 연관 균형이라는 가정 하에) 주어진 개체에서 마커들의 대립형질 조합이 관련없는 개체에서와 동일할 확률이 더 낮아진다. 따라서, 이러한 목적을 위해 이용되는 변이들은 바람직하게는 관련되지 않으며, 즉, 그들은 독립적으로 유전된다. 따라서, 바람직한 마커들은 본 발명의 마커들과 같은 이용가능한 마커들로부터 선택될 수 있으며, 선택된 마커들은 상이한 염색체 상의 마커들을 포함한, 인간 게놈의 상이한 영역으로부터의 마커들을 포함할 수 있다.
일부 응용에서, 법의학 검사를 위해 유용한 SNP들은 축퇴성(degenerate) 코돈 위치로부터 유래될 수 있다(즉, 특정 코돈의 제3 위치여서 SNP의 변이가 상기 코돈에 의해 코딩된 아미노산에 영향을 미치지 않음). 인종, 선조, 또는 신체적 특징을 포함한 표현형 특징을 예측하기 위한 것과 같은 응용에서, 코딩된 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치는 SNP를 이용하는 것이 보다 유용하고 바람직할 수 있다. 다른 그와 같은 구체예에서, 변이(SNP 또는 다른 다형성 마커)는 인접한(nearby) 유전자의 발현 수준에 영향을 미쳐서, 변화된 단백질 발현을 초래한다.
컴퓨터-구현 응용(Computer-implemented application)
본 발명은 또한 본 명세서에서 심혈관 질환과 연관된 것으로 기재된 다형성 마커 및 일배체형의 컴퓨터-구현 응용(computer-implemented applicatoin)에 관한 것이다. 그와 같은 응용은 본 발명의 방법에서 유용한 유전형 데이터를 저장, 처리(manipulate)하거나 또는 분석하기 위해 유용할 수 있다. 하나의 예는 개인으로부터 유래된 유전형 정보를 판독가능한 매체(readable media) 상에 저장하여, 제3자(예를 들면, 개인)에게 유전형 정보를 제공할 수 있거나, 또는 유전형 데이터로부터 정보를 수득하기 위해, 예를 들면, 상기 유전형 데이터를 심혈관 질환에 대한 증가된 감수성에 기여하는 유전적 위험 인자에 대한 정보에 비교하고, 그와 같은 비교에 근거한 결과를 보고하는 것에 관한 것이다.
하나의 그와 같은 양태는 컴퓨터-판독가능한 매체(computer-readable media)에 관한 것이다. 일반적으로, 그와 같은 매체는 (i) 하나 이상의 다형성 마커 또는 일배체형에 대한 식별자(identifier) 정보; (ii) 심혈관 질환(예를 들면, MI; CAD, IA, AAA, 뇌졸중, 재협착, PAD)을 갖는 개체에서, 상기 하나 이상의 마커의 하나 이상의 대립형질의 빈도, 또는 일배체형의 빈도의 지표(indicator); 및 기준 집단(reference population)에서 상기 하나 이상의 마커의 하나 이상의 대립형질의 빈도, 또는 일배체형의 빈도의 지표를 저장하는 능력을 갖는다. 기준 집단은 질병-불포함(disease-free) 개인의 집단일 수 있다. 대안적으로, 기준 집단은 일반적인 집단으로부터의 랜덤 표본이고, 따라서, 전반적으로 상기 집단을 대표한다. 빈도 지표는 계산된 빈도, 대립형질 및/또는 일배체형 카피의 계수(count), 또는 특정한 매체를 위해 적합한 실제 빈도의 정규화된(normalized) 또는 달리 처리된(manipulated) 값일 수 있다.
선조 정보(ancestry informaton), 성별, 신체적 특성 또는 특징(신장 및 체중 포함)에 대한 정보, 생화학적 측정값(예를 들면, 혈압, 혈중 지질 수준, 콜레스테롤 수준과 같은 지질 수준), 또는 특정한 개인의 유전형 상태에 관하여 저장 또는 처리되는 것이 바람직한 다른 유용한 정보와 같은, 개인에 대한 추가적인 정보가 상기 매체에 저장될 수 있다.
본 발명은 또한 개인에서 심혈관 질환에 대한 감수성을 결정하기 위해 유용한 유전적 데이터의 결정 또는 처리를 위해 적합한 장치에 관한 것이다. 그와 같은 장치는 컴퓨터-판독가능한 메모리, 컴퓨터-판독가능한 메모리 상에 저장된 데이터를 처리하기 위한 루틴(routine), 및 유전적 데이터의 척도를 포함한 결과물(output)을 생성하기 위한 루틴을 포함할 수 있다. 그와 같은 척도는 대립형질 빈도 또는 일배체형 빈도, 유전형 계수(genotype count), 성별, 연령, 표현형 정보, 오즈비(OR) 값 또는 상대적 위험도(RR), 집단 귀속 위험도(PAR), 또는 본래의 유전형 데이터의 직접적인 통계값이거나 또는 유전적 데이터에 근거한 계산에 기반한 다른 유용한 정보를 포함할 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 심혈관 질환의 증가된 감수성(예를 들면, 증가된 위험도)과 연관된 것으로 확인된 마커들 및 일배체형들은 유전형 데이터의 해석 및/또는 분석을 위해 유용하다. 따라서, 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 입증된 바와 같은, 심혈관 질환에 대한 위험 대립형질, 또는 본 명세서에서 심혈관 질환과 연관된 것으로 입증된 마커들과 LD인 다형성 마커의 대립형질의 확인은 해당 유전형 데이터가 기원한 개체가 심혈관 질환의 증가된 위험을 갖는다는 것을 나타낸다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 유전형 데이터는 본 명세서에서 심혈관 질환과 연관된 것으로 확인된 하나 이상의 다형성 마커, 또는 이들과 연관 불균형인 마커에 대해 생성된다. 유전형 데이터는 뒤이어 심혈관 질환에 대한 위험 척도의 형태(예를 들면, 절대 위험도(AR), 위험도 비(risk ratio, RR), 또는 오즈비(odds ratio, OR))인 유전형 데이터의 해석과 함께, 해당 데이터가 기원한 개체에게 예를 들면, 인터넷을 통해 접근가능한 사용자 인터페이스를 통해 이용가능하다. 또 다른 구체예에서, 개체로부터 유래된 유전형 데이터세트에서 확인된 위험 마커가 평가되고 상기 데이터세트에서 그와 같은 위험 변이의 존재에 의해 부여된 위험도의 평가로부터의 결과가, 예를 들면, 안전한 웹 인터페이스를 통해, 또는 다른 통신 수단에 의해 상기 개체에게 이용가능하다. 그와 같은 위험도 평가의 결과가 수치 형태(예를 들면, 절대 위험도, 상대적 위험도 및/또는 오즈비와 같은 위험도 값, 또는 기준 대비 위험도의 백분율 증가), 그래프 수단에 의해, 또는 해당 유전형 데이터가 유래된 개체에 대한 위험도를 보여주기에 적합한 다른 수단에 의해 보고될 수 있다. 특정한 구체예에서, 위험도 평가의 결과가 제3자, 예를 들면, 의사, 기타 의료인 또는 유전 상담가에게 이용가능하다.
본 발명의 다양한 양태에서 유용한 마커
전술된 응용들은 모두 본 명세서에 심혈관 질환에 대한 감수성을 평가하는 방법과 관련하여 보다 상세하게 기재된 본 발명의 마커 및 일배체형으로 실시될 수 있다. 따라서, 이 응용들은 전반적으로 표 1 내지 35에 열거된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들을 이용하여 실시될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 마커는 표 3, 10, 또는 21에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된다. 일 구체예에서, 상기 마커들 또는 일배체형은 서열번호 94로 표시된 서열을 갖는 게놈 세그먼트 내에 존재한다. 또 다른 구체예에서, 상기 마커 및 일배체형은 rs7041637, rs2811712, rs3218018, rs3217992, rs2069426, rs2069422, rs1333034, rs1011970, rs10116277, rs1333040, rs2383207, rs1333050, D9S1814, rs10757278, rs10757274, rs10333049, D9S1870, 선택적으로 이들과 연관 불균형인 마커를 포함하는 마커들로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함한다. 하나의 특정한 구체예에서, 연관 불균형은 0.2보다 큰 r2의 수치값에 의해 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 마커 또는 일배체형은 rs7041637 대립형질 A, rs2811712 대립형질 A, rs3218018 대립형질 A, rs3217992 대립형질 A, rs2069426 대립형질 C, rs2069422 대립형질 A, rs1333034 대립형질 A, rs1011970 대립형질 G, rs10116277 대립형질 T, rs1333040 대립형질 T, rs2383207 대립형질 G, rs1333050 대립형질 T, D9S1814 대립형질 0, rs10757278 대립형질 G, rs1333049 대립형질 C, rs10757274 대립형질 G, 및/또는 D9S1870 대립형질 X (2보다 작은 모든 대립형질의 복합(composite) 대립형질)로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함하고, 상기 표시된 대립형질은 심혈관 질환의 증가된 감수성을 나타낸다.
핵산 및 폴리펩티드
본 명세서에 기재된 핵산 및 폴리펩티드는 본 발명의 방법 및 키트에서 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, "분리된(isolated)" 핵산 분자는 (게놈 서열에서와 같이) 정상적으로 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 둘러싸는(flank) 핵산으로부터 분리되고 및/또는 (예를 들면, RNA 라이브러리에서와 같이) 다른 전사된 서열들로부터 완전하게 또는 부분적으로 정제된 핵산이다. 예를 들면, 본 발명의 분리된 핵산은 핵산이 원래 존재하는 복잡한 세포 매질(cellular milieu), 또는 재조합 기법에 의해 생성되는 경우 배양 배지, 또는 화학적으로 합성되는 경우, 화학적 전구체 또는 다른 화학물질들에 대해 실질적으로 분리될 수 있다. 일부 경우에, 분리된 물질은 조성(예를 들면, 다른 물질을 포함하는 조 추출물), 완충 시스템 또는 시약 혼합물(reagent mix)의 부분을 형성할 것이다. 다른 상황들에서, 상기 물질은 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 또는 컬럼 크로마토그래피(예를 들면, HPLC)에 의해 결정되는 바와 같이, 필수적인 균질성(essential homogeneity)까지 정제될 수 있다. 본 발명의 분리된 핵산 분자는 존재하는 모든 거대분자 종의 약 50% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상(몰 기준)을 구성할 수 있다. 게놈 DNA에 대해, 용어 "분리된(isolated)"은 또한 본래 게놈 DNA가 결합되어 있는 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 예를 들면, 분리된 핵산 분자는 핵산 분자가 유래된 세포의 게놈 DNA에서 상기 핵산 분자를 플랭킹(flank)하는 뉴클레오티드의 약 250 kb, 200 kb, 150 kb, 100 kb, 75 kb, 50 kb, 25 kb, 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 미만을 포함할 수 있다.
핵산 분자는 다른 코딩 서열 또는 조절 서열에 융합될 수 있고, 여전히 분리된 것으로 고려될 수 있다. 따라서, 벡터 내에 포함된 재조합 DNA는 본 명세서에서 사용된 "분리된"의 정의에 포함된다. 또한, 분리된 핵산 분자는 이종(heterologous) 숙주 세포 또는 이종 개체 내의 재조합 DNA 분자, 및 용액 중의 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 DNA 분자를 포함한다. "분리된" 핵산 분자는 또한 본 발명의 DNA 분자의 인 비보 및 인 비트로 RNA 전사체를 포함한다. 분리된 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 서열은 화학적으로 합성되거나 또는 재조합 수단에 의해 생산된 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 그와 같은 분리된 뉴클레오티드 서열이 예를 들면, 코딩된 폴리펩티드의 제조에서, 상동성 서열(예를 들면, 다른 포유동물 종으로부터)의 분리를 위해, 유전자 맵핑을 위해(예를 들면, 염색체와의 인 시투 혼성화에 의해), 또는 예를 들면, 노던 블롯 분석 또는 기타 혼성화 기법과 같은 조직 (예를 들면, 인간 조직) 중의 유전자의 발현을 검출하기 위해, 프로브로서 유용하다.
본 발명은 또한 높은 엄격성(stringency)의 혼성화 조건, 예를 들면, 선택적 혼성화를 위한 조건 하에, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 핵산 분자(예를 들면, 본 명세서에 기재된 일배체형과 연관된 다형성 부위를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화하는 핵산 분자)에 관한 것이다. 일 구체예에서, 본 발명은 높은 엄격성의 혼성화 및 세척 조건(예를 들면, 선택적 혼성화를 위한 조건) 하에, LD 블럭 C09 (서열번호 94)의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편(또는 서열번호 94로 표시된 LD 블럭 C09의 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함하는 뉴클레오티드 서열)을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화되고, 상기 뉴클레오티드 서열은 본 명세서에 기재된, 하나 이상의 다형성 마커 또는 하나 이상의 일배체형의 하나 이상의 위험 대립형질을 포함하는 것인 변이를 포함한다.
두 개의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성(percent identity)은 최적의 비교 목적을 위해 서열들을 정렬시키는 것에 의해(예를 들면, 제1 서열의 서열에 갭이 도입될 수 있음) 결정될 수 있다. 상응하는 위치의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 비교되고, 두 서열 간의 퍼센트 동일성은 상기 서열들 간에 공유된 동일한 위치의 갯수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 갯수(#)/위치의 총 갯수(#) x 100). 특정한 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이다. 두 서열의 실제적인 비교는 잘 알려진 방법, 예를 들면, 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 그와 같은 수학적 알고리즘의 비-한정적인 예가 Karlin, S. and Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)에 기재된다. 그와 같은 알고리즘이 Altschul, S. et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)에 기재된 바와 같이, NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 구현된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 개별적인 프로그램(예를 들면, NBLAST)의 디폴트 파라미터가 이용될 수 있다. ncbi.nlm.nih.gov에서 월드 와이드 웹의 웹사이트를 참조한다. 일 구체예에서, 서열 비교를 위한 파라미터는 score=100, wordlength=12로 설정되거나, 또는 변할 수 있다(예를 들면, W=5 또는 W=20). 다른 예들은 Myers and Miller, CABIOS (1989)의 알고리즘, Torellis, A. and Robotti, C., Comput. Appl. Biosci. 10:3-5 (1994)에 기재된 ADVANCE and ADAM; 및 Pearson, W. and Lipman, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-48 (1988)에 기재된 FASTA를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 두 개의 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지(Accelrys, Cambridge, UK) 중의 GAP 프로그램을 이용하여 달성될 수 있다.
본 발명은 또한 높은 엄격성 조건 하에 LD 블럭 C09 (서열번호 94)의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 구성되거나, 또는 LD 블럭 C09 (서열번호 94)의 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함하거나, 이로 구성된 뉴클레오티드 서열의 핵산에 혼성화되는 단편 또는 부분을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열은 본 명세서에 기재된 마커 및 일배체형에 포함된 하나 이상의 다형성 대립형질을 포함하는 것인 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 단편은 약 15개 이상, 약 18개 이상, 20개, 23개 또는 25개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이이고, 30개, 40개, 50개, 100개, 200개, 500개, 1000개, 10,000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이일 수 있다.
본 발명의 핵산 단편은 본 명세서에 기재된 바와 같은 분석법에서 프로브 또는 프라이머로서 이용된다. "프로브(probe)" 또는 "프라이머(primer)"는 핵산 분자의 상보적 가닥에 염기-특이적 방식으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드이다. DNA 및 RNA 외에, 그와 같은 프로브 및 프라이머는 Nielsen, P. et al., Science 254:1497-1500 (1991)에 기재된 바와 같은 PNA(polypeptide nucleic acid)를 포함한다. 프로브 또는 프라이머는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 다형성 마커 또는 하나 이상의 일배체형의 하나 이상의 대립형질을 포함하고, LD 블럭 C09로부터의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 약 15개 이상, 통상적으로 약 20개 내지 25개, 및 특정한 구체예에서, 약 40개, 50개, 또는 75개의 연속적인 뉴클레오티드에 혼성화하는 뉴크레오티드 서열의 영역을 포함한다. 특정한 구체예에서, 프로브 또는 프라이머는 100개 또는 그 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 예를 들면, 특정한 구체예에서, 6개 내지 50개의 뉴클레오티드, 또는 예를 들면, 12개 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 프로브 또는 프라이머는 연속적인 뉴클레오티드 서열 또는 상기 연속적인 뉴클레오티드 서열의 상보체에 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상 동일하다. 또 다른 구체예에서, 프로브 또는 프라이머는 연속적인 뉴클레오티드 서열 또는 상기 연속적인 뉴클레오티드 서열의 상보체에 선택적으로 혼성화될 수 있다. 종종, 프로브 또는 프라이머는 표지, 예를 들면, 방사성동위원소, 형광 표지, 효소 표지, 효소 보조-인자 표지, 자성 표지(magnetic label), 스핀 표지, 에피토프 표지를 더 포함한다.
전술된 핵산 분자와 같은, 본 발명의 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기법 및 LD 블럭 C09(서열번호 94)의 뉴클레오티드 서열에 의해 제공된 서열 정보를 이용하여 확인되고 분리될 수 있다. 전반적으로, 참조에 의해 각각의 전체 교시가 본 명세서에 포함된, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H.A. Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, CA, 1990); Mattila, P. et al., Nucleic Acids Res., 19:4967-4973 (1991); Eckert, K. and Kunkel, T., PCR Methods and Applications, 1:17-24 (1991); PCR (eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford); 및 미국특허 제4,683,202호를 참조한다.
일반적으로, 본 발명의 분리된 핵산 서열은 서던 겔(Southern gel)에서 분자량 마커로서, 및 관련된 유전자 위치에 맵핑하기 위해 표지화된 염색체 마커로 이용될 수 있다. 상기 핵산 서열은 또한 심혈관 질환에 대한 감수성을 확인하기 위해, 환자의 내재적 DNA 서열과 비교하기 위해 이용될 수 있고, 관련된 DNA 서열을 혼성화하고 발견하기 위해, 또는 시료로부터 공지된 서열을 제거하기 위해(예를 들면, 공통 유전자 제거 혼성화법(subtractive hybridization)) 프로브로서 이용될 수 있다. 핵산 서열은 유전자 지문법(genetic fingerprinting)을 위한 프라이머를 수득하기 위해, 면역화 기법을 이용하여 항-폴리펩티드 항체를 생성하기 위해, 및/또는 항-DNA 항체를 생성시키기거나 또는 면역 반응을 유발하기 위해 항원으로서 이용될 수 있다.
본 명세서에 기재된, 두 개의 폴리펩티드(또는 상기 폴리펩티드의 영역)는 아미노산 서열의 상동성이 약 45-55% 이상인 경우, 실질적으로 상동성이거나 또는 동일하다. 다른 구체예에서, 두 개의 폴리펩티드(또는 상기 폴리펩티드의 영역)는 그들이 약 70-75% 이상, 약 80-85% 이상, 약 90 % 이상 또는 약 95% 이상 상동성이거나 또는 동일한 경우, 실질적으로 상동성이거나 또는 동일하다. 본 발명에 따른, 실질적으로 상동성인 아미노산 서열은 LD 블럭 C09의 뉴클레오티드 서열(서열번호 94) 또는 그의 일부를 포함하고, 표 3, 10, 또는 21에 표시된 하나 이상의 다형성을 더 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩되고, 본 명세서에서 보다 구체적으로 기재된 엄격한(stringent) 조건 하에 상기 코딩된 핵산은 LD 블럭 C09(서열번호 94)의 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 것이다. 일 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 CDKN2A 및/또는 CDKN2B의 아미노산 서열 전체 또는 그 일부를 포함한다.
항체
유전자 산물의 하나의 형태에 특이적으로 결합하나, 상기 유전자 산물의 다른 형태에는 결합하지 않는 다중클론 항체 및/또는 단일클론 항체가 또한 제공된다. 다형성 부위 또는 부위들을 포함하는 변이 또는 기준 유전자 산물의 일부에 결합하는 항체도 제공된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "항체(antibody)"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉, 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 분자를 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분자는 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하나, 자연적으로 상기 폴리펩티드를 포함하는 시료, 예를 들면, 생물학적 시료 중의 다른 분자에는 실질적으로 결합하지 않는 분자이다. 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 예는 펩신과 같은 효소에 의해 항체를 처리하는 것에 의해 생성될 수 있는 F(ab) and F(ab')2 단편을 포함한다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 제공한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "단일클론 항체(monoclonal antibody)" 또는 "단일클론 항체 조성물(monoclonal antibody composition)"은 본 발명의 폴리펩티드의 특정한 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위의 단 하나의 종만을 포함하는 항체 분자의 집단을 의미한다. 따라서, 단일클론 항체 조성물은 일반적으로 그와 면역반응하는 본 발명의 특정한 폴리펩티드에 대한 단일 결합 친화도를 보인다.
다중클론 항체는 적합한 개체를 원하는 면역원(immunogen), 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편으로 면역화시키는 것에 의해 전술된 바와 같이 제조될 수 있다. 면역화된 개체에서 항체 역가(antibody titer)는 시간의 경과에 대해, 표준 기법, 예를 들면, 고정화된 폴리펩티드를 이용한, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)에 의해 모니터링될 수 있다. 필요한 경우, 폴리펩티드에 대한 항체 분자가 포유동물(예를 들면, 혈액)로부터 분리되고, IgG 분획을 수득하기 위힌 단백질 A 크로마토그래피와 같은, 잘 알려진 기법에 의해 더 정제될 수 있다. 면역화 후 적절한 시점에, 예를 들면, 항체 역가가 최고인 시점에, 항체-생성 세포들이 개체로부터 수득되고, Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)에 의해 최초로 개시된 하이브리도마 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72 (1983)), EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,1985, Inc., pp. 77-96) 또는 트리오마(trioma) 기법과 같은 표준 기법에 의해 단일클론 항체를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 하이브리도마를 생성하는 기술이 잘 알려져 있다(일반적으로, Current Protocols in Immunology (1994) Collgan et al., (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY 참조). 요약하면, 불멸 세포주(immortal cell line)(일반적으로, 골수종(myeloma))가 전술된 바와 같이 면역원에 의해 면역화된 포유동물로부터의 림프구(일반적으로, 비장림프구(splenocyte))에 융합되고, 결과물인 하이브리도마 세포의 배양 상층액이 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마를 확인하기 위해 스크리닝된다.
림프구와 불멸화된 세포주를 융합시키기 위해 이용되는 다수의 잘 알려진 프로토콜이 본 발명의 폴리펩티드에 대한 단일클론 항체를 생성할 목적으로 적용될 수 있다(예를 들면, Current Protocols in Immunology, supra; Galfre et al., Nature 266:55052 (1977); R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); 및 Lerner, Yale J. Biol. Med. 54:387-402 (1981) 참조). 또한, 통상적인 당업자는 역시 유용할, 그와 같은 방법의 다양한 변형이 존재한다는 것을 이해할 것이다.
단일클론 항체-분비 하이브리도마 제조의 대안으로, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 단일클론 항체가 상기 폴리펩티드로 재조합 조합적 면역글로불린 라이브러리(recombinant combinatorial immunoglobulin library)(예를 들면, 항체 파아지 표시(phage display) 라이브러리)를 스크리닝하고, 그에 의해 상기 폴리펩티드에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성물을 분리하는 것에 의해 식별되고 분리될 수 있다. 파아지 표시 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 키트가 상업적으로 이용가능하다(예를 들면, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 및 Stratagene Surf ZAP™ Phage Display Kit, Catalog No. 240612). 추가적으로, 항체 표시 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위해 이용할 수 있는 특히 유용한 방법 및 시약의 예를, 예를 들면, 미국특허 제5,223,409호; PCT 공개 WO 92/18619; PCT 공개 WO 91/17271; PCT 공개 WO 92/20791; PCT 공개 WO 92/15679; PCT 공개 WO 93/01288; PCT 공개 WO 92/01047; PCT 공개 WO 92/09690; PCT 공개 WO 90/02809; Fuchs et al., Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); 및 Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)에서 찾을 수 있다.
추가적으로, 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 제조될 수 있는, 인간 부분 및 비-인간(non-human) 부분을 모두 포함하는, 키메라 단일클론 항체 및 인간화(humanized) 단일클론 항체와 같은 재조합 항체가 본 발명의 범위에 속한다. 그와 같은 키메라 항체 및 인간화 단일클론 항체는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 재조합 DNA 기법에 의해 생산될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 항체(예를 들면, 단일크론 항체)는 친화도 크로마토그래피 또는 면역침전과 같은 표준 기법에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 분리하기 위해 이용될 수 있다. 폴리펩티드-특이적 항체는 세포로부터 천연 폴리펩티드 및 숙주 세포에서 발현된 재조합기법에 의해 생산된 폴리펩티드의 정제를 촉진할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체는 폴리펩티드의 양(abundance) 및 발현 패턴을 평가하기 위해 (예를 들면, 세포 용해액, 세포 상층액, 또는 조직 시료에서) 폴리펩티드를 검출하기 위해 이용될 수 있다. 항체는 임상 테스트 절차의 일부로서, 예를 들면, 주어진 치료 계획(treatment regime)의 효능을 결정하기 위해, 조직에서 단백질 수준을 진단 목적으로 모니터링하기 위해 이용될 수 있다. 그의 검출을 촉진하기 위해 항체는 검출가능한 물질에 결합될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보조 그룹(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 및 방사성활성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하고; 적합한 보조 그룹 복합체(prothetic group complex)의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하며; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드(dansyl chloride) 또는 피코에리트린(phycoerythrin)을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하며; 생물발광 물질의 예는 루시페라아제, 루시페린, 및 에쿼린(aequorin)을 포함하고, 및 적합한 방사성활성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
항체는 또한 약물유전학 분석에서 유용할 수 있다. 그와 같은 구체에에서, 본 명세서에 따른 핵산에 의해 코딩되는 변이 단백질에 대한 항체, 예를 들면, 하나 이상의 본 발명의 다형성 마커를 포함하는 핵산에 의해 코딩된 변이 단백질에 대한 항체가 변형된 치료 방식을 필요로 하는 개체를 식별하기 위해 이용될 수 있다.
항체는 또한 심혈관 질환의 활성 단계(active stage)와 같은 질병 상태에서, 또는 단백질의 기능과 관련된 질병, 특히, 심혈관 질환에 대한 소인을 갖는 개인에서 변이 단백질의 발현을 평가하기 위해 유용할 수 있다. 본 명세서에서 더 설명되는 바와 같이, 바이오마커(예를 들면, 심장 마커)에 의해 예가 제공된다. 본 명세서에 기재된 하나 이상의 다형성 마커 또는 일배체형을 포함하는 핵산에 의해 코딩된 본 발명의 변이 단백질(예를 들면, CDKN2A 및/또는 CDKN2B)에 특이적인 항체가 상기 변이 단백질의 존재를 스크리닝하기 위해, 예를 들면, 상기 변이 단백질의 존재에 의해 표시된 바와 같이, 심혈관 질환에 대한 소인을 스크리닝하기 위해 이용될 수 있다.
항체는 다른 방법들에서 이용될 수 있다. 따라서, 항체는 전기영동 이동성(electrophoretic mobility), 등전점, 트립신 또는 기타 단백질분해효소에 의한 처리와 함께 본 발명의 변이 단백질과 같은 단백질을 평가하기 위한 진단 도구로서, 또는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 다른 물리적 분석법(physical assay)에서 이용하기에 유용하다. 항체는 또한 조직형 검사(tissue typing)에서 이용될 수 있다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 특정한 변이 단백질이 특정한 조직형에서의 발현과 상관되며, 상기 변이 단백질에 대한 특이적 항체가 상기 특이적 조직형을 식별하기 위해 이용될 수 있다.
변이 단백질을 포함한, 단백질의 세포내 국재화(subcellular localization) 가 또한 항체를 이용하여 결정될 수 있고, 다양한 조직의 세포에서 단백질의 비정상적인 세포내 국재화를 평가하기 위해 적용될 수 있다. 그와 같은 용도는 유전적 테스트에 적용될 수 있으나, 또한, 특정한 치료 방식을 모니터링하기 위해 적용될 수 있다. 치료가 변이 단백질의 발현 수준 또는 존재, 또는 변이 단백질의 비정상적인 조직 분포 또는 발생에 따른 발현(developmental expression)을 정정하는 것을 목적으로 하는 경우, 상기 변이 단백질 또는 그의 단편에 대해 특이적인 항체가 치료 효능을 모니터링하기 위해 이용될 수 있다.
항체는 또한, 예를 들면, 변이 단백질이 결합 분자 또는 파트너에 결합하는 것을 차단하는 것에 의해 변이 단백질(예를 들면, CDKN2A 및/또는 CDKN2B) 기능의 저해를 위해 유용하다. 그와 같은 용도는 또한 치료가 변이 단백질의 기능을 저해하는 것을 포함하는 치료적 상황에 적용될 수 있다. 항체는 예를 들면, 결합을 차단하거나 또는 경쟁적으로 저해하여, 그에 의해, 단백질의 활성을 조절(즉, 촉진 또는 길항)하기 위해 이용될 수 있다. 특정한 기능을 위해 요구되는 부위를 포함하는 특정한 단백질 단편에 대한 항체, 또는 세포 또는 세포막과 결합된 완전한 단백질에 대한 항체가 제조될 수 있다. 인 비보 투여를 위해, 항체는 방사성 핵종(radionuclide), 효소, 면역원성 에피토프, 또는 세균성 독소를 포함한 세포독성제(디프테리아 또는 리신(ricin)과 같은 식물 독소)와 같은 추가적인 치료적 유효탑재물(therapeutic payload)과 결합될 수 있다. 항체 또는 그의 단편의 인 비보 반감기는 폴리에틸렌 글리콜로의 접합을 통한 페길화(pegylation)에 의해 증가될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 방법에서 항체를 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 이는 테스트 시료에서 변이 단백질의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 바람직한 구체예는 표지된 또는 표지가능한 항체 및 생물학적 시료에서 변이 단백질을 검출하기 위한 화합물 또는 작용제, 상기 시료 중의 변이 단백질의 양 또는 존재 및/또는 부재를 결정하기 위한 수단, 및 상기 시료 중의 변이 단백질의 양과 표준을 비교하기 위한 수단, 및 키트의 사용 설명서를 포함한다.
이하, 본 발명은 하기의 비-한정적인 실시예에 의해 예시될 것이다.
본 발명의 전술된 것들 및 기타 목적, 특징 및 장점이 하기에 기재된 본 발명의 바람직한 구체예의 보다 구체적인 설명으로부터 명확할 것이다.
도 1은 a)염색체 9 상의 1 Mb 구간(21.6-22.6 Mb, Build 34)에 위치한 127개의 SNP에 대한 연관 결과를 보여준다. P는 상기 SNP의 염색체 위치에 대한 개체의 관련성(relatedness)에 대해 조정된 P-값인 log P값을 보여준다. b) CEU 집단에 대한 HapMap release 19로부터 동일한 영역에 있는 1004개의 공통된 SNP 간의 일대일(pair-wise) 상관관계 r 2. c) 가장 강력한 연관결과를 포함하는 LD-블럭(NCBI Build 36; 서열번호 94 내의 위치 21,920,147 내지 21,149,982)을 정의하는 HapMap 데이터세트 (Nature 437, 1299-1320 (27 October 2005))에 근거한 두 개의 재조합 핫-스팟(hot-spot)의 위치. d) 패널 b에서 이용된 것과 동일한 세트의 SNP에 대해 D'에 의해 측정된 상기 영역 내의 일대일 상관관계 구조. 4개의 패널은 모두 패널 a에 표시된 것과 동일한 수평 Mb 스케일을 이용했다.
하기는 SNP 마커 및 마이크로새틀라이트의 단일-점 분석(single point analysis)을 통해 관상동맥 질환과 스텐트내 재협과 연관된 것으로 확인된 감수성 인자의 확인에 대한 설명을 포함한다.
방법
본 연구는 아이슬란드 데이터 보호국(the Data Protection Commission of Iceland) 및 국가 생명윤리 위원회(the National Bioethics Committee)에 의해 허가되었다.
아이슬란드 관상동맥 질환과 스텐트내 재협착 코호트
LD 블럭 C09 내의 마커들과 관상동맥 질환 간의 연관이 최초로 상기 마커들과 관상동맥 질환(심혈관 질환의 서브표현형)의 가장 우려되는 합병증인 심근 경색증 간의 연관으로 발견되었다.
최근 8년 동안, MI를 앓은 개인들은 deCODE에서 심혈관 질환(CVD) 유전학 프로그램을 통해 모집하였다. 현재, 혈액 시료를 2525명의 MI 환자들로부터 수집하였다. MI를 앓은 개체들이 a) 아이슬란드에서 1981년부터 2002년까지 75세 이전에 MI를 발병하고 MONICA 기준(J. Clin Epidemiol 41, 105-14 (1988))을 충족시키며; b) 최근 30년 동안 아이슬란드 심장 협회(IHA)에 의해 수행된 대규모 전향적 역학 연구(prospective epidemiology study)에 참여하고 1981년 전에 MI를 발병했으며; c) 2003년과 2004년에 레이캬비크에 있는 주요 병원으로부터 MI 퇴원 진단을 받은 10,000 명 이상의 등록부(registry)로부터 확인되었다. 상기 등록부의 모든 개체들 의 MI 진단은 징후(sign), 증상, 심전도, 심장 효소 및 부검 관찰에 근거한 엄격한 진단 규칙을 따랐다(2). deCOED의 CVD 유전학 프로그램에서 협력 의사들을 통해 환자들을 접촉했다. 상기 연구의 대부분의 참여자들은 IHA를 방문하고 혈액 채취에 참여했고, 레이캬비크 지역 외부에 살았던 참여자들은 그들의 지역 보건 센터를 방문했다.
관상동맥 질환을 가지나, 심근 경색증의 확인된 이력이 없는 추가적인 개인들을 1993년부터 2003년까지 레이캬비크에 있는 주요 병원에서 관상동맥 스텐트 시술을 받은 개체들의 목록으로부터 식별하였다.
다양한 정도의 재협착(0-100% 스텐트내 재협착)을 갖는 개체들을 포함한, 상기 목록 상의 700 명 이상의 개체에 대해, 스텐트내 재협착에 대한 정보가 이용가능하다. 재협착을 갖는 확인된 발단자(proband)는 개입 심장/방사선학자(cardio/radiologist)에 의해 판독된 관상동맥 혈관성형술에 의해 결정된 바와 같이, 50% 이상의 스텐트내 협착을 갖는 개체이다.
본 연구에서 이용된 대조군은 deCODE에서 다양한 유전학 프로그램의 일부로 모집되었다. 대조군의 의학적 이력은 대조군 개체가 또한 CVD 유전학 프로그램(즉, MI, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 타입 II 당뇨병, 비만증, 가족성 복합 고지혈증(familial combined hyperlipidemia), 관상동맥 재협착, 및 고혈압 유전학 프로 그램) 중 하나에 참여하지 않은 경우, 알려져 있지 않았다.
미국으로부터의 개체
필라델피아 코호트
필라델피아의 연구 참여자들은 심장 도관술(cardiac cathterization)을 받은 개체에서 관상동맥 질환(CAD)에 대한 생화학적 및 유전적 인자의 연관을 연구하는 PENN CATH 연구 프로그램을 통해 펜실베니아 대학교 의료 센터(the University of Pennsylvania Medical Center)에 등록되었다. 총 3850명이 참여하였다. 본 연구의 목적을 위해, 본 발명자들은 하기 중 하나의 관상동맥 질환으로 진단된 개체들을 PENN CATH 연구로부터 선별하였다: 심장 효소의 상승 및 심전도 변화의 측면에서 급성 MI에 대한 기준에 근거한 MI, 또는, 자가 보고된 MI 이력(history), 관상동맥 우회 성형술(CABG) 또는 경피 경관 관상동맥 혈관성형술(PTCA)의 이력. 대조군으로 이용하기 위해, 본 발명자들은 관상동맥 성형술 후 심각한 관강내 협착(luminal stenosis)이 없는 개체들을 선별하였다(50% 미만의 관강내 협착). 민족 기원(ethnicity) 정보는 자가-보고되었다.
펜실베니아 대학교 기관 관리 위원회(The University of Pennsylvania Institutional Review Board)가 본 연구를 승인했으며, 모든 개체들은 고지된 동의 서를 제공하였다.
클리블랜드 코호트
본 연구의 참여자들은 관상동맥 도관술(coronary catheterization)을 시술받은 개체들에 대한 생물학적 시료와 연관된 데이터의 등록부인 GenBank 프로그램을 통해 클리블랜드 병원 심장 센터(he Cleveland Clinic Heart Center)에 등록되었다. MI의 진단 기준은 하기 중 둘 이상에 근거하였다: 지속성 흉통, 급성 MI와 일치하는 ECG 패턴, 또는 심장 효소의 유의성 있는 상승. 관상동맥 혈관성형술에 의해 평가된 바와 같이, 심각한 관강내 협착을 갖지 않고(50% 미만의 협착), CAD의 과거 이력이 없는, GenBank 등록부의 개체들을 본 연구의 대조군으로 선별하였다.
본 연구는 클리블랜드 임상 재단 기관 관리 위원회(The Cleveland Clinic Foundation Institutional Review Board)에 의해 승인되었으며, 모든 개체들은 고지된 동의서를 제공하였다.
아틀란타 코호트
연구 참여자들은 Emory Genebank 연구 및 신경학 임상 등록부(Cinical Registry in Neurology, CRIN)를 통해 에모리 대학 병원, 에모리 클리닉 및 그래디 메모리얼 병원(the Emory Clinic and Grady Memorial Hospitals)에 등록되었다. Emory Genebank는 심장 도관술을 시술받은 개체들에서 생화학적 및 유전적 인자와 CAD의 연관을 연구하였다. 본 연구를 위해, MI, CABG, 또는 PTCA의 자가-보고된 이 력을 갖는 개체들을 선별하여 환자군으로 이용하였다. 대조군 개체는 CRIN으로부터 모집된 비-혈관 신경계 질환(non-vascular neurological disease)(주로, 파킨슨병 및 알쯔하이머병)을 갖는 개체들, 그들의 배우자, 혈연이 아닌 친구 및 지역사회 자원자의 군으로부터 선별하였다. 이 개체들을 연령, 및 민족 기원을 환자 집단에 조화시켰다. MI 또는 관상동맥 질환의 알려진 이력을 갖는 경우, 대조군에서 제외시켰다. 모든 개체들은 고지된 동의서를 제공하였다. 민족기원에 대한 정보는 자가-보고되었다.
유전형 분석(Genotyping)
단일 칩((Illumina, San Diego, CA, USA)) 상에서 약 317,000개의 단일 염기 다형성(SNP)를 분석하기 위해 Illumina사의 Infinium HumanHap300 SNP 칩을 이용하여 심근 경색증(MI)으로 진단받은 아이슬란드인 1570명과 7088명의 집단 대조군(population control)의 전체-게놈 스캔(genome-wide scan)을 수행하였다. 다른 케이스-대조군(case-control) 코호트에서의 재현(replication)을 위한 SNP 유전형 분석은 Centaurus 플랫폼(Nanogen)을 이용하여 수행하였다.
연관 분석을 위한 통계적 방법
개별적인 마커들의 관상동맥 질환 또는 심근 경색증과 같은 질병 표현형에 대한 연관을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 마커의 각 대립형질의 양측(two-sided) p-값을 계산하기 위해 가능성 비 검정(likelihood ratio test)을 이용하였 다. 본 발명자들은 승법 모델(multiplicative model)을 가정하여, 상대적 위험도(RR) 및 집단 귀속 위험도(PAR)을 계산하였다(C. T. Falk, P. Rubinstein, Ann Hum Genet 51 (Pt 3), 227 (1987); J. D. Terwilliger, J. Ott, Hum Hered 42, 337 (1992)). 상기 영역에서 마커들 간의 연관 불균형을 규명하기 위해, 본 발명자들은 CEPH Caucasian HapMap 데이터를 이용하였다. 본 발명자들은 D'(R. C. Lewontin, Genetics 50, 757 (1964)) 및 상관계수 r2(W. G. Hill, A. Robertson, Genetics 60, 615 (Nov, 1968))의 표준 정의를 이용하여 SNP 쌍들 간의 LD를 계산하였다. 아이슬란드 코호트의 경우, 일부 개체들이 상호 간에 관련된다는 것을 고려하여, 본 발명자들은 아이슬란드 계통(Icelandic genealogy)을 통한 유전형의 시뮬레이션 또는 최초의 전체-게놈 연관 스캔(genome-wide association scan)(인용)에서 연관에 대해 테스트된 총 300,000명에 대한 테스트 통계치의 귀무 통계치(null statistics)를 수득하였다. 유전형 상대적 위험도의 모델-불포함 추정치(model-free estimate)는 하기와 같이 생성하였다: 유전형 G0 대비 유전형 G1의 RR은 n과 m은 각각 환자와 대조군에서의 유전형 카운트를 나타내는 것인 [n(G1)/n(G0)]/ [m(G1)/m(G0)]에 의해 추정하였다. 상이한 코호트로부터의 결과를 코호트들이 대립형질/유전형에 대해 상이한 집단 빈도(population frequency)를 가질 수 있으나, 공통된 상대적 위험도를 갖는 것으로 가정하는 Mantel-Hanezel 모델(인용)을 이용하여 통합하였다.
본 발명자들은 케이스에서 MI의 발병 연령과 같은 정량적 속성과 마커들 간의 연관에 대해 테스트하기 위해 다중 회귀분석(multiple regression)을 이용하였 고, 상기에서 개체가 갖는 위험 변이의 카피의 갯수가 설명 변수(explanatory variable)로 간주되고, 정량적 성향이 반응 변수(response variable)로 간주된다. 연관은 적합한 경우, 회귀 분석에서 상응하는 항(corresponding term)을 설명 변수로 포함시키는 것에 의해 연령과 성별에 대해 조정되었다.
개체와 게놈 대조군(genomic control)의 관련성에 대한 보정(correction)
아이슬란드 환자군 및 대조군에서 일부 개인들은 상호 간에 친족관계를 가져서, 카이-스퀘어 테스트 통계값(chi-square test statistics)이 평균 >1 및 중앙값 >0.675을 갖게 하였다(Devlin, B & Roeder, K., Biometrics 55, 997 (1999)). 본 발명자들은 관련성 및 잠재적인 집단 계층화(potential population stratification)를 조정하기 위해 게놈 대조의 방법(method of genomic control)의 방법인(Devlin, B & Roeder, K., Biometrics 55, 997 (1999)), 305,953 개의 카이-스퀘어 통계값의 평균을 계산하는 것에 의해 게놈-전체 연관에 대한 팽창 인자(inflation factor)를 추정하였다. 상기 팽창 인자는 1.129로 추정되었고 게놈-전체 연관으로부터 제시된 결과는 카이-스퀘어 통계값을 각각 1.129로 나누는 것에 의해 조정하는 것에 근거하였다. 아이슬란드 재현(replication) 코호트 및 통합 아이슬란드 재현 및 발견(discovery) 코호트의 경우, 본 발명자들은 팽창 인자를 추정하기 위해 708,683 명의 아이슬랜드인의 계통을 통해 유전형을 시뮬레이션한, 이전에 개시된 절차를 이용하였다(S9). 상응하는 조정 인자(adjustment factor)는 각 각 1.092 및 1.029였다.
cDNA 라이브러리의 PCR 스크리닝
전혈(90명의 풀), EBV-형질전환 인간 림프아구성 세포(lymphoblastoid cell)(90명의 풀), 인간 심장 근육세포(Sciencell, Cat.no. 6200), 인간 대동맥 평활근 세포(Sciencell, Cat.no. 6110), 인간 심장 섬유모 심실 세포(Sciencell Cat.no. 6310) 및 인간 일차 제대 정맥 내피 세포(human primary umbilical vein endotheial cell, HUVEC)(4명의 풀)로부터 cDNA 라이브러리를 구축하였다. 제조사의 추천에 따라, 총 RNA 분리 절차(Ambion Inc. Cat.no. 1560)를 이용한, RNeasy RNA 분리 키트(Qiagen, Cat.no. 75144), 전혈로부터의 RNeasy RNA 분리 키트(Qiagen, Cat.no. 52304) 또는 mirVana RNA 분리 키트를 이용하여 총 RNA를 분리하였다. High Capacity cDNA Archive Kit with random primers (Applied Biosystems PN 4322171)를 이용하여 deCODE에서 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 상기 라이브러리 외에, 심장 전체(Clontech-639304) 및 대동맥(Clontech-639325)으로부터의 두 개의 상업적인 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다.
PCR 스크리닝은 제조사의 설명서에 따라, Operon Biotechnologies로부터의 PCR 프라이머를 이용하고, Advantage2® Polymerase mix (Clontech cat.no. 639202)를 이용하여 수행하였다. PCR 반응은 3.5μM 최종 농도의 정방향 및 역방향 프라이머, 2mM dNTP, 1x Advantage 2 PCR 완충액, 0.2㎕의 Advantage 효소 및 0.5㎕의 cDNA 라이브러리를 포함하는 10 ㎕ 부피로 수행하였다(표 23 참조). 테스트 된 라이브러리 중 여러 개에서 모든 EST에 대해 발현이 검출되었다(표 24). 77 bp 보다 더 큰 개방 해독 프레임(open reading frame)을 갖는 EST는 없었다. 그들 중 다수는 그 발현이 p14/ARF와 함께 밀집(cocluster)되는 것으로 확인된, 최근에 보고된 안티센스 비-코딩 RNA와 중첩된다(Pasmant, E., et al., Cancer Res 67, 3963 (2007)).
CDKN2A 및 CDKN2B의 서열결정
PCR 증폭 및 서열결정 반응은 Zymark SciClone ALH300 로보틱 워크스테이션(robotic workstation) 상에 준비하고 MJR Tetrad에서 증폭시켰다. 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정확한 길이에 대해 PCR 산물을 확인하고 AMPure (Agencourt Bioscience)를 이용하여 정제하였다. ABI PRISM Fluorescent Dye Terminator 시스템을 이용하여 정제된 산물의 서열을 결정하고, CleanSEQ (Agencourt)를 이용하여 재정제하고, Applied Biosystems 3730 캐필러리 시퀀서(capillary sequencer) 상에서 분리하였다. deCODE Genetics Sequence Miner 소프트웨어를 이용하여, 일차 서열 데이터로부터의 SNP 호출(calling)을 수행하였다. 자동화된 시스템에 의해 확인된 모든 CDKN2A 및 CDKN2B 변이를 일차 신호 트레이스(primary signal trace)의 수동 검사에 의해 확인하였다. 96명의 조기발병 MI 환자로부터의 시료에 대해 표 25에 표시된 프라이머를 이용하여 서열을 결정하였고, 확인된 SNP의 목록이 표 26에 제공된다.
후보 영역에서 후보 조절 변이의 탐색
MI 영역(hg release 17, 염색체 9, 21800000번 내지 22400000번 염기)을 둘러싼 600 kb에 대해 SNP 및 보조된 TF 결합 부위를 추출하기 위해 캘리포니아 대학 산타 크루즈 게놈 브라우저(The University of California Santa Cruz genome browser) (genome.ucsc.edu)를 이용하였다. 두 개의 표를 Python 스크립트와 교차 참조하고 결합 부위에 위치한 SNP를 대상으로 Hapmap(release 22)의 CEU 표본에서 rs1333040와의 LD에 대해 조사하였다. 상기 분석은 인간 게놈의 release 18에 대해 수행되었고, 결과를 hg 17 좌표(coordinate)로 전환시켰다.
MI 영역을 둘러싼 600 kb의 생물정보학적(bioinformatic) 분석은 전사 인자에 대한 보존된 결합 부위와 일치하는 16개의 SNP를 생성했다(표 27). MI 일배체형을 태깅하는 SNP에 대한 LD의 부재는 이 후보 목록으로부터 16개의 SNP 중 절반의 배제를 가능하게 했다. 나머지 다형성은 보존된 TF 결합 부위를 변화시키는 것에 의해 유전자 기능에 영향을 미칠 수 있다. 이와 병행하여, 본 발명자들은 보존된 블럭(UCSC 게놈 브라우저를 통해 이용가능한 Multiz 정렬에 근거함, release hg18)에 위치한 SNP들과 MI 일배체형 태깅 SNP 간의 상관관계를 조사하였다. 74개의 SNP 중 약 절반이 HapMap에 존재하나, 본 발명자들은 MI 일배체형과 강하게 상관되는 것을 발견하지 못했다(데이터는 도시되지 않음). 요약하면, 이 분석들은 특정한 SNP를 MI 일배체형 상에 있는 추정적 조절 변이(putative regulatory variant)로 확인하지 않았다. 상기 분석은 i) MI 일배체형의 서열이 완전히 결정되지 않았고, ii) 일부 후보 SNP들은 Hapmap 상에 나타나지 않았고, 따라서, 그들이 위험 부여 일배체형 상에 존재하는지 여부가 알려져 있지 않기 때문에, 상기 영역에서 일부의 기능성 후보만을 검출할 것이라는 것에 유념한다. 또한, 덜 보존된 영역 내의 다형성이 기능성 MI 변이일 현실적인 가능성이 있다.
실시예 1.
전체-게놈 연관 연구
본 발명자들은 Illumina 330K 칩을 이용하여, 1570명의 아이슬란드 심근 경색증 환자 및 관상동맥 질환의 확인된 이력을 갖지 않는 7088명의 집단 대조군 개인(코호트 A)을 대상으로 성공적으로 유전형을 분석하였다. 본 발명자들은 MI와의 연관에 대해 게놈-전체 스캔을 수행하여, 성공적으로 유전형이 분석된 309,091개의 SNP 각각을 개별적으로 테스트하였다. 모두 염색체 9p 상에 위치한 단일 LD 블럭(본 명세서에서, LD 블럭 C09로 표시됨)에 위치한 세개의 마커(rs10116277, rs1333040, rs2383207)가 MI에 대한 강한 연관을 보였다(도 1 및 표 1a 참조). 이 세개의 마커들은 모두 강하게 상관되었고(표 2) 위험 변이의 집단 빈도(population frequency)는 42% 내지 49% 범위이며, 상응하는 상대적 위험도는 약 1.2였다. 상기 세개의 마커들의 위험 대립형질은 MI 환자 내에서 보다 낮은 발병 연령과 유의성 있는 상관관계를 보였다- 상기 위험 변이를 갖는 개체들은 상기 위험 변이의 비-보인자인 개체에 비해 보다 어린 연령에 MI를 발병할 유의성 있는 위험을 갖는다(표 8a).
상기 3개의 연관된 마커를 포함하는 LD-블럭, LD 블럭 C09는 두 개의 재조합 핫-스팟-하나는 Build 34의 약 21,920,000bp에 위치하고, 나머지 하나는 염색체 9 상의 약 22,150,000bp에 위치함-에 의해 둘러싸이고(flank) 한정된다 (Nature 437, 1299-1320 (27 October 2005))). LD 블럭 C09 내의 다른 유전적 마커들을 조사하여, 본 발명자들은 마커 rs10116277, rs1333040, 및 rs2383207의 위험 대립형질과 강한 상관관계를 갖는, 두 개의 마이크로-새틀라이트 마커, D9S1870 및 D9S1814를 확인하였다. 표 1b는 게놈-전체 연관 스캔에서 이용되었던 MI 환자와 대조군의 동일한 코호트에서 상기 마이크로새틀라이트 마커의 각 대립형질의 MI에 대한 연관을 보여준다. 마커 D9S1814의 경우, 연관된 대립형질은 대립형질 0이었으나, D9S1870의 경우, 복수 개의 대립형질(대립형질 -4, -2 및 0)이 MI의 증가된 위험도를 보였다. D9S1870의 상이한 대립형질과 마커 rs10116277, rs1333040 및 rs2383207의 위험 대립형질 간의 상관관계를 조사하는 것에 의해, D9S1870의 2보다 짧은 모든 대립형질(각각, 대립형질 -6, -4, -2 및 0)을 풀링(pooling)하는 것에 의해, X로 표시된, 복합 대립형질이 SNP의 원래의 위험 대립형질들과 강하게 상관된다는 것을 관찰하였다(표 2). rs10116277, rs1333040 및 rs2383207의 위험 대립형질(표 1c) 및 5개의 모든 위험 대립형질(표 2)이 강하게 상관되기 때문에 D9S1870의 복합 대립형질 X 및 D9S1814의 대립형질 0은 MI에 대한 유사한 연관을 보였다.
LD 블럭 C09에 의해 정의된 염색체 영역에 위치한 HapMap v9 CEU 데이터세트 내의 모든 SNP에 대한 추가적인 조사는 5개의 마커 rs10116277, rs1333040, rs2383207, D9S1814 및 D9S1870(표 3) 중 하나 이상의 위험 대립형질과 강하게 상관관계를 갖는 추가적인 88개의 마커들을 확인했고 따라서, 상기 마커들은 또한 LD 블럭 C09에 대한 관찰된 연관을 태깅하기 위한 대리 마커(surrogate marker)로 이용될 수 있다.
본 발명자들은 668명의 추가적인 MI 케이스 및 관상동맥 질환의 확인된 이력을 갖지 않는 58,643명의 추가적인 대조군을 포함한, 70,000 명 이상의 아이슬란드인의 대형 코호트(코호트 B)에서 마이크로-새틀라이트 마커 D9S1870의 유전형을 분석하였다. 또한, 본 발명자들은 클리블랜드의 549명의 MI 환자 및 606명의 대조군; UPenn의 580 명의 MI 환자 및 404 명의 대조군; 및 에모리의 400명의 MI 환자 및 477명의 대조군을 포함하는, 미국의 3개의 재현 코호트에서 마이크로새틀라이트 D9S1870를 분석(type)하였다. 미국 코호트의 모든 개체들은 코카서스 기원이었다. 본 발명자들은 모든 4개의 코호트에서 MI와의 연관에 대해 복합 대립형질 X를 테스트하였고(표 4a 및 b), 하나(클리블랜드)를 제외한 모든 코호트가 유의성 있는 연관을 보였다. 4개의 재현 코호트로부터의 결과를 통합하여(표 4c), 통합(combined) P-값 = 2.65 x 10-8을 산출하였다. 게놈-전체 연관에서 이용된 최초의 아이슬란드 코호트(코호트 A)와 통합하면, P-값은 1.44 x 10-12 이고, 승법 모델(multiplicative model)을 가정하는 경우, 각 대립형질 X는 비-보인자에 대한 위험도 대비, 보유된 카피당 1.214 [95%CI:1.151-1.281]의 추정된 상대적 위험도(RR)를 부여했다. 상응하는 통합된 집단 귀속 위험도(population attributable risk, PAR)는 17.1%였다.
본 발명자들이 X를 갖지 않는 개체 대비, 위험 대립형질 X에 대해 이형접합체인 개체와 X에 대해 동형접합체인 개체들에 대해 부여된 위험도를 분리하여 조사한 경우(표 7a), 이형접합체 개인에 대한 추정된 유전형 상대적 위험도(genotype relative risk, GRR)는 1.204 [CI:1.094-1.324]였고, 동형접합체 개인에 대한 GRR은 1.507 [CI:1.360-1.670]이었다. 이는 승법 모델과 일치하며, 즉, 대립형질 X의 MI 위험도에 대한 부가적 기여(additive contribution)를 보여준다.
본 발명자들은 4개의 코호트 모두에서, MI의 발병 연령에 대한 위험 대립형질 X의 상관관계를 더 조사하였다. 분석을 남성의 경우, 50세 이전 및 여성의 경우, 60세 이전의 MI 사건으로 정의된, 조기-발병 MI 케이스에 한정한 경우, 통합된 코호트에 대한 상대적 위험도는 모든 MI 케이스에 대한 1.214에 비해 1.331[CI:1.223-1.449; P = 3.96 x 10-11; PAR = 24.7%]까지 증가되었다(표 6c). 대응되게, 대립형질 X에 대한 이형접합체 보인자 및 동형접합체 보인자에 대한 유전형 상대적 위험도는 각각 1.314 [CI:1.105-1.562] 및 1.790 [CI:1.517-2.113]으로 증가되었다(표 7b). 대안적으로, 본 발명자들은 다중 회귀 분석을 이용하여, MI 케이스 군의 개체들에 의해 보유된 X의 카피 수와 MI의 발병 연령 간의 상관관계를 테스트하였다(표 8b). 4개의 코호트 모두로부터의 결과를 통합하여, 본 발명자들은 MI 개체에 의해 보유된 X의 카피당 평균 발병 연령이 0.95세[SE=0.25] 낮아졌다는 것을 관찰했다.
아이슬란드 코호트 및 에모리 코호트에서 마커 D9S1870에 대해 분석된 개체들 중에 경피 경관 관상동맥 혈관성형술(PTCA) 또는 관상동맥 우회 이식술(coronary artery bypass graft surgery, CABG)을 시술받은 개체들이 있고, 상기 두 수술은 모두 중증의 관상동맥 질환(CAD)을 나타낸다. 본 발명자들은 상기 개체들이 또한 대조군 대비 위험 대립형질 X의 증가된 빈도를 갖는지 여부를 테스트하고, 상기 변이가 개체를 단순한 MI보다 더 일반적인 관상동맥 질환에 대한 소인을 갖도록 하는지를 고려하였다(표 5b 및 c). 두 코호트에서, 본 발명자들은 MI의 경우와 유사하게, 더 강한 것은 아니나, PTCA 및 CABG에 대한 증가된 위험도를 관찰했고, 이는 아이슬란드 코호트에서 매우 유의성이 있었으며, 에모리 코호트의 경우, PTCA에 대한 연관만이 유의성이 있었다. 그러나, 에모리 코호트에서 PTCA 및 CABG를 갖는 개체들의 수가 작았다는 것에 주목해야 한다. 이 연관은 상기 PTCA 및 CABG 그룹으로부터 확인된 MI 케이스를 제거한 후에도 아이슬란드 코호트에서 유지되었다(표 5b).
또한, 아이슬란드 코호트에서, 본 발명자들은 말초 동맥 질환(PAD)과 같은 관상동맥 질환 및 경색증 또는 일과성 허혈 발작(TIA)과 같은 뇌졸중 표현형과 관련된 다른 질환에 대한 연관을 조사하였다. 1661명의 PAD 케이스에 대해, 본 발명자들은 매우 유의성 있는 연관, P = 5.36 x 10-5 및 RR = 1.154 [CI:1.074-1.239](표 5a)을 관찰하였고 이 연관은 그 효과가 다소 약하기는 했으나, 분석에서 PAD 코호트로부터 MI 케이스를 제거한 후에도 유의성이 유지되었다(표 5b). 경색증 또는 TIA를 갖는 1678명의 개체에 대해, 본 발명자들은 X에 대한 유의성 있는 연관을 관찰하지 못했으나, 주혈관 질환(LVD)-관상동맥 질환과 가장 밀접하게 관련된 뇌졸중 서브-표현형-으로 진단된 개체에 대해, 본 발명자들은 각각 MI 케이스를 포함시키거나 또는 배제시킨 경우, 증가된 위험도, RR =1.120 또는 1.172를 관찰했다(표 5a 및 b). 그러나, 아이슬란드 코호트에서 LVD로 진단된 개체는 197명에 불과했으며 이 연관은 통계적 유의성을 갖지 않았다.
본 발명자들은 스텐트내 재협착에 대한 정보를 가지며, D9S1870의 위험 변이에 대해 유전형이 분석된 454명의 아이슬란드인의 그룹에서 상기 마커 D9S1870의 위험 변이 X의 빈도를 조사하였다. 상기 코호트를 중증의 스텐트내 재협착(50% 이상)을 갖는 개체들과 경증의 스텐트내 재협착(50% 미만)을 갖는 개체들로 분류하였다. 모든 개체들이 PTCA를 시술받았고, 따라서, 관상동맥 질환을 갖기 때문에, 양 그룹은 모두 대조군에서 관찰된 것보다 유의성있게 더 높은 변이 X에 대한 빈도를 가졌다(표 9 a). 그러나, 중증의 재협착을 갖는 개체들의 군에서 빈도는 경증의 재협착을 갖는 군에서보다 더 높았고, RR = 1.067 [CI:0.827-1.376]이며, 이 차이는 유의성이 있지는 않으나(표 9b), 이는 상기 변이가 PT를 시술받은 관상동맥 질환 환자에서 스텐트내 재협착의 중증도를 나타낼 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 2.
염색체 9p21 상의 공통 변이가 심근 경색증의 위험도에 영향을 미친다
급성 심근 경색증(MI)을 포함한, 관상동맥 질환(CAD)은 전세계적으로 사망의 주요 원인이다(Thom, T., et al., Circularion 113:e85 (2006)). 심장 질환의 근본적인 유전적 아키텍쳐의 확인이 개선된 위험도 평가 및 예방과 치료를 위한 보다 우수한 수단을 제공할 수 있다.
이 목적을 위해, 본 발명자들은 Illumina Hap300 칩을 이용하여, MI를 갖는 아이슬란드 환자들에 대해 전체-게놈 연관 연구를 수행하였다. 적격 기준을 만족하는 대상을 선별(quality filtering) 후에, 70세 이전의 발병 연령을 갖는 남성 및 75세 이전의 발병 연령을 갖는 여성으로 구성된 1607명의 케이스 및 CAD의 이력이 없는 6728명의 대조군의 표본에서 MI에 대한 연관에 대해 테스트하였다(Helgadottir, A., et al., Science 316:1491 (2007)). 결과를 게놈 대조(genomic control)의 방법을 이용하여 개체들 간의 관련성 및 잠재적인 집단 계층화(potential population stratification)에 대해 조정하였다(3). 수행된 테스트의 수에 대해 조정한 후 유의성을 갖는 SNP는 없었으나, 우연에 의해 기대되는 것보다 더 많은, 유의성에 근접한 신호들을 관찰하였다. 따라서, 본 발명자들은 게놈 전체 유의성(genome wide significance)에 가장 근접한 SNP들을 더 탐색하였다.
MI에 대한 가장 강한 연관은 3개의 상관된 SNP, rs1333040, rs2383207 및 rs10116277에서 관찰되었고, 각각은 위험 대립형질에 대해 약 1.22의 오즈비(OR) 및 약 1 x 10-6의 P 를 가졌다(표 15). 3개의 SNP는 모두 본 명세서에서 LD 블럭 C09로 표시된 염색체 9p21 상에 있는 연관 불균형(LD) 블럭 내에 위치했다(도 1). 이 3개의 SNP 외에, 동일한 LD 블럭 내에 있는 11개의 다른 SNP들이 MI에 대한 명목적 유의성 있는(nominally significant) 연관을 보였다. 이 SNP들에 대한 연관은 전술된 3개의 SNP에 대한 연관에 대해 조정된 후 더 약해지는 경향이 있었다(표 15). 조정 후에, 일부가 명목적 유의성을 유지하였으나 (P < 0.05), P < 0.01인 것은 없었다.
관찰된 연관을 재현하기 위해, 본 발명자들은 추가적인 665명의 아이슬란드 MI 케이스 및 3533명의 대조군 및 미국의 3개의 도시, 필라델피아, 아틀란타, 및 더럼(Durhum)으로부터의 유럽 선조 기원의 3개의 케이스-대조군 표본 세트에서 세개의 SNP, rs1333040, rs2383207 및 rs10116277에 대해 유전형을 분석하였다(2). 일관성을 위해, 본 발명자들은 연관 분석에서 발견(discovery) 그룹의 경우와 동일한 발병 연령 기준을 이용하였다. MI에 대한 연관은 4개의 그룹 모두에서 유의성있게 재현되었다(표 16). Mantel-Haenszel 모델(Mantel, N. & Haenszel, J. Natl. Cancer Inst. 22:719 (1959))을 이용하여 재현 세트들을 통합하였을 때, 3개의 SNP는 모두 MI (P < 1 x 10-8)에 대한 높은 유의성의 연관을 보였고, OR은 아이슬란드 발견 표본(discovery sample)에서 관찰된 것들과 유사했다. 모든 그룹들을 통합했을 때, rs2383207이 가장 유의성 있는 연관을 보였고(P = 2.0 x 10-16), 위험 대립 형질 G에 대해 OR은 1.25(95% CI 1.18-1.31)였다. rs2383207과 rs10116277이 높은 상관관계를 가지며(r 2 = 0.90) 그들의 효과가 이 데이터에서 상호 간에 용이하게 구별될 수 없다는 것이 주목된다. SNP rs1333040은 또한 rs2383207 및 rs10116277과 실질적으로 상관된다(각각, r 2 = 0.57 및 0.67). 이 연관 신호를 정립(refine)하기 위한 시도로, 본 발명자들은 Hapmap CEU 데이터에 근거하여 rs2383207과 실질적으로 상관되고(r2 > 0.5) Illumina Hap300 칩의 일부가 아닌 SNP를 확인하였다. 36개의 그와 같은 SNP 중에서, 본 발명자들은 유전형이 분석될 8개를 선택하였다. 36개의 SNP 각각은 상기 8개중 하나이거나 또는 그들 중에 매우 우수한 대리물(surrogate)을 가졌다(r2 > 0.90) (표 21). 모든 케이스-대조군 그룹으로부터의 데이터를 통합하는 경우, 정립된(refined) SNP rs10757278의 대립형질 G가 상기 질환에 대해 가장 강한 연관을 보였다 (OR = 1.28, P = 1.2 x 10-20; 표 12 및 16). 또한, rs10757278에 대해 조정된 후 rs2383207은 더 이상 유의하지 않았으나(P = 0.25), rs10757278은 rs2383207에 대한 조정 후에도 유의성을 유지했다(P = 2.0 x 10-5). 개별적으로 테스트된 경우 상기 질환에 대한 매우 유의성 있는 연관을 보인 이 영역 내의 SNP 중에서, rs10757278에 대한 조정 후에 유의성을 보이는 것은 없었으며, 정립된 SNP rs1333040만이 조정 후에, 겨우 유의성이 있었다(P = 0.044)(표 22). 이하에서, 개시의 단순화를 위해, 본 발명자들은 본문에서 가장 유 의성 있는 SNP rs10757278에 중점을 두고 상기 영역 내의 다른 SNP에 대한 추가적인 결과는 표 16 내지 20에 제공된다.
유전 양식을 보다 상세하게 조사하기 위해, 본 발명자들은 rs10757278에 대해 유전형 특이적 OR을 계산하였다. 모든 그룹으로의 결과를 통합한 결과, 비-보인자 대비, 위험 대립형질 G의 이형접합체 보인자 및 동형접합체 보인자에 대한 OR은 각각 1.26 및 1.64였다(표 13). 상기 대립형질에 대한 빈도를 아이슬란드와 미국에서의 빈도의 평균인 45.3%로 가정한 경우, 상응하는 PAR은 21%였다.
유전적 인자의 CAD에 대한 효과가 어린 연령에서 더 강한 것으로 확인되었기 때문에(5), 본 발명자들은 rs10757278의 대립형질 G의 MI의 발병 연령에 대한 상관관계를 조사하였다. 이 분석에서, 본 발명자들은 남성 및 여성에서 각각 70세 또는 75세 후에 발병했던 케이스들을 포함한, 확인된 발병 연령을 갖는 모든 케이스들을 이용하였다는 것에 유념한다. 이는 상기 케이스-대조군 분석에서 이용되었던 것에 비해 연구 그룹에 총 973명의 케이스를 추가했다. 위험 대립형질의 갯수에 대해 발병 연령을 회귀시키는 것은 대립형질의 각 카피에 대해, MI의 발병 연령이 평균적으로 약 1년 낮아진다는 것을 보여주었다(P = 2.9x10-7)(표 18). 대안적으로, 케이스-대조군 분석을 남성의 경우 50세 이전 및 여성의 경우 60세 이전의 MI로 정의된, 조기 발병 MI에 한정시키는 경우, 통합된 모든 그룹에서 rs10757278 G에 대한 대립형질 OR이 1.42 (95% CI 1.31 - 1.53)까지 증가되었다(표 19). 비-보인자 대비, 조기 발병 MI에 대한 유전형 특이적 OR은 상기 위험 대립형질의 이형접합체 보인자 및 동형접합체 보인자에 대해 각각 1.49 및 2.02였다(표 13).
rs10757278의 대립형질 G가 MI와 연관된다는 것을 확립한 후, 본 발명자들은 CAD의 보다 광범위한 표현형에 대한 그의 영향을 탐색하였다(표 14). 최초의 전체-게놈 연구에서 가장 유의성 있는 변이의 선택으로부터 발생할 수 있는 편향을 제거하기 위해, 아이슬란드 발견 그룹(아이슬란드 A)로부터의 케이스 및 대조군은 여기에 포함시키지 않았다. 본 발명자들은 후자가 포함되는 경우, 추정된 효과에 대한 변화는 거의 없으나, 보다 큰 표본 크기 때문에 결과가 보다 유의성이 높아질 것이라는 것에 주목한다. 또한, 더럼으로부터의 그룹은 MI 없는 CAD 케이스를 갖지 않았다. 예상된 바와 같이, rs10757278은 높은 유의성으로 CAD에 연관되었다(통합된 그룹에 대해, OR = 1.29, P = 3.6 x 10-14). 분석으로부터 MI 케이스를 제거한 후, 아이슬란드와 아틀란타로부터의 그룹에 대해 연관은 유의성있게 유지되었으나, 필라델피아 그룹에서는 유의성이 유지되지 않았다. 상기 세 그룹으로부터의 결과를 통합한 경우, 1.24의 OR이 산출되었다(P = 0.000011).
MI와 연관된 염색체 9p21 상의 변이는 CDKN2A 및 CDKN2B 유전자를 포함하는 LD 블럭 내에 위치했다. p16INK4a, ARF 및 p15INK4b 라 불리는, 이 유전자들에 의해 코딩된 단백질은 다수의 세포 종류에서 세포 증식, 세포 노화(aging/senescence), 및 자가세포사(apoptosis)에서 중요한 역할을 갖는다(Kim, W.Y. & Sharpless, N.E. Cell 127:265 (2006)). 이들은 MI와 CAD의 근본원인 원인인, 죽종형성(atherogenesis)의 모든 중요한 특성이다(Lusis, A.J. Nature 407:233 (2000); Minamino, T. & Komuro, I. Circ Res 100:15 (2007)). 93명의 조기 발병 MI 환자의 CDKN2A 및 CDKN2B의 엑손, 엑손-인트론 연접(exon-intron junction), 및 조절 영역의 서열결정은 rs10757278에 대한 관찰된 연관을 설명할 수 있는 기능성 변이 또는 기타 변이에 대한 분명한 후보를 밝히지 못했다(표 25 및 26). CDKN2A 및 CDKN2B 유전자 외에, 상기 LD 블럭은 mRNA 전사체(transcript) AF109294의 두 개의 엑손, 가상의 메틸티오아데노신 포스포릴라아제 융합 단백질 mRNA 및 다양한 조직에서 발현되는 여러 EST를 포함한다(Helgadottir, A., et al., Science 316:1491 (2007)). 이 게놈 영역의 변이의 MI/CAD에 대한 기능적 관련성은 아직 규명되지 않았다.
요약하면, 본 발명자들은 염색체 9p21 상에 있는 종양 억제자 유전자 CDKN2A 및 CDKN2B의 주위에 위치한 공통된 유전적 변이가 MI와 연관된다는 것을 입증하였다. 이것은 유럽계(European descent)의 복수 개의 케이스-대조군 그룹에서 MI의 실질적인 위험도(OR > 1.20)를 부여하는 것으로 발견된 최초의 공통된 변이이다. 높은 빈도 때문에, 상기 변이의 집단 귀속 위험도는 일반적으로 MI에 대해 약 21%이고, 조기 발병 케이스의 경우 약 31%이며, 이는 공중 보건의 관점에서 상당하다. 그러나, 상대적 위험도가 극단적으로 높지 않기 때문에, 이는 상기 질환의 가족 집적성(familial clustering)의 일부만을 설명하며 큰 연관 점수(linkage score)를 생성하지 않을 것이다. 따라서, 다른 감수성 변이가 확인되어야 하고 일부는 전체-게놈 연관 스캔에 의해 확인된 후보 영역 내에 위치할 수 있다(Zintzaras, E. & Kitsios, G., J Hum Genet 51:1015 (2006); Wang Q., et al., Am J Hum Genet 74:262 (2004); Samani, N.J., et al., Am J Hum Genet 77:1011 (2005)). 확인된 변이가 MI에 대한 영향 외에 일반적으로 CAD의 위험도를 증가시킬 수 있다는 것을 지지하는 증거가 있으며, 이는 추가적인 연구를 정당화하는 관찰이다. 유전적 변이가 MI의 발병기전에서 그들의 효과를 발휘하는 메카니즘은 아직 규명되지 않았다.
실시예 3
서열결정을 통해 확인된 다형성 마커의 유전형분석
표 25에 표시된 프라이머를 이용한, CDKN2A 및 CDKN2B 유전자의 엑손, 엑손-인트론 연접부 및 잠재적인 조절 영역의 서열결정은 표 26에 표시된 바와 같은 다수의 SNP이 확인을 가져왔다. 공개 데이터베이스에서 발견되지 않았던 상기 SNP들 중 3개에 대한 플랭킹 서열이 표 31에 표시된다. 염색체 9의 이 영역에서 MI와 연관된 것으로 발견된 마커들과 LD인 SNP 마커, 또는 다른 다형성이 보다 높은 위험도를 갖는 연관을 보일 수 있기 때문에, 본 발명자들은 표 28에 표시된 바와 같이, 서열결정에 의해 이 추가적인 마커들의 유전형을 분석하였다. 이 마커들 중 여러 개, 특히, 마커 SG09S291 및 rs2069416이 1.7-1.8의 높은 RR 값으로 MI에 대한 연관을 보였다.
실시예 4
관련된 심혈관 질환에 대한 연관
본 발명자들은 본 명세서에 제시된 염색체 9 상에 있는 신호를 주는 마커들 중 3개에 대해, 관련 질환, 말초 동맥 질환(PAD), 복부 대동맥류(AAA) 및 주혈관 질환 뇌졸중(LVD)에 대한 본 발명의 위험 변이의 연관을 조사하였다. 표 29에서 알수 있는 바와 같이, 3개의 마커들은 이 관련 질환들과 연관된다. 연관은 표 30에 표시된 바와 같이 이 3개 외에, 다수의 마커들에 대해서 유의성 있는 연관이 관찰된, AAA에 대해 특히 강하다. 이 결과는 본 발명의 마커 및 일배체형이 실제로 관상동맥 질환, MI 및 스텐트내 재협착, 예를 들면, 복부 대동맥류와 관련된 질환을 반영한다는 것을 보여준다.
실시예 5
동맥 표현형 AAA, IA 및 뇌졸중에 대한 연관의 추가적인 정립(refinement).
다른 심혈관 질환에 대한 rs10757278의 효과를 보다 상세하게 조사하기 위해, 본 발명자들은 복부 대동맥류(AAA) 및 뇌졸중에 대한 연관을 더 연구하고, 또한 동맥 질환인 두개내 동맥류(IA)를 조사하였다.
방법
연구 집단
관상동맥 질환 그룹
아이슬란드 및 미국으로부터의 관상동맥 질환 그룹은 전술된 바와 같았 다(Helgadottir, A., et.al., Science 316:1491-3 (2007) 참조)
아이슬란드 대조군
연관 연구에서 이용된 14278명의 아이슬란드 대조군은 다양한 GWA 연구에 참여한 개인들로부터 선별하고 deCODE의 유전학 프로그램의 일환으로 모집하였다. 그들이 하나 이상의 CVD 유전학 프로그램(즉, MI, 뇌졸중, PAD, T2D, 비만, 가족성 복합 고지혈증, 관상동맥 재협착, 및 고혈압)에 참여하지 않았으면, 대조군의 의학적 이력은 알려져지 않았다. 확인된 MI, 뇌졸중, PAD 또는 CAD를 갖거나, 또는 T2D를 갖는 개체들은 대조군으로부터 배제되었다. 14259명의 대조군 중에서, 9202명은 본 발명자들의 이전의 MI의 GWA 연구에서 이용된 대조군과 중복된다(Helgadottir, A., et.al., Science 316:1491-3 (2007)). 대조군은 5615명의 남성 및 8644명의 여성을 포함했고, 그들의 평균 연령은 55.2세 (SD 21.7)였다. 대조군의 다양한 유전적 프로그램으로의 분류는 대략 하기와 같았다(괄호 안은 두 개의 변이 rs10757278 대립형질 G 및 rs10811661 대립형질 T의 빈도): 정신분열증 500명 (0.428/0.825), 전립선암 900명 (0.447/0.815), 유방암 1300명 (0.433/0.817), 결장암 700명 (0.413/0.817), 중독 2600명 (0.444/0.814), 불안 900명 (0.442/0.824), 감염성 질환 1200명 (0.434/0.821), 집단 대조군 700명 (0.427/0.830), 마이크로어레이 발현 연구 400명 (0.445/0.817), 장수 1100명 (0.450/0.819), 편두통 1100명 (0.446/0.818), 하지 불안 증후군 400명 (0.439/0.812), 알쯔하이머병 350명 (0.457/0.822), 천식 1300명 (0.419/0.819), 난독증 600명 (0.438/0.830). 두 변이 중 어느 것에 대해서도 상기 질병 그룹들 간에 빈도의 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다(rs10757278 및 rs10811661에 대해, 각각 P = 0.52 및 P = 0.99).
뇌졸중 그룹
아이슬란드 뇌졸중 환자들은 1993년부터 2002년까지 레이캬비크의 주요 병원, 랜드스피탈리 대학교 병원(Landspitali University Hospital)에서 허혈성 뇌졸중 또는 TIA로 진단받은 개인을 포함한 4000명 이상의 개인들의 등록부로부터 모집되었다. 뇌졸중 환자들은 deCODE의 심혈관 질환(CVD) 유전학 프로그램을 통해 최근 9년 동안 등록되었다. 스웨덴 스톡홀름의 카롤린스카(Karolinska) 대학 병원, 후딩게(Huddinge) 유닛의 뇌졸중 유닛 또는 뇌졸중 외래환자 클리닉에 다니는 허혈성 뇌졸중 또는 TIA를 갖는 스웨덴 환자들이 지속적인 유전적 역학 연구인 SSISS(the South Stockholm Ischemic Stroke Study)의 일환으로 1996년부터 2002년까지 모집되었다. 아이슬란드와 스웨덴으로부터의 모든 환자들은 CT(computed tomography) 및/또는 MRI(magnectic resonance imaging)에 의한 뇌 영상촬영(brain imaging)을 포함한, 임상적으로 관련된 검사, 및 경동맥 및 척추동맥의 이중 초음파검사(duplex ultrasonography), 심장초음파, Holter 모니터링, MR-혈관조영술, CT-혈관조영술 및 표준 혈액 검사를 포함한 보조적 진단 검사를 받았다. 환자들은 최초의 영상촬영 및 데이터를 검토한 의사에 의해 TOAST(the Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment)에 따라, 허혈성 서브타입(ischemic subtype)으로 분류되었다(Adams, H.P. Jr., et al., Stroke 24:35-41 (1993)). 심장색전성 뇌졸 중(cardioembolic stroke) 및 기록 심방 세동(documented atrial fibrillation)을 갖는 것으로 분류된 환자들은 분석으로부터 제외시켰다. 본 연구에서 이용된 스웨덴 대조군은 본 연구에서 이용된 스웨덴 대조군은 이 지역의 일반 집단을 대표하는, 환자와 동일한 스웨덴 중부의 지역으로부터 모집된 집단-기반 대조군이었다. 개인들은 정상 기준 집단을 대표하기 위해 카롤린스카 대학 병원의 임상화학과에 의해 모집된 건강한 지원자(1990년-1994년에 모집됨) 또는 헌혈자(2001년에 모집됨)였다. 아이슬란드 및 스웨덴의 이 뇌졸중 연구는 관련 기관 검토 위원회(Institutional Review Board) 또는 윤리 위원회에 의해 허가되었고 모든 참여자들은 서면의 고지된 동의서를 제공하였다.
두개내 동맥류 그룹
아이슬란드 IA 환자들은 아이슬란드에서 신경외과를 갖춘 유일한 병원인, 랜드스피탈리 대학 병원의 1994년부터 2006년까지의 입원환자 데이터베이스를 통해 확인되었다. 1996년에서 2006년의 기간에 ICD10 진단 I60.0-7(동맥류 지주막하 출혈(aneurysmal subarachnoid hemorrhage)), I67.1 (파열된 뇌동맥류) 및 I69.0 (지주막하 출혈의 후유증)을 갖는 모든 환자들이 등록되었고, 또한 1994년부터 1996년의 기간에 ICD9 진단 430(파열된 뇌동맥류로부터의 지주막하 출혈)을 갖는 환자들이 등록되었다. 이는 총 367명의 IA 환자였다. 모든 환자들은 두부의 CT 스캔 및/또는 뇌혈관조영상(cerebral angiogram), CT-혈관조영상 또는 MRi 혈관조영상을 포함한 임상적으로 관련된 검사를 받았다. 367명의 환자 중 170명에 대해 DNA 시료가 이용가능했다.
위트레흐트 대학 의학 센터(the University Medical Center Utrecht)에 입원한 파열성 IA(91.5%) 또는 비파열성 IA(8.5%)를 갖는 네덜란드 환자들이 본 연구에서 이용되었다. 파열성 두개내 동맥류는 CT 상의 지주막하 혈액 및 혈관조영술(통상적인 혈관조영술, CT- 또는 MR-혈관조영술)에서 입증된 동맥류와 조합된, 지주막하 출혈(SAH)을 시사하는 증상에 의해 정의되고, 비파열성 두개내 동맥류는 CT 또는 MR 혈관조영술 또는 통상적인 혈관조영술에 의해 확인되었다. 20.5%의 케이스에서 복수 개의 두개내 동맥류가 발견되었다. SAH 발생 시의 평균 연령은 49.5세(범위 10-84)였고, 환자의 66.1%는 여성이었다. 대조군은 건강한 유럽계의 네덜란드 혈액은행 헌혈자들이었다.
핀란드의 쿠오피오(Kuopio) 대학 병원 또는 헬싱키 대학 병원에 두개내 동맥류의 치료를 위해 입원한 핀란드 IA 환자들이 본 연구를 위해 이용되었다. 이 연구 그룹 및 이용된 핀란드 대조군은 이전에 설명되었다(Weinsheimer, S. et al., Stroke 38:2670-6 (2007)).
아이슬란드, 네덜란드 및 핀란드의 IA 연구는 관련 기관 검토 위원회 또는 윤리 위원회에 의해 허가되었고 모든 참여자들은 서면의 고지된 동의서를 제공하였다.
말초 동맥 질환 그룹
1983년부터 2006년까지의 기간 동안, 레이캬비크에 있는 주요 병원인 랜드스 피탈리 병원에서 PAD로 진단된 개인들의 등록부로부터 PAD를 갖는 아이슬란드 환자들을 모집하였다. PAD 진단은 혈관 조영술(vascular imaging) 또는 분절성 압력 측정(segmental pressure measurement)에 의해 확인되었다. PAD 환자들은 deCODE에서 CVD 유전학 프로그램의 일환으로 최근 9년동안 등록되었다.
이탈리아 환자들 및 대조군은 2000년 내지 2001년에 로마의 A. 게멜리(Gemelli) 대학 병원의 내과 및 혈관학과(Angiology)에 순차적으로 입원된 대상자들 중에서 모집되었다. PAD 군의 선발(inclusion) 기준은 유럽계 및 PAD의 존재였다. PAD의 진단은 확립된 기준에 따라 수행하였다(J Vasc Surg 4:80-94 (1986)). 모든 환자들은 0.8 미만의 발목/상완 압력 지수(ankle/arm pressure index)를 가졌고, 간헐적인 파행 및 휴식통 또는 영양성 병변(trophic lesion)의 부재를 동반한, Fontaine 단계 II에 있었다. 대조군에 대한 선발 기준은 유럽계, PAD 및 CAD의 부재 및 환자(case)와의 비혈연관계(unrelatedness)였다. 본 연구로부터의 추가적인, 배제 기준은 종양, 만성 염증 질환, 및 자가면역 질환이었다(Flex, A., et al., Eur J Vasc Endovasc Surg 24: 264-8 (2002)).
스웨덴 PAD 환자 및 대조군은 스웨덴의 3개의 최남단 보건 구역(health-care district)(2001년, 723,750명의 거주자)에서 중증 하지 허혈(critical limb ischemia)을 갖는 모든 환자들에 대한 유일한 위탁 센터(referral center)인 말뫼(Malmo) 대학 병원에 있는 혈관 질환과에서 모집되었다. 중증 하지 허혈의 진단은 궤양, 괴저, 또는 발목 압력 (<50 내지 70 mm Hg)에 의해 입증된 PAD에 의해 유발된 휴식통(rest pain), 저하된 발가락 압력(<30 내지 50 mm Hg), 또는 저하된 경 피 산소 분압의 TransAtlantic Inter-Society Consensus 과학적 기준에 따라 수행되었다(Dormandy, J.A. & Rutherford, R.B., J Vasc Surg 31:S1-S296 (2000)). 진단은 숙련된 혈관 수술 컨설턴트(vascular surgery consultant) 및 영향받은 다리에 눌리지 않는(noncompressible) 동맥을 갖는 환자에서 발가락 압력 측정에 의해 확인되고, 발목 압력은 50 초과 내지 70 mm Hg였다. 대조군은 예방 의학 프로젝트를 위한 건강 스크리닝 프로그램에 포함된 건강한 개인들로 구성되었다. 이들 중 증후성 PAD를 갖는 사람은 없었다(Barani, J., et al., J Vasc Surg 42:75-80 (2005)).
뉴질랜드 PAD 환자들을 뉴질랜드의 오타고-사우스랜드(Otago-Southland) 지역으로부터 모집하였고, 대다수(>97%)는 이전에 보고된 바와 같이 앵글로-유럽계였다(Jones G.T., et al., Clin Chem 53:679-85 (2007)). PAD는 0.7 미만의 발목 하지 지수, PVR(pulse volume recording) 및 혈관조영술/초음파 영상촬영에 의해 확인되었다. 대조군은 동일한 지리적 지역으로부터 과거 혈관 질환의 이력이 없는 장년층으로 구성되었다. 대조군은 PAD에 대해 무증상이었고 1보다 큰 발목 하지 지수를 가졌다. 모든 복부 초음파 스캔은 PAD 및 대조군 모두로부터 동시발생된 AAA를 배제시켰다.
아이슬란드, 이탈리아, 스웨덴, 및 뉴질랜드 PAD 연구는 관련 기관 검토 위원회 또는 윤리 위원회에 의해 허가되었고 모든 참여자들은 서면의 고지된 동의서 를 제공하였다.
복부 대동맥류 그룹
AAA를 갖는 아이슬란드 환자들은 1980년부터 2005년의 기간에 아이슬란드의 레이캬비크에 있는 랜드스피탈리 대학 병원에 증후성 AAA 또는 파열성 AAA의 응급 치료 또는 예정 수술(elective surgery)을 위해 입원한 개인들의 등록부로부터 모집되었다. AAA를 갖는 사람들은 deCODE의 CVD 유전학 프로그램의 일환으로 최근 9년 동안 등록되었다. 일부 분석에서, 1981년부터 2006년까지의 기간 동안 아이슬란드에서 진단된 CAD 환자의 포괄 목록(Helgadottir, A., et.al., Science 316:1491-3 (2007))과 중복된 AAA 케이스는 배제시켰다. 397명(288명의 남성 및 109명의 여성, 평균 연령 75.3세 (SD 8.7))의 AAA 케이스에서, 208명이 CAD 환자들과 중복되었다. 189명(131명의 남성 및 58명의 여성, 평균 연령 75.5세 (SD 9.3))의 나머지 CAD 중에서, 138명의 케이스에 대해서는 정보가 입수가능하지 않았고 51명은 설문지에서 CAD로 진단되지 않았던 것으로 보고하였다.
93개의 영국 병원에서 혈관 수술의사에게 위탁된 AAA를 갖는 영국 환자들은 UK Small Aneurysm Trial에 참여했다. 본 연구의 목적을 위해, AAA 직경 4.0-5.5 cm를 갖는, UK Small Aneurysm Trial에서 관리(surveillance)로 랜덤화된 환자들을 환자 그룹으로 선택하였으나, 일부 환자들은 그들의 동맥류가 상기 시험을 위한 역치(threshold)인 4.0 cm에 도달하기 전에 모니터링되었다. 기준시점(baseline)에서 평균 AAA 직경은 4.5 cm(3.2-5.5 cm)였다(Eriksson, P., et al., Br J Surg 92:1372-6 (2005)). CAD 발생에 대한 정보는 97%의 AAA 케이스(479명 중 466명)에 대해 이용가능했다. 대상자가 협심증의 치료 하에 있거나, 과거에 MI를 갖거나, 관상동맥 우회 이식술 또는 혈관성형술을 받았거나, 또는 ECG 코딩이 두 명의 전문 관찰자에 의해 판단된, 허혈증의 증상을 갖는 경우, CAD의 이력은 양성으로 간주되었다. 이 정보를 갖는 대상자들 중에서, AAA 대상자 중 CAD의 빈도는 52%였다. 대조군은 유럽계였고, 영국으로부터 모집되었다.
벨기에와 캐나다의 AAA 환자들은 각각 벨기에의 리에주(Liege) 대학 병원과 캐나다의 핼리팩스에 있는 댈하우지(Dalhousie) 대학 병원에 파열성 AAA의 응급 치료 또는 예정 수술을 위해 입원한 개인들의 등록부로부터 모집되었다. 이 케이스-대조군 세트의 세부사항은 이전에 보고되었다(Ogata, T., et al., J Vasc Surg 41:1036-42 (2005)). 모든 환자들은 유럽계였고 3 cm 이상의 신장하 대동맥(infrarenal aorta) 직경을 가졌다. 35명의 환자들은 초음파촬영술을 이용하여 AAA로 진단되었고 고령 때문에 또는 동맥류가 비교적 작았기 때문에 수술을 받지 않았다. AAA 환자들의 약 40%가 AAA의 가족력을 가졌다. 벨기에 AAA 환자의 경우, 인터뷰을 통해서 및 의료 파일로부터 수술을 받았던 사람들에 대해 CAD 이력에 대한 정보가 확인되었다. 또한, 모든 환자들은 CAD가 의심되는 경우, 경흉부 초음파검사(transthoracic echography), 스트레스 테스트 및 관상동맥 혈관조영술과 같은 심장 검사를 받았다. 본 연구를 위한 CAD 정보는 벨기에의 AAA 케이스의 45%(176명 중 79명)에 대해 이용가능했다. 이 정보를 갖는 케이스들 중에서, AAA 대상자 중 CAD의 빈도는 29%였다. 유럽계의 대조군 표본(51% 남성)을 AAA 환자의 배우자, 또 는 AAA가 아닌 다른 이유 때문에 동일한 병원에 입원한 개인들로부터 수득하였다.
AAA에 대한 예정 수술 또는 응급 수술을 위해 피츠버그 대학병원에 입원한 환자들이 본 연구를 위해 선택되었다(St Jean, P.L., et al., Ann Hum Genet 59:17-24 (1995)). CAD의 병력은 자가-보고되었고 86%(101명 중 87명)에 대해 이용가능했다. 이 정보를 갖는 사람들 중에서, AAA 대상자 중 CAD의 빈도는 48%였다. 대조군은 필라델피아, 펜실베니아 대학 의학 센터의 PENN CATH 연구 프로그램의 참여자들로부터 선택되었다. 대조군은 관상동맥 혈관조영술시 심각한 관강내 협착을 갖지 않고(50% 미만의 관강내 협착) MI의 병력을 갖지 않는 개체들을 대표한다. 이들은 펜실베니아로부터의 CAD 표본에 대한 연관 분석에서 사용된 것과 동일했다(Helgadottir, A., et.al., Science 316:1491-3 (2007)).
AAA를 갖는 뉴질랜드 환자들은 뉴질랜드의 오타고-사우스랜드 지역으로부터 모집되었고, 대다수(>97%)가 이전에 보고된 바와 같이, 앵글로-유럽계였다(Jones, G.T., et al., Clin Chem 53:679-85 (2007)). 약 80%의 환자들은 수술적 AAA 치료를 받았다(통상적으로 직경이 50 mm보다 큰 AAA). 대조군은 뉴질랜드 PAD 그룹과의 비교를 위해 기재된 것과 동일한, 혈관 질환이 없는 개체들이었다. AAA 환자의 98%(588명 중 575명)에 대해 CAD 정보가 이용가능했다. 정보를 갖는 개체들 중에서, CAD의 빈도는 40%였다.
네덜란드의 AAA 표본 세트는 주로 환자들이 혈관 수술의를 방문했을 때 또는 드물게는 병원 입원 동안에, 네덜란드에 있는 8개의 센터로부터 모집되었다. 대조군은 유럽계의 건강한 네덜란드 헌혈자였다. 다른 CAD에 대한 정보는 자가-보고되 었고 69%(480명 중 330명)에 대해 이용가능했다. 협심증의 치료, 이전의 MI, 관상동맥 우회 이식술 또는 스텐트 삽입이 CAD로 간주되었다. 정보를 갖는 330명 중에서, 96명이 CAD를 가졌다(29%).
아이슬란드, 영국, 벨기에, 캐나다, 펜실베니아, 네덜란드 및 뉴질랜드의 AAA 연구는 관련 기관 검토 위원회 또는 윤리 위원회에 의해 허가되었고 모든 참여자들은 서면의 고지된 동의서를 제공하였다.
SNP 유전형 분석(Genotyping).
모든 표본에 대한 SNP 유전형 분석은 아이슬란드의 레이캬비크에 있는 deCODE genetics에서 수행하였다. 개별적인 SNP 유전형분석은 Centaurus (Nanogen) 플랫폼에 의해 수행하였다(Kutyavin, I.V., et al., Nucleic Acids Res 34:e128 (2006)). 각 Centaurus SNP 분석법의 질은 CEU 및/또는 YRI HapMap 시료에서 각 분석물의 유전형 분석을 수행하고 그 결과를 HapMap 데이터와 비교하는 것에 의해 평가하였다. 주요 마커인 rs10757278과 rs10811661은 10% 이상의 표본에서 재-유전형분석을 수행하였고 0.5% 미만의 표본에서 불일치(mismatch)가 관찰되었다. 일부 표본의 경우, 본 발명자들은 이전에 Illumina 317K Bead 칩 또는 Centaurus 방법에 의해 SNP rs1333040, rs2383207, 및 rs10116277의 유전형을 분석하였다. 이 SNP들은 rs10757278과 높은 상관관계를 가졌고(HapMap CEU 데이터세트에서, 각각, r 2 = 0.57, 0.87, 및 0.90) 그들이 결실된 곳에서 rs10757278에 대한 유전형을 귀속시키 기 위해 이용되었다. 또한, 다수의 아이슬란드 표본에서, Illumina 317K Bead 칩 상에 존재하는 SNP rs2383208은 이전에 유전형이 분석되었다. 이 SNP는 SNP rs10811661 (HapMap CEU 데이터세트에서 r 2 = 1)에 대한 완벽한 대리물이고 rs10811661에 대한 유전형을 귀속시키기 위해 이용되었다.
SNP는 분석을 위해 이용된 연구 코호트에서 하디 와인버그 평형(Hardy Weinberg Equilibrium)으로부터 벗어나지 않았다.
연관 분석
본 발명자들은 (위험도에 대한 승법(multiplicative) 모델을 가정하여, 즉, 한 사람이 갖는 두 개의 대립형질의 위험도가 곱해진다는 것을 가정하여, 각각의 개별적인 대립형질에 대해, 양측 P 값 및 오즈비(OR)를 계산하기 위해) NEMO 소프트웨어에서 구현된 표준 가능성 비 통계값(standard likelihood ratio statistics)을 이용하였다. 보인자 빈도(carrier frequency)가 아닌 대립형질 빈도가 마커에 대해 제시되었고, 아이슬란드 연구 그룹의 경우, 이전에 기술된 708,683명의 아이슬란드인의 계통을 통해 유전형을 시뮬레이션하는 것에 의해 개체의 관련성에 대해 조정된 P 값이 제시되었다(Stefansson, H., et al., Nat Genet 37:129-37 (2005)). 유전형 특이적 OR(표 34)을 추정할 때, HWE를 가정하여 집단에서의 유전형 빈도를 추정하였다. 다양한 그룹에 대한 OR 추정값이 로그-노말 분포(log-normal distribution)을 갖는다는 것을 가정하여 이질성 테스트(heterogeneity test)를 수 행하였다. 가능성 비 카이-스퀘어 테스트를 이용하였고, 연관된 자유도(associated degrees of freedom)는 비교된 그룹의 갯수에서 1을 뺀값과 동일했다.
일반적으로, 대립형질/일배체형 빈도를 최대 가능성(maximum likelihood)을 이용하여 추정하고 일반화된 가능성 비 테스트(generalized likelihood ratio test)를 이용하여 케이스와 대조군 간의 차이의 테스트를 수행하였다. 이 방법은 목적 마커(marker of interest)에 대한 일부 결실된 유전형이 있고, 상기 목적 마커와 강한 LD인 또 다른 마커의 유전형이 일부 부분적인 정보를 제공하기 위해 이용되는 경우, 특히 유용하다. 상태(phase) 및 결실된 유전형에 따른 불확실성을 다루기 위해, 최대 가능성 추정값, 가능성 비 및 P 값이 관찰된 데이터로부터 직접 계산되고, 따라서, 상태 및 결실된 유전형에서의 불확실성에 따른 정보 손실이 가능성 비에 의해 자동적으로 포착된다.
rs10757278 대립형질 G와 rs10811661 대립형질 TT의 연령 및 성별에 대한 상관관계가 아이슬란드 대조군 집단에서 테스트되었다. 상기 대립형질 중 어느 것도 이 공변량(covariate)에 대한 유의성 있는 연관을 보이지 않았다. 또한, AAA 케이스 내에서 남성과 여성 간에 변이의 빈도에서 유의성 있는 차이가 검출되지 않았다(데이터는 도시되지 않음). 또한, 아이슬란드 표본에서 rs10757278 대립형질 G의 AAA와의 연관 분석에서 연령과 성별을 공변량으로 포함시키는 것은 결과에 무시할 정도의 미미한 영향을 미쳤다. 따라서, 단순화를 위해, 연관 분석은 연령 및 성별에 대한 조정 없이 제시된다.
rs10757278 대립형질 G의 AAA에 대한 관찰된 연관 결과가 집단 계층 화(population stratification)에 의해 영향을 받을 가능성이 WTCCC 표본에서 지리적 분화에 대한 강한 증거를 보여주는, WTCCC에 의해 확인된 13개의 SNP를 분석하는 것에 의해 UK AAA 케이스와 대조군에 대해 다루어졌다(Nature 447:661-78 (2007)). 상기 SNP들 중 단 하나만이 UK AAA 케이스와 대조군 간에 명목적 유의성을 보였으며(P = 0.017), 테스트된 13개의 SNP에 대해 조정하는 경우, 유의하지 않았다. 본 발명자들이 케이스-대조군 분석에서 이 SNP에 대해 조정하는 경우, UK 케이스-대조군 그룹에서 rs10757278 대립형질 G의 AAA에 대한 연관은 영향받지 않았다(P = 0.0063 및 OR = 1.35 대신, P = 0.0052 및 OR = 1.36). 아이슬란드 케이스-대조군 분석에서, 본 발명자들은 연구 개체들의 관련성에 대해 조정하였다. 이 조정은 게놈 대조군에 근거한 조정과 매우 잘 일치되는 것으로 확인되었고, 상기 조정은 아이슬란드 집단에서 전체-게놈 연관 분석의 최근 발표에서의 집단 계층화에 대한 조정을 포함할 것이다(Steinthorsdottir, V., et al., Nat Genet 39:770-5 (2007); Gudmundsson, J. et al., Nat Genet 39:631-7 (2007)). 가장 중요하게는, 5개의 AAA 데이터세트로부터 수득된 매우 유사한 대립형질 오즈비가 집단 층화가 효과에 대한 추정치에 실질적인 영향을 가질 가능성을 매우 낮게 한다.
그룹들이 대립형질, 일배체형 및 유전형에 대한 상이한 집단 빈도를 가질 수 있게 하나, 공통된 상대적 위험도를 갖는 것으로 가정되는 것인 Mentel-Haenzel 모델을 이용하여 복수 개의 케이스-대조군 그룹으로부터의 결과를 통합하였 다(Mantel, N. & Haenszel, W. J Natl Cancer Inst 22: 719-48 (1959)).
결과
표 32에 표시된 결과는 아이슬란드 IA 코호트, 재현 코호트로부터의 결과, 및 상기 코호트에 대한 통합 분석(combined analysis)을 보여준다. 연구된 복수 개의 케이스-대조군 그룹으로부터의 데이터를 각각 IA, AAA, PAD 및 LAA/심장성 뇌졸중에 대해 통합한 경우, rs10757278 대립형질 G는 상기 4개의 표현형 모두에 대한 유의성 있는 연관을 보였다. 그러나, 추정된 효과 크기는 상당히 상이했고 AAA (통합 분석, OR = 1.31, P = 1.2 x 10-12) 및 IA (통합 분석, OR = 1.29, P = 2.5 x 10-6)에 대해 가장 강했다. 높은 전체 통계적 유의성 외에, rs10757278 대립형질 G에 의해 부여된 IA 및 AAA에 대한 추정된 위험도는 아이슬란드(OR=1.36), 핀란드(OR=1.33), 및 네덜란드(OR=1.24)로부터의 3개의 IA 표본 세트(P het, 이질성 테스트에 대한 P-값 = 0.75), 및 아이슬란드(OR=1.37), 벨기에(OR=1.21), 캐나다(OR=1.29), 미국 펜실베니아(OR=1.39), 영국(UK)(OR=1.35), 네덜란드(OR=1.31), 및 뉴질랜드 (OR=1.25)로부터의 7개의 AAA 표본 세트(P het = 0.98)에서 매우 유사했다. rs10757278 대립형질 G의 IA 및 AAA에 대한 효과는 CAD에 대해 이전에 보고된 것과 유사했다(Helgadottir, A., et al. Science 316:1491-3 (2007)) (표 32).
AAA와 CAD 간의 높은 공존-이환(co-morbidity) 때문에, 본 발명자들은 CAD의 증거를 갖는 케이스를 제거한 후 AAA에 대한 연관 분석을 반복하는 것에 의해 상기 두 상태에 대한 변이의 효과의 속성을 연구하였다. 표 33에 표시된 바와 같이, CAD의 증거가 없는 AAA에 대한 rs10757278 대립형질 G의 효과는 전체 표본 세트에 대한 것보다 단지 약간 더 작거나, 또는 OR은 아이슬란드 표본 세트에 대해 1.3, UK 표본 세트에 대해 1.31, 펜실베니아 표본 세트에 대해, 1.19, 벨기에 표본 세트에 대해 1.20, 네덜란드 표본 세트에 대해 1.25, 및 뉴질랜드 표본 세트에 대해 1.18이었다. 이용가능한 CAD 정보를 갖는 6개의 상이한 그룹에 대해, 확인된 CAD 케이스를 제거한 후, 통합된 OR은 1.25이고, P = 3.0 x 10-6이었으며, 이는 AAA에 대한 연관이 단순히 rs10757278 대립형질 G와 CAD 간의 연관의 결과가 아니라는 것을 나타낸다. 본 발명자들이 알고 있는 바로는, IA와 CAD의 공-분리(co-segregation)를 시사하는 문헌 증거는 없다. 또한, IA에서 성별 비는 CAD와 같은 죽상경화성 질환에서의 성별 비와 상이하고; IA는 남성에서보다 여성에서 보다 빈번하며, 최고 발생율(peak incidence)도 CAD에서보다 더 어린 연령에 일어난다(Schievink, W.I., N Engl J Med 336:28-40 (1997)). 따라서, rs10757278 대립형질 G의 IA에 대한 효과는 CAD를 통해 매개되지 않는다.
유전형-특이적 효과가 모든 7개의 AAA 표본 세트 및 3개의 IA 표본 세트로부터의 데이터에 근거하여 연구된 경우, 위험 대립형질 G의 이형접합체 보인자 및 동형접합체 보인자에 대한 OR은 AAA의 경우 각각 1.36 및 1.74였고, IA의 경우, 각각 1.38 및 1.72였다(표 34). G 대립형질에 대해 47.5%의 집단 빈도를 가정하는 경우, 상응하는 집단 귀속 위험도는 AAA 및 IA에 대해 약 26%였다. rs10757278 대립형질 G는 IA 또는 AAA의 위험도에 영향을 미치는 것으로 기재된 최초의 공통된 서열 변이라는 것에 주목해야 한다.
AAA(3 cm를 초과하는 대동맥 직경으로 정의됨)의 유병율은 50세 이상의 남성 및 여성에서 각각 4.3% 및 1.0%이며(Lederle, F.A., et al, J Vasc Surg 34:122-6 (2001); Lederle, F.A:, et al. Arch Intern Med 160:1425-30 (2000)), 전체 집단의 2-5%가 IA를 갖는 것으로(Brisman, J.L, et al., N Engl J Med 355:928-39 (2006)) 보고되었다. AAA 및 IA는 모두 통상적으로 무증상이고 자연 경과(natural history)가 치료적 개입 또는 파열로 정점에 도달하는, 동맥의 비대를 초래하는 동맥의 퇴행성 과정을 나타낸다. IA의 파열은 지주막하 출혈을 초래하고, IA 및 AAA의 파열은 모두 높은 이환율 및 사망율을 갖는다(Brisman, J.L, et al., N Engl J Med 355:928-39 (2006); Thompson, R.w. Cardiovasc Surg 10: 389-94 (2002)). AAA의 경우, 파열 위험도는 동맥류의 성장 속도 및 크기와 함께 증가된다. UK 연구 그룹으로부터의 환자들은 소형 무증상 동맥류(small asymptomatic aneurysm)(5.5 cm 미만의 대동맥 직경)를 갖는 환자들만 포함했으나, 다른 연구 그룹들은 주로 동맥류 치료를 받는 환자들을 포함했고 따라서, 보다 크고, 증상을 보이는 동맥류(5.5 cm를 초과하는 대동맥 직경)에 대해 편향될 가능성이 있다. 모집 차이에도 불구하고, OR은 유사했으며, 이는 상기 변이가 대동맥류 성장의 적접적 위험도를 부여하지 않는다는 것을 시사한다. 이 개념은 소형 무증상 AAA를 갖는 개체들이 순차적인 대동맥류 크기 측정을 받은, UK로부터의 표본 세트에서 더 조사되었다(Eriksson, P. et al., Br J Surg 92:1372-6 (2005)). 표 35에 표시된 바와 같이, rs10757278 대립형질 G와 동맥류 성장 또는 파열 간의 연관의 증거는 없다. 오히려, 대립형질 G가 느린 성장과 상관관계를 갖는다는 일부 징조가 있다. 동형접합형 GG 그룹과 이형접합형 AG 그룹 간의 평균 성장 속도의 차이는 -0.46 mm/년이고 명목적 유의성을 가지며(P = 0.05), 이는 추가적인 조사를 정당화하는 관찰이다. 확인되면, 이 역 연관(inverse association)은 또한 보다 느린 동맥류 성장 속도가 전신성 동맥경화증(generalised atherosclerosis)의 마커인 낮은 발목/상완 압력 지수를 갖는 환자에서 관찰되었다는 과거의 발견을 반영한다(Brady A.R., et al., Circulation 110:16-21 (2004)). 이 데이터는 서열 변이가 빠른 동맥류 진행의 위험도를 증가시키기 보다는, 동맥류를 발병할 증가된 감수성을 초래한다는 것을 시사한다.
rs10757278 대립형질 G의 PAD 및 LAA/심장성 뇌졸중에 대한 효과는 AAA, IA 및 CAD에 대한 효과보다 더 약한 것으로 보였다(표 32). 아이슬란드 표본에서, AAA와 IA 케이스 간에 rs10757278 대립형질 G의 빈도 차이는 없었으나, 상기 빈도는 AAA와 IA 케이스의 통합된 그룹에서보다 PAD 및 LAA/심장성 뇌졸중 케이스에서 더 낮았다(각각, P = 0.012 및 P = 0.052). 또한, 확인된 CAD를 갖는 PAD 및 LAA/심장성 뇌졸중 개체를 분석으로부터 제외시킨 후, 효과는 훨씬 더 감소되었으며, 특히, PAD에 대해 현저했다(표 33).
본 발명자들은 아프리카계 미국인 표본에서 LD 블럭 CO9 내의 여러 변이와 MI 간의 연관을 테스트하였다. 표 36에 제시된 결과에 의해 나타난 바와 같이, 아프리카계 미국인에서의 효과는 상대적 위험도에 의해 측정된 크기에 있어서, 코카 서스계 표본에서의 효과와 유사했다. 다수의 마커에 대해 아프리카계 미국인 표본에서의 연관의 명목상 통계적 유의성(0.05 미만의 p-값)의 부재는 상대적으로 작은 표본 크기 때문이다. 가장 중요하게는, 아프리카계 미국인에서 관찰된 연관, 및 코카서스계에 대해 결정된 것과 유사한 위험도를 갖는, 일본 및 한국으로부터 기원된 아시아계 표본에서 보고된 연관(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008 Feb;28(2):360-5. Epub 2007 Nov 29, and J Hum Genet. Epub 2008 Feb 9 참조)은 아이슬란드로부터의 코카서스계 표본에서 최초로 발견된 유전적 효과가 다른 인간 집단에서도 나타난다는 것을 보여준다. 따라서, 그 효과는 모든 주요한 인간 집단에서 심혈관 질환에 대해 영향을 갖는다.
이 데이터는 rs10757278 대립형질 G가 CAD보다 죽상경화성 질환, PAD 및 LAA/심장성 뇌졸중에 대해 더 작은 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 대조적으로, 두개의 동맥류 질환, 죽상경화증과 더 약한 연관을 갖는 AAA 및 그와 같은 관계를 갖지 않는 IA에 대한 효과는 CAD에 대한 효과와 유사하여, 상기 변이가 이 동맥 표현형(arterial phenotype)들에 공통된 병태생리적 성분에서 역할을 수행한다는 것을 시사한다. 이는 CAD, AAA 및 IA의 발병기전에서 핵심인 것으로 확인된 비정상적인 혈관 리모델링 및/또는 복구(vascular remoelding and/or repair)를 포함할 수 있다(Chatzidisis, Y.S. et al., J Am Coll Cardiol 49:2379-93 (2007); Hashimoto, T. et al., Neurol Res 8:372-80 (2006); Moore, J.E., Jr., et al, Atherosclerosis 110:225-40 (2006)). 따라서, 염색체 9p21 상에 있는 서열 변이 rs10757278 대립형질 G 및/또는 rs10757278과 연관 불균형인 변이는 하복부 대동 맥, IA가 발생하는 윌리스 환, 및 불안정하고 파열되기 쉬운 죽상경화성 플라크를 발생시키기 쉬운 관상동맥(coronary tree)의 영역에서 우세한, 불리한 상태에 대한 조직 반응의 유전적 결정인자(genetic determinant)로 작용할 수 있다.
Figure 112009057317769-pct00003
Figure 112009057317769-pct00004
Figure 112009057317769-pct00005
Figure 112009057317769-pct00006
Figure 112009057317769-pct00007
Figure 112009057317769-pct00008
Figure 112009057317769-pct00009
Figure 112009057317769-pct00010
Figure 112009057317769-pct00011
Figure 112009057317769-pct00012
Figure 112009057317769-pct00013
Figure 112009057317769-pct00014
Figure 112009057317769-pct00015
Figure 112009057317769-pct00016
Figure 112009057317769-pct00017
Figure 112009057317769-pct00018
Figure 112009057317769-pct00019
Figure 112009057317769-pct00020
Figure 112009057317769-pct00021
Figure 112009057317769-pct00022
Figure 112009057317769-pct00023
Figure 112009057317769-pct00024
Figure 112009057317769-pct00025
Figure 112009057317769-pct00026
Figure 112009057317769-pct00027
Figure 112009057317769-pct00028
Figure 112009057317769-pct00029
Figure 112009057317769-pct00030
Figure 112009057317769-pct00031
Figure 112009057317769-pct00032
Figure 112009057317769-pct00033
Figure 112009057317769-pct00034
Figure 112009057317769-pct00035
Figure 112009057317769-pct00036
Figure 112009057317769-pct00037
Figure 112009057317769-pct00038
Figure 112009057317769-pct00039
Figure 112009057317769-pct00040
Figure 112009057317769-pct00041
Figure 112009057317769-pct00042
Figure 112009057317769-pct00043
Figure 112009057317769-pct00044
Figure 112009057317769-pct00045
Figure 112009057317769-pct00046
Figure 112009057317769-pct00047
Figure 112009057317769-pct00048
Figure 112009057317769-pct00049
Figure 112009057317769-pct00050
Figure 112009057317769-pct00051
Figure 112009057317769-pct00052
Figure 112009057317769-pct00053
Figure 112009057317769-pct00054
Figure 112009057317769-pct00055
Figure 112009057317769-pct00056
Figure 112009057317769-pct00057
Figure 112009057317769-pct00058
Figure 112009057317769-pct00059
SEQUENCE LISTING <110> deCODE Genetics <120> GENETIC SUSCEPTIBILITY VARIANTS ASSOCIATED WITH CARDIOVASCULAR DISEASE <130> 2507-PC00 <160> 94 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tttcgcaatg cttattttca atttcttcag aaatgcctta aagatattaa tggaggtaac 60 aacttaatct caaatagtaa tccatagaca gaatatgtaa magcaatgtt ctctgatctg 120 ttctttggct tctattccct agagaaatag ttctctaaga ccaaacagtc tatagataga 180 attgtagcaa cagtcaatta t 201 <210> 2 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtggagagaa aatgattata ctttgagcta tatggctcca ataaacaaag atagatccct 60 caatttaaat ttgatcctca gaaaactgag ggtcagagaa yccctcaggc atgacgggat 120 aatgtgacag ttaatttggt atgtcaactt ggctaggctg tggtacccag tgtttgagtc 180 aaacaccagt ctaaatattg c 201 <210> 3 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 agtactatat tacactgttt tttttgtttg ttttgttagt tttttttatt taaagcaaac 60 ctcaaacatt attgggtatc aattaccacc tggttgtatt raaatagtaa cttatcaatg 120 ccatgtaaaa attaattcca ttttcgaagc cacctggcag acaggtttag ctgtttcatc 180 agcagcctaa tatatactgt t 201 <210> 4 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cattatactg ggtcatgaaa aattatccct tgaaatagat atgaaacatg ttacttcatt 60 tctggtttaa ataacttgtg gaatctttcc taatgacaac ytgatattaa gggaaactaa 120 agaaaatgtt attgtggatc ccacagtact atattacact gttttttttg tttgttttgt 180 tagttttttt tatttaaagc a 201 <210> 5 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tgatacaagt tatgaaactt gtgaagccca agtactgcct ggggatgaat ttaacttgta 60 tgacaggtgc agagctgtcg ctttcagaca tcttaagaaa sacggagtta ttttgaatga 120 ctttctctcg gtcacaaggg agccaccaac gtctccacag tgaaaccaac tggctggctg 180 aaggaacaga aatcctctgc t 201 <210> 6 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 aaataaaaat aagatacctg acaaagtggg tttaaatagg taagagtgca aacaaagatt 60 tactgtacaa atatgatgaa actgggatct cagattctta hagtataatt tttttttgtc 120 ttatgtgtgc caggttgcca ctctcaatct cgaactagtt tttttctctt ttaagggttg 180 tatccataat gcaaaaatgg a 201 <210> 7 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gtccaagaca aatgtgctat tgtattacat gtgaaatgtc atctttgaag tctggtaagg 60 gtgtgctgtg aggtgagcca tctggaaaac acagtgtaga ytgaaaaata attataagcc 120 agtttattac ttttttccag ttaagcctac catgacagct gctaaaaaaa acactatgta 180 gtataaaggg taaaaagact c 201 <210> 8 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggggtgcagg ttgttggtgt ggccacactt cttcttgcgg caattgacag cataggggtg 60 caggagagca tagcgcttat ggcagatcat cttgtttcag ytgtatttct aggtgagctg 120 gaagagtgaa ggctcaataa tgccacctcg caggtgcagc accaggtgcg gggtgggctg 180 tttctggacg ttgtagtctg a 201 <210> 9 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tcttaatttt tacacatttt acttttcatt tctttttaaa ctgttattaa taatttattc 60 atttgaataa ggattaaaat aaggctagga tattgaaatt ygttgaaatt gctacagtct 120 cttgtatctc tctctctctc ttttttttct tataagggac aggtttcatt caccttgtcg 180 accaggctgg agtgcaatac t 201 <210> 10 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tgtgattcta gcagccatgg ataattattt catagattat tattttcttg gggatggcaa 60 aatggtgata ttctaatttt actattcctt catttactag stggaatgtc tttttaaatt 120 atttatttat ttatttatta tttgagacag agtcttgcac tgtcacccag gctggagtgc 180 agtggtgtga tcatagctca c 201 <210> 11 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tgcgcgcctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcgt gagccactgc gcctcgccaa 60 cttccttatt ttaaatgcca tttcccacta aaaataaaac magtaattct ttgaaaaaaa 120 gttaatatta tgtataggac tggaagtata taagataaaa ctggaatata ttgtcatacc 180 agaaatcaaa gattttgtca a 201 <210> 12 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 attactgatg tgacaaggta cacaagccaa tgttgacata atgttttcaa aatggggtgt 60 ctgctgtaac tgaactaaat ataataactt tattcaagaa ygagtttcaa tgataggaca 120 aaacttgata aaatgaataa ataaataatt atatgccaga gttcagtaaa ccctgtgtgt 180 acacctgaaa aagctcaaac t 201 <210> 13 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gaacagagca gaagagagtc tggatacaca aatttcacaa ttattggctc ccatcaacat 60 atctaactca agcataaagt tgtttcagca gtagtttaag yttggttact aatgcaacac 120 ctctttgcat gcaatggccc attaaattat cttcaacttt aaaaggttcc tttgttttta 180 aatgcttata atgaacaaat a 201 <210> 14 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 tatgtgatgt aaagagcgcc aacatgttta tatcctccta tttcaatcta cttttacttc 60 atctacattt ttagcaataa tgtgaacatg aaatcttgaa waattagcta tctgtaatat 120 atttactcat ccactcaaaa tattgagccc ccccaataaa tatcatacac tatattctag 180 gtacaggtga taaacaattc a 201 <210> 15 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 ccagtgaaag ttagagagag gggtctagag ctcagggagg agtgtgtatc cctaatttag 60 actaatttgc attaacagct gtagtaatgc aattttctct rtactgaaat gcagacattt 120 gagtatagaa aattagcaga catttgaata tagaagaaag atttactttc cttcagaaaa 180 agaatagtag agtataaaga a 201 <210> 16 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 tcgtgccact gcactccagc ctgggtgagt tgagagtccg tatcaaaagc aaacctacac 60 atttttgtgg cctgttttta gctctatcaa gtcagttaca wtcttctgta ttctagcttt 120 tttatctgta agctcctgca atgctttatt agaattttta gttcctttgc attttgttac 180 aacatactcc tataactctg c 201 <210> 17 <211> 169 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 taaaagaaaa aataatccaa atgtcagcaa cctcaaagat tgaaggtaga tgagcccaca 60 aagataagaa ataatcagca caagaacact gaaaactcaa wacatcacct ctctggcaag 120 cgttcagtac caggctgagg ctgagatggc tgaaatgata gaagcagaa 169 <210> 18 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 caagaccact ctgcagatat caagtctgaa aattccccta gggccaaagt ctattatggg 60 agcaagttga gcctagaggg atcgccatcc ctgtccatgc wctgctgtag acactcctgc 120 actaaaccct ctgggctcca catcagctgg cttgctgctc taccactttg cttgtctctt 180 gggggctcca ccccagagag a 201 <210> 19 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gtctcttggg ggctccaccc cagagagatg tgggtcagca atcattcagt tcaatcagcc 60 caggatggag agtctgtgct atgggcccaa gccaggggct stctgtctgg tgacgagcag 120 ctggggggtg gggtgggacc tgtgggagat ggactggcct cctctccttg agtcaactgc 180 tgcttattgg aggtgtggat g 201 <210> 20 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ccattgcaga ggtagtggca gagaggcttt cagttgtccg tggcggctct gtccagggag 60 ttgctgagtt gctattggct tgatatctct ggtggggtgt rgctagaggt ccaggcctgg 120 aggacctgct cgttgaagag atgtgggaat gggcacccac ataacagtct gttcactttt 180 ccatagggct gctgtagtat g 201 <210> 21 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 ggggagctta agcaggggtg gaaggggaac cccagcacag aacagctgcc cgacaaaaat 60 gtggccacac tgcttttttt ttttttttag caggtcccca rtcccgttcc tcatcactgg 120 gtagagtctc ccatctgggg tccccggcta ccccaactgg tgttctctga ctgagagagg 180 tttcagactt ccatgggacc t 201 <210> 22 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tgggcaaaag tagctgcgac tttggcaaag ctggaggtta gacccccaaa cataccccag 60 gaggttagac tcccatacat accccagaaa agaggctgaa wccagcgaga tcagcagaga 120 aggtctacag gccccacttc cacagcgcct cacaggataa gacccactgg cttggaattc 180 cagctagcca ccagtagcaa c 201 <210> 23 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 aagtggtaag tgaatgcgca actctgggaa tccacactgc tctcacagat ctttgcaaac 60 ctcagatcag gagatcccct tgtgaactca ctccattagg sccttcacac acagccacgt 120 ggagtctcag cagagcagcc actcaggcat gcatggagac ccaagagctt tagctactcc 180 agctttctgg gtgtctgggc a 201 <210> 24 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 cttaacagca aagtatcaga ttcatttata aaacaatgtg actgatcttt atgtatggtt 60 tgtgaaacat ttatgcagtg tcacttcaga aaactctgcc rttatagatt tgaattgatt 120 aaggatatcc actcctttcc ttggcatgat acaaataaat tactaaagta taattgtaac 180 aatgataaat ataagtgaca a 201 <210> 25 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 caccctttgg ggaaggggat caaaatatag tgattttcta attctaagat tcgttctgtg 60 tatattagct gctattcttc tagaaagaag actttcacca ycgtcccttg gatttttttt 120 tttaattttt gtatggttta aattgcatca tcattctttt tgatgtccaa attgtcccaa 180 attaagccag ttagagaaac a 201 <210> 26 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 taatgggatt cctgatggaa tgtttagtct gaatctaatc acatagagac ttgtctgaca 60 aatccagatt ttttggatgt tttgcaggac tatttgccac racatttcaa aggattccaa 120 gagagaatat tggtgtccat gctgtgatga ttcctcagct cctctcatct gatctccgtc 180 ctggccccca tgactttctt t 201 <210> 27 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 ctcttctttt atcacacaga cctgaaagat gatggtttcc caaacagcac ttacagcaat 60 aggtgtgggc ctcagtggca cataccacac cctaactacc rcaaagaaag tcatgggggc 120 caggacggag atcagatgag aggagctgag gaatcatcac agcatggaca ccaatattct 180 ctcttggaat cctttgaaat g 201 <210> 28 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 caaatctttc cctaagggag atttcagatg aggcccccag ccttggtaga caccttgatt 60 gcagtcttgt gagagattgt gaagcagagc tattctcaga rttcatgggt gttttaagct 120 atgaggtttt ttttgggggg agaatggtca tttgtgattc agctatacat aagtctacaa 180 aagtcattcc agaagtgatt c 201 <210> 29 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 tggggctcac aaccacatga ttctacctcc actgaatcac ttctggaatg acttttgtag 60 acttatgtat agctgaatca caaatgacca ttctcccccc maaaaaaacc tcatagctta 120 aaacacccat gaattctgag aatagctctg cttcacaatc tctcacaaga ctgcaatcaa 180 ggtgtctacc aaggctgggg g 201 <210> 30 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 tttttatagt gtgactcatt tacatatgca tgtgtatgtt taggtgctat tattaaattt 60 tgctggcata tagtgaggaa attgtgattc aaattcgtcc rtatgtactc ctcccccacc 120 atctgctctg cccctccatt taccagaagg ctagctttag ctacttgtgc atgtaaaaca 180 gaagcaagca acactgtgaa a 201 <210> 31 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gaacatagat actccttcat tcatgtattg tctatgggtg agtctttatt acaacagcag 60 agatgagtag ttgtgacaga aactcgatgg ccctcaaaag ygaaacaagc tactatcagg 120 acctctatag aaaaagtttg ccaacctcta cactgtagta tgccttaagg atttttagaa 180 gattgagtat gataaacact t 201 <210> 32 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 gaagggatga tcagtccttc cctcctctat tttcttgagc cccgtttttc acctttcttt 60 ttctctctcc tttcttatca tgaagaataa agacaaatga kaacagatct accttaggct 120 gatacagggc agggaatcca tttaataata aaacgtgggt caaaattcac ttttctcctt 180 ttgaattgaa attatattgt g 201 <210> 33 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 atttgatgca acttacacac tgttgttata cctctagaat taaaatgaca attttttaaa 60 taattttggg gggcctagat ttgctattta acctatcaaa raattgtgtc ttacagtatt 120 attcaaatgt agtgtgtaaa gacttatact attggtccta agcactactg gttgttttag 180 gctttttctc tttctctgta g 201 <210> 34 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 acatttatat aattaagatg ctaacactga ctgacagaaa tgtcagtaag atgaaatcag 60 actgcatggg agttttatgt tacattaatt tgtaaattgt rtatctctgt attcatgtga 120 gtgtggctat catgatgtta gacatccagc tacaaaggag gcattcgtgc acacacacag 180 tctccaatct tctgtttacc t 201 <210> 35 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 tagacaaagt ttaatgttcc cttttatatg ttttcctggt aaacaaaaat tgtctcaggg 60 ttattatgca tatatgatat tgtcaagaaa ctttctgggt rctgtggggc aaagtcttct 120 ccataaataa gctagggttg attggagttt tcactttgaa aaatatcgca caggaggatc 180 tcaacagcta gacaatttcc a 201 <210> 36 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 aaattaaatg acatacgtaa agtcctcaat aaataatagc tcttattacc attgctatgg 60 ttactatcac tatttctgta ttttcttttg ccattcctca ygcttgaata tgaatctcat 120 gggtagagtt tcccaaagca tgatatgtgt agtactacta aaggcaagat tttgggtgca 180 tacagacaaa aaaataattt a 201 <210> 37 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 aaaccagagg agtaaaattc tactttcacc agtaattagc agtgtggagt tgagtaaata 60 aacctctcta agtctcagtt tctacatcta ctaaatctaa rcaaattcaa aacagtgatt 120 atttcattag attagatatt ttgattagtc ttaaatgtct aatatataat aaacactcaa 180 caggtagtag ctattctatg t 201 <210> 38 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 tcatttcttc ttttaaggtc ttaatttctt gtttttcgag tttcatggga gatatccagt 60 caccaatcca atccatatcg gggaaaagta caacaaatga rtgaaatttg taaccaacct 120 tggatgatgg aataagacat ttgggagaac acaggagaag tggggaggtt aaggagggat 180 agctctgtga aaattttgca t 201 <210> 39 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 aactaattct ccaaatttgc aatttggcag catcctactg ggactctaga aggctgataa 60 atcatggaga gtaggtattc atataggaac tatgaaagct statgtagta aacactactt 120 aagaaggcct tacatttcat aaaaagttgg agatttttgt ggagactcat aaaatgcatc 180 ctttatatca gtgaagtttt t 201 <210> 40 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 actcgtagcc agagctacct tccagatgac ttctttctac cactttcttt cttcccagtg 60 taagagaatg caagtatatg ctgatgtttg gagcaagaac rttcaaaaat tttcttatta 120 acataacttc taatggaaat acagtatact actatggtgc atacaaagaa gaaatagcaa 180 catatatttg ttttagacct g 201 <210> 41 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 ataagcagcc ttaaattaaa aaaaaaaaag ttaactcata actaactgtg tgacctggga 60 taagttactg accctcttta gggcttaggg tcctaatctg yaaaacggaa attataataa 120 taaccttagc tagcatttct tgtgcacata ctataagctg gtgataaaca atttatacac 180 actatctcat ttaatcctca c 201 <210> 42 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 tccaatgcaa aagaataata ggagcaaaag cacagtggtg agaaattgga ggggaactgt 60 gaaaattgcc acatagatta gaggcaggaa aataaaggac rgctaagttt atatagtgaa 120 cagtgagccg catggacaca ggtgactgtt ttctcctttt tgaacccctg cttactccag 180 agtcaccacc tctcctggct t 201 <210> 43 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 tattctgagt attaattcct gtttccaaat agattactct tttaaacata gcactactac 60 ttacctaatg aaatttagtt gctattaatg gatgaatttt ktatctaaca ggcttgattt 120 tgattatgca ttttaaatgt cagtcagaca catattaata atgatccatg tttgtagcta 180 ataggcccaa tatatacttt t 201 <210> 44 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 gtaagggctg ggacaaataa acacaagtaa ttttcaaata tattaataat aatattctga 60 gtattaattc ctgtttccaa atagattact cttttaaaca yagcactact acttacctaa 120 tgaaatttag ttgctattaa tggatgaatt ttgtatctaa caggcttgat tttgattatg 180 cattttaaat gtcagtcaga c 201 <210> 45 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 tggtggtcct aaagtggcat taaggagcca ataaattgtc attcctacct tagctctgtg 60 tcagatgaaa tacacagcat agtgtgggga gaaaatgttg rgcttattgg ggatggggtc 120 tttcacataa aggaagaagg tttcagaagg catagtggta tgaaaagagg agaaaccaaa 180 gggaggaagg tcaataaagg g 201 <210> 46 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 cagcatagtg tggggagaaa atgttgggct tattggggat ggggtctttc acataaagga 60 agaaggtttc agaaggcata gtggtatgaa aagaggagaa rccaaaggga ggaaggtcaa 120 taaagggtta agaacgaggg gaggcaaatt gactttcttt cagcatatga ggattatagg 180 aatggaaacc ttaattggaa t 201 <210> 47 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 gaggatttaa tgcaattgtt tgtgggaaag cactttaaca actctaaatt acgatatata 60 tgctaggttt tattgttacc cacacctttg atgtatttct stttgtactc ttcactgtat 120 ctgtaacaca ttccctagga taattagggc taccctttaa caaagccaag attctattta 180 tagtggtaag ctggcacctg g 201 <210> 48 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 cttctgctat tgaacgaact ttttgttaag gtagctccca agcaggttca gtagctttgt 60 tctattatca cttttctact gacagtgatt tttttccttt saaggcctgg gacatggaga 120 ctgcttttct gcagaaacca catcccttgg agtaatgagc tacacctacc tcaattattc 180 agtgcagtac aacactccag g 201 <210> 49 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 acattgtgca catgtaccct agaacttaaa gtataataat aaacaaaaaa aaccactgca 60 caatctctag tattcagatg gagactaagc atgatttttc wtataaaaga gcagatcaga 120 atgttgtatc ttttattcag aagactggag ttaatcactg ttatctttag tacttagtgc 180 tgccaaggct gtgtgttcac a 201 <210> 50 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 acagagtgct tatttaaaga aaaataaaaa gaacacacac acacacgcac gcacacacac 60 acgcacgcac acacacacac atgtagctac atgtctagga rggatgtgga gagctgaaat 120 atgaaggcaa aataaaacat ctttttcaaa gtatacagcc tacagtggtt agcacagagc 180 tggccacata gcaggggttt c 201 <210> 51 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 caataatgta gaagcaaaga gcctaaagtg ttttcataaa tcttaagtgg tagctttatg 60 ttccagttca gcaaaacaca aatttgaagg caatctgtac rttagggttc aggtgaagaa 120 ggcaaaggaa tcaatgaaat tgtaaaagct ttccaaattt gccttttctc ttaagattgt 180 ctttctctca ttctcttctc c 201 <210> 52 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 tttctgtagc agaagtgtaa gggtgttact cgtaggaggc ctctattgaa ctcttttcca 60 gtgacgtagt gtgtggtctt taagtggctt tgcaatgata rtaagatcag cattgcatta 120 ctgaatgagc tcctttagta aacgtggata tgtgctttct gaatctattt gtttgttttt 180 cccaagtcat aaacagtgaa t 201 <210> 53 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 ccatttagag tacttgcctc tgagggaaat aaaaatttgc tagcaatttt ctctaaatga 60 cattatcata ggcacttaat tccttgatag gttcttttag rtaatttttt tataatgaag 120 caattaattt gattcacgaa agtaagtttc tagtttatat aaagaccaga tctggcctat 180 ttcttagctt gtctacattt g 201 <210> 54 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 tgctagcaat tttctctaaa tgacattatc ataggcactt aattccttga taggttcttt 60 tagataattt ttttataatg aagcaattaa tttgattcac saaagtaagt ttctagttta 120 tataaagacc agatctggcc tatttcttag cttgtctaca tttgagtagt tccattgctg 180 gaaaatgacc ctggagcttt t 201 <210> 55 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 aagttgctct caacatactt aaagttttcc aataactgaa ttaaatatca gtttatcagt 60 ttaatataaa caattagggt aaatgaaaat aaaatttcag ytctttggtt ccattagcca 120 tggttcagga gcagaatagt cacctgaggc tagtgacaac gcttttggat cacaggaaag 180 aagaaaaaaa atcaaaataa t 201 <210> 56 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 ttataactaa tgaggcaatg tgtcttgagt attttgaatt aactctctag aatcgattct 60 tggggaggtt atttactttg aagtgatgga cagagtgtag kagatttatg agtgaactct 120 tgtctgattt ggaaatatag agttgtttag gctaggtatt accaacccaa agttgacact 180 tgagtcacct aagttcttct c 201 <210> 57 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 tattagttgt gtaatcttga aaaaatctct gacacttttc cctctgactc agtttcccca 60 tctggcaccc aatcttttac agtgttatga aaaataggga raatgtagaa aggaagaaca 120 tggcacccaa tccttaatgg acactcagtg aaagctggct atcatcatca tttttggggt 180 tgttgtgttc tacaaatgta t 201 <210> 58 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 tccccatctg gcacccaatc ttttacagtg ttatgaaaaa tagggaaaat gtagaaagga 60 agaacatggc acccaatcct taatggacac tcagtgaaag ytggctatca tcatcatttt 120 tggggttgtt gtgttctaca aatgtatttt cccaggagtt ttttttactc tgtctcctct 180 ttccttcata tacccccagc c 201 <210> 59 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 tgggaaggat gaattaatgg gatggagtgc aggggatgca gagtgcccac ttatggaatg 60 atttcattca agagagacag gagggtcaga ggtaagaatg ytaccgctgg gacagagagg 120 aaggtacaga tatgagatat ggtaagaagg tatactacaa cagtggctcc caaatctcaa 180 tgagtagcca gttctcatgg a 201 <210> 60 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 tttgagccca agtctctttc tgactctagg cttagagctt tagggctatt tcacaaaagg 60 gctgttccta ggtcaggcat gacaacttct atattacctt ygtaaaagaa gcaatataat 120 ctaccactat taaattttgc aggttaattt tatattatgt ttaaatacag aaaactttat 180 ttaaaactca gttgaatttc t 201 <210> 61 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 gaaactggat ccctgatgac attgaaccat tgactgaatc taccctggaa ccatcaggaa 60 ataatcctta gttttttaaa gatgctttta gttgtgtttt ytattacaag tacctgaaag 120 catcctaact aatcaatgct aaatgcatct ctcacagttt atgcttattt ttcagaaatg 180 cctagtggaa atttctattg c 201 <210> 62 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 tccttccact gactgagact atttccttgc cacaatcaga agaactaaaa gaaaggagga 60 tatctgttaa tatatgaatt tatctaaatg tcatgcagtg rcttctaaaa tcatctggtg 120 tgctctgttt ccccttggag gtgacttagg cctggcatcc caaacaatac atactggagt 180 gaagctccag gaaaccctga g 201 <210> 63 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 atacatactg gagtgaagct ccaggaaacc ctgaggagaa gagaagggct taaagagcaa 60 tcagccttcg attgctggga ttatgaaagg tcgtaagaag ygaatgttgc aatgttttat 120 tatacttgat attgaagcaa ggacaagtaa taatttatta ttctctccat gtcagtggta 180 tttacctttt tggaatcatg t 201 <210> 64 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 ataaaaataa aataaaataa aaaatgaaaa acaaagtcca cttgtaacca catgtcagta 60 gcatgtttgc tttcagggta catcaaatgc attctatagc rcaggatgtt ccagtcactc 120 taacaaaaga tgtcctgttt ggaacaccaa ctctgtatca gttacttcag acactttctc 180 tcattgagtc ccttcagcaa g 201 <210> 65 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 aaccacatgt cagtagcatg tttgctttca gggtacatca aatgcattct atagcacagg 60 atgttccagt cactctaaca aaagatgtcc tgtttggaac rccaactctg tatcagttac 120 ttcagacact ttctctcatt gagtcccttc agcaagccct tttaggttta tgttcttaga 180 tgaggaaacc aagtcttaga a 201 <210> 66 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 atattttctt gtttttagat gcacatatac gtactttttt agctggtcat ttctttctga 60 aattggaatg aatcttacaa tcaatggcat gttataattt mattggcagc attatttgtc 120 tcttaagggc ccccaaataa tagtgtgtca cataactgat agcatctcaa attagatgaa 180 atacagtagt ccaggcaaga a 201 <210> 67 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 gttatgggat aaaggcgata gtattttatt gactatattt tattctttta attattcctc 60 taatttctta aaacaacttt attgaggtat aacttccacg stataatttc acccatttta 120 agtgcatgaa ttcagtgatt tttagtagag tcattgagta gtgtaaccat tcctacaatg 180 gttatagcac atttttatca t 201 <210> 68 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 tgttttcttt tatttttcct tctaaaataa tcacacgttt cattgcaacc ctaaccctct 60 tcaacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca yggcttctag attctacatg 120 tacaagagtg caaatcaaac taccatagaa aaactaagaa gagaggccta gaagcaagag 180 gctgatacac tatctcaggc t 201 <210> 69 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 aaccaacact taaaatgcag ggaatttaag ataaaaattt gataaaaatg ggaagatttg 60 gccgtattgg gctcatggta actgagatgc atctgaatga yaggcattcc tttgaattgc 120 acatttgctc ttgtttttac tataggccac tctcactttc tgtttttttc cccggctttg 180 aaacgatcag ttttagtact g 201 <210> 70 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 atgactgggc aattatgtca ttatcaccac tgatatatag ctggaagagt ttagtgttgc 60 cctgctaaga tctggatttt cttttctgga gcttggctat kggggcattg agaagtccag 120 ccaggaggtt ggtcagaggc taacccaaaa agctttgctt aactctgggc tacagctggg 180 ggttgccaga gagaagtgcc t 201 <210> 71 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 aatttatttg agtagacagc caaccccctg tattgtactc ctttaaaaaa tattttaggc 60 tttttaaatg ctgaggcaag gggacatacc aaacactaac rggcacattg gggttttctg 120 gctattgaaa taaaaatgtc cttacataac actgatgtac tggaatagca ctgcgttcca 180 gtgacggtta ttgcaactca g 201 <210> 72 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 ggagcatgat gtgctttgat ttcaactatg ggctttatta cttactaact gggttacttt 60 ggttaagttg tttgactctt gttttttgag atggagtcag yctgggagac tccagctctg 120 tcgcccaggc cggagtgcaa tggcacgatc ttggctcact gcaacctctg cctcccggat 180 acaagcgatt ctcatgcctt a 201 <210> 73 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 ctggcacaaa gtaggcactt catatataaa agctgtgatt attgatgaac cagtagtgag 60 gtacataact ggggaaggag aaggggccag tttgtgggaa wgctttttta gttattaata 120 gtaaggtggt aaaataataa tagtaataat aaccaaaagt tactgaaaac taaatacagt 180 gctaaactct ttaaaaggag t 201 <210> 74 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 cttctttagc tgtaaataag taattgtatg aggtgatggt taaggtgatt tactaatttt 60 acaattctat tattttatga atagacccta gttaggatag yttgaaatag atacttaatc 120 cactattatt ctctcttcta agatatagtt actagttgat catacttttc cttaaaggct 180 gaactgaatt ctctgatatc a 201 <210> 75 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 gaaacatact ggttaatgga attccagaaa ggactgaaca atcaaaccat tttgaaggac 60 agcatagagc tggactctag aacagccaaa acaaggggtt maaccactgc gagggatctc 120 tctccaactc ttgctcaggc ttttctccct ggcttgactt tcttctcttt cactgtagat 180 tggcttctct cacatggcaa g 201 <210> 76 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 tattatgtgt ggctgactat ataaaaacat ggatattttc ttggaatcac ttggtttgac 60 tgggagaaga ccattctcaa aacaaaggaa gtgcaattta yagaaggtag tagaataggc 120 agataaaaca ataattcttc actatattgc tcaaataatc cccatgacat ttttagtata 180 ttataaagag agttctaaag t 201 <210> 77 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 gagaaagatg ttaagatgaa attagatgtg caagagattc gccgaggtaa accttgtggg 60 agaaaatgga gaggtacata gaggagcctg ggcagactgt stggctacta tgtaagactc 120 atccccatga aggagaaagg agaggaaggc aaagaagaaa aaccttaaga tttcaattct 180 aagaacgttt tgacaaagct g 201 <210> 78 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 tgtgcaagag attcgccgag gtaaaccttg tgggagaaaa tggagaggta catagaggag 60 cctgggcaga ctgtgtggct actatgtaag actcatcccc rtgaaggaga aaggagagga 120 aggcaaagaa gaaaaacctt aagatttcaa ttctaagaac gttttgacaa agctgattag 180 gagtatttaa ggcaaagctg c 201 <210> 79 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 aaatacttta actcatggcc cgatgatttt cagttaacca aattctccct tactatcctg 60 gttgcccctt ctgtcttttc cttagaaatg ttattgtagt rtttgcaaga tggcctgaat 120 cctgaacccc ccatcttcaa tgagcaccaa atggtaatta tagattccca gctgtagagc 180 tatgtcagac aaaggaaact t 201 <210> 80 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 ctcttccttg gtggcttaaa gttaggctga agaagattta cattatgttg tgcatgacct 60 ctttagtttg gttctactta tactttcaag gagggaagac yggggaaggt gtcccttagt 120 gagcatattt tgtacaaatg aaaacagggt actaacactt atgccaggac gcatgcataa 180 actaggatgg ttctgagaaa a 201 <210> 81 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 agaaccttaa tgggagcaca ggtcccaccc accccttgct accccatgta cttgttccca 60 tcttcaccca agagaggaaa cactctggaa ctagggcagc wtaagtgaag cagagtgaaa 120 aggaatgtga agttttgaga agaaagaaaa ggctaaagtg tctatctttc cacattgctt 180 ttttcaggtt tctcttcgga a 201 <210> 82 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 gatgaaaaat tcatattcat ctgaatttta taagtgaatc atgagaactc aaagatactt 60 agcccttggg accatttttt actcctgttc ggatcccttc rgctaagcat gattatttac 120 tattttcagc tattagttat gtcttgttga aaaagtatga aaagagctgc ccaataaatt 180 agagtgtatg ctcaacattc t 201 <210> 83 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 ttcggatccc ttcagctaag catgattatt tactattttc agctattagt tatgtcttgt 60 tgaaaaagta tgaaaagagc tgcccaataa attagagtgt rtgctcaaca ttctcttagc 120 ttctttatct ctttccaaaa ttggatcaaa tgacattgga catgatcaac ttcttactgt 180 tttgacaaac atctgaggat a 201 <210> 84 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 ttatttacta ttttcagcta ttagttatgt cttgttgaaa aagtatgaaa agagctgccc 60 aataaattag agtgtatgct caacattctc ttagcttctt yatctctttc caaaattgga 120 tcaaatgaca ttggacatga tcaacttctt actgttttga caaacatctg aggatacttt 180 tataattgat aatttggact a 201 <210> 85 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 ttttgtgcct cagtttcctc attcaatatg ggtgtaataa ctgtgcctgt cttgtaggat 60 tattgtgagg cccaagtgca ataatatata gtacactgtg yctggcatct agtaagcatt 120 cattaagatg acatgaagat aacacagata tatcttaaca tgtaattatg attttgctta 180 ttcaaggcca agcattccaa t 201 <210> 86 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 gaagaagaag acagtcagag agaagtgagg gcttactttt catgtttaaa gtctgttatg 60 tggtaaaggg attagattta tctgtgttgt tccaggggac mgaaatagga caaatggatg 120 caaatagagt gaggaagatt taaaacaaat ggagaagaca ttctaaaatc aactacaatg 180 agcgtaaaca atgacaacgg a 201 <210> 87 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 tcatatgcat agacaaatac accaaactga tgaatatttg ccttgtataa tctttttgta 60 gtttttttat gaacatatat tactcaaaca atttagaaca wttggcaata tatatatatt 120 tcatttataa aaggttagga agattaatta cactttctga ggtcgcaact aaaagccaag 180 attttaatcc atttctattt g 201 <210> 88 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 agtgtcactg gaaagtgaca aagaggacag ttaagttagt tggaactgaa ctgaggccag 60 acagggctgt gggacaagtc agggtgtggt cattccggta rgcagcgatg cagaatcaag 120 acagagtagt ttctccttct ctctctctct ttaattgtaa cgccttttat aacaaacaaa 180 tattatgctt atttctgtct t 201 <210> 89 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 cagttaagtt agttggaact gaactgaggc cagacagggc tgtgggacaa gtcagggtgt 60 ggtcattccg gtaagcagcg atgcagaatc aagacagagt wgtttctcct tctctctctc 120 tctttaattg taacgccttt tataacaaac aaatattatg cttatttctg tctttaaatt 180 ttttgtagta atttctcatc a 201 <210> 90 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 ttttctagtt gagctatcat tcatatttat tatgtggaac tagaggtagt cctggctact 60 tgggaacagc gtggagtcta gccatgtcag ggccagaagt sgtctcagct aagttagaat 120 gtgataccat tgtttacaca agtgtggcct gccttcaaga tagggtgagg tgttttatga 180 ccacaggctt tatgagttat a 201 <210> 91 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 tgactctgaa gatcataccc gaagtagagc tgcaaagata tttggaatat tggtaatatc 60 caataaagaa tgaccttcat gctattttga ggagatgttt maatgtcgaa ttattgaaat 120 atttataaaa tacaaataaa ctaactctgc ttcatattcc aacttgtgta tgacacttct 180 taggctatca tttcattcca a 201 <210> 92 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 ttccaacttg tgtatgacac ttcttaggct atcatttcat tccaaattta tggtcactac 60 cctactgtca ttcctcatac taaccatatg atcaacagtt saaaagcagc cactcgcaga 120 ggtaagcaag atatatggta aatactgtgt tgacaaaagt atgcagaagc agtcacattt 180 atacagtagt gaaggaaatg t 201 <210> 93 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 aattacagta tatctaaaaa aagaataata tataacaact gaaaaaataa aatagttgat 60 ataagcagat attccaagat ctgccagaca tattgttaaa ygaaaaatct agatacaaaa 120 ttgtttatag ttctctttca tactatagcc aaagaaaatt cagaaaaaac tacttacagt 180 tgatccttga ataatgcagc a 201 <210> 94 <211> 229836 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 gtaaactcaa aattctcttt ttttgggaaa atgaaaccaa gggagctaat cagagccaaa 60 ccccatgtac ccaagtgtta gcaggcatga atgtagctac cagctacctg ggtgtgttgt 120 catccttggt atttttgggg gctgtcctca tctcttcttt tgttttgaca tctctacttg 180 tcttaaaacc caaggagcct tctgtgtttg tggccaatca gtttaccaat gcctcctcat 240 taaatggact ggaacttgta ccatagatta tgtacccctg gacatcttta tactccctgg 300 caatctctct cttccagcac caatccatgg gaattctatc ttgcccaggg tgaaaagggc 360 tatccaatta attccccttc ttatgggcct cagcattata gctggtatgg gaacctaaac 420 tgccggaatc tcaaaagcct ccttgaccta tagccaactc tgaaaggaaa tagccagcaa 480 gtttaatatc atggctaaaa cctcaaccat ggccagagca aattaacact ttagcagttg 540 tagtcctcca aaactgtcaa ggactagata tgttaatggc agcacaggga ggaatttgtt 600 tagctttaga tgaaaaatgt tgcttttggg taaatcaatc agtaaaagta caaaacaaca 660 tcagacaact cctaaatcga gcctccagct tacaagaaca agcctctcgt ggttagttag 720 attggtaagg aacctggaaa tgggatcttc cctgggttct tcccttttta ggcccacatg 780 ttagcctcta cttttgctcc tttcagtcca tgtcttcaaa aatctaataa cccaatttgt 840 ctcctttctc tcacctttag atgatcaagt tccagatgat cctcagtgag ggataccatc 900 ctttcaatat tcaagagtca cccttctaca gaggactcct agacttccca tcagtgggac 960 atggcagagg tgaaatcctg cccctgtctc ccttagacct ggctggatac tgcttccaac 1020 aacccatgca gccaccctgc cctgacagct agcaagaggc caagacccac agaacaatca 1080 ccatcacacc tctgtcagca ggaagcagtt acagaagact gaccttcatc cagtttccca 1140 aagaattggg tcatggattt ttgcggggga aaatgttaga gtaggtaatt aggcagacat 1200 gagtaaggga ggagagaccc cctccaacta ggaatgtcag gtgagcatca gatgatcatc 1260 aggtggttgt taaactctct ctctaaaata ataataggtt gcaactggca gcagggaaag 1320 acaatctccc aatagataga aaagtcctga agctggtgat cagcagcttc ctagtaagat 1380 ctcaggattt gggcaagcag gctcaaacat gggcactaag aggcaaaatc gtggagttta 1440 actggtatac agacttcctc taaaaacaca tgactcatgc acatgtggac agcctgcccc 1500 aaggaaaaat caaaagagga gagatgcaaa accccagaag catgccaata tataaaaccc 1560 caagtctaag gtcaaacagg gcacttggat ttctcaagtt gcccacttgg ccctcttcta 1620 agtgtacttt atttcctttc attcctgctc taaaactttt taaatttcac tcctgctcaa 1680 aaacttgcct cagtctttca ctctgcctta tgccccttgg aagaattatt tccttcaaga 1740 tggcaaaaag caagctgctg cagacccata cagatttgct gctgctaaca ggaggataac 1800 ttgagcccag aaggttaagg ctgcggtgag ccttgattat gccactgctc tccagcctgg 1860 caacagaatg agactctatt tttttttctt ttaaaaagac tttttacaaa aggcaaaatg 1920 ataatggaac taaaaatgta cgttgactga cttaactcca actgcttctt ccctcaattg 1980 aaaccacctt tgcaaaaatt ataacagtga gaaaattatg gcagtagggg tgatctgatc 2040 aagccaaacc ccatcttgcc tttagccttc aagctgccca taattattcc tgggcttagg 2100 ccaagctaac tttgggagac acttggtcta tagtttaaat gataatagtc cttccttaaa 2160 attcaaccac ctcagcaaag ctgatgagag gccaccaggc aaggaggata gaggagtcta 2220 aattctgcta aggtgtagat ataaacagtt tccagccatt attctggagg tcacaaaatg 2280 tgcaacttct tcaattactc ctgcagataa catcagtatt ttagaaccta agattggcct 2340 tttgagatgt cttttcaggt ttttttgtgt gtctgactac cgatggctcc acctggaccc 2400 accaaccact cctgtggccc catccagaag caactcagca tgcataagga ctatttccca 2460 cacccctatg attgcacccc caaccaatta gcagcaagga cttattgcct aaaacagccc 2520 cattcatccc ccaaaccatc catgaaaaac cctagctttc aaatttccgg ggaagctgat 2580 ttgagcaata ataaaatacg tctcccattt agccaactct acatgtataa aactctttct 2640 ctattgcaat tcccctgcct tgataaatga taaatcagct ctatctgggc agcaggcaag 2700 aagaacccgt tgagtcctta caatatcctt ctttctaccc tcctctgcct aattactctg 2760 aatctactaa ctttttcact cagttatttt tccactttga agacaaaaag ttagaaaaaa 2820 aaatgcctta tgaaattagt ccctcagaat aaaccagctg ggctttcttt agccacctgt 2880 atgctttagt caaaatctaa gctcagaggc aatagtgaaa ggctttctta tcccaaagga 2940 aaactctcag aaatttgctg aagctatcca cactgagtgt aggtatagaa catgctttgc 3000 cctatttatt catgggcacc atcctgaact cagtaatcta gcttttttct tttgaagctg 3060 gatggggaag acacagatct agctgaatta gttgccaaaa tatgctatct ggcataaaga 3120 ttattttgag agagttattt tgagactctt tgtaagagaa atttatatct acaaaggaag 3180 tctccattta taagcttgtc tctctgcatc aggaagaaaa gaaggactaa atcaccagac 3240 actcttaacc aatggagaag gagtttaagt aacaaacctt acctttgttt aaggtgcttt 3300 ttctggctct ctgccattaa gatctacatt ttccaccctg tctcctctag gacctgaggg 3360 ttatctcttt gatatgcaaa tgccagggag attactcacc agaagaagaa gaagaaatag 3420 agctaattgg aaattgagca aataaaaaaa tcttgttttt tctcccagaa acagtgaaaa 3480 gctttagcca tcctttagat aatcttaact tgttccatct gccagaaaca caatttggat 3540 tcagaaattc tttatgaact gtttttgtat tattgtacct ggcacatggc tacagttttc 3600 aaatgaaaac tgtgaaatct gcttctgtct gtattttatg tatgtctgtg tatgcatgta 3660 tgtgtaatat ttttctacct ctagagacta tcctaaaatt aacttataaa gagctgtatt 3720 taattgcctt aaagaaaaag cacttataca aattaagtat tttttaaact ttcagaaaaa 3780 taagacctag cgcaaatgtt cttcaagttg atattgttaa aagaagaaac ttcagccaaa 3840 ttaaacttaa agaagtttaa ttgagcaatg aatgattcac aaatcaggca gcctccagag 3900 ttacagctga ttcatggaga ctccagggat gcctcatggt cagaacaaat ttatagacaa 3960 aaaaagggaa gtgacataca gaaattagaa gtgaagtaca gaaagagctg gactggttac 4020 aggttggtgt ttgccttatt tgaacacagt ttgaacactc agcagtgtct aagtggttga 4080 agtatggcta ctagaattgg ccaagactcg gctattgtta caggaacgta ctcctaaatt 4140 aggttttcaa tcttgtctac ctgttaagtt aggttacagt tcatccacaa ggactcaaat 4200 atagaagtac ggagtccttc tcaggctatc ttcagttctc tttaacagta tgatacggga 4260 taatcttcag taaataaaaa tttctttaag tttgttggat taactaaagc aggcatgtct 4320 tcagagttgt caacattaaa tataatacat acatacagtt tttttctacc aggggttact 4380 aggcaaataa gtttgttatt gtaactagat gtttaagatt ataaaactgt cagtttaatc 4440 taagagcaaa agtgaaaatg tggtagctat tttattaagt acagcggtaa agcaagtata 4500 tattaagtat agcagtaaag caaaaaaaca aaaaaaaaca agtatttaac ttttttttgg 4560 tttttttttt tgagacggag tctctctctg ttgcccaggc tggaatgcag tggcacaatc 4620 tcagctcact gcaacctcca cctcccgggt tcaagcgatt ctcctacctc agcctcctga 4680 gtagctggga ttacaggcgt gcaccaccat gcccggctaa tttttgtatt tttagtagag 4740 atggtgtttc accatgttgg tcaggctggt ctcgagctcc tgacctcatg atctgctcgc 4800 ctcggcctcc caaagtgctg ggattacagg catgagccac caagcccggc cttaactttt 4860 ttttaggttc ttgcttttgt gatatttggc taacatacat atgctgtaaa aattgttaat 4920 aggaaaatat taataatgag atgttgacta gctttgtctg tctaatgaaa tttcataagt 4980 caattaaaat taagaacaat tgaattatag aatagaattc aattgaattc tattgaatac 5040 acttgctgaa tacaacaatt gaattgtaaa tagaatagaa attataaatg aacttttcaa 5100 tagtaattat tttttaatac gggtacttaa aattgtgtca acttcttaac aaaagaaatg 5160 gaggcaaaat tagtataaac agtttatttg ggccaaattt gagaactgca atgtgggaga 5220 cacgtcttca agttgctatg aatataaact ccaattagca gcagttacaa gcggtttttt 5280 ttttttaaag aaggggcagt tctttagttg catataaact attgattggc tatacatttt 5340 tttttaacca taaattccag gagcatgaac ataatgggtg agggtcacat cccctgggca 5400 tggatttggg gcaggatgtg acaaaaatct catactcatg tctctctggg cctgataaat 5460 tttgcatact ttatatagtt cagactcttc tgagctacgt ttctttctct tccttttggt 5520 tgagtttttt tttcttctga aagtattgat gatcaacatt ttagatgtaa gtttgtccca 5580 tgtcactgga agacttagtt ttagttagtc tcatcccaca ttggaggaag agaggagaga 5640 taaaatggct taagaatgca gtgaagtctc aaggccaagt tgattggcaa cacaaaggga 5700 cagggcaatg gtatttcagg tcatctgctt acaaaggagc tatggcatgt tggatcattt 5760 ctaagcatct agctatcatt attttagtgt ttttgttgat tttggacatc tagaagtgca 5820 aagtataatc aatttgagaa taaaagacat gatgcaaata aagacaatta ctaacaaaag 5880 ccagatctga aaaatgtttt tatttccgaa ggcgaccaaa taaatatgtt ttctacttct 5940 tgtgctgatc taaagatcaa tgtataggag atctccagtg atgagtttgt ccactcaggc 6000 agagctgcct ttttaaaata aaaattatga atgcataagt caatgtattt gaatttaact 6060 ccacaagtat tggttaacaa tacagatatg gtcgcttcca aggtgtttgg agggagtttt 6120 gtatttgatg gcattccaca ttggaggcca tgctatttga tgtcttcatc tcctggaacc 6180 acactgtatt gtttggacat atctatccag acagatgatg ataaattttg catatctcac 6240 atagttcaga ctgctctggg ctacttttct ttctcaatag cttctcattg ttaacttatg 6300 cctgtagagt tttgctaaac taaattagat aatggacatt tattaaatat ttagatcatt 6360 tccaaataac ataaaatgct gaaacattaa ttgcttaaca taagttaatc tacttttggt 6420 ttttattaca aaggaactaa atatatttac atctgttaaa aaacacttta aactgtacta 6480 tgagaaagaa tatacttcta tagaaattat aaaatggtat atttatagat ttaccatttt 6540 atggaatacc ccataaccgt tcacaatttc ttatttccta gttttcacta gaaattgaag 6600 ttactaagag ttaacaattt taactaatat agagtagtta aaaagactaa aaataataag 6660 ggagataact atatgcaaag aaagtaagac atgtttttgg taaggaaagc cataaggtat 6720 aaggatgtgc ttttttttaa ggaaaaggaa gaataatttg gtctagtttg gaggttattt 6780 aaaggttgtt tcagaatgaa tgaaagataa aatctaaatg gatacaaaaa ggaagagaga 6840 tgacacacac acaaaatgaa tgactcttgt atggacaagt tggctagaac tgaatgtatt 6900 ataaggtttt aaaaatgagt cttgaccaag cactgtggct cacgcctgta atcccagcac 6960 tttgggaggc caaggcgggc agatcatgag gtcaagagat caagaccatg gtgaaactcc 7020 atctctacta aaaatacaaa aattagctgg gcgtggtggt gcgcacctgt agtcccagct 7080 actagggagg ctgaggcagg agaatcgcat gaacccagga ggcagaggtt gcagtgaact 7140 gagatcacac cactgcactc cagcctggcg acacagtgag actccatctc aaaaaaaaaa 7200 agagtcttaa tatcaaaagt aaactgatgc aaaactagaa tttggtcttc tctgtgaaaa 7260 tgacagtttt ctttttaaag agtattgctc cagtttttaa aagtgattgt gaaaaatttt 7320 cctttccctt gtaactaatc ggcctacaaa atgaagattt tgtgttttct caaaataatt 7380 ctttgtgctt cgtgttgcct ttttttggtc tttaattact taagaaaatt gaatcttccc 7440 aacaaaagag ctagttttgt ttgttttgtt tttacagtta ttaaactttc tctatttgcc 7500 tttgaaacct cttagttgtt actttttgtg tcttcacagt gacttttgat atatttaatc 7560 aagtgtttaa aacatttgat atttttgcca gacttcctaa aaccaaattc taaactaaat 7620 ctttttttta acctcaagct aagtaggatt ttccagatgg attcctggaa tatctcaaaa 7680 gactttgttt tctttcctta tagaaagaga ggtcaggcac agtggctcag gcctgtaatt 7740 ctagcacttt gggaggccaa ggtaggcaga tcacttgagc ctgggagttt gagaccagcg 7800 tgagtaacat agggagaccc ttctctacaa aaattagcct ggcagcccag cgtggtggct 7860 catgcctgta atcctagcac tttgagaggc taaggtgggc tgattgcctg agctcaggag 7920 tttgagacca gtctgggcag caaggtgaaa ccccatctct actaaaaata caaaaaatta 7980 tctgggcatg gcggcgtgtg cctgtagttc cagttacttg ggaggctgag gcaggaggat 8040 tgcttgaatc cgggaggcag aggttgcagt gagccaagat cacaccactg cactccagcc 8100 tcggcaacag agcgagagtc cttctcaaaa aaaaaaaaaa aaattagcct aacatggtgt 8160 catgcctgta gtcccagcta cttgggaggc tgaggtggga ggatcacctg aacctaagga 8220 ggttcaggct gcagtgagcc atgattatgc tactgtattc cagcctgggc aagaaagtga 8280 gaccttggaa aaaaaaagaa agaaagaaag ggaaaaagaa agaaagaaag aaaaaaagag 8340 aattgcatag gaagttgtca aataagggtg atgtttaacc ttcttatgtt ataatattat 8400 tcatgtaagt tttccagatg ttctgtgaac ttctacaact ccgatatgtc ctgatatgtt 8460 atcagtcata attttagtta ccttaaaatg ttgtgtttct cagaaataac aaattacatt 8520 gtcaattgca ttataatgaa ctttcatcag atctttaacc atggccattt ttaagtctgt 8580 tgtcatccac aaacagtagt tttactctga tactttcctg aaagttattc caaatgcttt 8640 gtttgcagga agatttatgg aaaatattga aatgtgtggg tttctggtaa ctttaagatc 8700 ataacattgg actgcataag aatttccagg actctattgg aaaaactaaa tttataaaat 8760 tgctaaccca agatcaagta gaagaaaaat taattacatg gtgatatggt ttggctgtgt 8820 ccctactgaa atctcaactt gaattgtatc tcccagaatt cccacatgtt gtgggaggga 8880 cccagggaga ggttattgaa tcatggagtc tggtctttcc catgctattc tcgtgatagt 8940 gaataggtct catgagatct gatgggttaa tcaggggttt ctgcttttgc ttcttcctca 9000 tttcaccatc aggtaagaag tgcctttcag ctcccgccat aattctgagg cctccccagc 9060 cacgtggaac tgtaagtcca attaaacctc tttttcttcc cagtctctgg tatgtcttta 9120 tcagcagtgt gaaaacggac taatgcacat gggataaaat gtattgataa taatgataat 9180 tttatgactt ttcgtttgaa acattgctgt ttctttaatg tctaattttt cagatttaac 9240 gtaacttttt ctttctttcc ttaagctatc tatagcttac agaaatttag cagattatac 9300 ctttatcaac agaaaagaag catatacttt ctctcttacc tgatccctcc agaattcaga 9360 aactattagc aagtattatt atttccaagg caatatagtt atatgcataa ctgcaataag 9420 aatatgttct tctgggctgg gcgcagtatc tcatgcctgt aatcccagca ctttgggagg 9480 ccaaggaggg ctgatcactt gaggccaaga gtttgagacc agcatggcca acatggtgaa 9540 accccagctc tatgaaaaaa taataataat aataataata caaaaattaa ctaggtatgg 9600 tggtgcacgc ttgtaatccc agctactcag gtggctgagg cacaagaatt gcttgaacct 9660 gggaggtgga ggctgaagtg atctgagatt gtgccactgc actctagcct gggtgacaga 9720 gtgagactct gtctcaaaaa aaaaagaata tattcttcct ataacaggac acaattagaa 9780 acactggtta tattaccaag gttttaaata gaatatcata cttaaaaata tgtgtaaaat 9840 tttatatgac cagccgggtg tggtggctca cgcctgtaat cccagcactt tgggaggccg 9900 aggcaggtgg atcacctgag gtcgggagtt tgaaaccaag cctggccaac aggaccctta 9960 aggaccctta aggagatttt aagaacctaa tgaagaagag aattcaccca aaattatagg 10020 cattgcagat gaagtctgat gacaagtcct tggcttgcct tcctagcttg gaaagacttt 10080 ttaaattcta atttgagact ccttattaaa agtcccagca aagtatactt tgaaaaagct 10140 tatgtaatga atcactattc ttactatact tatgtaagta atcaggccaa gtgtaacggg 10200 actaggccta ttttgcaaac aaatcagttt tactgtgatt atttttggaa tgggcatgac 10260 tataaagaga aaaactatat attagtagaa aactatagca cacccattgt tagattctag 10320 cctagttcac tgtctttgag gttttgttat ctacttgtaa actgaactgg atcctgaatt 10380 ctaatttcct ccagtatctg gctatgactt ctaccgagct gactacaaat ttgagggttc 10440 ccttgacctc ttcctcatgt tcaataattt actaggacaa ttaacgggaa ctcaggaaaa 10500 cacatatgat tgccagttta taatgaaaaa tacaatttag gaatagccaa gtggaagaga 10560 ttcatggggc aaggtatggg ggctctttct tccatgcctt ctccaggtgc accatcatcc 10620 tagcacctca ttgtgttcac caacccagaa gctctctgaa ccccaaagtt tagaggttag 10680 tatggaggtt ttattacata ggtatgatta gttaaattgc caaccattgg tgcttgaaca 10740 ttatctttac tgcctttctt cccccaaccc ccagaagtgg aaaggggtgc taaaagttac 10800 aaccctctta tatttgcttt caggtgacaa ctttcaaagt gagttggagc aaagaccaaa 10860 catatatttg catgaaatca tgacatccta tagtaatatt tgattttcaa actctgcatg 10920 tataatagtt acttaaaatt taaattaaat tttaaaatgt accagttatg cagctgaatt 10980 ttggtacttt ttcccttggc tttgtctggt atctgaatcc accatcattt ccctgtacaa 11040 tatctgccat tggagatcca attgggaaaa tacatttaaa gaaaaaatct aagaagcatc 11100 tcataggttg tggttccctt gcatccacac tcattatcat ggtattatct tccccaaggt 11160 gggtaatagt atatccctgg ctaatatcaa gattagcact agctgtctgt agataccatt 11220 tagaaaagtt ttctctacat gtcctctctc accactccta ttcaacatag tattggaagt 11280 taaaaaaaaa gttttctcta cttgaaacta aaatttatgg cagactatat gcttccgaat 11340 gttctaaaac cttactagaa gacaaacatt gtcaaaggta ggaatgtggc caacatgtca 11400 ggtaacgcct ataacaaatt aaaatctggc gattgctgcc aagataccca caaaactatc 11460 ggaggcaact gctgctaaaa gaccataaag atgattctgg agacaaaggc ctgtggaagt 11520 caataaaata atggtcaaag tggacaagat ttaaaaaaat taggattcag aaagaagcca 11580 attgtcattt aggaaacaat tatctgataa caaagctcag tgccctctta gggctgacat 11640 tcatgtacat attaaatatt gtagaactga taaggcttgg tggattatat ttgacaaagg 11700 ttatttgtat ttcaaaaagg aatcaacttt tgagacaaag gaatgcttta attcattcaa 11760 caaatatttg ccaagtacct actttaggga tatgatggtg tgtaaaaaaa tttttgctgc 11820 tatcatggag tttagaatat agaggtaagg ccaatattaa tctagcaaca ttaaatcttg 11880 tgtaattgta aactgaggta gataagtgct caagaaaaaa aggttctgta aaagtttata 11940 tcaaaagatc ctgatcaaag aagtattcta ggggaaataa tcattaaact gagagctgaa 12000 ggaagagttg ggttgaatgg cataaatctt aaaatgagac agggtttata cctgagggtt 12060 ggtatattag tttactaggg gtgtataaca aagtatcaca aactgggtag tttaaataac 12120 agaaatgtat tgcctctaag ctctggaggc taaatatctg agatcaaggt gctggtaagg 12180 ctgtttcctt ctgggttgat gagggagatt ctttttcatg actctctcct agattctagt 12240 gatttgctgg aaatctggtg tttcttgact tgtacacctt tgcctttgtt atagactgat 12300 gttgtctccc cctaaaactt atgtgttaaa atcctaaccc ccagtgtgat gggattagga 12360 ggtggctctt ctttggggaa ataattaggt aatgagtgtg caaccctcat caatggaatt 12420 agtaccctta gaaaaatgac tccagaaagc tctctcatcc cttctgctat gtggggacac 12480 agtgacaagg gggccatctg taaagcagaa agcaggccct caccagacac taattctgcc 12540 agtgccttga tctgggactt cccagcctcc agaaccatga taaataaatt tctgttgttt 12600 aagccactag cttatggtat ttttgttgtt agtccaaaca gactgagata gccttcatct 12660 ccacatggca tttttttctc tgtgtctttg tgaataaatt tcttcttttt ataaggacac 12720 cactcatatt tgattaggag tctaccctaa tccagtataa gcttatctta atgaattatg 12780 cctgcaatga ctctatttcc aaactaagtc acattttgag gtattgcagt taggacctca 12840 acatatgtat ttttggggga gacacaatac aactcttacc agttgagaaa gagacaatgg 12900 gagcaaagaa gatttgaaat ttacctgctg acttagctag gttaatcatg agagaacaaa 12960 aagctttcat ttgaaaacgc ttcaggaaat tcagtgttct caaaggagag ttggattgtg 13020 tttataccaa gaagggggct gaaactatct gaggaggagg ttcaggctat aaagattata 13080 cagattgatt attgagaaaa gtacaaagga gcacagtgca aagtttggga ggtggagaag 13140 tttgagtcaa aaataaggaa gtatagagag cattattggg atgatgggaa ggtaaaataa 13200 actggccagg attaattgct tctattcata tctctgcctg atgaaaatgg gagtgagaag 13260 tgtgatggct ttagtctcaa atgccttctt gagaaaggcc aaagaattta gactgcccag 13320 tccagaacaa tgtcagtccc aataggtata gtctctgttc tcctggccag aactagaatc 13380 aattactggc tccatcattc actagatgtg tgcgtttggg ccagttacag tacctctcta 13440 agaccgagct ttctcattct taaaatgagt ataataataa cacttagttg aggaagcttg 13500 tgtagtacgt ctcagtatca ctattgaagg gctggaggat tctcatgccc tcgataaact 13560 gtgtgatctc tcagatcctc tattttctga ttttaaaact gtcatagtaa tgctttagag 13620 tactgtaata acaacttatg gagatcttat ttataaaaag taatttgaga aatagaaaag 13680 taacacctag ttactttttt cctagttatt ttgggccagg attgtgttct gtgactgtgt 13740 ctaaatgcac catgagagga cgcccaggga aggcacctcc actccattct atctcattcc 13800 tctttcctag tgtgagttca tcctgtgtgc tgatttattt tccttaatcc acctggtcct 13860 atcaaagggc catttcagtt agttgctcca cttcagttta tgggagataa gtcttgtcca 13920 gattttccta atggccaaaa aagtcaaatc cttatcctct ttgggcttta ctcaaaaatg 13980 cttgttcagt tagggctcta gttttattcc ccagagattc tgcatgtttt atactgatct 14040 tgccagggcc ttcatctttt gggctagtct ctggaaaatc tacctctggt cctgtgcact 14100 tttccccctc tagattctag aaggaaaagc aatgaatagc gtctcccaca aagatatttc 14160 caagacctaa cccccagtac ctgtgaatag tgagagtaaa atgattagtg gctgccagag 14220 gttcaagaga aggagagaaa tattgaatag gtgaaggaca ggggattttt tagagcagtg 14280 aagttattct gtatactgta attgtgtatg catgacatgt tttttcataa cccattggac 14340 tttacaatac aaagaatgaa cttaaggtat gcaaaattta aaaatcactt aggagggggc 14400 agggccaagg tggtagatta gaagcagctc atgtgtgctg ctctcataga gaggaaacaa 14460 aagggctagt gaacattgac cctccaggct gatcatctga aaaaccatgc tgggatccat 14520 caaggcagtg ggtgaacaca gagtacagag atgagcaaag ttgggcacca gcctttcagg 14580 actcagagtg aagccaagag aacctctcca acatgggaaa gggtgagtga gtgagagccc 14640 ccagaggaat tcacactctg cacagggacc cacacaagac ttggaatggg agaatccccc 14700 tggaccccct ggacacctgc caccaccatg ctcctagact gaggcagaga gccaactaga 14760 tgttttgcag gggcaactct tgagtccaag gggacctcta caagccttgg ccccttgagt 14820 agaccagcac tggttccaca gccccaaaag aggccacagt tgcagtgcct gggagaagta 14880 agattgcccc gccccctctt gctggacagg gcttgatggc agcttctggc ccagcagtcc 14940 cacttcagcc tgaacttgtc tggccactcc aatcacccct caccactggt atcctggcgg 15000 gcaaccctcg atagagcttc cagcccagta gtcccacttc tgtgtcaact tagcccatgg 15060 acacagcctc ctgttgtccc aggaagcact cagacattag ggcaggagaa tgtacccatc 15120 ctcaccactg atagccaggt ggcccagtgc tcctacttca atggggactc agctggaggg 15180 ctcagcctcc cattgtccca agaaatgcat agacagcagg gtgtgtagcc ccaaccatcc 15240 ctgccactgg tagacaggcg ggcaatgcct cctagacctt ctggcccaga ggtcctatat 15300 ctgtgggaac tcagccagtg cgcacagcct cctgctgtcc caggaagtat ctggatggta 15360 gggtgggtgt ccccaaacac ccctgctgct ggaagccagg tgagccatgc ctgttagaac 15420 ttctggctca gtggtcctac ttctgccaga atttgctgag ggtcacaacc tcctgctgcc 15480 ctggaaacac ccagagagca gggtgagcaa ctccactcac acctgcctcc catagccaga 15540 cagggcccac ccaatagagc ttccaaccca gcagttctgt tctacctgca ctctgtgaaa 15600 aggcacaagc ccgtgtttct ccaagaagca catggatagt atattagtgc tgacttggca 15660 aggatacagc ttgtctgcca acagcagctc ctgcctgagg gaacaccatg gacccgaaaa 15720 cccaacaaaa aacataggca cagagacagt aattggaggg ggctcctcca agacccagga 15780 gtggactaga attgaaacca gtcaaccaaa gccaccttat acaataatga aacccccaag 15840 ggcatcaaag aagaaaaaag caaaaaaaaa aaaaaaaaat ccactcaaat tacagcaatg 15900 ttaaagactg aaagaacaac agcccataca aatgagaaag atccagcaca agaactctgg 15960 caactcaaaa aaccagagtg ccttctttac tccaagcaac tgcactagtt tcccagcaag 16020 ggtccttaac taggctgaaa tggctaaaat gatggaaata aaactcagaa tacagataag 16080 aatgaagatc attgagattc agacaatgtt gaaacccaat ccaagtaagc taagaatcac 16140 aataaaatga tacggaaatt gatcgatgaa atagccatca taaaaaagaa cccaactgat 16200 ctgatatagc ttaaaaacac actacaggaa ttgcacaatg taattacaaa tattaacagc 16260 agaacagacc aagctgagga aagaacctca gagctcaaag actggctctc tgaaataact 16320 cattcagata aaaaattaaa aaagaataaa caaaacctac aagaaataga agattatgta 16380 aagagaccaa ttataggact cactggcatc tatgaaagag atggggagaa agcaagaaac 16440 ttggaaaaca tattttagga tgtcatacat aaaacttcct caacctcatg agacaggcta 16500 acattcaagt ccaggaaatg cagagaaccc ctgctgacat tacacaaaaa gaccatcccc 16560 aagacccata attatcagat actccaaggt tgaaatttaa aaaaaaaaaa aaaaagacaa 16620 aggcagctag agaaaacggg caagtcgctt gcaaagggaa tcccatcagg cttacaggag 16680 acctttcagc agaaactcta caagccagaa gaggtttgga gcctatattc agcattcttt 16740 ttttatgaga cagagtctcg ctgtttcacc caggctggag tgcagtggtg cgatctcggc 16800 tcactgcaag ctccgcctcc tgggttcaca ccattctcct gcctcagcct cccgagtagc 16860 tgggactaca ggtgcccacc accatgcggg gctaattttt tttttttttt tttttgtatt 16920 tttagtagag acggggtttc accatgttag ccaggatggt cttgatctcc tgacctcgtg 16980 aggaggtcct cctgacccgc ctcggcctcc ccatatattc agcattctta aagaaaaaat 17040 ttacaatcaa gaattttaca tctggccaaa ctaaacttca caagtaaaaa gaaataagat 17100 cattttctta caagcaaatg cttagggaat tcattaccaa cacacctgcc ttataaaaag 17160 tcctgagagg agcactaaat atggaaagac cattacaagc cactacagga acacatttaa 17220 gtacacagac cgatgacact gaaaagcacc cacagaaaaa aaagtctgca taataatcag 17280 ctaaaagcat gattacaaaa tcaaatccac acatattagt actaagctaa tgggctaaat 17340 gatccaatta aaaggcgcag agtggcaagc tgaataaaga agcaaggccc aatggtatgc 17400 tgtcttcaag agaaccatct cacatgcagt gacatctata ggctcaaaat gaaggggcgg 17460 agaaaagtct atgaaacaga agaaatcaga ggttacaatc ttaatttcag acaagatgga 17520 ctttaaacaa acaaacatca aaaaatataa agaagggtat tatataatac ccttcaattc 17580 aatggttcaa ttcaacaaga aggtataact ctcctaaata tgacagacat ctaacacaag 17640 agcacccaga ttcacaaaac aagttcttag agacctacaa agggacttag aacccccaca 17700 caataatatt gggagccttc aacatcccac tgacagaatt agacagatca tcaaggcaga 17760 aaattaacaa acatatttaa gacctgaatg caatacttga ccaaagggac ggaatagata 17820 cctatagaac ttgccatcca aaaacaacaa aaaatacatt cttctcattg ccacatggca 17880 catactccaa aatcaaacac aaaattggac ataaaacaat actcagcaaa ttaaaaaaaa 17940 aacagaaatt ataccaacca caatcttaga ccacagcaca acaaaaatag aaataagttc 18000 taagaacata actcagaacc ataaaattac ataggaatta aacaatctgc tctggaataa 18060 cctttgggta aacaacaaaa ttaaggcaga aataaagaaa ttctttgaaa ttaatgagaa 18120 aaagatataa catatccaaa tctctgggaa acagctaagg ccatgttaag agagggaagt 18180 ttatagcact aaatacccac atcaaaaatt tagaaagatc tcaaattaac gacctaacat 18240 cacaaccagg agaactagag aagcaagagc aaagtaagac cccaaagcca ccagaagaca 18300 agaaataacc aaaatcacag ctgaactgaa gaaaactgag acactgaaaa ccatacaaaa 18360 gatcaacaaa tccaggagtt ggttattaga aaatattgat aagatagata gactactggc 18420 tagactgata aagaaaaaaa gacagaagtt ccaaataaac acaattagaa atgacaaagg 18480 agacgttacc actgaaccca cagatataaa aaaaaacatt gaagactact ataaacactt 18540 ttaagcacac aaactagaaa atttagaagg ctgggtgtgg tcgatcacgc ctataatccc 18600 agcactttgg gaggccaagg agggtggatc acaaggtcag tagatcatga tcatcctggc 18660 caacatggtg aaaccccatc tctactaaaa tataaaaaaa aaaaaaaaaa ttagctgggc 18720 ccagtggcat gtgcctgtag tcccagctac ttgggaggct tgaggcagag gaatcacttg 18780 aacctgggag gcggaggttg ctgtgagctg aggttgagcc actgcactcc agcctggtga 18840 cacagtgaga ctccatctca aaaaaaaaaa aaaagaaaga aaaaagaaaa gaaaatttag 18900 aagaaatgga taaattccaa gacacataaa ccaggaagaa actgaatccc taaacaaaca 18960 aacaatgagt tccaaagtta aatcagtagt aaaaagccaa ctgtattaat gcattcttat 19020 gttgctataa agaaatacct gagattgggt aactataaag aaaagaggtt taattggtta 19080 acagttctgc aagctgtaca ggaagcatga cagcttctgg gaaggcctca gggaactttt 19140 aatcattgca gaaggcaaag ggaaagcatg tatgtcttac atggccagag cagggggaag 19200 agagagagag gggaggtgct acatactttt aaacaaccag atttgtgaga attctatcac 19260 gagaacagca gtagtgggat ggtgctaaac cattagaaac cacccccatg atctaatcac 19320 ctcccacaag tccccacctc caacactggg gattaaaatt gaacatgaga tttgggttgg 19380 ttcacaggta taaaccatat catctactaa acataaaaag cccaggacta cacagattca 19440 cagccaaatt ctaccagatg tagacagaat agctggtgcc attaataatg aagctattcc 19500 aaaaaattga ggaagaggga ctcctcccca actccttctg tgaggccagc atcatcctga 19560 taacgaaacc tggcagagac aaaacaaaaa aagaaaactt caggccatta tccttgatgc 19620 acatagatgc aaaactcctc aacaaaatac tagcaactga atccagcagc acagtgtaaa 19680 gctaatccac cactatcaag caggctttat ccctgggatg caagattggt ttaacataga 19740 caaaacatat gtttgtgtga ttcattacac aaacagaact aaaaatgaaa accacatgat 19800 aattccaata catgcagaaa aggcttttga taaaattcag catcccttca tgttaaaaac 19860 tctcgataaa ctatgcattg aagaaacata cctgaaaata attagagcca tgtatgacaa 19920 atccacagac aacatcatac tgaatgggca aaagttggaa gcatttccct tgaaaactag 19980 aacagccaga cacgatggct catgcctgta atctcagcac tttgggaagc aaaggcaggc 20040 agaccacttg agcccaggag tttgagacca gcctggtcaa catagggaaa ccctgtcttt 20100 acaaaaaaat aagaaaaatt agccaggcgt gatggcacac acctgtggtc ccagctactc 20160 gggaggctga aatgggagga tcacctgagc ctgggagctc aaggctgcag tgagctatga 20220 tcacactact gcactcaagc ctgggtaaga gtgaaaccct gaccaaaaaa aaaaaaaaga 20280 aaagataaaa gaaagaggcc aggcgtggtg gctcaggcct gtaattctag cactttggga 20340 ggccgaggca ggcggatcac ctgagattgg gagctcgaga ccagcctgac caacatggag 20400 aaaccctgtc tctactaaaa atacaaaatt agcgggcgtg atggtgcatg cctgtaatcc 20460 cagctgctcg ggaggctgag gcaggagaat cgcttgaatc caggaggcag aggttgcagt 20520 gcgctgagat tgtgccattg cactacagcc tgggcaacaa gagcaaaaaa aaaataaaaa 20580 taaaaaataa aaaataaaaa aaaaataaag aagaaagaaa agaaaactgg cacaaacaag 20640 aatgctctct ctcaccactc ctatttgaca tagtattgga agtcttggct gcagcaatta 20700 ggcaagagaa agaaataaaa ggcatccaaa taggaagaga gggagtcaaa ctatccctgt 20760 ttcaaatgac atgattctat acctagaaaa ccccatagtc tctgccccaa agcacattaa 20820 tctgattcac atcttcagca aagtttcagc atacaaagtc aacatacaaa agtcagtttc 20880 attcctatac cccgatagct ttcaagctga tagcaaaatc aggaacacta tcccaccaca 20940 attgttataa aaagaacaaa atacctagaa atacagctag ccagggatgt ggaagatctc 21000 tacaacagga attatataac actgctcaaa gaaatatgag atgatgcaaa caaatggaaa 21060 aacattttat tctcatggat aagaaaaatc aatatcatta atatggccat agcgcccaaa 21120 gcaatttaca gatgcattgt tattcctaac aaactaccaa tgccattagt cacaaaacct 21180 aaaaaaataa aaaaactgtt ttaaaatcca tatgaaacca aaaaagaccc ttatagccaa 21240 ggcaatctta agcaaaaaga acaaagctgg aggcatcacg ttacccaact tcaaactatg 21300 ctacggggct acagtaacca aaacagcatg gtactggcac aaaaacaggc acatggacca 21360 atggaacaga atagagagcc cagaaataag gccacaacca ctggatattt gacaaagctg 21420 acatcattct accataaaga tacatgcaca caaatgttca ttgcagcact attcacagta 21480 gcaaagatgg gaatcaacct aaatgcccat caaaggtaga ttagataaag gaaatgtgat 21540 acatatacac cacataatac tatgcagaca taaaaaggaa tgagatcatg tcctttacag 21600 caacataaat ggagctggag gtcattatgc taagcaaact aacacaggaa cagaaaacca 21660 aaataccaca tgttcttact tataattggg agctaaagga tgagaacaca tggatactag 21720 gaggggtaca acagacactg gtgcctactt gagggcggag ggtgggagga gggagaggat 21780 cagaaaaaat acctgttggg tattatgctt attgcccagt gatgaaattt tctgtacacc 21840 aaacccttct aacacacagt tcatctatat aacaagtctg cacatgtacc cttgaaccta 21900 aaataactat tacaataagt aaatacatat ttttaaaaat catttagaat gtcagaaaat 21960 tccaggattg tattagtctg ttcttgcact gttatgaata aacacctgtg actgggtaaa 22020 tttataaaga aaagaggttt aattggctca cagttccact ggcagtacag aaagcatgac 22080 agcttctggg gaggcctcag gaaactttca atcatggtgg aaggcaaaga gcaagcaggc 22140 atgtcttaca tggccagagc aggaggaaga gagaaggtag acgggctaca cacctacaca 22200 accagatctc gtgtgaactc tatcacaaga atagcactag gaggatggtg ctaaaccatt 22260 agaaaccacc cccatgatcc aatcaccaga cccacaagga cgcacctcca acattgggga 22320 ttatgattga acatgagatt tgtttaggga cacagatcca aactatatca aggatagagt 22380 gtagaatatg acaaaataat ctaactgtat tacaaatgtg tgaaacaacc tcactgcagg 22440 tggtggtaaa agaagtgcag acctaagtaa cttttggaaa ttagtggagt ctgtaatact 22500 aaatgaaaaa ctgtttataa acgccacact cttgtttttc acagggatat gggttaacaa 22560 ttctaatact tctatacgtg tgtattggaa ttgagcagtt aagtaaatta tggtaaattg 22620 tgggtagtga ggctggtttc tctctgctgg agtgagagtt tatgcctaat caaagggagg 22680 gagctaaaat aatctctgtg gtaatggatt acagttggat atattaatat taaatcatat 22740 ttggcttaat gtagatacac atggctacat acacgtacac atggctacat atagacacat 22800 atagatatgt gtacatacat gattagtata cacaaacgtt cccttccatt gacaaatgag 22860 aaggcctaga agcaacagta ccccagtagt aacaagcaca tctggcatcc agttcatggt 22920 ttgtaatagc actctgcaat aaagggaaac agggcttctt agaaaaattg gtgtttctag 22980 gactagggca ggaaatatac atgatgagcc tgtaacattt tgtagtgcca gaaaggaaag 23040 aagtgctaac aacaaaaaca agcccacaaa gatggggctg tgtcaaatag atgtactgaa 23100 agagccaata ccaagaactc ctgacgccaa atctggaaca ctttggggaa acaaataaag 23160 cagtattgaa ttgtaacaca aagtataaaa taaatagcca tgagtctaca ctaatataag 23220 taaataagtg aataaataaa taaatggggg caaagaaaca atcttccatg cagaaaaact 23280 ccaaatgatt tatgtagata tgccaaccta aaggagataa agcataactc ctcactgttt 23340 cagttcaggc cacacatagt gactttcttc caaagagtat agtatgaaaa agggaaataa 23400 aagagtaact tgtgatggaa aagcctgaca agcacaaatt acctcagcag agtgatcagg 23460 gtcaacataa acagtaataa atcatatcaa cagtatgttc tcttgatatg atacgatgaa 23520 aatcatctag tcatcctttt ttttttttta gatggagtct tgctcttgtc acccaggctg 23580 gagtgcaatg gagtgatttt ggctcactgc aacatccacc tcctgggttc aagcgattcc 23640 cctgcctcag cctcccgagt agctgggatt acaggcgccc gccaccatgc ccagctaatt 23700 tttgtatttt tagtagagac agggtttcac cactttgacc aggctggtgt cgaactcctg 23760 accttgggtg gtccactctc ctcatccccc caaagtgctg ggattacagg cgtaagccac 23820 cgcgcttggc tgaaaatcgc ccttaacctc tgtagtcttc ttccccaaaa aaacattatc 23880 cctgtctaat aatgacaaag acatctaaca aatcccaaaa gatagatatt taaaaaatac 23940 ctgacccatt cttctcaaac tgtcaagatg accaaagcaa ggaacaactg aaaagctgtc 24000 ataaccaaga ggggcctgag aagacatgat gatgaaatgt tatatgatat tctggatggg 24060 ttcttggttt gcaaaaggga atttatgcaa aaactaagga aatttgatta aaacatggac 24120 tttcagttat ggtaatgtct tgatattggt tcattaattg caataaatat accttgctaa 24180 tgtaatatat tcataaaggg gaaactgggt acagagttaa tgagaactcg ctagactata 24240 ttctaatagt tctgtaaatc taaaactatt gtaaaaatca agtttacttt aaaaatatta 24300 ctgactgtct tggttctgtt ttactacttt ttttttttct tttttttgag tcagggtctc 24360 cctctgtcac ccaggctgga gtgcagtggg gtgatcttgg ctcactgcaa cctctgcctc 24420 ccgggttcaa gcaattctcc cacctcagcc tcagaggttt gaataatact tctttgtttt 24480 aatcattcag ctcagattaa aaacaacgcc taatttctta atgtcaacta ttgccttgcc 24540 ctctgttata tcctaccttc tcccattcgt tatagtcact ctctagtatg gtattgagtt 24600 ggggatgtgc atctgcccaa caaattttta tattttttgt agagatgggg ttttgtcatg 24660 ttgcccaggc tagtctcaaa ctcctgagct caagcagtcc gcccaccttg gcctcccaaa 24720 gcgctgagat tacaggtatg agccacattg tccagccatt tccatttact tttctttccc 24780 attgagccca attcttaaaa acatccagtg gcagcttagc ttgggtgtct tggctcagct 24840 ctggaggttt gaatgatact tctttgcttt tctttgcttt aatcattcag ctcagattta 24900 aaaatttctt aatgtcaact attggcttgc cccctgttat attctacctt cttccattcg 24960 ctatcctaac tctctagtat ggtattgagt tggggatgtg cacacacagg caaacacaca 25020 cacatacaca tccccataca tatacagtgg tgtgctgaaa ctgtgtcaga ccagctagag 25080 agacccaatt gttaaatatt caagaatgag gcaagccagt tattaagcac atccattatt 25140 aaaaattaaa ggataaagtt acaattaagt aaatcatatt aaaaagaaag gttataaata 25200 atatcattac ttctatttat tttactatta tctatacttt ttgaggttaa gtctactgta 25260 tttctataat ggaattacta catactggtg tgctacttct tgattccgta tttggtgatg 25320 tcaccctgat atgacatcat atcattgata tgatatgaaa tagaccatgg gtggagtatt 25380 tgtaccatgg atattgaaaa aacttaaatc agagcttgag ttattgtttt gttgattttc 25440 tactttaaaa agatggatgt gcttaataac cggccttaaa aagatggggg aaaatgttat 25500 cacggttaat actgtaggtt aagctctaaa atgtttgtag ctgttacatt tgaatagcac 25560 aaaatattga ggaatattct ttaagtgttt gaaaacagtt ttaaactcag caaagaggtt 25620 aactgatatt gttaacaaga ttcaacttca ttcaattcta ttgttatact ctcatcttac 25680 tcgtcaatat aaatgaaaat gtcaattgat attcatttga gagttactct catttgttaa 25740 ttgcaaccat aggttaacta aagatacaag agtttggcta aatcagtgag aacattgtat 25800 gagaataagt tcattataca gaatagagaa tattatatat tttattatta tttgtaagtt 25860 ttgtattaca tatcctttat gtcagtaaaa tttataataa acatgtacat atttattttt 25920 tgcagtttgt tattaaacag ttactagcaa attgctatgt acacacattc cttatcaaaa 25980 atgtgggaat tatttgcaac ataaatgaga acatatgagg ttatacgtag taggtacaat 26040 cttaaagaga caaaccacaa gtatgattga tacttccact agacatcttg tcaagagaat 26100 tatattccca aataagtatc accaaaaatt ttgttgaaac tagacctttc cacaagctat 26160 gggctcctat aaatacatat ttttaccaga gtttcttcat ctaattaggt ttttaaattg 26220 tggtaagaat aagatacaga taaatgaatt agatgcagcc tggccaatat ggtgaaaccc 26280 catctctact aaaaatacaa aaattagctg ggtgtggtgg cagacgcctg taatcccagc 26340 tactcgggag gctgaggcag aagaattgct gggagccggg aggcagaggt tgcagtgagc 26400 tgagattgcg ccactgcact ccagcctggg cgacagagcg agactccaac tcttaaaaaa 26460 aaaaaaaaac aaatcaatta gatgtattaa ttaggaatct gctatgaact gaattgtgtt 26520 cccccaagat ttacatgttg aagcgctaac ctccaatgtg gcaatattta cagatcgggc 26580 ctttaaagag gtaattgagg ctacaagagg ttgtaagggt ggagccctaa tccagtagaa 26640 ctggagtctt tacaagagga agacacacca aaggtgcatg ggcacagaga aaaggccatg 26700 taaggacaca gtgggaaggg gccatctaca agccaatgag agaggcctca ggagaaacca 26760 aatctgtcaa catcaacatc ttgatcttgt acttccagcc tccagactat gaaaaaacaa 26820 ctattgtttg agccgccctg tctgtggtat accatgtacc atggtgtttg tagggaagcc 26880 ctagtaaact aaaacaaaat cttagattgt aagtaataga aatcaactgt aggtagatta 26940 tagcagaaag aggacagaaa tgcaggtaaa agttacaact ggaaactgca gtgctatagg 27000 aagcccaaga tgttctcttt ttctgtatct cctctctgct atagcctatc tattttattc 27060 tgaacatctt tattccacac atctttattc cacagctata ctgtccaata tgatagtcac 27120 aaggaacatg cggcttttta aatttaataa aattcagttc ttcagtcaca ttaaagatat 27180 tgcaaatatt aaatagctac atatggctac tgtgttggac actgtagata tagcacacct 27240 ccatcattgt agatagttct tttggacagc actggattat aggattacca gagatcaagg 27300 taaacttccc ttgaagttga aggtaaactt ccatttaacc attaggacac ctcagctgta 27360 tcactccctt ttaaggccta tatttagttt tgaatttata attttttatc atttttctta 27420 gggactgata tcaccagtga cctctaggga aaggattagt agtgaggaga aacattattt 27480 tgtattgttt gaatgtaaat acatccatgt acaaactgca taatattttt taaggtattg 27540 gagttttgta ttgctcatca ttgtatccaa acacccagta tagtacctta acaggtaatg 27600 ttaggaagtc gaagagatgg acatacggtt aatgctaaat cctgtgatgg tgagaagatg 27660 ctctggttat gcctaattct ttctgcttca agcccagcta ggtctgggaa ttgcttgggg 27720 aaactggaag cctgaaccag aggactgtgt gcatgtgtgc atgcgtgcgt gcgtgtgtgt 27780 gtactggtag gtaataaata actactgtgt atctgacact atggtagttt atacttttta 27840 tgtctactct aaacaacaac actacaaagt agtcaccctt gtacccattt tataaatgag 27900 gaaactaaga ctaactcatt tatcctggtg tgttcttttt tcttttcctg ttagtgcaat 27960 ttgacagtta cacaattgtt actaaataga atgtagccag ttctagagaa acttcattct 28020 accagtgttt attttattat tttatttttt attagataat tcatactctt ggatcaaaaa 28080 ctggtagcaa attgtattta gcacgaagta aatcttcctt cacacactac cctcaggcaa 28140 ccgtcaacaa cttcttgtgt gtctttacag aaatatttta tgtgtataca acacatatac 28200 gaatatttct aaaatttaat ttggagtatt ttacatactc caaatctttt ttttcacttg 28260 acaatatatc ttgaaaatca ttatatatta ctagatctgc tgaatttctt ttaatagcta 28320 tatgttattt gttgtaggaa agcctcaaaa tttattcaaa tccctactca tttatgattg 28380 ttgtttcata tcttttgtta ttacaaagct tcagtgacca ttcctataaa taggccattt 28440 tgcacatgtg gaaatatatc tgcagaataa atttctagag gtagagttgc tgagtcaaat 28500 ttaaaggcaa agagtcttta aactcttcat agatattgct aatttttatc catagatgtt 28560 atacaaatat acttcccctc agcaatgttt atccataccc tttccaatac taagggaacc 28620 ctttcttgta caagagaaaa agaaagaaag aaaaatcaat ctaatttgct tataggcacc 28680 taaagatttt tttttttttg gccttgccca gaagttatgc atttcagtga accctaccct 28740 caccatcccc atttcctgga ataatattaa tactactttc caactgaaac tctgagatca 28800 cattctttct tttctatttt atataatact ggcctacttt atatatgact gggatggagg 28860 ttgttcattc tgctcatctg tgtattatgc aaatttgcct ccaagcagat tggcctcttg 28920 caaccctggt gagaggtgac agcatgctgg cagtcctcag agccctcgct tgcacctccc 28980 ctgcctgggc tcccactttg gcggcatttg aggagccctt cagcccccac ctgcactgtg 29040 ggagcccctt tctgggctgg ccaaggctgg agcccactcc ctcagcttgc agggaggtgt 29100 ggagggagag gcgcgagcgg gaaccggggc tgcgtgcggc gcttgcgggc cagctggagt 29160 tccgggtggg cgtgggcttg gcggccccgc actcagagca gccagccagc cccgctggcc 29220 ccgaggaatg agggacttag cacccgggcc agtggctgcg gagagtgtac tggatccccc 29280 agcagtgccg gcccaccggc gctgtgctcg atttctcgcc gggccttagc tgccttcccg 29340 cggggcaggg cttgggacct gcagcccgcc atgcctgagc ctcccaccca ctccatgggc 29400 tcctgtgctg cccgagcctc cccgacgagc accaccccct gctccacggc gcccagtccc 29460 aacgaccacc caagggctga cgaatgcgag cgcacggcgc aggactggca ggcagctcca 29520 cctgcagccc tggtgcagga tccactaggt gaagccagct gggctcctga gtctggtggg 29580 gacgtggaga acctttgtat ctagttcagg gattgtaaac gcaccaatca gcgccctgac 29640 aaaacaggcc actgggctct accaatcagc aggatgtggg tggggccaga taagagaata 29700 aaagcaggct gccggaggca gcattggcaa cccactcggg tccccttctg caccgtggaa 29760 gttttgttct ttcactcttt gcaataaatc ttgctactgc tcactctttg ggtccacgcc 29820 gcttttatga gctgtaacac tcagtgcgaa gatctgcagc ttcactcctg agcccagcga 29880 gaccacgagc ccatggagag gaacaaacaa ctccagacgc gctgcgttaa gagctgtaac 29940 attcaccgcg aaggtctgca gcttcactcc tgagccagcg agaccaggaa cccaccagaa 30000 agaagaagct ccgaacacat ctgaacatca gaagggagag actccagacg cgtcatctta 30060 agagctgtaa cactcacggc gaaggtctgc agcttcactc ctgagccaac gagaccacga 30120 acccaccaga aggaagaaac tccgaacaca tctgaacatc agaagggaca gactccagac 30180 gcaccacctt aagagctgta acactcaccg cgagggtccg cggcttcatt cttgaagtca 30240 gtgagaccaa gaacccacca attccggaca cactgggtca ctttctgact gcactttctt 30300 gaagtattcg tctttggtcc tgtggtagta cccagtggac aacctcactt gcctgtaaac 30360 tacttccttg aggtattttc cctaacaacg tgaaatacat tccatttctc tgcttgctct 30420 tttcatgact ctcatttcaa tggtccttag aaaacacttt ttttgattat tattcagctt 30480 tgtaatactt atttcttcag ttccccatcc ataaagtctt tgatttagag gtcaaatctg 30540 ttttgcttta ctattcctat ctaaagcttg aaagtatggt aattaataaa aacattccac 30600 atgttaaatt agctttaatg ttagctttaa aagaagatag cagttaatca gtcttgatga 30660 cgtagaggtt gacaggtaga aggatcctaa aatttaattc ctgggctgct aacttcaaat 30720 ctcatctgta tcaacagttt tctcacttaa gtcattaaca tcgaaaatta ttttattaaa 30780 tgatttataa ttgggagagt actatttctc tttctcccca cctccagtta tgagaagata 30840 cttattccca gctttttctg ggtagagcta ttcaattttt tttttttttt tttttttttt 30900 tttttttttt tttttgagat ggagtttcac tcttgttacc taggctggag tgcaatgctg 30960 caaaatctgc tcactgcaac ctccacctcc caggttcaag cgagtctcct gcctcagctt 31020 ctggggtagc tgagattaca ggtaagtgcc cccacgccca gctaattttt gtatttttag 31080 aagagatggg gtttcaccat attagtcagg ctgatctcga actcctgacc tcatgtgatc 31140 cacccgcttc tgccttccaa agtgctggga ttgcaggcgt gaaccaccgc atccagccca 31200 atttgttttt taaatctttt tggcactcta ccaaatcacg aaggctcttc ttagttaggg 31260 gaacagaagg gatttagtct taataaattt ttctccatgc catggggaag actctctcag 31320 aaggtagcat ctagaacaga acattgaaaa gtttataaac aacaccagta cttcatactt 31380 ttgttttatc ttccctttga gatagacgtt tagtccttta ctgttattac ctagcacaat 31440 atctggcaca cagtaggtgg ccactgatta tttcttgaat gaagtaagga atgagaatat 31500 tacctacaga gttagagctc tgcgcattac ttccttccag atttcataca tcttttttta 31560 gtaatgaatg caaacaggct ctggggcagc tacattatcc ttctgaatca agacagggat 31620 ttcgcaatgc ttattttcaa tttcttcaga aatgccttaa agatattaat ggaggtaaca 31680 acttaatctc aaatagtaat ccatagacag aatatgtaac agcaatgttc tctgatctgt 31740 tctttggctt ctattcccta gagaaatagt tctctaagac caaacagtct atagatagaa 31800 ttgtagcaac agtcaattat gatgttagct atttgagaga cggttgagaa ttcagaaaaa 31860 actactgaaa tgttgtaaga caactcactc aaagaacagt tcaaatagtg gaaaagggaa 31920 atgatgatgt atccatttat tttgttctat tttttccaat ttcataggat agcaaatgct 31980 gcccatttat ttattttttt atttttcata agttattggg gtacaggtgg tgtttggtta 32040 catgagtaag ttctttagtg gtgacttgtg agatatgggt tcacccttca cctgagtagg 32100 atacactgaa ccatatttgt agtcttttat ccctcgcccc ctccatctct tccccgtaag 32160 tctccaaagt ccattgtatc attcttatgc ctttgcattc tcatagctta gctcccacat 32220 atcagtgaga acatacaatg cttggttttc cattcctgag gtagttcact tagaatagta 32280 gtctccattc tcatccaggc cactgcaaat gctgttaatt cattcctttt catggctgtg 32340 tagtattcca ttatatatat atatatatac cacagtttct ttatacactc attgattgat 32400 gggcttttgg gttagttgca cgattttgct attgtgaatt gtgctgctat aaacatgcgt 32460 atgcaagtat cttttccaaa taatgattcc ttttcctttg ggtagaaacc cagtagtggg 32520 attgctggat caaatggtag ttctactttt agttctttaa ggaatctcca cactgttttc 32580 catagtagct gtacttgttt acattcccac cagtggtgta aaggtgttcc ctgctcacca 32640 cacccatgcc aacatctact gttttttgat tttttgatta tggccattct tgcaggagta 32700 tagcattgtg gttttgattt gcatttctct gatcattagt gatgttgagc attttttcat 32760 gtttgttggt cagttgtata tcttcttttg agaattgtct tttcatgtcc ttagcccact 32820 ttttgatgaa attgtttgtt tttttttctt acagatttgt ttgagttcat tgtagattct 32880 ggatatcagt cctttgtcag acgcatagat tgtgaaggtt ttctcccact ctgtgggttg 32940 tctatttact ctgctgactg ttccttttgc tgtggaaaaa ctctttagtt taactgggtc 33000 ccagctacgt acctttgatt ttattgcatt tgcattttgg ttcttggtca tgaaatcctt 33060 gcctagtcaa tgtctagaag ggtttttcca atgttatcgt ctagaatttt tatagtttca 33120 ggtcttaggt ttaagtcctt aatccatctt gagttgattt ttgtataagg tgagagatga 33180 ggatccagtt tcattctcct attatgtggc tagccaatta tcccagcaac atttgtttaa 33240 aagggtgtcc tttccccgtt ttatattttt gttcgctgtg tcaaagatca gttggctgta 33300 agtatttggg tttatttctg agttctctgt tctgttccat cagtctatgt gcctattttt 33360 atactagtac atgctgtttt ggtgactgtg cctttatagt atagtttgaa agcaggtagc 33420 atgatgcctc cacatttgtt ctttttgctt agtcttactt tggctgtgca ggctcttttt 33480 tggtttcata tgaattttag aattgttttt tctaattctg tgaagaatga tggtggtatt 33540 ttgatgggga ttgcattgaa tttgtagatt tttttggcgg tatggtcatt ttcacaatat 33600 tgattctgct catccatgag catgggatat gtttccattt gtatgttgtc tattatttgt 33660 ttcagcagtg ttttgtagtt tttcttgtag aggtcttttg actccctggt aaggcatatt 33720 cctaagtatt tgatttgatt tgattttttt tttttttttt ttgccgctac tgtaaaaggg 33780 gttaagttct tgatttgatt ttctgcttgg tcgctgtttg tgtatagaag agctactgat 33840 ttgtatacac taatcttgta tccagaaact ttgctgaatt cttttatcaa ttctagtagc 33900 tttctggagg agtccttagg gttttcaagg taaacgatca tatcatcagc aaacagtgac 33960 agtttgactt cctttttact gatttggata ccctttttat ttttctctct catctgattg 34020 ctctggctag aacttccagt actatgttga agaggagtgg tgagagtggg catccttgtt 34080 ccagttttca gaggaaatgc tttcaacttt tcccattcag tattatgttg gctgtgggtt 34140 ttcatagatg gcttttatta cattaaggta tgtcccttgt atgccaattt tgctgagagt 34200 tttaatcata acaggatgct gaattttgtc aaatgctttt tctgcatcta ttgagatgat 34260 catgtgatgt tttgttttta attctgtttt cgtggtgtat cacatatgtt aaatcatccc 34320 tacattcctg gtatgaaacc cacttgatca tgtcatggtg gattattttt tgatatgttg 34380 ttggattctg ttagctagta ttttgttaag gattttagca tcaatgccca acaaggatat 34440 caatctgtag tttttaaatg tgcttttctg gaccggcacg gtggctaagg cctgtaatcc 34500 caacactttg ggaggtcgag gagggcggac cacttgaggt caggagttcg agatcagcct 34560 ggccaaaatg gtgaaaatcc gtctctacta aaaaggtgtt gtggcgggcg cctgtaatct 34620 cagctactga ggaggctgag gcaggagaat cgcttgcacc cgggaggcgg aggttgcagt 34680 gagccgagat cgcaccactg cactccagcc tgggcgacag agaaagactc cgtctcaaaa 34740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gttgttttct gctatttcct gaactttatt acgtaaatga 34800 gacacgtgag atctggaagg aggtggaggt gaagaccctc ccacctggcc tgcatccaga 34860 gtacttgggg tgtggcactg gcgtgggccc caggaaggat cccagccagt tttggtgctg 34920 gaggcccggc caaaggaagg gctgctctcc cgtcccgcgg gctccgaggt cgccgcaccc 34980 gggcgcgcct gggcctcgtc acccgcgctc gtgacgcgtg cttacaaagg aaacttttac 35040 aggtttcggt gggcagggcc ttttattgcc cttctgctcc acagcccccg tgcttaatcg 35100 gttggttggg aggtttcttt cgtccgtggt tttggaaagt ccccgcctcc aaaccgcagt 35160 cccgcagtca gttctgcagc ctcagggcct cgaacagcca tgcttagaat ccgtccttct 35220 ttcctgctcc atctaccctt cccctctggc ttcttttttt tcactggaga aagcccaccc 35280 gagtctctca gcctgcttcg gaggttactg cggcctcctc cacgggtagt tctgggaccc 35340 gggtctagtc cgcggttccg gagcaggtcc ctccctggag tcgtcaggcc cagtatgcgt 35400 gtgctcagtg tgctcgggaa acacgcgtgg gctttaacag cagatctcca taaaagggtc 35460 ccggagatag cctctgcctg gcccgaggcc cagtgcctca aagcggacgc ctttgcgctc 35520 ccggaggtgc tcacaccaca gcggagcctg ctggcgagtg gagcgtagga ctgcgaacca 35580 gcaatctccc gagaagcggc gagggggagg ggaatgtctg tgaatcggtt atccctccca 35640 cccccagcag aagtcgggga aatgggggtg gaagggggaa aaagggagag aacaggagtg 35700 gggttgagga agggtaagga ggaaggtgag cttcctacag ctgcggggga aggtggagaa 35760 aattttcagg gggacagctg agtggtagag ctagcgagct tcagagaaat gttgacagac 35820 agatgcccag aaagtgagga tgccgggcat gggcactgcg taccaggcac aggagatata 35880 tggaggcagg aaattggcac atcataagca tttgaccatc ctgccctaaa acaaaacaaa 35940 ttgaacaaca acaacaacaa aagataatag caaaagtggc acagtagtga gctcgcaggg 36000 cccattccta tatagaaaca cagaaaaata agcaaaagct gccagaattg acttcgtggg 36060 aactctggga aacagtaaga aagttttaca gcaaccaagt gagtgctgaa ccaaggcaaa 36120 ggtaactgaa acgcaatgat agagaagagg ggcagggaag tgttgggtag acaaaggcgg 36180 gtccctggta agggccctcc cctgggcctg tgcccactgg acctaggtga ggacaggcac 36240 tccttccttc acgcccaaat gttgcatatc ccaagaccac cctgtcccgc cacgccccca 36300 tcctttgcct atgaaaaccc tgagacccta gcaggcagac acacaagcgg ctctatgtcc 36360 agaggaactc atcggaggaa ctggacgtgg agcggggcac cccagcggaa gggagcacgc 36420 cagtggaaga gcacactgac agaccatagg agtcagtctg ttatattatc atagtataat 36480 attataaaat tattataata caataaaaat ataaaaatat aaataatgta ataaatatgg 36540 ataaaaataa taattacata tttatattta tatgagaaca ctatgaataa ttttaagcca 36600 aaaaacaact cgatgttcat cactggatga gtagacgagc aatttccagt atattcatac 36660 aatggaatat gattcagcca taaaatgaaa tgaggtactg atacatgctg cagcaggaat 36720 gaacccccaa aacactacac ttggtgaaag aagccagaca cggaaggtca catattgtat 36780 gatcccattt ataagaaata ttcagaatag gtaaatccat agagacaaaa ggagttttgt 36840 agttgccagg agttggaggc aagaagagtt taacaggtat gcttaatggg gcctcctatg 36900 cagttgacga aaatgttttg ggctagatag gagtgatggt tgcataacat tgtactaaat 36960 gccactgaat tctactcttt aaaattttta gttttatgtt atgtggcgtg taccctaaaa 37020 aaaaaaatag aggtgcagtg ctccagcacg ggatgaggca gcgtggacag gagcatctcc 37080 caacctcagt gaagtctgag ccgcgtgcct gcaacaatcc cactgtggca gagaaccgca 37140 gagttccttc cggtttggca gcagtcattc gcaacctcac agccctctgg aaccccagcc 37200 tgggggtctc agaacgccga ggcggggact gggagccgag tcggattccg agactatggg 37260 ccagggttgg ctggattcag ttacctggct gaggcctggt gagcaaaata tcccaaacct 37320 cgcgtgatct ggaaggggaa gccggataaa tacggatctc cagatgtgcc agtctcgagt 37380 ctatcgatat gaggtccccc tagagtttct attcatcatt ttaaccgcat ttcatcgatc 37440 ttgagacacg gcttttgata ttttatcacc tcaagataaa tagtgttaga tgtctaatag 37500 cagcgttttt ctaagagata catgaaacaa cagtgtcaga aacgatgctg tcttccatgc 37560 gatgaaattg ttgtaatagg tgctcaataa atgttgacaa taaatgagtg aatgaatgaa 37620 aattatttta tttttatttg agctttggtt ctgccatttg ctagcagtgt gactcaagag 37680 aagccagtaa cccccctgag cttccctagt tcacaaaatg cttgtcatga agtcgacagc 37740 ttccggaggc tgcgaggctc gcaagaaatg cccacatgaa tgtgcgctta gggcgtgagt 37800 gctcactcca gaaaactcca acacagtgaa aaggcagaag cggtgttttt cttttttaca 37860 tttttataag aatatataaa aaatgatata aatggacatt tacggtagtg ggggaaggca 37920 tatatctacg ttaaaaggca ggacattttt aaaagctcta ttttctaaat gaaaactacg 37980 aaagcggggt gggttgtggc gggggcagtt gtggccctgt aggaccttcg gtgactgatg 38040 atctaagttt cccgaggttt ctcagagcct ctctggttct ttcaatcggg gatgtctgca 38100 gagggcagaa agaaaacagg cgttagaaac ctgaggtcaa agatgtgtgg cacatcccgc 38160 cctcctctct tgccgtccct accggcattg aaatacttat ggataaagtt ctcgcaatgg 38220 cttcacgtgc atgtacccgc cgccaccgct ctcccacacc tccctggtcc agcagctagt 38280 ccactgcccg cctggctgct ccaggcgcgc cgaccgctca agcgctccag gtccacccgg 38340 cggagggcag agaaagcgcg accgcgcggc ccgcagggtt gcaagaagaa aacgagtgtt 38400 atataatgag tctcagtggt tgctcacaat gccaggcgcg aaggcgtgaa gatgtggcct 38460 ttcccttccc gcatccccag gcatcttttg cacctggtgc ggagtgagcc agccagcttg 38520 cgataaccaa agggcgcctc aggctctggc gctcctcggc ggaatcccgt agcttcccta 38580 cgcatgcctg cttctacaaa cccacaaatg gtttccgatc atttctgaaa caaaatggat 38640 gctcatttat tcatgtgctc tggcttctgc cttcctctct aatctcgttg cgtatgggct 38700 ccagctcgcc gttcggttct cccgaggcag catttacact tgagagtctc aagattattt 38760 tattcctgag ggagcatttg cacttgaaag tctcttttta cgtttattcc tgaggcagca 38820 tttgcacttg agtttctttc tcccgtagct tgcattagat tctccgacca ctctttagct 38880 tctcctccta ttcacacttc atatttaccc attgcattgg ttttataaac tcgctctctg 38940 aaaatagatt gttatcttcc ttaacgtctg tttcccaggt cgggcaagat agcttgggac 39000 tgtaatccca gtactttagg aggaggaggg gggatgatcg cttgagccca gataacatgg 39060 tgagaccttc gtctctatta aacaaacaaa caaacccagg cgtcgtggcg tgcacctgtg 39120 gtcccagcta gtcgggaggc tcaggtggga gaaccccttg agccagggag tttgaggctg 39180 cagtgagctg tgatcgcgcc actgcactcc aggttgggca acagatcgac tctgtctcca 39240 aatgtaaacc ccatgagggc aagactcttg tttggtctca ttcaccttgg cgtgcccacc 39300 acctagaaca gggctgatca cgcagtagaa tctaaccata taattaattg tgcttgaaga 39360 gggggtgttg gggagtaaga gaaggaaggg aggagggaag aaatgaaaga cttgtgtgtt 39420 tggattaaat atattaggtt tggttaagag tcgttcagtt tattcatttg cttgtggccc 39480 aattcagtag ttttactccc tctcccactt ggctcctcag gctttttgct cagccctgga 39540 accgcgctgt aattggcagc tccttctaaa tcgggacccg gatgctagct gtaactggag 39600 ccgaagtctc cttcttcacc tcccgggacc tggatgctag ctgtaactgg agggaattgg 39660 cgggggggag gggaggaggg gccgagtaaa gaagaacttc gcgtctttaa cttcgaaggt 39720 gattttgcgt tctgtattta cagcatctcc aagcagaggg cttagagcta actcttcacc 39780 ctgtcctccc cagctcccct atggcccaag gagcccaatg cccccgttct gggccaaaat 39840 aagatggatt tcataatctt caaggtcatg ttttacctta aatattcgtg ttaattcccg 39900 tgtactgttt catatatcta ttttgtttca aaaaaaaatg ttcctccccc cagaaacaat 39960 tgagtaatgt tggcagtttc agcagacagc tgtgggagta gggaactggg gccatggaat 40020 gggggcggag ggaggatgct ttgagatcac aaaaaggaaa ggcaagggca aggaggacca 40080 taattctacc ttcatcgctc agcgatctct tgcacaagtt taagagggaa aggagccaac 40140 tccggtgcac agactgccag ggtcagcgaa gtcttggtcc tgatgtcccc agaaccccct 40200 ggggcagctc tggaaaactc taccgcataa agcggagggt cagattagct gaggagggtc 40260 agattagttg agttgtgcag aagagccgag atcgagagat ctccagatga tgccacgcac 40320 aattgggttt ggaaatcctg aggttggtcc agccagcttg gtatgcaaat gaggaaacag 40380 acctggtaag tggatgcaac tggccctagt ttggaggaag agggggcact agacctctag 40440 cctcttgagt cttcattgct ccgcagtcta ggccttgaac tagcagaggg taggtgtttg 40500 ggtggtggta tgctttggga agtataatgt acaaaatggg ctttcacgtg cgcaagtcca 40560 tttcgggatt atttcccatt tgccgccctg gcggggcagg gcgataggga gactcaggcc 40620 gtcccaccga ttggcgcgtg agctgaggca agaccggaga ctggtctccc gggctgaact 40680 ttctgtgctg gaaaatgaat gctctgagct ttggaagctc tcagggtaca aattctcaga 40740 tcatcagtcc tcacctgagg gaccttccgc ggcatctatg cgggcatggt tactgcctct 40800 ggtgcccccc gcagccgcgc gcaggtaccg tgcgacatcg cgatggccca gctcctcagc 40860 caggtccacg ggcagacggc cccaggcatc gcgcacgtcc agccgcgccc cggcccggtg 40920 cagcaccacc agcgtgtcca ggaagccctc ccgggcagcg tcgtgcacgg gtcgggtgag 40980 agtggcgggg tcggcgcagt tgggctccgc gccgtggagc agcagcagct ccgccactcg 41040 ggcgctgccc atcatcatga cctgccagag agaacagaat ggtcagagcc agggtggggg 41100 ccggcatgac ggaaaggaag cttgtgtaga gccccctcac cgccaagcag acccccacac 41160 aagccccagg tgtctaatta cccctacatt tgcttccagt ttccaatttc cttcttgagt 41220 tctctatcca ttcttcagta cacaatgaat tccattatat cctccgaact tctgcggagc 41280 tgtcgtcaca ggcagagagc actgtgaggc acgggcaaaa tagcaaaggg gcagggacag 41340 actgactttt actccaggct aacttcctgt atttcccctg agatacaact actgaaattt 41400 cttcctgaaa ttatgttagg cctggagatt tttttttttt tttttgttca ctgctgtata 41460 tccaagcgca gaatgtggta attgttaaaa agagaaaact tgtttgtttg ttaaaacaaa 41520 ttctcacaaa acttttaagt tacacttagc ttctgggaat gttgaacttc aatttctttt 41580 tcattatatt agttttaaaa ttatatattg ggatagtaca gttgtatata tttatgtggt 41640 acaatatgaa gttatgatct ttgaacacaa tggggaatta ttaagtcaag ctaagtaacc 41700 tatccatcat ctcaaatatt tgacattttt gtcaaatgag agcatttggg atttactatt 41760 tagctatatt catcatgcta tgaaacacat ctcaaaaaaa acaatcaaac ttattcctcc 41820 catcttaact gaggctttat atcttgatta ccatctcccc attcctccca ccccccagct 41880 ctagtaacca ccattctact ctttactgct aagaatgtaa ttgttttata tttcacagat 41940 aagtgagaac atgtgatatt tgtctttctg tgtttggctt atttcattta gcataatgct 42000 ctccaattcc aaaacttcaa tttcttcaag tataaaataa gaaggctagt ttaattaacc 42060 ctaaaattcc ttcctgtggt aggctgaata atgccccccc acccccaatg tctatgtcct 42120 aatcctcaaa aacttttaat acattaactt atgtggcaaa agaggctttg cagatgtgat 42180 ttaattaatg gtcttgaggg agattatcca gaattttcag ggtgggccca acataacccc 42240 aagtgttttt attagagggt cacagtcaga gagaagatac aagaatggaa gcacaggcca 42300 cagagaaaat acagagacca tgagccaagg aatttgatgg tcactagaag ctggaaaaga 42360 caaggaaaca gattgcccct tagagtttcc aaaaggaatg aaaccttgtg gacccatttt 42420 tgacttctga tctctagaac tgtaaaataa taattttgtg tttgttttag ctaacacatt 42480 tgtgataatt tgtaacagca gcagtaggaa actaaaacac ttcccaggtt tatgatttga 42540 gagttcatta aacaagagat ggtcacctct ttggttccta aatcatcttg gaaacaaagc 42600 catttccaga gaggaatttt aaaatactgt ctgcagtcat agcaacctta aaatttgagt 42660 gctgcatggt ggaagtagac aatttatttt aggataactg ttatttgtta tattagtttg 42720 aggatggtgg tgttaaagag gagttactta tttttaggta catttcatac taaacacaaa 42780 ttgcataatt tgcctaaatc aaggaattat actaaattat attatggtta ttaaatcctg 42840 tcctgagaaa gtgaaactga ctcagttttc aaagagacaa agagaaagta taagcaaacc 42900 aaattgcagc tacaaaaaga aagacaaaat gttgcagtat atttattgtt ttgtgtattc 42960 aatgaagtcc ttcgtcttgg tcataaaact agccttaaag gtttttctta tatttcatag 43020 tatgaaaaat ctaaaaagta acccatatgt aaatatttaa atcatgatag aaatccaaag 43080 caaaaagaaa atgaatcaat tgaattaaaa tgtgtaggat gcttaaaccc atttgataat 43140 atatccattt gataatatac taatatgaat ttagtacttt aaaatgttat ataaataaat 43200 gttcctatat taaacaccaa tgtagttagg attctaagcc aacatcattt ccccttttct 43260 acatgttctt ctcccgtctc cattaaaaat tgtcaaaact atccactttt ctttttcctt 43320 tttgttttta aacaaataag gtctcttcta agatattgta ggactacaaa gccaaactcc 43380 cgggttcaag ctgttggcaa aattttagag atgctaagtt acccatgtat taattacttt 43440 taaatcctcc cctaactccc tcacaaaaca ggagtaggga gaggagaaac acctctgttc 43500 aaaaatgagg aattgaaaac tcttatcaca aataaactat atcaagtaag ctaaagatag 43560 taaaagagca aaaatgttag cagatattcc caaaatggta actacatatt acctctggaa 43620 tgatcacatg aatgtggctc attatttcct aagttcctac agcaaacata tatttatttg 43680 ccctactcag ttaaaaataa acacaatatg tagttgcttc tgaataattt ttctctctct 43740 ctttctctct ttctttcttt cgacaaagtc tcactctgtc acccaggctg gagtgaagtg 43800 gctccatctc gctgttcact acaacctcag cctcccgggt tcaagcgatt ctcctgcctc 43860 aacctcccga gtagctggga ttacaggcgc ctgccaccac ccccggctac tttttgtatt 43920 tttagtagag gcgaggtttc acctgttggc caggctggtc tcgaactccc gacctcaggt 43980 gattcccccc gccttgatct cccaaagtga agggattaca aggcgtgagg caccgcgccc 44040 ggccgcttct gaataatttc gatcaaaatt tatattcgat atttattcca acatacacca 44100 cagatttcca ctgataatcc ctcctagtaa gaaagataag ctccatccag gtatctgtga 44160 attggaggct aagtagtccc agcacatctt acatttcttt aagactccct ttttatccca 44220 aacgttcgta aattttgtat ctgataaaga gcatacttcc atctaataca aatatgttcc 44280 ccccttcaga tcttctcagc attcgagaga tctgtacgcg cgtggctcct cattcctctt 44340 ccttggcttc ccaagccccc agggcgtcgc caggaggagg tctgtgatta caaacccctt 44400 ctgaaaactc cccaggaagc ctcccctttt tccggagaat cgaagcgcta cctgattcca 44460 attcccctgc aaacttcgtc ctccagagtc gcccgccatc ccctgctccc gctgcagacc 44520 ctctacccac ctggatcggc ctccgaccgt aactattcgg tgcgttgggc agcgcccccg 44580 cctccagcag cgcccgcacc tcctctaccc gaccccgggc cgcggccgtg gccagccagt 44640 cagccgaagg ctccatgctg ctccccgccg ccggctccat gctgctcccc gccgcccgct 44700 gcctgctctc cccctctccg cagccgccga gcgcacgcgg tccgccccac cctctggtga 44760 ccagccagcc cctcctcttt cttcctccgg tgctggcgga agagccccct ccgaccctgt 44820 ccctcaaatc ctctggaggg accgcggtat ctttccaggc aaggggacgc cgtgagcgag 44880 tgctcggagg aggtgctatt aactccgagc acttagcgaa tgtggcaccc ctgaagtcgc 44940 cccaggttgg gtctcccccg ggggcaccag ccggaagcag ccctcgccag agccagcgtt 45000 ggcaaggaag gaggactggg ctcctcccca cctgcccccc acaccgccct ccggcctccc 45060 tgctcccagc cgcgctcccc cgcctgccag caaaggcgtg tttgagtgcg ttcactctgt 45120 taaaaagaaa tccgcccccg ccccgtttcc ttcctccgcg atacaacctt cctaactgcc 45180 aaattgaatc ggggtgtttg gtgtcatagg gaaagtatgg cttcttcttt taatcataag 45240 aaaaagcaaa actattcttt cctagttgtg agagccccac cgagaatcga aatcacctgt 45300 acgactagaa agtgtccccc taccccctca acccttgatt ttcaggagcg cggggttcac 45360 taagtcagaa accctagttc aaaggattcc ttttggagag tcggactgct ctctccttcc 45420 cctccccttc ccctcctgcg tgtaaaacgg ctgtctgggg caagggtttc tcagacgtgt 45480 acattgcctg gtataagagc agactctgaa aagatgaggt ttatttaata cggacggggg 45540 agaattctgc ctgtaggcag ataggaaaat ggggagggag tcattggaag gacggactcc 45600 attctcaaag tcataattcc tagaccagaa aaagtgctca gtgttctaga agcagagttg 45660 cacagtgatc caaagaccag cttcaaatac tgtcctgtct ccttcacact tctcacattt 45720 ctctttccta ctgaaaatac cttgcatttt tcgtaattat aaagggggaa gggaatatga 45780 gtgccccctg ctttataggg gttgttgtga gtttaaatga tgtattaata catataagcc 45840 ttaagaacag tgccacacat cctaagctaa tacctgttag ctcttgaatt atccgctttg 45900 aggactggct tgcaatcttg ttttgaggca tagaaagaaa atgctttgga gcaggacgcg 45960 gtggctcaca cctgtaatcc cagcactttg ggaagccgag gcgggcagat cacctgaggt 46020 caggagttcg aggccagctt ggccaaaatg gtgacacccc gtctctacta aaaatacaaa 46080 aattagctgg ccatggtggc gcacgtgtgt aattccagct actcaggagg ctgaggcagg 46140 agaatcgctt gaacccggga ggcagaggtt gcagtaagcc gagatcgcgc caccaccctc 46200 cagcctgggt gacagaatga gactccgact caaaaaaaaa aaaaaaaatg ctttggatag 46260 aattatcact attacataaa aggaaagtcc ggatgcggtg gctcacgtct ataatcccag 46320 cattctggga ggccgagaca ggcggatcac ctgaggccag gagttcgaga caagcctgac 46380 caacatggcg aaaccctgtc tctactaaaa aatacaaaat tagcggggct tggtggcgca 46440 tgcctgtaat cccagctact cggaggctga tgtaggagaa tcgcttgaac ccaggagaag 46500 gcggaggttg cagtgagccg agatcgcgcc attgcactcc agcctgggag acaagagcga 46560 aacttggtct caagaaaaaa agaaagaaag aaagaaagaa agaccaagaa gaacttactc 46620 cctgaaaaga ttatgggcac cctccaccac cctcacttac aaagaaaagt taaacagcac 46680 taaagagtat aacaagcgca aggaggtaaa agttctaatt tttcctgtga ctactacttt 46740 ttaagcttat caaaaacatg tactacgttt taaaaaatgg attgctcaga ctttgctgat 46800 gccttaagca catgcttaat ctgcctactg gataatccag ctctgtttaa aagttatatt 46860 tcaatccctg gttgacttaa accttgtaga cccagtatat cttgtacttt tagtgtctgc 46920 ttgattttaa aacatgtagt ttttaaaatg aagccaatga aaacaatttg ggatgtcaag 46980 tatgttatta aaatctacaa tgcattactg taccatttat attttcctcg gggtacctct 47040 caattagctg tgtagcaatg atagggaaaa ttcaaactat cgataaataa aattatttta 47100 gtttagttta agatatttta tgatggagga ggaagaaagt ggttgccagg atgggaggga 47160 gggaacacat ttccatcact aatacaatgg ttctttcttt ttgtttgttt gttttgtgtg 47220 tttttttgag atggagtttc gctctgttgc ccaggctgga gtgaaatggc accgcacgat 47280 ctctctcggt tcactgcaac ctccgcctcc cgggttcgag caattctcct gcctcagcct 47340 cccgagtagc tgggattaca ggcacatgct gccataccca gctaattttt gtattattag 47400 tagagacggg gtttcactat gttggctagg cttgtctcga actcctgacc tcaggtgatc 47460 cacccacctt agcctcccaa agtgctggga ttacaggcat gagccatcgt gcccggccta 47520 cagtggttct taatgggggt gggagagtgg gaagagtagg ctccttcaag agtctgttga 47580 aataaatacc ttcttctcaa aaaagaaagt aggtaatgat tttttttaaa aaagatgtgt 47640 tcacttgcac atgtatttct agataaaact ttcagtgaat tcagggattt ctctgaaact 47700 ctaccatgga ttcctacatc aagaactctt tcagctcttg tgaaaaatat atatagctat 47760 tggtgaagaa gatgggagat gcaaccatat aaaaacaaca tttggatgca ttataaacag 47820 gtgtaaaagt tgactgcttt ggaaatacca agaacaagtt ttagatatgt atatctcata 47880 tcttgcagta gagctctgga aggattatgg catccttggg tggggccatt ttgctctaga 47940 aattgaagtc cattatccat tataaatctt atgtaggggg gaggggggag ggatagcatt 48000 aggagatata cctaatgcta aatgatgagt tgatgggtgc agcacaccaa catggcacat 48060 gtatacatat gtaacaaacc tgcacattgt gcacatgtac tctaaaactt aaagtataaa 48120 taataataaa attaaaaaaa tattatgtaa ataattaata atagtgggaa aactttccta 48180 gtttttctgt taaagagccc attatactcc cagtttactc atacatatcg acctgaggtg 48240 caaaatccta gaagaatgaa aatataaagt cctggatctc tgtgctcctt atgccagtct 48300 cagatttcct atgtgcaaaa tgggattata atatatttca tgtggccata aaatatgata 48360 atgtatgtcc aaaagctttt aatgtaaaaa tttactacat ttactaaatt tactaaagtt 48420 tgttggttat tgttattatt attctcacac ttacttttcc tctttcctga gaatgccatt 48480 ctttttttag atttgcactg cctttgcagt tttgaaaatt ctacacgtga aatttaaacc 48540 tgtcttaatt ctgatcagtc ttataacaaa aaaagactac cacctgttca ttcattcaac 48600 aagctcagaa actaagggca gacatggggt gggggcagag gggagtaggt caaacatagt 48660 atctctacag tcagactgcc agggttcaaa cctcaactgt tccacttatt ggttctttaa 48720 cttttatcaa agttactcaa catgtctggg cctctgtttt ctcatttgca tgattaggat 48780 aataactgta cttgcctcaa acagttgttt agggattaaa tgaagcatgt aacgctctta 48840 gaagagcaaa ataaagcaca gaatgataca agaaaatgaa aaggtgacca aactcattct 48900 catttgtctc tagtaggcaa aggcttccgg atgctgagag ctgatcccag tcttgaagaa 48960 tgatgtgaga gtttaaagat ggaaaagaag gagaaagata ttctaggcag aggtaagagg 49020 atgtgcaaag gcatagaagt ttaggaaaac tgaaagtgat tcatttagac ttattcctga 49080 aaaccagcct gtgaaggact cctcagagag ccaaaagaaa aactaggata atgggatggc 49140 aaggaagtgg ggacactgcg ttgactactc tttcatagct tggttgtgat agttcaaggc 49200 cctatgccat gaagtgaggc agatggaagg tggaggagac ctgagcacac atatacctgg 49260 aagggcaagt gccaagtgaa gagaagggaa agttagaaaa gaataaaaga aaagttaagt 49320 acacaggcaa gataggatat ttttgaggac ttgaggtccc tcaaaaataa tgaagaaata 49380 gaactcaaag tacagcggtg gttatagatt ttgtcacaag agatacatag atttgggagg 49440 gagaaaaggt cagaacgggg aggaagttga ggcacttcct tctatgaatg aggaggttag 49500 cttgtttgca gagtgaaaat aagatggtcg gttaggaagt ttgagaatcg taaaggtttg 49560 gaatacctct tatgagtaga gaggatgggt tgagtaagac tcagacagag aagccttttg 49620 ttttgttctt taaaaccaga ctggagaacc cagctgaggg tggagatcat gacacagtag 49680 ggacacctga ttactttctt taaactaaag aaagccctgc agtggtgcta ctacttcagc 49740 aaccctacaa atcaaagact agtcataata gatgtgaata ttaattcaac atattaccat 49800 aaagagacag aaagatactt gagaaggtag tgttccagag ttgggttctg gttctgatgc 49860 ggcattgtag gattggcaat atgcacgtat ttcatgggat aagcaagatg attttgttag 49920 gaaaataaag ggagttgagg caatagctct acactgagac caagtgacag ttctcatgta 49980 tctaatgaac tattttttga ctgcaaaatc ttttgagatt atttctagat tcattgtcca 50040 taattttcaa aatgggctct ctcttgttct attgtttacg cttgaggtga gataatacac 50100 acatatttct ttaccagttt caatattaac attattatta aagataattg ttttaaatat 50160 agcttggtgt taaaaacaaa atatacatag aatatctctg gggagataca ggaaaagctg 50220 ttacctgtga ggtaaggaaa tgaagaactg ggatgggcat gtgacttact tttcacattc 50280 catgatttat attgtttgaa ttttgtacta tgtccatggc ctttctaatg aattaaataa 50340 acataataaa actagtagac aaataagtta cttttattag aatcatcatt cataacttta 50400 gttgaaaaag agtaactgag tacctaatat atgtcaggca ctcggcttaa agttgtcaat 50460 attaattaag aaagaaggtt tcttagtcaa gagcatgtat tggtaacaac catcaatata 50520 tttgcttctc tgccaggcgc ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccga 50580 ggcgggcgga tcacgaggtc aggagatcta gaccatccta ggtaacacgg tgaaacccca 50640 tctctactaa agatacaaaa aattagccag gcgaggtggc gggcacctgt agtcccagct 50700 actccggagg ctgaggaagg agaatggcgt gaacccgggg ggcggagctt gcagtgagcc 50760 gagatcgcgc cactgcactc cagcctgggc aacagagcga gactccgtct caaaaaaaaa 50820 aaatgtatat atatatatac acgtatatat atatacgtgt atatatatat atacgtgtat 50880 atatatatac gtgtatatat atatatacgt gtatatatat atacgtgtat atatatatat 50940 acgtgtatat atatacgtgt atatatatat atacgtgtat atatatatat acgtgtatat 51000 atatatatac gtgtatatat atatatacgt gtatatatat atatacgtgt atatatatat 51060 ttgcttctct ggaggaggaa ggtggtcttg aactgggatg agctcttgag tggagcctac 51120 agtaatcatt tgaggaggga agactggggt gatgcattct gataaatgac acctcacact 51180 tgtgttacca ggaaaaaaag atttcagagt ctggaaaagc tcccataatt aaagagaatt 51240 ccttaggaag tagcttatga gagcgagata tatgccctgt aatggagctc ccaggtacag 51300 ctgtgttaag ccttcataga tgagttctag aataggatgt tgggtgcaat agataattat 51360 ttgaaggcaa aggcaatgga ggaataattc catgcatccc tttaatttag aaaagcaata 51420 atgtaaggaa attagagtcc ctgtcctagt tctaccacct actttgttac cctgaaaaaa 51480 tgactttttt ttttttttac tagcttcaat gtcttgatct acaaaacggg tataatcaca 51540 aacatgtaaa aacagattgt ggtttagccc cgaagtgcca aagtgctcct gaagctgccc 51600 cggataaaaa ttctgataat cgagtccaat gtgggtggta agagcatttt aaacgggaaa 51660 gaaacacttt cttaggtaaa taattgcaag gtatttaatt acttatgttc cacaaggaaa 51720 aaagatagct tcagcatgaa agggagacct ctgagaaagt agagcagacc tccaaacaga 51780 tttgctaaga aaaaacaatg tgtccctggg agtagatctc tagaagtttc aaaacattgg 51840 atgtttcttt ctccctttta ctattctcta tttaattaaa ttcaatatag cacaattatt 51900 tagtatttgc tataaggaag gtactctttt agaaactctg tgccaacttc cctcattcag 51960 aattactgta aaatttatct tcctactcaa actggatctt agtaaggagt acaaaatgca 52020 aaattctttg atgtgttgta gatttaatgc ataattatag ttaagtcaca attttcaacc 52080 ttagtttcca aaatgttaac tgggtataga attagcagta cctattatca tcttcccaag 52140 aatattttga aggaaactta aaagtatatt acttattata tagcaggtat cttttctaaa 52200 ttatgtgcaa aacaaatgtg attttaaatc tatgtgagaa atttactatt aaaatatctc 52260 tagggtgtac tcttgtgaaa tgagggatct ttgcagctca tggagacaat tattccttaa 52320 cttttttgta aatttttttt atgttgataa attacttgtg gcgaattact tatatctatt 52380 tgtagctatt tgatcagctg agaacactaa aagattagca cagtatgtat gtatgtacat 52440 actatatgca catatttggt atatatgtat attatgtaca gcacagatat tgagaattga 52500 cctcatcctg aggaacaaaa taagtaataa acataattag aggagatagg cagaaagaaa 52560 tagagataat aaaaaattca ttaaaagttg ccaagaaaat aatggctatc attttttcaa 52620 cccccagcta tgtgacaagc atcaagcagt tttatatgtg taatttataa ttccacagct 52680 gtcccatggg atagagagta ttattctttc ttcataatgc agacaaaaaa aaaagctcag 52740 agtgcttaag taataaggaa aagaaaagtt caaacttaag gttctcagtt ctgtttgaga 52800 ggtcctcact ctccctacta caatatgttt tcctaatgat aatttatcca gtacattgtg 52860 gacaactcat caatgcttcc ttttctttga ggactctgct ttagagcaag ttgcaaaacc 52920 tgggccaaga ttactgactc tccattttca gaaactactg tgcttctatg attattcttc 52980 agtagtaata catagtgata gaaatttgga actcaaagac acgcaaagtc ccctgaaagt 53040 cacttaattc agtcccctca tttttgaatg atttgctttc ctgattaaag ctcacatatt 53100 taaaaataat taaggaatta gctgcacata gaaaatgaaa aactacccca cacaaagcaa 53160 taattattaa cattttgaaa tacttcttcc tttttctttg cttaatcttt acattgtgaa 53220 tattatgcaa ttttgaaatg agctttttct aacttattac agcattttcc aaacttctcc 53280 aaaaacactt cataaatgct acttttaaca gctgtaacac atcccactgg aaaaagttat 53340 aatttactta atgatgtccc tgttgtcaga tatttaaggt gtttctaatt gctactaaaa 53400 atagtattgc agtttttcaa agggtagaag gctcttgaat atattgtaaa actgcttttt 53460 aaaaagccac cattttgatt tatagataac aaaatggagg agtggtacat attgaggaac 53520 tatgtagcta tggttactca gctaataaat gtttgctgta gctgttgaag tcagttcctc 53580 tctccattct ccattctttc tatggccaca gctacttaat tggacttaat gtgggtggcg 53640 ggaaatgcca accatatcct taatcataat tttggaaatg acacatatgc aagtgggaca 53700 agcctagtct ttaaactcag atagaactga cctctcattt accagctctg tgggcttgaa 53760 taagttatgt aaactttctg agcctttatt tcctcacctc acaaagtggg gaaaataaaa 53820 tttaccccat aaggttactg tgaggaataa agaatgtcag atatataaaa atccgggtgc 53880 acggtaggct ctcaataaat ggtgcttttt aattttttga gaatatatat gacatttact 53940 atgaagttat tcatttaggt catcaaaata aatgtccttt tgagtaattt ttcattaatt 54000 cctgtacatt ctagcaggta tctgtggttt caacaagcaa attctcttct aaaaggtatg 54060 atgctacctc tgaattctaa ccctctgaaa aaacagcttc tttgtaacaa agtttcccat 54120 gttatgacag aagaatttcc aaaaaaaacc cctcattaaa tcatgagaag tgacactgga 54180 gagtgtcact gtgttcagtg tttcctctgc attcattgct acccacctcc actgcttgga 54240 gtgcatttca agtggaaggt acaatggaga aactacagtt aaaactgagg aattgcaaaa 54300 tttactttct ctaaactact tttcctaacc tccctctttt tcattcttga taggacagat 54360 tttcccctct caaatatgct gtccttttta attgctaaca caagcatata taatatctca 54420 tttctgctta tgctgctgat gtacgcatgt gctgttagag ttctgagata atgttgaaag 54480 tcacagataa ataataatgt attcggtttt cactactggg agtggaggtt taatattcat 54540 gtttcactga taggtttaac actggtttag gatactctaa tttcaggggc accatctaca 54600 tggaagcttt tctcatcaaa tggagaatgg ttgtccccct tttgcccctc taaaaaacta 54660 tcctttaaaa gtagcttgct ttcttgggac tctatagtct tactgttatg ttcaattttc 54720 tgtgtccttt cctgaactta ggagagttct gaagccaatc tcccctctga tattattaaa 54780 gattgcaaga aaattttctt gtgttagacc attcttcccc aaatcacatt cttcacctga 54840 tatgtgattc aactccactc aagggaatca acttcttgat gaaatataat caactttgat 54900 taaataagta actgcttcct attcatgttt tagcactttt cacatacaga tttaacattt 54960 ccactcatgt tttcctttga gtctctgggt tgagggtaga gttttatctt ttgtgttgtt 55020 acggttaaga tgataacttc cataattaat ttttcaaaaa ggcaatgata acagaatata 55080 ctgtatgttt actctgtact gatttaaaac ccccaagtca atttagcctt aagaaagcat 55140 actatttagt gtattttgtg ttactctttg atatcctact tctaaataac ttcttcacat 55200 ttgcataaaa ataactgaag gtcaccctcc aaggtaggca ttttgaatgt cgtaaggatg 55260 acagtaatgt ttctgcctat cattcctttc atcacacaga cacacacaca cataattttt 55320 tatactaaag aatttttaga aaattgtttt ggtcaaaact gttgattcag atattcagac 55380 tgtgacaacc attctgaagg aattaaaaat ccagttatct tcagtgattc ctttggaaat 55440 tattattctg ggttattaga tagatagact aataactttt tttccagttt tctaaagcta 55500 ccttgatttc ctgtcttaga aaacaggggt tcacaaacac tgcttaatat ctctttaatg 55560 attatgaata ctagaatagc ttagaggtat accctaaagg ccaccatata gatcttctgt 55620 acagatgtga atttaaaagt atgcaaattt acactgattt tacctaacac cttggaacat 55680 accaggagtc tgaatacata aatatatttt tattatgata tgtatatttt taaagtggag 55740 tttagaaatt tctagctaca ctgaaaaatt ataatgaagt aggtatttac tgtaaaaaac 55800 taatgtgctt tcttaagggc atagtttaat taggcactat aataactgac aaacgtacac 55860 tgtgtaaaag tttacagtga ctcttcacac atactatttt atctacctct tattacggga 55920 ctaccatagg gtctcaggtt tacagatgag aacatgaaag cactgagagt ttctcatact 55980 tcattctggt accatgacag ctaataagca aaagaaatag aatctgctca caggtcatgt 56040 gaatgctaaa gaaagtaatc tttcaactgc acgcttcaag tggttcctgt gctggtgaat 56100 aggtatccca cttattgctt ttaaattaag gtaggaataa gtaatttata tgtacagtca 56160 tatgagaatt tttcactggt tttattttgg tcaaaaaata aatttttgaa agatgttaac 56220 ctcctttcaa ccaataaata tttactgtga cttatacggc tgatgcttga gtatagtaga 56280 ggcccaaagg ggttaagcga ctttcaaaat aatagttaac taaaagagat ggaactgaaa 56340 ccatatacat atttatagca ctccatgggc aaccaagttc aactatatat gaattactag 56400 tcaatgactt ttggtaggcc atgcaaccta tctgagcctc agtctccaga tctacaaaat 56460 gaaaaaatga aacattgaaa acataaggat attgtgataa ttaaattaga taatggaagt 56520 tgaagtgtcc tattattgtt aagctcctcc taattgtttt tgaagaaaac aataacttta 56580 ccatgtgatt taggaagaaa gtttcaataa gcttttaaaa attaaatgtt aaatataata 56640 tattcaactt caactattca gcatgtaaat tgcatggagt aaaattcaaa gtgtccgatg 56700 ttggacattt aacaattaga tgttcaactg ggggagtcat tgttctctag acagctgctg 56760 tttctttaaa ttgggtgaga gagttataca attgctgagt cagatgatct ggcagcctga 56820 aagagaatga gagcaagaaa atggtggcac tcgagaaaag aaagcaaaac aagctttttc 56880 ctaatacatc agcaaagtca ctggtgtaat attagacaaa ttttagctta aaagcagaaa 56940 aatgatcatt tgaaaggcat gatattttag tttttcttat aattgttact ttttagctta 57000 catttttcat ctatatttcc ccccccatca ctgtgctttt acagagacat aaagacccat 57060 cattttgtcc ataaatgctt tattctgtta tggctacatt ttcctgcaat cttgccctga 57120 tcttagataa gcataagtta aacctgtgaa acacttgtgc tttgattttt cttttttaca 57180 taattttagg ttgtcatgtt tattacgagc ctggtctgga tcataaaatg aaagaaaccc 57240 cttattacaa cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacagaga gagagagaga 57300 gagagagaga tccattcatc ctgcacgaac agaaagaagt gtatatagtg ttttaaaaag 57360 acaacgtatc ttatatagct tatgtggaaa ttttctgtct ggttctgtaa gctttaaaac 57420 acaaatatat cttgttatat ttttttctct caaactatgt tctgactgta aaaatgtggt 57480 atctacaaga cattcttttc caattcatac aaagggtcac ataataataa agggtctcct 57540 tcatttggtg aaataactcc tccactgatt actcagactc tcctccctgg gatccagtaa 57600 actgactcta aacttaaaat cttacctaaa atcctggacc tcaattcaaa gataaagaag 57660 cagaaataag gtttaaaaag taaaattggt catatttgtc aaattgtgtc ccaatgggcc 57720 acttgtatta gtatctcctt caagtgttta tttaaaatgc agatttctgg gacccacagc 57780 aaatctgaat caaattttct gaacgtgaac cccagaaata tgtattttta aaggcagccc 57840 aggtaataat gctgttgtta acctttgcca tacttttaaa atttctagtt actcacataa 57900 ttcaattaag aaagcagagg cttttttatt tacgttacct tgattgtacg attttattag 57960 tttcaatttg cttaagagat tacatgtctt tgttcatgta attctgaacc tctataaaac 58020 ttttctctct taaaaaaatc ctactgcctt cacaaccatt taaataattt atgatatttt 58080 attttgaagg tgaaagagaa aactgagaaa tagttgaatt aaaaaatcct ttgtgataac 58140 atgtttatat tttcatgaac aaagccaata agtcataaaa attaaaaatc aacatactat 58200 tttttgaaag gacctctgat gctttgggaa tttcaatcct gtagttgatg gctttcactt 58260 ttttttccct tttattactt ctttttgatt gtagagttct gcccaaatga aaccatcatt 58320 ccagggctca tgaattaaat gaatgcactg agagacactg acaagcactg agaatttctt 58380 caaccaccct ttttaaaaaa caaatgctaa ttggacataa atatgagaac aatagacatt 58440 ggggactact agatggagga gaaagggaat gagcgagggc tgaaatacta cctactgtgg 58500 gtactgtgct cactacttga gtgacagatt cagtcgtact cgaaacctca gcatggtgca 58560 atataccttt gtaattaacc tgcacatgtg ccctctcctc ctaaataaaa gttgaaaaaa 58620 aatctacgag gcactatatt tttaaaaata ccactatgta caaggcactg tgctatatct 58680 ggaactacaa atattagtta aatagtccaa gattcagtgg gttcagagac tctaagtatt 58740 tgccattccc tttagatgga aacgttcttt ggtccaccaa gccctatcgt tctgctcttt 58800 ggaaattctc cctcactttc ttcataatgc cgtccttgac taactctcct ctagcaatac 58860 tattggtttt gtatgtgatt taaaatcatt cctgtaattt cttctgttta tatggcttcg 58920 tacaagagat tcacattcaa caaatagaaa aaaaacgcta ttgacatttg gtagcttcga 58980 caattgtaaa cacatgtggg tttgctgaat acacattaaa atagcatgaa ttaggatatg 59040 gtaaatctgt tgcggtccca agttggtggg tttttctagg aagagtcaga ccctttaaaa 59100 ggacctttta tcatctacca aacaaatcct tcatttatta attcccaagg ttttctccat 59160 cggttggctt actgtcatgg aaattgatct tgttttaata gctacttact tttttttatt 59220 ctaatcaatg atttcatttg aaaagaaaat tttcaaacat ggggaaagct gcaatataag 59280 aagaaaacaa tggagagaca tcgtcactgg aaaaatacta cgggccactc tctataccat 59340 cctgcacccc cagatggaga aactgaggga agtcgtggcc tttcaacact cttgggtctc 59400 catctggctt ggaagggaac gaaatggctg tcaagagtct cagaagcgca ctttccccgt 59460 ggttcctccg ggtaaccctg actcactttt catctaccca tcccctccaa aacaaggcct 59520 agccagttcc aagctggaga ggtgacccag agttgccttc tgtcatgtcc tgcctttcgt 59580 ctcgagtcca ctaaccccac tcagactctg tctgctccca cccccaccgc ggccagtgaa 59640 atcccaatcg tcttccacgt ggaaccccag gtccgcagtt atgataacgg atcacatcgc 59700 tcctgcggaa agtgcgcgcg gtggagtgat aattggacct agcgtctaaa ttcttgttgg 59760 aggacctcgt tccagctgcc agttaagcct ctgggatccg cagcgtctct aggaattgag 59820 agagtgggga agttaggatc caggaggagg atggtggggg ctgaggagtg gaggagcagc 59880 gtgcatctca tctcttgtcg ccgggcgggc gctctttcgg gtccagggcc cttgcacccc 59940 cagcgtggct ccggaggcgg cgagacctgc ctgaaattga ttggagggga ctagagtgtg 60000 cttgtggggt ggggtagtgg gggcggagag aagagatccc aagaagggcg ccaagtgctg 60060 tgaccagagg cctaacacga ggcaccttgg aaacaggtat agctacggat ttatgggttt 60120 taaaatggaa cgtcttggtg aatggacata gcgtgcattt cacagtctga cgtcacagcc 60180 ctcgcaggtt ttcccagacc ttaaagccac gttctcgtgt atgacactta aacaactcag 60240 tttccttgtc tttcctccct ccctacccat ctaagggtag agaagctctt agttcatcca 60300 ctgtgtagga ctgttaccgt gtgtcaaagg ctttggaaat gtatatttta ctgatgatgg 60360 tcatagcact ttggaaaact caaaagtgaa acgaagaaaa taaatatcac caaacttttt 60420 cccaacccct ctcatcctgc ggaaaccatt ataactaatt tggtgagaga gagagagaga 60480 gagagagaga gagagagaga gagaaactgt ttactgtttg gaatcttgct ttaaaaaaac 60540 ctgactttat aatgcaatca tttaacagtc tatgaaatat tcttcagata cctgatgatc 60600 cagaatgtaa ctgtaccata atttaacact ttattgctag aattttatgc agtttttgat 60660 ttcttgctac tacttatcca tctgtattaa tctttgtcag aacctttctt tccttaggat 60720 gatgcctgaa tataaaatag ctgaatgaaa gtggatgggt tcattttaaa atacaaaatt 60780 gtttttcttg atggtgaagt gtttaagagg tggattaatc tcattgggca acaaatagag 60840 aagatattag tagttaggta tatgagaatc agaattcaga taatttgtct taaaaattca 60900 tattcaatgt aaaaatttta tatttagaaa atgaaactgt acccattgtt tatataactt 60960 aaactgccaa aataaagcac cacaaaaact ttttatcacg ttggtttttg tatcaggctg 61020 ggctttgcag cagatggagg agctagggca agcttgtcca acctgtgggc ccgagggtca 61080 catgcagccc aggatggttt tgaatgctgc ccaacacaaa ttcatacact ttcttaaagt 61140 atcatgagtt tttttttttt tttaagctca tcagctattg ttagtgttag tgtatttaat 61200 gtgtgtccca agacaattct tcttcttcct atgtggccca gggaaggtaa aagattgaac 61260 acccctggcc tacagtgttc tactatgaag tttcagtttt agttcggcct agaatgtttt 61320 agtacagaag gcaagtgaga ttttctctgt ttctccaagg acttttgaaa aagtgtaaaa 61380 gcactgggcc cactgttgaa ccttgctata aaaaagtatt tttgatacca tttgtatcac 61440 tttagtaata ggagtttttc atatgttggg aaaatggttt agcttaactc tatcatggta 61500 gttgatagtg atgaactaac gtggaataat agatctgtaa accatcatag acggtaatag 61560 gctatgttgt tgctacctta ggatcataat ggactttcta aaattcaaga gtactcaaag 61620 aagtaaaatg aatataagtc ttgatttctg aaagggctat ggttcacttg gaacacaata 61680 caaactgtga atcatgtaca catggggaat aatggtttat actaactgca cagtgcttac 61740 cttgagagga ctctgtgcta ttaaagaaaa aaataacctg agccttctga agtagctata 61800 aacaaatgaa tatttaactt cataataaaa atatgactat tttgtaaatg caccaaggta 61860 gaagtaacaa atcaactatg gcaatttttc aggtttctgt ggttaagaaa ctggtaacgt 61920 ggaattttag tatatgtatt tccaatcata taaaaataaa aagtcataat aaacatattt 61980 gcagaaactt aaaaaaagtt aaaataacat cttatttgca atgatattaa ataattcata 62040 caagtaattt ttagcacttg tgcctctcaa ggaattgtat gaatcctaac ataattagta 62100 tccatatata ttcccaaatc aatatagcca tgggcataaa atatattaat gtgaaatata 62160 taattacata tcattataat taacaccgct agattttata ttatgtatat cattttacat 62220 atgaaattgg aaaattgcat atatttcaag acattctatc caagctgtgt tctatcttga 62280 gaaacttcct gaagattgcg cttttcacat acgtcctgaa aattgattta tacctaaata 62340 acaaaaaatg atctatttca atgaacctat catttaaata tttttgcatt tcatgcatat 62400 acattaacat actataaaat attttctcta acttaaaatc accacaatgt tatgttttat 62460 aggcctaaac taaaaaatac ataattatgg catttatata cattgacatg ttctactttg 62520 ttactacaga ttttcagagg caacttaata atttaaacaa aatgatttta tatagaataa 62580 tattaactag agtaataaat atttttatat agacaataat attaagaact atattcatac 62640 agttaccggt cacagtggct aaacttttgc tgatacggat aaaccactgt taaaaaaaac 62700 aacaaccagg gtcttgtcaa tgtttcaaaa tgaattaaaa tcaaatccag caacaggccc 62760 tgaaatcctt tataagctcc tttgactaaa ttaaaaaaat taacttgcat aatatgaaaa 62820 gtaaaaaata aaatgtgcat ttatcctata gattataaat ttttgctaat agaaattgag 62880 acactaaatt aaacactgat agttttaaca ggtttatatt tccatgtcaa agagacaatt 62940 aacattgcag taaaaaaata attacccctc cgctggcctt tgctttttga agctatatat 63000 tcctggcgaa gcataccaca aggacggtca taaaagtgaa gcctcattaa attactttta 63060 gacttattac acaagtttta attagcattg tacatatttt aactgtacat atattctttc 63120 agttttcctg gttataggaa attacactgg ctgtgtcaac atttgtcaat gtgaggacaa 63180 aactaccttg gattctgttt ttcaagaagt aggcctcatt tttaaactgt gctaactgtc 63240 gtctgagatg actaaaatac tatcagttgg gatttctcag gaacagttct acagttctgt 63300 cgtttgctaa acatacgagc attgtcccga gcagtttcaa tcactcaggc cgccggacct 63360 ctacctctaa ctcacaaaga aagcccattt ccctgttggc tgcaaaactc ccccaagaag 63420 caagtgcttg ctcctcgcag cagtaactga tcctacgatc cttgttagca tttcaggaag 63480 tcgctgcctg cgtgccccgt atctcacggg tcctccactc tcctggaagg tgggagaggg 63540 tgaccccgcc gggaggctgg ggagaaaaaa ggccgcctcc agaaaactta gatggttagc 63600 aataattctc cccaaggaga aagaaagtgt gcttgaaata cacctttcct actgtgtgtg 63660 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtc ttagtcattc ccacccagga 63720 tattcgggac tcactgactt ctgaggtggg tttagaagct ctgttcgcct cagtttccca 63780 cgattgaggg gctgtgtgaa gggaggtcca ggttcaatgg tactgcgaga accacatgtc 63840 taagtcgttg taacccgaat ggggaagcct ccaccggcgg ttatctcctc ctcctcctag 63900 cctgggctag agacgaatta tctgtttacg aaatcacacc aaacaaaaca agtgccgaat 63960 gcgccccgga cttttcgagg gcctttccta cctggtcttc taggaagcgg ctgctgccct 64020 agacgctggc tcctcagtag catcagcacg agggccacag cggcgggcgc ccctggcgct 64080 gcccactccc ccgtgagccg cgggatgtga accacgaaaa ccctcactcg cggcgggccg 64140 cacgcgcgcc gaatccggag ggtcaccaag aacctgcgca ccatgttctc gccgcctcca 64200 gggccgagct cggcagccgc tgcgccgccc tttggcacca gaggtgagca gcgccactcc 64260 tgccccctta actgcagact gggacccacg caccgccccc tgcccatctc cgccccgcag 64320 gcgcgcaccc gccttccctg agcgcgcccg ccccccacct tcacccccac ccccacccca 64380 cccccactcc cacccggacc tccaagatct cggaacggct ctgagccctg cgcacgcggg 64440 aagggctgcc ggaggcgccc gtagggaggc gcgcgcgcgg gcggctcagg gcccgcgttc 64500 ctctccctcc cgcctaccgc cactttcccg ccctgtgtgc gcccccaccc ccaccaccat 64560 cttcccaccc tcagcgcggg cgccccgcgg tgacggccca ggggccggac gcctggaacg 64620 caactccagg cagctcgccc cctagctaca tccgtcacct gacacggccc taccaggaac 64680 agccgcgctc ccgcggattc tggtgctgct cgcgtccccg ctcccctatt ccccttattt 64740 tattcctggc tcccctcgtc gaaagtcttc cattcttcaa actagattat ttaaaaatga 64800 aaaaggaaga aaggaaagcg aggtcatctc attgctctat ccgccaatca ggaggctgaa 64860 tgtcagtttt gaactaaaag ccgctccgct cctcttctag atttggaaaa caagcgaaat 64920 taaactaaac cgctgcacgc ctctgacgcg acatctggac acggcgcggc gctggcgctg 64980 ccggagctgt cgacccggcc tggcgccgga ctaggtaggt ggagtcgcac ccgggggtcc 65040 cagctgggtc cgggcgccca ttcccctccc agctgcccgc gtcgccgagg gcgcctggct 65100 gggacaagca ccgagtcctt tgtgtctagc ccatttttat tttcggtttt aaccttcacg 65160 acagccgcgg agcatctgag cgcttcttcc tctttcctct tcccccgcgc tcccctcccc 65220 tgctggccgc tcccctcctg tcgccgcgtc ctcgcgtaga atggttgtct tggcgaccgt 65280 tggccgctgc cgcctccacg ctctgccccg cgcccagaca ccccgactcc ccttgatccc 65340 gccgcctgac tcctcggcgt acgttctctc tccggtctcc ccctccatgt cccctcctcc 65400 ccttttcttc cacatcaccg atcctttctg gactctctcc cttcctcctt tccagctggg 65460 agacaggaaa agcggtcctg tttgggaaca gtaaaagcag ggcaaggaaa ggaaggagcg 65520 gcagaaagga ggggtgagtc gaggacacag gggcagccgg agaatgcgga ggagccgggt 65580 cctgagcgcg gtctaagcga ggctcggctc tcgtccagga actcggacgc gggctcgccg 65640 gctctccgcg cgcgggaagt cgagcccagg acgccgcctt caggccggcg cgctgacccg 65700 gtgccccgac ccggagcctg cggtctgcct ggatccgtcc taaacctcgc gggctggacc 65760 cgcggcctga gtgggtgggt gtgtgccaga ggattcggga ctaggcccag ctccgggaac 65820 ctggaaatgt ggcccgcttc tcagtggctt cctgttcatg cgcttgggcc tagtggccta 65880 gttgaagaag tggaaccaca gcgtgagccg acagggcctt acagatcaga cgtcaagccc 65940 cccagacctt acaggggagg aaagtgaggc ctgcactggc cgagccaccc acttaaggcg 66000 gtgcggtagc ctagaggagc ggcagacttc tctttcccca tcccccgccc catcacttga 66060 cgttgctgcc ggacctcggt acaaacccaa gacaaaacgg ggccctttgg aaaaagtgag 66120 atttagcgat cactcttacg tagccactct aaatatctat ctagatattt acaaatgcac 66180 ctccccggta ggtagatttc actcagaatt tacccaacac cgtgctttgt gctggggcca 66240 catgccacct ttctgtctag tatggctgct ctttctccct cttcgcaaat atagctcttt 66300 ttccttcagg tctcttctga agtaagtagc ccttcctcag aaatgcttcc cttttcaggc 66360 accctcatac caccgtgatt tttttcttta tagcacttag gacgaagaga ttattttact 66420 tatgtacttg tttacttgtt tgttgtgtag aatgtcagct ctatgggaac cagatccttt 66480 tatgggtctt cctctgcacc tatgccacgc ccccagcatt cccctcctac caccaccttc 66540 agccggcctc cgcctctgta ggggggcatt aggttttctg tcccacagag gaagggcgct 66600 ttagaaaggg ttagttcatc ctggaagaaa aacgatgtcg gatgccagca tagtgtcatt 66660 taaagatact ggaggaatgg agtgggagcg gtgagggttt cttgggccta gacaatgtaa 66720 ctagttgttg caataaagca tggtggggaa aggagaaaag gcacgtatta aacatctttt 66780 gaagtcgcta tctatatcag tcagttctcc agggaaacag aacccattgt gtgtgtgtgc 66840 gtgccagtac cacacatatg tatatgtata tacacaccgt catggggttg cttaacaaca 66900 gggatacatt ctcagacatg tatctttagg cgatttcatt gttgtgcaaa catcatatac 66960 aaacctaggt ggtatagtct attatacatc taggctgtat ggtatgggct attgctccta 67020 ggctgcaaac ctttacaaca tgttactata ctgaatactg tagataattg taacaaaatg 67080 tagttttata tctaaacaca tctaaacata gaaaaggtag tatgttgtgc tacaacttta 67140 ggacagctat gacatcacta ggggatagga atttttcaca tccattataa tcttatggga 67200 caccaccaat atgtgactgt ggttgactga agcatcgtta tccagcacat gactctgtgt 67260 gtgtatacaa ttttatatat acgtacatta tatgtctaca cacacatatg tgggggagag 67320 aaagagaggg agggagagag agagagagag agagagaaag agaaagagag aaaatactta 67380 ttttaaggaa ttgtctcaga aaatggtggg ggttgacaaa ttggagaccc agggaagagt 67440 tgttgttgca agacttgaat ccaaaggcaa tctggaagca gaatttcttc ttccttgagg 67500 gacctcagtc atttctctta agctcttcaa ctgcttggat gaggaccacc catattattg 67560 aggataatct gctttttcaa gtctactgac ttaaatgtta atcatatcta aaaaatacct 67620 ccacagcaat atttagactg gtgtttgact caaacactgg gtaccacagc ctagccaagt 67680 tgacatacca aattaactgt cacattatcc cgtcatgcct gaggggttct ctgaccctca 67740 gttttctgag gatcaaattt aaattgaggg atctatcttt gtttattgga gccatatagc 67800 tcaaagtata atcattttct ctccacagga actagaccta gggataaggg taattgctta 67860 tttcagagga atgccatctg aataaaagga taattatata gtaagctctc tgttcaaaaa 67920 atgtaaatat taaagtttga acatctaaat tccatcttgg tttcccccac tgccgctgcc 67980 caatacctgt tctctttcag ttgcagtatg caggggaatt ctaagtttaa tattagtctc 68040 agcaaaatac aatggtgaag atgactcttt ctagcataac aatgggtatg tggtattcca 68100 aatacttttg gaatgcggag tgactattgg ctatgtgctc ttcaaaaaat taataatgaa 68160 gaactgagca tgtaatttca cttatattac ttattttatc ctcacagtgg cctttcaaaa 68220 ttgggattat tactcctgtt ttacaggtgg aaagaatgag gcctagaaag gctcaaatct 68280 tgaacacttc atggccagca agagccaggg ctggaatcat caggcaggcc tttgggttac 68340 aagccttgtg ccttttctgt tgtcccaaag gccagggtca atagggagtg agttatctgt 68400 gggtcactta tgcagacaga atcactgaat attggaagtt tttggggttc tcttccactg 68460 gcctaaaaac ctgagttaat tgagtttttt ttaacagggg taaataattt tctgttttag 68520 atcagcaaat tcattccata ggcagggata ggggagaaaa atcttactga atatcccttg 68580 tcttgttctc ctcctcccca aacttaatgt cctatgacac tagctttatc ccttaggtaa 68640 ctcttgatta tccaaatttc atgagaaact ttcctaacat tgcacatgct caaactcaaa 68700 accccaaagt cataagaaaa aagataacat aagcaagaat aaaaaacaat tatttgatca 68760 tatatgtcaa aagattaatt actagactat ataaataaat acataatcca gtaaaacaac 68820 aatccaataa aaaaggcaaa ggatataata gtttatagta gaatatgtgc aaatagtaaa 68880 aaataaaaag ataatcttac tcattaataa atgtaaacag aaacaatggc atataaccac 68940 aagtgtggca aaaagaaaaa agactacttt gacaaagttg tcaggaaaca atcactctta 69000 ctattacaac ttggtgtaat tgttttgaaa ggcagcatta caatatctag tcaaaactgt 69060 atgagaatat aggtaccctt tgactcagct attccactat tttaagtatg taaagacaca 69120 cacaaataat gtatggaaat atatatacac atatatacta tatagtatat atagttcata 69180 tgtatgttat atgtttgtgt atatatctat atacttatat acaccctttg actcagcaat 69240 tctattccta taactcatgt atgtaacata tataatacat atctttatat acacatatgt 69300 acacacatat ctgtaagtat gggaagatgt atacacatgt acacatatat atacatacat 69360 atgtatatat gtattttatg tatggataca tatgtatata tggatagatt ttacacctac 69420 agacacattt agatatgtaa cttcagctaa agcaattcac tcctatataa attgctacag 69480 ataacttgta taagtatgca gaaatgtttc tttatagcag tgtgtattag caaacaaagt 69540 gcaagaaaga gaaaaatgat tgacatgctt gtgaggagac tttttttgtt gttgttgttg 69600 ttagggctca ttcataaaat aataaaactg tgcatccata aacaataatg aagcacatct 69660 atatgcactg acaatggaag ttgtcaaaga tctattgcta attaaagaaa gcaagtgaca 69720 gaatagtatg atcccattca tgttttccaa atatgcatgc tgggggagag atgtttgcaa 69780 ttatatgtac ttatatttct ggaaggataa ttaaatattt gtaatagtgg ttacctttgg 69840 gtagtaagaa tgagggtggg aaaaatttca gatttttgct tactactttt tgctttctgg 69900 actgtttgaa agtttaccat gagcaagaat tattaaataa caaccacagg aatattgggg 69960 ctcaaaccta gagattctaa ttttgtagac ctggagctga tcaacaagtc taaatgttaa 70020 aacatcctca cgggtgattc tgacatggag ccaggattga gaaacaattt tctgaaatgg 70080 aaggggtttt aaacttgttg tcctcaaatg actactgagg caaacaccat tcttatagac 70140 ataagacata cttgggagca aatgtataat aaagtggtat gcttccctag aaaggggacg 70200 accttaaatc tttctgttta tggtggtatt taaacatatt aaaaactact aattttggaa 70260 tagtcttact gtgataagtc taactatcaa aggcagtcca gagattagca aataatagag 70320 gatgatcaaa tgtttttcag aaaatattat aggtggcact ttggcaggag attctgagaa 70380 tggtgagagg gtgcctctgt gccctaggaa aggtgataga gcttagaaac tcagaactca 70440 gatggaatga ggagccatgc catatacatc tttacaacag tcaccctcta gaagaaaact 70500 ctgtgttgac aataatctgc tgacttgtct gtgggttttt gaacagaata aactgtttct 70560 tcttttatgt ttgtgtatta ttgcttataa atatattcta aaatatataa taacaaacaa 70620 taacagtact tgcagcttaa ttaaagaaaa aatgcaagta tcttatttat actaagagaa 70680 gagagaaacc cgaagaacaa tggattatcc ttacatattt ggtttgggat tacattgaga 70740 gctacctaaa taccagacac tcattcttgg tcctgactcc tactctgtta tccatagctc 70800 agtacctagt atctggcgca gaaagaagtg gaatggaatt atcagggaga cccagttttt 70860 agccaagact aaaaggtttt agccaagggg atggaagaat ttgtgcatag atagacggca 70920 gatgggaatt cgtttaaaat ggaatggaga cccagaggtc acataagaca gggttcagag 70980 gaagtagccc caacaacatc ataatagaga acattgataa tgagaggata gatagattat 71040 gcatttgggg aggaggccaa atatgagaaa taagacatgg tttacttact gtaattggtc 71100 ttaaagtttt gagtggaact ctgttgtaaa atattttctg tgccagagct gactccatat 71160 atctactgga agtctaatgc caggggcttc tgagtgtgaa gtggattaat aggtgtttgg 71220 ggtcctttgt aaacttctag tgtaatgtga atagctgtga ggtagtcagt gtgtcatctt 71280 aatacattgt tcttagttct ttttccagca aactcttttg ttttacattt agttcacacc 71340 acaaattagt aagtcaggct tggtgctttt tgacccatac attaattttc attactgtgc 71400 ttaatataca atccatgcca attacatatt attaattagt ggcactagta ttagttcata 71460 ttttctttta ttatgtaatt aatagggcct atatgtgaaa gttactgtgt ttctgtaaaa 71520 tgaagtattc tttttcctta cgcaaggaat gacattaaaa tcttctgagt agggaattta 71580 agaggcaaga aaggagtaat ttcatttgga tagctgaaat tgagaaacgt tttatagaaa 71640 cttttcaggt atgaaggata gtagtagaga tgttacatga gttagcactc atatattgaa 71700 ttagttaagg aaccaatgtg ggaatctagg tcttctatct tccagtcaag tccttgtttc 71760 acttttcttc attccctctt tctttcctgt cgttataagt agaataggaa aatattgaaa 71820 gtattgaggc tcaactgttg ttgccccttt aagtaatttc taaaattaaa attgtcttat 71880 tttcatatat gtgtgattgt gtatctaggt atctctttgt agcttagtaa ttgaacactg 71940 tgaactacac caacctaagc attattctcc aagttttcat caaataacta gacagtttct 72000 gttaatactg aaaatctagt aaacgtgtca gaatttggtt atgattagtt gctgacataa 72060 aacatgaggg cagacctcac tgtactttag aagatactgg ctttcacatt tgccccagta 72120 ggtagttcac atgagtgctt cttcagataa tgtctctaag ttttgcatat cattagttct 72180 acttgctcca cttttgatag agtggcaatg tattgaacat tgtaaaaatt atgctctatg 72240 atttaaaaaa tccatctctg gtaaagcata aaatgagtat atgttttact gtttaaaata 72300 attgaggggt aattatagaa tcagcaaaaa gaaaaaaaaa ccctactgac tattacatat 72360 caatgcacac agtgtgttaa tattttcaaa aaagggaggg caatctcagt gtaagtgtaa 72420 atgaaattag tttttgtata tatttgctga agatcagtta cctagcttca tatgataaat 72480 tatttggtgc tggtcacaat attgtgcttg ccatattagg gaaataaaat atcatgaaag 72540 tattcctaag tatacatttt cccagaggcg tttggggttt tatcagtctc gagctctcct 72600 cttgaaactg tttcattcct tagttatgaa attactaatt ttaaccattt aaggcatagg 72660 aaattttaca tagattttgc tttaacagca aaacaccctt taaaaaattc atccacttag 72720 gtgaaaaata aaagataaaa atgaagccaa atgaatgtta ttaaatttat aaatttattt 72780 aactttccag atcttcttgg aataaatgtc aggtagtaga atttgtacaa accttggtaa 72840 tgtcttaggt ttagatacga acttaacagg tatatttaat tttctgtatt ccacaatgga 72900 gctagaagca ggactcatga aaatagtaac tatatgtttt gcatgtatcc ttcaaagtga 72960 aatccttaac aaatttaaca gtatatatta ggctgctgat gaaacagcta aacctgtctg 73020 ccaggtggct tcgaaaatgg aattaatttt tacatggcat tgataagtta ctatttcaat 73080 acaaccaggt ggtaattgat acccaataat gtttgaggtt tgctttaaat aaaaaaaact 73140 aacaaaacaa acaaaaaaaa cagtgtaata tagtactgtg ggatccacaa taacattttc 73200 tttagtttcc cttaatatca ggttgtcatt aggaaagatt ccacaagtta tttaaaccag 73260 aaatgaagta acatgtttca tatctatttc aagggataat ttttcatgac ccagtataat 73320 gcaactagca aatttaaaca tcttggaatt taagatatag aggtcaaatt aagggatttt 73380 ataaaccaaa tgggagattt taaagtatca actgacttct tttatataga atgttttcta 73440 ataattgtaa aatactgtaa ctttaaaaat attattcttg tagcctctaa tgattgagtg 73500 cttaagtgat aactagaaat atattttctg tccctgtgct tcagtttgaa aatggaggtt 73560 ccattatctt tgttccaaaa atttgggttt ttataggtgt gttggggggg gttattctcc 73620 atattgttga cattttaaaa tagttttcaa acaaaccgtt tatatttact agaagttaga 73680 gaaagaaaag ccaccttagg agcttacaag ggagatcatt gtgtatttct gctttttttt 73740 aaaaaaagtt atcttcatgt gtatcattca tgattttgga ggacaagctg gtgcaatggg 73800 aagaaaagca agacaaccat aatcagctgt ggaactagat gcacttcttt gtgcatccat 73860 ggaatgaata tcttgtaacc tttggcaagt tacttgatat ttctttgcct cattgtcctc 73920 atctgggaaa caatacctat ctctcaggtt taaatattaa attaacaaat atattttaat 73980 gcatacctgg tacagattat gtgtcaataa acatatcctt tccccaataa catatgctct 74040 gattctcaac taactttccc cagtaatatg ttcattttgg gaataggaat tggtagagaa 74100 gtaaagattt gtgtattcaa ctcaaatgta ctccttctta taagtctcca ctctcaaatg 74160 acttgtttct gttccttttt tctcttttaa atgtgtatct ggtagaatga gcatttagaa 74220 gcataataca tgtatacact ttgtgtttaa ttttctatgg cataagtaag cagtttttat 74280 gaattgctgg tattgcttat gagcaattat tacaaacatt gagagaaggg aacccctgtg 74340 aacctttaac atttctcagg agttagtggt aaacccatga acatgtattt ttaaaccaaa 74400 ttacccacct cttggagttc aatctctgtt aattctttat taaagtagtg aagtatcagt 74460 tgttccaatg atataatgat caagcaaccc tggaaattaa atcccaaagc agtgcacctt 74520 tagtttgttc agtgatagta ggacatccca cgagccatca tatattttca agtttttata 74580 ctcaatctac tttttcagca atcttttggg aactatccca agataattta ctgcataagt 74640 gcatctatct tctaaaagac atttggaata tttcttagtc tgacctctgc accctgagac 74700 actctataaa ggaaacaatc agaaaaattt aacaaagaaa taaataggtt aagaagaaag 74760 caatctaggc gtttgcactg agtttgcaac agtgccattg ctacatttaa gagctgtagt 74820 tcttcctcac attttaactg agagccacta gttatgttac ttaaaatctc cccattaaat 74880 aagacagttg ctgaacaact aaaaagtaca aaatatcaca aaatcaaaaa gtagcaagtc 74940 ataaggggat ttccgcatcc tagcatgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgaaaga 75000 aaacgttaca gttaaccgtt acaattgctc tcactccact ccaccacctc atcctgtgta 75060 gtctgcctgc ggaacccgcg ggaatctctc ctcagtgtag taagagcaaa ggccagcatc 75120 ctgtgcaaag gtgctctgca gcgtcgtgat ccagggattt tagcatctgt cgtcgcttgc 75180 acatcctctc ttacccctct gctatctggt ggagttgggc gagggtctcc agggcttcca 75240 gagagtgtcg tttacgcatg tgacttgcca tgcgctcaaa ctaaagcgcc gccggggact 75300 tactgaagcc cacctcggcc ctcctccact ttgtcctcag tcttcaggtt ttcctttctg 75360 ccgctagggc ctaagttgtg ggttcaccat aactcctcag cagacattgg agtgaacgca 75420 tcgactgccg tcacccaagt gctaatcact gccttctccc actcagcgct ggagtgggag 75480 attcatccat cggaagattc gtagccacca ggtccagtca aggatttcat atgcactttc 75540 cctcagaaaa ccctgaaaag caaacgaccc ctggaatgtc acacactcct aaatatccct 75600 ggaaatccgc ttctctgtgt ttcgcttcat ggtgagtgtc gagggccaga taagacaaag 75660 aaaaaaatgt atggaaggtt attcccggtc ggctcctcct tcctgtgagt ctcagacagg 75720 cttgcaggct tacaggcttt ccgccgctcc ccgttggcag ccttcatcga attaggtggg 75780 tgggggtggg aaattgggta agaaaataaa gtcgttgtgg gcggctgggg aacctggcgt 75840 cagtcccccg tggctgtgcg caggtaccct gcaacgtcgc ggtggccccg ctcctcggcc 75900 aagtccacgg gcagacgacc ccaggcatcg cgcacgtcca gccgcgcccc ggcccggtgc 75960 agcaccacca gcgtgtccag gaagccctcc cgggcagcat catgcaccgg tcgggtgaga 76020 gtggcagggt ctgcgcagtt gggctccgcg ccgtggagca gcagcagctc cgccacgcgg 76080 gcgctgccca tcatcatgac ctgccagaga gagcagagtg gtcagagcca gggtgggggc 76140 aggtatggga gatgccggcc ggggcaaggc aggtggagcc atttaaagaa acacctaatt 76200 gcaaagtttt cacccagtgc agaggtgttc aggtctctga tgtctggtgt ttcttcattt 76260 gctgatgcaa tccactttcc caccccacct tcaggttata ctcagtacaa attaaatgcc 76320 attttattct ctaaacgtgc agagacaaga aagttgatgg taaagtgatg atcatcatta 76380 tggaaaaaca aatcttgatt tccattggaa catgggaatc tattttgtta aatgatttag 76440 gggcagagtt aaatttattc ggcttttaaa gttttaaatt atttgccttg ctgacccctc 76500 ctccataatc caggtctaca aatatttatt aggtagtcaa ctactgtttg ttagaagttg 76560 ggagtaatgg tttaggggag aaaataaaca actaagtttt tttctttctt ttttttttaa 76620 tttatttagt tctcatagca aatcccgtgc ggaaggcttt tgtttgtcat gtgtctgagc 76680 tcataactgg cttgtagtgt gataatttga gccaaagttg gagattagaa gggaaaagta 76740 aattaaatca tgcaaaatct tataaaatta taataaatga tttttcctta acagttcatc 76800 attttaaatt tagactataa tatttttaat gtaatataaa actaactata tttgtatact 76860 acaggatttt ataatagcta agatttaaaa atgttaaaca gtaaatattt tgctatataa 76920 aaagagcttg ggccaggccc agtggcttat gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccat 76980 agcaggcaga tcacctgagg tcaggagttc gagaccagcc tggccaacat ggtgaaatcc 77040 cgtctctact acaaaaaata aaaaattagc tgggcatggt ggggcgtgcc tgtagtccca 77100 gcaactcagg aggctgaggc aggagaatcg cttgcatcct ggaagaggtt gcagtgagct 77160 gagattgtgc cactgcactc cagcctgtcc gacagagtga ggcctcatct caaaaaaaat 77220 aaaataaata aataaataaa tagagcttgg atgttagcag tcaatcagga tgatgcataa 77280 cttagaaaaa atgatgtttt gcaggagtaa tcctgtagca gccatttgtg tacatgaaca 77340 ttatgaaaac atttgctgtc atatttaaag tcaattataa gacaattttt ggtaactaaa 77400 tgtctaaaat cgagttattt gttatgggtt tatgcacttt aaaatatacc atttaattga 77460 aaggcagtat acttctcatg ttttgttggc ttgtttcatt aatattagaa atgttcattt 77520 catctcttaa aaaccgtgat aagttatatc tactagtgat gtaaggatat tttacataga 77580 aaaaaagggg aaaatagctg ctgttagtat ttcagaaaat ggtgaattac atatataact 77640 tgtttttata attattaata aaattttaag tttttaagat gcactttaca atatttttgc 77700 tcctttaaaa atccctcatt tgttatacca ttattctaag aattcaaaag aaatgaacac 77760 ttctttaaaa tctatactat taacaagatc ccttaatatt agcttagttt tagagggtga 77820 tagtgaggtg agtactgaat atgaccacta gccaacggta aagtacaaaa gagttgtccg 77880 agattgtaaa agaaataaaa aatatcagta ctaattaaag caggattcgt acttaaacat 77940 tgaataagtg tattttaaca atgaagataa agatgcatta tttatgaaga tcctttgcca 78000 ttcaaaaagg acctaacagt tgctgcagga atatttttgt aatctgggca ctgagtatga 78060 taattaaaga atgagaaacc tatagaacta tatatttttt ctcttatgca tcactcataa 78120 gacactgcta acataaaagg aactaagtac tgtggttgag gaatcccgtc tcattctcaa 78180 ttaacctcta tgagaaaaca atacaacaga tttcatatag tagcttagaa gtttacattg 78240 attttttcca tgtactatga ttttgtagaa ttccttaaat ccaatctaga atgcgtaact 78300 tatactttac ttatctttat cgttgaaagc agacagacaa gataatcttc ttccctaaat 78360 aagctttcct tttctccttt tctccccaat tcagtctatt ccttgcatct ctgatcatga 78420 gatggcagaa caaaaaccac taaaaaaagc ttaaacagtg ggtttttcaa tgtctctctt 78480 taggattttt gctgggtaaa agcctgtttt acgcgtggaa tgcacacctc cggccaacgg 78540 agactcctgt acaaatctac atcggcgatc taggttccag ccccgatccg ccgaggccgc 78600 gccccgcgtt cgcgcgcccc ctgccggcga ggccctgggg ccccagctac ctggatcgcg 78660 cgcctcccga aacggttgac tccgttggga tccgcgccgg cttccaggag ctgtcgcacc 78720 ttctccacta gtccccgcgc cgcggcgctg gccagaccct catcgctgcc gcccccactg 78780 ggcatgccct tgttctcctc gcgcattccg cagcccccag acgcgcagcg gcccggataa 78840 tccaccgttg gccgtaaact taacgacact cttcccttct ttcccacgct gctccggcgc 78900 actctctcct tcctaggaga cctgggctca gcttcattac cctcccgtcg tccttctgcg 78960 gcttggggcc ccgtgcagtg gccgagcggc cggtcgttag ctccgggctt ttcctggcgc 79020 tcaagaacca gcgggcgcgc ctggattgct tctgggaaaa agcgcctagc gcggacgcag 79080 ccgagctcaa agccgctctg gccgcagggt gcggacgcgt cgcggagtcc tcactgcccc 79140 gcctcgctct ggcagagtgg ggagccagcc ggcaaagaat tccgttttca gctgggccaa 79200 ggggccggcg tctccccacc cccttaggct ccgccccctg tccgctgtga tcgccgggag 79260 gccaggcccg ggccgacgcg tcacgagggc ggggaagcct gcccaaagat gctaggacgc 79320 atgcgccaga gactgggcca gggagccgcc aggaatgctg gctgcactgc tcgctggatg 79380 tccagtaaag ccaaggctaa tattttggga atgttcacca ctgccctcag ctcctaatcc 79440 ccagtaggcg gagcagagga tttctgttcc ttcagccagc cagttggttt cactgtggag 79500 acgttggtgg ctcccttgtg accgagagaa agtcattcaa aataactccg tgtttcttaa 79560 gatgtctgaa agcgacagct ctgcacctgt catacaagtt aaattcatcc ccaggcagta 79620 cttgggcttc acaagtttca taacttgtat caaacttagc aattttctct tggatgtgtc 79680 tttctgtttg aattagtcaa ccataaaaat agagaaaaat cccgagaatc atgttttgcg 79740 tgtgcttttt aattctttcc atttttgcat tatggataca acccttaaaa gagaaaaaaa 79800 ctagttcgag attgagagtg gcaacctggc acacataaga caaaaaaaaa ttatacttta 79860 agaatctgag atcccagttt catcatattt gtacagtaaa tctttgtttg cactcttacc 79920 tatttaaacc cactttgtca ggtatcttat ttttatttat catgagtaat aaaggaaatt 79980 tatgcagtaa taatgaaaca tcataagaga ggggtgtggt gctgggcttg tcattaaaca 80040 ggctgaacct gtcattaaat tctcttctga agatttaaat gccaagtgct ttttttcccc 80100 ttcctaatct tcctaggtga gtttgaatca acatttatta cttaaaatat ttaaaacatt 80160 tcagcggatg ctacattgga taggaagaga accgcaagtt atggatttgt tgcctaaaaa 80220 ctttggtgag gaactgcata agtggacctc tcctaaaagt gaacaatttt tgtttacaga 80280 atcattttgg ttcggagtgc tgaggaagac aaagtcttaa caggagggca attgcttgtg 80340 tattgcaaaa tgagagtctt cacatgtttt ttttaggata ccttagctct gactcctcat 80400 cccccaaatc cctgtagaat taaaaaaagc tctttctttt aaaggcagtg gaagtgccac 80460 caccatggaa gtgctggtta gggctgaaaa tctactgaca gagcctcaac agagctgaaa 80520 tccacctgga cagggaaggg aaccgggtag cattaataac aatttctttt tctttcccat 80580 ccaaccccca tttcctagtc ttcagtttct taatttctct accttttact cttatgctct 80640 tgttttgacc tttgagtttc tctgaaactt atcagaaaag ttaggacaag atagtctgac 80700 ccaattcttg agccattttc ttaggtagta aatatgtcag aaaaatgaaa gctgtttgga 80760 gttgataagg aaatggaaga taatgttttt ctttgagggg gacataaaga atggtgatag 80820 ggaaagaacc aatgactaag taaaatgact gagaatcttg cacgaggcag atgtgtgagc 80880 ttcgcgaagc aagttgactg aatgaaaaac aactttgggt agggaaaacg ttgccggggg 80940 cattcgcgct tactagcacc acggacagcg ctttgcttat actcaggcct gggtggtcct 81000 aaccagctcc agacagaatt ctaaagcttc acacttgatc ttccaaagcc ccttttctcc 81060 cgtcaaatag aaaggacatt atggaagctc aatgaatttc tttgaaaaac caacctgctc 81120 aacctggttt tcaaatatga ttggatttta tctaatattc tctgtataaa gaatattata 81180 tagtctatat ttagaagacg agaagagaaa tcaaacttat tgtgtactct gtacgaagtg 81240 ctttacagct gttgtttcat ttaatactca taaaactcct ctgtggcatg tgtccatatt 81300 tcaattttac agacaagcca aaaggatcag agaatttgag tgacttgtat actagctaat 81360 cattgttgga ggtgggtata acttttgcga cttcagagtc tttttaccct ttatactaca 81420 tagtgttttt tttagcagct gtcatggtag gcttaactgg aaaaaagtaa taaactggct 81480 tataattatt tttcagtcta cactgtgttt tccagatggc tcacctcaca gcacaccctt 81540 accagacttc aaagatgaca tttcacatgt aatacaatag cacatttgtc ttggacaata 81600 gagtgagatt atgaaacatt ttacctctcc ttgaaaccca gctgtctcta gggtgaaaca 81660 caatctgttg ttaatgcttt aaacacattt aaaagatgaa gtggatggga acatagtggg 81720 cagctgaaac ttggaattgt cagagccatg tcttttaata aggtggagaa tttataattg 81780 agaagaaaga aagagaaagt taatggtaaa ttggcataga attttggagg tcagtagaag 81840 ggaatgagtg gcatccattc caatgttgca cataactcag atcactagta ataatatttt 81900 tatattctag ttggtgaaat tgtctgtata tgaccttgat atagaagtat gaacagatct 81960 gccatcctct ttttcttcag cgaggcagcc gagctgcaga cacagagatg cagatctttg 82020 tgaagaccct cacgggcaag accatcaccc ttgaggtcga gcccagtgac accattgaga 82080 atgtcagtgc gaaaattcaa gacaaggagg gtatcccccc tgacaagcag cgtctgatat 82140 ttgccagcaa acagctggag gatggccgca ctctctcaga ctacaacgtc cagaaacagc 82200 ccaccccgca cctggtgctg cacctgcgag gtggcattat tgagccttca ctcttccagc 82260 tcacctagaa atacagctga aacaagatga tctgccataa gcgctatgct ctcctgcacc 82320 cctatgctgt caattgccgc aagaagaagt gtggccacac caacaacctg caccccaaga 82380 aggtcaaata aggctcttcc ttcctcggag ggcagcctcc tgcccaggcc ccatggccct 82440 ggagcctcaa taaagtgtcc ctttcattga ctggaaaaaa aaaaagtatg aatagaactg 82500 gttgactggc caagagaaac agcgacctaa ccttgccctc atttatgcac acttttgcat 82560 atgattagga ctaagatagt gtttataagt gagaagagaa ggaaattcat aatcactttt 82620 ggggcttttt caaatttttt atgaacacac cttcccacca agaggtttga ttttctccat 82680 tttatgagtt gggtttattg ctccgtgatc cacagtatat ccacttctat attcccatgt 82740 atttttcaag attaattaaa tggtggactt gttcatcatt ttagtatccg tattagtttg 82800 ctagggctgc cataacagaa taccacagac tgagtagctt aaacaacaaa tatttatttt 82860 ctcagagttt taacttctcc tgaggcttct cttcttgact tgcacatggc catcctactg 82920 ctgcctcttc acatagtcat ccctctgtgc acacgtgccc ctggatctct tgtgtgtgtc 82980 caaatttcct cctcttttga ggacaccagt cagattggat tagggcccac cccaatggcc 83040 ttattttaac ttagtcactt ctttaagggc tctatttcca aatacggtca aattgtgagg 83100 tattgggctt aggactttaa tataaaaatt tagaggtgac agaatttaac ccataacaac 83160 agcatcttaa tttttacaca ttttactttt catttctttt taaactgtta ttaataattt 83220 attcatttga ataaggatta aaataaggct aggatattga aattggttga aattgctaca 83280 gtctcttgta tctctctctc tctctttttt ttcttataag ggacaggttt cattcacctt 83340 gtcgaccagg ctggagtgca atactgtgag caagggtcac tgctgcctcg aattcctggg 83400 cttaagggat gctcctgcct catcctccag agtagatggg actacaggtg ttggccacca 83460 tgactggcta atatttttac ttttttgaag agatgaagtc ttgccatctg gcccaggctg 83520 gtcccgaact cctgggctca cacaattctt tcacctcggc cccccaaagt gctggattgc 83580 aagtgtgaac cactgcacct ggcgtcttgt ttcctcttaa tctacagttt cccccttttg 83640 ccttcttttt ttttctttca atttatctat tgcagaaatt ggctttatct gtagttttct 83700 aaagcttgga ttttgctgaa tgcttcttta taatgacact taacattttt ctttgtcatt 83760 tgtatttctc ataacttatt atttaggcct agagtctgta tgtgattcag gtttgatatt 83820 tgggcaaaag tatttaataa gtgggattac gtactttcac caagagacac ataatatggt 83880 tgtctctttc tgtgattcta gcagccatgg ataattattt catagattat tattttcttg 83940 gggatggcaa aatggtgata ttctaatttt actattcctt catttactag ctggaatgtc 84000 tttttaaatt atttatttat ttatttatta tttgagacag agtcttgcac tgtcacccag 84060 gctggagtgc agtggtgtga tcatagctca ctgcaacctg caactcccag gctcaagtga 84120 tcctcccacc tcagcttccc caatagctag gactacaggc acacatcacc tggctaattt 84180 ttaaattttt tgtagagatg agggtcttgc ttttttgccc aggctggtct ctaactactg 84240 ggctcagcct cctaagctcc tcctgcttca gcctcccaaa gtgttgggat tacagacata 84300 agccactgtg cctggcctgg aatatttcta tatagaaagt tctcttcatt atctacttca 84360 ttgctttcag gtatatgtaa gaaagacagg ataaaccact agattttgaa atgtatttat 84420 aaattttcaa aataatgagt tgagtcctag aatctttctt ttattattat tattattata 84480 ctttaagttt tagggtacat gtgcacaatg tgcaggttag ttacataggt atacatgtgc 84540 catgctggtg tgctgcaccc attaacttgt catttagcat tagatatata tcctaatgct 84600 atccctcccc cctcccccca ccccacaaca gtccccagag tgtgatgttc cccttcctgt 84660 gtccatgtgt tctcattgtt caattcccat ctatgagtga gaacatggcg gtgtttggtt 84720 ttttgtcctt gtgatagttt actgagaata atgatttcca atttcatcca tgtccctaca 84780 aaggacatga actcatcatt tttatgactg catagtattc catggtgtat atatgccaca 84840 ttttcttaat ccagtctatc attgttggac atttgggttg gttccaagtc tttgctattg 84900 tgaatagtgc cgcaataaac atacgtgtgc atgtgtcttt atagcagcat gatttataat 84960 cctttgggta tatacccagt aatgggatgg ctgggtcaaa tggtatttct agttctagat 85020 ccctgagaaa tcgccacact gacttccaca atggttgaac tagtttacag tcccaccaac 85080 agtgtaaaag tgttcctatt tctccacatc ctctccagca cctgtttttt cctgactttt 85140 tttttctatt tctagactct ttattaagat tcattttcct atgaaaaagt ccattcttta 85200 gtcagttcta cactgtcttg attaaggtag ctttatagga agtttttaaa tcaggtaatg 85260 taacccctcc aaattcatcc tcccttttcg aaattgtttg gtcattctga atcctttact 85320 ttttaatata aatttaaaaa ttatcttgcc aaataatctt gtttgaattt taattgggat 85380 tgtgtggaat ttatagatca atttggggaa gactgtcatc taaaaatatt gaatcttcaa 85440 ttcattaaca tgaatttatt cccccattta tttttattta tttatttatt tttctttatt 85500 attattatac tttaagtttt agggtacatg tgcacaatgt gcaggttagt tacatatgta 85560 ttcatgtgcc atgctggtgc gctgcaccga ctaactcatc atctaccatt agtttcctga 85620 ctgtttaatg attgccattc taactggtgt gagatggtat ctcattgtgg ttttgatttg 85680 catttctctg atggccagtg atgatgagca ttttttcatg tgtcttttgg ctgcataaat 85740 gtcttctttt gagaagtgtc tgttcatatc cttcgcccat tttttgatgg ggttgtttgt 85800 ttttttcttg taaatttgtt tgagttcatt gtagattctg gatattagcc ctttgtcaga 85860 tgagtaggtc gcgaaaattt tctcccattt tgtaggttgc ctgttcactc tgatgatagt 85920 ttcttttgct gtgcagaagc tctttagttt aattagatcc catttgtcaa ttttggcttt 85980 tgttgccatt gcttttggtg ttttagacat gaagtccttg cccatgccta tgtcctgaat 86040 ggtaatgcct aggttttctt ctagggtttt tatggtttta ggtctaatac aagggacgtg 86100 aaggacctct tcaaggagaa ctacaaacca ctgctcaatg aaataaaaga ggatacaaac 86160 aaatggaaga acattccatg cttatggata ggaagaatca atatcgtgaa aatggccata 86220 ctgcccaagg taatttatag attcaatgtc atccccatca agctgccaat gactttcttc 86280 acagaattgg aaaaaactac tttaaagttc atatggaacc aaaaaggagc ccgcattgcc 86340 aagtcaatcc taagccaaaa gaacaaagct ggaggcatca tgcaacctga cttcaaacta 86400 tactacaagg ctacagtaac caaaacagca tggtactggt accaaaacag agatatagat 86460 caatggaaca gaacagagcc ctcagaaata acaccgcata tctacaacta tctgatcttt 86520 gacaaacctg agaaaaacaa gcaatgggga aaggattccc tattgaataa atggtgctgg 86580 gaaaactggc tagccatatg tagaaagctg aaactggatc ccttccttac accttataca 86640 aaaattaatt caagatggat taaagagtcg tagcatcttt caaaggtgac taatgatttt 86700 aacattatta ctataaacct atagatttaa acataattgc tatgttttaa cccattatag 86760 ttattattcc tgttgatgat caagctctat ctttggccag tgggagcctc tgcaaattga 86820 ttagtgaatc tttttgacat ggaactatta gtctttgaca aaatctttga tttctggtat 86880 gacaatatat tccagtttta tcttatatac ttccagtcct atacataata ttaacttttt 86940 ttcaaagaat tactggtttt atttttagtg ggaaatggca tttaaaataa ggaagttggc 87000 gaggcgcagt ggctcacgcc tgtaatccca gcactttggg aggccgaggc gcgcagatca 87060 caaggtcagg agttcgagac cagcctggcc aatatggtga aaccccatct ctactaaaaa 87120 caaacaaaat tagccagacg tggtggcaca cacctgtagt cccagctact caggaggctg 87180 aagcagaaaa aaataaataa aataaggaag tctgcctata tgggttatct acctcttttt 87240 tagggctcaa cctacccgtt tcacacaaac ccaactgaat tcggactcta tatgtgctag 87300 gcaagtttga gctttttcag gtgtacacac agggtttact gaactctggc atataattat 87360 ttatttattc attttatcaa gttttgtcct atcattgaaa ctcattcttg aataaagtta 87420 ttatatttag ttcagttaca gcagacaccc cattttgaaa acattatgtc aacattggct 87480 tgtgtacctt gtcacatcag taatgtacag ttctcattta ccagaaattt ttatatgaac 87540 aacatattga agttattaag ttaatgaatt ctgccaaggt attggtatat atttgttcat 87600 tataagcatt taaaaacaaa ggaacctttt aaagttgaag ataatttaat gggccattgc 87660 atgcaaagag gtgttgcatt agtaaccaac cttaaactac tgctgaaaca actttatgct 87720 tgagttagat atgttgatgg gagccaataa ttgtgaaatt tgtgtatcca gactctcttc 87780 tgctctgttc ttaatggatc tagtgttaat gttagaatct agtgcatttc acaactgttg 87840 ctattataga tggaatatca ggaggggtag tgaggtattg agatagatga aaacattttc 87900 taaaagtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg ctgaggtggg tggatcacct 87960 gaggtcagga gttcaagacc agcctgacca acatggtgaa accatgtctc tactaaaaat 88020 acaaaaatta gctgggggtg gtgtcaggca cctgtaatcc cagctaccag ggaggctgag 88080 gcaggagaat tgcttgaacc caggaggcag aggttgagtt ttctccacag ctttggatcc 88140 tgatgacttt ttttttttta attgttactt tcaacttcct tgctttgact gaagccatac 88200 ttacatatta ctgataacat atgccatggg ccgcgcatgg tggctcacgc ctgtaatccc 88260 agcactttgg gaggccgagg cgggtggatc acctgaggtc agcagttcag accagcctgg 88320 ccaacatggc gaaaccccgt ctctactaaa aatacaaaaa ttagctgggc ttggtggtgg 88380 gctcctgtaa tcccagctac tcgggaggct gagggaggag aatcgcttga acctgggagg 88440 cagaggttgc ctgtgcactc gggccactgc cgtccagcct gggtgacagc gcaagacttc 88500 atctaaaaac aaacaaagaa aaacataatc catgtatgtg atgtaaagag cgccaacatg 88560 tttatatcct cctatttcaa tctactttta cttcatctac atttttagca ataatgtgaa 88620 catgaaatct tgaataatta gctatctgta atatatttac tcatccactc aaaatattga 88680 gcccccccaa taaatatcat acactatatt ctaggtacag gtgataaaca attcagagag 88740 tattaatttc aaaacatggt aagtgcatag tgagagagct gatctggtct ggtggttgag 88800 ggaatcaaga gatatttgag ttgaggtctg cagtattata gaaaattaac taatcaaaag 88860 agaggcagtc attccaagga aggggatgtg agtcagaaga aactgcatgt ggcaagctct 88920 gaggtgggac aaagcaagga catattgaag gaattgtgac tggagcatag ggatggagga 88980 aaacattgta gctagctgag aaataagcat ggaaaaatgt tgtagagctg tataggccat 89040 gttaggactt ttgtctttat cttaaggata agccattgat gtgtttataa agacacatga 89100 tgtgatcaga ttttcagtta aatttaaaaa atacttggaa tgcattttgg agaatggttt 89160 aggggagagg caagagtgga ttctgtgggc cagtagttca gaggataggt tatggtagct 89220 tggactaaag tgcctgagcc aagatggaga gaagtagatt gctttaagac atatttaaag 89280 aataacatca gcacttagca atgaactgga gatggaagat gagggaaggg aaggtgttag 89340 gcaggttttt acaatgagag aggttggtga tcatggtcac caaggtaggg aatgctggat 89400 gaggatgcag tttaaggtga agattatgag ttcaggttca gcaaaactga acttgagaca 89460 tggtgaacta tcaaggtgga gatatccagt gaaagttaga gagaggggtc tagagctcag 89520 ggaggagtgt gtatccctaa tttagactaa tttgcattaa cagctgtagt aatgcaattt 89580 tctctatact gaaatgcaga catttgagta tagaaaatta gcagacattt gaatatagaa 89640 gaaagattta ctttccttca gaaaaagaat agtagagtat aaagaataat atttaatcct 89700 aggaattaat accaaaccct ttaaaaaaaa cttttaagtt caggggtaca tgtgcaggtt 89760 tgttacatag gttaaacttc tgtcatgagg gtttgttgta cagattgttt catcacccag 89820 gtattaagtc tagtacttgt tagttagtta tttttcctta ttttctccct ccacccatct 89880 tccaccttct gataggcccc ggtgtgtgtt gttcccctct gtgtgttcat gtgttctcat 89940 catttatctt ccacttataa gtgagaacat gtggtatttg gttttctgtt cctgcattag 90000 tttgctaagc ataatggctt ccagctccat ccatgtccct gcaaaaggac atgctattgt 90060 tcttttttta tggctgcata gtattccatg gtgtatatgt accacatttt ctttatccag 90120 tctatcactg atgggcattt atgttgattc aatttttttt ggctattgtg aatactattg 90180 caataaacat acacatgcaa gtgtcttcat aatagaatga tttatattcc tttgggtgta 90240 tacccagtaa tgggattgct gggttgaatg gtatttctgt ctttaggtct ttgaggaatc 90300 atcgcacagt cccccacaat ggttgaacca atttacactc ccaccagcag agtctaagtg 90360 ttcctttttc tccactacct caacagcatc tgttattttt tttgactttt taataatagc 90420 cattctgact tgtgtgagat agtatctcat tgtggttttg atttgcattt ttctaatgat 90480 cagtgatgtt gagcttttct tcatatgatt gttagccaca tgtatgtctt cttttgaaca 90540 gtgtctgttc atgtcctttg cccatttttt aataggggtg ttttattctt gtaaatttgt 90600 ttaaggtctt tatagatgct ggatattaga cctttgtcag atgcatagtt taaagaaatg 90660 ttctcccatt ctgtaggttg tctgtttact ctgttgatag tttcttttac cgtgcagaag 90720 ctttttagtt taattagatt gcatttgtca attttttctt ttgatgcaat tgctctgtgt 90780 cttcctcatg aaatctttgc ctgtacctat gttctgaatg gtactgccta gactgtcttc 90840 cagggttttg atagttttgg gttttacatt taagtcttta ctctatcttg agttaagttt 90900 tgtatatggt gtaaggaagg ggtccagatt taatcttctg catatggcta gccagttatc 90960 ccagcaccat ttattgaata gggaatctgt tctccattgc ttgtttttgt caggtttgtt 91020 gaagatcaga tagttggagg tgtgtagtct catttctggg ttctctgttc tgttccatta 91080 gtctgtgtct gctttttttt atgttcttaa cttttattta tttatttatt catgtattca 91140 tttattttta ccagtgccat gttgttttgg ttgctgtagc cctgtagtat agtttgaagt 91200 caggtaatgt gatgcctcca gctttgttct ttctgcttag gattggtttg gaaaattagg 91260 gcactttttt ggttccatat gacttttaaa atagtttttt ctagttctat gaagagattc 91320 aatggtagtt tcataggtat agcactgaat ctataaattg ctttggccag tatggccatt 91380 ttcacaatac tgattcttcc tatacatgag catagaatgc ttttccattt gtttatgtta 91440 tctctgattt ccttgagcag tagtttgtgg ttctccttgt agagattttt ttttgtatcc 91500 tgagactttg ctgaagttgt ttatcagctt aagaagcttt tgggctgaga caatggggtc 91560 ttctagatat aagatcatgt cacctgcaaa gaaagatagt ttgacttcct ctcttcttat 91620 ttggatgcct ttatttcttt ctcttccctg attgcccttg ccagaatatt caatactatg 91680 ttgaatagaa gtgttgaata gaaactaatg ctgcaagcat tagtttcaaa gaacttcttg 91740 atttctgcct taatttgatt gtttacccaa aagtcattca ggagcaggcg tttcactttc 91800 cgtgtaattg tatggttttg agtgaatttc ttagtattca tctctaattt aattgtgctg 91860 tggtctggga gacagtttgt tatgatttca gttcttttgc atttgctgag gagtgtttta 91920 attccaatta tgtgatcaat tttagagtat gtgccatgtg gtaatgagaa gaatgtagat 91980 tctgttgttt ttcactggag agttttgtat atatctatca ggttcatttg atccagtgtt 92040 gagttcaggt cctgaatatc ttggttaatt ttctgtctcg gtgatctgtc taatattctc 92100 actggggtgt taaagtctcc cactattatt gtgtgggagt cagtctcttt gaaggtctgt 92160 aagaacatga ttatgaatct gggtgttcct gtgttgggtg tatatatatt taggatagtt 92220 agattttctc gttgaattga accctttacc attatgtaat gcgtttcttt gtcttttttg 92280 ttcttgttgg tttaaagtct gttttgtcag aaactaggat tggaaccctg cttttttctg 92340 atttgcattt ccttgatata tttttctcca tccttttatt ttgagcctat ctcattgcat 92400 gtaagatgga tctcttgaag acagcatacc gatgggtctt ggctctttac ttggcttgcc 92460 gctctgtctt ctaattggtg catttagcct atttacattt aaggttatga tcctgtcatc 92520 ataatgctag ctggttgctt tgcagacttg tttttgtggt tgctttatag tgttactaat 92580 ttgtgtactt cagtgtgttt ttatagtgac tggtaatggt ctttcctttc cacaattagt 92640 gcttccttca ggagctcttg taaggcaggt ctggtggtaa ctaattcctt cagcatttgc 92700 ttgtctgcaa aggatcttat ttttccttct cttatgaaac ttagtttgac cagatataaa 92760 attctgggtt ggagtttctt ttctttaaaa acattgaata ttggcctcca atcacttctg 92820 gcttgtaggg tttcagctga gaggtctgtt gttagtctga tggggttccc tttgtaacct 92880 gggctttctc tctggctgcc tttaacattt gttctttcat tttgacctta gagaatatga 92940 tgattatgtg tcttggggat gaacttatta tggggtatct tactggggtt ctctgcattt 93000 cctgaacttg aatgttggcc tctctggcta ggatggggaa gttctcatgg atgatatttt 93060 aaaatatgct ttccaagttg gttccactat cttccatttt tttcaggtaa accaatgaat 93120 tgtagatgtg gtctctatat aatcctatat ttctaggagg ttttgtttat tcatttttat 93180 tcttttttct ctattcttgt ctgcttgtct aattttggaa aggtagtctt caagcttgga 93240 aattctctcc ttcacttagt ctattctgtt attaatactt gtgattgcat tatgaaattt 93300 tgggggttgg gagtggtggc tcacacctgt aattccagca ctttgggagg ctgaggtggg 93360 tggatcattt gaggtcagga gtttgagacc agcctggata atgtggtgaa accccacctc 93420 tactaaaaat accaaaaaaa aaaatcatag ctgggcatgg gggaacatgc ttataatctc 93480 agctactggg gagactgagg caggagaatt gcttgaacct gggagatgaa ggttgcagtg 93540 agctgagatc gtgccactgc actccagcct gggtgagttg agagtccgta tcaaaagcaa 93600 acctacacat ttttgtggcc tgtttttagc tctatcaagt cagttacatt cttctgtatt 93660 ctagcttttt tatctgtaag ctcctgcaat gctttattag aatttttagt tcctttgcat 93720 tttgttacaa catactccta taactctgcg aacttcattc ctatccatat tctgaattct 93780 gcttctatca tttcagccat ctcagcctca gcctggtact gaacgcttgc cagagaggtg 93840 atgtggtcct ttggaggaaa gaaggtactc ttgattattg agttttcagt gttcttgtgc 93900 tgattatttc ttatctttgt gggctcatct accttcaatc tttgaggttg ctgacatttg 93960 gattattttt tcttttatcc tatttgatga ccttgagggt ttgattgtgt tataaggtca 94020 attcaaccaa ctagctttgt atctggaaga ctttaggggg ccatcgttca cctcccaact 94080 cctggactgc atgttctaac tctggatgac ttgtattggg ccccaacttt gttctctggt 94140 tcctcgaggt ttggagtcta ctttgttgga ggaccaaggt gtggcagctc cagctgggtg 94200 ctagcggatt caggggtgcc tgcctccctg caggcattca ccatgctagt gaaggcaagg 94260 catttttgtg gggaacagga ggctcctgct atagactgtc tgtgcttttg cactggtgat 94320 ggtgttggtt tggtgagagg cactgaccag tgcagatctg agtgccttct tggtcacctg 94380 caagcaggag ggattgctca gggtgtggga ggatcctctg ttctccatgc agcattacca 94440 caagagtgag gcactggcag ctgcagggct tgctggctgt gtgctgctaa ggttctgtct 94500 gcaatggtgg ttgacagagg tcaaggggca tacttccctc ctgtatgcta gtggggcaac 94560 taaagcaaat tccacctgtg cagacatgtg cctgcaaagt gatgtgggga gttgccatgg 94620 gctcagggga agttgcagta tgggtagcga acacccggct ggtgtgcgca gtaagggctg 94680 tcttgctgga gttctccact ggtcaggcat ggcccactgg tgcagaagct attctgtggg 94740 ccaccacagc acccaagatg gccctagaag aggccagcag accaaggagt gctcaggttg 94800 caccagccct gactgatgta caagaccact ctgcagatat caagtctgaa aattccccta 94860 gggccaaagt ctattatggg agcaagttga gcctagaggg atcgccatcc ctgtccatgc 94920 actgctgtag acactcctgc actaaaccct ctgggctcca catcagctgg cttgctgctc 94980 taccactttg cttgtctctt gggggctcca ccccagagag atgtgggtca gcaatcattc 95040 agttcaatca gcccaggatg gagagtctgt gctatgggcc caagccaggg gctctctgtc 95100 tggtgacgag cagctggggg gtggggtggg acctgtggga gatggactgg cctcctctcc 95160 ttgagtcaac tgctgcttat tggaggtgtg gatgagacac ttagggtctt tgctccttta 95220 ttagtcagag ggtagcaagg acagttccat tgcagaggta gtggcagaga ggctttcagt 95280 tgtccgtggc ggctctgtcc agggagttgc tgagttgcta ttggcttgat atctctggtg 95340 gggtgtggct agaggtccag gcctggagga cctgctcgtt gaagagatgt gggaatgggc 95400 acccacataa cagtctgttc acttttccat agggctgctg tagtatgctg ggggccagct 95460 ccagtccctg gtcactttag attttccagt acctggaggt gtcaccagtg aaagctgcga 95520 aacagcaaag atggtggcct tcctttctct ctgggagctc catccctggg aaatacaggc 95580 ctgttgctgg cccgaacaca ctggtaggac atggctgaag acgctagttg ggagacctca 95640 cccagccagg aggaatagga tcagggacct gctttcaaaa gtagtcttgc cccattttca 95700 tagaggagtt gtgccatact gggggtatgc tttagcccct gattgcctca gacactctga 95760 agcccaaagg ctggaatggc taagttgttc taacagcaaa tatggtgggc tgctcctctc 95820 cctgggacaa aggtcccatg gaagtctgaa acctctctca gtcagagaac accagttggg 95880 gtagccgggg accccagatg ggagactcta cccagtgatg aggaacggga ttggggacct 95940 gctaaaaaaa aaaaaaaagc agtgtggcca catttttgtc gggcagctgt tctgtgctgg 96000 ggttcccctt ccacccctgc ttaagctccc caaagcctga aggctggaat gggtaagttg 96060 cccaaacagc aaagatggca gcctgcccct ccctctggga gctctgtccc agggagtttt 96120 cagatctctg tcagctggag aacactggca ggtgtggctg gaggccccag ttgggaggtc 96180 ccgcctgtaa ggatgaatgg gatcggggac caacttaaag cagcagtctg gccacatttt 96240 aatagagcaa ctgtgctgtg ctgggggatc tctttggccc ctggttagtt tggactctcc 96300 aaagcccaaa ggccataatg gctaagttgc ccaaacagca gagatggggg cctgcccctc 96360 ctcctgggag ctttgtacca gggaggcaca atgttgctac tggtggctag ctggaattcc 96420 aagccagtgg gtcttatcct gtgaggcgct gtggaagtgg ggcctgtaga ccttctctgc 96480 tgatctcgct ggattcagcc tcttttctgg ggtatgtatg ggagtctaac ctcctggggt 96540 atgtttgggg gtctaacctc cagctttgcc aaagtcgcag ctacttttgc ccagacaccc 96600 agaaagctgg agtagctaaa gctcttgggt ctccatgcat gcctgagtgg ctgctctgct 96660 gagactccac gtggctgtgt gtgaagggcc taatggagtg agttcacaag gggatctcct 96720 gatctgaggt ttgcaaagat ctgtgagagc agtgtggatt cccagagttg cgcattcact 96780 taccacttcc ctgggaaggg gagtttccct tgactccacg tctttcccaa gtgggctgtc 96840 ttcctgcctt gatttgctct ggtctccgtg ggtcgagttg tttccttgat tacttccaat 96900 gagagtacct taatgtttca gttgaaggtg ctatatttag tcaccccttt ctttccgccc 96960 tgtgagagtc acacacatta actgcttcta gttggccatc ttggccactc ctgccctaaa 97020 cctttctagc aaaaaaaaaa aaaaaattaa taacatgttg atctaccgct tctctctctt 97080 taaatttatt taatcattat gaattttttt acatttattt acattgttaa gctgttttat 97140 tttaaaaatt ctaggtccag ctcttcctgg attgctttta tataaggaac atatctcatg 97200 aaataaataa aattcacatt caaatgcaga agaatctatt ggaaaaaact cagaggacag 97260 gataaaagca ctcagaaaaa atgccaggag aaggcgttta tcacataata tcgctgataa 97320 gagtctctcg aaaatttttc tctctattca ttcttaccaa atatagaaag tgaacaaaac 97380 aatattagta ttagaaaaaa catccaaaaa taatgacctt tctgaatgaa gactgctttt 97440 ttcatggtta ctctttttgg ggtacagttc tatgttgatt tatccaattt atcaaatagc 97500 cattcagcaa atatttattg agtgtctgtt atgtcacagg cactcttttc ggtcctcaaa 97560 atacatccgt gacaaagagt aaaagattcc tgttcatggc tcttacattc caggagggat 97620 agcaatttct tttgtaaagt taatcacaca acagaaatgt gaaataatat tgatgctgta 97680 aggaaaggaa aaataaatga aataaattga aaaagaaatg tgaaggaata attaaaagag 97740 gctatatttt attgaataaa aataaaagag gctatgtttt attgaatatg ctccatgttt 97800 tatactatat cataaaacat acaagatctg gcttttaaga aatcaatatc ttcatcaata 97860 tcttcattca gactcatcta gattagatta ctctgaatct aatcacatag agacttgtct 97920 gacaaatcca gattttttgg acgttctgca ggactatttg tcaggatatt tcacaggatt 97980 ccaagaaata atattggtgt ccatgctata atgattcctc agctcctccc atctgataaa 98040 atattgattt cttatacata taaaacatat aaaaatattt aaaatatttt ttgttatatg 98100 agtgaatcaa taataaaacc actatctcaa taatcatcaa ctgattgcaa actgattgtt 98160 catctcagaa aaaccttggc agagttaaaa taaaagtttc aaaatacaga acttagtacc 98220 aaaattaagg cagtgttagg tttctaattt tgctattcac atgttaaatg aattttcaaa 98280 attcagtagc taatactagc tagggtttta aacaagacat agttaaaatg aaactttaaa 98340 aaaagaatca taaacttcag tatcatcatg atggcagttt taggatttta atgttgacac 98400 cctagtctca aatttgtact taatgtggtt atatagctag gcagtgctgg agtgaaagtt 98460 tcaaaacaaa ttaaaatcaa aagttaagaa aaaaatatga aggcaatttt aaggtgttta 98520 atttggcact gtagtttcaa aatagtacct gaaacttaac agcaaagtat cagattcatt 98580 tataaaacaa tgtgactgat ctttatgtat ggtttgtgaa acatttatgc agtgtcactt 98640 cagaaaactc tgccattata gatttgaatt gattaaggat atccactcct ttccttggca 98700 tgatacaaat aaattactaa agtataattg taacaatgat aaatataagt gacaatacca 98760 ccatattact atgaaacaca gattgattat ggtataatac aatttagcat ctccatattt 98820 ttgaaaatga acttgtttct ctaactggct taatttggga caatttggac atcaaaaaga 98880 atgatgatgc aatttaaacc atacaaaaat taaaaaaaaa aatccaaggg acggtggtga 98940 aagtcttctt tctagaagaa tagcagctaa tatacacaga acgaatctta gaattagaaa 99000 atcactatat tttgatcccc ttccccaaag ggtgacaaaa ccattggtag acagtggttg 99060 agaaacagaa tagtctcagg atatcactcc gtagatttat tcattaatta aaaagagaaa 99120 atgtgctttg agagagagaa agctattacc gtctttatca aataggagag cctgatcatg 99180 tgtggtctga agtttatcta atgggattcc tgatggaatg tttagtctga atctaatcac 99240 atagagactt gtctgacaaa tccagatttt ttggatgttt tgcaggacta tttgccacga 99300 catttcaaag gattccaaga gagaatattg gtgtccatgc tgtgatgatt cctcagctcc 99360 tctcatctga tctccgtcct ggcccccatg actttctttg tggtagttag ggtgtggtat 99420 gtgccactga ggcccacacc tattgctgta agtgctgttt gggaaaccat catctttcag 99480 gtctgtgtga taaaagaaga gccttgggga aatgttctct tccaaattta atctttacat 99540 tattagaaaa tattttgatg acctgttttc aaatattttc ttataacttt ccattttcat 99600 gtgtttattc tgacagttta ttttatcttg tatttataat cactaagatg ttagtattgt 99660 aatattaata ttacatgatt taaattagga aaaatgtgtt ttctattaca aaatggatag 99720 tggataattt aagtatagaa agtaatattt tctatatggg actatttcac tctctgtaat 99780 atcctgaatt ctaattccca ctgtagtgag ctataacttt actaatcagt tttcttacaa 99840 tcgattttaa gtctattttg ttagatctaa agacataaag ccaaaagttc ttcttgaaga 99900 gaagcacatt tcagttacgt ttataacttg aaatatctgg ttttactcaa aactcacatg 99960 tcatactgaa aaacagaagg gagatgttgt cttttcttga ggagagactt ctctgcagtt 100020 aaacagctca ccacatgttt agagtacata gacaatacac ttcctctttt gtaatgtaga 100080 tttcagcttt ttgcttgtag aattatcatt ggcgtggagg ttatacaggg gaagtagtga 100140 aaaatgtagc caataccagg aaccttagga agtgtctgaa cttcatcttt tctgtgttcc 100200 tttgccctta gggggtcagt gtaagagttt gggctaggaa gagattgctt cttttactct 100260 atttagtttg tacttcctat ctgggtattt gacaataaat gactcattct ctttgtttgc 100320 cctggtgttg aaaaattttc ccatatgcca gagaaaaaat gttacagtga cacaatgtaa 100380 aattgtaaga ggtggaaaaa gatgaggtat ggacatagtg aatggaagtt cagcccttta 100440 aaactactgg cagagtagat tttactcagg cttcaattaa gtagacctga atgtaaattc 100500 aggtctagct ctgcaactta ctaggtaagt gactttagtc ctctttaaga tttagtttcc 100560 tcattacagg atataataat actatttttc ttatgaggta agtattaatt gaaatagtat 100620 atgtacattc tagcatacag tgatccccta ataaatggaa cttatcatta atacattgct 100680 aggaaaagaa aaacacatca gggaacaaaa gatataactg tcttattgat aacaggggat 100740 ggattcttgt ggacaaaaaa atttagaatt gaattttcaa ggggtcattt ctttcaccag 100800 gtgtagttag gtttgctctt atggtaacaa tgaatatgtt tgtttagctt cttaaaccgg 100860 catcatggaa cgttaattaa taaacagaat tcaatgtatt tgtggggcat tttatttttt 100920 atgcaatcat ttgtatatgt caccttcaca atgcatgcca cattctcaga ccacctatta 100980 tgttattttc ttaacatttt tcttcaaatt cactcaccct tttaaaaact ttactgaagt 101040 ctcacttaag cacataattt gtaaaatcat gggtttgttg tgcaagtttt gtttttctaa 101100 tacactctaa aacaaatacc ttaaaagagt tacacctaca gtccatatac cacccataat 101160 catctcaagt acctccagtg cttgttactg cactttggaa aacactaaca tacattattc 101220 tcattagttt ttataatagt tatatgaggt gaatagagaa ggcataacta tacccatttt 101280 aaagatgaga aaagcaggtt catggataaa atctcatagt aaattgctag aattggtcct 101340 gatactcatg ctttctttag atcaacccag tgctcttact gtaattgata ccaaattctt 101400 taaggaaact tagagctaaa agtaaaattt tttgtattta gacctgatta ttttgtggta 101460 atttgaatat aggtcaatat gaaaaaaaat aaaagatgaa acaaagaaac tgagagcaga 101520 tcaccaagtt gcggtaggtt agcctaagat agcttttggt tttctcagcc ttctactatt 101580 cacagctttg tgtaatcccc tccacttgag tatcttgctc ataccaatag aatatggtag 101640 tagagtagag gtcacctctc tgataagttt acagaagatt gcgacctccg tcttgccaga 101700 gtacttcctc tcttgctggt tttgatgaag caggctgcca cagaagagag gctcacatgg 101760 cagggacctg agggcagcct ctggccaaca gcaagcagta aacagatgcc ctcagttcaa 101820 tatccctcaa agaaatgaat cttaccaaca gccagttgtg ttagctggga agcaaatctt 101880 tccctaaggg agatttcaga tgaggccccc agccttggta gacaccttga ttgcagtctt 101940 gtgagagatt gtgaagcaga gctattctca gaattcatgg gtgttttaag ctatgaggtt 102000 ttttttgggg ggagaatggt catttgtgat tcagctatac ataagtctac aaaagtcatt 102060 ccagaagtga ttcagtggag gtagaatcat gtggttgtga gccccaggca cttggagttc 102120 tgatagaatt gtgacttcta acactggaca ccttttcttt ttctcttatt ctcccatttt 102180 tctcctttcc ccttttcctc ccttccttcc cttcattcct tctacttttt ccgtacttta 102240 aattaataga gcagttggaa acacaaaagc aatgtctgta tctacaaaat gtcattattt 102300 atactttgta tccacagtgt gctgcctagg gcttcatgcc tgaggtgcat ctgtagaagg 102360 tgctcaacaa aggcttggct gttggtatta ttgaatcact gtggagttta ttcattgttg 102420 tccatgccat tttgagtttt cattttttta tttatgggag tgtctttatt cttttaaaga 102480 gctttgtttg tacactcatt ttctctctct ctcttttctt ccacaggcaa tttatagcac 102540 tgatctgtca tcaataccac ttgctgtctt ggatgtgaag atgatttttc ctgcagggat 102600 tccctctaca aaattaaaaa cactgggcat gtggaaataa tattcatgct ttaaattgtc 102660 ttttctcttc actacaccag gggtccccaa cccctaggcc acagactgtg gccctagtgt 102720 agtgaataga aaagacaatt taaagcgtga atattatttc ctcatgccca gtgtttttaa 102780 ttttgtactg gtctgtggct tgttagaaac caggctgcac agcagaaggt gggcagcagg 102840 tgagcaagca ttactgcttg agttccgcct cctgtcagat cagcagtggc attagattct 102900 cataggagca caaaccctat tgtgaactgc acacgcaagg gatctaggtt gtgcgccctt 102960 tatgagaatc taactaatgg ctgatgatct gacgtggaac agtttcaacc cagagcaccc 103020 cccacccacc tgcagaagaa ttgactttta cgaaaccagt ccctggtgcc aaaaaggttg 103080 gggaccaccg ctgcactaca ctacctaaaa gattttcact ttcacagtgt tgcttgcttc 103140 tgttttacat gcacaagtag ctaaagctag ccttctggta aatggagggg cagagcagat 103200 ggtgggggag gagtacatac ggacgaattt gaatcacaat ttcctcacta tatgccagca 103260 aaatttaata atagcaccta aacatacaca tgcatatgta aatgagtcac actataaaaa 103320 cttttaacaa gtactggcaa gtcagatggc agacttaccc tgaaacctgc cactccaata 103380 aaaacctcat aattaaaaac aaggctgtct ataaagcata acatataata acaattattt 103440 gcaactggta caaggctaga ttagaaagtt gaaagttatc tttctcaggt aaaaatgctt 103500 ttcctataca gtatgcagcc agcagattat catccatagt ttgagtagtg agatgccact 103560 tgctccaaca attaacacct gctgatgttg gtccaagaag agactgaggt gatgcagttt 103620 cacctgtttt gtaagaataa cgctggtgtt tgccatctat tgacagagtg cctactacgt 103680 gccagatgct ttgttggcac tgaatgtgct atctcattcc agtttcttta tactcaatga 103740 aaaaccaact acatttatat tgcattgagg cttaaagtgg tttactgact tgcttaagat 103800 tatacaagta gtaggtggct acagcagggt ttgaacccaa gtatgcttga ttccccaaac 103860 catgcttttt aaaaaatcaa aggtgtaact tcgataaaag acatgaagtt aatgaatata 103920 tgaaagatgg tgaatagata cagatacaat gtggccttag gccagatcat gttgaacatg 103980 tggtgggata gataagagaa ggttcttctt tgttgttacc tggttctcaa ttggttatta 104040 ctttatgtgc tttccatatt aaaattctat tattctggtc tataaattca cccacccaga 104100 cttgcctaaa ctaattaaac cctgaagttt ggcatgtctc ttttttgggg tgcctctatg 104160 ataggtggta gaaatgaaaa tggaattaaa agttttgtga agctatagca ctactttttc 104220 attgtgttcc cccctgactt tctgccttag gtgtttactt tggtgagata tcctgggaga 104280 aattgaggtg aaaagaagcc cgagttagga ttagggaaga gatgaagtag tcaataaaat 104340 tcaaattctt gtattctgaa acgcaactat tctttctcca acttggtttt ggacagaatg 104400 tcttagtgta gctgttaaca aagaaattga tgacaattaa ctcccatttc tcagaatttc 104460 atcattcttt gaaagtgttt atcatactca atcttctaaa aatccttaag gcatactaca 104520 gtgtagaggt tggcaaactt tttctataga ggtcctgata gtagcttgtt tcgcttttga 104580 gggccatcga gtttctgtca caactactca tctctgctgt tgtaataaag actcacccat 104640 agacaataca tgaatgaagg agtatctatg ttccaataag acttttaaaa ataaaattag 104700 gcagcaagac tgatttgaca taagggtcat aatttgctaa cctgtggtat agtgaaagga 104760 gttcaactag agtttgatta tggctgtgcc attctagttg ggtagtttta ggaaagttat 104820 ttaatttaga tttgatgtag ttttctcata tgtaaaatgg ggataataaa acctgcttca 104880 caagactact atgaggagta agctatgtag ctaaatatag caaaatatct ggcatctaat 104940 agatgcctaa taaatggtga ctataatgat tcttatcatt actgtattat tttaaacatt 105000 tatctttttt ttttaggttg ttgtctaact aaggtattta gagaaaataa gtgctgctga 105060 gggcagctgg aactgttttg ctggttcatc actgaaattc tagttcttgt tggtgcttat 105120 ttcataatta tgaaactaat tcttttgaaa agaacttgaa gtagagcaac aagaactaag 105180 atagaactaa taccattctc tctcagttct tattgcttta cttcaagttc ttttgaaaag 105240 aattacatag atatgggtgc atgtgtttgt ttattttcct tgttgggtaa tcgtgaatat 105300 gttgattggc gtcaaacatg ggtctcacct atacccatgg cagtaagctt ctattgattt 105360 gaattcagac tagccctggt ggccctgtga gtgggaaagt ctaggtgtgc ctagcttggt 105420 ctgtggttcc acgaggggtt ggatgcatct gttctacttg tggaatgttg gcaccaatat 105480 attggctgct tctccgagta tttgcctttg tcttctttgt gaaaggtcac tggctggttt 105540 gagctattgg gctgtttatg ccacatcctg tgcatgccac actggctttc tttctgtggt 105600 gtttccagag ataagtttgc ctgatagaag tcagactctg tggcttttta tcattataga 105660 tttttctaga aggagaagag gccatgatca catctgagga tcctgagtca ttgtagacat 105720 gtactgaatt aaagagaatt ttttgactaa aggagaattg catcaatcac ggtgaaggag 105780 atgccacagg acagggcctg aggtgttggc ttagccacag atgtaagggc tacagttaac 105840 agacaacttt cagtttccac tattggaagg gatgatcagt ccttccctcc tctattttct 105900 tgagccccgt ttttcacctt tctttttctc tctcctttct tatcatgaag aataaagaca 105960 aatgagaaca gatctacctt aggctgatac agggcaggga atccatttaa taataaaacg 106020 tgggtcaaaa ttcacttttc tccttttgaa ttgaaattat attgtgcatg ggctaattag 106080 attgaatgct gtaaacatga agataatgct tgcaaagtag ctacagagaa agagaaaaag 106140 cctaaaacaa ccagtagtgc ttaggaccaa tagtataagt ctttacacac tacatttgaa 106200 taatactgta agacacaatt ctttgatagg ttaaatagca aatctaggcc ccccaaaatt 106260 atttaaaaaa ttgtcatttt aattctagag gtataacaac agtgtgtaag ttgcatcaaa 106320 taacaaagtt agtctacagc ctaaattgtt tcgtcctgct tttttcactt ctatgcatat 106380 ttttatactt ccatgctaga gctacctcat tcttttaaaa ttgtgagata ttctataatt 106440 tatttgtatt cccctattaa tatattttta gcttattagt ttacttaaaa agatttatgt 106500 ttgccttcta atgtcaaagt taggagtcat ctgtccattt aacaggtggt gttttcttgt 106560 gtaactcctc tgccttcatg caaacctttg agaacaatct cttgaaacaa ggctaaaatg 106620 cctttggaga ggtattatag atgatcatat ctactttgtg cctctttcca ttacttagct 106680 gcattagagg cccagctgtg taggtgtaac tcaaaatcca ccaaaactaa tactgtggtt 106740 agattctggt caaacaagtt gccattaatc cagatgtaga atgggattga aaggtggctc 106800 ttccacaccc tgacatcaat gtaccagttt ggctctgtgc attctttctc cccttctccc 106860 tttaccaccc tcatataatt gtttgtgtac atgtctggtt tcgtcactac gctgatggca 106920 aggatcatgc atgccttatt catatttgtg ttattcaagg attctactct gggttctatt 106980 atggggcctg gcctaaagtg gttgttcaag aaatgtgtgt tagagaaatc atacataaac 107040 tagcaattct catttggatt cctgtatctg aacaactaac tttcagcttc ttcagtggga 107100 taaagaagaa aaatggggtt taaagtacat actattcagt attaatgtag aatttaacag 107160 ctgccatcca agtgcagaat cctctgtagt ttcccagtgt taacctcact tctatctcta 107220 gccatgtctc agtgctgggt gactctctcc tggcatgttc tggcaagact ctacctggtt 107280 tgcgtaatct acatcggctt ctagtttcca caagaattgt ttatatgcat ttaattttag 107340 ctcttgggct ataacatgtc attgttcttt ttacttatct cctcttactt ctggaaacag 107400 ggcaggcatc ttcaatactt gctgttcctg tttggtgtgc tcttagatta attttaactt 107460 tcctcttcag ctttcatgac acttcaagac attttccagt catatttcct gtataagaaa 107520 atacagacta tgtcaccaca aagggtagtg gagattgggg ggcataattt aattcattca 107580 gggaactcat attttggtgt gaatggaaat taaagcaagg tatttggatt aatttacctc 107640 atttggttct atattccatt tagaggataa cacattaagc ttttattcaa ttttatctgt 107700 tatggtcaca gtgaatctgg aaaaaaatat atatggggct tagttttcat atttagggga 107760 aaatgaatat cctagagaat aataataaaa gttagggaaa ataatgtttt cctaagagta 107820 ggcaatgaaa atctgaaggt actcaaagca gtcttgcaca agtgctttga aaagcctctt 107880 gcacaatttt atttctttat agtacttaca caatcatatt tcataatgac ttgctataaa 107940 caatgttctt gacaagaagc ttaaagatac aaaactgaag gaagcacttt tgggagaaaa 108000 tacttttata tttgcttact tctacactac aacagacata aaattatgga tttttttttc 108060 agtgcaattt tcatatgtca gttctaggag acaggaaatg tgaaacactg taggaggtat 108120 gagtttgcca cctagaggag agaggtgaaa ttcaactttt ctccaatttc tttagtataa 108180 ttcattaatt tatttaatta tttactcgtt taattattca aaaataatta tctaccaagc 108240 ttaactattt tgccagcgca gatttgataa atctgttcaa gatttatgag ctcaaagaaa 108300 ccacaaagtg catcttactt taattgctca gctgcctctt ttaaaaatct tttactttta 108360 agagagtata gcacaaatat ctgaacaact ctaaatatcc atacttggga tggatattac 108420 tttgagctct tgcactataa taaaacttta ttcttttgta ctaattcagt ccttttactt 108480 tttctttttt aatgtttaag aaacaagttg gatatggaca agatgtaatt tcttctgtca 108540 aggaacccac aggataatag gttaatgata gagaccaaca atgctgatgc atttttaatg 108600 acggagataa tgtctagaaa aaaatccatt atttggtaaa gacaaagtat gcatatgtat 108660 tcctttgttt caattatttt taaagttaaa aaacaactgc ttatctcctt ttgtactaca 108720 agcaatatct ggtatagtgt atgcatagta agtattctag aaatagtaat ttcattgttg 108780 acttgattat attggagtgg aacttactct ggaagagatc ctaactttca tttatctgag 108840 aaaatttcca gttaggacat ggaaattttt tccttgtcaa tatttattct taatgtgttt 108900 agaattttag aaaatgggtt tagggattta gaaatttctt tactaaataa ctctagggaa 108960 cagtacctta aaaatattca aaatgacaaa aacttaaaat gacatctaat tttttaaggc 109020 caagaatcat taaaaaggga tccaaatctt tagactttgt tgctcggtgg aactagaatc 109080 attaatatct cagtcagggg aagccatgtc aacttactgg tttaatttcc tgtgagcttc 109140 ccatgttctc tccctgcaag gaccacctca aatccctcag tagtcctgtc tttatgaaac 109200 cagtataatt tttcttttcg ctcttgtcct tcaccttcct gtggcaacaa gagtcaattc 109260 tccatatata aatactcggc ccctgtttta gctgtgtctt aattgcgcaa catctgttta 109320 ctctgtgttt taacatctgt gtggatagca ttgttgttgt aatattttga ctgtaagctt 109380 ctaggaggta gaggccagca ttattttctc catttttgga atgagaaaat acagattacc 109440 acaatcaaag tagaatggca gcttatagta gttatttgga taatttatat agtctcttaa 109500 aaaaacagat tatagtaaga agtggctgag caattagcta tggcacactg cacggttttt 109560 ctgacctctc agctcctaaa taaactttgc caaatcttca ggccctcaaa attttttcat 109620 tccatttgtt atgggctgaa ttgtgttccc ccgaaatgac tatgctgaag tcctaactcc 109680 tagtgcttca gaatgtgacc ttatttggaa acagggtcat tgcaaatata attagttaag 109740 atgcgatctt actgacatag gagaagctcc taatcatggt gtccttataa aaaggagaat 109800 tttggccata gagacatgca ctgggagaat gctctctgaa gactggagtt atgctgctaa 109860 aagtcacaaa attaacagaa gctacggaag agaccttgaa taaattcttc cctgtagcct 109920 tgagggagag gatggcccag ccaactgcta atctcagacg tctagcttcc agagctgtga 109980 gacaatttct ctttttaggc cactcagttt gtggcacttt gtacagcagt cctagccgac 110040 taacacacca ctctaactgt tgatcaaggc aagagcctgt gatcatgtat tatcttgctt 110100 attccttatc agcattctat ggtgtagata ttagtgccat ctatatacaa attaggaaat 110160 ggagcctcat agaaattaaa tgacaagttc aaggtgtcat ggctatttca ttatagtgcc 110220 agtgtttgaa cacaaatcaa tttgactcca aaacatcatt actctactca attctagttc 110280 aatccagatg ttcacaaaca accagactat agtggagatg tgggtggtgg gttgagaagg 110340 agatcataac caacatcaga ctgtcagtga agcagactgg gagaagtttt atgaagccaa 110400 gcagctgtgc aaggtacagt agagatggtc agattgttca tgtgtatgga ttccatcttc 110460 tgaggaatga actccttgat attcctgagt tagtccagtt taggcaggag taaacagaag 110520 gtaaacagaa gattggagac tgtgtgtgtg cacgaatgcc tcctttgtag ctggatgtct 110580 aacatcatga tagccacact cacatgaata cagagataca caatttacaa attaatgtaa 110640 cataaaactc ccatgcagtc tgatttcatc ttactgacat ttctgtcagt cagtgttagc 110700 atcttaatta tataaatgtg gaaactgaaa tactcaagag gttccctgac ttcccaggcc 110760 acacagtaag ctttggtgcc agaatgtatc tctaggcttt ctcatctcaa cccagcattc 110820 attatactat tgctcactgc gtgtagaatc agatttgatt tctctgactt ttcttagtca 110880 cttctgtggt tttgtaccac tccctctctc actaaataac tgcctgcaaa agtaaaaatt 110940 tccatgaaaa cagaaaacaa atgtaccaga aatgttgatg gtgtaagaga taaaactggg 111000 ataaagagaa aatgtgttgg aaagtggtgt cctttaatgc aacagaaaag tatattggga 111060 gaaaaagaaa agagagaaaa atagacaatc tgaagtgatg agaagagcaa atgctacaga 111120 tgtacctgaa cctcttcagt aggtgtgatc ctgaagagtt gtgtataaca acaatgaaca 111180 aaaataaaat gtactgtgga aattgtctag ctgttgagat cctcctgtgc gatatttttc 111240 aaagtgaaaa ctccaatcaa ccctagctta tttatggaga agactttgcc ccacagtacc 111300 cagaaagttt cttgacaata tcatatatgc ataataaccc tgagacaatt tttgtttacc 111360 aggaaaacat ataaaaggga acattaaact ttgtctagtt ctactgcata aacatgtgat 111420 aatgtgcatg gtgaccttct gttgtaaatg gaaagagtta agctctctga atctactgct 111480 gaaaggtgaa aacactttct tagggctttg aacttcattt gaaatcttac tgaaaaaaca 111540 ctacagactc tattttcttt atatttgaag atactttaca taaaaatcta aagcattttg 111600 acttatgttt tcatctactt gagaaggaaa ctcacagact ccaaagcaac tgttgtctgt 111660 tttgaaaaaa atttcagaaa tcaccagaag caatagggag tggccttgat tcctgttctt 111720 gtatttatgg gtagctaaag ttcatatttc tcaacatacc ataatctctg tgtaattggc 111780 caaattccat ggtggataat tagatctagc ttaccagggc agatttggat ggtgagagca 111840 gtcacactgt tctgggaata tgttagccaa gtttactatg ttttacatga gttgacagac 111900 tcacctcact tgctgaagga ctagcccagc aggttctacg ggtgagatca ctgctagctc 111960 attcactgct gggcctggta ggcacaagag gccaagaaat aaataatgtg aatttgggct 112020 tcagaagttc tctttcctat tttctttcct aaaccctttc ttctaccagc tgtctagggg 112080 ctaaaacatt tgttcatacg tttattaact aattcaacaa atatttacca accatgtttc 112140 aggcactgga cactagaaat ataatagtga actagacatt ttctgccttc aagggtctat 112200 gaacaattat aatattctga aaaatattac aattcacaga gctcagtaat ccaaatcctt 112260 attatttctg tctttaaaaa gcagaaagtg aaaaatgctc ttaaaagagg atggcataga 112320 aatgtattta tgcattgcaa cagataaaat taaggaatgc atgaagactg gttcatctgt 112380 gtggttgtga gtcaagaata aatcccaccc tccctgaagt actcagactc taccttgccc 112440 catggccacc actgtggccc aatggaagca ccagtccagg gggtctccat tcatgctgtc 112500 tttggatgtc ttcagaatgt tgtttcacaa gtactcagac ccaacagtaa gattttaaaa 112560 attgtccata atattaacct tggcattatt atgttaaaga aagcaaaaca gatatcactg 112620 agtttacttc tcaaaaaaac cttgcgttcc tgcaaaagtt tcttgaattc tgactcttgt 112680 cacacaatca cacaagaatg gctatactta aacccttcta atcaattata tccttaatat 112740 gtatgactga gtgatgtgtt ttcatgacta tgaaatgtat acatgtttgg aaaatctatt 112800 cacaatagag ttttatgata ttcctgttaa caggctgtca ttgtaacact gtttatgcag 112860 gaattgtaat tctatctgtt tttattttta gcgtcttttc tctccatccc ccaaatttta 112920 aggagctatc aggtctgtat tttatttggt tttgaagttt taggttattt gtagttataa 112980 tagccatatc aattattcat ttagcaaaca tgtattgagt gctactatgt gcttagattt 113040 ttccaatgtt gtgaaggata attggctaaa acttttccac ttttattagt aatttgagag 113100 tttttttctc catggatttt agtcactggt aaaggctgtt tcatattcat agattttttt 113160 ctacggtaag aaacatatga tgttgaataa ggtatgaatt acaaattaag gcttttccac 113220 attcgctgcc tttataagat ttttttttct tcatcaaaat ctattcacac acacacagac 113280 acacatgcgc tgttttgatt ttcttcaaat atatccagtg ttcagttctt gggcacatat 113340 taatatactt gcctagatga agactatgtg tcctcaggaa tttataatct agcaggtgaa 113400 agatttgctt ctttcaaaat gtgactctac ttccccactc cttaggttgt gaaagcagtt 113460 gtttacgctt tatttcattg ttttccaaac tttagttatt tatgtgccat cttcatgatt 113520 atgctattca cataccacct atactattat gcttctgaaa atatactatg attttcaact 113580 taattaaatt tgtttagtaa taacagtagc tgttacatca ctaggttgat gtgctagtta 113640 aaaattttta aatatacttt aatataaata tgttactact aaattatttt tttgtctgta 113700 tgcacccaaa atcttgcctt tagtagtact acacatatca tgctttggga aactctaccc 113760 atgagattca tattcaagca tgaggaatgg caaaagaaaa tacagaaata gtgatagtaa 113820 ccatagcaat ggtaataaga gctattattt attgaggact ttacgtatgt catttaattt 113880 tattttatcc tcacaacaaa ttttagccat gagtatcaga taaatatgag gcaaaagggc 113940 aggaaagaag gaacagtgga agtcaagctt tttttcgcct aggtcagcta taactaacac 114000 gacaagatgt tttagtattt gtactttatt tttagtcagc tcagatttca cacctgacta 114060 ttttacaaaa atttggatgt gatggtggca gattaacata attactttta gcaattatta 114120 tgggacaaat tagttaaagg ttgtaaaatg cctagaaaca gagtagaata tcctagtagg 114180 atatcctaga atatcctata attaagttat caaacaatta ctctgattat ttttcacagt 114240 agttcaatca aagtgtaact ttgggtctgt tagtatacat gagtgtgaat actctggaga 114300 tttgatcttt ggctttcctg tgtaagttca tatatatttt tgttattatc ctgtaaataa 114360 ctgaattata gtacagtgat tctgtaaaaa acactttagt tattaatatt ctttggtgtg 114420 aagttcacat taaaaattgt tatatttcca gaacctggtt tttacctgtg aaagtcaatg 114480 catccttctt ttaatcctct gcattggttt tgcatagctt gatgaaatat gacttgcttc 114540 tcctccctcc ccctccttcc tgtgcctgta tccccatcat ttttttttct attcctcttg 114600 gtatctggac ttctttttct gccaaatgag tcagtaagag aggaaatgtt taacccacat 114660 ttgtcatctt ggctgggaaa gaagtttgaa ggcaaaaggt gcctgaatat gtttcactag 114720 gatgctgaca caaccttttt gactctctcc taagaatact actctatatt caagttataa 114780 agtgctaaat gatctatttc caccatgtat acatttcata tgatcaatac ttattttgta 114840 acttttttct ttgaggagaa gtatttttct tttggaaaaa tattatttat ttgtgtgtgt 114900 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtatttat tttcttttaa tatgtggtct ccctatgcaa 114960 aggatttgat tttataaaca gaagcaatag gattaagagg ataaaggaaa aataggagaa 115020 ggggaaatat gagtatcatg ataaggtaaa aatgaattgc ttgtattcta acatagaata 115080 gctactacct gttgagtgtt tattatatat tagacattta agactaatca aaatatctaa 115140 tctaatgaaa taatcactgt tttgaatttg cttagattta gtagatgtag aaactgagac 115200 ttagagaggt ttatttactc aactccacac tgctaattac tggtgaaagt agaattttac 115260 tcctctggtt ttctcatcca gcacatcatc actataaccc ttatagtttg cttttggcac 115320 aagtattcat tattaatgga aatgcatagt attatctcag caaatgtaca aatagtttag 115380 cttcactaaa ctagtcaatt ttttttttct aaacatcaat gcttaggaag caaaacaggc 115440 tgggggaaca gtagttgtac tggtggcagc tgtggtgctg atggaggaag tggtggaatg 115500 cataggctgc tcatgctttt tgccacaatg aaggtcaaaa agtagatcac ttaaagtcta 115560 aagttaacct tgggggtcat attcttcacc aaaaactatg tttatacata tagacttagc 115620 agtatgctat aaaagtgaag atatagcact ataaaattcc accataaagt aaattgttca 115680 agattgtggt ccaagctctt caaaatgctc ataaatcaga aggtgtattt attaaacaat 115740 attttatatg tacctataat aatacaatac tatactacac aaattggacc taaaatgaat 115800 tctcttgcta tattaaatat taaacattaa ataggcagaa attttgtttg cactggactt 115860 agaatataag aagaaaattt gggacaacct gaatagttga ggtctcttga gaaacccttc 115920 agcttctttt cctccaaata aatttctctg tagcaaatgg aagccatcca aatgattccc 115980 tagctacctc aaagtactgt aatttgtcta cttcacaaag tggaggacta tatctagcaa 116040 taattcaaga aaaatgcagt gactcccatt atatcttagg cactatgcta ggaagtttat 116100 gcatatcatt ttgtttgatt ttaatagcaa cttcatgaaa taaatcatca taataaatca 116160 ctatttcaga tattgagaaa ccacagaaag agagaagtta aataattttc ctgtcaaaga 116220 ccacatcaat gatgaagcca gaatttgagc tcatgtactt aaccactgga ctacctgcct 116280 gccctgtcga ggaacagcta aggttgtcat agagtcttga ctgtgtatag atagttgttt 116340 gaagagagaa aaaaggcagg aggatctggg gcatatgttt aaatcaggca ttggcatctg 116400 tactagaatt gaaaggtgga actattattg tgttctattt attgagtata ggtataccat 116460 attcaatgta tttctctgct tcatacacta tccaaggtga taaaagtgtt tatgaagagg 116520 gattaggaaa tatctgctgt gtttaggtca tagtccaacc aaaggattaa ttaacatttg 116580 cctctttttt ctcctacatc cagtgtccct tttgatgaga agaataagcc tcattctgat 116640 tcaacagcag agatcaaaga aaagacttct gttttctggc caccagatat atgttatctg 116700 tgcttaaaga attgaaaaac acacatcaaa ggagaatttt cttggaaaga gaggtaatga 116760 gatacagtga aagagaatgg agattcttta aatcacagag acctaggatc aaatcctgtg 116820 attagcactt tttagtaatg tagcctactt catttctttg agccctcgtt tatttttctg 116880 aaaatgaggg tgatctaaat tacgtctgga gtagtaataa agattaaatc catgtgatac 116940 aggtaaactc atgacaataa tagacatgaa acaaatagtc tttcatctcc ctcctttgct 117000 caagcattgc tctgctcttc tcacctcctt tcccttcctt tttcttttct cctctttatt 117060 ttgtctgtac ccaatagctt ttcccaagcc ttaaaactat gtataggtat attgttgcag 117120 caaaatgcat aaaggagaca ctcattattt gcatccattt atatgctgat ataaatattt 117180 catcctcaca agtttcagag ggaaagacca catgctggtg atttggtgag aaagaagcaa 117240 ctatttctgt gatttaattt caacctgagc attaaagagg caccctttca ctactagtgg 117300 taactccatg cttccaagaa ctaatgagct gaagaactta gcacttgtga tgaattagtc 117360 aagcaaaaat tatgaagcga gtaatctata acattatagt acattacaaa tgctgaaata 117420 tattagttat tatttattat gattcttata gctcatttat actgtacaaa attcttctgt 117480 cattttatga agatgttaca catatacata acaaaactta gctaattaga tacaaagact 117540 atagaaccaa ataactcttt tctaaatatt ttccctttaa ggaggttttg caatccagct 117600 ttgctgtggt tagacactgt tgatgagaaa actttttttt tctttctttt ttttttttag 117660 acagggaatc attctgttgc ccaggctgta atgcagtggc acaatcatgg ttcattgcag 117720 cctcaacctc ttgggctata gtcgtcctcc tgcctcagtc ttctgagtag ctgggactat 117780 ttgatgtgca ctcccatgtg cggctaattt ttgtattttt ttttttttgt agagatgggt 117840 tttcaacatg ttgcctaggc tggtctcgag ctcctaggct caaggtatcc acctgcctca 117900 gcctctcaaa gtgctgggat tacaggcgtg agtcagtgcg cctgacctgg atgagaaaat 117960 attgagttgg aaacccaaaa tatgacataa ataattggta tattttagag ctggatttca 118020 acaacttttc aacactgtca tcctgtaaat gtctttccgt cctaatccca ttgcccatgc 118080 actcagcaga agtgtgtgcc tctaaggtgg atgctggtat gaaatatctc agctggggca 118140 ggctctgaaa gggagagatc tggttaaagt gctcatacca aacaaagctc ctcatgatgc 118200 tggcctaact ctcccaatcc tgcatttctc aacaaaactt tttgctcttc tctttcacat 118260 aactcccgtg gaataatttc cattgaattg catggaagag gctgttcatg gggttagtct 118320 ggcagataag aggtctccac tggatttttt cattttgcaa tcagtttcat acatatacgt 118380 acatactttt cttggagtca tagttcattc tcaggtcttt tagagttaaa tatctttcat 118440 ttcttctttt aaggtcttaa tttcttgttt ttcgagtttc atgggagata tccagtcacc 118500 aatccaatcc atatcgggga aaagtacaac aaatgagtga aatttgtaac caaccttgga 118560 tgatggaata agacatttgg gagaacacag gagaagtggg gaggttaagg agggatagct 118620 ctgtgaaaat tttgcattac tcttgcctga ggtctactct tccttgtcat gttggtggct 118680 gttttgacaa tgagaaatat ttaatggcaa acttagtctt ctaatttgaa aatggaaatc 118740 ataacagttc ttgcctctta gggatagtgt gagacaagtg aaataatcca tgtaagaggt 118800 atagtactat gcttgccatt ctttaagagc tcaacaaata ttcacttttt acctattagt 118860 atcaatctta attctaaaat tctattattt aatattttcc agtggtgttt ctaaataata 118920 tctaatgact aggctaatac actatgtggt tcttctaggg ttcaagcatc actgttaggt 118980 gtgctggaat cctttcccga gtcagtactg ctttctagaa gaaaaccggg gagatctatt 119040 tggaatgtat ctaactccaa agaaaccatc agaggtaaca ggtaggagat atgaaacgac 119100 cttttagata tgaaccctaa ttgaataaaa gttgccaaac aactgttccc aaacatctaa 119160 agaagagttt tagtctaagt ggaatggctg gagagtatgg gaagagttct ttcctactct 119220 gtccaaacac aagcctctgt gacatttatc aaagaaatgc agccctttaa atctgggtat 119280 aagtccgaaa ggtgctttcc ttgtgaagct tcttttgtcc tctgctttta ggactctctg 119340 cacactgcat cctctatgtc accctccagt acatctgctc ttacacaagg ggccccacag 119400 ggactggccc acacaccagc cagggcacat gggccaactt ttaacagcaa aaggaaatgc 119460 taaatcctag agtagggcag atgagaaaaa tggcattctt cagagagctg ggatgactca 119520 cattaagatc aagggccctg aagtaagaca gacctgagtc tgaatctcaa ttccaacaat 119580 aaatttgttt atacacttaa ggcatcatgt atagtattgt taaatagata ctttacaaga 119640 ttgtaactaa gaggaagcaa aataatatct gtaaagcgtt tcatagattg gccagcatat 119700 agtaaacatt taataattag tagctattat tatttttcct taaatatttt ttttctggct 119760 tcctagcaat cataaaattt agtcttgtat agactccatg gctaggactt gcagaattaa 119820 aaatggtctg aacaatttag acattgcctt tttgtcctca aaccaagggg tgaattttta 119880 ttctaaaata tccagattgt ccatatcact taaccagttg attgctaagt ctgtatttct 119940 cttttatgca attgggaaac attaaaaagt tgaatgtata tactgtacac atacatgcac 120000 acacatagac ttaagtacat aaatgtgtat gtaccttcca tagcacttag ctcatctgtt 120060 ctttcctatg accttttcta taatcctgtg aagtaggttt tatattatcc tattttatga 120120 ttaaaggaga agggaagaca gaaaagcagc ctggcttggc cagaggcctt gcaattgatt 120180 acgtatagag ccagggagtc ctgacccctt ttcagttttt cttcctctgt actgctgtga 120240 tgactgtgga agtgaagtac ttctttggct gccaaggaag tcccagctga aaggtaacca 120300 aaggaaagga gtatttggga gcagcatggc tgaaatccag ttaacagtta aaatcccgtt 120360 gggcaatttc tcgttaattg acaacaggaa ttgctgtcac tgtcctgtct agccactttc 120420 aaacggtggg gatgttagca agagctccca gtgaatgctt cctaggagag cagtgattgc 120480 tttggctagc ttcttctgta gcagttttct ggcggtgaaa agtctgtact aagacaattg 120540 gaggtggtaa tcattttcta ataaccacct caggcttttg gcacctaatt cgctggcact 120600 gtctagggaa gctccttatg ctaactcatg cttcttgcca tgtcaatctg cttatctaat 120660 tttgctggga aatctgatat cacccttcaa atagttcacc tcagtgggat ccagtgtgtg 120720 acctgcaaag tgctcaagga agagtctgat cagctctgac aagcaaacag cagaaagaag 120780 ttttgaaaaa acggctaccg tttttgcagc tttttcactg tggttccatg gtgtttgaaa 120840 tcagaatgta atattgagtt aatgacacaa ggaaacactt ggatgttcat attgtctact 120900 tggttttcat gaacctcaca tggactggct tcatcctgtt tcagagtcca ttcaactgta 120960 atttccactc tacttcctgt gcaggccttc ctctggtttg tgggctgtac atttcagcct 121020 gctcctttaa ggggccccct gagctgaaaa tgaaagagac attttgttgc ttctgctacc 121080 tgcttatcgt ccaatcccaa tctcagattt tctttttcta ttttttaaac ccgagtagca 121140 cttttccaac tagtgtgtag tttttctttc aattctctgc tcttcacagt aattaaacaa 121200 gagctagcct ccttttccaa atcttgtttt tgtaatacct ttattcccaa agagttatgc 121260 ttataagagt aacataaatg tgttaaactt ggtattgatt tgatgatttc ataaacccca 121320 gactccttga aattctgcag gtttttgtga aaggacttgc ttaaaatctt tgctaatcta 121380 cctgaatttt cttccaaagg cagttatata caatgtttct taaaactaat tctccaaatt 121440 tgcaatttgg cagcatccta ctgggactct agaaggctga taaatcatgg agagtaggta 121500 ttcatatagg aactatgaaa gctgtatgta gtaaacacta cttaagaagg ccttacattt 121560 cataaaaagt tggagatttt tgtggagact cataaaatgc atcctttata tcagtgaagt 121620 ttttgcttct aggtatatta tactcacatc gaaacactcc agggattttg ttttcagcct 121680 gcatatacca cgtatattta ttatctggat agataaatta gacgtataca tttaaaggag 121740 tttgcatcag ctgctgctag gaagtttttc ttgtgttagt taagatcctg tgaaacaacc 121800 cttgacattt cactagctgc acagtttgta ataaaatcca ttttagcctg aggttaaatc 121860 atgactgtgg tcctcacatc atggtggggg atcctggtgg ccagattaaa ggaaactcca 121920 cattctcatt tctgacttcc ctacaacctt gtattaagac cttaattgaa aaacttattg 121980 cctctctcac caaaatattt caaattttaa tagtttcccc caatgaaatt acaagtacta 122040 ttttactttt ttcagtgccc ttggaatttc gaggctggat ggggggcttc aatgtctgac 122100 tcattaagtg ttctatatac aaagccctac atggtcccta gagcatagca ggcattcagt 122160 gaatgaaatg aatgaatgaa aagctagagt cacattttag tgacctaact gtatattttc 122220 agagtaatgt agtgcttaaa aaaggacaat gataacacgt ttctacaaag agatgcatga 122280 cagataacac ttctcaagaa gaaggaattt agcttctgtc atttgatcta ggttttcaat 122340 tacagaagca ttgagaattt cctgtggctg gataagggcg aatctttaag gcaagttgaa 122400 gacccaggct gcccatgtgg acatcaatac tcccacagag cactcttcat gaagaaaagt 122460 gtgggcttgc tgtcttttca tcaaaactcg tagaatttgg ctgactgcct ggtttatccc 122520 aggacattag tcagcccaca aatcccgcat ttgtttattc agtccagagc aagtgaatac 122580 tgccattttc tcatctcctt tgttggcaac actttgttaa cctgaattgg gttctcaaca 122640 taaaatgaag tgactaatct tttggggggt tccccctccc aggttcttgt atgagcaact 122700 aaatctacac accacaaagc cccatgctgt cattttttct catcctgccc ctttattttg 122760 atgattccac attgtagttc atgaaaccaa taccttctag agtgtggctg aactggcgcc 122820 agcattaaga aaaggagttt ccaaactttt tagttttgtg agaaaatgtt agaggaagag 122880 ggaggttagg ttgactattt atacttatgt aatcttctgt gaatttgcag tagttatcac 122940 cttgtactct caaaagtttt ctagctctga gtatgtgaat ctgaaagtgc aggaagtagg 123000 aatcttagca caaaacaacc agtttggatt atcacacaat taatatggga cggagctgga 123060 ggatggacct gaacagaatg tatattcttt atcactaggt tatttatcta tctacagatg 123120 tctagaaaga cctgggcttt tttagcaaac gtttgagaat ctaggtttct aagtttccat 123180 tgaccatgaa agagtgatta gttttagaag acagttgggg gcaacattgt gcaagtcaga 123240 agaggggatg aagaaaatca taaagctaaa catgtttgcc ataggcccag gctgtttttc 123300 agcatgtttc acctagcagc ttggcagata attcccagtg atcattaggt ctgtggaaat 123360 tctgtttggt ttataaagtt ttggccctga ctatgtgtac cactgataac ttgtttttct 123420 ctctcttccc ttttcctcca actcgtagcc agagctacct tccagatgac ttctttctac 123480 cactttcttt cttcccagtg taagagaatg caagtatatg ctgatgtttg gagcaagaac 123540 attcaaaaat tttcttatta acataacttc taatggaaat acagtatact actatggtgc 123600 atacaaagaa gaaatagcaa catatatttg ttttagacct gattgctgta ttttattcct 123660 taggtcctcc ttgatgtctt gtagaccgtc actagctaat tgttacagcc atcgaaggaa 123720 aaaataagga tttttactta ggacatacgt aacagaaaaa gagatggttt agcaaaaaag 123780 cacaggcttt gcaataagca gccttaaatt aaaaaaaaaa aagttaactc ataactaact 123840 gtgtgacctg ggataagtta ctgaccctct ttagggctta gggtcctaat ctgcaaaacg 123900 gaaattataa taataacctt agctagcatt tcttgtgcac atactataag ctggtgataa 123960 acaatttata cacactatct catttaatcc tcacaacaat cctgtgagat aggtactatt 124020 atcatttcta ttttacagat gaagaatcca gacataagaa gtgaagttaa gtaactttct 124080 caaggtcgca cagctaccat atgatggagc tggaatgtga atctctgcag tttgacgcca 124140 gagtgcatgc tcttagtcac tacatttgtc tacaaatcta aaacacgtaa gacacatagg 124200 aggtgctcag ttagtggtat ctattattaa atcagactat aaataatcac caggcaatac 124260 ttgaaaggcc acaaacaatt tcttaggatt tgtgacaata ctaataatta taactgatta 124320 tgagcatacc ttgtgtcagg cacttctttt catagtattt cagtcattat ttaagagatt 124380 tattcttatt tttatttttc tagtgagaaa actgaggctc aaaaaagccg acaaatttgt 124440 ttaggattac aaaaatatca aatgatagga ttgaaaatca aatccatatc ctttctatgt 124500 gaaaacctgt gttctttcag ctttttttat ttttattttt ttatttttta tttatttttt 124560 taaattttta tttattttat ttttttattt tataagcctt tttattttta tttattttac 124620 tttatttgtt gttgctggtg tttttttctt gagacagagt ctcactctgt ctcagctcac 124680 tgtaacttct gcctcccggg ttcaagcaat tctcctgcct ctgcctccca aggagctggg 124740 attacaggca cctgccacca tgcctggctc acttttgtat ttttagtaga gatggggttt 124800 caccatgttg gccaggctgg tctcgaactc ctgacctcaa gtgatctgcc tgccttggcc 124860 tcccaaagtg ctgggattta caggcatgag ccaccacgcc cagcctgcct gatttttaaa 124920 attattaaat tcatatttgt tatttatcag atgcctctgc cactttattt tttaaaaatt 124980 tatttttatt aaggtatagt taacaaataa aaattctata tatttattgt gtacagtgga 125040 atgttttgat atatgtatac attgtgaaat ggttaaatca aactaagata tctgtcatct 125100 catatgcatg ccatattttt gtggtgagaa catttatgat ctactctctt agcaattttt 125160 aatattctgc tgtttgactt ttaaaccaag gcttggatta ggacagtctt tgtagcttag 125220 ttttaggttc agggataaca aaagttgttt tatcctttgg gcttttgcaa cttgccattt 125280 tcttaatgaa gatctgggag aaaaattagt ttaagtggtt tttaaaatag ccattagctc 125340 aggacatact cagccaaggc aggataagta gttttgccag cattcttctg taggtaggtt 125400 ggttgttttt tgtttttttg ccacagtctt tttaaaaaat ataactttaa aaaaaccttg 125460 gttttctgtg attgatcttt ttcactattt tttatagagg gccaggaata tgagtaaata 125520 attcttgggc ttgggtgcag atgatccacg tgctggcaga cagaaatcta aagggacaaa 125580 agaggctgtc ctttgaagat acttttcctg gcttgggttt tatatttttg gatttgattt 125640 agtgaaaatt tttattgagg acctactgca taccagacac tcggctacat tatgagaggt 125700 ttggggggcc tatattggca tatagggagg atgaataaag aatacaaaca attatagtac 125760 aaatcagaat aaaatttggc atgcaacggg ctatcagata gtatggagga agaaagcata 125820 ttttattagt ggagctagga aatacgttac aaagttgata gcattcttga tgggtcttga 125880 aggttacata gatttttttt tctttttttt tttttgagac ggagtcttgc agtgtcgtct 125940 gggctggagt gcagtggtgc aatctcacct cccgggttca agtgactctc ctgcctcagc 126000 ctcctgagta gctcggatta gaggctcctg ccaccacatc cagctaattt atatatgtgt 126060 gtgtgtatat atatatatat atatatattt tttttttttt ccagtagaga cggggtttca 126120 ccatgttggc cagactggtc ttgaactctc gacctcgtga ttcgcccgcc tcggcctccc 126180 aaagtgctgg gattacaggt gtgagacacc acacccggcg gatagagaga attttgacag 126240 gtgaggaggt attccaatgc aaaagaataa taggagcaaa agcacagtgg tgagaaattg 126300 gaggggaact gtgaaaattg ccacatagat tagaggcagg aaaataaagg acggctaagt 126360 ttatatagtg aacagtgagc cgcatggaca caggtgactg ttttctcctt tttgaacccc 126420 tgcttactcc agagtcacca cctctcctgg ctttctgcca atcttcttgg ccacagtttc 126480 tcggtcttct tttctggctt ctcttccttg gcctgaatgc tacatgttaa gtgatgtcag 126540 cttcagtttt cttaacctct cttctcttaa gttgctatca tttaaatatc tttaaatatc 126600 atctacatcc aagtgacctc taaaccagta attttaccca tgacccatct cctcaactcc 126660 ggattgtata taaaactgtc tactcaacat cttcactttt gatgtctaaa tctctatgtc 126720 caatttagaa ttcttgattc tttgctttcc ctccctcctg gaaatcctgc tcttaccagt 126780 cttccccatc ttaattaatg aacctgacat tcacctagta gcttagtcct caaaactagg 126840 gattaatcta gatttagtca tttttcttac tcttgccata taataacata ttattctgag 126900 tttaccttta cccgacccca aataggtaac tgctgttttt gttataagat agtaatattt 126960 gcctctgagt gtatgtgaat tattttgata aaaataaata ttatttttaa aatattaatt 127020 ttacagggat tgtctcttga tttctttcca aaagttaact cataagttgt tcagcagagc 127080 tatgtattct tcagtatgtt ataatttcgt tccatcttcc aaaaggcctt cacattctct 127140 tggcttacag actcagatgc tatggattag atacacaagt acatgttcct gtatatctat 127200 tatatagtga acataacaat tatgattgtg atcttccaaa gctcgtattt ttaatcaaaa 127260 ttaattaaat attttaagcc aaagaataaa ggtagatgca gcatctagtc aaaaggatat 127320 ttctgctggc cacactcagg aagacataaa gatatagttg tagaaagtga tatagtattg 127380 gccaggtgtg gtggctcaca cctgtaatcc cagcactttg ggaggccaag gtgggctgat 127440 tgcttgagct caggagttcg aggccagctt gggcaacatg gtgtaaaccc catctctaca 127500 aaatacaaaa attagccagg tgtggtggtg ggcacctgga gtctcagcta ctcaggaggc 127560 agaggtggag gattgcttga gcctgcgagg tggaggttgc agtgagctga ggtagtgcca 127620 ctgcactcca gcctgggcga tagagtgaga ccctgtcttg agaaaaaaaa aagcaaccca 127680 gtgataggct gggcaaggtg gctcatgcct atatttctag cagtttgaga ggccaaggcg 127740 ggtggatcac ctgaggtcag gagtttgcaa ccagccttgc caacatggtg aaaccctgtc 127800 tctactaaaa atataaaaaa ttagccaggt gtggtggtgg gcacctgtaa tcccagctac 127860 tggggaggct gaggcaggag atttgcttga aaaaaaatta gccaggtgtg gtggtgggca 127920 cctgtaatcc cagctactgg ggaggctgag gcaggagatt tgcttgaatc cgagaggcag 127980 aggctacagt gagccgagat tgcgccattg cacttcagcc tgggcagcaa gagcgaaact 128040 ccatctcaaa aatgaaacaa acaaacccag tgaaaaccag tattgaaaat agattgcctc 128100 tcccttgctt catggtctgt tcttacgtaa ttttcaagat aagttcattt tggcgggtac 128160 tgacaaattt ccatttattt acttttttcc cttacattca tttcttctca gtctctccaa 128220 tgaacgcctt cactgatatc caaagcatga aggacacacc agggaaaaac atagacctaa 128280 cacaggacaa atggaattat tagaaacatt ttctagcaga agaacactat tctgttgcca 128340 tttgaatctt tgcttctttc taggtttgac aatgagccta tcatataagc ccaaatgtaa 128400 acagaaagag gttgaatcag tcacgataag cccaattatg ctgtggtaac aaacaacctc 128460 aaaatctcat tggcttaaaa tatacagaat tattcttact catggcacat atccatctat 128520 catctgcagg ggatctgctc actgaagtca cttaggaact tggactgatg gaacggccac 128580 tttttggtca ctatatgtat taatctgttt taatcctgct gataaagacc caaaattggg 128640 aacaaaaaga agtttaacta gacttacagt tccgcatggc tgaggaggcc tcagaatcat 128700 ggtgggaggc gaaaggcact tcttacatgg tggcagcaag agaaaaatga ggaagaagca 128760 aaagcggaaa cctctgataa acccatcaga tcttatgaga cttattccac tatcaagaga 128820 atagcatggg aaagactggc tcccataatt tacctccctc tgggtccctc cctcaacatg 128880 tgggaattct gggagaaaca attcaaggtg agatttggtg gggatgcagc caaaccacgt 128940 aatttcaccc ctggcccctc caaatctcat gtcctcacat ttccaaacca accatgcctt 129000 cccaatagtc acccaaagtc ttaactcatt tcagcattaa tccaaaagtc cacagtccaa 129060 attctcatct gagacaaggg tagtcccttc tgcctatgag cctgtaaaat caaagcaagc 129120 tagttacttc ctagatacaa tggtggtacc agtattgagt aaatacagct gttccaaatg 129180 ggagaaattg gccgaagcaa aagggttaca gggcccatgc aagtccaaaa tccagcgagg 129240 cagtcaaact ttgaagctcc aaaatgatct cctgtgactc caggtctcat atccaggtta 129300 tgctgatgca ggaggtgggt tgccatggtc ttgggcagct ccgtccctgt ggctttgcag 129360 ggtacagcct ccctccaatc tgctttcacc ggctggtgtt gagtgtctgt ggcttttcca 129420 gatgaatagt gtaagctatt ggtagatcta ccactctggg gtctgaagga cgatggccct 129480 cttctcacag ctccactagg cagtgcctag ggactgtgtg tgggggctct aaccccacat 129540 ttctcttctg cactgcccta gcagaggttc tccatgagag ccccgcccca gcagcaaact 129600 tttgcctggg cattcaggca tttccataca tcttctgaaa tctaagtgga ggtttccaaa 129660 cctcaattct tgacttctgg gcacccacag ggtcaacacc acgtggaagc tgccaaggct 129720 tggggcttcc accctctgaa gccacagcct gagctatata ttggcctctt tcagccacag 129780 ctggagcagc tgggacacag ggcactaaat ccctaggctg cccatggcgc agggaccctg 129840 ggtccagtcc atgaaaccac tttttcctct tgggcctctg ggcctgtgat gggaggggct 129900 gccatgaagg tctctgacaa ggcttggaga cattttcccc atggtctcgg ggattaacat 129960 taggccccat gctacttatg caaatttcta cagctagctt gaatttcttc ccagaaaatg 130020 ggtttttctt ttctattgca tagtcaggct gcaaattttc tgaactctgt ttccctttta 130080 aaactgaatg cctttaacag tacccaagtc acatcttgaa tgctttgctg cttagaaatt 130140 tcttccgcca aataccctaa atcatctctc tcaagttcaa agttccacaa atctctaggg 130200 cagaggcaaa atgccaccag tctctttgct aaaacctaac aagagtcaca tttgctccag 130260 ttcccaacaa attcctcatc tccatctgag accacctcag cctggatttt attgtccata 130320 tcgctgttgg cattttggac aaagccatta aacaaatctc taggaaattc taagcattcc 130380 cacattttcc tttcttcttc tgagcctttc aaactgttcc agtccctgcc tgttacccag 130440 ttccaaagtc acttccacat ttttgggtat ctattcagca aagccccact ctactggtac 130500 caatttactg tattagtctg ttttcatgct gctgataaag acatacctga aactaggaac 130560 aaaaagaggt ttcattggac ttacagttag ttccacatgg ctggagaggc cttagaatca 130620 tggcaggagg tgaaaggcac ttctcatgtg gcagtggcaa gagtaaaatg aggaggaagc 130680 aaaagtggaa acccctgata aacccatcag atctcgtgag acttacttca ctatcaggag 130740 aatagcacga gaaagatcgg ccctcgggat tcagttacct caccctggat acctcccaca 130800 aaatgtggga attctgggag atacaattca agttgagatt tggtagggac acaggcaaac 130860 catatcacta taccacaagt ttttttaaaa aaacaaactt ttgagaatct tgtactgata 130920 attaatatct ggtctggaag tgaagcacat ttctttttct tgcaactgat tggccagaac 130980 cagctagatg gccccaccaa gccaacattg ggggagaact gaaatatttg gcaaacagca 131040 accatgacca tcacagctgg aagttctcag tctggaactc cttccccagg cctcccattt 131100 ctggaactct gagaacaaca atccaggaat ctgatgacat cttttccttt actagccaaa 131160 atctgatgac attttttcct ttactagcca aaagggagaa caataagcaa ataaattcaa 131220 ttttctccca tttatacttt taaatctgag aacgaattgt gtgtttataa gaaagtgagg 131280 gttgagcatc atgaagaaaa atataaagat ctttaaaaag tatatattgg gcctattagc 131340 tacaaacatg gatcattatt aatatgtgtc tgactgacat ttaaaatgca taatcaaaat 131400 caagcctgtt agatacaaaa ttcatccatt aatagcaact aaatttcatt aggtaagtag 131460 tagtgctatg tttaaaagag taatctattt ggaaacagga attaatactc agaatattat 131520 tattaatata tttgaaaatt acttgtgttt atttgtccca gcccttacaa ggtgtgtggt 131580 aatggttaag gtatttctcc tctatatgcc tgagttttct tctttacaaa aggggggagg 131640 gaataatagc acctgatttt acttttgttg tgaagattaa atttgtacat atataaatct 131700 atatatctat atatacactt atatatgtat gtaaaatatg taggcttgtg cctgacatta 131760 aatactaaaa aatactagct attattttta tcctcatatt atcagatatg acacattcat 131820 aatttaaaca gaagcctacg aagaactcat aaattaaaag aagataatct tttcacaagg 131880 taacaaattt tggaacaatt ttttagagtc tctagacatc tgttactgac gttgtgagtg 131940 aaatgggtct gtgaagggaa gatacaggtg gaactgggcc agtgtttgca gaggaccatg 132000 atatttctat atctctgctg gctccctatc agttctagag ctagttcaag tgaagcctcc 132060 ataacctctg gacaataaaa atgcaccatg ctattgttag catgatgaat gaatttattt 132120 ttgtttagct tacagaaagt tagtagtttt caaaagggtc tttatgtata caattgaaga 132180 tactacattc ttgaaaagga aatctttaca gcatacaggt ccctggcact aatacctcat 132240 ttctgggcac agcttgatat ggaggtatag tttgtgtttt atctgaggaa aatttaggtt 132300 ggtgttatgt tttgggctag ctctgctgaa acattattct cttttctttt agagccaggg 132360 ctgtgggctg tgtcacttgt gacttggcag cccttaatgg ggctacatga ggaagacatt 132420 tccttacatg attccaagag tctttctctg gggttctgag gtagtctctg tgtttcttgg 132480 agatatcgtt ggctctaaaa tttcccctaa gtgaggtgat attctgtcat ctcatgcatg 132540 ggttttggag gctgaggggt gtctgggttg gctccaccac ctaccagttg ggtaatattg 132600 tgtagttttt tttttaaacc tttctcagct ttagtttcct tatttgaaca gggttaaaaa 132660 ttgggcttga gagaaggatt agagataata ttagtagata ttgttgatga attgggcgaa 132720 gcagagggag ggggcaaagt tgactacctt tgtttctgtc tcaaacaagt aggtggtgat 132780 gcctttgagg agataagaaa agtgacttgt gtgtgtgtgt gaaagacaga cacacacaca 132840 tatatatata tagagagaga gagagagaga gagagactta taaattttgg atatatggtt 132900 tcaaggcact tttctggatg cataagtgta aatgttcagt tgaagtttta atggtgctta 132960 ggagagagat gtgaacgata atagagattc caaaggcctt tacatcaaga ggataactga 133020 agctatagga gcagatgagg cacacctgta aagatgagac aagaagaaag cctagggtag 133080 ctctgagaac tttgctattt agtgtcctca tagaggggat ggaggattct tcacaaaaag 133140 ttcagttttg tgacaccaca ttcccctgat tttactctta cctcttgaga caccaatttt 133200 ttaatgaaga agaaaattat gttgcctgct taaagtaagg aaagcaggtg ttggtgggat 133260 tccttaatag aaatatagag gtttaaaata cctacaagag taggagatag aattgatcaa 133320 gtaaaaaaat tgaagagatt aattgaggac ttaacatcag agaccatatg tttgttgtga 133380 caataatcca aattattgta ataatgtgtt taggagtatt tagccttgta ggtaccaaga 133440 ttgcattgat cctgtgttag gagtttgcca ggtgtgtgca atagtgagaa agacatgaag 133500 ggatttgagg ttgctgatga gtgaccagtt tagatgacaa ctactgtttc ttcaactctt 133560 tcttcaactt caactgtctg ttttgggaaa ggctagtggc ctgtgaggaa acgaagaccc 133620 cggagctgga ggactcaaag agtttggaga gcagacgtgt gcaagtgagg gttttgtgag 133680 cactggagga caggcagctg gggaagagag tgtgttattt gcagttatga tattgggtgt 133740 ggagctattt ttggtggcag caaagctcag gatgtatttt tttattattc ccataggtga 133800 tggaggcttt ttattttgcc acaaaaccac tggtgacgtt gcctgtggcc accttggaga 133860 agacactgga ggtacacagg atgtatccct ggaagtggca gggggtataa gtttagtagg 133920 agatttgtta ctgagtattt aaggtctagg aacagattga gggtgttggg tggattgccc 133980 actaagacac tgggttttct agcatgatga cagaaattgg agtttggggg gagaagagtt 134040 ctattgtgtc ttgaagaatg tgatcaggag gtatttctaa tgacacaaac atagaagtat 134100 acacactggt atagtcagat ggcatgagta ccaaggtgga agtgtggtgg tcctaaagtg 134160 gcattaagga gccaataaat tgtcattcct accttagctc tgtgtcagat gaaatacaca 134220 gcatagtgtg gggagaaaat gttgggctta ttggggatgg ggtctttcac ataaaggaag 134280 aaggtttcag aaggcatagt ggtatgaaaa gaggagaaac caaagggagg aaggtcaata 134340 aagggttaag aacgagggga ggcaaattga ctttctttca gcatatgagg attataggaa 134400 tggaaacctt aattggaatt aattgaccac aaatattcca aagatggagt gaatcagttc 134460 gagacagaga tatctgaggg tctgagggtc tgaagtagga tttgtcccag tcgtgtgtgg 134520 gtgggttcac tgtgtggagc ctggggtctt gaggatctga acatgggctg cctcctgtgt 134580 gcacggtgga ggcatctggc ctgttctccc tggggtggac tcatgatgag ctgagtggcc 134640 aaacacacaa tggttttcat ttaacatctc atttctagcc taacgacaaa cctaaaaggt 134700 gggcataaca ataatgttaa taaaacatct gcatttctcc catccttgga gttgtgagga 134760 tttaatgcaa ttgtttgtgg gaaagcactt taacaactct aaattacgat atatatgcta 134820 ggttttattg ttacccacac ctttgatgta tttctctttg tactcttcac tgtatctgta 134880 acacattccc taggataatt agggctaccc tttaacaaag ccaagattct atttatagtg 134940 gtaagctggc acctgggctg attctctcta gtgattatgt agttttgatg tggactggca 135000 ttcttccctg gagtttgagt acctccgtca gcacttctcc cgtccagaag ttccatctct 135060 gtgtttttct attacaaagc ccagacaccc atctaggcca cccaccaggt tcctctttcc 135120 agtcttaagg acatctttag ctcctggctc atttgtgaga tggagtggac tgacatgccc 135180 taagcaaaga ttgccagcct ggtctagttt tccaggtctc ccttgactcg acaataaagt 135240 aaccactaga ctttgagaat tgcagtttta cattgtctag agtcttctag actttcatga 135300 agataggcaa atatgattct aaccaagatg tattaatacc tcctacttcc tttgaaatgt 135360 aactgagact gtacttgaga cgttacaatt tcttggaagg ggaaaggaag cttctgctat 135420 tgaacgaact ttttgttaag gtagctccca agcaggttca gtagctttgt tctattatca 135480 cttttctact gacagtgatt tttttccttt gaaggcctgg gacatggaga ctgcttttct 135540 gcagaaacca catcccttgg agtaatgagc tacacctacc tcaattattc agtgcagtac 135600 aacactccag gtcagctatt aagaggtgca cacattattt ttagaaaatg tgagtcagtc 135660 ttggggaaaa caaatctatg ctatatgttc tttttactca cttgatttac aacatactgt 135720 gatgtattct ttttctattc agcatctttt tgtacccgta gctctttgtt ctgagcataa 135780 atgtgacctt ttggcttcag gtagaaactc tgtctcatga gcactccctg gacacggaag 135840 ttctttgaaa tagcattgat tttgtttaag ccttcatgtt cccctggaag gctgattaac 135900 cttagtgcct tctttctgta atagctcata ttgaattatc tccctctgtc tgattatatc 135960 catttgaatc acctgcaagt ttcttttaca tgtctagagt gaggacaatg tgggtgatga 136020 agagctgaaa tcttctaggt aaacattaga tttttaaaaa ttctattttt ttttttttat 136080 ttttaagaca gggtctcact ctgtcaccca ggctggagtg tattggcatg attacagctc 136140 actgcaacct tgaactccca ggctcaaacc tgagcagctg ggactacaga tgcaccacca 136200 tgcatggtta gttttttaat ttttttttgt agatagaggt tctcactatg ttgcccaggc 136260 tcatctcaaa ttcatggcct ccagagatcc acctgcctca gccttccaaa gtgctgggat 136320 tacagacatg agccactgca ctaagccaaa aactcttgtt caaattacat tttctgcctt 136380 agtaatgctg ctttcctagc ttctgagaat ttctaagacc caatggtaac tctatgctaa 136440 aattaaaata cgaatgtcct tttcaaaact gcacaatatc tttgctattg tcaataatgt 136500 ctcaataaac ataaaatagc aaagagattg tgcagtttta aaaagaacat tcgtatttta 136560 attttagcat agagttacca tcgggtctta gaaattctca gaagctggaa aagcagcgtt 136620 actaaggcag aaaatgtatt cacaatagca aagacttgga accaacccaa atgtccatca 136680 atgatagact ggattaagaa aatgtggcat atatacacca tggaatacta tgcagccata 136740 aaaagggatg agttcttgtc ctttgtaggg acatggatga agctggaaac catcattctg 136800 agcaaactat cgcaaggaca gaaaaccaaa cactgatgtt ctcactcata ggtgggagtt 136860 gaacaatgag aacacttgga cacagggtgg ggaacatcac acaccagggc ctgttgtggg 136920 gtggggagag gagggaggga tagcattagg agaaatacct aatgtaaatg acgagttaat 136980 gggtgcagca caccaacata gcacatgtat acatatgtaa taaacctgca cattgtgcac 137040 atgtacccta gaacttaaag tataataata aacaaaaaaa accactgcac aatctctagt 137100 attcagatgg agactaagca tgatttttct tataaaagag cagatcagaa tgttgtatct 137160 tttattcaga agactggagt taatcactgt tatctttagt acttagtgct gccaaggctg 137220 tgtgttcaca atgaggatag gatgtcaaat aaatgaagct tcatagaaca agagcaggat 137280 tgagtcatgt aggcaactgt ttcagcttcc tcacctaact tagcaccaaa atgtgttatt 137340 gtcattacag agtgcttatt taaagaaaaa taaaaagaac acacacacac acgcacgcac 137400 acacacacgc acgcacacac acacacatgt agctacatgt ctaggaagga tgtggagagc 137460 tgaaatatga aggcaaaata aaacatcttt ttcaaagtat acagcctaca gtggttagca 137520 cagagctggc cacatagcag gggtttcata aatgcttgtt gattaaactc ttttttttga 137580 aaacaataat gtagaagcaa agagcctaaa gtgttttcat aaatcttaag tggtagcttt 137640 atgttccagt tcagcaaaac acaaatttga aggcaatctg tacgttaggg ttcaggtgaa 137700 gaaggcaaag gaatcaatga aattgtaaaa gctttccaaa tttgcctttt ctcttaagat 137760 tgtctttctc tcattctctt ctccctattt caggaatgca aatatcctgt ttcatcaatc 137820 ttttgttttc tgactcaaga taacaacaat aatttattga gcacaaacca tgacttttgg 137880 gtctgtgtag ccccgaagct tcatagttca atatctgaca cataagaggg gcttactcta 137940 cacttaaatg ttagttttgt cctcactttt ttctctttct cagagatctc ccttttcccc 138000 tacttgtata agcatgaaga aatctttctt ttcattctct ccaagtttaa tcagacaact 138060 ccacatacat acatctttgt tcacaactat gaacaagaca gaaaagttgc tggacctcaa 138120 ggactttaca atcaatctgg gaaggcaaac attgaacata taatgtccag tctgataagt 138180 gttagggaag gaaagctcag aatgcaaggg aatataatct aatctaggag atcgtgggaa 138240 atatcactgg ggaatttgga actgaaagaa aaataagatt tgattagggg aaattgaagg 138300 atcagggagt caggcggaga agaatgtccc ggcagatgag acactatgta ccaagcccga 138360 gtttgacaga gagcgtggtt tacagaagga atctaaaagg tgtagtttct gtagcagaag 138420 tgtaagggtg ttactcgtag gaggcctcta ttgaactctt ttccagtgac gtagtgtgtg 138480 gtctttaagt ggctttgcaa tgatagtaag atcagcattg cattactgaa tgagctcctt 138540 tagtaaacgt ggatatgtgc tttctgaatc tatttgtttg tttttcccaa gtcataaaca 138600 gtgaatcaag caaatgaaac ataatcaagc ttggatagta tcttccacta atttccttgg 138660 tcttaagtaa gactgacagt aaactgatgg tcaacctgtt caatgggctt taacaagtag 138720 tagccacatc caagtcaaca aacagtacag gcaatcaggg cccctggcct acagtgaatc 138780 atgggaatta ccccagggac ctatgctttg gggactcgtc cttcctggca gctatagatg 138840 ccatcagaaa ctcatttgca cactcttata accaagataa gggcaatggt tagtcccctg 138900 tcattgcatg ttagctttct ttcccttttc taggcttttt cagatgcctc ttttacatta 138960 ttacttttcc tgtgtgaaaa taatgcgtgg gaaatgggta ggtcatacag agcgataatt 139020 tcattcctgg gcccctgtct tgcagctccc taagtaaagt tttgcgcctg gcactcctct 139080 ggcatagtaa cctctgacaa acccttgggt aatagaggag tagcaaaacc catgggtaat 139140 ggaggagtag caggaatatt atgattagct aacaaattca caaagtacat agaaattttt 139200 ttctcgaata accactatag ctgaggaata tagattagtg acaaaattgt gcactcaacc 139260 aactctatta aaagtatttc attattcccg tgaaaaaact cctaggaaaa tgattcactg 139320 agagatatac gattgtataa gtattgagaa acagtctttc ttttttgctt tttatttatt 139380 tatttaatag acattatagt tacacataat tatgggatac aatttgatgg ttcgatacat 139440 ttttatgttg tataataatc caatcaaggt atatttagtg tactcatcac ttcatgcatt 139500 tattattcct ttttgatgag aacattcaaa agcctctctt ctagctcttt cgtaatatca 139560 ataccttact gttaatcata gtcactctac tgtgcaatag aatgctagaa tttattcctc 139620 ctattgaatt gtaactttgt acctgtcgac cagcctctcc ccatcttctt ccccttcctt 139680 cttgcttccc cagtctctgg taaccactgt tctattcctt tttttgtttt ttctttttgc 139740 agagttcgct ctgccgccca gactggagtg cagtgcacaa tcttggctca ctgctacctc 139800 cgcctcccag gttcaagtga ttctttctat tttttgggaa tgtgcgttat ctaatactta 139860 ggtgcctcag atttaatggt ggtaaatctc actcatttta tgaaaaccaa atgaacacta 139920 tcctcacaat ggttagaaag caagatcagc tcaactttat gaaaatatga ctataaaacc 139980 atttattatt gccaagtggt tggagtggag ttgacagaaa gatgcattat tttaaattgt 140040 gttttagatg acagaacagg agtcagtaat gttccagttt ggaggaatta gagttaattg 140100 gttaattgat tgattcgatt cagtcaaatt tattgaatga ctgctgtttc agacactgta 140160 tttggtcctg ggaaaacaca gataaataat atataattgt attataaatt aataaaatag 140220 ttttttccct ccaaatgtca gtagtccttg gaaaggacat gtaaacaatg aatataaagt 140280 gacacatagt ccagtcaaga taggtaggaa ggtctaagta caattgagtg gtcaatttca 140340 cttcagggaa gggcaatgat cagggaagat ttcccaggga aagtgatgct tgggcaaata 140400 agtaagcatt ttacaaagag acaaggaagg atagggcgtc ctgggcagag gaaggagtgt 140460 gtacaaaggc caagtgacat atgacaacat tgtacatgaa ggaaactacc atcaggcaga 140520 gctgaaatgt tggcacatgg tgaagtgcta gttaccggtc ccagccatga cagtagtgta 140580 acaaatgcct gcctctggtg cacagcaaga tattaagatt cctcaaaaca gttcatatat 140640 tttataaatt aagatagaca ttaacagaag ctcatagaat caattaatgc aaatgtaagt 140700 gacctaagag gcattttgtt cagcatagtt attgattttg cctgacccag aggatttgaa 140760 tttaggaaga tgtaagccta gagtagctgt cagttatctt gtgatacatg ggccttggaa 140820 gcaaggtaca gggacacagt ggaccaatgg gggaagatta ggtcctggtg atgtgattca 140880 agccactgga ttaagccaca tctgaaacgt ctatttctgt actcttcagt tacaagagat 140940 gttagtttga attatttgct taagtcagtt tttaaaaaat tcaattgcaa cttaggagat 141000 acatctggcc tcttcatttt acaacttagg agactaatat ctagtatgac aaagtgactt 141060 gccaccaaat ggctggttaa aaactgatac caggacccag atctaatgac tcagaggcca 141120 ggcttagaaa tatctagctt tttttttttt tttttttttt ttttttttta gacacggagt 141180 cttgctctgt tgaccaggct ggagtgcagt tgcgcgatct tggctcacag caaattttta 141240 aagcatctac atgtgagggc ctaagtatac gagtacctag aaatctattt tgcagcaact 141300 atatatttga tagagtgatt gagtttagtt taaagatgac atttctaagt ggtagtgctg 141360 tcaaaagagc attgcattga atcaagaatc tggcattctg tgttcatagt tcacttttgc 141420 cactaattat ttttgtgacc ctgggtattt ctttctggga ctgtattcat tggatatgag 141480 tatctctaaa tcttcttcaa cttctatgat tctaaatgga agtacactca attttcaagt 141540 atccattgtg gattttatat actgctatgt atcctgagaa aatcttcctt ttgaattatt 141600 tttcgtatta atgagttcaa cttcacaaat atttactgaa caccaactat gagctaggtg 141660 atgtaaaagt gaatagttac ttctagtcag tattacttac ttacttttgt attccacagt 141720 gcagtttgat attgtttgta gttccaaagc attaaacaat gccttttaat ctaggacatg 141780 tggaatcttc aaataagagc agaattacaa agagttttag actgccactt tgcatcattc 141840 tgagaggcaa taccataagt gttcagcagt cagaagaagg gacaggggaa agtcctgagc 141900 agtgcaggtg gattaagaac taaatatgcc tacaaaagca cattcatgcc taaatgtcat 141960 tgcatttgga tcacaggcct tgagaagatc tgtaccatca ctgtgggtaa cttgggccca 142020 tttagagtac ttgcctctga gggaaataaa aatttgctag caattttctc taaatgacat 142080 tatcataggc acttaattcc ttgataggtt cttttagata atttttttat aatgaagcaa 142140 ttaatttgat tcacgaaagt aagtttctag tttatataaa gaccagatct ggcctatttc 142200 ttagcttgtc tacatttgag tagttccatt gctggaaaat gaccctggag cttttcaatc 142260 tcatttgaag agtccagggg acagacagag acactagtta tgcagtttac tagagccagg 142320 ttccatttca tctctaataa tttttgcctg tgtgcgcctg cacatgtagc ttaagctatc 142380 taagccttag ttagttttgt catcagtcaa aggggaatag tgatatctcc ctctaagggt 142440 tgtacaacat ggtggttatt tatagcacag cttgaataaa tgttattaga tgatatagtc 142500 tcagtcaggt tttccttgga ccatgtttta gtgacatatt agactccaaa gaagcaaaat 142560 gctaggagca caaggcagcc taacttgtga gttgatgtac agtgtgaaga tgcaccacag 142620 atttagaatt tcagttgact agaagaataa gtggtagaat ttgtccctgg ttgactactg 142680 tcttaacttt gtgtctttgg ggaaatattt aagctctcca gacttctatt tcttcatgtt 142740 taaatcggga ataatattcc tttctcattt cgtagaaatt gaaaggagat aagtatgaaa 142800 gcgtttatga gagtagaaat catgagtgtg aaagttcatg ctattatggc acaattgatg 142860 ttgaaagtta atattacaga ccattccttt tttgcacagt gaaaattgtt ttatatccat 142920 attggcccct gtcacatatt aaaatattat tttctcttat taatttctat gagaataata 142980 ctgccttcat acttttataa agggacctag gaaaccaata tttgtctaat gtttcaggct 143040 aaagagtaaa aaggaatagg tatactcttg aaaatagatg gctattgtca atatttttcc 143100 taccaagaaa ataattcctt ctctataaag aactgttact gtttagagca atattttcac 143160 gattcaaaaa gattatctga gcatgtgtcc aaccataact gacccctgca aaatatttct 143220 aaaagcactg tgcatctagg ctgggaagta tgcaaaatta gcaaaaatcc cctagcattt 143280 tcacaccaag ccatgtgtat ttaatataca ccacctcaaa gaggaacatt accaccctag 143340 cactatgagt gaggtgagac agagagattt ctaagaatat atgggtgtaa ttttctgtta 143400 actgagagtg attgacagtt cgtggaaatc tgccctccaa aataacctgt tttgcagcac 143460 ccttagtttt atttgatatg aagaaactgc ctgctgtttt gacccattta gctactagga 143520 actctattta ctaccctaac tgcctaaatc cctatggata aattaggcag tatctgttta 143580 ttttagttta gatttatttt taaaaccagt gttcctttga ctgttcttac tatttctatt 143640 tgagagttgg ttgaaataag atcatgtaaa taaaaataca atgtagtcta gatctaaagt 143700 cactgtacat acctagataa tttttttttt ttttgagaca ggatcttgct ctgtctccca 143760 ggctggagag cagtgttatg atcacagctt actgcaacct ctggctccca gattcaggtg 143820 attctcccac ctcagcctcc ctagtagttt ggactacagg tgtgtgccac cacacctggc 143880 taatttttgt atttttgtag agatggggtt ttgccatgtt gcccaggctg gtctcgaact 143940 cctaggctca agtgatctgc tcatcttggc ctcccaaatg agaaggatta caggtgtgaa 144000 ccactgtgct tggcacctag aggatttcaa taaaatttga ggtcctataa ttttaagatc 144060 acatttccaa aggaaggagt tttgcttctt ttcaaatgca tggacaatga gcaactatat 144120 tgttttggta aaactagtag tcccaaataa gaaagaggtc ctactagtcc ctagtagtct 144180 agtcccttga ctagaagaaa aagtcaagcc caatttattt tatctgcagg acttggttta 144240 agggggatta taaaactatc accacataaa gtctttgatg aagaggacat agggggatgt 144300 agggagtact tcagagatgc atctggtcac tctcgaatac ataacacatt tacataaata 144360 tatatatcca agtaaacttc agacttcaca tatttgtttc cttttgtttc cttgttgaaa 144420 atctttatcc aagctgacaa tcacagtaca ctgctcatgt agattccact gctgagagct 144480 ggaagctgag agtagagtgg gctggggagc gactttcttg ggactattat gcttttcttg 144540 cactttacta ggttcctgtt cttccccacc cactacctct cctgggcact gattccaggc 144600 aagtgagatg catatctgtg gactatggtt aagtgaaagc ctttgttctg gaaagctcta 144660 tctggtttct cttaagccag acagaccagc ttgccatgaa ggctttcata ggctctggtc 144720 cacactttag acttccaact ggtctgctac tgacattcta ggctattgtt tctccaagta 144780 atgaatgagt ataccattgg tggtggaaga gagaatttta gatggtacat agacaaatgt 144840 ttttattgtg attgttatgt atttttaatt catatgagaa aaatgttttc cattcatggt 144900 agcaatatac agtttcttct ttaaatacat ttacttaaaa atgtgagttg atttaaagag 144960 aaatattaat aagacttctg gggaaactca ggcatgacaa aatacatgaa ggtgacatgt 145020 gagtagttga ggtttagaaa gcactgcaat gttatagact ctaggctagc tccctgccta 145080 tccccaggcc agttaactag ttgaattctc tcaagagtca ggatgtcttt gcctgttggc 145140 cttcacctta agaaagtcag gcaatgatga ggaatcacac ctgaggagat tgtaggagac 145200 ctttaactta aagagtggtg atgaatatga aagaaagagt catagtatat gatcaaagca 145260 gagaggactt tgagactcag cgattgggat gtaggaaggt ttcctgtaaa aataaagtct 145320 taactgggct tcaaaggatg aacaggaatt atcctgtgga gaaaagtagg agaagaatga 145380 catatgccaa gtttgtttct taaaaccaca acccccaaat tgtgagctct gggtcttaat 145440 ttggtgggga tgggaagcgc caatctatct gtgacttctt tcctgacatg ggctttcaag 145500 tgcatgtaac ttgacattta tgatttcctc tgcaaaagaa gaaaggaaca gggtgatggt 145560 gcctctgtga tcagttgcat ttatgggtgc aacagcaaag gaggtgggac acctaaggga 145620 caaccgttca cgtgaaatga agcagggatg agaagaaatg cccgtttgta tttaatacat 145680 cccagaaatg aaccccttta ttttctggga ctgttagagc agggaaacta tatatttcta 145740 agaatggggg ctctgctcaa atctttgtat tacagtacaa agaagggtga ggacaggaag 145800 cagtggtgat cttgctcttt ttggaagagt ttgtgtctgt ccttttaaag tcaggtatga 145860 ttgataggaa agtcaagtac tggcatcctc agattggaga ggttttattt tattttattt 145920 tttttaatgg agtcttgctc ttgtcatcca ggctggagtg caatgccacg atttcagctc 145980 actccaacct ctgcctcttg ggttcaagca attctcctgt ctcaacctcc caagtagttg 146040 gattacaggc acctgccacc atgcctatct taatttttgt atttttagta gagacagggt 146100 ttcaccatgt tggcccggct ggtcttgaac tcctgacctc aggtgatcca cccgcctggg 146160 cctcccaaag tgtgggatta caggtgtgag ccaccacacc tggcctgagt ttaacataaa 146220 caaagaaata aaaataatat aatctctcaa aatagcaaag aacagggttg tctaatcaaa 146280 atatataact atttattttt aatagccaca ttacaaaagt aaaaagaaac aggtaaaatt 146340 aatttaattt aattttaaaa atatatttta aggtatacaa cacggtgcta tgggtaaaat 146400 ggttattaca atgaaacaaa ttaacatctc catcatctca catagttacc tgcttccctt 146460 cccactccaa acccctcatt gcaagagcag ctatagttta ctcatttagc aaaaatcctg 146520 aacgcaatac accattttta ttatttttta aatttatttt tttgagacaa ggtctcactc 146580 tgtcacccag gctggagtgc agtggcgcaa tcttggctca ctgcaacctc cacctcccag 146640 gctcaagcaa tcctctcacc tgagccttgc gagtagctgg gactacaggc acgggccacc 146700 acatttggct aatttttgta gagacagggt ttcaccatgt tgctcaggct ggtctcgaac 146760 tccttgggct taagtgatct gcccacctca gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcatg 146820 agccatcatg cctggcctac aatgcactaa tattaactat agttggcagg ttgggcatta 146880 gatcttcaga cttgttcatc ctacatattt gctactttgt atcctttgag gtacatctac 146940 ccatttcctc cacccaccct acctctggta atcactattt tattctctat ttctgtatat 147000 ttgactttta aaaaaattct acatatatgt aaaataatgc aatagttttc tttttgtatc 147060 tggcatattt tacttaatat aatttaaata atatacttca tttaactcaa tatatttaaa 147120 gtattttaac atacaatgaa tgtaaaaata ttgaaatgtt ttgcactttt ttcatgtaaa 147180 tatttaaaat ttggggtata tgttatagta catgccattt aggacattaa attgccaatg 147240 gaaataatat tcagatttta taacatttgc agttgaaaaa gtagatacat gtatccaagt 147300 tgctctcaac atacttaaag ttttccaata actgaattaa atatcagttt atcagtttaa 147360 tataaacaat tagggtaaat gaaaataaaa tttcagctct ttggttccat tagccatggt 147420 tcaggagcag aatagtcacc tgaggctagt gacaacgctt ttggatcaca ggaaagaaga 147480 aaaaaaatca aaataatttt tcttggtcac atttagctcc ttttcttcca ggatgattac 147540 ggagctagga atttcctacg aagctgggtg ataaaaggac attggacaaa aacacagata 147600 gcttcattct ataccaggat ccatcactga ttagctgtat tatatttgtc tctactgtaa 147660 tttgaggaga atgatacctg cttctctatc ttgttgggtt ttacagatga tgtattgaaa 147720 gttcaataaa atctataaac aatagatctc tgtggcttga atggtcctca gatatcttga 147780 ccaatgattc tcaaatgctt accatagacc ataatttttc cccacatgac actgcttcat 147840 atttttaagt tttttttcac caaatatttt gttttactat ctccaagccc tgaaactttt 147900 tttctccctc aaacatgact tcaactttac tatcctggtc cctttctatt gaatgtgttt 147960 tgtttgtgtc tatatttctt atagtgtctt gaactgattg tacttacgat atgacttgac 148020 tagcataaga tagaataggg cagtcatctt ctttgatcta gactagatgc tatccttcta 148080 ttaatgcagt tgctagtttt gtatttgctt gctttcaatt tttttttttc agattttggt 148140 aaccactgtt acttgactcg tatcaaactt atcagtagct aaaaccccca ttttccctct 148200 tcctgtgctt atttgactag ttttgttgcg ctttctgaaa tgtttctcac ttgtttttga 148260 ccaaaaaaat aaaaataaca aatgccattg attctgtgtc tatactattt gaggcagtta 148320 ggcctttact tacttcttcc aacattttaa gcagtgttgc attcaatttg aacaagagga 148380 ataaaaaggc ttgagaaatc ttagggaagt gtgtctcaag ctttagcaaa caaacaacag 148440 atctgcagga gatcttgtta aaatgctaaa ttctgattca gcaggtctgg agtagggtcc 148500 aagattttac atttctagta agtttctatg gattatgttt tgagcaacaa attcttagag 148560 tgtctgaaag gtttttaaaa taactgattt cccttcaaaa tcttcttcat taggagtaaa 148620 atatacatct tctcactctg taaatcagct ctgagatctt ctataatctt agctgaggtt 148680 tgggtatgca gagttttgaa actcttattt gcttaagaga ggagccatgt atgatcttct 148740 tttgggtttc cccattgtct ggtaaaatga ggagcattac taaacggcac tcacttttac 148800 tgagtttgtt tggatcccac agagaactga aaaagtcacc attatggaag ccttatcaga 148860 gagatgggga caagtcgccc caaagcagtt gtcaatatct ggaagatatt tttctagttg 148920 gccttatatt tcatttctat tttcctcagt tctaattcag tttatcacaa ttaaaaagaa 148980 accaatgaaa aacataaata ttggagatca tttgatttca ttggaggctg gaaaggatag 149040 aaaggctgaa aagtggccgg gtgcagtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggaag 149100 ccgaggcggg aggatcacct gaggtcagga gttcgagacc agcctggcca acatggtgaa 149160 aacccatctc tactaaaaat aaatacaaaa attagttggg cgtggtggca cgtgcctgta 149220 gttccggcta ctcgggaggc tgaggcagga gacttgcttg aatgcaggaa gtggaggtta 149280 cagtaagccg agactgtgcc tctgtactcc agcttgggtg acagagcaag acagagtgtg 149340 acagagcaaa acaccatcta aaaaaaaaaa aaaaagggaa agaaaaaaaa gaaaagctga 149400 agggtgtgct gggtcctgtc ctgggtgagg gaacaacttg tggaaaagtg aattgaggct 149460 tatcggaatg tttggggctc ctcaataatg ttggcactct gagatacaga ccaaaagtga 149520 ggtaaaaagc gagtgtttcc tttttttcag aataggactt tactccagat tttcttactc 149580 ttctcttgat tccttcacca tccttgatcg acattcacct cagatgccca tgtcccttct 149640 ccaccggcat agcttgtttt cttcttaatc ttcttgtgtt catctagcct cacattgcat 149700 ttgtcacact tcgttgaaaa cctactgttt gtcaaagtgt ctttctagta atccagatat 149760 ctcttccccc atgcctttgg tgtggtttcg gtagagtcat acagagcagc aatgccttat 149820 gaaaacgaat tttacagaat ctgcctgttc atcaaaggag gccagacagg aggtgagaaa 149880 aaccaggtgt gtcccacacc agtctcaatg aagccttttg gggtgtcttg tgctcttgac 149940 taaatctcag atggtactga atgaataatc accaaaggcg tgagctgtta aggaatccca 150000 gtttggctgg ctctgtgcag tcagatgtag ccagccctgt ttatgtgtga aaggattggg 150060 ttttccccaa gctgtttggt aatgttgcaa gaacagactt tcccctccct ggctccctgg 150120 agtaaaatgg ctgccaaagt attttggaac agaaacttag aaatgtaccg accactagaa 150180 gagagtaaca agggtccttt gatattttcc gtgttcacta tgatcaagct ggcatcgttt 150240 ccttctgagc taaagattct gagctatcat tggctgatgt gagcttgtga cctagctact 150300 tctgttcaca atacactgtg gaggggcagc gggggcagcc ctatttgggt tgagagtctt 150360 taaggagagc tttacagatg agttctagtg aagcccatca gggagaagaa aatcaaacac 150420 aatgggaaat gtttaacaat taaaaccagg ctttgcctgt gtggtcctgt gttttaccac 150480 atcactctat ggaaatgggc tgttggaagg aagactgtat ttctgacagt ttgcagagcc 150540 aaaaacctgt tgaaggcttt ttgtaaggta gtggagaaaa tggcaaaacc tttaaaactt 150600 aagggaaatt acttgatagt tctgatgacc acaggccacc agactgctgg gtcatggaat 150660 tatagctaca tgacaaagaa aataggaggg tgggctgagc cagactcaga aactattcca 150720 aaagtactat gactttttag gaagctagtt ctttttattt gaaatatttt gtgttttttt 150780 gcatgagaat tagcctatgc ttcttaaaaa tatcataaaa tgtcagctag tagaaaaata 150840 aagagtttaa tctccactcc gactacctag agtcaaccct tgttcatact gcagtacatt 150900 tttttctttt agttctgttc tatgctttaa ataaaaatac aattaggtcc atatggcaat 150960 ataattttga ctccttttaa aactgtagct tatatcataa gtctatttga tgttgttttg 151020 aagttgtcat gtacattttg tcatacaagt ttttaatgac tgtttttatg gggttgtgcc 151080 ccaagttact tattcattcc catgttatca gatattttgt tctttagctt tttttttttt 151140 tttttttaca ttataactaa tgaggcaatg tgtcttgagt attttgaatt aactctctag 151200 aatcgattct tggggaggtt atttactttg aagtgatgga cagagtgtag gagatttatg 151260 agtgaactct tgtctgattt ggaaatatag agttgtttag gctaggtatt accaacccaa 151320 agttgacact tgagtcacct aagttcttct ctactccaga gacttggccc tgcctggcct 151380 gatcccagga aaagagattt tagggattac agaaatggga acaagttgtg ggtctgagca 151440 cagcatgcaa attaattcaa cacagcccct gggacaggcc catgatcagt gagctgaaac 151500 tcccccttca agtgctttca tgattagact ccagcctagg aagcttgtct attagttgtg 151560 taatcttgaa aaaatctctg acacttttcc ctctgactca gtttccccat ctggcaccca 151620 atcttttaca gtgttatgaa aaatagggaa aatgtagaaa ggaagaacat ggcacccaat 151680 ccttaatgga cactcagtga aagctggcta tcatcatcat ttttggggtt gttgtgttct 151740 acaaatgtat tttcccagga gtttttttta ctctgtctcc tctttccttc atataccccc 151800 agcctgtggc tggggtcttg cttcaaccac catgcacctt tctgaaaccc aagttttact 151860 ccctgataaa ggtattgacc tcttgttggt ctcatcctcc agacctacct atacttaaga 151920 aaatgacatc tctttaaact ggtccccagt tcacttgttt tccctaacat tttaattcac 151980 aagattaatc acttccctta caggccagtc ttactgcaga gttgattttt ataattttgg 152040 gcctgttggt ctggttgtac ttttctcttt ctgctggtct gctagttata gcgggtcttg 152100 aaagcagtga tatgttatga cattgtcatc accctcatta ttgctcttta tataacagta 152160 gcagcataac tgtgttttga tttcttgtac aaggcataaa gtgtgctagt ggctcactat 152220 tcacatcaat ctcatcagaa aatgttattt cctccttttg ttgatcatga tatagaggcc 152280 cagtgacatt aggtaacttg ctcaagatca cacatgtgga aagctacaga gccagacttg 152340 gaactgagtc cattatatct taatcccact gcactccaaa atttgttgaa tgaaggaata 152400 gataaacgta tcatgatttt gatgttctga ctaattcgta gccagtactt tattgctatc 152460 ggagcttaag ctttaagtac tggctaggaa atagtcagaa ctttattttt aaggaggagc 152520 atataattat gtatatttta tacctgtagt aaattgggaa ctatagaaaa catgtagagg 152580 attgtgttta ccaacttcat gtagagtgag gatacccgac tctagcttgc tggtagttag 152640 gtaagtcaga catgggcagg ggataaacca aattagacta tttccatttg actaagccat 152700 ataatcaggt gtaagccacg gaaagaaatc tggaaagaca ggtgcaatat tagaagatgg 152760 ctcatgatag tgatcattag aggttcaggc ttgagaaagc caattggaat caagaaggcc 152820 taatcctggg gttctgtcac agaaaagaag gctggtagca ggaagaggac atgtaacatg 152880 aattacatga ttagatttgt gtcataataa caaaaacaat aatgataata acactaatag 152940 cttgttatat gccatgccct gtactaagaa ctatacgtat gttatcccat ctaaatcaca 153000 tttaatagat tcccattttt ctcatgagaa aattgcatca tacagagatg aactaacttg 153060 ctcaaggcta tagacctggt aattagcaaa gcagggattt gaatttagat gtatttttct 153120 ctgaaggctg ggtttagata aatggatctg gaagcactgg gaaggatgaa ttaatgggat 153180 ggagtgcagg ggatgcagag tgcccactta tggaatgatt tcattcaaga gagacaggag 153240 ggtcagaggt aagaatgcta ccgctgggac agagaggaag gtacagatat gagatatggt 153300 aagaaggtat actacaacag tggctcccaa atctcaatga gtagccagtt ctcatggagg 153360 ttttgttttt atttttgaat gaagattccc atggcatacc ttgaatattc tgaatcagaa 153420 tctctggaat acaacttggt attcttataa agcaccctag gtgatgctga agctctgcca 153480 ggttcaagaa ccacagctcg atcagcctat atttagatgt ttggggtgga gaatgagaga 153540 aagaaaagat tttagggtgg catccaggtt tctgaatttt gtgactcagt gaagtttttg 153600 gagggtaggt aagatgctga gttcagtttt ggatgtgttg agatggactg gtcctgtgga 153660 tttagttgga tattagagtc taacgcttag aacagaggtc aaggctgtag atttagatat 153720 ggaggacact ggtgtttggg tggtgatggc gctatatatt acatggaatt ttcaaaatac 153780 tcaaaacttc agttttccct caataattaa tcactttaca tctttgtgat cttaaatctc 153840 tttctgacca ttgattgaaa cttttgcttt taaaatttac attacctttc ttaacagttc 153900 cttaagattc atgcattgtt gtaagtagtt acttgcacca tttcattgga ttcacaccaa 153960 caattgttaa agtaaaattt atttttcctg tgttttagat gaagagattt aggcaggtta 154020 tgtaacacac ccaaggtaat atagtcaaat aattgagcca gaatttgagc ccaagtctct 154080 ttctgactct aggcttagag ctttagggct atttcacaaa agggctgttc ctaggtcagg 154140 catgacaact tctatattac cttcgtaaaa gaagcaatat aatctaccac tattaaattt 154200 tgcaggttaa ttttatatta tgtttaaata cagaaaactt tatttaaaac tcagttgaat 154260 ttctcttgag aaattggcca tgtagtaaat tatatttaat agaagagttt gtgtacttcc 154320 cagggagcag agtattggcc tgatcaaagc acctttcagc ctttgtctaa cagcatgtgg 154380 gtaggctaca ttttttttac tctcagagaa agggggtggg caggggtgtg atatgggttt 154440 ttgtctctgg gagttctgtt gcatgatttg acctcccaaa ttgttttgtg gggcatatcc 154500 aactttgggt tgaaactaaa atgggttctt ggtaatccca gattgaaaat atgtctcagc 154560 agtaacattg tttatcttta ggtttaggta aatacagaca tttgccatgt cttcttggta 154620 gcactgtaag aatgagtagg gctgtgaaaa atgcacaggg cattcattat gaagactggc 154680 tggttaaaac tgatacacta aagaaattgc attcttttcc acaagctgag tcatacagct 154740 gaaattgtgg aatcatctga gccagcagct gtaatatgat acttaatctc cataagtgac 154800 agatatctaa gataacacga acacccagac gacaactcag gcaaccccag cacagtgttt 154860 tggtatgaga acaggagaaa tgttagtaga gtgaacattt ttccacagag aactcaaata 154920 tggtaacatt ctcatagctt tgataatccc caataaactg tggttactaa aatgcatgac 154980 aaaaagaact tctatctata aagaacttct ttatacattt ccaatacttg ggttatgatc 155040 aaggagaaaa aagtttatca gttaattaag agttaggtag ctagtttgcc cacagattaa 155100 tttgtatgag gtaaaggaaa tctcacctaa ctgggaaaaa gcaagcttac cctcaaggta 155160 tgcttatccc aaccccaccc tgccaagtgc attccttatt cctcaggtgt gcctgtttat 155220 cccaaggacc tagccacacc tacatcttgt tctggcccca caccaaggaa catataaaag 155280 ttccctctct ggccgggcgc ggtggctcac gcctgtaatt cccagcactt tgggaggctg 155340 aggcgggcgg atcacgaggt caggagatca agaccaccct ggctaacacg gtgaaacccc 155400 gtctctacta aaaaatacaa aaaattagcc aggtgtggtg gcgggcccct gtagtcccag 155460 gtactcggga agctgaggca ggagaatggc gtgaaccctg gaggaggagc ttgcagtgag 155520 ccgagatcgt gccactgcac tccagcgagg gcaacagagc gagactccgt ctcaaaaaaa 155580 aaaaaaaaaa aaagtccctc tctttatatc tcagggtatc ttggagtcac tactgatcct 155640 tgacctccct cctttctctg accatgtcta gacaagtgtc caggtctcct gtgccaaatg 155700 tctatttgtt gcctggatta ggttttgact tgtttttcta tttctttgca tctcgtagcc 155760 catttctttg attcaatttc acaatctctt gattttgtcc ttaagtattt ggcaacacaa 155820 accctcgaga ggcaggatag ttcaacagaa agaagatgaa ccttgggggt cagaagattc 155880 aaacttccag aatttaaatc ttcattctgc tattactaga tttataaact ttatcaaatc 155940 actctcctac tctatccctt aattcaacat atttaaaatt ggaataaaaa tctcaatgtg 156000 gtagagttat tattgagatg aaaatcagaa tagatacaaa gaacttgata gccccaagga 156060 gcttgatcag tgtttgttta atggcccttc ctctcttctc atatctcagt tcagatccta 156120 ctcagccatt tattttattc tgctcctttt ggagtagaga ataaagccaa gaattatgct 156180 taaaaagtag cataattaaa agtatttaaa acacaagtaa cttgagaaag gtgagttgga 156240 agtttatatc taacctcagt tttttttgga gagaaattta cccgtcaggg ccagattaaa 156300 acatttacaa gtcccaagca cacgtgagat gaagatgccc ctcacttatc tcacatgtaa 156360 gttgaaagtt aaaaagtgaa aatgtctact agagttcaat aatattcttt ttttcccatg 156420 acttctctga agcttttaga aaatatgaaa ttcttaaaaa caataacagt aacccacatt 156480 tttattgccc tggtttgccc tatcttatct ttctcctgct cacagggtct gaggcagctg 156540 ggatagggga gaatgattac cagccaatca atattttttg aaccccagag attatttatt 156600 tatctatcca tttatttatt ttgagatctt attttatctg gaatcttaat aaacgattag 156660 tttccaaact gtatctactg tgtgtatttt atccatatgg cccagatttg tattacttat 156720 ttgtgattct gaataatatt ttttccaaca ttaattatca gcctctctgt gcccctccag 156780 aattgttaca acctatgtta atgcacacta tggcaagcca tgtgaattgc ctacgcaggg 156840 aagttttctt catacttcct tgccaagaga accccattat tggtcagtta ctagtcacat 156900 gatcttcttt agcccctcct tagcccctgt agtgaatcag gagtagccta aggccatggt 156960 ggtaactccc ctttttcttg gaaatgtttg atttagatat ggagaagagg tgcaactttg 157020 cttatgaaat gggagggcaa atatgggaaa ctttaaggta agttttcttt ccccttgaag 157080 gggaccaaaa agttgtggtt tatactttct tgactctggt cactgttggg tgaagagttg 157140 gtgctatgga agccatcttc agaccatgag gggacaagtc tgaggataca attacatgct 157200 accggtggca gaggacagta tagcaagaaa ctggatccct gatgacattg aaccattgac 157260 tgaatctacc ctggaaccat caggaaataa tccttagttt tttaaagatg cttttagttg 157320 tgttttttat tacaagtacc tgaaagcatc ctaactaatc aatgctaaat gcatctctca 157380 cagtttatgc ttatttttca gaaatgccta gtggaaattt ctattgctga ttataatatt 157440 tgtcctaaat aaattgaata gactgtcaat cttttgaaaa taaaagcatg acttgattag 157500 caattgttta gtctgatgtt ttcctaattt ctgtcatttg cataccactt ctttgatttt 157560 gtcatatcct tgtatcatct gcactaatag aaatattttt ccttaagttg tctctccttt 157620 aaaaaattat atccatttat tttgaagaga aactttttca ctaactataa attgaaaacc 157680 gatatcattt gccttaaata gaagattgtc ataaaaagaa atgccatgag tgaaataatg 157740 ttattaaata tttgccagat atagtttcct atgaagactc tgagcttgtg gcttgctgtc 157800 tctgttgaaa ggagagacta gggagtgtta tagaagtggt aaaataatcc ttccactgac 157860 tgagactatt tccttgccac aatcagaaga actaaaagaa aggaggatat ctgttaatat 157920 atgaatttat ctaaatgtca tgcagtgact tctaaaatca tctggtgtgc tctgtttccc 157980 cttggaggtg acttaggcct ggcatcccaa acaatacata ctggagtgaa gctccaggaa 158040 accctgagga gaagagaagg gcttaaagag caatcagcct tcgattgctg ggattatgaa 158100 aggtcgtaag aagcgaatgt tgcaatgttt tattatactt gatattgaag caaggacaag 158160 taataattta ttattctctc catgtcagtg gtatttacct ttttggaatc atgtgcccca 158220 ttgagaattt ctggaaaacc atggttcttc tactcaggag aatgcacaat tgcacacata 158280 cacaaatgtg caagcacaca cacacacaca cacacacaca gaattgccac agaaggtcag 158340 taggttcaca ggccctaggc taagaaccag cattctgtat attttacatg tgttctctta 158400 caagttaccg tgtgattcag ttcactccaa actgcggtta agtgcaaaac atggttttga 158460 atatttctat caattagtaa gagtggtatg ttaatttaaa tacaccaaag tggagaatta 158520 ctgtcctctc aatagctact ttaaatagac ataagttaca gtgatattgc cttccaggag 158580 gcttcaagaa atgagatcag gctctataaa agaaaatcac ccaaccctat aaagtcatct 158640 ttatgaactt tgaaacacca ctgtatgtac ctagtaaaaa ttattcctgg gtaagcagac 158700 tcccaggcct gggtggagtt cacatgagtc cctttgctaa aataaacaga agtgactggg 158760 aactttggat tgcctttgtc tgaacttgag tgtctggatg gatcagcatc agcagcatac 158820 cacacacctg cttgtccagc caaagagaaa cccaaagact tggcatttgt tttttacatt 158880 gtcaactgtg caaaaatatc acgattctaa tttatgaggg tccatgagtt ttaaaaacac 158940 cccctgacat ttttctagcc aaataatttt tcctttaaaa ggcacaggat gagcaacaag 159000 attaggtaga tcacttcaat ctctaatttc aaaagataat agttaaaaat tcaactgtag 159060 gactaacaca ttaactatgt aataagaccc agaatagtct ttggagcaaa tttcagtgga 159120 tacttgatca aaataatgtt gaagacaaaa tcttgaattg atgatattta tctgatacaa 159180 ttatttacat aacaaatgtt aaaagaatta gaaaaatttc ataggtaaga tgttcattat 159240 cttcaagtga agttacttgc tttatattaa gaaccacaaa aacttactaa actttttttt 159300 ttaaaagggt ctcactctgt cacccaggct ggaccggagt ggctcaatca cagctcactg 159360 cagccttgat ctacccagat tcaagtgatc ttcccacctc tgcctcccaa gtaactggga 159420 ctataggcac atgccaccat gcctggctaa tatctctctt ttcttttttt ttccccttat 159480 tttgtaggga caagttttct ccatgttgct gaggctggtc ttgaactcct gggctcaagt 159540 gatcctccta cctcagcctc ccaaagtgct ggagttatag gcatgagcta ctttgccccc 159600 tagcagacgt cttacttttt tttttaattt ggtattagat tgagccaatg actaatttca 159660 aacatttata aattactaaa ttcttttttt taattatact ttacgtttta gggtacatgt 159720 gcacaacgtg caggtttgtt acctatgtat acatgtgcca tgttggtgtg ctgcacccag 159780 taactcgtca tttaatatta ggtatatctc ctaatgctat ccctcccccc tccccccacc 159840 ccacaacagg ccccggtgtg tgatgttccc cttcctgtgt ccatttgttc tcattgttca 159900 attcccacct atgagtgaga acatgcagtg tttggttttt tgtccttgtg ataatttgct 159960 gagaatgatg gtttccagct tcatccatgt ccccacaaag gacatgaact catccttttt 160020 tatggctgca tagtattcca tggtgtatat gtgccacatt ttcttaatcc actctatcat 160080 tgttggacat ttgggttggt tccaagtctt tgctattgtc aatagtgcca caataaacat 160140 acgtgtgcat gtgtctttat agcagcatga tttataatcc tttgggtata gacccagtaa 160200 tgggatggct gggtcaaatg gtatttctag ttctagatcc ctgaggaatc gacacactga 160260 cttccacaac ggttgaacta gtttacagtc ccaccagcag tgtaaaagtg ttcctatttc 160320 tccacatcct ctccagcacc tgttgtttct tgacttttta atgatcgcca ttctgactgg 160380 tgtcagatgg tatctcattg tggttttgat ttgcatttct ctgatgccca gtgatgatga 160440 gcaatttttc atgtgtcttt tggctgcata aatgtcttct tttgagaagt gtctgttcat 160500 atccttcacc cactttttga tggggctgtt tttttttctt gtaaatttgt ttgagttcat 160560 tgtagattct ggatattagc cctttgttgg atgagtagat tgcaaatatt ttctcccatt 160620 ctgtaggttg gctgttcact ctgatggtag tttcttttgc tgtgcagaag ttctttagtt 160680 taattagatc ccatttgtca attttggctt ttgttgccat tgcttttggt gttttagaca 160740 tgaagtcctt gcccatgcct atgtcctgaa tggtattgcc taggttttct tctagggttt 160800 ttatggtttt aggtctaaca tttaagtctt taatccatct tgaactaatt tttgtataag 160860 gtataaggaa aggatccagt ttcagctttc tacatatggc tagccagttt tcccagcacc 160920 atctattaaa tagggaatcc tttccccatt gcttgttttt atcaggtttg tcaaagatca 160980 gattgttgta gatatgtggc attatttctg agcgctttgt tctgttccat tggtctatat 161040 ctctgttttg gtaccagtac catgctgttt tggttactgt agtcttgtag tatagtttga 161100 agtcaggtag cgtgatgcct ccagctttgt tcttttggct taggattgac ttggcaatgc 161160 aggctctttt ttggttccat atgaacttta aagtagtttt ttccagttct gtgaagaaag 161220 tcattggtag cttgatgggg attgcattga atctataaat tactttgggc agtatggcca 161280 ttttcatgtt attgattctt cctacccatg agcatggaat gttcttccat ttgtttgtat 161340 cctcttttat ttcattgagc agtggtttgt agttctcctt gaagaggtcc ttcacatccc 161400 ttgcaagttg gattcctagg tattttattc tctttgaagg aattgtgaat gggagttcac 161460 tcatgatttg gctctctgtc tgttattggt gtataagaat gcttgtgatt ttcgcacatt 161520 gattttttat cctgagactt tgctgaagtt gcttatcagc ttgaggagat tttggctgag 161580 acgatggggt tttctagata tacaatcatg tcatctgcaa acagggacaa tttgacttcc 161640 tcttttccta attgaatact atttatttcc ttctcctgcc tgattgccgt ggccagaact 161700 tccaacacta tgttgaatag gagtggtgag agagggcatc cctgtcttgt gccagttttc 161760 aaagggaatg cttccaggtt ttgcccattc agtatgatat tggctgtggt tttgttatag 161820 atagctctta ttattttgag atacatccca tcaataccta atttattgag agtttttagc 161880 atgaaggttg ttgaattttg tcaaaggcct tttctgcatc cgttgagatt atcatatggt 161940 ttttgtcgtt ggttctgttt atatgctgga ttatgtttat tgatttgcgt atgttgaaca 162000 agccttgcat cccagggatg aagcccactt gatcatggtg gataagcctt ttggtgtgct 162060 actggattca gtttgccagt attttattga agatttttgc atcgatgttc gtcagggata 162120 ttggtctaaa attctctttt ttttgttgtg tctctgccag gctttggtat caggatgatt 162180 ctggcctcat aaaatgagtt ggggagaatt ccctcttttt ctattgaatg gaatagtttc 162240 agaaggaatg gtaccagctc ctctttgtac ctctggtaga attcggctgt gaatccatct 162300 ggtcctggac tttttttggt tggtaagcta ttaattattg cctcaatttt agagcctgtt 162360 attgctttat tcagagattc aacttcttca tggtttagtc ttgagaggat gtatgtgtcg 162420 aggaatttat ccatttcttc tagattttct agtttatttg catagaggtg tttatagtat 162480 tctctgatgg tagtttgtat ttctgtggga ttggtggtga tatccccttt taatttttta 162540 ttgtgtctat ttgattcttc tctcttttct tctttattaa tcttgctagt ggtctatcaa 162600 ttttgttgat cttttcaaaa aaccagctcc tggattcatt gatttttttg gagggttttt 162660 tgtgtctcta tttccttcag ttctgctctg atcttagttg tttcttgcct tctgctagct 162720 tttgaatctg tttgctcttg cttctatagt tcttttaatt gtgatgttag ggtgtcaatt 162780 ttagatcttt gctcctttct cttgtgggca tttagtgcta taaatttccc tctacacact 162840 gctttgaatg tgtcccagag attctggtat gttgtgtctt tgttgtcttt ggtttcaaag 162900 aacatcttta tttctgcctt cattttgtta tgtacccagt agtcattcag gagtgggtag 162960 ttcagtttcc atgtaggtga gcggttttga gtgagtttct taatcttgag ttctagtttg 163020 cactgtggtc tgagagacag tttgttataa tttctgttct tttacatttg ctgaggagtg 163080 ctttacttcc aactatgtgg tcaattttgg aataagtgca gtgtggttct gagaagaatg 163140 tatattctgt tgatttgggg tggagagttc tgtagatgtc tattaggtcc gcttggtgca 163200 gagctgactt caattcctgg atatccttgt taactttctg tctcgttgat ctgtctaatg 163260 ttgacagtgg ggtgttaaag tgtcctatta ttattgtgtg ggagtctaag tctccttgta 163320 ggtttctaag gacttgcttt atgaatcttg gtgctcctgt attgggtgca tacagattta 163380 ggatagttag ctcttcttgt tgaattgatc ccttaccatt atgtaatggc cttctttgtc 163440 tcttttgatt ttgttggttt aaagtctgtt ttatcagaga ctaggattgc aacccctgcc 163500 tttttttgtt ttccatttgc ttggtagatc ttcctccatc cctttatttt gagcctatgt 163560 gtgtttctgc acatgagatg ggattcctga atacagcaca ctgatgggtc ttgactcttt 163620 atccaatttg ccagtctgtg tcttttaatt ggagcattta gcccatttac atttaaggtt 163680 aatatgttat gtgtgaattt gatcctgtca ttatgatgtt agctggttat tttgctcatt 163740 agttgatgaa gtttcttcct agccttgatg gtctttacaa tttggcatgt ttttgcagtg 163800 gctggtagtg gttgttcctt tccatgttta gtgctttctt caggaactct tttagggcag 163860 gcctggtggt gacaaaatct cttagcattt gcttttctgt aaagtatttt atttctcctt 163920 cacttatgaa gcttagtttg gctggatatg aaattctggg ttgaaaattc ttttctttaa 163980 gaatgttgaa tattggcccc cactctcttc tggcttgtag agtttctacc gagagatcag 164040 ctgttagtct gatgggcttc cctttgtggg taacccgacc tttctctctg gctgccctta 164100 acattttttc cttcatttca actttggcaa atccgacaat tatgtgtctt ggagttgctc 164160 ttcttgagga gtatctttgt ggcattctct gtatttcctg aatttgaatg ttggcctgcc 164220 ttgctagatt ggggaagttc tcctggataa tatcctgcag agtgttttcc aacttggttc 164280 cattctgccc gtcactttca ggtactccaa tcagaagtag atttggtctt ttcacatagt 164340 cccatatttc ttggaggctt tgtttgtttc tttttattct ttttcctcta aacttcttgc 164400 ttcttttcat tcatttgatc ttccatcact gatacccttt cttccagttg atcgaatcgg 164460 ctactgaggc ttgtgcattc gtcatgtagt tctcgtgcct tggttttcag ctccgtcagg 164520 tcctttaaag acttctctgc gttggttatt ctagttagcc atttgtctaa ttttttttca 164580 aggtttttaa cttctttgcc atgggttcga acttcctcct ttagcttgga gtagtttgat 164640 catctgaaga cttcttctct caactcgtca aagtcattct ccatccagct ttgttccatt 164700 gctggtgagg agctgcattc ctttggagga ggagaggcac tctgattttt agagtttcca 164760 gtttttctgc tctgtttttt cccatctttg tggttttatc tacctttggt gtttgatgat 164820 ggtgacgtac agatggggtt ttggtgtgga tgtcctttct gtttgttagt tttccttcta 164880 acagtcagga ccctcagctg caggtctgtt ggagtttgct ggaggtccac tccagacgct 164940 gtttgcctgg gtatcagcag cggaggctgc agaacggcga atgttgctga acagcaaatg 165000 ttcctgcctg attgttcctc tggaagcttc gtctcagagg ggtacccagc cgtgtgaggt 165060 gtcagtctgc ccctactggg gggtgcctca cagttaggct actcgggggt cagggaccca 165120 cctgaggagg cagtctgtcc attctcagat ctcaaactgg tttcaaagaa catctttatt 165180 tctgccttca ttttgttatg tacccagtag tcattcagga gtgggtagtt cagtttccat 165240 gtaggtgagc ggttttgagt gagtttctta atcttgagtt ctagtttgca ctgtggtctg 165300 agagacagtt tgttataatt tctgttcttt tacatttgct gaggagtgct ttacttccaa 165360 ctatgtggtc aattttggaa taagtgcagt gtggttctga gaagaatgta tattctgttg 165420 ttttggggtg gagagttctg tagatgtcta ttaggtccgc ttggtgcaga gctgacttca 165480 attcctggat atccttgtta actttctgtc tcgttgatct gtctaatgtt gacagtgggg 165540 tgttaaagtg tcctattatt attgtgtggg agtctaagtc tccttgtagg tttctaagga 165600 cttgctttat gaatcttggt gctcctgtat tgggtgcata cagatttagg atagttagct 165660 cttcttgttg aattgatccc ttaccattat gtaatggcct tctttgtctc ttttgatttt 165720 gttggtttaa agtctgtttt atcagagact aggattgcaa cccctgcctt tttttgtttt 165780 ccatttgctt ggtagatctt cctccatccc tttattttga gcctatgtgt gtttctgcac 165840 atggtgatgg gaggtactgg tattacaaaa agcttctccc ccgtgggtca aatctaagct 165900 gagtgttgag acataattga aattcactag atagatagga gataggggta gggaattcta 165960 atcagaggga atagcacatg taaggcaaac aatacagtgc atctgggaaa gctatacaat 166020 tttattgtta taggacaaat gttggggaat gttgagagat ggaactggag agtgaggcag 166080 aagttagcat ttattcattt attcagcaga cctttatcta ttacctacat tgcactaagt 166140 actgtgtgag cattagagag aaaaagatga atgagattgg acaccattcg ttcattcctg 166200 actatgaact tggcattgtt ctaggtacca gagatataat aatgagaaac agacatgctc 166260 cctcccctca ttgaggttac agcttagtgt ggagacacac agatgcctaa cgcactatgg 166320 tatggaaggt gctatggaca cagtgctcaa atccatgatc tacataggta tgagagtgac 166380 ttttctacaa cttaaatctg atcttgttat tccctgctta aaatcctgca gtagctccca 166440 gtagtgcctt ctggttaaaa tacaagatat atagtatgac ctctcaagga cctttgttat 166500 ttgtctctgg ccacctctcc aatttttcac catgaccctg gccctgtccc actggcattc 166560 catctccaat cacacggaac tatgtggagt tattaaaatg ccctatgtta tttcaagact 166620 cagagattta gtgcctcagc ctgttttgtt ccctctcccc tcctccacct ggccttctcc 166680 agctcactca tcaatctatt agactcaggc atcatctgct tgccttcgta accctcccca 166740 ccccgctcac cttgctggat tctgtgcctt tgcttgctgg ttcccagaga tccctgccct 166800 tatttttctt tgcctgctgg atttgcagtg ttgtgtccta tatggtgtag aaaaccagct 166860 caggctccca cttctctggg cttatgtggt cagatgcaga cctgtcttcc atccatacca 166920 aaggccatca gggagtttct tttgtcctct tcaccagccc attcttaatc tttctgataa 166980 attttctgca ctgtgtgcgc gtgacaaatt gggtcaaggt gatggtaatt tacagcatga 167040 gatggtgaac ttgctgcctg tgctgatgag cccattggat ttcccctaac tagtctgttt 167100 ccctacccag gtggagaact tcagtagagg aagtggcagg aatttgggaa tgaggagcac 167160 agtgattaaa ctggggccat tcatatgaga gtttaagaac tcagaccagt gacttaggtg 167220 agtaaaaata tcagaaaaag ggaaagagga taagagcaac ttgggccata attaaacttg 167280 tcaatgaaat gaaggtctgt tattctaatg cctacatttt gccaaacctt tgtgcttata 167340 acttcatcat ttgctgtgat taacaaagtt gaaagaataa taactactta caaggcccac 167400 atcacctcct tataccacta gcttttgctt tccgtacaga catagcttta aaaagtgcaa 167460 atcctattct gtacctgagc cacaacccta aaagggaact tgtttacaat tctaagaata 167520 atattgtcct ttaaaggtga aggctcgctg gaaaacatgc cattcatgtg ataaaaagca 167580 ggtagcaggt agtgctaaag acttactaga ctgcatgttt gtgctttctg ctgcattcct 167640 ctaatctcaa ggcagtataa ggagataaca tcttcacagc cctttcagcc ctgttgcaat 167700 ttctttgacc ctggcctgat ataaaaggca aacttggttt ttcactgttc tagtcatgca 167760 gtttctttgt ggttcccttt agaaagactt gaggctatga gtcaaagctt ttacgtcttg 167820 ctgatagttc agagttgtga tgtgaagcaa taaataaaat ccctccttcc acatacttgt 167880 ctccttgatt agaatcattc tgggcaaatt tagaggctca taaagtccat ttagatattt 167940 agtgaaaaaa caccagcact cagaacagaa tgttgataat gtagatggaa tatctttctc 168000 tctctgtctc tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgta tttatatatg tgtgtattta 168060 tattatatat gtgtatattt atatatgtgt gtgtatacat ttatatgtgt atatgtattt 168120 atagtaaata tatcacatgt atttatatat agtaaaaaag aggggactat aatatatctt 168180 tatatgttag catttatttt aaaaagaaaa cacaggaata tctaaaagaa actattactt 168240 ataggggtta tgggaaatgc catgggcaag aatttttttt ttttttatca ccatgctttc 168300 tgaaacaaca cgatatgtat cacctttata aaaataaaat aaaataaaaa atgaaaaaca 168360 aagtccactt gtaaccacat gtcagtagca tgtttgcttt cagggtacat caaatgcatt 168420 ctatagcaca ggatgttcca gtcactctaa caaaagatgt cctgtttgga acaccaactc 168480 tgtatcagtt acttcagaca ctttctctca ttgagtccct tcagcaagcc cttttaggtt 168540 tatgttctta gatgaggaaa ccaagtctta gaaacattaa ctggccaaac taagatcaga 168600 gagttagaaa tgtcagagcc cagaactggc atcttctgac ttcagatccc atgtactttc 168660 ccctacactg tgctgaccac acctccatta ctacagatgt gttgattaca tctaggggcc 168720 aaagtacaca ttcatccaat aaatgcttac tgaatgctta ccgtgttcag ggcactgtgg 168780 caatcttttg taatgcaaga aaaataagag tagtgaagac agtcaaggaa acaaagaagc 168840 ctaatactag gcaagaagtg cttttgatgg aattaagcac aatgagggtg ttagtacaga 168900 aaggacattt aattgaactg ggaaagttca tggcagtttt cccagagatg agtcttgaag 168960 gacaaatggt atttagccag gaggaaaggg ggtcaagtgt attccaggga gagggaacaa 169020 catgtacaaa agcacagttt tgaaagaaca ctccattttt gaggaatagc caatagctgg 169080 gcacgtctag agcatagggt agtagagaga aaggaggccg gaaatgggaa gagacttgaa 169140 tgccacattc agttatgtgg acttcatctt gtagcaatgg gagcctacaa aattttaagt 169200 agaggaataa aaagattcca tctaaaactt agaaaaatta ctttggcagg ataagagaca 169260 atgaattgac ggggagctgg gtttgatagc aagaaactgt ttgggagact gttctaatta 169320 catattttct tgtttttaga tgcacatata cgtacttttt tagctggtca tttctttctg 169380 aaattggaat gaatcttaca atcaatggca tgttataatt tcattggcag cattatttgt 169440 ctcttaaggg cccccaaata atagtgtgtc acataactga tagcatctca aattagatga 169500 aatacagtag tccaggcaag aaatactgag atggtggggt ggtaaagagg gaaaagattt 169560 gagccacatt tagatcctga tgtggtatta attattaagt aaaaaaaagg aatgtgcagt 169620 acatattcag tatgccacaa gttgtggaaa aaaggtgtgc atggatagat gcacatgtat 169680 gtattcataa agttaatgtg gatgcataaa gcgtctctag aatgatacac aagaaacaaa 169740 taacacccgt ggcttttagt ggggggcatt gggtggctga gggagaacag cggtaggaaa 169800 atttttcatt gtgttctatt ttgtacattt gatagtttga actagtcgta ttatgcactt 169860 caaatatgta aaaagataaa aagtaagaga tatttagaaa ggagcattga cacatttgtt 169920 gacagattgg ttatgggata aaggcgatag tattttattg actatatttt attcttttaa 169980 ttattcctct aatttcttaa aacaacttta ttgaggtata acttccacgg tataatttca 170040 cccattttaa gtgcatgaat tcagtgattt ttagtagagt cattgagtag tgtaaccatt 170100 cctacaatgg ttatagcaca tttttatcat cctaatgaga tccttcatgc tcatttattt 170160 aatctccatt cccatctcca tccccaggca accataatct tccatgtttt taaaatagct 170220 ttgcctattt ttggatgttt catacaaatg gaatcataca aaaggtggtg ttctgtgtct 170280 agcttctttc ccttaggata atgttttctg gtttataaat gttgcaaatg tcagtatgat 170340 acttcattcc tttttatttg tgtctacaaa atactctatt ttatgtatat accacctttt 170400 gtttttctgt tcatcagttg aagaacattg cagccgtttt tgctttttga cttttatgaa 170460 taatgctgtt ataaacgttt atgtttaagt ctttgtgtgg aagtattttt tcatttcctt 170520 gggtagacac ctagaagtag gatgttgtat ggaaaattaa tgtttgactt tttaagaaac 170580 tgttttccaa agtggctgta acagtttaca cttctactaa caatgtatgg aggttcccac 170640 ttctccacat ctttgcttac acttattatt gcctgtcttt ttggcagact taagcctagt 170700 ggttgtgaag tggtacttca ttgtgggttt gacttccatt cccctaatga ccaatgattt 170760 cggacatctt tcaagtgctt attaaccatt cacgtgtctt ctgtgatgaa atgtctattt 170820 gaatattttg cccaatttaa aactgggttg tttacctccc tattcttgac ttgttaggat 170880 tctttgtatt tttaacttta atttgactga ggataatgat ccaccagtaa agagatgcat 170940 ttatttctgt atttatgaaa atctttaaaa ttcctctacc tttcagagac acccttcaac 171000 agactgcgct tcttattttc agagtatgta tttccatgat aacacaagta tcaattataa 171060 atattaatta caactttccc tcctcactgc agactcaacc aagagttata aatctgtgta 171120 ttactttcaa tgctcataac aatcttctta accaccataa gcagactgaa aaagtcaatc 171180 tagttgaatt gttttacttt ataatgcttt tataagatac tcagtctgaa actgaaagat 171240 aggtagctct agaaatgtga taaatggcca cagaagtaac aacttttaat aaattaaatt 171300 atggatgtta tgtcaatttt aagtaatgtc tcagttttat atcttgttac ctgacctaaa 171360 tatcattccc tttagtaaaa tatctattaa agctttgtgg caaaataaga acagaaaaat 171420 ggtttttgat tttcagcttt ctctggtgaa taatttgttt tcttttattt ttccttctaa 171480 aataatcaca cgtttcattg caaccctaac cctcttcaac acacacacac acacacacac 171540 acacacacac acacatggct tctagattct acatgtacaa gagtgcaaat caaactacca 171600 tagaaaaact aagaagagag gcctagaagc aagaggctga tacactatct caggcttcaa 171660 caaaatattt atctctgact ataccaagga tgggcagagc ttgcatgtaa gtggcttggg 171720 ctagcagact gggttttgaa ggaggacaac atggccatgt tcttggttcg gtcatgaact 171780 gtctatggca cataccttaa atactgttgg aaggatccgt tagctccaga gactgcaacc 171840 aactgcctat ggtcataact cagctctcag acacattttg ttgtgcccac agagtgctgt 171900 ttgcctgttt ggtttttaaa ccaacactta aaatgcaggg aatttaagat aaaaatttga 171960 taaaaatggg aagatttggc cgtattgggc tcatggtaac tgagatgcat ctgaatgaca 172020 ggcattcctt tgaattgcac atttgctctt gtttttacta taggccactc tcactttctg 172080 tttttttccc cggctttgaa acgatcagtt ttagtactga aaaattatct aggatactaa 172140 aaccagaatt tctctgctag atggcttgct cattacatta cctacatgat tctgtgtaag 172200 ggattgtgta agttttctat ggttgccata actatcacaa acttgatggc tttataacaa 172260 cagaaatgta tttacagttt ggaggcagaa ggtctaaaat caagacttct gattttagtc 172320 tgtccaagag cctctgctgg tagggccatg ctctcggcag aggctcttgg ggagaatctg 172380 ttccttgcct cttccacctt ctggtggctt caggtgtttt gtggcttgtg gctgtatcac 172440 tccaatttct gcctctgttt tcgtatggcc ttctactctg ctcctttagt ctctccttta 172500 ggctgtttct tataagacac tcacctaaaa cccaaaaaca atctaaaaga ttttgcaaat 172560 atgaacattc taattacctt agagttaaga ttttcttttc tgctaagtga gggcatggtg 172620 cagagagcag gaaagatgtg aaactagata gcatacaaaa ataggtgttc atagatctgg 172680 gcctaacaag ggtgtggcca gcaactctgc cctgctttat cagcattaga aagccagtcc 172740 tctcagaaag tgcccagtta gctaaattca tgagattata gactattaag gtggaatgga 172800 cctcagagat ggtccttgct ctcatctgag gcttcagttg ggccagtcag aaatgtggga 172860 aaattgaggc aggtcaaata accaggagta caaacaaaca caatctatcc agaaaactag 172920 aaatcttact agtgactatt cacaggttac tttctgcatt ctggggtttt cattctagaa 172980 cagatgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tggtgcgtga 173040 agagagggga ggggtgccca gaaaaccata cccactttcc cacatatccc aactatgact 173100 gggcaattat gtcattatca ccactgatat atagctggaa gagtttagtg ttgccctgct 173160 aagatctgga ttttcttttc tggagcttgg ctattggggc attgagaagt ccagccagga 173220 ggttggtcag aggctaaccc aaaaagcttt gcttaactct gggctacagc tgggggttgc 173280 cagagagaag tgcctggcat tcctgcatgc tgacatcaag cttcgaagtt gctgccctct 173340 ggtgagtcag cagcaaaggc ccacatcgtt cgagaatgct gcccaatcag aagatgtgat 173400 gccacacctc agaaatcttt ctaaacctca gcattctgta gacttcaaac aactcctcct 173460 gagaaagaat gtagaaataa ttaaatttat aagattaaag ttataaaaag catagagcct 173520 ataataataa cagcaataag ataaactcca catttgcttt taaaacaatt tatttgagta 173580 gacagccaac cccctgtatt gtactccttt aaaaaatatt ttaggctttt taaatgctga 173640 ggcaagggga cataccaaac actaacaggc acattggggt tttctggcta ttgaaataaa 173700 aatgtcctta cataacactg atgtactgga atagcactgc gttccagtga cggttattgc 173760 aactcagcca gcatatctgt agcttgtgag cttttcttat cagaatttta tctataaata 173820 tacatatacg taaattctat tgtgaaataa aaataaaatg tagaatcttc tcatctttct 173880 tattagtcaa tattgtgcta ctctttaata atttctctca attttttcat taagcagata 173940 ttactaggga aatatacatg aggcagaagg caaattattt gcttagtgca atgcaaactt 174000 gcttaacagg taagagcaga gtcccttcca tagcattgcc accatatggc attgccatat 174060 cgtggaggcc ataaagagga atgacattgt aaagattaac tggattttac ttggcaaggt 174120 caggcaccta gatggcatgc tataaaatgg ttagaagtgc aaaggaaacc tgtagctaga 174180 ggccatgtga gattatggaa gtgacttttc ttacaatcct gccatctggt ttggattgtc 174240 aggatcaaaa catttcactt gcccaagtga ggatgctctc tacatggttt tggggatgag 174300 ggagactcag aaataatgtt tgtggtactg tagcaccact aggaaaagag aaaaattgga 174360 cctgacatga agaaaagcat gcagccagcc actaagacta cttcccacag gactggaaat 174420 ctctaccacc gtacctctcc tacatgctgg gtataagaag ttaaagggaa gccagattat 174480 atttacctac tctttcattc attcattcac tcattcattt attcatccat ttaccatttg 174540 tttgtttttt gttcatttac ttatttaata aaaattgtgt tttgcatatt ctaggtgcca 174600 ggcattgaag aaccactgtt attgttctca aatgactgac agtttagagg agaaaatgga 174660 agaataaata gacacttgtg atgcaatata atagtgctct aataagagca acatatattg 174720 aataccactg aatattaaat accagggact ttgctaggag ctataaatta atctccacag 174780 tacatctaag atagaagttt tataattact ctctttagga ggaaataggg gtctatagag 174840 gttaagtctc acagcctgga aggagtcaac aaaaaaatac tcagccttag gtattctgac 174900 tagaagcttg ggtccttaac cacctactca ccaatttgaa gaaagatgat tgaaactgca 174960 acagctacac tgactcttga aagcaaagta actcgttaaa tgagggtatg tgtatactgg 175020 ctgggatatt gtgggctcat gatgacttgt aggccgaggc agctgcacat atgaagacta 175080 tggagggtat atcatcagcg gaaatgaaag tgattagtgt tggaggtttc agtgcatatt 175140 ctggttttct attactgcat aacaaatcac cctaaaattt agtgacttaa ataaacatga 175200 tcatttattt agctcatgaa tttgcaagtt gtgcagcact tgggtgggat agctcacctt 175260 tcttccatgc agtgtctgct gggactgcat gattgcatga agcggggctg ggcagctaga 175320 gctcttcatg aatctctatt tttgcatgat attttcacaa ggtctctcaa gcatgggagc 175380 ttcaggtagc agaacttctg acagggcagc ttagtccttt gaaagtgtat gtctgaaaag 175440 agagactcag gcagatgcta tattgccttt tgtgaccaag ccttggaaat cactagtctc 175500 tcttgtgttg aggtggttat aagagcctgt ccaggttcag tagggagcat aaatttcacc 175560 tctgaatgga gaagtgccaa tgtcctgaaa aagcatgtgg gcccagaaat actgttgtgg 175620 caattttttg aaaatcaagt gtgataaaga cagcatagtg tagtcataaa aaacagatta 175680 ggagcatgat gtgctttgat ttcaactatg ggctttatta cttactaact gggttacttt 175740 ggttaagttg tttgactctt gttttttgag atggagtcag tctgggagac tccagctctg 175800 tcgcccaggc cggagtgcaa tggcacgatc ttggctcact gcaacctctg cctcccggat 175860 acaagcgatt ctcatgcctt agcctcccga gtagctggga ttacaggcac ctgccaccac 175920 atctggataa tttttgtact ttttttcttt ttcgagaccg tgtctcactc tgtcacccag 175980 gctggagtgc agtggcatga actcggctca ctgcaacttc cacctcctgg gttcaagcca 176040 ttctcctgcc tcagcctcct gagtagctgg gagtacaggc acacgccacc atgccaggtt 176100 aatttttgta ttcttagtaa agatagggtt tcagcatgtt ggccaggttg gtctcaaact 176160 cttgacctca tgatccgccc gcctcagcct ctcaaagtgc tgggattaca ggcatgagcc 176220 actgtgcccg gcctaatttt tgtattttta gtagagacag gattacacca tgttgaccag 176280 gctggtctgg aactcctgac ctcaggtgat ctgcccacct tggcttccca aagtgctcgg 176340 attataggca tgcgctaccg tgcccagccc aagttgtctg actcttaatt ctcagctttc 176400 ttatttgtaa aatgaaggta ctagtactaa tttggagagt tgttaaagat taaataatat 176460 atgtaaatgc cttggcataa gggactggca caaagtaggc acttcatata taaaagctgt 176520 gattattgat gaaccagtag tgaggtacat aactggggaa ggagaagggg ccagtttgtg 176580 ggaatgcttt tttagttatt aatagtaagg tggtaaaata ataatagtaa taataaccaa 176640 aagttactga aaactaaata cagtgctaaa ctctttaaaa ggagtatcta attggatctt 176700 aacaacaaag ctatgaagca ggactaatgt tatctcattt tataaatgag gaaatgtaag 176760 atcaaacagg ttaagaaact ttcccaagtt gatcagtagc aaagacagga ttcgaaccaa 176820 ggtaattgtc ctatcagaaa ctgtactagg atagtctgca tttcatggta aagactatca 176880 gatgccacta aaacttttta aaaagggaag tcttgtggtc aaatttgctc tttagaaggc 176940 agtatggagt gcagatcaga tgctggcagc agggagatca gttagaagat ggttgctcta 177000 attcagttga gaaatactga gacatctgaa atattgaaga catcagtagt gtgggtgatg 177060 tgaaagtggt tctaagaaac tagcggcaat catccttcat tactgattgg gcgtggagag 177120 aaagagaggt agcattggta gccgttagtc aactctgagt gcaggcactg gcatgtgcat 177180 tattacccag ggctctaagt ggagaaagaa aacaacccca gggtgtcttc aaacctaaag 177240 catatttcct aagcctttgc actctcagtc tagactaaaa acaaacaaag cagcctcctc 177300 tgaaatgctg gaaactttcc ccacttgaaa ctctcagatc tcttaccttg caattctagc 177360 tttcaaattc caagctgagc ttcctttccc acaccccgag tccttgtact ggggattaca 177420 atgatcattt gtatgtacta ggtgattgtt ccttccacat caggggcctt ggagcggatg 177480 acctaaagct gctttctcct gtcctgactt tctccaccca gcactgcaac catacataca 177540 attttctggt cttgtagaga atgactgact ggtcattata gtcttccaaa aggataagag 177600 attagtgtca tgatgtggcc ttcaggcagc cagggggaat ctccatatga ggtacttgtt 177660 gactgtatta cttagtttta ggtgaacttc ctgtggaggg acaatatgtg cttagaagga 177720 cagagaagga atgtattagg taaggcattc tacatctcag ataaagaact tcaatgaatt 177780 gttgggtcaa ggtctaagaa acaaaccagc cgtcaatggg aaagttaact aaaatgaaga 177840 acccaacata caaccccaaa tcctagtttt tctgactatg ttttcttaaa ctgaaataat 177900 ttctgagatt aaaaagaagt tgctgtgact ttgtctgata gatgtatttt tttgttatat 177960 attagtttgg gccttctatc tctcctactt tgttttcttt ataatagaat taatctctga 178020 aaagtaactt tactgtattc tgatgctcca ttttgaataa gtcagttctt ctccgaatgg 178080 gctctggaga ttggcatttg attgaacagc ttttgtgtat tgattgtttt aggtagactg 178140 ggtactccat ttaacttagt atttctgaca ataaatcagt cgagaaggga gtattactct 178200 aacggtttga acacttgtct atgcacattg cttggtcatt caataagtag ttattggtga 178260 gatcgggcac gttcagggtg gtatggccat agacaataaa tggttacgac tctgccttca 178320 gctgtaccag tatttaagtt ataaggtagt taagttacac cagtgcaaaa tcatacagtt 178380 tggtcacagt cctacttgag gatctcaaac ctagctcccc ttaacaaaca tggaggctta 178440 atcttggctt tgcacactga attattcctt tagaaaaata cttggtgtac aactcatcct 178500 tttcatttac aaagaaacaa atttgagcag tttcacaatt taaaaagtct cccaaatgga 178560 ttatatttaa ttgtccattt ccaatgaaac tcactaaatt ggtaaatagc agtgagtgaa 178620 taactgatga ggtcatactt tcttgttttg gactactaca aacaccacgg agcaacaaca 178680 gattagaata taaaggttaa gcaagggttt agtttttgtt caaaagccgt tttgcttgtt 178740 acaaaggcta ccaaaccttt gaacatcaga ccaaaccaaa aacaaaacaa aacaaaataa 178800 aaaaaacccc aaaactgaaa gatgaaaaca tagtttgata atctaagctg ctcttccttt 178860 atttaacctt gaatttatga gattattttt ttccccagaa gaaaaattct cttagggaca 178920 ctttcagcaa tttaacattt tctaagcatt acagcaaata agaggcgatc atcattcttc 178980 agtcataaag ataagccaag gaatgaaagt gttttgcagg tcatgtcacc tgacagaaac 179040 tttggactgg tcctttcctg gttcaagagt tcagccataa tacctacttt ccctatcagc 179100 tggctcaagc tgataaggtc ctgaagcaag caaagcttct ttatgagctt ttatttaatt 179160 gtccttgcca cataagggtt gaggggattc gtctgtacag agttacttct tgttggtcta 179220 ttttttcttt ggaataaatc gctgtctccc ctgactggat agagtaaata gagtttgttt 179280 aaacactttt catcaaattc ctagtgccta gtacagagct tttaacccta atacgtttcc 179340 tgcgtgtact tattgaagga ataatgacaa actctgcctt agattggtga ctggctaggg 179400 agaaacatgg ttcaagagct gaataagtaa gagcaagtat tttattgtat gcccatcaaa 179460 tgtattcgat gctggtgatg gaggtaagag tgtgatagag gctgagttct ctgaaattac 179520 atatgagatg tcatctgcca tttagtatta gctgtgtctg tcttttttcc aggaatttgg 179580 ccttaaaaga gatcattcaa aagtattacc caaatagtga tttatcaggc tttattgtgg 179640 ggaacctaaa gtggattgca actgctatgg tccctttgaa gggagctggt gcaagatttt 179700 ccatgcctaa tcacactcat tttcccttgc tctcccaatg acctcccatc tttccttcta 179760 tttggtctga taaacaccaa caataggatc ctttctgcag cttccatcct aacttgtatt 179820 ctagccttaa cactgcaaca aactcactgt tacctagaag tcaattgact tccctgaatg 179880 ttagcttctt tagctgtaaa taagtaattg tatgaggtga tggttaaggt gatttactaa 179940 ttttacaatt ctattatttt atgaatagac cctagttagg atagtttgaa atagatactt 180000 aatccactat tattctctct tctaagatat agttactagt tgatcatact tttccttaaa 180060 ggctgaactg aattctctga tatcagcaac taaacatctc atatttgtca gtatgaacat 180120 ccactgggtg cctgttattt aaccaggtag aattcttagc tgtgattgaa aatctaggta 180180 tctcttctgg tactatcact tggatgagta aagtttgaaa accattaagt tgacatttct 180240 aataggactg tggatttaac atagattccc agaagtcttg gaatacaaca gtgtacacag 180300 atgaagatac agtacttttt ggtattttct ttttgcaagt gttacaaata tctgcatgtc 180360 ataacatcat cactatggat cccatctttt aatgagagct tagtatatgc tacacactgt 180420 cactaaacat gtaggatctt gtttagtttt ctcaaaatgt tgtagttact atgattattt 180480 tttgtgtctt gcaatcattg tgtataagtg cgtaaaccat gtatctagag tttatagaag 180540 aattaaaatt caaaaaccct atactcatct ctcattttta aaaaatacca ttttacctgt 180600 ctttagatgc cctgtatttc ctccccaatc tcatcccgct cctactcttg aaagtgatca 180660 ctatccaaat tttgtgccaa acattaactt gttttcttta gctttgccat ctatgtatgt 180720 atccctaggt aatacatggc ttagttacac ttgtttttaa atttgatgta aatgtaatcc 180780 tatagtatga attttctaag acttgattaa tctatgaaca ttttattttg agattcatca 180840 atattgatgt gtgtagctat agtttattca ttgctgttgc tgaaaaatat tctattggat 180900 gactttgcta caatttattc taccattgtt ggatatttga gttgttccca ttttatttat 180960 ttattttatt tttttgctgt tatgaacaat gtggctttga acattcttat actacctggc 181020 gtgtatatgt atgtatctgt ctgtctgttc atcttaagat gcactacaaa actgaggcct 181080 agagtcacca agcaacttgt ttaatgtcag agtgagttgg tggtgaggcc aaagtctgaa 181140 ttcagcagtc tgttaccata gttttcatcc ttaaccacaa tactctatga atccttattt 181200 taaaaaggaa ggtctggaga atttaaaata acttcctaaa gagcagggat tcaacaaagc 181260 tcagtctgac taatgccttc catttttaaa aaatcaccca aagcacatat tatgattcta 181320 tttgtgaagt attagctaat tacaagagaa tgagttcata cttggcacta ctatctcttt 181380 cttacaagtg atcagatgtc aaaatgtgaa aactatacat ttcacattat ccatatatat 181440 gtgacatttt tcctttagga atatgagtag aaatagaaag acaggttttt acagtgaaat 181500 agattttttt tctctctctt tagcctacca aatctctttc gcaataccta acacttataa 181560 atgcatttaa tttcagtgcc aattaaagaa attcgaaagt agataataag tgagacaagc 181620 acccagtaaa tgtttatgat gtgacactga caaattatgg gctgctataa tcaagatagc 181680 attaaaaatt ttaaagtgtt tgtatgaaca aaccattttg gaaggagtgt ttggtgtggc 181740 agtgagcaaa acaacccagt aactatggca gttagtgtta aagctctgat tttgacatga 181800 aaggaataaa aatggaagtc cagctaaatc acaagtgtcc tggagaaact tggatgagtt 181860 tcttggctag aggtttttcc caccacagta agtattttca aaggaaaaca aagtaaaatt 181920 tttctcttgt atgagtcaca tctctgttgg ttgtaagtgg ctgaaactca tcttgaacta 181980 ccaaggtaag agaagaaaca tactggttaa tggaattcca gaaaggactg aacaatcaaa 182040 ccattttgaa ggacagcata gagctggact ctagaacagc caaaacaagg ggttaaacca 182100 ctgcgaggga tctctctcca actcttgctc aggcttttct ccctggcttg actttcttct 182160 ctttcactgt agattggctt ctctcacatg gcaagaaaca ttgctgctag cacttcccga 182220 gttctacgtt ctacaacatc caccactggt gagagattaa cttatggttt ttctgttgaa 182280 aagtcaaaaa ttacctggga aaagtctgat tgtctcagat tggagatgtt gcccatctct 182340 ggaccaatac actattatgt gtggctgact atataaaaac atggatattt tcttggaatc 182400 acttggtttg actgggagaa gaccattctc aaaacaaagg aagtgcaatt tatagaaggt 182460 agtagaatag gcagataaaa caataattct tcactatatt gctcaaataa tccccatgac 182520 atttttagta tattataaag agagttctaa agtgtttcca aactattata gcaaaattta 182580 atcttataat aatttcttct tgaactatgt ataatttacc tgaaatattt tccaaaaagc 182640 aatcaatgtg agaaaatgag agccctgtct tcttaaaaaa atgagtaaaa gtccacaagt 182700 tcagaacaaa agaaaatgag gtaaggccta aaataaattg tgctaagaaa gctaaaattc 182760 tagacaaagt cacatcggca aaactagaag gttggtactg tgcttcagtt tactgcttgc 182820 tgtttggtta agaggagggg tgatgtgata aaaatagtga cgaagtgaga aaactgacgt 182880 attagttttc tattgcatta taacaagtca ccacaaactt agaggtttga aataacgccc 182940 atgtattatc tcgcagttcc tgtgtgtcag acctccaggc actgcgtggc tcggctgggt 183000 tctctgctta gaatctcaca ggtcaaaatc aaagtatcaa tgggagctgc agttctccca 183060 agctggagcc tgtgtccctt ttaaactctc aggctgctgg cataatttat ttccttatca 183120 agccatccat atgatcccct ccatcttcag gccagcaatg gcctgtcaaa tccttctcat 183180 tctttgaaaa tctctgactt ccctttctgt cacagctctg taacttcttt tctcttctgc 183240 caccagcaga agaggctttt aagagtttat gggattagat tacatccgtc tggataatct 183300 tttacttaaa ggtcaactat gctatataac atagccaatc acattcgcac attgcagaga 183360 ctagggtata aaatcttcgg ggtcattcct agaaattctg cctgctgcag cctggtttct 183420 tgcttggact ctagtatata tttgctaaat ctcccaagcc tcagtctcac tatttgcaaa 183480 agtgagtttt aatgctcttt gccctgcttg cctcacagga tcttaacata gacgtaagat 183540 caaatgcaat agcatgtcaa acaatgtgta actccagtta tacaaacatt actgtatctc 183600 attggggata cgaagctcta cacacttgaa gatggtgaag gaatataaaa atgtaagtat 183660 tgcttttata ataaatgtgt tcctattggc tgaaaatttc aatatctgat acaaatagtc 183720 aactttctat tttacttttt ctaattatgc aagaccttgt aatcacaaat gtaaaaattg 183780 caagccacat gcccctaagg ccaaataaaa atttgtaaaa ttctcttaaa aagactctat 183840 agagtccaaa tgaaaatacg tcgagtcctt ttaaaaggat ccaaccacat atatcaactg 183900 atatacatgg taccaaaaac aatggaatct tttcagattc tctaattggc ctttggaact 183960 tatgtagcat caggtatgca aatgaacaac ttcagacctt gattactcca acctcctctc 184020 ccactgtcac agccacttct gtcatgacct agttgttctc agaaagttcc ctcttatacc 184080 tggtcaaact tctcttacaa tcacctgtga ctttccctct tggtcttgga tcaaatcatc 184140 ctaaatacat taaaagtcct gattcttcct gtcccttaaa tatatctcta cttgaatcac 184200 tgtgttagtt caggtcctct gagagaaaga tgttaagatg aaattagatg tgcaagagat 184260 tcgccgaggt aaaccttgtg ggagaaaatg gagaggtaca tagaggagcc tgggcagact 184320 gtgtggctac tatgtaagac tcatccccat gaaggagaaa ggagaggaag gcaaagaaga 184380 aaaaccttaa gatttcaatt ctaagaacgt tttgacaaag ctgattagga gtatttaagg 184440 caaagctgcc caccagaaga gtactgcatc tttcaggaac ggacttgctt tagtacatct 184500 gctgtgctta gtaattggct gggagcagcc atagaaagca tggactcagt acaaacttgg 184560 tgatgaattt cagaggcagc ggctaagacc atcagtctat tattttcctt gcaatagctg 184620 tcataattac tatcagagca aacaattttt tgtgtgtgaa ttcatgagat aatggtcttt 184680 tctttcctgc tttcaagagc catgtcattg aaagagctaa tcattcaaat ttatgctgca 184740 ttactgacta aatactttca tttatcatac tttattttaa aatactttaa ctcatggccc 184800 gatgattttc agttaaccaa attctccctt actatcctgg ttgccccttc tgtcttttcc 184860 ttagaaatgt tattgtagta tttgcaagat ggcctgaatc ctgaaccccc catcttcaat 184920 gagcaccaaa tggtaattat agattcccag ctgtagagct atgtcagaca aaggaaactt 184980 cattagtatg taccaatgtt tggactccaa atgcttttgt gtctgagtca caaggactcc 185040 tcttccttgg tggcttaaag ttaggctgaa gaagatttac attatgttgt gcatgacctc 185100 tttagtttgg ttctacttat actttcaagg agggaagact ggggaaggtg tcccttagtg 185160 agcatatttt gtacaaatga aaacagggta ctaacactta tgccaggacg catgcataaa 185220 ctaggatggt tctgagaaaa ctgcgatata tgatcactcc agggtctccc ctctcagaag 185280 cgagggagac ttaaaccttt tacatcacca agtacatgga aagaaagaca gcagggaagt 185340 gattccgaag agaaacctga aaaaagcaat gtggaaagat agacacttta gccttttctt 185400 tcttctcaaa acttcacatt ccttttcact ctgcttcact taagctgccc tagttccaga 185460 gtgtttcctc tcttgggtga agatgggaac aagtacatgg ggtagcaagg ggtgggtggg 185520 acctgtgctc ccattaaggt tcttccagaa tcatttctat gtgattatca gcttggatca 185580 catggacttg gggattattg gtggttttct agggtaaaca gggcatattg tgctggagga 185640 catattttat atgtaacaat ttggggaaat tttcttttat attaaataaa actgagatat 185700 gtaatgaatt aggatgaaaa attcatattc atctgaattt tataagtgaa tcatgagaac 185760 tcaaagatac ttagcccttg ggaccatttt ttactcctgt tcggatccct tcagctaagc 185820 atgattattt actattttca gctattagtt atgtcttgtt gaaaaagtat gaaaagagct 185880 gcccaataaa ttagagtgta tgctcaacat tctcttagct tctttatctc tttccaaaat 185940 tggatcaaat gacattggac atgatcaact tcttactgtt ttgacaaaca tctgaggata 186000 cttttataat tgataatttg gactagatta tgcaatgtgt gatgagacac aaggtagtct 186060 gtactcccca tgatatgtat atctgtttga tatactcaaa cggtgtatat caaacggata 186120 taagtttgag taggtatgga gatgagccag ggtttatttc ttcaactagt atttactgaa 186180 tggtcttatg tgccacaact gttctggaaa ctgtgataca ttaattaaca gataaagcct 186240 ttccctcaca atgcataaca gacccaacag agtatgaatg tacatacaaa ctagtaaata 186300 agaaaacaaa taaaagtatt cagatagtgc tataactact gggatgaaaa tcgagcagga 186360 aggaaaatat agcctgcttg atgtggaaga cagggatagc ctctctgagg aggtgacatt 186420 tgacccaaga cctaaatgag gagaaggaga cagtgagatg aaaatgaggg aaacagcaat 186480 ggcaaataca gagaacttga gacaacttgg cccattggag ggacagagac aaagccaatg 186540 tgggaccaca ggggatgaaa gggaggctga ttggagaaat aggcagtgct gaggccataa 186600 aaggtcctat aggtcatgga aagacatttg gttaccattc taatgacagt gagatgttac 186660 tggggagttt taaactggag aatgtcataa ctgtccagat gtaaccaaat agtaaaacca 186720 ttcttcctga ataacttggc taaaaggaat attatgacta cagatgtaca tgaagattaa 186780 gcagaacatg gaagaaaggc ctcaagtaaa cttgacctca cataaatatg ggaggaagat 186840 caaatggaag ctgggagtgt tgaaagaatg taaggggaat gacttctaat aatgaacaaa 186900 aagctgttat tttattatga agaaaaatgt tatgcatctt atgcatgcag aagaaattcc 186960 cattcaaaag acttggaaaa tgtcttgggt gtttactata ataaaccttt taagatatag 187020 aaaattcaca tatttagagc ttaatttcta aagagctcag acttctcagt ttattatatg 187080 ctatgaaatt ttgtttattt ttaatttaac ctacttgtgt gcaaaatcaa taaggaagct 187140 taaggaatat aaacaactat ttaacatggc catttaaata gattcaaagt aaagaatatc 187200 agcatagtgt ttctttgata tgacaacccc tcctcccagg gcacttaaat gaagggttgg 187260 gggggaatct taacctgaaa ttgaaaaccc tgaaatcatg tttccaagga aggagaagga 187320 aaataggaaa aacaaaaaca aaaagcagca actcatttgg aagctcgtgg gagaggagag 187380 gaggattcat acatctcgga ctggtttgcc ttagcaagtg aatcatttaa ataggaaaaa 187440 acagggggct gactcagctt gagcaaactc ttgctatccc ctgctgaggt ccgcacttgc 187500 tgtggcccct gccgctctcc tcggaccttg ctgccctcct cctttgtcac tgtggagaaa 187560 caggaaggaa tgtttattag caagactgac tggggtcaca cccaaggcaa tatcaggttt 187620 ttacctctcc caggcctggg aagaggttca aggatcaagg acaagctccc ggttagagtg 187680 agaggcaagt tcaaaccttt gaaaaataaa ctcacaacca gcatttggca caggcctctg 187740 gagtttacag aatgtatctg cctgtgtgtg atttcattag ttcctcctgc caatctaatg 187800 agattttacg tcctgtaaca gtgaggcaat tggagtctca gcagggaaag gaacttgcct 187860 aaaactgcag gatgggtagc gcttggatcc tgactttctg actcctagga ctgtgctgtc 187920 ttcagatgat cacatgcctt cttggcagat gtttctaaca aaggagagag ttgcccaggg 187980 tggggctctg ctagctccct tgtcatgagc cattctctcc acattgcctt ttagttgcac 188040 cacatagtca ccttcaatta gctgtgcgaa taggctcact cttatgctaa catgtactaa 188100 aagtgaaaat ggggagagag agagagagag agaaagagag acacacagag agagagactc 188160 atattatggt atgttccctg ccccacccca ctccactccc tctcaacagg gagaaagtac 188220 ctgaagaaaa tcattgctat gaagggcata gccagctaaa tgggtgtcac ttagtctgaa 188280 aaatctcaaa gatgtcaata agccactcga gacaacaagg aacctgtttt cctgtcatca 188340 ttccttctca gtccttggct ttgggaaggg taactttatg gagagagaag aacctctgtg 188400 gagttaaaag gtttatgaac ttttttccct gcaacaaatc agtgacagct gttccacagg 188460 ctgatggttt tccctttacc tttcgttttt taacagctat gtctcacagt ccagacttgg 188520 agtacaagta ataagaagaa taaaacttaa tcccttaagt agattcacca taagttagct 188580 cagagcaatt ccagtgcaag tatggtctgt gatccagtag gtgagtgact ctgctgctga 188640 aattcacatg tatgtgaatt tcacagtggc ctttgctttg tagcatgctg taatcctttt 188700 gtccattttc atcacacgaa ctgctgaata taggattgtt aaatggatgg ggagatatca 188760 tgaaaatgat taaagaagaa agttcttatt taggggtgca tacctgccta tctgaccatt 188820 gtacttaggc aatcgggatc ttgctttaag aaaaggtagg cattggagtc aggctgctgg 188880 agtatgaatc actatgctat catttttcat ttgtttttgc tctgttacat taggaaagtt 188940 atgtagaatt ttgtgcctca gtttcctcat tcaatatggg tgtaataact gtgcctgtct 189000 tgtaggatta ttgtgaggcc caagtgcaat aatatatagt acactgtgtc tggcatctag 189060 taagcattca ttaagatgac atgaagataa cacagatata tcttaacatg taattatgat 189120 tttgcttatt caaggccaag cattccaatt taatggagtt aggcaaacac agtaaattca 189180 ttgctctttc ctttttatgc tacttccttt gaagaggcag tcaagttcca tttgactgat 189240 tcggaacttt ttagcaatgt atattatgct gacttcactc ttatgcgctc ttggggctat 189300 aattcatcaa gttaggcgag caaagaagtg tgttggtgaa agagaaatga ggaagaacaa 189360 ggaagaaaaa aagggtcatg agcttattca ctgccaatat ttattatatg gaacaatgac 189420 catccttcag aagtgtttgt tctctattat actgtaggtg tggaagaatt atcattgctc 189480 aatagctgtc tcagtcacta cctgatagac ttgggaggtc tggctatttc agggcgcatt 189540 tgacatacag tgacattttt ggattaaagc tttcatgatg agtgccagtc tgggtccaaa 189600 agggttgaaa gctgtcgcca tctataggct agttgtttgt agtaaaatac tttccctcac 189660 tgcattaggt tcttggtacc atttatctag cagagttctt cagtgggctt gaggcttagc 189720 agtcaagtta aaacaataac caacatccca aacccagtgg ctgtcaaatt tcagtgaggt 189780 ggcatagaac tttagcatga acttgagctt gggttcagct agactttcat ataaatcctt 189840 gtttgaagtt agtagctgtg tgatcttggg cactgatatt aaacctttat gagaaagtta 189900 tgtctgaaat atgggaaata aaccttccac ttaggttgtt gtgaagattc aatgagttgt 189960 aacgattgta tacactataa tgatctatat tacagttgtt tcataaatat gattgccttc 190020 attttattct ttccttgtct cgttcttccc agtatcttac agacagcaag ttgaacattg 190080 tgggatgcat gagctattga ggcctttgca gctttctgct acatggaggc tagggccaga 190140 gtcaagattt atgctttgca gcacactggt cagctgtttt tgcaaatcag attaaatgat 190200 ttttaaatga ggctgagagc atgggagata ctaatgtgtg tttccttgtg agctactgca 190260 taagtaagtg ctttgtaaaa tgtcaggggc tccaggatta tatggtatta ctgtcactat 190320 tgtaagcact tctacctttt ttttctcctt ttacaggtta ggaaattgaa atacagaaag 190380 atgaaaagtg atttgcccaa gcatatagat caaagctgtg gcagaaccag gactggaacc 190440 tatatctctc tactaatggt ttttttaaaa aaataacctt gtttcaaaaa tattaaaaag 190500 tcacaagaaa ggtaaacatg tggataaaca aaatgaagaa aataaaaatt atccagtaat 190560 aacatattgg catatgtctt tctggtatat tttcctgtgt tgtcatcatt atcatctcca 190620 tcatcattat atccatcatt atcatcatca tcatcatcat catcatcatt atcatcacca 190680 tagtgaacat gtaatgctta cctagtgcca gatgctgtct aggcatttta catgtgttac 190740 tggtaactca tgtaatcctc ataacaacct tataaggtgg ttgctattat ccccatgtta 190800 catatgaaga gacagaagca taaagaagtt gcaccgctgg taattggctg ggatttgaac 190860 ttaagcagtc taaccttaga gtaatgattt taacaactat gctatataca tacaaattta 190920 caaaataaaa ctgggctcag acaataaaaa cagctctctt ttcatgttat aatacttttt 190980 caccccataa cacataatca ctaatgtttt aaagatcaaa acaatgcaca taaaatgtac 191040 tggttttaaa aaaaagagga aatagccact tacctcaacc aaactaactt ggagatagat 191100 tagattgata atggcaaggg tgatgggtag atgggtagag gttgctcaaa aagaaacaca 191160 aaatatatcc tcttttaagg atcctgatgc tttgctcaaa gtaattttta ttcttttaaa 191220 actaaaaaaa aactgtacaa aattcatagg gtacatagtg gcgctttgat atatataatg 191280 tatagtgatc agatcagggt aattcgcata cccagtcatc ctatagtggg tatagaacac 191340 cagaacttat tctttctatg tagctataat tttgtatcct ttaacaattc tctccctatc 191400 cctcccttcc ccctactttt cctagcttct agtatcctct gttctacttt ttacttctat 191460 gaaatcaact ttttcagctt ctgtatgtga gtgagaacat gcggtgttta gtaggaaatt 191520 tctgttcctg gcttatttca cttaacacag tgtcctccaa gagcatccat ccaggatttt 191580 attgcttttt atggcttaat agtatttcat tgtgtatata taccatattt tctttgtcca 191640 ttcctttgtt tttggatgcc tggattgatt ctataacttg gctattgtga atagtactgc 191700 aataaacatg gtctgtagat gtctctttga tataatgatt ttctttcctt tggataaatt 191760 gctagtaatg ggattgctca atcataccat agtactattc gtagtttttt gaggaacctc 191820 cattctgtcc tccatagtgg ttgtactagt ttacgttccc accaacagtg tataagaatt 191880 cccttttctc caaatccctg ccagcatttg ttattttttt ttttttgtct ctttgacaat 191940 agtcatccta actggggtga gatgatacct cattgcagct tcaattcaca tctccctgat 192000 gattagggat gttgagcatt ttttcatata tttattggcc atttgtatgt gttcttttga 192060 gaaacgtctg ttcagatcat tttcctactc tttaattaga ttgtttttac tgttgagatg 192120 tttgagtccc ttatatattc tagatattaa tctcttgtca gatgagtagt ttgcaaatat 192180 tttcttccat tctgtagttt gtatattcac tctgttgatt acttcctttg ctgtacaaaa 192240 gctatttgga ttgatataat cccatttgtg tattttgttt gtgttaccta tgtttttaag 192300 gtattattca gaaaattttt gcccagacca aggtcctgaa gcatttcttc tatgttttct 192360 tctagtaatt ctatttttca tgtcttacat ttaggttttt gatccatttt gcaatgatat 192420 ttatataggg tgagagacgg gaatctagtt taattcttct gcatatagat atccagtttt 192480 cccagcacca ttcgttgagg agactgtcct ttacccactg agtgttcttg atatctttgt 192540 taaaaatcag gtggttgtag atatgtggat taatttctgg gttctctatt ctgttctatt 192600 gatctatgtg tctgttttta taccagtacc atgctatttt gtttactata gctttgtagt 192660 atactttgat gtctggtagt gtgataactc cagctttgtt ctttttgctt aggattgctt 192720 tggctgtttg gggtcttttg tggttccata taaattttag aatttttttt tctatttctg 192780 tgaagaacgt cattagtatt ttgataggga ttgcattgaa tctataggtt gctttgggca 192840 gcagatatct ttccatttgt ttatgtcctt ttccatttct ttcatcagta ttttgtagtt 192900 ttagttgcag aggtctttca cctccttggt tacatttatt ccttggtatt ttattgtttt 192960 cgtagctatt gtaaatggga ttgccttctt gattgctttt tcagctagtt cattgttcat 193020 gtatagaaat actactgatt tttgtatatt gatatcgtat tctgcaactt tacagaattt 193080 gttattagct ctgagttttt tggtagagtc attagatttt tctgtatata aaatcatgtc 193140 atctgcaaac aggaacaatt tgacttcctc ctttccaatt tggatgtcct ttatttcttt 193200 gtcttgccta gttgcttggg ctaggacttc cattactgtg ttgaataaga atgttaagag 193260 tgggcatcct tgtcttgttt cagttcttag aggaaatgct agtgtagctg aggagagaaa 193320 tgaaaacaga ataaaaactt cagtagaagt tggggagaaa tgtgtttgca ccaaaagagg 193380 tgagggatgg aactgaggga ggtctcgagg ggtaagagag gccaaagagc tggcaggtgc 193440 tgctattagg atggccaatg atccagaagt aatgatgaat gagaagatgg attaaaaaaa 193500 ccctgacatt gtttaactag aagaagaaga cagtcagaga gaagtgaggg cttacttttc 193560 atgtttaaag tctgttatgt ggtaaaggga ttagatttat ctgtgttgtt ccaggggaca 193620 gaaataggac aaatggatgc aaatagagtg aggaagattt aaaacaaatg gagaagacat 193680 tctaaaatca actacaatga gcgtaaacaa tgacaacgga aaggactatt tttgcaatta 193740 tgtagctctt gttctctata gatagatgtg taagcagacg ctgaataacc atttactgaa 193800 aatataaata aaaacaaagc aaattgcagg caataaatat tgtattagtt ctcattttgt 193860 aaaacttata caggtatcat atgcatagac aaatacacca aactgatgaa tatttgcctt 193920 gtataatctt tttgtagttt ttttatgaac atatattact caaacaattt agaacatttg 193980 gcaatatata tatatttcat ttataaaagg ttaggaagat taattacact ttctgaggtc 194040 gcaactaaaa gccaagattt taatccattt ctatttgatg taaagtctgg tcttttttca 194100 gcaaaccaca atcccacatt ttaagggcat taagaaaggg atgggtagac aaaatgtaga 194160 ggtagtaggt acagaataca aagtttcaag aaattaaaag cttctaaact aacaaacagc 194220 caatttgtgg agtgtcactg gaaagtgaca aagaggacag ttaagttagt tggaactgaa 194280 ctgaggccag acagggctgt gggacaagtc agggtgtggt cattccggta agcagcgatg 194340 cagaatcaag acagagtagt ttctccttct ctctctctct ttaattgtaa cgccttttat 194400 aacaaacaaa tattatgctt atttctgtct ttaaattttt tgtagtaatt tctcatcact 194460 taacctctat tttttaaaaa actaactttt ctcttgtttt tctagttgag ctatcattca 194520 tatttattat gtggaactag aggtagtcct ggctacttgg gaacagcgtg gagtctagcc 194580 atgtcagggc cagaagtcgt ctcagctaag ttagaatgtg ataccattgt ttacacaagt 194640 gtggcctgcc ttcaagatag ggtgaggtgt tttatgacca caggctttat gagttatagc 194700 tataaaacaa tcaatctttt aaagcaaaca caccacaatg tctacacgca aatgagaatt 194760 gtccttcagg gctgtgacct tgggaaactc ttcacacata ctagcataaa acatatttaa 194820 actcttcact gaaaatatta ttcagaccta gtttctctct cagtctctct ctatgtttct 194880 ctctcacatg tacgtgcatg cacgcacacg tgtgcacaca cacatatgct cacatcattt 194940 taagatacat ctcattttta accaaaacca ttttatcttg cttgataacc aattttattt 195000 gttagatgac ttggctataa atgcctttgg ctatcaggaa aatcaaatca aaattaaaag 195060 acactgttac tactgaagaa gtaaaaaaag aatgggctgc tgactctgaa gatcataccc 195120 gaagtagagc tgcaaagata tttggaatat tggtaatatc caataaagaa tgaccttcat 195180 gctattttga ggagatgttt aaatgtcgaa ttattgaaat atttataaaa tacaaataaa 195240 ctaactctgc ttcatattcc aacttgtgta tgacacttct taggctatca tttcattcca 195300 aatttatggt cactacccta ctgtcattcc tcatactaac catatgatca acagttgaaa 195360 agcagccact cgcagaggta agcaagatat atggtaaata ctgtgttgac aaaagtatgc 195420 agaagcagtc acatttatac agtagtgaag gaaatgtaaa ttggacaaac tttttggaag 195480 ataagttgag aatgtcaaaa atcaaaacac actttctgtt ttattcagca attatgagcc 195540 ctttgtttta cagctatgct cacaaatata tacaaacatg tatgcacaat tatgttcact 195600 gtggtattgc gctagaaaaa tactaaaaac aaaccaaatg ttcatcaata gggaaattgt 195660 tcaacaaatt acagtatatc taaaaaaaga ataatatata acaactgaaa aaataaaata 195720 gttgatataa gcagatattc caagatctgc cagacatatt gttaaacgaa aaatctagat 195780 acaaaattgt ttatagttct ctttcatact atagccaaag aaaattcaga aaaaactact 195840 tacagttgat ccttgaataa tgcagcaggt aggggcacca gcttcctgcg cagtcaagaa 195900 ttgcatataa cttttgactc ccccaaaact ttgctaatag cctactgttg actggaagcc 195960 ttatcaacaa catcaacagt tgattaacac tggaaaagga ggggttggtc ttactgtctc 196020 aagggtggca aaggcggaag aaaagccacc tataagtgaa cccttgaagt tccaacctat 196080 gtttttccag ggcaatcata catccatgtc catattcatg atgaatatgt gaaagggtac 196140 ataagaaaat gtgatagtcg tttcctctgg agaataaaat gagaggtcta tcataggtga 196200 gaaaataatt ttttattata tattcttttg taggtttatt tttttgtcat gtgtatgtat 196260 tcttttcaaa ataataaaaa caataacaac gattaaaata tacaagggga aatgcattgg 196320 ccaaggttta gttgagagca aagtttgctt atctttcgaa agaggtgaac taagcttttc 196380 ctttttctct ttgggtatac ttgaatgggg atggagtaag tggattcttt tttttttttt 196440 ttttttttga gacggagtct cgctcgccca ggccgactgc agtggcgcta tctcggctca 196500 ctgcaaactc cgcctccgga gttcacgcca ttctcctgcc tcagcctccc gagtagctgg 196560 gactacaggc gcccgccact gcacccggct aattttttgt atttttagta gagacggggt 196620 ttcaccatgt tagccaggat ggcctggatc tcctgacctc gtgatcagcc cgcctcggcc 196680 tcccaaagtg ctgggattac aggcgtgaga agtgagtgaa ttctaaggag tatcgagaac 196740 agtgattaaa acagaaggtg gggaggtgtc ataagcttat ttgtaggtga agtattaaga 196800 ctagaagaat gacattatgc atcaaatctt ttacattgtt tgatctcttt tacctaaaaa 196860 caaaacaaga tacttttttg ttgtttgaca tatgaccaat tagcagccag ttggagctaa 196920 atgttttctt ttttcttttt cttttctttt tttagatgta gtgtcactct gtcgcccagg 196980 ctggagtgca gtggcgtgat ctcggctcac tgcaacctct gctacccagg ttcaagcgat 197040 tctcctgcct cagcctccca aggagctggg attgcaggca cctgccacca cgcccagcta 197100 atttttgtag ttttggtaga gatggtgttt caccattttg gccaggctgg tcttaaactc 197160 ctgaccttgt gatccacctg ccttcgcctc ccaaagtgct ggtattacag gcatgagcca 197220 ctgtgcccag cctaaatgtt ttctttaaaa gcaaggtaag tatgcctaga tgcactgcct 197280 cttagtaatt tttgaggatg gattattcat taaattgctt ccctttctca cagctggtga 197340 attagaacga tagtgagctt acaagagctt taacgaggaa aagatggtca ttgtttaaca 197400 gagaaggatg gtttgggtga gcatttttgt gtttttggag gggaactttg agggcaatga 197460 gtgttgcacc tgtgtccact gaggatctct gggcggggta aaaggaaggc agggatgaga 197520 gtgaggaagg gagacaggag ggtcccaaat acgaactttg acttaacgag gatgattact 197580 agaagggaaa gattgtggat tcattgatga gatgttgaac catgaaaact ctaattgtag 197640 aactcacttc agactgaatt gacttggctt tcagtagcag aagccctttg tctacttctc 197700 tagtattgaa gtgaatgcaa atttctcaat gtaagaaaag tagagtggtg aaataagagt 197760 gtgggttcca gggtcagaca actgggtgca taaaaagggt aaggatgcta caactggtaa 197820 gccctgtgag aattatttaa tccttccatg tctcattccg ctcatctgga aaatgatgat 197880 catactaact tatgagatgt gtgtacagac tagatataat attaaaacat ttctgatacc 197940 tatgcattat attggatcaa tatatatttg caataaatga tcaacttttt attaatgaag 198000 ttagtactta tttcataacg agattgttta cttctaattt actagtattg tcattattac 198060 tgttgctgtt atactgctac tgctgttgct actaactctt tatgaagtac ctaatatgct 198120 ctaagccttg ctctaggtgt tgtatatgaa gtatttctaa acctgaaaac tatctaagat 198180 ggctcagtct agcccatttt atagacgaag actgaagcca agagagttga aataatgagt 198240 aaagttgaga tttgactttg tcttccaaac aactagaagc ataaagcaat ggaccaggtt 198300 ccaaagtgac agggaggggc attagtttgg cccataggct gcagagcctg tgaccacaga 198360 gccctatata ttccagtggt gaattatgtt tgggaatgtg gcagaccata tggctatggc 198420 atcgttagac atgaggtgga gagaggcaga tgtgtggtta ctcgattgag ttgagagatg 198480 ccatggaaag gaggaagaag agcctgagag agcaacttca ctcatgggga gagaagctta 198540 tgtggagata agcttcactt cactaatggg gagataagct tcacttatgg ggagacaagt 198600 aaggaagcag ggatctccag aggatgtgga gtatgcctgg tactttcatt gttctttttc 198660 cttattcttc tttattcttt tcattatttt acctaggtta gatgttaaac acttcctgtt 198720 gtttagtcag gcttcctttt ctaattataa gactaaacac taagatttca tttgtagata 198780 taattattag agaattttga taaaatttcc aagcagtgtt ccctctgttt atcatcgtgt 198840 tccctgctgt tattagttca cagtttggtc tggaattact ccagttaatc ttggggtttc 198900 aggagagaaa ttgtgctcag ggtacatgag aagagaaagt ttagaaagcg aagggcttcc 198960 ctgtctagtt tctagctcag aaaagcaaag atattctact ttcatatgta tgataattgg 199020 agctgagctg actttaaaaa cagataattt ttctttttta tccctaataa ataatggtgc 199080 ttacagcaat gagtgttgct ggtaacagat tccaccaatg ggtgtggtgt gaagtttagc 199140 atttgtggat tttgcagctt ctgctattgt ctacagcatt tcctctcttg tctcggaggt 199200 tcatactttc tcaggcaagg acacttttaa ctccagataa atgtctgggt tttctcactc 199260 caaggataag aaggtggggg tgatggagtg gtggtggtag ttgtggagtt gtcttcctgg 199320 cagggatttc attgtggggg aaagtctgtc tttagaaaag aaatgtaaac tgggcaagta 199380 gtctcatcag ttaaatgatt tccttgttga cataaggtga ggaaaagaag aacaactttt 199440 gggaaaagta actgtgagaa tacaagggaa gaagaaaaat aaggggttga acattgagga 199500 agacttatga gacagataaa gtataaaggc aggtaatttg ttctttcaat ttggcatggg 199560 gacagtaaaa attttttctt actaaacaaa taaagcccat gtatttcttc tgctctggga 199620 gcaccaatta tattgagcct ctaaataaag aaagtcaaca tccacaagtg ttctaaattc 199680 catctcgtag tgagagtcct gaaaattgca atagctagag tcaatacttg gagtatatgc 199740 ataagacgtg gtgtctcaaa taggattaag gcctactctt ggcatcttct gttattggtg 199800 ttgtttctct gtattgattg gtataacgtt agacaaaact gcaggtcatc tttgagaaaa 199860 actcagtata aacaatgaaa aaaatgtgta gctgcacatg taatttgcat gtaacaaaac 199920 caaaggatgc tttagatagt aacagcagcc tgtactttac tccaacccat tagttttatg 199980 ataaatgtgg tctggggaag tgctcgatct aggttgttca ctttgtgttt ttgtttcttt 200040 ctatcattcg ggtgttgagt cacctgtttg tctgtgtcag tgtcagagca ctgggtcaca 200100 tcctgcattg tccaggtttt attggtccct ttcttaaatt aaagctgatt ttccacttaa 200160 agagaattct gtctccttct gcaattgttc aaagtctagc atctcaagtg cagactctaa 200220 actgtatgta tatgtattgt gcaggctatc tatcttctta gctttgaatt ctctagaaat 200280 attccagagg tgtgattcct ctgttattca agagtgattt ccaaattgcc tcagccaatg 200340 tgcctgcaca agttgtttgt aactcagggt gtaatgggaa atgctttaga gccacatttg 200400 tggcttttga tgggaaaaaa aaaaaatcag tgtcctccta agacttatac agtccttgaa 200460 gccttttagg ctattcctgc atctcatgtt gcatccatac ggactattta gccatattca 200520 acaccatcct cttgctattt tgttaagatt tgactgttgt tgttgttgtt tttaaatata 200580 aatgtgtgat cacatgcaca tacacagaca atgatgtgta actcataaac atgaaaagta 200640 aaaatttgaa ttttaactga agaaaaatca gcattattca taaaaagctg gtaagatatt 200700 ctaaaagtgg aaattcatgc agaaaattga ttcttaagca cttactaaat gccaggaata 200760 ttttaccagc atattatcat ttaattttta aacaagtttg agagatagag atgtcttatt 200820 ttatagaaga ggcaactggg gttctgaaat gtgaaataac ttgcaaaggc tatggttaag 200880 ggcagggcca gccacgtgtc tagtgtctct gacacctgag atcacacact gtatgctggg 200940 cttcaattaa tttgcagcta cttgttgcat taaattcaca atccttgctt tcatcataat 201000 aaaaacaata ataatcatac aacacaacta ttttcagtga gctctggcta aggccatttg 201060 attcagagtc aaaaccttct atttgtatag tattttatat tgtcaaaatc taataaggat 201120 agttttcata tctgacgtaa accaaactga tctgtctcca tttgatatag tgacatatca 201180 aattgttact ttcatatatc ttagtcaacc tctatgttta tcattctcta tgttttagaa 201240 agtaaagaat ttaaaattac ttcagaaaga tttcttcttc ataaacataa aatgattaga 201300 tgtccctttt aaaggcaaca gcttcttctt tttctttttt cttttctttt tttttttttt 201360 tttttttgag aaggagtctg gctctgccgc ccaggctgga gtgcagtggc gccatctcga 201420 ctcactgcaa gctccacctc ccgggtttaa gccattctcc tgcctcagcc tcccgagtag 201480 ctgggactgc aggcgcctgc cactacgcct ggctaatttt tcgtattttt agtagagacg 201540 gcgtttcacc gtgttagcca ggatggtctg gatctcctga cctcgtgatc cgcccgcctt 201600 ggcctcccaa agtgctggga taacaggcgt gagccaccgc gcccggccaa ggcaacagtt 201660 tcttaatgag agagtagaaa tgagaattca cattcataac aaagagttta ttgtctttcc 201720 tagtatactg tactatctag tagctaatct gtctaaagac atgtttctta tctattaata 201780 gtcctattaa taatgtaaag tagctttaga tatgccaagc tgttactggc tggggaacta 201840 aaaaagcttc cagagttata tctagaaagt ctttggggtt tcttaatgtt atgtgattag 201900 caactaaaac tgtgacagga aggaagtcca catgaattga gcatctacta gtttcaagat 201960 ttatcattat gcacattact tataataact ttgtgaagct gatattaact ttacaatgga 202020 taaaaagata gatgaattag taatttacct ccagtggtgc agacagcagg atttgaattt 202080 agtctgtcca acaccaaagc ctccgtactt ttcattaccc tgcatccatc tagtttaaaa 202140 aataaatgta ctaggcatag tggcttgcac ctgcaatccc agctgcttgg gaggttgagg 202200 ccagaggatc acttgagccc agaagttcaa ggctgcagtg agttatgagc acacaactgc 202260 actccagcct gggtgataga cagaccccat ctcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 202320 gagagagaaa ataaaagaaa aatcgaatgt attgcatttc atgtctggac cacctgtatg 202380 agaaaattgg gcactttctc tctgaagtaa ctcatactaa aaacaaacac cttcttcctc 202440 ccaggagctt cccaaggttg aagagaggaa ccctgaagct ctaatatgcc taagatgctc 202500 tctggtgtta tctaaaatca aaatatatca cctagagcac ttatttattt atttatttat 202560 ttttgagatg gagtctagct ctatcaccca ggctggagtg caatggcatg atctcggctc 202620 actgcaacct ccgcctccca ggttcaagcc attctcctgc ctcagcctct gggattatag 202680 gtgcacgcca ccatggccgg ctaatttttg tatttttagt agagatgggg tttcaccatg 202740 ttggtcaggc tggtctcgaa ctcctgacct cgtgatccgc ccaccttggc ctcctgaagt 202800 gctgggatta caggcgtgag ccaccacgcc cggccagagc actttttttt cttaattttt 202860 tatgatggaa aatttcaagc atacattaag tagagaaaat agtataatga acaactgaat 202920 acttaaatct ggcttcaata atttctaatt ttatgttctg tctaatgttg acataaagta 202980 tagtttgtat gtatttggtg gtgagtacat aatgggccac atgattttta ccttttaggc 203040 tgtagttcta catcagtata agatggttgt ttttttcttc caatacaaaa tctaaagcgt 203100 tgtcggcagt gacattttta aaaacacaat atgagacgca acaataaatc agttattaaa 203160 ataagataaa gtaggtatat aaatatttca ccttggaaat aaagcaaagt cagtggaaga 203220 gtgtgaagac tgtgaagatt aggagcatga aaataaacga ctattgggag ccattctatt 203280 cccatgagtg aatgtgtatt ggttccattc aatgtaggga agagcagtaa aagggaataa 203340 ccataaggat aagaccactg gattatctga gagccacagt tgtcctttgc cacatggagc 203400 atctgcccta ggtattacag ctctgtgaga aacagaggtt caaggaaaga aatttgttat 203460 ttttcaatta tctgcataaa ttctttggaa caggggcatg gattataaaa gatgtaagat 203520 aataaaaagc atttgtattt gactttggaa tgtattgtac ttacatttgt ctagaggtgt 203580 gtctattctg gctattctct ttaaaggagc cattctatcg tgaacagatc ctgttggagc 203640 tgttttcttg ttctaccaac cttcagccac ctctctgtct ttcatattac ttattggcag 203700 ggtttcaaaa ggttttagtc cttacttaat ataaacaaaa atgtacaata ttgacaaagt 203760 ttcagttaag cagatgaaat tctaagagtt aagctgggat tttccaaaat aatcctgtta 203820 acagacttga aagcacttat cagttctgtc taatgaagac attagaacac cataaccttt 203880 ccggcccatt ttctttgtca ataagcgttc ttgccctgtc agcagctcac ctccagcttt 203940 agttttctca tgacagtaag tctattaccc tcctgatctg tcttctggct cctcctaccc 204000 aggatgggga aggtttttga ctttactgat attctcagaa caaattttgg gaagtaaata 204060 taaggttttc cagtcgggtg cagtggctca cgcctatgat cccagcgctt tgggaaacca 204120 aggtgggtgg atcacctgag gtcaggagtt tgagaccagc ttggccaata aggtgaaacc 204180 ccatctctac aaaaattagt tgggcgtggt ggcggcacct gtaaatccag ctactcagga 204240 ggctgaggca agaggattgc ttgaatctgg gagccggagg ttgaagtgaa ctgagattgg 204300 gccactgcat tctagcctgg gcgacaagag tgaagctcca tctcaaaaaa aaaaaaaaag 204360 atgaggtttt ccttaagagc actaacctag tatactgcac aggtgcctgt attcatgcat 204420 cccacacaga aagagaaaat acttgtctga acttgtccat aaattcagaa tcctgcccct 204480 taacttgtat gccaggtttc tggcatactc ttatctgaaa actcactcta ttagaaaagc 204540 aaagcacagt gattttccca tcctgattac ctggcactgt tttttatttc agtgcttctg 204600 tttctttgcc atgtaaatgc ctgtgatttg ccaggtcatt tgtcctgatt ttagttgaaa 204660 cagtgcagtc atcatacttg cagaatgata caaaataata taaaatatat tgcctttgta 204720 ctaaacagaa gtgcctctct gttggtgaaa taatacatat aaacaaaaat aataattagt 204780 gatacttatt gtgtgttcac tatctactag cactgtattg agtgctttac ctgcattgct 204840 tcattttctc ctcacaatat ccctattagg taaattcagt tataattccc attttacaga 204900 tgggggcatt gaggcttgat gaggttagtt aacctgcttc atggtagtaa aagcagagct 204960 tggatttgag cacagcatga atgactccag aacttacaca cacacaccca ctcacacaca 205020 tgcaaagaga gagagagaga gagagagaca actgctgaac atagacccaa ggcaaaatat 205080 ccttgagtag aggaacagtg tgagagtgaa gctgtagtgc tggttggggt taatcaggat 205140 gggctcactg ggcaagacca ggttgtgggg ggcaaaggag atggaaaatt gtgtgaagag 205200 aagaagggtg gactaggtag ataaaggtag tggactaggt aaataaaggt ggtaattcag 205260 acatccactt taggcttcaa atcactttag gagaagtggt ggtctattgc tttgcccttt 205320 agtagcaaca tgcttattat acaatttaat aagattctat ccaatacact gttttaaggg 205380 ctcccatctc ccggattaga gctgagttct aacttccttt tccaatgata atgatctgag 205440 aaatttcctt catgttgcac tttttttttc tgaagacttg acattgatgg aaagaagtga 205500 aacccaccta tgcttttgat tttggtgact aatattaatt gtcatgtatt actaatagtg 205560 aatctgcatt tttaaagtct tgttggaaag cacattaggt gtgtatataa aggtattaac 205620 cttgaaagta tgaacgtgtt ttctataatt agtcctatga taatttaaaa tttaacatgt 205680 gcttgacaca tttgataaag gctttgtcta ctatggtttt atttatggtt gttaattaag 205740 taggagcagc agcatactac ttgaaagtat gaaggtgtcc tctatagtta gtcctatgat 205800 aatttaaaat ttaacaggta cttgacacat ttgataaagg ctttgtctac tatggtttta 205860 ttggaataga caacttatct tttcttaaag tatattttac cttggtacca ggaaacttga 205920 gaccaaggta aaatgtaata ctttaaaaaa tgcctaaata ggaactgtca tatatagtta 205980 tatttagggt tgattcatat tttgaaatat attctagaat ataaaaacta ctatatttta 206040 caattacttt accaagctct ctaataatac ctgtttacct ttaaaatctt ggtctttccc 206100 acagaggaca agttattata tttttaattg ttaagccttc tgatcatatg aattcttttc 206160 atatttcatt gaaattatat aaaacatttt acttcaaagg aaaaatgtta tgaatttata 206220 atgcttttag aatttaaaaa tctgtttcct attttgttga ttaagacaga gaagcattgc 206280 ttgtgaataa atagcatgct atgttgaaaa gaaaattaag gatcctgatg tttctctgcc 206340 agataggaca aaaactaagg acgccacagg aatttttcaa catttttaac ctcttgacaa 206400 tatgtgggtc gtataaagga caaatgaatg tttggatgga ctgagaatgc caattttaac 206460 agattgtcca atcactgtag ataaatattt gtgttcctgg ggattatctg attattatca 206520 agcaaattga attggaaaca tagcatgtat taagtcatta ctacttattg tctagttctt 206580 tttctcatag aagtgtctat gtactagaag agcactaagt catcagttag acatgatctt 206640 tatcatatcc agacaaaaat aaaaaccttt taagaagcta ctttacaaga caactgcata 206700 gctttcttca caggaacttg ttaaataaat aatgattatt aaagcaattg ggtcagtctc 206760 ttacactaat ttaacaagag cagttccaag atgtctagcc cattccacat tccgtgtgac 206820 taaccatggt atccagagct tggaaaatat ccaggcaacc cacagtagct tttcttaaat 206880 gcattatgga cactggaatg taaggaaagt gatagaacta ggtgaacaag aagagagtct 206940 ttaaggcata cccattgtca gtgtcgtaaa tggcctcaat tgtatgttga acattgttca 207000 aaagtaccca tggctgaaac agtgtagatt tagctcctat ctgtattgaa gttgataaat 207060 gcataaatct taatcattga catggaggtt tattgtattc aatgagacag atatacttgg 207120 agttttccac aaaccaccaa taagagtcta ttgtgaattg gaatgattag cttttaaaga 207180 tgtatacatg ttaaccaccc ttttatatta agttggtgca caagtaattg tgctttcaac 207240 ggcaaaaacc acaattactt gtgcaccaac ctaatactta cagttatgcc aagatagggg 207300 tagaagcaga aggaaaattt agagtgagaa gatagagaca agagataggg aggacaggaa 207360 ttgagtcaaa caaagattct ggaaagtctg tgattaattc tgtggttgtt aattaagtag 207420 gagcagcaga tattataaaa ctcaatatac aagtggtcaa gttcaggaag agccaaggag 207480 gagaccagtt gatattctag gtccatgttt cttgtaagca aagtttggaa accagaactt 207540 tggatctgtt tcaagagccc aaggtaagag gctttagaat aaagtctaac ccaggccaag 207600 aatctgggta acagaaccag ggatctccta gggcactagc actaactggt ggccaaggca 207660 agtacttcta catttcctgc tttgagtcca aacttgtgaa aatttttaga aggcctgagc 207720 ccacagattt attttttcat caattcatat ttattaggca cctatatgtg ccaggcactg 207780 tattaggagc atggactatt ggtgatctca atggacatat tatccgtttt tataaaggag 207840 atgtatcgtg gaccagtaaa taaagaagtg aacaaatagc actagaagga aataaaaagg 207900 gcaataaatc agataatcta ggggagggtg ttttagatag aatgatcagg gaaagcctat 207960 ccaaagaagt gatgtttgag aatgagaatt aagtttgaga atgagcagat acatgaggag 208020 ctggaaggag gacactccaa agtctaggcc aagtggaaag gcttggaggg gagaaaggcc 208080 ttggcatgtt caaggcttgg aaggaagtgg atttagacgc tagcaagcag aaaagagagg 208140 gtgtgacttg gggcatagag aaattggtaa gagccagatc aagcagtggg aggggaaaag 208200 ccacttagct agagtaaggg atggaccaag tactctgtag aacagatatg aaattattca 208260 gtgtttttat agctgtaaac tggaaaatag attacaggga cttaaaattc tccctaagta 208320 ctccatgcat tgtgaagggt ttactaatga aatcttctta gagatggaaa catgaggcag 208380 accattagtg ctagatcatg gtggtcatat tagttctggg gagtccaggg ttaaaaaaag 208440 tagcttcagg gcaaagcatt gcagttcaag agagtggtgg taatagccag agagttttgc 208500 ctttggatga tgaaactggt tggcaaatga cagtggagca gggtagtgag gcacccaggg 208560 tgggctggtt tgaaacagag cataatgtga gtgaacctgg gatgcacatg aataataaga 208620 tggaagaaac ataaagcatc atccttctta ggatttcctt tcttccacag agtcagctaa 208680 gttataggtg ccctgaggag gtcttccaaa tggttaacag tatattatgc tcttcctttg 208740 aatttttagt ttgaaaattt gttaatagcc aaacaatagt aatgatatcc ttaccactct 208800 ttggattgaa tgatgtcccc caccaaacca aaacatcagt taagtcctaa tccccagtag 208860 ctcagaatgt ggtcttattt ggaaacagag tcattgcaga tgacattagt taaatgaaga 208920 tgaggtcata ctggaatagc atgggccatt tatccaacac gactggtgtc tttacaagaa 208980 gaggaaattt gaacacagtg ggaagatggc tgtataaaga tacaaagatg gctgcagtga 209040 gtcatggtca tgctactgca ctccagactg gacgacagag tgagaatttg tctcaaagga 209100 aaagaaaaag aaaaaaaagc taggcatagt ggttcatgcc tgtaacccta gcactttggg 209160 aggttaaagt tggaggatca cttgagctta ggagtttgag acaagcatgg gcaacatagc 209220 aagaccccgt cttcgcaaaa aataaaacta gccaggtgtt gtggtgcatg cctgtagtcc 209280 cagctactga ggtggctgag gtgggaggat tgcctaagcc cagcaggtca aggttgcagt 209340 gaccagtgat ctcaccactg caatccagcc tgggcaaaag agcaagaccc tgtcaaaaaa 209400 agaaagaaag tagaaagaaa gaaagagaaa aagaaaacaa aaagaaaaaa gacagataca 209460 gagctgcaga aggagaatat tatgtgaaga aggagacaaa gattgaagtg atatatctat 209520 tatcaaggaa atgctagggc atgatgcctg tcatcacaag ctgggagatg gcatggaaca 209580 gattcttcct tagggccttc caaaggaacc accactgcca caccttgacc tcagaatttt 209640 agcctccaga actgtgatat aataaatttc tgtttaaagc cacccagtgt gtggtactca 209700 ttagggcagc cgtagaaaag gaaaactacc ccttcccatt cctcttgtcg tattcttttc 209760 caccgttttg tctcacacac tacaatcgat gaaaaccaaa ttgctttttc taccacttgt 209820 actctttcaa cccagaatag cctcctcttt tttttttttt tttttttttg tctccaggga 209880 cctattttaa aataagaaaa aagtttttaa gcatagtacc tgatagtttt ttaatcttca 209940 cccacaccca ccccttcccc ataacttttt tgattgatta tgaaatattt caagcaaaca 210000 cagaaaataa tatgacagta ttcttctaaa atctacattc atcagattac aactttttgc 210060 catatttgct tcaaatcact ccttttcacc ctaaaaagaa aatattactg agagagagaa 210120 agtctcctct cttcatactt tctttcactt cactgttcgc atccttaatt tttatttatt 210180 tatttttaat ttttttttta gagacagggt ctctttttgt tgtccaggct agagtgcagt 210240 ggcacaatca tagctcactg cagcctcaaa ctccttggct caagcaatcc tcatgtctca 210300 gcctcctgag tagctgggac tacaggtaca tgccaccatg ccccactcca attcttattt 210360 atttttaaag tggcatcact ttgttagtaa agccttccca ttatcactca gatttactta 210420 actctatcac ctattcccac aatattttat acacaaatta tattacagga atgatcatat 210480 tgtattttaa ttgtagtcac tttttctcta taagaaaaaa atgacttggt catttttaat 210540 catctagtgc ctatgcaata tctaactctg ggttaaactg aattttaata taatagtgtt 210600 tacatcgaac cgtttgacct tcaaaagagc cctaagagtc aggactagaa ttgtcattct 210660 ttattccaga aatggcaact ttatgaattt tacgtgttta atgtggtcga ttattgtttg 210720 tcactgttgg tgaagtttac ttccttgccc tcctgatgtt gggcttggcc gtgtggtttg 210780 cttaggccag tggaaggcag gtggaagtga caacatgtca gttccaaact gaggctgtaa 210840 gaagttcaca tatttctgct ttcttctttg tgcttctgac attcaccgtg aaaacattcc 210900 ctgagtagct gttggtccca gaatgaagag acagatggag ccaacctgaa cccaacttga 210960 aggctgaatg ccaacaaaca tagcaggatc acagcaaacc tgaagtgaat gctcgctgat 211020 gtcagttacc aagatttggg gtggtggtta cccagcatta gcatagttga aacctcacta 211080 atacacctag atggttgata ataaaggcag aactagaata cacgttatct gattagcaat 211140 atagtgtctt tttactaaat tattctgtta ttcatctgca cattcaacaa gtatttaatc 211200 atatatttac tgtagaaaac agcacatcat taaacagaca gactgtggtc tctgccccca 211260 aggagaatat gtttctagtg agggaaagag atacaaattc ataaatctaa actatagaaa 211320 atggcaaact ctatagcaca aatgtctttt gagagagaat aatgggtgag gggaaggaaa 211380 ggagatgaat acctttaagg tggcaggggt agagctcttt gagagactgc aaagcagaga 211440 agatgcttca agaaaaagaa gtacacattt ctctccctgg aatggtctca gtggtctcag 211500 ataatggttt cagttttcca tattccttta tttatgtagt gtcaggccaa cagtgtactt 211560 tagctccagg ctaaccagtt gtccttggtt tgcatcccgt gtattcagaa agctattgga 211620 ttgttttgta agttcttaaa gaaggactga aaaaggcttc attttccctt tttccaaagg 211680 gagcaattac atactgtcac tggaataata aacttaagtc ctaggctgcg aatgaaattt 211740 gatttctctc aggtgagagg tattttgtat atggaaagct aaggaaagaa atgcaatgtt 211800 tttttttttt tttttttttt ttagcaatcc agtagggaac tgtggccagc attgagctga 211860 taaagacctt tgttttccat gttttgattg gcccagtgag aagcctcgag cagtttgcac 211920 acccatctgt gtccatactg gtggggcaga aaagtgctga cacaggattg cagattagcc 211980 cctgcagctt gccagggtaa acttgtgtaa tgcactgtac accactccta acaacagtgg 212040 tccttttgtc acttaaacag aggttattaa gaatatgagt cattaaaaag agctttagaa 212100 aagcaggcaa cattttccaa tacagtggct ttaggggatc tttggaaagt atcagaagtt 212160 ccggaagaag taaagcatct cattaataac taacaataga cacagaatca aaatctgaat 212220 tgatgaaaaa aagtaatatt taaaatgtaa tttttgaatg ttgaaaagag cccatttttg 212280 tagagaattg gatgaggatt aacttagata ttttcttgaa tgtgtataaa tattacatat 212340 aagaatactt tcaagtctta aattggcccg gggatctcca gcttgctgat aaaaacaaat 212400 caaagaaact acctttagga cttctttttc ttatttttga aacattaaaa agttgcaagt 212460 gccggaataa tggggaaaaa gtctttattc tattatccag acaaaaagct ggtcaacatt 212520 ttaatgctgt ttctgctggc atttttctct acaaatactt tctatgtagt taagatcata 212580 tggtatatgt aatcttgttt cattcatttt ctttcacttt tgttattcct tattcagtga 212640 ttggaaaact atggtttata ggccaaatct ggactactgc tacacgtgga acacagccac 212700 atgcattcat ttacatattg tgtatgactg ctgtctctgt accataatag aattgagggc 212760 ggctacagag cttaagtgac tcacaaagcc tgaaatattt gctctctgga cctttataga 212820 aacagttttc cagtttgtga gatagattat tagagtcata tgaacacaat agaattttac 212880 aaaaatatac caaaagttta tacagccatt gatactttaa ctagcattgt ctgatgaaac 212940 tgttttattg cctataacaa tatatatggt aaatatatat ggttatgcat atataaccat 213000 atatatgtaa tagccagcta tatatatata tgtataattt tatatgtata cagttttgga 213060 ttttaataga catagaatgt tagtgtatct cttttttgct ttaatattta tttctttgag 213120 tagcagttag acaaaatgat tttccatttt tttagttctt taattttctt tatcttcaac 213180 tgccttctta tgacgtttgc ccctttttaa atagagggtt tttttaaaaa taaatttgta 213240 agggctctat atagatgcgg aataccaact cttattgttt ttactttgac tatattttct 213300 cagtttttta atcctttaat ttgagagatt tttttgaaac ttgaaagttg tttaatcagt 213360 gtaaaatttc ctctgtgatt cctttccaag ctccaatata tcatgctgag gaagtatctt 213420 atcattttta attttttaaa aatttataag gattgatatt ttatgaaagg cctcttgagt 213480 gtctattttt aaaaacatac tttgttctta gaatagtttt ggacttacag aaaaattgag 213540 aagatagtac aaagggttct cataaactcc acagtgattt ttccctgtca ttaacatcat 213600 tcattagcat tttgtcatta gtatctttca ttagtattgt atgttcgtta caatcaatta 213660 actaagattg atgcattgtc attacctaaa gtccatattt tattagaatt gtttaagttt 213720 ttacctaata tactttttgt tctggtatct tgtcctagat accaccattc aaccattcat 213780 ttagttgtta tgtctcctta tgtttttctt ggcttgttat attttctcat agttttttgg 213840 tttttgatga ccttgacaat tttaaggagt attgactagg cattttgtaa aactcctttc 213900 tattagaatt ggtcactgtg agcagtccac attttaggaa taggaagttt tatttcccca 213960 tcttgagggt gaagttgttg cataaacttt tggggattct tctgcatggg agattttttc 214020 tacttctcct tttatttatt tattcagtca tttagtatga gctcatagat attaatttta 214080 tactttgggt tataatctaa tactttttta ttattttgtt gcttacatac ttctagattt 214140 ggccactggg agctctttca gttgacttcc gtatttcttt gacatacctt ggcaaatgta 214200 ggatttgtgt gtgtgtgtgt ttattagcac atttttcatt tctggcacta caagatcctc 214260 caggctcatc ttgtttattt cctgtgccag tcctaggatt agtcatttct acaatgtgcc 214320 ctgattcctt tagtcagttt ccttttatta ggaaccaata tctggacact ggttatgctt 214380 atttgtacaa gcatgtagtt acttctgggc cctctcagct tacagagcaa ggaaccatac 214440 tatgctatgt gtgtgtatgc taagctgtgt atacacacac agaaaaaaat atatatatat 214500 atatgcacac acatatattt ctatacatag ccatctgtat caattttgag ctaaacatga 214560 gtgttcatac tggtgtctcc aactctaatc cagtatcaca tgtatcattt tagccttatc 214620 cccttgttta tctgtacact cccatcccaa cagtgataat cctggctcct gccatctgtc 214680 aattccagta tacaggtatt ggaatatcag aatttttaac ttgtactcta gttattttaa 214740 ccaagaaata actttgttaa ctagagtaca atgcttatgt actgtcaaac gagattccac 214800 tcgtttccaa agttatttag gttcctctcc tgatttttaa ctcttatttc actgcatttt 214860 aatccggatt tatttattgt tcctggttgt cagtcctgaa actaaagtgg taataaagga 214920 aacaggtggt atacgtgaga ggctttcaaa ttccttgagg tcataaaata tatatgtatg 214980 tgcatatatt taaaataaag ccttgaacag gcagaaaaac tgatattgca ttgtagataa 215040 caaatggcat aaaacactta tgtagaatta gtcccatcaa aatatgtaaa gaagtaaggt 215100 tcgataaaag ttgtgggcat tataataaaa tatttctctc cctttatatt cactccttac 215160 ctgttctcag taaaataagt tcaactctgt acaattaatt ttctgccatg tctactgctt 215220 gtacttggga acaaatgcta tattataata taaagatatg tgtggaactt ggtttcaaaa 215280 gtcaggtaat gcaaatatca aaaaacaggt gatctctcaa acaccttatg ataagtcagt 215340 cagataaagt gctctgcaga actccagcca acaaacaggt tgattatcag tgaagtatct 215400 catattttca ggtagtcctc acactaagaa agctaatgaa aaagagtttg agctcacata 215460 atcatgagaa agtacatttc aaaccacctt cccaaatttc ctgctgcagt ttcttctctt 215520 tttactcatt atttttcttt ttacctcagt ttactttctg gttttcttgg ctgagtgcct 215580 ttttaactgc tttgaagtaa gatgctatct tctttatcag gtttgcaaac tatttattga 215640 atttagcaat taaaattgtc gctgtggttg aactggaaaa tgtccttttg gtacttgaat 215700 ttactgaata taatgactga aaaagcattt caaacaaaca aatcaacaaa caaaaaatct 215760 caattagttt gttgcataga cacaatagta actcacagca ctggcatatt atttttgatt 215820 cacaaaacac atatagagcc tggcatctat tagacatgga agccacttat taagtattta 215880 tttaatcaat gaatgcatca aaggattagt aatatcaact tcaacacaat cctgtagtat 215940 atgtaatatt cttcctcttc cctaccttta acaatgagga atttgagctc agaaggatta 216000 agtgaattac ttgaagttat attattaatt aaactactga agccagaaca cgaatctaga 216060 acttaatcat cagaagggca actactacct ccacctacgt tactcatgat agtattaaca 216120 tggtagcaca gtggtacata gtagttgctc attgaatatt atttagtaaa agaaatgaaa 216180 agagtggtgc tagatacttg gaagaataag aattctaaga aggagaataa aggtgtatat 216240 acatattcat ttgataagta ttcaaataat agttaaagag atgcatagga tactgcagag 216300 ctctttcaga attgagaagc tgaaattaaa agatgtatta gacttgtttc catcttaaat 216360 catcatcata tcaagtgata gacattggta cctgcagtat ttcagtggca tttgattttt 216420 ttcctgcaga gttctattaa tacagtattt taaaatttta ttgtatgtca tttaaaaaat 216480 acttttaaaa agcaagaaca ccacattttt ctgggcataa gagacaaggt tgctttttgc 216540 atgcatgtat gcaattctaa cctttaaatt tcctatgtct ttattttttc ccctgacttt 216600 agagcctaat attgactaac agctcatttt gaaagataaa aatccacaaa ataataattt 216660 agaaagtgaa aatgaaaaat tacattaatt tctcctctac cattgttttt cgttcaaaac 216720 cacagttaac atgagttgat ttattttttt taaatgaatc tactgtgacc ggccttatga 216780 tccacccatt cgcctaagtt tgaaaccaca ttgattcagt caacaaactc tataccacct 216840 actaattgat aggtaatgac tagttttgtt aatacttggt tacagcgata gctttgagca 216900 aattttcaaa gtgaagcttt tctcaacttt ttcttgttga ttcggtatct gaaatagctt 216960 attaattcat tccttccttg tttccactga cactgccaat cagttgtagg tgaaaactct 217020 aaactggtct cctgtacttt actatcccat tttctgcctt aattcatctt ctccagtgtc 217080 tcaagtgtaa tcttgctaaa atacaaacct aattatgtta ctcctctgtt tacagtcttt 217140 aaatgtttta ccaaattaaa tccaaactcc ttgagaagtt catacaaggt tgtatcagag 217200 cctctgaaac gctaacccac atcttcacag cttcatctct tgattccagc ctggatgcaa 217260 tgggcattct ggatttgact catattacaa caacaaaata atctcaagtg aataccatgc 217320 actttttact ttttttccac tgggcttctt cagtgccaca cctgggaatg gggttttact 217380 tgttaagctt acctatggag ctccaaaatg caaggaagtt taacttttga gagcaatgtc 217440 caaccaatga gggatggaaa cataggaaaa catgctttcc caagttattc ttctaacaaa 217500 cagctctaag gtacgttctg tatgcttatt ccccctagat gtcagggttg agttccagtg 217560 tcccaaagct atataataaa aatgcacctt ggtatagact ttcccgcctt cccttactct 217620 ctttagtctc cttttgtact ccataggatt atctcattga ctgggctttg ctttctagta 217680 gaacctaagc tatgacatat agtactagac tctctcacca ggagtgattt aggacgagga 217740 ggcgttgaaa actgaagctt tggacatctc agatagttaa agcactcgca atttctggca 217800 tttatgtgct cataatgtag tggtgaatgg caattgcggc aaccatggcc tgacaagagc 217860 aaggtcatca agagcttaga ttgtttggag ctgaaggtct gagtcacccc attaggctaa 217920 aaacctagaa aagtagaagt gctgatggag ggtgaggaaa atctaatatg gattgtggag 217980 gaaggagacg atacatataa aacatgactg caggacctgc agttgtagca gtgagggctg 218040 taacttattc cattaatatt tgtgtgttaa gtcacatgta gagattgtgg ctaactacca 218100 ccttgaagac ttagaggttg ctggaactta ttctagggcg taggtgtatc tgtgtggtac 218160 aaaggataga ctgtatgggt tgtttttggc tttctgactc atatcctctt ggcttcatct 218220 ctgattacag tgtagatgca gtgggtagtt tggcttacgt caggctgaca tctttcctca 218280 agcactggat gttttgcact tttgcccttg ggtttttcca atgccacaat tgccattggg 218340 aagccctctg ttcaagcagg catgctcagt cgagaagcca acaggggttt acatccccaa 218400 agcaaacctt aactaatgga ggatacaagt tgatggataa aaatagtcaa accttaagta 218460 cataattcca aaaggtattc taaacactcc ttagaagatt ccaggcaggg ctgagcacaa 218520 gttgcctaca atggtgatat taataatgca tctatatata tgccttttca cattccctcc 218580 ctcttctgtc tctcactcct gctccctgtt cataaatttt tgcagcaggc tctgcttttg 218640 ggaaaactca agctaaaaca aaagtcctta aattccagta tgcctctgtc ctccactttc 218700 tacccaattt tgtgttgttt cttttggttg tttccctgat atatgccaag aaaataaatg 218760 gagaaataga agggtgggac tatcaacaaa tactttaata gaatttccag aaggacttaa 218820 gctgtcagat tgaaaggatc cactaagtag cccagaaaat agtttaaaag ttggttgttt 218880 tgaagttttt ttctccctgg tttgttttaa tctctacatc tggtgtacag ctgtcctcat 218940 gagatgcctt gttactatta ttctcttgtg ccaaaacttc tatttcttat ccctgtaatg 219000 ttttctttct tggagcacct cctaaatagt cttagaaagg atgcatggga ggtaactttt 219060 ttgaggcctc aaacatctaa tgaagtctct attttatttc ctttgacctg attgaatgat 219120 tatggattta taggttagaa actatttctt tcaaatacat gaagggagtg tcttattttc 219180 tgtgttgcta ttaaaaagtc ctaatgcaac tctttttatc attctgtgta cagtgtatgt 219240 gatttttttt cttctctgga agcatgtgga gtcttcttta gtcccctgtg ttctgaaatt 219300 tcaacagaaa tacccttatt aaggtctgct gcttggtttc tattctccat gttaaaactt 219360 tccacacatg tttggtaatc cttggaagtg tttaaatttt cagttatctt ttaagtaagt 219420 taagagaaga aaaaacttta aaaaggcagt ttttatgttt actcatgtat ttcccatttc 219480 tgttgctctt cattctttcc tgtaattctt agttcccatt taatgtcatt ttcttcacct 219540 gaataacttc ttttactgca tattttctgc ttataaattc tctcagtttc catttatccc 219600 ataaagtcta ttttaccttt attttcaaag gatcttttca ctggatatag atttatggtt 219660 gacagtattt tgttgttgtt gttgttgtta atttacttca gtacttacat atattctagt 219720 ttcttctgtc tccactgttt ctgatgagaa gtcattattg gtatcagtgt tcctttgtat 219780 ataatatgtt cttttccctc cagctacttt caagagtttc cccttgtctt tgttttttca 219840 gtttgattgt gatgtacttc gttttcttta tgtttatcct gcttcaggtt ccctgaaatt 219900 cttggatatg taggttgatg ttttaaataa atttttaaac attagaccat tatttcttca 219960 aatattttct tcttctcttc atctaagact tcaatgatat acatggagac tccttgatat 220020 tgttccattg tcacaaagcc tttattaatt tctttcaata gttttttctt tttgcagctt 220080 gaacttaaaa ttcactgcac tctgcacctc cttttccccc cgtgaagtct ccaatccatt 220140 gttaagctca ttcaggattt ctccacttca gatattatac gctgtagttc taaaatttcc 220200 atttttctgc tgctatccca tatgcattca ctgattatga ccataatttc tatacatttt 220260 tgagcatatt tataataagt gctttaaagt ccttttctac taattataca tctggggcat 220320 ttcagagttc agtttctcct gactactttg tctcttgagt atgctttttc ttccagtgtc 220380 taataatttt taaattatac acaaagcatt aaagataatt tgttggccag gagcggtggt 220440 tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg ccaaggcgga cagatcatga agtcaggaga 220500 ttgagatcat cctggctatc actgtgaaac cctgtctcta ctaaaaatac aaaaaaaaga 220560 aaaaattagc tgggcatggt ggcgggcgcc tgtagtccca gctacttggg aggctgaggc 220620 aggagaatgg cgtgaacctg ggaggcggag cttgtagtga gccgagatcg cgccactaca 220680 ctccagcctg ggtgacagag cgagactgtc tcaaaaaaaa taaataactt gtagagattt 220740 tggagtctgt tacctttctc tgaagaatgt tgatttttgt tgtagcagca gggcatcagt 220800 gaaatctctg ctcggtttac aagtcttttt ttcttttctt ttcttttttt ttgagatgga 220860 gtttcgctct tgttgtcttg ttgtccaggc tggagtgcaa tggcgtgatc ttggctcacc 220920 gcgacctcca cctcccgggt tcaagagagt ctcttgcctc agcctcctga gtagttggga 220980 ttacaggcag gcgccaccac acctggctaa ttttgtattt ttagtagaga cgtggtttct 221040 ccatgttggt caggctggtc tcgaactcct gaccttaggt gatcctccca tctcagcctc 221100 ccaaactgct gggattacag gcgtgagcca cggcgcccgg cctagtcttt taactattgc 221160 tatctgctgg gctttttgga gtctctacca tgcatgcata gtccagtagt tagtcaagga 221220 tttgaaggga gttgatacac agattttgtg gcttcctcct ctgtgcgtct ctcctttcag 221280 caatttttct gtttaaattc agtcaccctg gaatccctga gctcactctc tgactccaca 221340 actcagaaag acaatgactt tctttatgaa ttttagctac cctgcatcac ttgggctgca 221400 agatgctctc cagagaaaat ctacattaaa acatgtcact caatgcagtt accttctttc 221460 aaaggttgaa tcaccttctt tttgaatccc tgttggttgt tattttgtac cttaaataat 221520 tatttttaat actggtccag agtttataat tgttatctat gaggagtgtt agtctaacac 221580 aagatatttt gtcatttcta gaacaagact actccactct tatgtagctg tgacattgtc 221640 atgcatttct ttaaaacatt ttagtggttc tttattgttt atcaaataga aaatattcct 221700 taaactgcat gtactctatt ttttcattgt ttcccataac aaagaaatat tatttcattg 221760 aaatattgaa atattgagca tgccttcaaa tattatgttt caccatgttc ttttgctcat 221820 accgttttcc atccagaata catttttccc cctacatttg aatgcccaaa tcctgcctat 221880 tctttaagat ctagctaaaa tgtcacctcc tccacgaaag ctattcttct ccctccagtt 221940 tcagttttga ctaaattatc tgtttctatt tcattgcttt acttatgttt tataaggaca 222000 ataagagatt agtgccctta taaaagagac cccacaaagc ttccttgccc cttctactat 222060 gtgaggacac agcaagaaga cagccaacta tgagcctgga agcagggcct catcaaacct 222120 tgagcatgct ggtacactga tcttggactt tccagtctcc aaaactgtaa gaaataaatt 222180 tctgttgttg atggctgggc gtggtggctc acgcctgtat tcccagcact tgggaggccg 222240 aggtgggcga atcacgaggt caggagatcg agaccatcct ggctaacatg gtgaaaccct 222300 gtctctacta aaaatacaaa aaattagctg ggtgtggtgg caggtgcctg cagtcccagc 222360 tactcgggag gctgaggcag gagaatggcg tgaacctgaa aggtggagct tgcagtgagc 222420 caagatctca ccagtgcact ccagcctggg tgacagagcg agactccgtc tcaaaaaaaa 222480 gaaagaaatt tctgtttttt ataagccacc cagtctatgg tactttgtta tagctgcctg 222540 aatggactaa gacacaatgt gaaagtacat tatcttcttt ttgattctca agttaccacc 222600 ttttctcaaa cgaccaccaa ctctctctgg acttctgaaa tattcttgta actggtctct 222660 ctgcttccat tcttgtacct ttaaacctta gtattccaca gtagcctaag aggtcttagg 222720 gtatataaac aaaatgacgt taatttcctg catctaatca ttcaatagct tcccattgca 222780 ctaaagtgga accctttctt tagagtcctt gccatgatca ataaggtctc ctctcctaca 222840 aggtatgggc actgcctact actctgacct catttattac actcttccct gccttaacat 222900 atgccaaaag tattcgacct ttcccccaat tctcaaacac tgcaaaaaac cctccaaagg 222960 cctactactt tacagttgct ctatcttctt cctcgaatgc cctccttatc tttatagatg 223020 gctccttctt ttaagttctt agtaaaaata tcatctcctt agagggacct tcaccccctc 223080 agtcacaacc ttgttttaaa ttcctcagac cctcatgatt atctgaaatt atcttattat 223140 atttctttct ttgttgttta atgtttctct ctgtcacaaa gcaatacatt tttttttaaa 223200 gcaggaatgg gctatatatt cttcattttg ttgacctcta ggagctgcat cagttggggt 223260 cccctgcctc tgccctccag ttgagttcag ttaagtaaag accagaggat aagaaagaag 223320 gctactgtgt gtttctactg agggttatag ctcctttcag gcagtcctct tctacagctt 223380 ttgggttcca taactatttc ttctccttga tgatctccgg taattcaact tggctccttg 223440 ttttctcttt ctgtcctcct cactgttgct agccttaggg tgcttcagtt tcccttaacg 223500 cagttcacat cttttaaaaa cagactcttc attaaattct ctttaatgat ttgtttcaag 223560 tatgacaaat ctgtctttct gggaccttga attttattct tcaaaatatt accagccctt 223620 agcacagaac ctgttacatg gtgacgttca acacatattt gttgaatgaa tggatgaatt 223680 aataggctct tttgctcttc attcagaatc tattaagcta tacactccct cagtatttta 223740 aacccaaaat tcagttttta aaaactaaac ttcttgagag catagtctat ctatatctct 223800 ttaaaattta ggcctaagac aggacactgc cccacattga gtcccacaca acaacctgtg 223860 agtctggctc cccaggaggg cccccagaca gctcccaggc acttcatagg caaagcctgt 223920 cccccccact caggattccc aaggtctggg gtcccgctca ccccgctttc ctctcatgcc 223980 cagcctgacc ccaggtttca gctgggagag gccacttccc ttagccaagg aaaacgagaa 224040 cccccagggt acaggaggaa gctgggacag gtccccttgg gtgtcactcc ctcaccccct 224100 gcccaggccc actcccactg gtgctggagt acgcactggt ggggggaccc tgctcagccc 224160 agcctggagg gccccagtgt caccacaacc aggggcacgg caacatcatt gatgggttct 224220 gcagcccagg gcccccgatg cggggtcaga gtgtgtgggg cacagggccc ccgatgcggg 224280 gtcagtgtgt gggggtgcag ggcccccgat gtggggtcag tgggggtggg gcgcagggtc 224340 cccgatgcgg ggtcagagtg tgtggggcac agggcccccg atgcggggtc agtgtgtggg 224400 ggtgcagggc ccccgatgcg gggtcagtgg gggtggggcg cagggtcccc gatgcggggt 224460 cagagtgtgt ggggcgcagg gcccccgatg cggggtcagt gggggtgggg cgcagggtcc 224520 ccgatgcggg gtcagagtgt gtggggcgca gggcccccga tgcggggtca gattgtgtgg 224580 agcgcagggc cccctcgtgt ccagggcact ttggtacact gtcccacaag gcacctgtct 224640 cagaggaggg gtcctggcag gcagtgtggc aactcccttc cagagcccag ctccatgcta 224700 acctgcccac agcaacccca cagagccaca tcccctgctg cacctggcct gcaggagtgt 224760 cccaggacag gcccaagtca gcccagcatg cagctgccct cctaccctga agaagggagt 224820 gggctttcca ggggacataa ggatgccagg cctggacctc ctgggcagga aagggagcag 224880 gtcctgaggg cctgtgcccc acagccccag caccaggtgg actgcagcgc agtgggtggg 224940 ccagtggcag ctggggagaa gccccccgtc agcaggctgg ggtctgccca ccagggcctc 225000 cccacgtctg cctttgaggg tgcctgccat gccctggggg atcctggtat ctttactgga 225060 ctggaagcag gagacagaac agtgtctgtc ccggggtgac ttcatcagga gaccgcccac 225120 atagagctgg accccgcagc tgaagcggaa atgtgagaca ggctggcacc tccggaaaaa 225180 ctgcctttca gccttggtgt tccgtgcaag gtgaaaaaaa ataggtcctc caagtttaca 225240 gcttgaaatc aggctactgt gtggccctgg agaccacgag gggagaattt aaagtggccc 225300 cggctggcag ggtctaggtg gctggcagag gcacatgcag accctacctg gagcccgccc 225360 tagggacgct gggcaggtca gtctccgtgc aggatgtgag cagcgtccct gggctctatc 225420 cgcgaggtgc cagtagcgtg tgcaggtaca tacacatgcg tgcacactgt tatgacaccc 225480 agaaatgtct caggacgtcg aaatgtgtcc ttgggagcag aagtgtcccc ggttgagaat 225540 ctgtcccaga ggaacacgac cacgacaggc ctcaggattt tgtgttgatc aagttccaag 225600 gaaaaggaac atctcggcca ggcgtggtgg ctcacgcctg gaatcccagc acttgaggcc 225660 aggagttcga gaccagcctg ggcaacgcag tgagagaccc ccatctctac aaaaaaaaaa 225720 aagaaaaaaa aaagaaagaa agaaagaaaa gaaaatgaga tctccaggtt taaaaattca 225780 taaacaccac aaggaaacaa tacactatga gatccagcag aagcaacaga ttgactctgt 225840 agacccagat actggaatta tcagagagaa tataaagtaa cagtgtttta tatatctaaa 225900 gaaataaaag agatttctgg aaaaaaaaat ttaggcctaa gaattagtga aaatcccaac 225960 attaaggaag ggattatatg ttcagttttt gaaaggataa tgtgtcattt ttaatatttg 226020 ctatttcctg gaatcttagt tctaggatac accataaatg tctgctttta taggtgaaga 226080 aactgagggt gagaactgaa gagggattta tctgaagacg ttatggtagt ggaaccaatt 226140 tttactttaa tgttgttgct ctcttgatga tattagatgg tttcatcaat tactaagtaa 226200 attcccaaga tttacctcga agtcacatta ccctattaac ttattctcca gttgtaccaa 226260 tttgccattt cattctggta acaaagctct cttactacaa ttcagaaaat atttgggagg 226320 cagctgccac tgagcccaga ctttgacaaa atatcctccc acagaggccc agttaaacta 226380 tggattgcac tgagcattct gtccttaggt gctctggcct cccagtagat agcggatgct 226440 gtggtaattt atcacaaccc tctacccctc cgattacctg ccaggtgact cttcactcct 226500 ggcttctgca gcctctgctc tccccaagat ccagctctct cagcccccca tctaaggttg 226560 cacagtttag gtacatgctg aaatcaccaa tacagaatcg ttttaaaatt cgaattaatt 226620 ggctgagtgt tttgttaaga cctgattgtg ggcaagaact atttgttaaa tactctaaat 226680 tcttagaacc cagcccagta cttgctagtc atcatttaaa tacattgaat gatagagaaa 226740 attcttctga tcacaaacct tataccagcg ttgtcaaaat tataatgata aagtagctca 226800 ttttaagcgc gtcctgggtt gggaaactta acaattttaa aacttggaat aaattcaata 226860 aaatgacata gtatggttac aatgtctgtc tacagagtca gggcaagaac aaagaaaatt 226920 gaaagaagat tgttttagtg tagtaaaatt actggataat tttcatttcc tttgctcttt 226980 aaagaattat ttgtaaaggg tatttgaaat gaaaacaaga ttggagaaaa acaacttgga 227040 agaaaatcat aggcaaataa caataatgat tgaagagttg tgaataagga gagttaggaa 227100 tcaagtggtt ccaggcttgc agaatctgaa aggagcctag agtgaggagg ttgatctgtg 227160 aaggatgatg atgatctcca ttaaggacca gacaggaggc aataggctta agctgcagta 227220 tgagggattt agataagaga aaaggaaaaa ttttcagaca gtgaggttca tagatactgg 227280 aatgtgtaac tgaggaagct tgtggaattt ccttctctag aagtctttta aaaatagggc 227340 agtgtctcat ctgcctgaag gatggactct atttgacctc tcaaattgtc tactgaactc 227400 agaaggtgaa ccacacctta gataagaaag agagcctgaa tgatcctggg tagcttgagt 227460 aataaaagta gggtgaacaa gtcatattta ttttgattta tatatgtcat atatgtaaat 227520 tatgtctgct ataattcctt tttttctttc aattgaatgt tttcattttt aaggcctaga 227580 gattagagtt caagtaaaga tattatagga aagcaaggaa gaactctttt atcttactgt 227640 agaacaaatt tttagaggaa taaaaggaga aaaggatata ttggacatat ttgattttga 227700 tttcactccc tattctaaat aaaaaaaaat acactgccct ttctgttagc tttagtattt 227760 taagggtaaa tttcaaaaag ttaatttagt gtaagtgttt ctcacggtgt ttttggcaga 227820 accggtatcc caaactggaa gaggttctct gtatttaatt tcctctcagg aagtttaccg 227880 tcagaagtcc aaatgtgagg tcaagttttg ggttgccgga aatggtaatg tcctttactg 227940 tctgaacacc cagacaacac ttaatgaaac attctacttt gtggacattg aaagaaatta 228000 aaatgctttg tttcctcctt tttatgattg gtgatttctg tattcagtct tctaaaactc 228060 agaaacaaga ctatgtgtaa gtaagagcat ctgcattctc aggatcaagt tataactgca 228120 gattttcagt tacaggtgat atccatcttt tttttccttc ctaaaaataa aaatgtactt 228180 acttcaggcc aaaggagagg caagctttag aactcattag ccttcaagaa aaacaattcc 228240 agagcattct aaacctgatt tctttctaac tctgtttgag ttgacctgag gacttttaca 228300 ggttaaagca gtgagtcatt atatctcaca ttcatacagc tctacatatt tgtcaaagtg 228360 cttactcatc taatatctaa tatgatctta ataagaacct tgtgaatgtc attatcttat 228420 agatgaaaaa atgatatctt cataagatac agtttgctca agatcacaaa actagaaaat 228480 gtagtttgaa cacttctgat ttcaaagcca gagtcttctc cactgcccca tgctgtactg 228540 tttttgagaa tttgtgattt cctggtgttg tattattttt accattgatg agatttttgc 228600 ctgtgattta tcctgaatca aaatagatac tgtgatatga tactaaagta attgttacca 228660 aacaaaaagt tgtgctagca ttcttatgaa gtacagcact aaagattttc aaaacatttt 228720 gttattttta cataattggt catgtaaatt tctggtagga cactccttat gagattacaa 228780 cccattctaa tttatgctag ctatttattg ttaagcagta tgttgttttt attacaaaac 228840 ctcctttaat cattgcatca gtctctggca gaatattaaa aacaactccc ataatccctg 228900 gcactctgtc ctgggtgtct ttgggggtac agtggcttta tttccttccc taatagttcg 228960 gaagtttgtt taatactgac tcagaggaag cattctagct gagtcctcac atggtcttgt 229020 ttacagctcc ggagtgtaca taatagataa gctactgact tccacaagac ccccacgctt 229080 cctgggtgtg tgggtgtgtg tgcttgtgct tgtgaattaa ggttgtgcaa tctccctgct 229140 agctgcatca ggttgcaaag tcatttactt ctctaaaata ttcctctagc cagcctgact 229200 tgataaacca aaatcattgt attccatggt ggacatgctg gtaactcatg ataaacacta 229260 aaaatcctac gggtttataa caagataaaa cctgatattg gggcagggtg tagagaaatt 229320 tgcccaagga aatattgtga aataaagttg caaatggcta tagatgaatg cttttctatc 229380 tataggattt cttttcttga ttgtaattat aaattctttt actggttgta aatataatta 229440 tgattcttat gttacccagt ctgtaccaag aactttgtta ggccaacaac atcttacttg 229500 attgtagtag taaccttaaa agataaatat aggtataatg ctttttcaga agaaaaactg 229560 gagaattcaa acatgttctg cattgcacag atggtaaatg agtgatgaat agggtccttt 229620 gactccaaag atcaactagg ttctttccac atatctctct ttggttccct tttttgatat 229680 gactgtatga aatataattg tatttacata aagtgcagta gagttcatta gaaaaactat 229740 ttctgaatct tagggttcag actaaaggtg tttggaggct gatgatagtg ggctgcaaag 229800 agcttcatgg tgggctgcga atagcttcat caaacc 229836

Claims (74)

  1. 개인으로부터 수득된 핵산 시료 또는 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트(genotype dataset)에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 개인에서 동맥 질환에 대한 감수성을 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질은 rs10757278의 대립형질 G이고, 상기 하나 이상의 대립형질의 존재는 동맥 질환에 대한 증가된 감수성을 나타내고, 상기 동맥 질환은 심근 경색증, 관상동맥 질환, 두개내 동맥류, 복부 대동맥류, 말초 동맥 질환, 또는 심장성 뇌졸중인 것인 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 개인의 위험 평가, 진단 또는 예후 판단을 수행하기 위해 비-유전적(non-genetic) 정보를 분석하는 단계를 더 포함하고, 상기 비-유전적 정보는 연령, 성별, 민족, 사회경제적 지위, 과거 질병 진단, 개인의 병력(medical history), 심혈관 질환의 가족력(family history), 생화학적 척도, 및 임상적 척도로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 개인에서 동맥 질환에 대한 감수성을 평가하기 위한 키트로서, 상기 키트는 상기 개인의 게놈에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질을 선택적으로 검출하는 시약을 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질은 rs10757278의 대립형질 G이고, 상기 하나 이상의 대립형질의 존재는 동맥 질환에 대한 증가된 감수성을 나타내고, 상기 동맥 질환은 심근 경색증, 관상동맥 질환, 두개내 동맥류, 복부 대동맥류, 말초 동맥 질환, 또는 심장성 뇌졸중인 것인 키트.
  18. 삭제
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 시약은 상기 하나 이상의 다형성 마커를 포함하는 상기 개인의 게놈의 단편에 혼성화하는 하나 이상의 연속된(contiguous) 올리고뉴클레오티드, 완충액 및 검출가능한 표지를 포함하는 것인 키트.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 18개 내지 50개의 뉴클레오티드로 구성된 길이인 것인 키트.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 개인으로부터 수득된 핵산 시료 또는 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 개인에서 동맥 질환에 대한 감수성을 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질은 rs1333040의 대립형질 T, rs10116277의 대립형질 T, 및 rs2383207의 대립형질 T로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립형질의 존재는 동맥 질환에 대한 증가된 감수성을 나타내고, 상기 동맥 질환은 심근 경색증 또는 관상동맥 질환인 것인 방법.
  27. 개인에서 동맥 질환에 대한 감수성을 평가하기 위한 키트로서, 상기 키트는 상기 개인의 게놈에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질을 선택적으로 검출하는 시약을 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립형질은 rs1333040의 대립형질 T, rs10116277의 대립형질 T, 및 rs2383207의 대립형질 T로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립형질의 존재는 동맥 질환에 대한 증가된 감수성을 나타내고, 상기 동맥 질환은 심근 경색증 또는 관상동맥 질환인 것인 키트.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
KR1020097019455A 2007-02-21 2008-02-21 심혈관 질환과 연관된 유전적 감수성 변이 KR101571523B1 (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IS8613 2007-02-21
IS8613 2007-02-21
IS8640 2007-04-30
IS8640 2007-04-30
IS8701 2007-12-21
IS8701 2007-12-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090117896A KR20090117896A (ko) 2009-11-13
KR101571523B1 true KR101571523B1 (ko) 2015-11-24

Family

ID=39432938

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097019455A KR101571523B1 (ko) 2007-02-21 2008-02-21 심혈관 질환과 연관된 유전적 감수성 변이

Country Status (16)

Country Link
US (2) US9617597B2 (ko)
EP (2) EP2471954B1 (ko)
JP (1) JP5646179B2 (ko)
KR (1) KR101571523B1 (ko)
CN (1) CN101668865B (ko)
AU (1) AU2008218542B2 (ko)
BR (1) BRPI0807927A2 (ko)
CA (1) CA2679581C (ko)
DK (1) DK2471954T3 (ko)
EA (1) EA022610B1 (ko)
HU (1) HUE030996T2 (ko)
IL (1) IL200453A (ko)
MX (1) MX2009008878A (ko)
NZ (1) NZ579445A (ko)
SG (1) SG178811A1 (ko)
WO (1) WO2008102380A1 (ko)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7883851B2 (en) * 2007-05-02 2011-02-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Common allele on chromosome 9 associated with coronary heart disease
AU2009205956B2 (en) 2008-01-18 2015-07-02 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting signatures of disease or conditions in bodily fluids
US20090221620A1 (en) * 2008-02-20 2009-09-03 Celera Corporation Gentic polymorphisms associated with stroke, methods of detection and uses thereof
ES2344396B1 (es) * 2009-02-24 2011-06-24 Fina Biotech Slu Marcadores geneticos del riesgo de sufrir reestenosis.
WO2010131268A1 (en) * 2009-05-11 2010-11-18 Decode Genetics Ehf Genetic variants for basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma and cutaneous melanoma
ES2623633T3 (es) * 2009-06-09 2017-07-11 Gendiag.Exe, S.L. Marcadores de riesgo para enfermedad cardiovascular
CN102803951A (zh) * 2009-06-15 2012-11-28 心脏Dx公司 冠状动脉疾病风险的测定
EP2582816B1 (en) * 2010-06-15 2017-12-20 Cellagenics B.V. Novel intergenic elements for enhancing gene expression
EP2596116A4 (en) 2010-07-23 2014-03-19 Harvard College METHODS FOR DETECTION OF AUTOIMMUNE OR IMMUNE-RELATED DISEASES / PATHOLOGIES
US20120053073A1 (en) 2010-07-23 2012-03-01 President And Fellows Of Harvard College Methods for Detecting Signatures of Disease or Conditions in Bodily Fluids
US20130210647A1 (en) 2010-07-23 2013-08-15 President And Fellows Of Harvard College Methods of Detecting Cardiovascular Diseases or Conditions
WO2012012717A1 (en) 2010-07-23 2012-01-26 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting prenatal or pregnancy-related diseases or conditions
CN103124795A (zh) 2010-07-23 2013-05-29 哈佛大学校长及研究员协会 利用吞噬细胞检测疾病或病症的方法
US20130338012A1 (en) * 2010-11-18 2013-12-19 Illumina Inc. Genetic risk factors of sick sinus syndrome
US20150044239A1 (en) * 2011-03-31 2015-02-12 Yale University Compositions and Methods for Diagnosing, Preventing and Treating Intracranial Aneurysms
HUE029534T2 (hu) * 2011-08-05 2017-02-28 Gendiag Exe Sl Genetikai markerek kardiovaszkuláris betegség kockázatának becslésére
WO2013032883A2 (en) * 2011-08-26 2013-03-07 Ottawa Heart Institute Research Corporation Methods of detecting and treating cardiovascular diseases
US20150275298A1 (en) 2012-06-15 2015-10-01 Harry Stylli Methods of detecting diseases or conditions
WO2013188828A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 Harry Stylli Methods of detecting diseases or conditions using circulating diseased cells
MD707Z (ro) * 2013-01-18 2014-07-31 Институт Зоологии Академии Наук Молдовы Metodă de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric
US11585814B2 (en) 2013-03-09 2023-02-21 Immunis.Ai, Inc. Methods of detecting prostate cancer
NZ771629A (en) 2013-03-09 2022-12-23 Harry Stylli Methods of detecting cancer
US9629834B2 (en) 2013-04-26 2017-04-25 Kyoto University Medicinal composition for inhibiting formation and/or enlargement of cerebral aneurysm or shrinking same
KR101602688B1 (ko) 2013-12-30 2016-03-11 가톨릭관동대학교산학협력단 microRNA-365 활성화제를 포함하는 혈관평활근세포 증식 또는 이동 억제용 약학적 조성물
CN104946731B (zh) * 2014-03-28 2019-12-20 中国中医科学院中药研究所 快速检测金银花的pcr试剂盒及检测方法
EP3693742B1 (en) 2014-09-11 2022-04-06 Harry Stylli Methods of detecting prostate cancer
CA3012985A1 (en) 2015-01-27 2016-08-04 Kardiatonos, Inc. Biomarkers of vascular disease
RU2627643C2 (ru) * 2015-08-18 2017-08-09 Государственное бюджетное учреждение "Академия наук Республики Саха(Якутия)" (ГБУ АН РС(Я) Способ прогнозирования риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы
CN106811520A (zh) * 2016-08-17 2017-06-09 上海易瑞生物科技有限公司 一种心肌梗死易感基因检测分型试剂盒及其应用
RU2693997C2 (ru) * 2017-12-04 2019-07-08 Федеральное Государственное Бюджетное Научное Учреждение "Федеральный Научно-Клинический Центр Реаниматологии И Реабилитологии" (Фнкц Рр) Способ определения степени предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям
CN108342472A (zh) * 2018-04-13 2018-07-31 东华大学 一种冠心病易感基因检测分型试剂盒
US10468141B1 (en) 2018-11-28 2019-11-05 Asia Genomics Pte. Ltd. Ancestry-specific genetic risk scores
CN113767179A (zh) * 2018-12-13 2021-12-07 国立研究开发法人国立循环器病研究中心 脑梗塞发病风险预测方法
CN109486940A (zh) * 2018-12-25 2019-03-19 北京北基医学检验实验室有限公司 一种扩增颅内动脉肿瘤相关基因的引物组及检测试剂盒
CN109628577A (zh) * 2019-01-07 2019-04-16 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 检测冠状动脉硬化相关单核苷酸多态性位点的引物和方法
KR102158720B1 (ko) * 2019-04-03 2020-09-22 한림대학교 산학협력단 Lrrc3 유전자의 단일염기다형성을 포함하는 뇌동맥류 진단용 snp 마커
KR102158714B1 (ko) * 2019-04-03 2020-09-22 한림대학교 산학협력단 Tcf24 유전자의 단일염기다형성을 포함하는 뇌동맥류 진단용 snp 마커
RU2719914C1 (ru) * 2019-12-06 2020-04-23 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ прогнозирования исходов операций коронарного шунтирования
KR102344173B1 (ko) * 2021-05-03 2021-12-29 주식회사 바이오에이지 임상 및 유전변이 정보를 통합한 한국인 관상동맥 질환 예측 방법 및 관련 검사추천방법
KR102366097B1 (ko) * 2021-05-03 2022-02-23 주식회사 바이오에이지 임상 및 유전변이 정보를 통합한 한국인 뇌혈관 질환 예측 방법 및 관련 검사추천방법
CN113484453B (zh) * 2021-07-07 2022-08-09 天津中医药大学 一种缺血性脑卒中预警方法
CN114672548B (zh) * 2022-03-10 2024-04-19 华捷生物科技(青岛)有限公司 一种人类静脉血栓风险基因pai-1，thbd和proc基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用
WO2023205243A1 (en) * 2022-04-19 2023-10-26 The Regents Of The University Of Michigan Determining risk of fibromuscular dysplasia and systems and methods of use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004035746A2 (en) 2002-10-17 2004-04-29 Decode Genetics Ehf. Susceptibility gene for myocardial infarction

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4376110A (en) * 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
DE3486467T3 (de) * 1983-01-10 2004-10-14 Gen-Probe Inc., San Diego Verfahren zum Nachweis, Identifizieren und Quantifizieren von Organismen und Viren
US5288611A (en) * 1983-01-10 1994-02-22 Gen-Probe Incorporated Method for detecting, identifying, and quantitating organisms and viruses
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DE768377T1 (de) 1988-09-02 1998-01-02 Dyax Corp Herstellung und Auswahl von Rekombinantproteinen mit verschiedenen Bindestellen
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5424186A (en) * 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5288644A (en) * 1990-04-04 1994-02-22 The Rockefeller University Instrument and method for the sequencing of genome
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
EP0562025B1 (en) 1990-12-06 2001-02-07 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Compounds and their use in a binary synthesis strategy
DE69233697T2 (de) 1991-03-01 2008-01-24 Dyax Corp., Cambridge Verfahren zur Entwicklung von bindenden Mikroproteinen
DE69233750D1 (de) 1991-04-10 2009-01-02 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer Rezeptoren mittels Phagemiden
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5384261A (en) * 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
US5837832A (en) * 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US5858659A (en) * 1995-11-29 1999-01-12 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
CN1141398C (zh) * 2000-03-28 2004-03-10 陈高明 一种多基因扩增芯片及其制备方法
USH2191H1 (en) * 2000-10-24 2007-06-05 Snp Consortium Identification and mapping of single nucleotide polymorphisms in the human genome
USH2220H1 (en) * 2001-08-10 2008-07-01 Snp Consortium Identification and mapping of single nucleotide polymorphisms in the human genome
US20040267458A1 (en) * 2001-12-21 2004-12-30 Judson Richard S. Methods for obtaining and using haplotype data
JP2009521904A (ja) * 2003-03-10 2009-06-11 アプレラ コーポレイション 狭窄に関連する一塩基多型、その検出方法および使用
CA3050151C (en) * 2003-11-26 2023-03-07 Celera Corporation Single nucleotide polymorphisms associated with cardiovascular disorders and statin response, methods of detection and uses thereof
US20050191678A1 (en) * 2004-02-12 2005-09-01 Geneob Usa Inc. Genetic predictability for acquiring a disease or condition
JP2009521905A (ja) * 2004-03-05 2009-06-11 アプレラ コーポレイション 冠動脈心疾患に関連する遺伝的多型、その検出方法および使用
JP2009523006A (ja) * 2004-05-07 2009-06-18 アプレラ コーポレイション 脈管疾患に関連する遺伝的多型、その検出方法および使用
US20060004526A1 (en) * 2004-07-01 2006-01-05 Ambion, Inc. System and method for processing results of a complex genetic test
US20080131887A1 (en) * 2006-11-30 2008-06-05 Stephan Dietrich A Genetic Analysis Systems and Methods
US7883851B2 (en) * 2007-05-02 2011-02-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Common allele on chromosome 9 associated with coronary heart disease

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004035746A2 (en) 2002-10-17 2004-04-29 Decode Genetics Ehf. Susceptibility gene for myocardial infarction

Also Published As

Publication number Publication date
DK2471954T3 (en) 2016-09-12
KR20090117896A (ko) 2009-11-13
NZ579445A (en) 2012-02-24
CN101668865B (zh) 2015-05-06
EP2471954A1 (en) 2012-07-04
EP2115172A1 (en) 2009-11-11
EP2471954B1 (en) 2016-08-24
SG178811A1 (en) 2012-03-29
IL200453A (en) 2014-12-31
CA2679581C (en) 2020-12-22
CA2679581A1 (en) 2008-08-28
US9617597B2 (en) 2017-04-11
US20120208709A1 (en) 2012-08-16
BRPI0807927A2 (pt) 2014-06-24
EA022610B1 (ru) 2016-02-29
EA200970781A1 (ru) 2010-04-30
US20100068705A1 (en) 2010-03-18
WO2008102380A1 (en) 2008-08-28
HUE030996T2 (en) 2017-06-28
JP5646179B2 (ja) 2014-12-24
AU2008218542A1 (en) 2008-08-28
CN101668865A (zh) 2010-03-10
MX2009008878A (es) 2009-08-28
AU2008218542B2 (en) 2014-06-26
JP2010518848A (ja) 2010-06-03
IL200453A0 (en) 2010-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101571523B1 (ko) 심혈관 질환과 연관된 유전적 감수성 변이
KR101582321B1 (ko) 심장성 부정맥의 위험 관리를 위한 유전적 마커
CN101874120B (zh) 作为用于乳腺癌风险评估、诊断、预后和治疗的标记的chr2和chr16的遗传性变型
KR102046668B1 (ko) 암 대상자의 예후를 결정하기 위한 방법 및 핵산
KR102149483B1 (ko) 예측변수 인자들을 이용하여 동정된 환자 부분 모집단에서 암 치료를 위한 마시티닙의 용도
CN101641451A (zh) chr8q24.21上的癌症易感性变体
KR20110036608A (ko) 유방암 위험도 평가를 위한 유전적 변이
US20090305284A1 (en) Methods for Identifying Risk of Breast Cancer and Treatments Thereof
KR102481305B1 (ko) 유전자에 기반한 염증성 장 질환의 진단
KR20180049093A (ko) 신규한 바이오마커 및 암의 치료 방법
KR20090087486A (ko) 타입 ２ 당뇨병의 유전적 감수성 변이
WO2006022629A1 (en) Methods of identifying risk of type ii diabetes and treatments thereof
CN101631876A (zh) 2型糖尿病的遗传易感性变体
EP1729930A2 (en) Methods for identifying risk of osteoarthritis and treatments thereof
CA2497597A1 (en) Methods for identifying subjects at risk of melanoma and treatments
IL179831A (en) In vitro method for detecting the presence or possibility of autism or autism disorder, and in vitro method for selecting compounds with biological activity on autism or autism disorders
KR20170116009A (ko) 전립선암의 진단을 위한 신규한 rna-바이오마커 시그니처
WO2006022636A1 (en) Methods for identifying risk of type ii diabetes and treatments thereof
KR20190126812A (ko) 질환 진단용 바이오마커
TW202227102A (zh) 治療脂肪肝病之方法
WO2006022634A1 (en) Methods for identifying risk of type ii diabetes and treatments thereof
AU2017209307A1 (en) Compositions and methods for screening and identifying clinically aggressive prostate cancer
WO2006022638A1 (en) Methods for identifying risk of type ii diabetes and treatments thereof
KR102642320B1 (ko) 항암제에 대한 내성 진단용 조성물
KR100909709B1 (ko) 골밀도 및 골절 위험과 ｉｔｇａ１ 유전자 다형성과의연관성

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant