KR101569334B1

KR101569334B1 - 래프틀린을 함유하는 패혈증 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법

Info

Publication number: KR101569334B1
Application number: KR1020130160665A
Authority: KR
Inventors: 배종섭
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2015-11-17
Also published as: KR20150072946A

Abstract

본 발명은 래프틀린을 함유하는 패혈증 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로서, 상기 바이오마커 조성물 및 진단방법을 통해, 패혈증의 진행 여부를 용이하게 진단할 수 있다. 또한, 상기 방법을 통해 패혈증의 진행을 조기에 진단하고 이와 관련된 치료를 효과적으로 할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

Description

래프틀린을 함유하는 패혈증 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법 {Biomarker composition comprising raftlin for diagnosis of sepsis and the method of diagnosis using the same}

본 발명은 래프틀린을 함유하는 패혈증 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다.

패혈증(sepsis, 敗血症)은 녹농균, 대장균, 연쇄상구균, 포도상구균, 폐렴균 같은 미생물에 감염되었을 때 미생물이나 그 미생물이 생산한 독소에 의해 오한과 함께 고열, 관절통, 두통, 권태감 등의 전신적인 증상이 나타나는 상태를 말한다. 이러한 증상이 심해지만 저혈압이 동반되고 소변량이 줄며 패혈성 쇼크가 나타나기도 한다(Riedemann, N.C. et al., 2003). 미생물의 감염 경로를 잘 알 수 없는 경우도 있으나 맹장염, 중이염, 피부화농증, 욕창, 폐질환, 담낭염, 신우염, 골수염 등이 패혈증의 원인 병소로 알려져 있다. 혈액검사와 소변검사, 뇌척수액 검사 등을 통해 패혈증을 진단할 수 있으며 백혈구 수와 급성염증성물질이 증가한 경우도 패혈증을 진단하는데 도움을 준다.

아직까지 패혈증의 치료를 위한 근본적인 치료제는 확인되지 않은 상태이다. 패혈증은 통상적인 염증 억제 치료방법으로는 잘 낫지 않으며, 유일하게 FDA 승인을 받은 드로트레코긴 알파(drotrecogin alfa, Xigris^®, Engl. Ranieri, V.M. et al., 2012)조차도 임상단계에서 패혈증에 대한 치료 효과가 명확하지 않아 이에 대한 연구가 중단되어 있는 실정이다. 현재 패혈증은 주로 항생제나 항진균제 주사로 치료하고, 치료 약제와 기간은 미생물의 종류에 따라 결정한다. 또 환자의 상태에 따라 혈액투석 또는 수혈을 하기도 한다. 항생제와 항진균제가 잘 들으면 패혈증은 완치되기도 하지만, 약제에 내성이 있는 미생물에 감염된 경우와 면역력이 약한 환자인 경우, 또 너무 늦게 치료를 시작한 경우 등에서는 치료가 어려워 환자가 사망하기도 한다. 또한, 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크는 항생제 치료(antibiotic therapy)를 비롯한 다양한 집중 치료(intensive care)(Anderson, R.N. 2002; Andreu Ballester, J.C. et al., 2008; Angus, D.C. et al., 2001)의 발전에도 불구하고, 선진국에서 세번째로 사망률이 높은 질병이다. 따라서, 초기 패혈증 증상이 중증 패혈증이나 패혈성 쇼크로 이어지기 전에 이를 진단 및 치료하는 것이 이러한 패혈성 사망률을 낮추는 매우 중요한 요건이 될 수 있다. 한편, 패혈증은 이를 진단하는 마커가 잘 알려져 있지 않아 초기 패혈증 증상을 진단하는데 많은 어려움이 있다.

세포의 이동성을 결정하는 유전자 2 단백질로 알려진 래프틀린(raftlin, 다른 이름으로는 RFTN1, lipid raft linker 1)은 아미노산 578개로 구성된 세포막 단백질이며, 래프트 세포의 구성과 유지에 필수적인 지질뗏목 단백질(lipid raft)로서, Raji B 세포에 존재한다. 또한 래프틀린은 래프틀린 족 단백질의 일부를 구성하며 다른 지질뗏목의 유지(integrity of lipid raft)나 B-세포 항체 수용체 신호 전달(B-cell antigen receptor signal transduction)에 필요한 단백질이다(Saeki, K., et al., 2003). 래프틀린은 TLR3 활성 및 자가면역반응의 유도과 연관된 뉴클레오캡춰 복합체(nucleocapture complex)와도 관련이 있다(Saeki, K. et al., 2009; Watanabe, A. et al., 2011).

한편, 본 발명자들은 패혈증의 진행 과정에 비례하여 래프틀린의 단백질 및 RNA 유전자가 증가하는 것을 확인함으로써, 래프틀린을 패혈증의 진단용 바이오마커 조성물로 하는 본 발명을 완성할 수 있었다.

Anderson, R.N. 2002. Deaths: leading causes for 2000. Natl Vital Stat Rep 50: 1-85. Andreu Ballester, J.C. et al., 2008. Epidemiology of sepsis in the Valencian Community (Spain), 1995-2004. Infect Control Hosp Epidemiol 29: 630-634. Angus, D.C. et al., 2001. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med 29: 1303-1310. Bone, R.C. et al., 1992. The ACCP-SCCM consensus conference on sepsis and organ failure. Chest 101: 1481-1483. Chien, J.Y. et al., 2005. Low serum level of high-densit lipoprotein cholesterol is a poor prognostic factor for severe sepsis. Crit Care Med 33: 1688-1693. Clackson, T. et al., 1991. Making antibody fragments using phage display libraries. Nature 352: 624-628. Gibot, S., A. et al., 2005. Time-course of sTREM (soluble triggering receptor expressed on myeloid cells)-1, procalcitonin, and C-reactive protein plasma concentrations during sepsis. Crit Care Med 33: 792-796. Hanley, J.A. et al., 1983. A method of comparing the areas under receiver operating characteristic curves derived from the same cases. Radiology 148: 839-843. Kohler, G. et al., 1976. Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. European J Immunology 6: 511-519. Marshall, J.C. et al., 2003. Measures, markers, and mediators: toward a staging system for clinical sepsis. A report of the Fifth Toronto Sepsis Roundtable, Toronto, Ontario, Canada, October 25-26, 2000. Crit Care Med 31: 1560-1567. Ranieri, V.M. et al., 2012. Drotrecogin alfa (activated) in adults with septic shock., Engl J Med 366: 2055-2064. Riedemann, N.C. et al., 2003. Novel strategies for the treatment of sepsis., Nat Med 9: 517-524. Saeki, K., et al., 2003. The B cell-specific major raft protein, Raftlin, is necessary for the integrity of lipid raft and BCR signal transduction. EMBO J 22: 3015-3026. Saeki, K. et al., 2009. A major lipid raft protein raftlin modulates T cell receptor signaling and enhances th17-mediated autoimmune responses. J Immunol 182: 5929-5937. Watanabe, A. et al., 2011. Raftlin is involved in the nucleocapture complex to induce poly(I:C)-mediated TLR3 activation. J Biol Chem 286: 10702-10711.

본 발명의 목적은 래프틀린을 함유하는 패혈증 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 래프틀린 단백질(Accession numbers : AC010727) 또는 이의 면역원성 단편을 함유하는 패혈증 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다. 상기 면역원성 단편은 래프틀린에 대한 항체에 의해 인식되는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단백질 단편을 의미한다.

또한, 본 발명은 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 인식하는 항체를 함유하는 패혈증 진단제를 제공할 수 있다.

이에, 본 발명은 상기 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 함유하는 바이오마커 조성물을 이용한 패혈증 진단방법을 제공한다. 마찬가지로, 본 발명은 상기 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 인식하는 항체를 함유하는 진단제를 이용한 패혈증 진단방법을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 래프틀린의 유전자 서열(NCBI Reference Sequence : NM_015150.1)의 전부 또는 이의 일부를 포함하는 패혈증 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 래프틀린의 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머를 함유하는 패혈증 진단제를 제공할 수 있다.

이에, 본 발명은 래프틀린의 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부를 포함하는 바이오마커 조성물을 이용한 패혈증 진단방법을 제공한다. 마찬가지로, 본 발명은 상기 래프틀린의 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머를 함유하는 진단제를 이용한 패혈증 진단방법을 제공한다.

이하 본 발명을 자세하게 설명한다.

상기 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 인식하는 항체를 함유하는 진단제에는, 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등이 포함될 수 있다.

상기 항체는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 바람직하게는 상기 항체는 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 폴리클론 항체, 모노클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다. 상기 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 상기 폴리클론 항체는 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편(항원)을 동물에 주사한 뒤 채혈한 혈청에서 얻을 수 있다. 상기 동물로는 염소, 토끼, 돼지, 양 등 임의의 동물 숙주를 이용할 수 있다. 상기 모노클론 항체는, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로, 하이브리도마 방법(Kohler, G. et al., 1976), 또는, 파지 항체 라이브러리(Clackson, T. et al., 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법을 수행하기 위해서는 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포와, 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이 후, 폴리에틸렌글라이콜 등을 이용하는 방법, 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로, 이러한 두 종류의 세포들을 융합시킨 후, 항체 생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킬 수 있다. 이 후, 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후, 본 발명의 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양할 수 있다. 상기 파지 항체 라이브러리 방법은, 본 발명의 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 인식하는 항체 유전자를 획득하여, 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 상기 라이브러리로부터 본 발명의 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편과 결합하는 모노클론 항체를 분리 및 제작하여 수행할 수 있다. 상기 방법들에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.

상기 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, F(ab)2, Fv 등이 있다.

한편, 상기 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 인식하는 항체를 함유하는 진단제는 통상적인 진단제 조성물에 포함되는, 동결건조형태의 항체, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 방사종, 형광원, 효소 등에 의해 표지화될 수 있는 것으로서, 상기 항체는 이뮤노어세이 키트(immunoassay 키트 : ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 다양하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 함유하는 바이오마커 조성물을 이용한 패혈증 진단방법을 제공한다. 또는, 상기 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 인식하는 항체를 함유하는 진단제를 이용한 패혈증 진단방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 진단방법은,

(1공정) 분석할 시료에서 단백질을 분리하는 단계;

(2공정) 상기 1공정의 단백질에 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,

(3공정) 상기 2공정에서 생성된 항원-항체 복합체를 정량 검출 및 분석하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 모든 절차에서는 패혈증 관련 시료(패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람[환자] 또는 동물의 시료)와 대조군 시료(건강한 사람 또는 동물의 시료)의 단백질 발현량을 비교 분석한다. 즉, 상기 1공정의 시료는 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람(환자) 또는 동물에게서 추출할 수 있다. 또한, 바람직하게는, 상기 시료는 사람 또는 동물의 조직, 세포 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 뇨, 혈액, 혈장, 혈청 등일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 동물은 패혈증이 발병할 수 있는 동물이라면 무엇이든지 다 가능하며, 바람직하게는, 돼지, 소, 염소, 토끼, 개, 양, 말, 쥐(마우스, 레트), 원숭이를 비롯한 포유동물이라면 무엇이든지 다 가능하다. 상기 대조군 시료에서 단백질을 분리하는 대신에 상기 본 발명의 바이오마커 조성물에 포함된 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 이용할 수도 있다.

상기 1공정에서 단백질을 분리하는 과정은 공지된 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 단백질의 양은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

상기 2공정의 항원-항체 복합체란 본 발명의 래프틀린 단백질 또는 이의 면역원성 단편과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 즉, 상기 항원은 래프틀린 또는 이의 면역원성 단편을 뜻할 수도 있다.

즉, 상기 분석방법을 통하여 대조군 시료의 항원-항체 복합체의 형성량과 패혈증이 진행되고 있을 것이라고 의심되는 시료에서 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 래프틀린의 발현량을 판단하여 실제 패혈증이 진행되고 있는지의 여부를 진단할 수 있다.

상기 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 상기 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으나, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 라벨로 효소를 사용하는 경우, 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스 옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으나, 상기 기재된 범위로 제한되지는 않는다. 상기 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있으나, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 상기 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 발광물질로는 루시페린 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 미소입자로는 콜로이드, 금 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 방사선 동위원소에는 ³H, ¹⁴C 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 진단방법은, 웨스턴 블롯(western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오크털로니면역확산법(ouchterlony immunodiffusion), 로켓면역전기영동법(rocket immunoelectrophoresis), 조직면역염색법(immunohistochemistry), 면역침전분석법(immunoprecipitation), 보체고정분석법(complement fixation assay), FACS(fluorescense activated cell sorter), 단백질 칩(protein chip) 등에 적용할 수 있으나, 기재된 방법에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 바이오마커 조성물은 래프틀린의 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 또한, 상기 래프틀린의 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부 대신 이의 상보가닥분자가 포함될 수 있다. 상기 래프틀린의 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부는, 바람직하게는 DNA(deoxyribonucleic acid)일 수 있으며, 더 바람직하게는 cDNA(complementary DNA)일 수 있다. 이 외에, 본 발명은 상기 래프틀린의 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머를 함유하는 진단제를 제공한다. 상기 프라이머는 상기 래프틀린의 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부에 상보적인 염기서열을 가질 수 있다.

이에, 본 발명은 상기 래프틀린의 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부를 이용한 패혈증 진단방법을 제공한다. 또한, 상기 래프틀린의 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용한 패혈증 진단방법을 제공한다. 자세하게는,

(1공정) 분석할 시료에서 RNA를 분리하는 단계;

(2공정) 상기 1공정의 RNA를 cDNA로 합성하는 단계;

(3공정) 상기 2공정의 cDNA를 대상으로, 래프틀린 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 또는 RT-PCR(Reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및,

(4공정) 상기 3공정의 유전자 증폭물의 발현 정도를 확인하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 모든 절차에서는 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람(환자) 또는 동물의 시료와, 건강한 사람 또는 동물에게서 얻은 대조군 시료의 유전자 발현량을 비교 분석한다. 즉, 상기 1공정의 시료는 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람(환자) 또는 동물, 또는, 건강한 사람 또는 동물에게서 추출할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 사람 또는 동물의 조직, 세포 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 뇨, 혈액, 혈장, 혈청 등일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 동물은 패혈증이 발병할 수 있는 동물이라면 무엇이든지 다 가능하며, 바람직하게는, 돼지, 소, 염소, 토끼, 개, 양, 말, 쥐(마우스, 레트), 원숭이를 비롯한 포유동물이라면 무엇이든지 다 가능하다.

한편 상기 공정에서, 대조군에서 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하는 대신 상기 본 발명의 바이오마커 조성물에 포함된 래프틀린의 유전자 서열의 전부 또는 이의 일부를 cDNA로 바로 사용할 수 있다.

상기 RNA를 분리하는 과정은 공지된 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, RNA의 양은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다. cDNA를 합성하는 단계 또한 공지된 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 바이오마커 조성물은 패혈증에서 증감되는 다른 유전자들과의 조합을 통해, 래프틀린 유전자의 증감을 확인함으로써 패혈증을 진단할 수 있는 DNA 칩(DNA chip) 또는 RNA 칩(RNA chip)에도 적용할 수 있다. 상기 DNA 칩 또는 RNA 칩에는 래프틀린의 유전자 서열의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함할 수 있다.

도 1A는 LPS 처리된 HUVEC의 세포배양액에서의 래프틀린의 단백질 발현량을 확인한 ELISA 결과이다.
도 1B는 LPS 처리된 HUVEC의 세포용출물에서의 래프틀린의 단백질 발현량을 확인한 ELISA 결과이다.
도 1C는 도 1A 및 도 1B의 결과를 합산하여 나타낸 결과이다.
도 1D는 LPS 처리된 HUVEC의 세포용출물에서의 래프틀린의 RNA 발현량을 확인한 Q-PCR 결과이다.
도 1E는 LPS 처리된 수컷 C57BL/6 마우스 혈청에서의 래프틀린의 단백질 발현량을 확인한 ELISA 결과이다.
도 2A는 21명의 건강한 사람과 82명의 패혈증 환자의 혈청에서의 래프틀린의 단백질 발현량을 확인한 ELISA 결과이다.
도 2B는 CLP 수술을 한 마우스의 혈청에서의 래프틀린의 단백질 발현량을 확인한 ELISA 결과이다.
도 2C는 CLP 수술을 한 마우스의 생존률을 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1. LPS 처리된 HUVEC에서의 래프틀린 생성 확인>

실시예 1-1. HUVEC 준비 및 LPS 처리

HUVEC은 Cambrex Bio Science(Charles City, IA, USA)에서 얻었으며, EBM-2 기본 배지(basal media) 및 이에 공급되는 성장 보충물(Cambrex Bio Science)을 첨가하여 배양하였고 3~5번째 계대배양된 것들을 실험에 사용하였다. 실험을 위해, HUVEC을 6웰 플레이트(6-well plates)에서 배양한 후 LPS(lipopolysaccharide, 100ng/㎖)를 100시간째까지 처리하였다(대조군은 saline 처리).

실시예 1-2. ELISA 수행

먼저 HUVEC의 세포배양액과 세포용출액을 이용하여 ELISA(competitive enzyme-linked immunosorbent assays)를 수행하기 위해 96웰 플레이트(96-well plastic flat microtiter plates, Corning, NY, USA)에 래프틀린 2 단백질(raftlin 2 protein[Origene, Rockville, MD] in 20mM carbonate/bicarbonate buffer[pH 9.6] containing 0.02% sodium azide)을 코팅하여 4℃에서 18시간 이상 밤을 지새워 반응하였다. 이 후, 플레이트를 PBS-T(PBS-0.05%[w/w] Tween 20)로 3번 세척한 후, PBS-T를 넣어서 4℃에서 18시간 이상 밤을 지새워 보관하였다.

한편, 래프틀린 2 단백질(raftlin 2 protein, Origene, Rockville, MD, 단백질 정량용, PBS-T에 희석), HUVEC의 세포배양액(conditioned culture media)(LPS 처리된 샘플 포함), HUVEC의 세포용출액(cell lysates)(LPS 처리된 샘플 포함)은 각각 96웰 플레이트에서 항-래프틀린 2 항체(Santa Cruz, CA, PBS-T에 1:1000 희석)와 37℃에서 90분간 전반응시켰다. 상기 HUVEC의 세포용출액은 1mM PMSF, 1mM Na₃VO₄, 1mM NaF, 1㎍/㎖ 아프로티닌(aprotinin), 1㎍/㎖ 펩스타틴(pepstatin), 1㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin) 및 10% RIPA lysis buffer(Upstate Biotechnology, USA)를 함유하고 있는 단백질 분리 시약을 이용해 4℃에서 1시간 동안 볼텍싱(vortexing)하여 분해시킨 후 원심분리(15000rpm, 4℃, 20분)하여 얻은 상층액이다.

상기 항체가 전반응된 래프틀린 2 단백질, HUVEC의 세포배양액 또는 HUVEC의 세포용출액을 래프틀린 2가 코팅된 플레이트로 옮겨 실온에서 30분간 반응시켰다. 이 후, 각 플레이트들은 PBS-T로 3번 세척하였고, 실온에서 90분간 2차 항체(peroxidase-conjugated anti-goat IgG antibodies, R&D Systems, PBS-T에 1:2000 희석)와 반응시켰다.

각 플레이트들을 PBS-T로 3번 세척한 후, 실온의 암실에서 60분간 200㎕씩의 기질용액(100㎍/㎖ o-phenylenediamine & 0.003% H₂O₂)을 처리하였다. 다음으로는 50㎕의 8N H₂SO₄으로 모든 반응을 중단시킨 후, 490nm에서 흡광도를 확인하였다.

실시예 1-3. Q-PCR 수행

다음으로는 Q-PCR(quantitative-PCR, realtime PCR)을 수행하여, HUVEC의 세포용출액에서의 래프틀린의 RNA 발현 정도를 확인하였다. 이를 위해, LPS(100ng/㎖)를 처리한 후(대조군은 saline 처리) HUVEC을 시간별로 수거하여 TRI-Reagent(Invitrogen)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA 5㎍씩을 이용하여 cDNA 합성을 하였으며(PX2 Thermal Cycler(Thermo Scientific), 200U/㎕ M-MLV reverse-transcriptase(Invitrogen), 0.5㎎/㎕ oligo(dT)-adapter primer (Invitrogen) 이용, 총 20㎕ reaction mixture가 되게 함), 상기 cDNA를 이용하여 래프틀린(raftlin)과 α-액틴(α-actin)에 대한 Q-PCR을 수행하였다(Mini Opticon Real-Time PCR System(Bio-Rad), iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad, Hercules, CA) 이용).

각 프라이머(primer)의 염기서열은 하기와 같다.

raftlin/sense : 5'-CTGGATGGACCGGAGAGCAAC-3'

raftlin/antisense : 5'-GTATTGCCGGCACTTCTGATGGC-3'

α-actin/sense : 5'-TGAGAGGGAAATCGTGCGTG-3'

α-actin/antisense : 5'-TTGCTGATCCACATCTGCTGG-3'

또한 Q-PCR 수행 조건은 하기와 같다.

1 cycle, initial denaturation : 95℃,

35 cycles, amplification : 15초 - 95℃, 20초 - 60℃,

melting curve analysis : 72~98℃.

실시예 1-4. HUVEC 세포 내의 래프틀린 생성량 분석

상기 실시예 1-1 내지 1-3의 결과를 도 1A~D에 나타내었다. 도 1A~C에서 ●는 LPS 100ng/㎖ 처리군이며, ○는 LPS 무처리군을 의미하고, 도 1D에서 ■는 LPS 100ng/㎖ 처리군이며, □는 LPS 무처리군을 의미한다. 또한, 도 1A는 HUVEC의 세포배양액에서의 래프틀린의 단백질 발현량을 확인한 ELISA 결과, 도 1B는 HUVEC의 세포용출물에서의 래프틀린의 단백질 발현량을 확인한 ELISA 결과, 도 1C는 도 1A 및 도 1B의 결과를 합산하여 나타낸 결과이다. 도 1D는 HUVEC의 세포용출물에서의 래프틀린의 RNA 발현량을 확인한 Q-PCR 결과이다.

따라서, 도 1A~D를 참고하면, LPS의 투여를 통해 HUVEC 세포의 배양액, 세포내(세포용출물)에서 모두 래프틀린이 24시간째부터 생성되어 96시간까지 계속 증가하는 것을 알 수 있다.

실시예 1-5. LPS 처리된 마우스에서의 래프틀린 생성 확인

수컷 C57BL/6 마우스(6~7주령 및 체중 18~20g의 마우스를 구입하고 12일간 실험실에서 순응화한 후 사용, Orient Bio Co. Sungnam, Kyungki-Do, Republic of Korea각 군당 10마리씩)를 이용하여, 마우스 내에 LPS(10㎎/㎏)를 복강투여한 후(대조군은 saline 투여) 혈청 내의 래프틀린 생성이 증가하는지를 확인하였다.

이를 위해 마우스의 혈액을 2000×g에서 5분간 원심분리하여 혈청 샘플을 얻었고, 상기 혈청과 실시예 1-2에서 사용한 ELISA의 방법을 이용하였다. 즉, 실시예 1-1에서 사용한 HUVEC의 세포배양액이나 세포 용출물 대신 상기 마우스 혈청 샘플을 대신 사용하였고, 이에 대한 결과는 도 1E에 나타내었다.

도 1E를 참고하면, 마우스의 반수 치사량(일정 시간내에 실험 동물의 반수를 사망시키는 양, median lethal dose, LD₅₀)에 해당되는 LPS(10㎎/㎏)를 투여한 경우, 래프틀린 단백질의 양이 24시간째부터 증가하여 96시간째까지 지속적으로 증가하는 것이 확인된다(●는 LPS 10㎎/㎏ 복강투여군, ○는 LPS 무투여군).

이에, 실시예 1의 모든 결과를 종합하면, 상기 도 1 A~E의 결과들을 통해서 래프틀린이 패혈증의 원인이 되는 염증 반응의 매개체임을 알 수 있다.

<실시예 2. 패혈증 환자 및 패혈증 모델 마우스에서의 래프틀린 생성량 확인>

실시예 2-1. 사람 혈청의 채취 및 래프틀린 생성량 확인

21명의 건강한 사람과 82명의 패혈증 환자의 혈청을 채취하였다. 패혈증 환자는 경증 패혈증 상태(sepsis), 중증 패혈증 상태(severe sepsis), 패혈성 쇼크 상태(septic shock)로 그룹화하였다(1992년의 Sepsis Consensus Conference Committee의 지침을 따라 그룹화함, Bone, R.C. et al., 1992; Hanley, J.A. et al., 1983).

각 사람들에게서 채취한 혈액을 48시간 이내에 2000×g에서 5분간 원심분리하여 혈청 샘플을 얻었고, 실험 전까지 -20℃에 보관하였다. 상기 혈청 샘플에서의 래프틀린의 분석은 실시예 1-2에 개시된 ELISA 방법을 이용하여 확인하였다. 즉, 실시예 1-2에서 사용한 HUVEC의 세포배양액이나 세포 용출물 대신 상기 사람 혈청 샘플을 대신 사용하였고, 이에 대한 결과는 도 2A에 나타내었다.

도 2A를 참고하면, 건강한 사람의 혈청 내의 래프틀린은 364.9ng/㎖ (312.1~392.4ng/㎖)인 것으로 확인되지만, 경증 패혈증 상태(sepsis) 환자의 혈청 래프틀린은 496.1ng/㎖(418.1~738.9ng/㎖, n=30), 중증 패혈증 상태(severe sepsis) 환자의 혈청 래프틀린은 681.6ng/㎖(480.1~819.6ng/㎖, n=22), 패혈성 쇼크 상태(septic shock) 환자의 혈청 래프틀린은 891.6ng/㎖(789.7~1087.8ng/㎖, n=30)로서, 래프틀린 단백질의 혈청 내 수치가 패혈증 증상에 비례하여 급격하게 증가된 상태임을 알 수 있다.

실시예 2-2. 패혈증 동물모델에서의 래프틀린 생성량 및 패혈증으로 인한 치사율 확인

마우스의 맹장을 터트리는 CLP 수술법(cecal ligation and puncture operation)을 이용하여 마우스에 패혈증을 유도하였다. CLP 수술에 이용된 마우스는 수컷 C57BL/6 마우스를 이용하였고, 각 군당 10마리씩 이용하였다(6~7주령 및 체중 18~20g의 마우스를 구입하고 12일간 실험실에서 순응화한 후 사용, Orient Bio Co., Sungnam, Kyungki-Do, Republic of Korea). 마우스를 졸레틸 50(zoletil 50) 및 3%(w/v) 이소플루란(isoflurane, Forane^®, Choongwae Pharma. Corp., Seoul, Korea)으로 마취시켰다. 패혈증 모델을 유도하기 위해 배 부위 2㎝ 절개를 하여 맹장과 근처의 창자를 노출시켰다. 맹장 끝으로부터 5㎜ 부위의 맹장을 3.0-실크 봉합선으로 강하게 묶고, 22-게이지 바늘로 이를 터트렸다. 맹장을 부드럽게 짜 내어 천공 부위를 통해 소량의 배설물이 누출되게 하였고, 이 배설물을 복강에 노출시켰으며, 개복부위를 4.0-실크 봉합선으로 봉합하였다. 음성대조군(sham)은 맹장을 묶고 터트리는 단계를 수행하지 않고 단순히 배만 절개하고 다시 봉합하였다. 각 마우스들은 CLP 수술 24시간 후부터 패혈증 증상에 노출되었는데, 전율(shivering)이 있거나 털이 곤두서거나(bristled hair) 또는 무기력증(weakness) 등의 현상이 나타났다. CLP 수술 이후, 4일간 매일 마우스로부터 혈액을 채취하여 혈청 내 래프틀린의 생성량을 실시예 1-2에 개시된 ELISA 방법을 이용하여 확인하였다. 즉, 실시예 1-2에서 사용한 HUVEC의 세포배양액이나 세포 용출물 대신 상기 마우스 혈청 샘플을 대신 사용하였고, 이에 대한 결과는 도 2B에 나타내었다.

도 2B를 참고하면, CLP 수술을 한 패혈증 마우스의 혈청 래프틀린 단백질이 시간의존적으로 증가하는 것으로 확인된다.

한편, 패혈증은 치사율이 매우 높은 질병 중의 하나로 알려져 있기에(Angus, D.C. et al., 2001), CLP로 유도된 패혈증 마우스들의 생존을 확인하였다. 마우스의 생존은 CLP 수술 6시간 후부터 140시간까지 확인하였고(카플란-마이어의 생존 분석법[Kaplan-Meier survival analysis]에 따라 관찰), 패혈증 증상에 따른 마우스의 생존결과는 도 2C에 나타내었다.

도 2C를 참고하면, 대조군(sham, ○) 마우스는 140시간째에도 모두 살아있는 것을 알 수 있으나, CLP를 수행한 마우스(●)는 120시간 째에 모두 치사되는 것으로 확인된다.

한편, CRP(C-reactive protein), 프로칼시토닌(procalcitonin), sICAM-1(serum intercellular adhesion molecule), IL-6(interleukin-6), vWF(von Willebrand factor protein), HDL(high-density lipoprotein cholesterol), NT-proBNP(N-terminal pro-brain natriuretic peptide) 등이 패혈증의 진단마커로서 제안된 바 있지만, 이들의 발현량 증가는 패혈증 이외에도 다양한 원인이 될 수 있어 임상적인 승인까지는 받지 못하고 있는 실정이다(Marshall, J.C. et al., 2003; Chien, J.Y. et al., 2005; Gibot, S., A. et al., 2005). 그러나, 래프틀린은 다른 외부적인 요인에 영향을 받지 않으면서도 패혈증 증상의 정도에 비례하여 그 수치가 증가하는 것으로 확인되기에, 패혈증 증상을 진단하기에 적합한 마커로 사용할 수 있다는 장점이 있다.

Claims

래프틀린 단백질(Accession numbers : AC010727) 또는 래프틀린에 대한 항체에 의해 인식되는 에피토프(epitope)를 가지는 래프틀린의 단백질 단편을 함유하는 것을 특징으로 하는 패혈증 진단용 바이오마커 조성물.
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래프틀린 단백질(Accession numbers : AC010727) 또는 이의 면역원성 단편에 특이적으로 인식하는 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 패혈증 진단제.
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래프틀린의 유전자 서열(NCBI Reference Sequence : NM_015150.1)을 포함하는 것을 특징으로 하는 패혈증 진단용 바이오마커 조성물.
래프틀린의 유전자 서열(NCBI Reference Sequence : NM_015150.1)을 증폭할 수 있는 프라이머를 함유하는 것을 특징으로 하는 패혈증 진단제.
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