KR101051435B1 - 대장암 관련 마커를 이용한 대장암 진단 키트 및 이를 이용한 대장암 진단 방법 - Google Patents

대장암 관련 마커를 이용한 대장암 진단 키트 및 이를 이용한 대장암 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장암 특이적인 유전자에 대한 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질 발현 수준을 측정하는 마커, 또는 상기 마커들을 적어도 둘 이상 포함하는 복합 마커를 함유하는 대장암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 대장암 조직 또는 혈액에서만 특이적으로 과발현되는 유전자들을 선별할 수 있고, 이러한 대장암 진단 유전자들 특이적인 마커 또는 복합마커들을 통하여 유전자 발현 수준을 동시에 측정할 수 있으므로 대장암을 조기에 정확하게 진단할 수 있고, 진단의 신뢰도를 높일 수 있는 장점이 있다.

Description

대장암 관련 마커를 이용한 대장암 진단 키트 및 이를 이용한 대장암 진단 방법{Diagnostic kit of colon cancer using colon cancer related marker, and Diagnostic method therof}
본 발명은 대장암 관련 마커를 이용한 대장암 진단 키트 및 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 대장암 특이적인 유전자에 대한 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질 발현 수준을 측정하는 마커, 또는 상기 마커들을 적어도 둘 이상 포함하는 복합 마커를 함유하는 대장암 진단용 조성물과 이를 사용하여 대장암을 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
대장은 입으로 섭취된 음식물의 소화, 흡수가 이루어지는 곳이며, 잉여 음식물이 머무르는 곳이기도 하다. 또한, 이곳에서 수분을 흡수하여 대변이 만들어 지고, 이와 더불어 여러 종류의 많은 세균이 서식하는 곳이기도 하다. 사람의 경우, 대장의 길이는 약 2m 정도이고, 결장과 직장, 항문으로 구성되어 있다. 대장점막이 있는 곳이면 어디서나 암이 생기지만, 암이 생기기 쉬운 부위는 에스결장과 직장이다.
현재 우리나라에서 대장암 발생률은 매우 현저하게 증가하고 있다. 대장암에 의한 사망은, 남성의 경우 위암, 폐암, 간암에 이어 네 번째를 차지하고 있으며, 여성의 경우 또한 유사하다. 대장암 빈도는 남성이 여성보다 많은 것으로 조사되어 지고 있다. 연령별로는 50대가 가장 많고, 60대가 그 뒤를 잇고 있다. 우리나라는 유럽이나 미국과 비교했을 때, 발생 연령이 10살 정도 어린 경향이 있다. 5% - 10%의 빈도로 30대의 젊은 사람에게서도 발생하며, 이처럼 젊은 층에서 나타나는 대장암은 가족 사이에서 많이 발생하는 경향이 있기도 하다. 대장암의 발생에 영향을 미치는 것으로는 유전인자보다도 환경인자의 비중이 크다고 여겨지고 있는데, 식생활의 급격한 서구화, 특히 동물성 지방이나 단백질의 과다섭취가 원인이라고 인식되고 있다. 그러나 5% 전후의 대장암은 유전적 소인에 의해 발생한다고 알려져 있다. 이를 종합해보면, 대장암에 걸리기 쉬운 위험인자로서는 1) 대장용종에 걸린 경험이 있는 경우, 2) 가족력이 있는 경우, 3) 장기간 궤양성대장염에 시달리고 있는 경우, 4) 고치기 어려운 치루에 걸린 경우 등이 있다.
대장암에는 듀케스(Dukes) 분류법과 UICC의 단계(stage) 분류법이 대표적이다. 그 기준은 암의 크기에 의해서가 아니라, 대장벽 속으로 암이 들어간 깊이 및 원격전이의 유무에 따라 진행도가 규정되어 있다. 하기의 표 1 및 표 2는 각각 듀케스(Dukes) 분류법 및 단계(stage) 분류법의 구분기준을 설명한 것이다.
[표 1]. 듀케스(Dukes) 분류법의 특징
Figure 112008073166757-pat00001
[표 2]. 단계(stage) 분류법의 특징
Figure 112008073166757-pat00002
두 가지의 분류 방식에는 아주 작은 차이가 있을 뿐이기 때문에, Dukes A는 0기, 1기에, Dukes B는 2기에, Dukes C는 3기에, Dukes D는 4기에 해당하는 것이라고 현재 통용되고 있으며, 특히 Dukes 분류는 국제적으로 널리 쓰이고 있는 방법이다.
대장암은 조기 발견 시 내시경 적절제나 외과요법에 의해 완전히 치유될 수 있으며, 진행되어 간이나 폐로 전이(원격전이) 되었더라도 수술이 가능한 시기라면 외과요법에 의한 완치를 기대할 수 있다. 다시 말하자면, 현재의 치료법 중에서는 외과 요법이 가장 효과적이라 하겠다. 그러나 발견이 늦어지면 폐, 간, 림프 절이나 복막 등 절제하기 어려운 곳으로의 전이가 일어나기 때문에 상기의 경우처럼 외과요법을 사용할 수 없고, 궁극적으로는 대장암의 효과적인 치료를 위해서는 조기 진단 및 치료가 필수적이라 하겠다.
외과적 요법으로서 수술을 받은 이후에는 재발하는 경우가 종종 있으므로, 수술 후에는 3 ~ 4개월 간격으로 재발유무를 점검하기 위한 정기검사를 받아야 한다. 신체 내의 장기들 중에서 간, 폐, 복막 등이 재발하기 쉬운 장기이며, 또 절제한 부위에서 국소적으로 재발하기도 한다. 대장암은 다른 암과 비교할 때 빠른 시기에 재발이 발견되며, 재발한 병소를 절제하여 완전히 치료할 수도 있다. 재발의 80% 이상은 수술 후 3년 이내에 발견되므로, 수술 후 5년 이내에 재발하지 않는 것이 완치의 기준이 된다.
대장암은 조기인 경우라면 거의 100% 가까이 완치되지만, 일반적으로 자각증상이 없기 때문에 무증상인 시기에 발견하는 것은 매우 어렵고 주기적인 검사가 선행되어야 한다. 대장암의 선별검사(screening)로서 대표적인 것은 잠혈 검사이나, 이 검사에서 양성반응이 나왔다고 해서 대장암에 걸렸다는 것은 아니고, 또 역으로 음성반응이라고 해서 대장암에 걸리지 않았다라고 말할 수 있는 것도 아니어서 정확한 진단용도로 사용되기에는 무리가 있다. 따라서 현재 사용되고 있는 유효한 결과를 보장하는 대장암 검사법은 아래 표 3과 같다.
[표 3]. 대장암 검사법
Figure 112008073166757-pat00003
현재까지 대장암을 조기에 발견할 수 있는 대장암 특유의 종양 표지자는 아직 밝혀진 바 없다. 물론, CEA라고 불리는 표지자가 있으나, 상기의 표 3에서도 언급한 바와 같이 대장암에 있어서 약 반수가 양성을 나타낼 뿐이므로, 주로 대장암의 진행도와 치료효과를 판정하는 지표로서 사용되고 있을 뿐, 초기의 진단을 위한 표지자로 사용하기에는 다소 무리가 있다.
AZGP1(alpha-2-glycoprotein 1, zinc-binding) 유전자는 295의 아미노산, 33872 Da을 지니는 단백질로서 분비 단백질이다.
CXCL6 유전자는 Size가 114 아미노산, 11,897 Da의 단백질로서 분비 단백질이고, 뉴트로필(neutrophile), 과립백혈구(granulocytes)에 대한 화학주성(Chemotactic) 기능을 지니고 있다.
EGFL6(EGF-like-domain, multiple 6) 유전자는 사이즈가 553 아미노산, 61317 Da이며, 태아 조직(fetal tissues)에서 측정된다. 선행연구로 미국특허 6,808,890호가 있다.
AGT 유전자는 안지오텐시노겐(angiotensinogen, serpin peptidase inhibitor, clade A, member 8)으로서 사이즈는 485 아미노산, 53154 Da 이며, 임신 기간 동안 PRG2의 전구 형태(proform)를 지닌 이황화 결합된 헤테로 테트라머(disulfide-linked 2:2 heterotetramer)와 프로-피알지2(pro-PRG2) 및 C3 단백질과 복합체로 존재하며 분비 단백질이다. 암과 관련되어 췌장관 암조직(pancreatic ductal cancer tissues, Ohta T, Amaya K, Yi S, Kitagawa H, Kayahara M, Ninomiya I, Fushida S, Fujimura T, Nishimura G, Shimizu K, Miwa K. Angiotensin converting enzyme-independent, local angiotensin II - generation in human pancreatic ductal cancer tissues. Int J Oncol. 2003 Sep;23(3):593-8), human male germ cell tumors( Murty VV, Li RG, Mathew S, Reuter VE, Bronson DL, Bosl GJ, Chaganti RS. Replication error-type genetic instability at 1q42-43 in human male germ cell tumors. Cancer Res. 1994 Aug 1;54(15):3983-5)에서 보고 된 바 있다.
CXCL 3(C-X-C chemokine ligand 3)은 Size가 107 아미노산, 11342 Da인 분비 단백질로 세포외 공간(extracellular space)에 존재한다. 뉴트로필(Neutrophils)에 대한 화학주성(chemotactic) 활성을 지니고 있고, 염증(inflammation) 반응 시 중요한 역할을 담당한다.
이에 본 발명자들은 대장암과 관련이 있다고 예상되는 유전자들을 대상으로 DNA 칩을 사용하여 대장암은 물론 위암, 유방암, 전립선암, 간암 등과 정상 조직에서의 발현 정도를 비교하였고, 그 결과, 대장암 조직에서만 특이적으로 과발현되는 전자들을 선별하고, 선별된 대장암 진단마커로서의 가능성 있는 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 유전자에 특이적인 마커 또는 이들의 복합마커들을 통하여 유전자 발현 수준을 동시에 측정하여 대장암을 조기에 정확하게 진단할 수 있고, 진단의 신뢰도를 높일 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P로 이루어진 군에서 선택된 마커 또는 이들의 복합마커를 통하여 대장암을 진단할 수 있는 대장암 진단 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P로 이루어진 군에서 선택된 마커 또는 이들의 복합마커를 통하여 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 마커를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 대장암 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나의 유전자에 대한 mRNA의 발현 수준을 측정하는 마커, 또는 상기 마커들을 적어도 둘 이상 포함하는 복합 마커를 함유하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염 기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 마커, 또는 상기 마커들을 적어도 둘 이상 포함하는 복합 마커를 함유하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열은 갖는 유전자 군은 각각 서열번호 1의 AZGP1(alpha-2-glycoprotein 1)유전자, 서열번호 2의 CXCL3(C-X-C chemokine ligand 3) 유전자, 서열번호 3의 CXCL6[chemokine (C-X-C motif) ligand 6 ,granulocyte chemotactic protein 2]유전자, 서열번호 4의 AGT[angiotensinogen(serpin peptidase inhibitor, clade A, member 8)] 유전자, 서열번호 5의 FCGR3A 유전자, 서열번호 6의 Col5A2(collagen, type V, alpha 2) 유전자, 서열번호 7의 S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자, 서열번호 8의 EGFL6(EGF-like-domain, multiple 6) 유전자, 및 서열번호 9의 CTHRC1(collagen triple helix repeat containing 1) 유전자로 이루어진 유전자 군이다.
본 발명에서 상기 대장암 진단용 조성물은 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나의 유전자에 대한 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질 발현 수준을 측정하는 마커도 될 수 있으나, 바람직하게는 이들 마커들의 복합 마커인 것이 좋다. 본 발명에서 복합 마커는 어느 하나의 유전자에 대한 mRNA의 발현 수준과 상기 유전자의 단백질 발현 수준을 측정하는 마커들로 이루어진 복합 마커일 수 있으며, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 적어도 둘 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질 발현 수준을 측정하는 복합 마커일 수 있다. 본 발명의 상기 대장암 진단용 조성물이 상기 복합 마커로 구성되는 경우, 대장암의 발생과 진행에 있어 대장암과 연관된 상기 유전자들의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자들에 의해 코딩되는 단백질 발현 수준을 동시에 측정할 수 있으므로 대장암의 진단에 있어서 조기에 정확하게 진단할 수 있고, 진단의 신뢰도를 높일 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장암 환자에서 채취된 생물학적 시료에서 상기 유전자의 발현 변화를 분석한 결과 정상 대조군과 비교할 때 2 내지 9 배 이상으로 발현이 증가되는 유전자들임을 알 수 있었다.
본 발명의 상기 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열 또는 이들이 코딩하는 폴리펩타이드(또는 아미노산) 서열은 이들과 서열 상동성을 갖는 염기서열 또는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
본 발명에서 용어 "서열 상동성(Sequence homology)" 은 둘 이상의 핵산, 폴리뉴클레오타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드 사이에서 서열 관계를 기재할 때 사용되고, 문맥에서 (a) 참고 서열(reference sequence), (b) 비교 윈도우(comparison window), (c) 서열동정(sequence identity), (d) 서열 동정의 퍼센트 및 (e) 실재적 동정(substantial identity) 또는 "상동(homologous)" 을 포함하는 용어들과 함께 결부되어 이해될 수 있다.
(a) 상기 "참고 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로 사용되는 명시된 서열이다. 참고 서열은 예를 들면, 온 길이(full length) cDNA 또는 유전자 서열, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열의 절편과 같이 특이적 서열의 작은 부분 또는 전체 가 될 수 있다.
(b) "비교 윈도우"는 폴리뉴클레오타이드 서열이 연속하고 특이적인 절편에 대한 레퍼런스(reference)를 포함하고, 여기에서 폴리뉴클레오타이드 서열은 참고 서열과 비교될 수 있으며, 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부는 두 서열들의 최적 배열을 위하여 참고 서열(부가, 치환 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교하여 부가, 치환 또는 결실(즉, 틈(gaps))을 포함할 수 있다. 일반적으로, 비교 윈도우는 20개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드 길이가 되고, 선택적으로 30, 40, 50, 100 또는 그 이상이 될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열에서 틈의 포함으로 인하여 참고 서열과 비교하여 오해되는 높은 유사성을 피하기 위하여 틈 벌칙(gap penalty)이 일반적으로 도입되고 다수의 조화들(matches)로부터 제거됨은 당업자에게 자명한 것이다.
비교를 위한 서열 배열 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은 스미스와 워터만(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981)의 국부적 상동성 알고리듬(local homology algorithm)에 의해; 니들맨과 운쉬(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970)의 상동성 배열 알고리듬에 의해; 피어손과 립맨(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 2444, 1988)의 유사 방법을 위한 조사에 의해; 인텔리제네틱스(Intelligenetics)에 의한 PC/진 프로그램에서 CLUSTAL, 마운틴 뷰(Mountain View), 캘리포니아(California), GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)에서 TFASTA, 제네틱스 컴퓨터 그 룹[(Genetics Computer Group; GCG), 7 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA; Higgins and Sharp, Gene, 73: 237-244, 1988]에 의해 잘 기재되어 있는 CLUSTAL 프로그램을 포함하는 이들 알고리듬의 컴퓨터 처리된 수단들에 의해 수행될 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 데이터베이스 유사성 조사에 사용될 수 있는 프로그램의 BLAST 집단은 뉴클레오타이드 데이타베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 문의 서열을 위한 BLASTN; 단백질 데이타베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 문의 서열을 위한 BLASTX; 단백질 데이타 베이스 서열에 대한 단백질 문의 서열을 위한 BLASTP; 뉴클레오타이드 데이타베이스 서열에 대한 단백질 문의 서열을 위한 TBLASTN; 및 뉴클레오타이드 데이타베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 문의 서열을 위한 TBLASTX를 포함한다(Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995 참조). 상기 프로그램 또는 새로운 프로그램의 신규 버젼들은 대체적으로 앞으로 이용가능 하게 될 것이 명백하고 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
(c) 두 개의 핵산 또는 폴리펩타이드 상황에서 "서열 상동성" 또는 "상동성"은 특이적 비교 윈도우를 통하여 최대 일치로 조절되는 경우에 동일하고 통상적인 부가, 결실 및 치환할 수 있는 두 개의 서열들에서 잔기들에 레퍼런스를 포함한다. 서열 상동성 퍼센트가 단백질에 대한 레퍼런스로 사용될 때, 보존하는 아미노산 치환에 의하여 동일하지 않고 종종 다른 잔기 위치들을 인식하며, 이 아미노산 잔기들은 유사한 화학 특성(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 가지는 다른 아미노산 잔기들과 치환되어 분자의 기능적 특성들을 해롭게 변화시키지 않는다. 서열들이 보 존하는 치환과 다른 경우, 서열 동정 퍼센트는 치환의 보존 특성을 정정하여 상향 조절될 수 있다. 이러한 보존 치환에 의해 달라지는 서열들은 서열 유사성을 가지게 된다. 이러한 조절을 위한 접근들은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로 이것은 충분한 부조화 보다 부분적으로 보존 치환을 점수화하고 이로 인해 서열 상동성의 퍼센트를 증가시키는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들면, 동일한 아미노산에 1점을 주고 비-보존 치환에 0점을 주는 경우, 보존 치환에는 0과 1 사이의 점수가 주어진다. 보존 치환의 점수화는 알고리즘(Meyers and Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17, 1988)에 의하여 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA)에서 제공되는 대로 산출된다.
(d) "서열 상동성의 퍼센트"는 비교 윈도우를 통하여 최적으로 조절된 두 개의 서열들을 비교하여 결정된 값을 의미하며, 여기에서, 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부분은 두 개의 서열들의 최적 배열을 위한 참고 서열(부가, 치환 및 결실을 포함하지 않는다)과 비교하여 부가, 치환 또는 결실(틈)을 포함할 할 수 있다. 퍼센트는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 비교 윈도우에서 다수의 총 위치에 의하여 다수의 조화된 위치들이 분리되고 서열 상동성의 퍼센트를 얻기 위하여 100으로 결과를 곱하여 다수의 조화된 위치들을 수득할 수 있는 두 개의 서열들에서 발생하는 다수의 위치에서 결정하여 산출된다.
(e) (i) 이들의 다양한 문법적 형태에서 용어 "실제 상동성" 또는 "상동"은 표준 매개변수를 사용하여 기재된 조절 프로그램 중 하나를 사용하여 참고 서열과 비교하여 요구되는 상동성, 예를 들면, 약 60% 이상의 상동성, 바람직하게는 약 70% 이상의 상동성 보다 바람직하게는 약 80% 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성, 더 더욱 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 가지는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 기술 중 하나는 이들 값들이 계측 코돈 퇴보(account codon degeneracy), 아미노산 유사성, 판독 프레임 포지션 등으로 인하여 두 개의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 단백질의 일치하는 상동성을 결정하기 위하여 적절하게 조절될 수 있다.
이들 목적을 위한 아미노산 서열들이 실제 상동성은 정상적으로 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70%, 80% 또는 90% 이상이고, 보다 더욱 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 상동성을 의미한다. 뉴클레오타이드 서열들이 실제로 동일한 다른 예시는 두 개의 분자들이 엄격한 조건 하에서 각각 서로 하이브리드화 한다. 그러나 엄격한 조건 하에서 각각 서로 하이브리드화 하지 않는 핵산들은 이들이 인코드하는 폴리펩타이드가 실제로 동일하다면 아직 실제로 동일한 것이다. 예를 들면, 핵산 사본이 유전자 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 퇴보를 사용하여 생산되는 경우에 발생할 수 있다. 두 개의 핵산 서열이 실제로 동일한 하나의 예시는 이러한 교차-반응성이 실제로 동일하다고 여겨지기 위하여 두 개의 폴리펩타이드들에서 요구되지는 않지만, 첫 번째 핵산 인코드가 두 번째 핵산에 의해 인코드되는 폴리펩타이드와 면역 교차 반응하는 폴리펩타이드이다.
(e) (ii) 펩타이드 상태에 이들의 다양한 문법적 형태에서 용어 "실제 상동성" 또는 "상동"은 특이적 비교 윈도우를 통하여 참고 서열에 대하여 요구되는 상동성, 예를 들어, 약 60% 이상의 상동성, 바람직하게는 70% 이상의 서열 상동성, 보다 바람직하게는 80%, 보다 더 바람직하게는 85%, 더욱 더 바람직하게는 90% 또는 95% 이상, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 펩타이드를 말한다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 대장암 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 용어, “대장암(colon cancer)”은 대장의 가장 안쪽 표면인 점막에서 발생한 암으로, 직장암, 결장암 및 항문암을 통칭한 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, “진단용 마커, 진단하기 위한 마커, 또는 진단 마커(diagnosis marker)”란 대장암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 대장암을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함하며, 이들 유기 생체 분자들의 생체 내 발현 변화를 측정할 수 있는 프라이머와 항체들도 포함한다. 본 발명의 목적상, 대장암 진단 마커는 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P로 이루어진 서열번호 1 내지 서열번호 9의 유전자 군에서 선택된 하나 이상의 유전자들의 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자와 상기 mRNA의 생체 내 발현양상을 확인할 수 있는 프라이머 세트나 DNA 칩, 또는 상기 단백질의 생체 내 발현양상을 확인할 수 있는 항체를 들 수 있다.
유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 본 발명에서 유의성 있는 진단 마커라 함은 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도가(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 대장암 진단 마커는, 대장암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 항상 증가하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.
이 때, 정상 대장 상피 세포와 대장암 세포에서 거의 동일한 양으로 발현되는 유전자들은 제외하고, 예를 들어 대조군으로 사용한 정상 조직에서 발현되는 유전자들에 비해 대장암 조직에서 발현이 2 - 9배 이상으로 증가되는 유전자들을 선별하였다.
본 발명의 대장암 진단용 조성물에서, 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 마커는 대장암 세포에서 발현되는 mRNA의 발현 변화를 측정할 수 있는 어떠한 마커도 될 수 있으나 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트인 것이 좋고, 상기 프라이머는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열에 동시에 상보적으로 결합하고, 서열번호 10 내지 서열번호 27의 염기서열에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트인 것이 좋다.
본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상 보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방 사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 대장암 진단 마커 검출용 조성물은, 본 발명의 대장암 진단용 유전자인 AZGP1, CXCL3, CXCL6, AGT, FCGR3A, Col5A2, S100P, EGFL6, 또는 CTHRC1 중에서 1개 또는 그 이상의 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다(표 4).
[표 4]
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본 발명의 대장암 진단용 조성물에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 마커는 대장암 세포에서 발현되는 단백질의 발현 변화를 측정할 수 있는 어떠한 마커도 될 수 있으나 바람직하게는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자(AZGP1, CXCL3, CXCL6, AGT, FCGR3A, Col5A2, S100P, EGFL6, 또는 CTHRC1)의 단백질에 특이적인 항체인 것이 좋다.
본 발명에서, “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 대장암 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기한 대장암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol. 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 대장암 진단용 조성물에서, 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)인 것이 바람직하다. 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)인 것이 바람직하다.
본 발명의 대장암 진단용 조성물에서, 상기 항체는 서열번호 1 내지 서열번호 9의 유전자에의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 어떠한 항체도 될 수 있으나, 바람직하게는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트에 포함된 항체인 것이 좋다.
본 발명의 상기 대장암 진단용 조성물에서, 상기 면역크로마토그래피 스트립은 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); (b) 시료 내의 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자의 단백질과 결합하는 결합 패드(conjugate pad); (c) 상기 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자의 단백질에 대한 단일클론 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응 막(test membrane); (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 대장암 진단용 조성물에서, 상기 루미넥스 어세이 키트, 상 기 단백질 마이크로어레이 키트, 및 상기 엘라이자 키트는 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자의 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체, 그리고 표지물질이 결합된 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 2차 항체를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나의 유전자에 대한 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 1개 또는 그 이상의 마커의 복합구성을 통해 상기 본 발명의 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에서 “mRNA 발현수준 측정”또는 “mRNA 발현 변화 측정”이란 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 대장암 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “단백질 발현수준 측정”또는 “단백질 발현 변화 측정”이란 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 대장암 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
구체적인 일 양태로서, 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 대장암 진단용 키트에서, 상기 키트는 대장암 진단에 사용될 수 있는 어떠한 형태의 키트도 될 수 있으나 바람직하게는 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription - polymerase chain reaction) 키트, 면역학적 도트 키 트, 엘라이자(ELISA) 키트, 면역 크로마토그래피 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 및 DNA 칩 키트 중 어느 하나인 것이 생물학적 시료 중의 mRNA 또는 단백질의 발현 변화를 신속하고 정확하게 측정하여 대장암을 진단할 수 있으므로 좋다. 바람직하게, 상기 대장암 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명의 대장암 진단용 키트에서, 상기 루미넥스 어세이 키트는 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자의 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체와 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 효소 결합 2차 항체를 포함한다. 본 발명의 루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 소량(10-20ul)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 어낼라이트(analyte)를 동시에 측정할 수 있는 고용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg단위), 빠른 시간내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 엘라이자(ELISA)나 엘리스팟(ELISPOT)을 대체할 수 있는 분석방법이다. 루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 96-웰 플레이트(well plate)에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트(multiplexed fluorescent microplate) 분석방법으로 두 종류의 레이져 감지기(laser detector)를 사용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도록 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드(red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드(orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도(intensity)의 차이를 보이며 그 사이의 비드(bead)들은 레드(red)와 오렌지(orange)의 비율(ratio)이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100개의 색-코드 비드 세트(color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 단백질의 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반응으로 단백질 정량이 가능하다. 이 시료는 두개의 레이저(laser)를 사용하여 분석하는데, 하나의 레이저(laser)는 비드(bead)를 감지(detection)하여 비드 고유번호를 알아내고, 다른 레이저는 비드에 붙어 있는 항체와 반응한 시료 속의 단백질을 감지하게 된다. 따라서 한 웰에서 동시에 100가지의 생체 내 단백질 분석이 가능하다. 이 분석은 15μl 정도의 적은 시료로도 감지가 가능한 장점이 있다.
본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스(Luminex) 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.
또 다른 양태로는, 바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, 엘라이자(ELISA)를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 엘라이자(ELISA) 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 엘라이자(ELISA) 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 엘라이자(ELISA) 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 대장암 진단용 키트에서, 상기 대장암 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 대장암 진단 키트는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 래피드 테스트(Rapid test)를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 본 발명에서 면역크로마토그래피 스트 립(Immunochromatographic strip)을 포함하는 래피드 테스트 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, 본 발명의 대장암 진단용 키트는 복합마커를 동시에 분석하기 위한 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 본 발명에서 단백질 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 칩 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 단백질 마이크로어레이는 슬라이드에 결합된 상기 단백질에 대한 다클론 항체 및 상기 단백질에 대한 단일클론 항체와 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 효소 결합 2차 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군(AZGP1, CXCL3, CXCL6, AGT, FCGR3A, Col5A2, S100P, EGFL6, 또는 CTHRC1)에서 선택된 한개 이상의 유전자에 특이적이며, 염기서열 10 내지 염기서열 27의 서열 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 사용하여 대장암 의심 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 mRNA의 발현 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA의 발현 수준을 측정하는 방법을 제공한다.
생물학적 시료에서 mRNA를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 mRNA 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 대장암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 대장암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 대장암 의심 환자의 실제 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다.
mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 대장암 마커로 사용되는 유전자에 특이 적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.
상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 대장암 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 대장암 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다. 한편, DNA 칩은 상기 대장암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 대장암의 발병 여부를 판독할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군(AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P)에서 선택된 1개 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 대장암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법을 제공한다.
생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 단백질 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법에 있어서, 상기 생물학적 시료는 대장암 발병에 의해 대장암 마커의 유전자 발현 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 단백질의 수준을 측정하는 방법에 있어서, 면역크로마토그래피 어세이, 면역학적 도트(Immunodot) 어세이, 루미넥스(Luminex) 어세이, 엘라이자 어세이, 단백질 마이크로어레이 어세이, 면역염색법 어세이, 웨스턴 블랏 어세이, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 면역학적 도트 어세이에 의한 단백질 발현 수준의 측정은 (a) 막에 생물학적 시료를 점적(dotting)하는 단계; (b) 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 상기 점적된 막에 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 반응시킨 막에 표시체가 접합된 2차 항체를 첨가하고 발색시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 엘라이자 어세이는 (a) 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체 1을 고상체에 흡착시키는 단계; (b) 상기 고상체에 흡착된 항체 1과 대장암 의심 환자의 생물학적 시료를 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자에 의 해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체 2를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 샌드위치 엘라이자 어세이인 것이 바람직하며, 상기 단백질 마이크로어레이 어세이는 (a) 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 다클론 항체를 칩에 고정시키는 단계; (b) 상기 고정된 다클론 항체 1을 대장암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 서열번호 1 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 대장암 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 대장암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 대장암 진단에 필요한 정보를 제공를 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 대장암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택 할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민, DAP 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ , [RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, 엘라이자(ELISA) 어세이를 이용하는 것이다. 본 발명에서 엘라이자 어세이는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 엘라이자, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 엘라이자, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 엘라이자, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 엘라이자 등 다양한 엘라이자 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 엘라이자 방법에 의해서 검출한다. 대장암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 대장암 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏 어세이를 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 대장암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한 바람직하게는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 명역크로마토그래피 진단 키트일 수 있다. 면역크로마토그래피 스트립(Immunochromatographic strip)을 이용한 래피드 테스트(rapid test) 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, 복합마커를 동시에 분석하기 위한 루미넥스 어세이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 루미넥스 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, 복합마커를 동시에 분석하기 위한 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 대장암 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역 조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 대장 상피 조직 및 대장암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 um 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지여부를 판독한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. DNA 칩을 이용한 대장암 과발현 유전자 발굴
정상 대장 상피세포에 비하여 대장암 세포에서만 특이적으로 과발현하는 유전자를 1차적으로 추출하고자 DNA 칩(일루미나에서 판매하는 48K 사람 마이크로어레이)을 이용하여 2,230개의 유전자에 대하여 그 발현도를 조사하였다.
우선, 정상 대장 상피세포 및 대장암 세포에서 총 mRNA를 추출하였다. 총 mRNA의 추출은 알앤이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit, QIAGEN사)를 이용하였고, 칩(Experion RNA StdSens, Bio-Rad사)을 이용하여 정량하였다. 하이브리드화를 위해 상기 추출된 총 mRNA를 일루미나 토탈프랩 RNA 증폭 키트(Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit, Ambion사)를 이용하였다. T7 올리고(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하고, 바이오틴-UTP(biotin-UDP)를 이용하여 시험관내 전사(in vitro transcription)를 실시하여 바이오틴-표지 cRNA(biotin-labeled cRNA)를 제조하였다.
제조된 cRNA는 나노드롭(NanoDrop)을 이용하여 정량하였다. 정상 대장 상피세포 및 대장암 세포에서 제조된 cRNA를 칩(Human-6 V2, Illumina사)에 하이브리드화하였다. 하이브리드화 후 비특이적 하이브리드화를 제거하기 위하여 버퍼(Illumina Gene Expression System Wash Buffer, Illumina사)를 이용하여 DNA 칩을 세척하였고, 세척된 DNA 칩은 스트렙토애비딘-Cy3(streptavidin-Cy3, Amersham 사) 형광 염색약으로 표지하였다.
형광 표지된 DNA 칩은 공촛점(confocal) 레이저 스캐너 (Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 분석기기(BeadStudio version 3, Illumina사)를 이용하여 정량하여 각 스팟의 형광 값을 정량하였다. 정량된 결과는 프로그램(Avadis Prophetic version 3.3, Strand Genomics사)의 퀀타일(quantile) 기능을 이용하여 보정하였다.
상기의 과정으로 얻어진 1,601개의 유전자 발현 정도 분석을 통하여 정상 대장 상피세포와 대장암 세포의 유전자 발현 양상을 비교 분석하고 대장암 세포에서 mRNA가 과발현된 유전자를 최종 선발하였다(표 5).
[표 5]
Figure 112008073166757-pat00005
실시예 2. 조직 및 세포에서의 mRNA 분리
역전사 중합효소 반응을 위하여 20명의 대장암 환자로부터 대장 정상 상피세포 조직과 대장암 세포조직을 적출하여 총 40개의 조직에서 mRNA를 분리하였다.
우선, 외과적 절제술로 적출된 조직들은 적출 즉시 멸균된 인산완충 식염수에서 혈액을 제거한 후, 액화질소로 동결하였다. 이후, 구아니디움 법(Guanidinium Method)에 의하여 총 mRNA를 분리, 싱글-스탭 RNA 분리(Single-Step RNA Isolation)를 수행하였다. 상기와 같이 분리한 총 mRNA는 스팩트로포토메터를 사용하여 정량한 후, 사용 전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다.
대장암 세포 주들은 총 10개를 선정하여(DLD-1, HT29. HCT116, colo205, SW480, SW620, SNU C1, SNU C2A, KM 12C, KM 12SM), 대한민국 서울시 종로구 연건동 28번지 소재 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받았다.
각각의 최적 배양배지인 DMEM(Invitrogen 사) 또는 RPMI1640(Invitrogen 사) 배지에 10%의 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS, Hyclon사) 및 페니실린/스트렙토마이신(1mg/ml Penicillin/ Streptomycin, Sigma사) 5-6 일간 배양시킨 후, 상기의 조직에서 mRNA를 분리하는 방법과 동일한 방법으로 구아니디움(Guanidinium Method)에 의해 총 RNA를 분리, 싱글-스탭 RNA 분리를 수행하였다. 분리된 RNA는 상기와 같이 스팩트로포토메터를 사용하여 정량하였고, 사용 전까지 -70℃ 냉동고에서 보관하였다.
실시예 3. 역전사 중합효소반응을 이용한 유전자 발현 비교
상기 실시예 1의 결과 선발된 대장암 특이 과발현 유전자들에 대해 역전사 중합효소 반응을 실시하였다.
프라이머의 제작을 위하여 각 유전자들의 전체 DNA 염기 서열을 NCBI의 코어 뉴클레오타이드(Core Nucleotide, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 얻었으며, 프라이머3(Primer3) 프로그램을 통하여 이들 유전자들의 프라이머 서열을 디자인 하였다. 상기와 같이 디자인된 프라이머를 이용하여, 중합효소 반응을 실시하여 각각의 유전자들의 발현정도를 확인하였다. 각각의 프라이머 서열은 하기 표 4에 기재하였다.
[표 4]
Figure 112008073166757-pat00006
역전사 효소반응을 위하여 상기 실시예 2의 조직 및 세포주에서 추출한 mRNA로부터 역전사 반응을 통해 만든 cDNA를 제작하였다. cDNA제작은 cDNA 합성 키트(AccuAcript High Fielity 1st Stand cDNA Synthesis Kit, STRATAGENE)를 이용하여 제작하였다.
상기 제작된 cDNA와 프라이머들을 사용하여 역전사효소 반응(1 cycle: 94℃ 5분; 2 내지 35 cycles: 94℃ 40초, 56℃ 40초, 72도 30초; final extension: 72℃ 7분)을 수행하였다.
그 결과 정상 대장 조직세포와 대장암 조직세포 간의 유전자 발현의 차이를 확인할 수 있었고, 상기 실시예 1의 결과와 동일하게 서열번호 1 내지 서열번호 9의 유전자가 대장암 세포주에서 정상 대장 조직세포에 비하여 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(도 1, 도 2).
실시예 4. 웨스턴 블랏을 이용한 혈청 내 단백질 발현량 비교
대장암 환자와 정상인의 혈청 내 발현 정도를 웨스턴 블랏을 이용하여 비교하였다.
우선, 대장암 환자 및 정상인으로부터 얻은 혈액에서 혈청을 분리하고, 동량 부피의 샘플 완충용액(125 mM Tris pH 6.8, 4% SDS, 10% 글리세롤, 0.006% 브로모페놀 블루, 1.8% BME)을 넣고 5분간 끓인 후, 12%의 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 단백질을 분리하였다. 분자 크기별로 분리된 단백질이 포함된 상기 전기영동된 젤을 니트로셀룰로오스 막과 접촉하고 전류를 통하게 하여 단백질을 니트로셀룰로 오스 막으로 이동시켰다. 이에 3% 우태아혈청 알부민이 포함된 TBST 용액(10mM Tris, 100mM 염화나트륨, 0.05% 트윈 20)에서 1시간 동안 블로킹 시킨 후 AGT 항체(R&D, 1:2000)를 넣고 4℃에서 하룻밤 교반시키면서 반응시켰다. 이후 여분의 항체를 PBST로 세척하여 제거하고, 퍼옥시다아제(Horse Radish Peroxydase)가 결합된 2차 항체(ABCAM, Rabbit polyclonal to Mouse IgG)를 넣고 4℃에서 교반시키면서 1시간동안 반응하였다. 이후, 니트로셀룰로오스 막을 밀리포어(MILLIPORE)사의 ECL의 수용액 A(solution A, Luminol과 enhancer 포함)와 수용액 B(Solution B, Hydrogen peroxide 포함)를 동량으로 섞어 1분간 잘 흔들어준 다음 멤브레인(membrane)의 물기를 적당히 제거한 후 필름카세트에 잘 붙이고 암실로 가서 현상하였다. EGFL6 및 CXCL-3도 마찬가지로 상기와 같은 방법으로 실시하였다. 그 결과, 정상인의 경우(1~3번 레인)에서는 AGT, EGFL-6, 및 CXCL-3 단백질이 검출되지 않거나 그 양이 적은 반면, 대장암 환자의 경우(4-7번 레인)에는 AGT, EGFL-6, 및 CXCL-3이 과발현 되어 상기 유전자의 단백질이 대장암 진단의 마커로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다(도 3).
실시예 5. 면역염색을 이용한 조직 내 단백질 발현량 비교
정상 대장 상피 조직과 대장암 조직에서의 단백질 존재여부 및 발현 위치를 확인하고자 조직 슬라이드를 대상으로 면역 염색을 실시하였다.
우선, 외과적 절제술을 통하여 대장암 환자들로부터 대장 정상 상피세포 조직과 대장암 세포조직을 적출하여 파라핀 포매 블록을 만들었다. 이를 마이크로톰 을 이용하여 5um의 두께로 잘라 유리슬라이드에 붙여 조직 슬라이드를 만들었다. 이들을 공지의 면역염색법으로 염색하여 현미경으로 조직 내 단백질의 존재 여부 및 위치를 확인하였다. 면역에 사용된 항체로는 항 EGFL-6-항체(Santa Cruz, 1:2000), 항 CTHRC1-항체(SANTA CRUZ, 1:1000), 및 항 CXCL-3-항체(Aviva, 1:2000), 항 AGT-항체(R&D, 1:2000) 이다. 그 결과, 면역조직화학 염색에서 EGFL6, CTHRC1 단백질은 세포막과 세포질에서 발현되었고, 정상 점막보다 강하게 발현되었으며, CXCL3의 경우 종양의 세포질 또는 핵에서 발현되었고, AGT의 경우 종양의 세포질과 세포막에서 발현되었으며, 상피세포(endothelial cells)에서도 발현되었다(도 4a 내지 도 4d).
실시예 6. 이뮤노 도트(immunodot) 분석에 의한 환자 혈청 중 단백질 측정
다클론 항체를 이용하여 이뮤노 도트 방법을 확립하여 정상혈청과 대장암혈청에서의 AGT, EFGL6, CXCL3, COL5A2, CTHRC1, 및 FCGR3A 단백질의 분비정도를 비교하였다. 나이트로 셀룰로오스 멤브레인에 5배(AGT, EFGL6, CXCL-3) 및 10배(Col5A2, CTHRC1, FCGR3A) 희석한 혈청시료(각 환자 당 10개체)를 2㎕씩 점적한 후 상온에서 건조시키고, 1% BSAT(bovine serum albumin in Tris-buffered saline) 용액으로 블로킹하였다. AGT 단백질에 대한 다클론 항체(R& D, 1:5000), EFGL6 단백질에 대한 다클론 항체(Santa Cruz, 1:5000), CXCL3 단백질에 대한 다클론 항체(Aviva, 1:5000), Col5A2 단백질에 대한 다클론 항체(1:5000), CTHRC1 단백질에 대한 다클론 항체(SantaCruz, 1:1000), FCGR3A 단백질에 대한 다클론 항체(1:5000) 를 반응시킨 후 2차 항체 접합 호스 래디쉬 퍼옥시데이즈(1:10000)를 가하고 DAB 용액(0.5㎎/㎖, diaminobenzidine in PBT)으로 발색시켰다. 스캔하여 발색 정도를 비교하였다(도 5). 대장암의 경우 정상보다 AGT, EGFL6, CXCL3, Col5A2, CTHRC1, 및 FCGR3A 단백질이 과량 발현되는 것을 알 수 있었고, 이들 유전자를 대장암 진단 및 예후에 유용한 마커로 사용가능 함을 알 수 있었다.
실시예 7. 엘라이자 시스템(ELISA system) 확립 및 이를 이용한 대장암 진단
7-1. 엘라이자 시스템(ELISA system)의 확립
AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질에 대한 단일클론 항체(1ug/ml)를 0.1M 카보네이트 버퍼(carbonate buffer, pH 9.6)를 이용하여 1ug/ml의 농도로 희석하고, 96-공 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에 100㎕씩 분주한다. 4℃에서 오버나이트 코팅을 한 후 0.05% 트윈 20이 포함된 PBS 용액(PBS-T)을 이용하여 3번 세척한다. 1% BSA 용액으로 상온에서 2시간 동안 블로킹 해 준 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척한다. 서열번호 1 내지 서열번호 9의 단백질을 희석하여 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 2시간 동안 반응한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척한다. AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질에 대한 다클론 항체(1:2000 희석)를 100㎕씩 희석한 후 2시간 동안 반응시키고 세척한다. 2000배 희석된 호오스 래디시 퍼옥시다아제가 접합된 2차 항체 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응한 후 3번 세척을 하고, 마지막으로 TMB용액을 이용하여 발색시킨다. 발색 된 시료의 흡광도는 450nm 파장에서 측정기(ELISA reader, Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정한다(도 6).
7-2. 엘라이자 시스템에 의한 환자 혈청 중 단백질의 측정
실시예 7-1에서 확립한 엘라이자 시스템(ELISA system)을 이용하여 환자의 혈청 중 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질 농도를 측정한다. 정상인, 대장암 환자의 혈청을 5배씩 희석한 후, 혈청 중 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질 농도를 계산한다.
실시예 8. 키트 제조 및 혈청 중 단백질의 측정
8-1. 샌드위치형 엘라이자 키트
다음의 구성요소들을 사용하여 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질 농도 측정용 키트를 제조한다:
A. 고상형 항체: 항체가 흡착된 마이크로타이터 플레이트로서, AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질에 대한 다클론 항체 100 ㎕를 마이크로타이터 플레이트에 가하고 4℃에서 하룻밤 동안 방치한 후 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시켜 제조한다.
B. 검출 항체: AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질에 대한 단일클론항체
C. 효소결합 항체: 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 결합된 2차항체 용액
D. 혈청 희석용액
E. 기질액(TMB)
F. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액(PBS-T)
G. 표준용액: AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질 표준액.
상기 키트를 이용하여 암 환자 중 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 또는 S100P의 혈청 희석 반응을 다음과 같이 검사한다.
상기 A의 고상형 항체에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(D)을 사용, 적절히 희석하여 웰당 100 ㎕씩 가한 후, B, C, E의 구성요소들을 사용하여 실시예 8-1에서 제조한 샌드위치형 엘라이자 키트를 사용하여 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질 농도를 검사한다.
8-2. 면역크로마토그래피 키트
8-2-1. 면역 크로마토그래피 스트립의 제조
1) 항체-금 접합체(Ab-gold conjugate) 제조
항체를 콜로이달 골드 파티클(colloidal gold particles) 용액에 15㎍/㎖ 가한 후 실온에서 2시간 회전시키면서 반응시킨 후 10% BSA를 1/10 vol. 가하여 1% 농도가 되도록 한 후 다시 1시간 동안 반응시킨다. 12,000 rpm에서 40분간 원심분 리하여 상등액을 버리고 다시 2mM 보레이트 버퍼(borate buffer)를 가하여 항체-금 접합체(Ab-gold conjugate) 용액을 세척한다. 반복하여 3회 세척한다. 마지막 세척 후에 1% BSA를 함유한 2mM 보레이트 버퍼를 골드 용액의 약 1/10 부피를 가해서 현탁시킨다. 측정기(UV spectrophotometer)로 530nm에서 흡광도를 측정한 후 흡광도가 3.00이 되도록 희석하여 사용한다.
2) 샘플 패드
시험하고자 하는 시료를 흡수하기 위한 부분으로서, 셀룰로오스 소재로 된 것을 사용한다. 상기 샘플 패드는 시료를 흡수 할 수 있는 어떠한 소재로 대체가능하다.
3) 글라스화이버(GF) 멤브레인
수크로오스가 포함된 20 mM 보레이트 버퍼(borate buffer)로 전처리한다.
4) 나이트로 셀룰로오스(NC) 멤브레인 및 라인 처리
나이트로 셀룰로오스 멤브레인(Millipore사)을 적당한 크기(0.7㎝ x 5㎝)로 자른 후, 플라스틱 백킹 하단에서 약 3.4 ㎝ 되는 지점에 대조 라인으로서 염소 항-양(sheep) IgG(goat anti-sheep IgG)를 직선 처리하고, 2.7 ㎝ 되는 지점에 판정 라인으로서 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질에 대한 단일클론항체를 직선 처리한 다음, 건조시켜 나이트로 셀룰로오스 멤브레인을 제조한다.
5) 흡수(absorbent) 패드
면역 반응 후 시료 내 미반응 물질들을 흡수하고, 이에 따라 분석 물질을 포 함한 시료 용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 하는 역할을 하도록 셀룰로오스 멤브레인을 사용한다.
6) 접착용 플라스틱 백킹
상기 실시예 8-2-1에서 제조된 면역 크로마토그래피 스트립(도 7)의 접착용 플라스틱 백킹 위에 샘플 패드, GF 멤브레인, NC 멤브레인 및 흡수 패드를 순서대로 장착하되, 물질이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동될 수 있도록 조립한다.
8-2-2. 결과 판정법
샘플패드에 60-70 ㎕의 시료(이때, 시료는 혈청과 용출 버퍼의 비를 1:5)가하고 3-5분 후 컨트롤 라인(control line)과 결과 라인(result line)의 발색 유무 및 발색 진하기를 관찰한다. 양성시료의 경우 컨트롤 라인과 결과 라인에서 적색의 착색 선을 관찰할 수 있으며, 음성시료의 경우 컨트롤 라인에서만 적색의 착색 선을 볼 수 있다.
8-3 루미넥스 키트
8-3-1. 루미넥스 키트 제조
AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질에 대한 다클론 항체를 비드(bead)에 접합한다. 시료를 희석하여 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 2시간 동안 반응한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척한다. 서열번호 1 내지 서열번호 9의 단백질에 대한 단일클론 항체를 100㎕씩 희석한 후 2시간 동안 반응시키고, 세척한다. 2000배 희석된 PE(phycoerythrin)가 접합된 2차 항 체 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응한 후 3번 세척을 하고, 루미넥스 기기로 측정한다. 강도(Intensity)와 농도와의 그래프를 그려 표준곡선을 산출한다.
8-3-2. 샌드위치형 루미넥스 키트
다음의 구성요소들을 사용하여 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질 농도 측정용 키트를 제조한다.
A. 고상형 항체: 형광비드가 흡착된 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질에 대한 다클론항체
B. 검출 항체 : AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질에 대한 단일클론항체
C. 효소결합 항체: 퍼옥시다아제가 결합된 2차 항체 용액
D. 혈청 희석용액
F. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액
G. 표준용액: AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질에 대한 표준용액
상기 키트를 이용하여 암 환자의 혈청 중 단백질 검출 반응을 다음과 같이 검사한다. A의 고상형 항체에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(D)을 사용, 적절히 희석하여 웰당 100 ㎕씩 가한 후, B, C, E의 구성요소들을 사용하여 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질을 검사한다.
8-4. 단백질 마이크로어레이 키트
8-4-1. 단백질 마이크로어레이 시스템(Protein microarray system)
AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질에 대한 다클론 항체를 프로테아젠(Proteagen)의 웰칩(Well chip)에 코팅한다. BSA용액으로 블로킹 한 후 혈청시료를 희석하여 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척한다. AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질에 대한 단일클론 항체를 100㎕씩 희석한 후 37도에서 1시간 동안 반응시키고 세척한다. 2000배 희석된 Cy3가 접합된 2차 항체 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 0.5시간 동안 반응한 후 3번 세척을 하고, 532nm에서 형광물질의 발광정도를 측정한다. 강도(Intensity)와 농도와의 그래프를 그려 표준곡선을 산출한다. 이렇게 제조된 단백질 마이크로어레이 시스템을 이용하여 환자의 혈청 중 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 또는 S100P 단백질 농도를 측정한다.
8-4-2. 샌드위치형 단백질 마이크로어레이 키트
다음의 구성요소들을 사용하여 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질 농도 측정용 키트를 제조한다.
A. 고상형 항체: 슬라이드에 결합된 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질에 대한 다클론 항체
B. 검출 항체: AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질에 대한 단일클론항체
C. 효소결합 항체: Cy3가 결합된 2차항체 용액
D. 혈청 희석용액
F. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액
G. 표준용액: AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질 표준액.
상기 키트를 이용하여 암 환자 중 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질의 혈청희석 반응을 다음과 같이 검사한다. 상기 A의 고상형 항체에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(D)을 사용, 적절히 희석하여 웰당 100 ㎕씩 가한 후, 상기 B, C, 및 E의 구성요소들을 사용하여 실시예 8-4-1과 같은 샌드위치형 측정방법으로 AZGP1, EGFL6, CTHRC1, CXCL3, CXCL-6, AGT, FCGR3A, Col5A2 및 S100P 단백질 농도를 검사한다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 대장암을 조기에 정확하게 진단하고, 대장암의 전이 및 예후를 판단할 수 있는 진단 마커들을 제공함으로써, 대장암의 치료 및 예후관리에 유용한 자료를 제공한다.
또한, 상기 대장암 진단 마커들은 대장암 특이적인 유전자의 mRNA 또는 그 단백질 발현 수준을 간이하고 신속하게 측정할 수 있으므로 대장암 특이적 항암제 개발연구에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 역전사 중합효소반응을 이용한 정상조직과 대장암 조직에서의 진단 마커의 발현정도를 확인한 전기영동 사진이다.
도 2는 10종의 대장암 세포주에서의 대장암 진단마커들의 발현정도를 역전사 중합효소반응을 통하여 나타낸 그림이다.
도 3은 웨스턴블럿을 통하여 정상인의 혈청과 대장암 환자의 혈청에서 AGT, EGFL6, CXCL3의 발현 여부를 확인한 그림이다.
도 4a 내지 도 4d는 면역조직염색법을 통하여 정상점막과 대장암 조직에서 단백질의 발현을 비교한 사진이다(a:EGFL6, b:CTHRC1, c;CXCL-3, d:AGT).
도 5a는 면역학적 도트 어세이의 원리를 나타낸 그림이다.
도 5b는 면역학적 도트 어세이를 통하여 정상 혈청과 대장암 혈청에서 단백질의 발현을 비교한 사진이다.
도 6은 엘라이자 어세이에서 확립된 AGT 단백질의 표준곡선을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 면역 크로마토그래피 스트립의 구성을 나타내는 도면이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Diagnostic kit of colon cancer using the colon cancer related marker, and Diagnostic method therof <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1247 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gataatatct gtgcctcctg cccagaaccc tccaagcaga cacaatggta agaatggtgc 60 ctgtcctgct gtctctgctg ctgcttctgg gtcctgctgt cccccaggag aaccaagatg 120 gtcgttactc tctgacctat atctacactg ggctgtccaa gcatgttgaa gacgtccccg 180 cgtttcaggc ccttggctca ctcaatgacc tccagttctt tagatacaac agtaaagaca 240 ggaagtctca gcccatggga ctctggagac aggtggaagg aatggaggat tggaagcagg 300 acagccaact tcagaaggcc agggaggaca tctttatgga gaccctgaaa gacatcgtgg 360 agtattacaa cgacagtaac gggtctcacg tattgcaggg aaggtttggt tgtgagatcg 420 agaataacag aagcagcgga gcattctgga aatattacta tgatggaaag gactacattg 480 aattcaacaa agaaatccca gcctgggtcc ccttcgaccc agcagcccag ataaccaagc 540 agaagtggga ggcagaacca gtctacgtgc agcgggccaa ggcttacctg gaggaggagt 600 gccctgcgac tctgcggaaa tacctgaaat acagcaaaaa 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Claims (18)

  1. CXCL3(C-X-C chemokine ligand 3) 유전자에 대한 mRNA의 발현 수준을 측정하는 마커를 함유하는 대장암 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유전자에 대한 mRNA 발현 수준을 측정하는 마커는 서열번호 2의 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 조성물.
  4. CXCL3 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 마커를 함유하는 대장암 진단용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 마커는 CXCL3 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질에 특이적인 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 단백질에 특이적인 항체는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트에 포함된 항체인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트.
  10. 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 CXCL3 유전자에 특이적이며, 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 사용하여 대장암 의심 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 mRNA의 발현 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 CXCL3 유전자에 대한 mRNA의 발현 수준을 측정하는 방법.
  11. 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 CXCL3 유전자에 의하여 코딩되는 단백질에 특이적인 항체를 대장암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성에 의해 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 CXCL3 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법.
  12. 제10 또는 제11항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 뇨로 구성된 군에서 선택된 생물학적 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준의 측정은 면역크로마토그래피 어세이, 면역학적 도트(Immunodot) 어세이, 루미넥스(Luminex) 어세이, 엘라이자 어 세이, 단백질 마이크로어레이 어세이, 면역염색법 어세이 및 웨스턴 블랏 어세이로 구성된 군에서 선택된 어느 하나에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 AZGP1(alpha-2-glycoprotein 1) 유전자, CXCL6[chemokine (C-X-C motif) ligand 6 ,granulocyte chemotactic protein 2]유전자, AGT[angiotensinogen(serpin peptidase inhibitor, clade A, member 8)] 유전자, FCGR3A 유전자, Col5A2(collagen, type V, alpha 2) 유전자, S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자, EGFL6(EGF-like-domain, multiple 6) 유전자 및 CTHRC1(collagen triple helix repeat containing 1)로 구성되는 유전자 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA의 발현 수준을 측정하는 마커를 추가로 포함하는 조성물.
  15. 제 4항에 있어서, 상기 조성물은 AZGP1(alpha-2-glycoprotein 1) 유전자, CXCL6[chemokine (C-X-C motif) ligand 6 ,granulocyte chemotactic protein 2]유전자, AGT[angiotensinogen(serpin peptidase inhibitor, clade A, member 8)] 유전자, FCGR3A 유전자, Col5A2(collagen, type V, alpha 2) 유전자, S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자, EGFL6(EGF-like-domain, multiple 6) 유전자 및 CTHRC1(collagen triple helix repeat containing 1)로 구성되는 유전자 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 마커를 추가로 포함하는 조성물.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 따른 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트.
  17. 제 10항에 있어서, 상기 방법은 AZGP1(alpha-2-glycoprotein 1) 유전자, CXCL6[chemokine (C-X-C motif) ligand 6 ,granulocyte chemotactic protein 2]유전자, AGT[angiotensinogen(serpin peptidase inhibitor, clade A, member 8)] 유전자, FCGR3A 유전자, Col5A2(collagen, type V, alpha 2) 유전자, S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자, EGFL6(EGF-like-domain, multiple 6) 유전자 및 CTHRC1(collagen triple helix repeat containing 1)로 구성되는 유전자 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 수준을 추가로 측정하는 단계; 및 상기 측정된 mRNA의 발현 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 11항에 있어서, 상기 방법은 AZGP1(alpha-2-glycoprotein 1) 유전자, CXCL6[chemokine (C-X-C motif) ligand 6 ,granulocyte chemotactic protein 2]유전자, AGT[angiotensinogen(serpin peptidase inhibitor, clade A, member 8)] 유전자, FCGR3A 유전자, Col5A2(collagen, type V, alpha 2) 유전자, S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자, EGFL6(EGF-like-domain, multiple 6) 유전자 및 CTHRC1(collagen triple helix repeat containing 1)로 구성되는 유전자 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 의하여 코딩되는 단백질에 특이적인 항체를 대장암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성에 의해 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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