KR101545551B1 - 인슐린 저항성 개선 효능을 갖는 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물 - Google Patents

인슐린 저항성 개선 효능을 갖는 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101545551B1
KR101545551B1 KR1020130154608A KR20130154608A KR101545551B1 KR 101545551 B1 KR101545551 B1 KR 101545551B1 KR 1020130154608 A KR1020130154608 A KR 1020130154608A KR 20130154608 A KR20130154608 A KR 20130154608A KR 101545551 B1 KR101545551 B1 KR 101545551B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bifidobacterium
kctc
accession number
lactobacillus
lactic acid
Prior art date
Application number
KR1020130154608A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150068670A (ko
Inventor
김성환
정지웅
안영태
허철성
Original Assignee
주식회사한국야쿠르트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사한국야쿠르트 filed Critical 주식회사한국야쿠르트
Priority to KR1020130154608A priority Critical patent/KR101545551B1/ko
Publication of KR20150068670A publication Critical patent/KR20150068670A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101545551B1 publication Critical patent/KR101545551B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212로 이루어진 인슐린 저항성 개선 효능을 갖는 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병의 예방 또는 개선 효과를 갖는 약학 조성물, 식품조성물, 발효유, 음료, 건강기능식품 등 다양하게 응용될 수 있다.

Description

인슐린 저항성 개선 효능을 갖는 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물{The composition containing combination of 7 probiotics which have efficacy preventing from insulin resistance which cause type 2 diabetes mellitus as a effector component}
본 발명은 인슐린 저항성 개선 효능을 갖는 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212로 이루어진 인슐린 저항성 개선 효능을 갖는 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 대표적인 만성질환으로 췌장의 베타세포에서 생성되는 인슐린 호르몬 부족 또는 인슐린 저항성의 이상과 나아가 이러한 두 가지 모두의 결함으로 발생하는 고혈당을 특징으로 하는 대사 장애 증후군이다. 이러한 당뇨병은 인슐린 의존형 당뇨병과 인슐린 저항 및 인슐린 분비 손상에 발생하는 인슐린 비의존형 당뇨병으로 나눌 수 있다.
한편, 인슐린 비의존형 당뇨병의 주요 원인이라고 알려진 인슐린 저항성이란 혈액을 통해 인슐린이 목표조직으로 이동하여 작용하였으나 목표조직에서 반응이 일어나지 않는 증상으로 인슐린의 주요 역할인 혈당강하와 지방분해가 일어나지 않아 당과 지방의 항상성 유지가 무너지는 증상이다. 따라서 인슐린 저항성을 보이는 사람은 혈당이 높고 혈중에 인슐린 양이 높게 유지된다. 이러한 증상이 계속되면 지방조직이나 근육 조직 등 말초 조직에서 당 흡수가 일어나지 않으며 간에서 당 생성이 계속 일어난다. 이러한 증상으로 인슐린 저항성이 계속 지속되며 비만과 지방간, 당뇨 등으로 진행된다. 최근에는 이러한 인슐린 저항성의 원인과 이를 개선하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다.
TNF-α(Tumer necrosis factor-α)는 다목적 사이토카인(multipurpose cytokine)의 일종으로 면역조절 및 사멸세포(apoptotic cell)의 사멸 및 종양세포(tumor cell)의 용해(lysis)에 관여를 한다. 최근의 연구에 따르면 TNF-α는 인슐린 신호전달(insulin signal transduction)을 억제함으로써 인슐린 저항성을 유도한다고 알려져 있다. TNF-α는 IRS-1(Ser)의 단백질 인산화를 증진한다고 한다. 이는 인슐린에 의한 IRS-1(Tyr)의 단백질 인산화를 억제시키는 결과를 가지고 오는데 이를 통해 인슐린에 의해 작용하는 신호경로(signal pathway)에 영향을 미치게 되어 최종적으로 포도당(glucose)을 유입하는 GLUT4에도 영향을 미치게 되는 것이다. 이러한 TNF-α는 지방조직 및 근육조직에 많이 발현이 되며, 비만 및 인슐린 저항성에 관여되어 있는 동물모델에서 역시 많이 발현된다고 알려져 있다. 한편, PPAR-γ, PGC-1α는 기존의 많은 논문을 통해서 비만과 당뇨동물모델의 근육 및 지방조직에서 저발현되어 있어 인슐린 민감성에 관여한다고 하여 이들 또한 인슐린 저항성과 깊은 관련이 있음이 증명되었다.
한편, 사람의 장, 김치와 치즈 같은 전통 발효식품 및 모유, 우유 등에 많이 존재하는 유산균은 인체의 소화계에 공생하면서 섬유질 및 복합 단백질을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당하며, 장내 pH를 산성으로 유지시켜 대장균이나 크로스트리디움(Chlostridum sp.)과 같은 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라, 비타민 합성, 혈중 콜레스테롤 저하 등의 역할을 한다. 특히 유산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특성이 있어 정장작용에 많은 도움을 준다.
이에 본 발명자들은 생후 7일 전의 태아의 분변에서 분리한 락토바실러스(Lactobacilus sp.) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium sp.)의 총 7가지 유산균 복합균주가 인슐린 저항성 개선 및 혈당조절 효능을 가짐을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212로 이루어진 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유함으로써 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물, 당뇨병 예방용 식품조성물, 당뇨병 예방용 발효유, 당뇨병 예방용 기능성 음료 및 당뇨병 예방용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212로 이루어진 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유한 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물, 당뇨병 예방용 식품조성물, 당뇨병 예방용 발효유, 당뇨병 예방용 기능성 음료 및 당뇨병 예방용 건강기능식품을 제공하는 것을 특징으로 한다.
특히, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유한 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물은 근육세포에서 GLUT4(glucose transporter type 4) 유전자, PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 및 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha) 유전자의 발현을 증가시킴으로써 근육세포 내 혈당흡수(glucose uptake)를 증가시킴으로써 인슐린 저항성을 개선하는 것을 특징으로 한다.
특히, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유한 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물은 STZ(Streptozotocin)에 의해 유도된 당뇨동물 모델에서 인슐린 분비저하로 인해 유발된 체중, 식이섭취량 및 당화혈색소(HbA1c)의 이상 및 인슐린 분비저하로 인해 증가된 혈중 포도당(glucose)의 양을 간과 근육조직 내 포도당(glucose) 유입증가와 글리코겐(glycogen)의 합성을 증진시킴으로써 인슐린 저항성을 개선하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005(기탁번호: KCTC 12514BP), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(기탁번호: KCTC 12419BP), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101(기탁번호: KCTC 12418BP), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201(기탁번호: KCTC 12515BP), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023(기탁번호: KCTC 12512BP), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037(기탁번호: KCTC 12409BP) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212(기탁번호: KCTC 12513BP)은 생후 7일 이내의 신생아의 분변으로부터 분리 및 동정된 신규한 균주로서 생명공학연구원 유전자은행에 각각 단일균주로 기탁하였다.
근육세포의 당의 이용성을 살펴보면 베타 췌장세포에서 분비되는 인슐린과 근육세포내의 인슐린 수용체(receptor) 및 GLUT4가 밀접하게 관여한다. 혈중 내의 포도당(glucose) 같은 당은 지방세포 및 근육 조직 등의 각 기관에서 사용을 하게 되는데 근육세포의 경우 인슐린의 작용으로 인해서 인슐린 수용체의 작용으로 인해 인슐린 신호(insulin signal)가 작동을 하게 된다. 최종적으로 GLUT4의 발현 및 근육세포내의 전좌(translocation)의 증가로 인해서 혈중 내의 포도당(glucose)이 근육내로 들어오게 되어 글리코겐 등으로 합성 및 이용을 할 수 있게 된다. 하지만 이러한 과정에서 TNF-α나 팔미트산(palmitic acid)와 같은 지방산이 작용하게 되면 인슐린 신호 기작에 이상이 생겨서 GLUT4의 발현 및 전좌(translocation)에 이상이 생기되어 혈중 내 포도당(glucose)의 유입이 잘 이루어지지 않는다.
본 발명에서는 정상적인 레트(rat)의 근육 세포인 L6 골격근세포(Skeletal muscle cell) 또는 TNF-α에 의해 인슐린 저항성이 유도된 레트(rat)의 근육 세포인 L6 골격근세포(Skeletal muscle cell)를 이용하여 포도당(glucose) 유입을 증가시켜 주는 7종의 유산균(비피도박테리움 롱검 HY8005, 비피도박테리움 인판티스 HY8401, 비피도박테리움 락티스 HY8101, 비피도박테리움 브레베 HY8201, 락토바실러스 애시도필러스 HY7037, 락토바실러스 가세리 HY7023, 락토바실러스 카제이 HY7212)을 선별하였다.
또한, 혈중 인슐린이 근육 및 지방세포에 도달하게 되면 PPAR-γ 및 PGC-1α등과 같은 인슐린 민감성에 관여하는 인자들이 증가하게 되는데 인슐린 저항성이 유도가 되면 이들의 발현이 줄게 되어 GLUT4의 발현 및 전좌(translocation)에 영향을 미친다.
본 발명에서는 TNF-α에 의해 인슐린 저항성이 유도된 레트의 근육 세포인 L6 골격근세포(Skeletal muscle cell)을 이용하여 PPAR-γ와 PGC-1α의 발현을 증가시켜 주는 7종의 유산균(비피도박테리움 롱검 HY8005, 비피도박테리움 인판티스 HY8401, 비피도박테리움 락티스 HY8101, 비피도박테리움 브레베 HY8201, 락토바실러스 애시도필러스 HY7037, 락토바실러스 가세리 HY7023, 락토바실러스 카제이 HY7212)을 선별하였다.
한편, STZ(Streptozotocin)를 주입한 동물모델에서 STZ로 인해 췌장의 베타세포가 파괴되어 정상적인 인슐린의 분비가 저해가 되게 된다. 이로 인해서 인슐린의 의존적 당뇨질환이 유발이 되게 되는데 당뇨가 유발되어 혈중 내 포도당(glucose)의 양이 늘어남은 물론, 포도당(glucose)의 증가로 인해 당화혈색소(HbA1c)도 증가하게 된다. STZ(Streptozotocin)로 인해 체중이 급격히 감소가 되며, 감소된 체중에는 반대로 다뇨(多尿), 다식(多食)의 결과를 초래하게 된다.
본 발명에서는 STZ(Streptozotocin)로 인해 증가된 혈중 내 포도당(glucose), 당화혈색소(HbA1c)의 농도를 감소시키고, 비정상적인 체중 및 조직의 무게, 다식(多食)의 현상을 정상수치까지 개선시켜주는 7종의 유산균(비피도박테리움 롱검 HY8005, 비피도박테리움 인판티스 HY8401, 비피도박테리움 락티스 HY8101, 비피도박테리움 브레베 HY8201, 락토바실러스 애시도필러스 HY7037, 락토바실러스 가세리 HY7023, 락토바실러스 카제이 HY7212)을 선별하였다.
한편, 본 발명의 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212로 이루어진 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물은 단독 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 정제, 캡슐제 등과 같은 제재형태로 제제화 하여 사용될 수 있다.
사람의 경우, 통상적인 1일 투여량은 1~30mg/kg 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 투여경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.
물론, 상기 본 발명의 약학 조성물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명의 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212로 이루어진 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방용 식품 조성물은 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 발효유, 건강기능식품 등으로 사용될 수 있다. 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 또는 건강기능식품으로 사용되는 경우, 각종 식품류, 발효유, 육류, 음료수, 초콜렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료, 비타민 복합제, 주류 및 그 밖의 건강기능식품일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212로 이루어진 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방용 발효유는 상기 7종의 유산균 복합균주, 유산균 배양액, 또는 유산균 초음파 파쇄액 및 혼합과즙시럽을 일정비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 용기에 포장하여 발효유를 제조한다.
특히, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212로 이루어진 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방용 기능성 음료는 혼합과즙시럽, 상기 7종의 유산균 복합균주 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 기능성 음료를 제조한다.
특히, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212로 이루어진 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방용 건강기능식품은 상기 7종의 유산균 복합균주를 포함하는 것 이외에 영양보조 성분으로 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.
이상에서와 같이, 본 발명은 인슐린 저항성을 개선하는 효능을 갖는 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물, 식품조성물, 발효유, 음료, 건강기능식품 등 대사증후군의 예방 또는 개선 효과를 갖는 제품에 응용될 수 있다.
도 1은 7종의 유산균 복합균주의 정상 L6 근육세포 처리에 의한 포도당 유입을 나타낸 그래프이다.
도 2는 7종의 유산균 복합균주의 인슐린 저항성이 유도된 L6 근육세포 처리에 의한 포도당 유입을 나타낸 그래프이다.
도 3은 7종의 유산균 복합균주의 인슐린 저항성이 유도된 L6 근육세포 처리에 의한 포도당 유입에 관여하는 GLUT4 유전자 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 7종의 유산균 복합균주의 인슐린 저항성이 유도된 L6 근육세포 처리에 의한 인슐린 민감성에 관여하는 PPAR-γ유전자 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 7종의 유산균 복합균주의 인슐린 저항성이 유도된 L6 근육세포 처리에 의한 인슐린 민감성에 관여하는 PGC-1α 유전자 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 7종의 유산균 복합균주의 STZ에 의해 당뇨병이 유발된 마우스의 체중변화량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 7종의 유산균 복합균주의 STZ에 의해 당뇨병이 유발된 마우스의 식이섭취량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 7종의 유산균 복합균주의 STZ에 의해 당뇨병이 유발된 마우스의 간 및 부고환 지방 무게를 나타낸 그래프이다.
도 9는 7종의 유산균 복합균주의 STZ에 의해 당뇨병이 유발된 마우스의 공복 혈당(glucose) 수치를 나타낸 그래프이다.
도 10은 7종의 유산균 복합균주의 STZ에 의해 당뇨병이 유발된 마우스의 당화혈색소(HbA1c) 수치를 나타낸 그래프이다.
도 11은 7종의 유산균 복합균주의 STZ에 의해 당뇨병이 유발된 마우스의 포도당 경구투여 후 실험동물의 시간에 따른 혈당변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 7종의 유산균 복합균주의 근육조직 내 글리코겐의 합성 및 포도당 유입, 인슐린 민감성 관련 유전자 분석을 나타낸 그래프이다.
도 13은 7종의 유산균 복합균주의 간조직 내 글리코겐의 합성 및 포도당 신생 합성 관련 유전자와 포도당 유입, 인슐린 민감성 관련 유전자 분석을 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
<실시예 1>
7종의 유산균 복합균주의 분리 및 동정
1-1. 비피도박테리움 인판티스( Bifidobacterium infantis ) HY8401의 분리 및 동정
본 발명에 따른 신균주를 분리하기 위하여 생후 7일 전의 신생아에서 받은 분변을 수집한 후, 수집한 신생아의 분변 0.1g을 혐기 희석액에 십진 희석하여 1.5% 한천(agar)이 포함된 BL 고체배지에 도말하여 37℃의 혐기조건에서 48시간 배양한 후 콜로니(colony)를 백금이(loop)로 취하여 새로운 BL 고체배지에 접종하고 순수 분리하였다. 순수 분리된 콜로니를 BL 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
이렇게 분리한 신균주의 균 Crystal violet 염색을 통해 현미경을 통해 관찰하였고, DNA를 분리하여 Bifidobacteria 16S rRNA 분석(Im3, Im26)을 통한 균 동정을 하여 Blast search한 결과(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_
TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=MicrobialGenomes)를 하기의 표 1에 나타내었다.
Figure 112013113824445-pat00001
상기의 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신균주의 16S rRNA 균주 동정결과 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. infantis) ATCC 15697과 가장 높은 상동성을 나타내어 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)와 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여 본 발명자들은 이를 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401로 명명하고, 2013년 6월 10일자로 한국생명공연구원 유전자은행(기탁번호: KCTC 12419BP)에 기탁하였다.
본 발명에 따른 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
비엘(BL) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 혐기 조건에서 배양했을 때 균의 특성
①세포의 형태: 부정형의 간상형 균
②운동성: 없음
③포자형성능: 없음
④그람(Gram) 염색: 양성
2)생리적 성질
①생육온도: 생장가능 생육온도 15~42℃
최적 생장온도 36~38℃
②생육 pH: 생장가능 생육 pH 4.5~8.0
최적 pH 6.5~7.0
③산소에 대한 영향: 혐기성
3)카탈라제: -
4)가스형성여부: -
5)15℃에서 생육: -
6)45℃에서 생육: +
7)인돌생산: -
8)젖산생산: +
9)Biomerieux 사의 API 20 A kit를 이용한 당 발효 실험 및 동정
Figure 112013113824445-pat00002

1-2. 비피도박테리움 락티스( Bifidobacterium lactis ) HY8101의 분리 및 동정
본 발명에 따른 신균주를 분리하기 위하여 생후 7일 전의 신생아에서 받은 분변을 수집한 후, 수집한 신생아의 분변 0.1g을 혐기 희석액에 십진 희석하여 1.5% 한천(agar)이 포함된 BL 고체배지에 도말하여 37℃에서 혐기조건에서 48시간 배양한 후 콜로니(colony)를 백금이(loop)로 취하여 새로운 BL 고체배지에 접종하고 순수 분리하였다. 순수 분리된 콜로니를 BL 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
이렇게 분리한 신균주의 균 Crystal violet 염색을 통해 현미경을 통해 관찰하였고, DNA를 분리하여 Bifidobacteria 16S rRNA 분석(Im3, Im26)을 통한 균 동정을 하여 Blast search한 결과(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_
TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=MicrobialGenomes)를 하기의 표 2에 나타내었다.
Figure 112013113824445-pat00003
상기의 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신균주의 16S rRNA 균주 동정결과 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis)와 100% 일치하는 것으로 확인되어 본 발명자들은 이를 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101로 명명하고, 2013년 6월 10일자로 한국생명공연구원 유전자은행(기탁번호: KCTC 12418BP)에 기탁하였다.
본 발명에 따른 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
비엘(BL) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 혐기 조건에서 배양했을 때 균의 특성
①세포의 형태: 부정형의 간상형 균
②운동성: 없음
③포자형성능: 없음
④그람(Gram) 염색: 양성
2)생리적 성질
①생육온도: 생장가능 생육온도 15~42℃
최적 생장온도 36~38℃
②생육 pH: 생장가능 생육 pH 4.5~8.0
최적 pH 6.5~7.0
③산소에 대한 영향: 혐기성
3)카탈라제: -
4)가스형성여부: -
5)15℃에서 생육: -
6)45℃에서 생육: +
7)인돌생산: -
8)젖산생산: +
9)Biomerieux 사의 API 20 A kit를 이용한 당 발효 실험 및 동정
Figure 112013113824445-pat00004

1-3. 락토바실러스 애시도필러스 ( Lactobacillus acidophilus ) HY7037 의 분리 및 동정
본 발명에 따른 신균주를 분리하기 위하여 생후 7일 전의 신생아에서 받은 분변을 수집한 후, 수집한 신생아의 분변 0.1g을 호기 희석액에 십진 희석하여 1.5% 한천(agar)이 포함된 엠알에스(MRS) 고체배지에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 콜로니(colony)를 백금이(loop)로 취하여 새로운 MRS 고체배지에 접종하고 순수 분리하였다. 순수 분리된 콜로니를 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
이렇게 분리한 신균주를 동정하고자 Biomerieux 사의 API 50 CH kit를 이용하여 당 발효 실험을 한 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.
하기의 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신균주의 당발효 실험 결과 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)의 당발효 실험과 100% 일치하는 것으로 확인되어 본 발명자들은 이를 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037로 명명하고, 2013년 5월 9일자로 한국생명공연구원 유전자은행(기탁번호: KCTC 12409BP)에 기탁하였다.
본 발명에 따른 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성
①세포의 형태: 간균
②운동성: 없음
③포자형성능: 없음
④그람(Gram) 염색: 양성
2)균락의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균락의 형태
①형상: 원형
②융기: 볼록
③표면: 거침(Rough)
3)생리적 성질
①생육온도: 생장가능 생육온도 15~40℃
최적 생장온도 37℃
②생육 pH: 생장가능 생육 pH 5.0~7.5
최적 pH 6.0~6.5
③산소에 대한 영향: 통성혐기성
4)카탈라제: -
5)가스형성여부: -
6)15℃에서 생육: -
7)45℃에서 생육: +
8)인돌생산: -
9)젖산생산: +
10)Biomerieux 사의 API 50 CH kit를 이용한 당 발효 실험 및 동정
Figure 112013113824445-pat00005

1-4. 비피도박테리움 롱검 ( Bifidobacterium longum ) HY8005 의 분리 및 동정
본 발명에 따른 신균주를 분리하기 위하여 생후 7일 전의 신생아에서 받은 분변을 수집한 후, 수집한 신생아의 분변 0.1g을 혐기 희석액에 십진희석하여 1.5% 한천(agar)이 포함된 BL 고체배지에 도말하여 37℃에서 혐기조건에서 48시간 배양한 후 콜로니(colony)를 백금이(loop)로 취하여 새로운 BL 고체배지에 접종하고 순수 분리하였다. 순수 분리된 콜로니를 BL 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
이렇게 분리한 신균주의 균 Crystal violet 염색을 통해 현미경을 통해 관찰하였고, DNA를 분리하여 Bifidobacteria 16S rRNA 분석(Im3, Im26)을 통한 균 동정하여 Blast search한 결과(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_
TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=MicrobialGenomes)를 하기의 표 3에 나타내었다.
Figure 112013113824445-pat00006
상기의 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신균주의 16S rRNA 균주 동정결과 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)과 100% 일치하는 것으로 확인되어 본 발명자들은 이를 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005로 명명하고, 2013년 11월 5일자로 한국생명공연구원 유전자은행(기탁번호: KCTC 12514BP)에 기탁하였다.
본 발명에 따른 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
비엘(BL) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 혐기조건에서 배양했을 때 균의 특성
①세포의 형태: 부정형의 간상형 균
②운동성: 없음
③포자형성능: 없음
④그람(Gram) 염색: 양성
2)생리적 성질
①생육온도: 생장가능 생육온도 15~42℃
최적 생장온도 36~38℃
②생육 pH: 생장가능 생육 pH 4.5~8.0
최적 pH 6.0~7.0
③산소에 대한 영향: 절대혐기성
3)카탈라제: -
4)가스형성여부: -
5)15℃에서 생육: -
6)45℃에서 생육: +
7)인돌생산: -
8)젖산생산: +
1-5. 비피도박테리움 브레베( Bifidobacterium breve ) HY8201의 분리 및 동정
본 발명에 따른 신균주를 분리하기 위하여 생후 7일 전의 신생아에서 받은 분변을 수집한 후, 수집한 신생아의 분변 0.1g을 혐기 희석액에 십진희석하여 1.5% 한천(agar)이 포함된 BL 고체배지에 도말하여 37℃에서 혐기조건에서 48시간 배양한 후 콜로니(colony)를 백금이(loop)로 취하여 새로운 BL 고체배지에 접종하고 순수 분리하였다. 순수 분리된 콜로니를 BL 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
이렇게 분리한 신균주의 균 Crystal violet 염색을 통해 현미경을 통해 관찰하였고, DNA를 분리하여 Bifidobacteria 16S rRNA 분석(Im3, Im26)을 통한 균 동정하여 Blast search한 결과(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_
TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=MicrobialGenomes)를 하기의 표 4에 나타내었다.
Figure 112013113824445-pat00007
상기의 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신균주의 16S rRNA 균주 동정결과 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve)와 100% 일치하는 것으로 확인되어 본 발명자들은 이를 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201로 명명하고, 2013년 11월 5일자로 한국생명공연구원 유전자은행(기탁번호: KCTC 12515BP)에 기탁하였다.
본 발명에 따른 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
비엘(BL) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 혐기조건에서 배양했을 때 균의 특성
①세포의 형태: 부정형의 간상형 균
②운동성: 없음
③포자형성능: 없음
④그람(Gram) 염색: 양성
2)생리적 성질
①생육온도: 생장가능 생육온도 15~42℃
최적 생장온도 36~38℃
②생육 pH: 생장가능 생육 pH 4.5~8.0
최적 pH 6.0~7.0
③산소에 대한 영향: 절대혐기성
3)카탈라제: -
4)가스형성여부: -
5)15℃에서 생육: -
6)45℃에서 생육: +
7)인돌생산: -
8)젖산생산: +
9) Biomerieux 사의 API 50 CH kit를 이용한 당 발효 실험 및 동정
Figure 112013113824445-pat00008

1-6. 락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7023의 분리 및 동정
본 발명에 따른 신균주를 분리하기 위하여 생후 7일 전의 신생아에서 받은 분변을 수집한 후, 수집한 신생아의 분변 0.1g을 호기 희석액에 십진 희석하여 1.5% 한천(agar)이 포함된 엠알에스(MRS) 고체배지에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 콜로니(colony)를 백금이(loop)로 취하여 새로운 MRS 고체배지에 접종하고 순수 분리하였다. 순수 분리된 콜로니를 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
이렇게 분리한 신균주의 DNA를 분리하여 16S rRNA 분석(27F, 1492R)을 통한 균 동정을 하여 Blast search한 결과(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=MicrobialGenomes)를 하기의 표 5에 나타내었다.
Figure 112013113824445-pat00009
상기의 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신균주의 16S rRNA 균주 동정결과 락도바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)와 100% 일치하는 것으로 확인되어 본 발명자들은 이를 락도바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023로 명명하고, 2013년 11월 5일자로 한국생명공연구원 유전자은행(기탁번호: KCTC 12512BP)에 기탁하였다.
본 발명에 따른 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성
①세포의 형태: 간균
②운동성: 없음
③포자형성능: 없음
④그람(Gram) 염색: 양성
2)생리적 성질
①생육온도: 생장가능 생육온도 20~45℃
최적 생장온도: 36~38℃
②생육 pH: 생장가능 생육 pH 5.0~7.5
최적 pH: 6.0~6.5
③산소에 대한 영향: 통성혐기성
3)카탈라제: -
4)가스형성여부: -
5)15℃에서 생육: -
6)45℃에서 생육: +
7)인돌생산: -
8)젖산생산: +
9)Biomerieux 사의 API 50 CH kit를 이용한 당 발효 실험 및 동정
Figure 112013113824445-pat00010

1-7. 락토바실러스 카제이 ( Lactobacillus casei ) HY7212 의 분리 및 동정
본 발명에 따른 신균주를 분리하기 위하여 생후 7일 전의 신생아에서 받은 분변을 수집한 후, 수집한 신생아의 분변 0.1g을 호기 희석액에 십진 희석하여 1.5% 한천(agar)이 포함된 엠알에스(MRS) 고체배지에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 콜로니(colony)를 백금이(loop)로 취하여 새로운 MRS 고체배지에 접종하고 순수 분리하였다. 순수 분리된 콜로니를 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
이렇게 분리한 신균주의 DNA를 분리하여 16S rRNA 분석(27F, 1492R)을 통한 균 동정을 하여 Blast search한 결과(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=MicrobialGenomes)를 하기의 표 6에 나타내었다.
Figure 112013113824445-pat00011
상기의 표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신균주의 16S rRNA 균주 동정결과 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)와 100% 일치하는 것으로 확인되어 본 발명자들은 이를 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212 명명하고, 2013년 11월 5일자로 한국생명공연구원 유전자은행(기탁번호: KCTC 2513BP)에 기탁하였다.
본 발명에 따른 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성
①세포의 형태: 간균
②운동성: 없음
③포자형성능: 없음
④그람(Gram) 염색: 양성
2)균락의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균락의 형태
①형상: 원형
②융기: 볼록
③표면: 매끄러움(Smooth)
3)생리적 성질
①생육온도: 생장가능 생육온도 15~40℃
최적 생장온도 37℃
②생육 pH: 생장가능 생육 pH 5.0~7.5
최적 pH 6.0~6.5
③산소에 대한 영향: 통성혐기성
4)카탈라제: -
5)가스형성여부: -
6)15℃에서 생육: -
7)45℃에서 생육: +
8)인돌생산: -
9)젖산생산: +
10) Biomerieux 사의 API 50 CH kit를 이용한 당 발효 실험 및 동정
Figure 112013113824445-pat00012

<실시예 2>
7종의 유산균 복합균주를 포함한 동결건조 분말제조
2-1. 비피도박테리움 인판티스( Bifidobacterium infantis ) HY8401을 포함한 동결건조 분말
본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401 2 X 109cfu/㎖의 균수를 BL 액체배지에 접종하고, 배양기에서 혐기조건 하에서 37℃에서 24시간 동안 정치배양(batch culture)하였다. 이것을 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 균체를 세척한 후 다시 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 수거한 균체는 보존제인 탈지분유 분말과 1:1의 중량비로 섞어 동결건조하여 분말을 제조하였다.
2-2. 비피도박테리움 락티스( Bifidobacterium lactis ) HY8101을 포함한 동결건조분말 제조
본 발명의 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101 2 X 109cfu/㎖의 균수를 BL 액체배지에 접종하고, 배양기에서 혐기조건 하에서 37℃에서 24시간 동안 정치배양(batch culture)하였다. 이것을 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 균체를 세척한 후 다시 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 수거한 균체는 보존제인 탈지분유 분말과 1:1의 중량비로 섞어 동결건조하여 분말을 제조하였다.
2-3. 락토바실러스 애시도필러스 ( Lactobacillus acidophilus ) HY7037 을 포함한 동결건조분말 제조
본 발명의 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037 2 X 109cfu/㎖의 균수를 엠알에스 배지(MRS broth)에 접종하고 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 정치배양(batch culture)하였다. 이것을 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 균체를 세척한 후 다시 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 수거한 균체는 보존제인 탈지분유 분말과 1:1의 중량비로 섞어 동결건조하여 분말을 제조하였다.
2-4. 비피도박테리움 롱검( Bifidobacterium longum ) HY8005를 포함한 동결건조분말 제조
본 발명의 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005 2 X 109cfu/㎖의 균수를 BL 액체배지에 접종하고, 배양기에서 혐기조건 하에서 37℃에서 24시간 동안 정치배양(batch culture)하였다. 이것을 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 균체를 세척한 후 다시 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 수거한 균체는 보존제인 탈지분유 분말과 1:1의 중량비로 섞어 동결건조하여 분말을 제조하였다.
2-5. 비피도박테리움 브레베( Bifidobacterium breve ) HY8201을 포함한 동결건조분말 제조
본 발명의 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201 2 X 109cfu/㎖의 균수를 BL 액체배지에 접종하고, 배양기에서 혐기조건 하에서 37℃에서 24시간 동안 정치배양(batch culture)하였다. 이것을 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 균체를 세척한 후 다시 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 수거한 균체는 보존제인 탈지분유 분말과 1:1의 중량비로 섞어 동결건조하여 분말을 제조하였다.
2-6. 락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7023을 포함한 동결건조분말 제조
본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023 2 X 109cfu/㎖의 균수를 엠알에스 배지(MRS broth)에 접종하고 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 정치배양(batch culture)하였다. 이것을 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 균체를 세척한 후 다시 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 수거한 균체는 보존제인 탈지분유 분말과 1:1의 중량비로 섞어 동결건조하여 분말을 제조하였다.
2-7. 락토바실러스 카제이( Lactobacillus casei ) HY7212를 포함한 동결건조분말 제조
본 발명의 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212 2 X 109cfu/㎖의 균수를 엠알에스 배지(MRS broth)에 접종하고 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 정치배양(batch culture)하였다. 이것을 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 균체를 세척한 후 다시 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 수거한 균체는 보존제인 탈지분유 분말과 1:1의 중량비로 섞어 동결건조하여 분말을 제조하였다.
2-8. 7종의 유산균 복합균주를 포함한 동결건조분말의 제조
상기 실시예 2-1 내지 2-7의 각각의 균주를 포함한 동결건조분말을 각각 동일한 중량비(1:1:1:1:1:1:1)로 혼합하여 본 발명의 7종의 유산균 복합균주를 포함한 총 균수 1 X 1011 cfu/g의 동결건조분말을 제조하였다.
한편, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주는 상기와 같이 동결 건조된 분말 형태 또는 배양물 형태로 제공될 수 있다.
<실시예 3>
7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제조
액제의 제조
상기 실시예 2-8의 7종의 유산균 복합균주를 포함한 동결건조 분말 100mg, 이성화당 10g, 만니톨 5g을 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
캡슐제의 제조
상기 실시예 2-8의 7종의 유산균 복합균주를 포함한 동결건조분말 100mg에 옥수수 전분 100mg, 유당 100mg, 스테아린산 마그네슘 2mg을 완전히 혼합한 후 약전 제제총칙 중 캡슐제 제조방법에 따라 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<실시예 4>
7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조
본 발명의 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.55~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brix0)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 락토바실러스 애시도필러스 HY7037(Lactobacillus acidophilus HY7037), 락토바실러스 카제이 HY7212(Lactobacillus casei HY7212) 및 비피도박테리움 롱검 HY8005(Bifidobacterium longum HY8005)과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각각 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP배지에서의 총 유산균 수가 1.0 X 109cfu/㎖이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다. 그런 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix0 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다. 그런 다음, 상기 유산균배양액 69.5중량%와 실시예 2-8의 7종의 유산균 복합균주를 포함한 동결건조분말 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 30.4중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하였다.
<실시예 5>
7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 야채주스의 제조
본 발명의 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 야채주스를 제조하는 방법은 다음과 같다.
고구마, 단호박 등의 혼합야채즙 1.7중량%, 당근즙 52중량%, 토마토즙 42중량%, 시금치즙 1중량%, 양상추즙 2중량%, 셀러리즙 1중량%, 무수구연산 0.2중량%, 상기 실시예 2-8의 7종의 유산균 복합균주를 포함한 동결건조분말 0.1중량%를 배합기에서 균일하게 혼합한 후 살균기를 이용하여 85~97℃에서 살균하여 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 야채주스를 제조하였다.
<실시예 6>
7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조
본 발명의 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix0 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그리고, 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 상기 실시예 2-8의 7종의 유산균 복합균주를 포함한 동결건조분말 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량% 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하였다.
<실시예 7>
7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조
상기 실시예 2-8의 7종의 유산균 복합균주를 포함하는 동결건조분말 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기 실시예 2-8의 7종의 유산균 복합균주를 포함한 동결건조분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.
<시험예 1>
7종의 유산균 복합균주의 혈당흡수에 대한 영향 조사
근육세포의 당의 이용성을 살펴보면 췌장의 베타세포(β-cells)에서 분비되는 인슐린과 근육세포내의 인슐린 수용체(receptor), GLUT4(glucose transporter type 4)가 밀접하게 관여한다. 혈액 내의 포도당(glucose) 같은 당은 지방세포 및 근육조직 등의 각 기관에서 사용을 하게 되는데, 근육세포의 경우 인슐린의 작용으로 인해서 인슐린 수용체(insulin receptor)의 작용으로 인해 인슐린 신호(insulin signal)가 작동을 하게 된다. 최종적으로 GLUT4의 발현 및 근육세포 내의 전좌(translocation)의 증가로 인해서 혈액 내의 포도당이 근육 내로 들어오게 되어 글리코겐(glycogen) 등으로 합성 및 이용을 할 수 있게 된다.
그런데, 이러한 과정에서 TNF-α나 팔미트산(palmitic acid)과 같은 지방산이 작용하게 되면 인슐린 신호기작에 이상이 생겨서 GLUT4의 발현 및 전좌에 이상이 생기되어 혈액 내 포도당의 유입이 잘 이루어지지 않는다.
따라서, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주의 근육세포 내 TNF-α로 인해 혈당흡수가 감소된 상태에서 혈당흡수 증가 양상 확인을 위하여 혈당흡수분석기(glucose uptake assay)를 통해 혈당흡수(glucose uptake)를 확인하였다.
1-1. 근육세포 배양
본 시험에 사용된 동물 세포주로는 레트(rat)에서 유래된 골격근 세포(skeletal muscle cell)인 L6 cell myoblast를 한국세포주은행(cellbank.snu.ac.kr)에서 분양받아 사용하였다. 일반적인 세포의 유지를 위해서 90%의 DMEM 배지(Gibco#)와 10% FBS(Gibco#16000)가 함유된 배지에서 세포배양을 하였으며, 1:8의 비율로 주 2회 계대배양을 수행하였다.
1-2. 7종의 유산균 복합균주의 세포 추출물 확보
① 비피도박테리움 인판티스( Bifidobacterium infantis ) HY8401 세포추출물
본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 BL 액체배지에 접종하여 37℃에서 20시간 혐기배양 하였다. 상기 배양액을 3,000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 균체를 얻은 후 멸균된 PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 그런 다음, 균체를 다시 멸균된 PBS 완충용액에 현탁한 후 흡광도를 측정하여 OD600=1.0으로 조절한 후 현탁액을 100℃에서 20분간 살균처리 하였다. 이렇게 사멸된 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401 균을 3,000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 균체를 얻은 후 멸균된 PBS 완충용액 1㎖에 현탁하여 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401 균 현탁액을 제조하여 시료를 준비하였다.
② 비피도박테리움 락티스 ( Bifidobacterium lactis ) HY8101 세포 추출물
본 발명의 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101을 BL 배지(Difco)에서 혐기조건 하에 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 균체를 원심 분리한 후 PBS로 2~3번 세척한 후 남아있는 배지 성분을 제거하였다. 균체를 동결건조해서 분말화 시킨 후 연속희석법(serial dilution)의 과정을 거쳐 균수를 측정하였다. 균체의 농도가 1010cfu/㎖이 되도록 PBS에 리서스펜션(resuspension)한 후 소니케이션(sonication)하여 균체를 용균(lysis)하였다. 이를 원심분리한 후 상층액을 유산균 세포 추출물로 시험에 사용하였다.
③ 락토바실러스 애시도필러스 ( Lactobacillus acidophilus ) HY7037 세포 추출물
본 발명의 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037을 MRS 배지(Difco)에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 균체를 원심 분리한 후 PBS로 2~3번 세척한 후 남아있는 배지 성분을 제거하였다. 균체를 동결건조해서 분말화 시킨 후 연속희석법(serial dilution)의 과정을 거쳐 균수를 측정하였다. 균체의 농도가 1010cfu/㎖이 되도록 PBS에 리서스펜션(resuspension)한 후 소니케이션(sonication)하여 균체를 용균(lysis)하였다. 이를 원심분리한 후 상층액을 유산균 세포 추출물로 시험에 사용하였다.
④ 비피도박테리움 롱검( Bifidobacterium longum ) HY8005 세포 추출물
본 발명의 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005를 BL 액체배지에 접종하여 37℃에서 20시간 혐기배양 하였다. 상기 배양액을 3,000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 균체를 얻은 후 멸균된 PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 그런 다음, 균체를 다시 멸균된 PBS 완충용액에 현탁한 후 흡광도를 측정하여 OD600=1.0으로 조절한 후 현탁액을 100℃에서 20분간 살균처리 하였다. 이렇게 사멸된 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005 균을 3,000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 균체를 얻은 후 멸균된 PBS 완충용액 1㎖에 현탁하여 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005 균 현탁액을 제조하여 시료를 준비하였다.
⑤ 비피도박테리움 브레베( Bifidobacterium breve ) HY8201 세포 추출물
본 발명의 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201을 BL 액체배지에 접종하여 37℃에서 20시간 혐기배양 하였다. 상기 배양액을 3,000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 균체를 얻은 후 멸균된 PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 그런 다음, 균체를 다시 멸균된 PBS 완충용액에 현탁한 후 흡광도를 측정하여 OD600=1.0으로 조절한 후 현탁액을 100℃에서 20분간 살균처리 하였다. 이렇게 사멸된 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201 균을 3,000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 균체를 얻은 후 멸균된 PBS 완충용액 1㎖에 현탁하여 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201 균 현탁액을 제조하여 시료를 준비하였다.
⑥ 락토바실러스 가세리( Lactobacillus gasseri ) HY7023 세포 추출물
본 발명의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023을 MRS 배지(Difco)에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 균체를 원심 분리한 후 PBS로 2~3번 세척한 후 남아있는 배지 성분을 제거하였다. 균체를 동결건조해서 분말화 시킨 후 연속희석법(serial dilution)의 과정을 거쳐 균수를 측정하였다. 균체의 농도가 1010cfu/㎖이 되도록 PBS에 리서스펜션(resuspension)한 후 소니케이션(sonication)하여 균체를 용균(lysis)하였다. 이를 원심분리한 후 상층액을 유산균 세포 추출물로 시험에 사용하였다.
⑦ 락토바실러스 카제이( Lactobacillus casei ) HY7212 세포 추출물
본 발명의 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212를 MRS 배지(Difco)에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 균체를 원심 분리한 후 PBS로 2~3번 세척한 후 남아있는 배지 성분을 제거하였다. 균체를 동결건조해서 분말화 시킨 후 연속희석법(serial dilution)의 과정을 거쳐 균수를 측정하였다. 균체의 농도가 1010cfu/㎖이 되도록 PBS에 리서스펜션(resuspension)한 후 소니케이션(sonication)하여 균체를 용균(lysis)하였다. 이를 원심분리한 후 상층액을 유산균 세포 추출물로 시험에 사용하였다.
⑧ 7종의 유산균 복합균주의 세포 추출물
상기 ① 내지 ⑦의 각각의 유산균 세포추출물을 각각 동일한 중량비(1:1:1:1:1:1:1)로 혼합하여 본 발명의 7종의 유산균 복합균주의 세포추출물로 시험에 사용하였다.
1-3. 근육세포의 분화
상기 L6 골격근 세포(skeletal muscle cell)를 5 X 105cells/well로 96 well plate에 계대배양 후 2% FBS가 들어간 DMEM 배지를 이용하여 3~4일간 배양하여 분화시켰다.
1-4. 7종의 유산균 복합균주 처리에 의한 L6 골격근 세포에서의 혈당흡수 측정
(1)상기 시험예 1-3의 분화된 L6 골격근 세포에 상기 실시예 1의 7종의 유산균 균주 각각을 106cfu/well로 24시간 처리를 한 후에, 배지(culture medium)를 제거한 후 Cayman Chemical사의 키트(kit)에 동봉되어 있는 포도당에 형광물질이 처리된 2-NBDG(1:70), 인슐린(500μM), 상기 시험예 1-2의 7종의 유산균 복합균주 세포 추출물을 같이 섞어서 100㎕씩 30분간 처리를 하였다.
Cayman Chemical사의 키트 속에 있는 분석버퍼(assay buffer)를 이용해 웰(well)당 200㎕씩 5분간 세척한 후 분석버퍼(assay buffer) 100㎕를 동일한 플레이트에 넣고 플레이트 리더(plate reader) 기기를 이용하여 Excitation/emission= 485/535nm 형광측정을 하였다.
(2)상기 (1)의 7종의 유산균 복합균주 대신에 각각 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212를 사용한 것을 제외하고는 상기 (1)과 동일한 시험방법으로 시험을 하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
'음성대조군'은 분화된 L6 골격근 세포에 아무것도 처리하지 않은 군을 나타내며,
'양성대조군'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)만을 처리한 군을 나타내고,
'HY8005'는 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005를 처리한 군을 나타내며,
'HY8401'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 처리한 군을 나타내며,
'HY8101'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101을 처리한 군을 나타내고,
'HY8201'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201을 처리한 군을 나타내고,
'HY7023'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023을 처리한 군을 나타내고,
'HY7037'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037을 처리한 군을 나타내고,
'HY7212'는 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212를 처리한 군을 나타내며,
'Birth-7'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 7종의 유산균 복합균주를 처리한 군을 나타낸다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 각각의 유산균주 단독으로 처리를 하였을 때 보다 7종의 유산균주를 복합으로 처리를 하였을 때 인슐린 저항성이 유도되지 않은 정상 L6 골격근 세포에서 혈당흡수를 증가시키는 것을 확인 할 수 있었다.
1-5. 7종의 유산균 복합균주 처리에 의한 TNF-α에 의해 인슐린 저항성이 유도된 L6 골격근 세포에서의 혈당흡수 측정
(1)상기 시험예 1-3의 분화된 L6 골격근 세포에 상기 실시예 1의 7종의 유산균 균주 각각을 106cfu/well로 24시간 처리를 한 후에, 다음날 TNF-α(100ng/㎖)로 웰(well) 당 200㎕씩 6시간 동안 처리를 해서 인슐린 저항성을 유도시켰다.
배지(culture medium)를 제거한 후 Cayman Chemical사의 키트(kit)에 동봉되어 있는 포도당에 형광물질이 처리된 2-NBDG(1:70), 인슐린(500μM), 상기 시험예 1-2의 7종의 유산균 복합균주 세포추출물을 같이 섞어서 100㎕씩 30분간 처리를 하였다.
Cayman Chemical사의 키트 속에 있는 분석버퍼(assay buffer)를 이용해 웰(well)당 200㎕씩 5분간 세척한 후 분석버퍼(assay buffer) 100㎕를 동일한 플레이트에 넣고 플레이트 리더(plate reader) 기기를 이용하여 Excitation/emission= 485/535nm 형광측정을 하였다.
(2)상기 (1)의 7종의 유산균 복합균주 대신에 각각 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212를 사용한 것을 제외하고는 상기 (1)과 동일한 시험방법으로 시험을 하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
'음성대조군'은 분화된 L6 골격근 세포에 아무것도 처리하지 않은 군을 나타내며,
'양성대조군'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)만을 처리한 군을 나타내고,
'유도군'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖)만을 처리한 군을 나타내며,
'HY8005'는 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005를 처리한 군을 나타내며,
'HY8401'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 처리한 군을 나타내며,
'HY8101'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101을 처리한 군을 나타내고,
'HY8201'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201을 처리한 군을 나타내고,
'HY7023'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023을 처리한 군을 나타내고,
'HY7037'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037을 처리한 군을 나타내고,
'HY7212'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212를 처리한 군을 나타내며,
'Birth-7'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 7종의 유산균 복합균주를 처리한 군을 나타낸다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 각각의 유산균주 단독으로 처리를 하였을 때 보다 7종의 유산균주를 복합으로 처리를 하였을 때 TNF-α에 의해 인슐린 저항성이 유도된 L6 골격근 세포에서 혈당흡수를 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
<시험예 2>
7종의 유산균 복합균주 처리에 의한 L6 골격근 세포에서의 GLUT4, PPAR-γ, PGC-1α 발현량 측정
근육세포 내 혈당흡수는 GLUT4라는 단백질로 인해 유입이 되게 된다. 특히, PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma), PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha)는 인슐린 민감성에 관련된 유전자로 인슐린에 의해 발현량이 증가되어 GLUT4의 발현 및 GLUT4의 트랜스로케이션(translocation)에 영향을 미친다. 따라서, TNF-α에 의해 인슐린 저항성이 유도된 L6 골격근 세포에서 본 발명의 7종의 유산균 복합균주의 GLUT4, PPAR-γ, PGC-1α의 유전자 발현증가에 따른 혈당흡수의 증가를 확인하기 위해 GLUT4, PPAR-γ, PGC-1α 유전자의 발현량을 측정 하였다.
2-1. 근육세포의 분화
상기 시험예 1-1의 L6 골격근 세포를 1 X 106cells/well로 6 well plate에 계대배양 후 2% FBS가 들어간 DMEM 배지를 이용하여 3~4일간 배양하여 분화를 시켰다.
2-2. 7종의 유산균 복합균주 처리에 의한 TNF-α에 의해 인슐린 저항성이 유도된 L6 골격근 세포에서의 GLUT4 유전자 발현량 측정
(1)상기 시험예 2-1의 분화된 근육세포에 상기 실시예 1의 7종의 유산균 균주 각각을 107cfu/well로 24시간 처리를 한 후에, 다음날 TNF-α(100ng/㎖)로 well당 2㎖씩 6시간 동안 처리를 해서 인슐린 저항성을 유도시켰다.
배지(Culture medium)를 제거한 후 인슐린(500μM), 상기 시험예 1-2의 7종의 유산균 복합균주 세포추출물을 같이 섞어서 2㎖씩 30분간 처리를 하였다.
근육세포로부터 RNA는 Qiagen사의 RNA prep. Kit(RNeasy mini kit, Qiagen 74106)을 이용하여 분리하였다. 분리한 RNA로부터 Quantitect reverse transcription kit(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. RNA 발현은 하기 표 7의 Taqman probe와 Real-time PCR(applied biosystems, 7500 real time PCR)를 이용하여 정량하였다. GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 internal control로 사용하였다.
(2)상기 (1)의 7종의 유산균 복합균주 대신에 각각 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212를 사용한 것을 제외하고는 상기 (1)과 동일한 시험방법으로 시험을 하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
'음성대조군'은 분화된 L6 골격근 세포에 아무것도 처리하지 않은 군을 나타내며,
'양성대조군'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)만을 처리한 군을 나타내고,
'유도군'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖)만을 처리한 군을 나타내며,
'HY8005'는 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005를 처리한 군을 나타내며,
'HY8401'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 처리한 군을 나타내며,
'HY8101'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101을 처리한 군을 나타내고,
'HY8201'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201을 처리한 군을 나타내고,
'HY7023'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023을 처리한 군을 나타내고,
'HY7037'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037을 처리한 군을 나타내고,
'HY7212'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212을 처리한 군을 나타내며,
'Birth-7'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 7종의 유산균 복합균주를 처리한 군을 나타낸다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 양성대조군인 정상 근육세포에서는 인슐린에 의해서 혈당흡수에 관여하는 GLUT4의 유전자 발현이 증가되는데 반하여, 유도군에서는 정상 근육세포의 TNF-α로 인하여 혈당흡수에 관여하는 GLUT4의 유전자 발현이 감소되었다.
또한, 각각의 개별균주는 GLUT4의 유전자의 발현이 감소하였으나, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주는 GLUT4의 유전자 발현이 증가됨을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주는 TNF-α에 의해 감소된 GLUT4의 발현량을 증가시켜 혈당흡수를 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
유전자 Taqman probe
Rat GAPDH Rn01775763_g1
Rat solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 4, GLUT-4 Rn00562597_m1
Rat PPAR-γ Rn00440945_m1
Rat peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1 alpha Rn00580241_m1
2-3. 7종의 유산균 복합균주 처리에 의한 TNF-α에 의해 인슐린 저항성이 유도된 L6 골격근 세포에서의 PPAR-γ 유전자 발현량 측정
상기 시험예 2-2와 동일한 시험방법으로 PPAR-γ 유전자의 발현량을 측정하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
'음성대조군'은 분화된 L6 골격근 세포에 아무것도 처리하지 않은 군을 나타내며,
'양성대조군'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)만을 처리한 군을 나타내고,
'유도군'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖)만을 처리한 군을 나타내며,
'HY8005'는 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005를 처리한 군을 나타내며,
'HY8401'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 처리한 군을 나타내며,
'HY8101'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101을 처리한 군을 나타내고,
'HY8201'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201을 처리한 군을 나타내고,
'HY7023'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023을 처리한 군을 나타내고,
'HY7037'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037을 처리한 군을 나타내고,
'HY7212'는 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212을 처리한 군을 나타내며,
'Birth-7'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 7종의 유산균 복합균주를 처리한 군을 나타낸다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 양성대조군인 정상 근육세포에서는 인슐린에 의해서 인슐린 민감성 및 혈당흡수에 관여하는 PPAR-γ 유전자 발현이 증가되는데 반하여, 유도군에서는 정상 근육세포의 TNF-α로 인하여 인슐린 민감성 및 혈당흡수에 관여하는 PPAR-γ 유전자발현이 감소되었다. 또한, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101과 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037을 제외한 각각의 개별 균주는 PPAR-γ의 유전자의 발현이 감소하였으나, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주는 PPAR-γ의 유전자 발현이 증가됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주는 TNF-α에 의해 감소된 PPAR-γ의 발현량을 증가시켜 혈당흡수를 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
2-4. 7종의 유산균 복합균주 처리에 의한 TNF-α에 의해 인슐린 저항성이 유도된 L6 골격근 세포에서의 PGC-1α 유전자 발현량 측정
상기 시험예 2-2와 동일한 시험방법으로 PGC-1α 유전자의 발현량을 측정하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다.
'음성대조군'은 분화된 L6 골격근 세포에 아무것도 처리하지 않은 군을 나타내며,
'양성대조군'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)만을 처리한 군을 나타내고,
'유도군'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖)만을 처리한 군을 나타내며,
'HY8005'는 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005를 처리한 군을 나타내며,
'HY8401'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 처리한 군을 나타내며,
'HY8101'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101을 처리한 군을 나타내고,
'HY8201'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201을 처리한 군을 나타내고,
'HY7023'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023을 처리한 군을 나타내고,
'HY7037'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037을 처리한 군을 나타내고,
'HY7212'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 TNF-α(100ng/㎖) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212을 처리한 군을 나타내며,
'Birth-7'은 분화된 L6 골격근 세포에 인슐린(500μM)과 7종의 유산균 복합균주를 처리한 군을 나타낸다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 양성대조군인 정상 근육세포에서는 인슐린에 의해서 인슐린 민감성 및 혈당흡수에 관여하는 PGC-1α 유전자 발현이 증가되는데 반하여, 유도군에서는 정상 근육세포의 TNF-α로 인하여 인슐린 민감성 및 혈당흡수에 관여하는 PGC-1α 유전자 발현이 감소되었다. 또한, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023을 제외한 각각의 균주는 PGC-1α의 유전자의 발현을 증가하였으나, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주는 PGC-1α의 유전자 발현이 훨씬 증가됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주는 TNF-α에 의해 감소된 PGC-1α의 발현량을 증가시켜 혈당흡수를 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 시험예 2의 시험결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주는 TNF-α에 의해 감소된 GLUT4, PPAR-γ 및 PGC-1α의 발현량을 증가시켜 혈당흡수를 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
<시험예 3>
STZ(Streptozotocin)의 처리에 의해 유도된 당뇨동물 모델에서의 7종의 유산균 복합균주 식이로 인한 혈당조절 개선 효능 평가
C57BL/6J의 4주령 정상 수컷에 STZ를 복강 투여를 하게 되면 췌장의 베타세포가 파괴되어 인슐린의 분비가 잘 이루어지지 않게 된다. 인슐린 분비가 잘 되지 않게 되어 체중의 비정상적인 감소, 다식(多食), 다뇨(多尿)의 결과가 나타나게 되고, 비정상적인 당대사로 인해 혈중 내 포도당 및 당화혈색소(HbA1c)가 증가 되게 된다. 따라서, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주의 STZ(Streptozotocin)의 처리에 의해 유도된 당뇨동물 모델에서의 7종의 유산균 복합균주 식이로 인한 혈당조절 개선 효능 평가를 실시하였다.
3-1. C57BL/6J 마우스 준비 및 식이준비
본 발명에 따른 STZ(Streptozotocin)의 처리에 의해 유도된 당뇨동물 모델에서의 7종의 유산균 복합균주 식이로 인한 혈당조절 개선 효능 평가를 확인하기 위해 동물실험을 실시하였다. 실험동물은 C57BL/6J 쥐로 ㈜ 라온바이오에서 주문하여 4주령 수컷 쥐를 1주일 동안 Chow식이를 공급하면서 적응시킨 후 이용하였다. 시험군은 총 3군으로 각 시험군에 투여한 사료의 조성비는 표 8과 같다. 기본식이는 Research diets사의 AIN-76A를 이용하였다.
Figure 112013113824445-pat00013
3-2. STZ의 복강투여로 인한 췌장 베타세포 파괴
상기 시험예 3-1의 실험쥐를 정상군 10마리를 제외한 남은 모든 쥐(n=30) STZ(150mg/kg)의 농도로 200㎕씩 복강투여를 실시하여 췌장의 베타세포를 파괴시켰다. 복강투여 시작 5일 후에 6시간 공복을 유지한 실험동물에서 꼬리 체혈을 통해 혈액을 확보하고 혈장을 분리하여 혈중 내 포도당을 측정하였다. 250㎎/㎗의 이상이 되는 실험쥐만 선별하여 시험군당 6마리씩 배치를 시켜 준비된 상기 시험예 3-1의 식이를 투여하였다.
3-3. 체중 및 식이섭취량 측정
총 3주 동안의 실험 식이를 투여하며 1주일에 1회 간격으로 체중(도 6)과 사료 섭취량(도 7)을 측정하였다.
그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
'정상군'은 STZ(Streptozotocin)를 처리하지 않은 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타내고,
'유도군'은 STZ(Streptozotocin)를 처리한 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타내며
'Birth-7'은 STZ(Streptozotocin)를 처리한 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타낸다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주를 3주간 식이투여를 실시하였을 때, STZ에 의해서 감소된 체중을 유도군에 비하여 유의적으로 체중 증가가 이루어지는 것을 확인 할 수 있었다.
또한, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주를 3주간 식이투여를 실시하였을 때, STZ에 의해 증가된 다식(多食)의 양상을 유도군에 비해 유의적으로 식이섭취량 감소가 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.
3-4. 각 조직별 무게 측정
총 3주간의 실험 식이를 마친 후에 마우스를 희생시켜 간 및 부고환지방의 무게를 저울을 통해 측정하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다.
'정상군'은 STZ(Streptozotocin)를 처리하지 않은 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타내고,
'유도군'은 STZ(Streptozotocin)를 처리한 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타내며
'Birth-7'은 STZ(Streptozotocin)를 처리한 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타낸다.
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주로 인해 부고환지방의 무게가 유도군에 비해 유의적으로 증가함을 확인 할 수 있었다.
단, 간무게에 있어서는 유도군 및 정상군, Birth-7에서 별다른 유의적 차이를 확인할 수 없었다.
3-5. 공복혈당 측정
총 3주 동안 1주일의 1회 간격으로 6시간 동안 절식시키고 공복혈당을 측정하였다.
그 결과를 도 9에 나타내었다.
'정상군'은 STZ(Streptozotocin)를 처리하지 않은 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타내고,
'유도군'은 STZ(Streptozotocin)를 처리한 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타내며
'Birth-7'은 STZ(Streptozotocin)를 처리한 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타낸다.
도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주를 3주간 식이투여를 실시하였을 때, STZ에 의해 인슐린 분비가 잘 되지 않아 증가된 공복혈당 수치를 유도군에 비해 유의적 수준으로 공복혈당을 감소시키는 것을 확인 할 수 있었다.
3-6. 당화혈색소(HbA1c) 측정
동물 희생을 통해 채취한 혈액을 가지고 당화혈색소 측정기기[이지에이원씨(Easy A1c) 당화혈색소 테스트 카트리지, 인포피아]를 통해 당화혈색소(HbA1c)를 측정하였다.
그 결과를 도 10에 나타내었다.
'정상군'은 STZ(Streptozotocin)를 처리하지 않은 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타내고,
'유도군'은 STZ(Streptozotocin)를 처리한 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타내며
'Birth-7'은 STZ(Streptozotocin)를 처리한 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타낸다.
도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주를 3주간 식이투여를 실시한 후, STZ에 의해 인슐린 분비가 잘 되지 않아 증가된 혈당에 의해 증가된 당화혈색소의 수치를 유도군에 비해 유의적 수준으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
3-7. 인슐린 민감성 측정
상기 시험예 3-2의 3주간 실험식이를 투여한 쥐들의 인슐린 민감성을 측정하기 위해 공복상태에서 당부하시험을 하였다. 6시간 동안 공복을 유지한 실험동물에게 2g/kg 농도의 포도당(glucose)을 각각 경구투여하고 30분씩 2시간 동안 혈당의 변화를 측정하였다.
그 결과를 도 11에 나타내었다.
'정상군'은 STZ(Streptozotocin)를 처리하지 않은 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타내고,
'유도군'은 STZ(Streptozotocin)를 처리한 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타내며
'Birth-7'은 STZ(Streptozotocin)를 처리한 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타낸다.
도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 유도군은 혈당이 높아지고 120분이 지나도 공복시 혈당으로 낮아지지 않는 등 체내 혈당조절이 정상군 보다 늦게 일어남을 볼 수 있는 반면, 7종의 유산균 복합균주를 AIN-76A에 섞어 먹인 실험군(Birth-7)은 정상군과 마찬가지로 공복혈당이 낮으며 당부하 후 일정시간(투여 30분 후)이 지나면 공복혈당으로 조절되는 것을 확인할 수 있었다.
이와 같은 사실은 7종의 유산균 복합균주를 일정기간 이상 복용할 경우 혈당이 낮아지고, 음식물 섭취와 같은 당부하가 있었을 때에도 빠르게 혈당이 안정화되는 사실을 통하여 본 발명의 7종의 유산균 복합균주를 혈당 강하제로의 이용을 고려할 수 있음을 의미한다.
3-6. 간 및 근육 조직에서 유전자 발현량 측정
총 3주간의 실험식이를 마친 후에 쥐를 희생시켜 간 및 근육조직을 적출하여 RNA later 보관 용액에 넣었다. 간 및 근육세포로부터 RNA는 Qiagen사의 RNA prep. Kit(RNeasy mini kit, Qiagen 74106)을 이용하여 분리하였다. 분리한 RNA로부터 Quantitect reverse transcription kit(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. RNA발현은 표 9의 Taqman probe와 Real-time PCR(applied biosystems, 7500 real time PCR)를 이용하여 정량하였다. GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 internal control로 사용하였다.
Mouse Gsk3β Mm00444911_m1
Mouse Phosphoprotein phosphatase 1 (PP1) Mm00849631_s1
Mouse G6pc Mm00839363_m1
Mouse phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (Pck1) Mm01247058_m1
Mouse GLUT-2 Mm00446224_m1
Mouse GLUT-4 Mm00436615_m1
Mouse peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1 alpha Mm01208835_m1
Mouse peroxisome proliferator activated receptor gamma 2 Mm00440945_m1
Mouse GAPDH Mm99999915_g1
그 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.
'정상군'은 STZ(Streptozotocin)를 처리하지 않은 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타내고,
'유도군'은 STZ(Streptozotocin)를 처리한 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타내며
'Birth-7'은 STZ(Streptozotocin)를 처리한 실험쥐에 표 8의 식이 처리를 한 군을 나타낸다.
도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주는 근육조직 내 글리코겐 합성과 관련된 효소 GSK3β(Glycogen synthase kinase 3 beta)를 유도군에 비해 유의적으로 유전자 발현을 낮춰주고, 포도당 유입과 관련된 GLUT4를 유도군에 비해 유의적으로 유전자 발현을 증가시킴을 알 수 있었다.
도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 간 조직내 글리코겐 합성과 관련된 효소 PP1(Protein phosphatase 1)을 유도군에 비해 유의적으로 유전자 발현을 증가시키고, 포도당 유입과 관련된 GLUT2를 유도군에 비해 유의적으로 유전자 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었다.
이상의 시험예 3의 시험결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 7종의 유산균 복합균주의 혈당 개선효능은 간 및 근육조직으로 혈중의 포도당이 유입이 잘 이루어지게 하여 유입된 포도당을 글리코겐의 형태로 전환 및 이용을 활발히 시켜 혈당을 조절함을 알 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC12419BP 20130610 한국생명공학연구원 KCTC12418BP 20130610 한국생명공학연구원 KCTC12409BP 20130509 한국생명공학연구원 KCTC12514BP 20131105 한국생명공학연구원 KCTC12515BP 20131105 한국생명공학연구원 KCTC12512BP 20131105 한국생명공학연구원 KCTC12513BP 20131105

Claims (9)

  1. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005(기탁번호: KCTC 12514BP), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(기탁번호: KCTC 12419BP), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101(기탁번호: KCTC 12418BP), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201(기탁번호: KCTC 12515BP), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023(기탁번호: KCTC 12512BP), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037(기탁번호: KCTC 12409BP) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212(기탁번호: KCTC 12513BP)로 이루어진 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005(기탁번호: KCTC 12514BP), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(기탁번호: KCTC 12419BP), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101(기탁번호: KCTC 12418BP), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201(기탁번호: KCTC 12515BP), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023(기탁번호: KCTC 12512BP), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037(기탁번호: KCTC 12409BP) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212(기탁번호: KCTC 12513BP)로 이루어진 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방용 식품 조성물.
  3. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005(기탁번호: KCTC 12514BP), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(기탁번호: KCTC 12419BP), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101(기탁번호: KCTC 12418BP), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201(기탁번호: KCTC 12515BP), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023(기탁번호: KCTC 12512BP), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037(기탁번호: KCTC 12409BP) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212(기탁번호: KCTC 12513BP)로 이루어진 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방용 발효유.
  4. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005(기탁번호: KCTC 12514BP), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(기탁번호: KCTC 12419BP), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101(기탁번호: KCTC 12418BP), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201(기탁번호: KCTC 12515BP), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023(기탁번호: KCTC 12512BP), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037(기탁번호: KCTC 12409BP) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212(기탁번호: KCTC 12513BP)로 이루어진 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방용 건강기능식품.
  5. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HY8005(기탁번호: KCTC 12514BP), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(기탁번호: KCTC 12419BP), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) HY8101(기탁번호: KCTC 12418BP), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) HY8201(기탁번호: KCTC 12515BP), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7023(기탁번호: KCTC 12512BP), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) HY7037(기탁번호: KCTC 12409BP) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7212(기탁번호: KCTC 12513BP)로 이루어진 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인슐린 저항성 개선을 통한 당뇨병 예방용 기능성 음료.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 인슐린 저항성 개선은 근육세포에서 GLUT4(glucose transporter type 4) 유전자의 발현을 증가시킴으로써 근육세포 내 혈당흡수(glucose uptake)를 증가시키는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 인슐린 저항성 개선은 근육세포에서 PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 및 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha)유전자의 발현을 증가시킴으로써 근육세포 내 혈당흡수(glucose uptake)를 증가시키는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 인슐린 저항성 개선은 STZ(Streptozotocin)에 의해 유도된 당뇨동물 모델에서 인슐린 분비저하로 인해 유발된 체중, 식이섭취량 및 당화혈색소(HbA1c)의 이상을 조절함으로써 혈당을 조절하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 인슐린 저항성 개선은 STZ(Streptozotocin)에 의해 유도된 당뇨동물 모델에서 인슐린 분비저하로 인해 증가된 혈중 포도당(glucose)의 양을 간과 근육조직 내 포도당(glucose) 유입증가 및 글리코겐(glycogen)의 합성을 증진시킴으로써 혈당을 조절하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
KR1020130154608A 2013-12-12 2013-12-12 인슐린 저항성 개선 효능을 갖는 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물 KR101545551B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130154608A KR101545551B1 (ko) 2013-12-12 2013-12-12 인슐린 저항성 개선 효능을 갖는 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130154608A KR101545551B1 (ko) 2013-12-12 2013-12-12 인슐린 저항성 개선 효능을 갖는 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150068670A KR20150068670A (ko) 2015-06-22
KR101545551B1 true KR101545551B1 (ko) 2015-08-19

Family

ID=53516053

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130154608A KR101545551B1 (ko) 2013-12-12 2013-12-12 인슐린 저항성 개선 효능을 갖는 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101545551B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200012236A (ko) * 2018-07-26 2020-02-05 바이오스트림테크놀러지스(주) 신규 유산균 및 이를 이용한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 유산균 발효물의 제조방법

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3272396A1 (en) * 2016-07-18 2018-01-24 Bionou Research, S.L. Use of probiotics in the treatment and/or prevention of atopic dermatitis
IT201600109507A1 (it) * 2016-10-28 2018-04-28 Probiotical Spa Composizione per il trattamento preventivo o curativo dei disturbi epatici
KR102124704B1 (ko) * 2018-11-16 2020-06-19 농업회사법인 청원자연랜드 주식회사 비피도박테리움 롱검 및 홉 추출물을 포함하는 항당뇨 또는 항아토피용 유제품
CN109666615B (zh) * 2019-02-20 2021-03-19 无限极（中国）有限公司 一种益生菌组合物及其应用
CN111575202A (zh) * 2020-05-19 2020-08-25 北京科拓恒通生物技术股份有限公司 一株用于预防辅助治疗ⅱ型糖尿病的干酪乳杆菌及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009511469A (ja) 2005-10-07 2009-03-19 アルラ フーズ アンバ 脂肪代謝及び肥満に影響を及ぼすプロバイオティクス
KR100934747B1 (ko) 2001-12-21 2009-12-30 악티알 파마수티카 엘디에이. 새로운 젖산균 균주, 이를 함유하는 식용 조성물, 약물 및수의학적 제품

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100934747B1 (ko) 2001-12-21 2009-12-30 악티알 파마수티카 엘디에이. 새로운 젖산균 균주, 이를 함유하는 식용 조성물, 약물 및수의학적 제품
JP2009511469A (ja) 2005-10-07 2009-03-19 アルラ フーズ アンバ 脂肪代謝及び肥満に影響を及ぼすプロバイオティクス

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200012236A (ko) * 2018-07-26 2020-02-05 바이오스트림테크놀러지스(주) 신규 유산균 및 이를 이용한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 유산균 발효물의 제조방법
KR102097509B1 (ko) * 2018-07-26 2020-04-06 바이오스트림테크놀러지스(주) 신규 유산균 및 이를 이용한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 유산균 발효물의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150068670A (ko) 2015-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2518293C2 (ru) Средство против ожирения, питание или напиток против ожирения, улучшающее толерантность к глюкозе средство и питание или напиток для улучшения толерантности к глюкозе
KR101545551B1 (ko) 인슐린 저항성 개선 효능을 갖는 7종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물
JP5569710B2 (ja) 肥満予防又は改善剤
KR101992537B1 (ko) 신규한 락토바실러스 사케이 및 이를 포함하는 조성물
KR101912774B1 (ko) 포름산 생성능이 우수한 균주를 유효성분으로 포함하는 비만 또는 비만으로 야기된 대사증후군의 예방 또는 치료용 조성물
KR20060135016A (ko) 유카 추출물, 퀼라야 추출물 및 유산균을 포함하는 조성물및 상기 조성물을 함유하는 음식물
KR101426275B1 (ko) 지방합성 억제 및 지방산화 촉진에 의한 체지방 감소 효능을 갖는 5종의 유산균 복합균주를 유효성분으로 함유하는 조성물
KR20190118985A (ko) 비만의 예방 또는 치료 효과를 가지는 신규 비피도박테리움 롱검 균주 또는 락토바실러스 람노서스 균주 및 이의 용도
JP6923883B2 (ja) 栄養状態改善に使用するための組成物
JP7410336B2 (ja) ラクトバチルス・ガセリｂｎｒ１７を含む更年期疾患治療用組成物
EP3202892A1 (en) Uses of bacteroides in treatment or prevention of obesity-related diseases
JPWO2012073924A1 (ja) 子宮内膜症の予防及び／又は改善剤及びこれを含んでなる飲食品組成物
KR101823459B1 (ko) 헬리코박터 파이로리에 대한 항균활성과 응집력을 갖는 락토바실러스 파라카제이 hp7 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품
JP6793380B2 (ja) スクロース摂取による血糖値上昇を抑制する物質の評価方法、スクリーニング方法及び製造方法
JP5229977B2 (ja) 血中アディポネクチン濃度増加促進及び／又は減少抑制剤
JP2023514808A (ja) 抗酸化剤として使用するためのプロバイオティクス組成物
JP2007126399A (ja) グルタチオン増加用組成物
KR101504912B1 (ko) 인슐린 저항성 개선 효능을 가지는 락토바실러스 애시도필러스 hy7037 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품
JP6894242B2 (ja) 非アルコール性肝障害抑制剤
KR20230153832A (ko) 리모실락토바실러스 퍼멘툼 mg4295 균주를 포함하는 혈당 저하용 조성물
KR101535077B1 (ko) 인슐린 저항성 개선 효능을 가지는 비피도박테리움 락티스 hy8101 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품
US11857579B2 (en) Composition for promoting the secretion of FGF21
US20200069748A1 (en) Human-derived lactobacillus frementum mg4231 or lactobacillus frementum mg4244 strain having anti-obesity activity and composition comprising same
US20210268039A1 (en) Use of leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides sd23 for maternal fetal metabolic programming
JP5851242B2 (ja) チオレドキシン誘導活性を有する乳酸菌ならびにチオレドキシンを介する生体傷害の予防および／または改善用の飲食品および医薬品

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180809

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190809

Year of fee payment: 5