KR20160016280A - 타히보 추출물 또는 인삼잎 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 명세서는 타히보(Taheebo) 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개시한다. 본 명세서에 개시된 조성물은 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 포함하는 것에 의하여 iNOS 또는 COX-2를 활성화 시키고 NF-κB 또는 MAPKs 를 활성화시키며 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 사이토카인의 생성을 촉진한다. 따라서, 이러한 효과로 인해 본 명세서의 조성물은 면역 증강 효과 또는 대식세포 활성화 효과를 나타낼 수 있으며, 개체의 면역 증강용 조성물로서 약학 또는 식품 분야에서 널리 사용될 수 있다. 특히 본 명세서의 조성물은 사료 조성물로서도 사용될 수 있다.

Description

타히보 추출물 또는 인삼잎 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물{COMPOSITION FOR IMMUNE ENHANCEMENT COMPRISING TAHEEBO EXTRACT OR GINSENG LEAF EXTRACT}

본 명세서는 타히보 추출물 또는 인삼잎 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

인간 또는 동물의 병원체 감염에 대한 저항성 즉, 면역능은 동물 체내에 있는 각종 면역세포의 활성과 특정 병원체에 대한 면역 상태에 따라 좌우된다. 면역세포 중에서 호중구, 대식구, 수지상세포 등의 탐식세포들은 외부에서 침입하는 병원체를 비특이적으로 탐식, 제거하는 면역의 1차 방어선 역할을 하며, T 세포, B 세포 등은 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응인 특이면역반응을 담당하면서 1차방어선에서 저지하지 못한 병원체를 면역반응을 통하여 제어하는 면역의 2차방어선을 담당한다. 따라서, 비특이적인 면역을 담당하는 탐식세포와 특이면역을 담당하는 림프구 등이 면역의 중추적인 역할을 하게 되며 이들이 최적의 조화를 이룰 때 개체의 건강도 최상으로 유지하게 된다.

현재 병원체를 사멸시키기 위해 의지하고 있는 항생물질은, 바이러스에는 듣지 않고 내성균을 생성시킨다고 하는 문제를 안고 있다. 또한 아나필락시스(anaphylaxis)를 일으킨다고 하는 부작용도 있다. 스테로이드 등의 호르몬제나 면역억제제는 면역의 약체화(弱體化)를 통하여 병원균이나 기회감염균(opportunistic pathogen)에 감염이라고 하는 위험을 증대시키지만, 그 사용으로 인간을 포함하는 생명체를 정상화시킬 수 없다. 또한 인히비터(inhibitor)에 의한 치료도, 생체의 정상의 시스템을 저해하는 것에 의한 폐해가 강하게 지적되고 있다. 근치(根治)하지 못하는 약제를 계속해서 사용하는 것은 의료비의 증대에도 영향을 끼치고 있다. 이러한 문제를 해결하고자 하는 관점으로부터도, 안전하고 우수한 면역 증강용 조성물이 요구되고 있다.

KR10-2009-0025497 A KR10-2011-0118724 A

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 명세서는 안전하고 우수한 면역 증강용 조성물을 제공하고자 한다.

본 명세서는 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면으로서 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 명세서의 타히보(Taheebo) 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물은 iNOS 또는 COX-2를 활성화시키고 NF-κB 또는 MAPKs 를 활성화시키며 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 사이토카인의 생성을 촉진할 수 있다. 이러한 특성으로 인해 본 명세서의 조성물은 면역 증강 효과 또는 대식세포 활성화 효과를 나타낼 수 있으며, 개체의 면역 증강용 조성물로서 약학 또는 식품 분야에서 널리 사용될 수 있다. 특히 본 명세서의 조성물은 사료 조성물로서도 사용될 수 있다.

도 1은 타히보 에탄올 추출물의 지표물질을 분석한 결과이다.
도 2는 타히보 추출물에 포함된 TA4 및 TA5의 구조를 규명한 것이다.
도 3은 타히보 추출물에서 TA4 와 TA5의 피크(peak) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 명세서의 타히보(T, 이하 도면에서도 동일) 및 인삼잎 추출물(GL, 이하 도면에서도 동일)의 처리에 따른 세포생존력(cell viability)을 나타낸 그래프이다.
도5는 본 명세서의 타히보 및 인삼잎 추출물의 NO생성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6는 본 명세서의 타히보 및 인삼잎 추출물이 iNOS 및 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 그림이다.
도 7은 시간 및 농도에 따른 타히보 및 인삼잎 추출물의 NF-κB 활성화 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 시간 및 농도에 따른 타히보 및 인삼잎 추출물의 MAPKs 활성화 결과를 나타낸 그림이다.
도 9은 타히보 및 인삼잎 추출물이 iNOS 및 COS-2의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 10은 타히보 및 인삼잎 추출물이 여러 사이토카인의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11는 타히보 및 인삼잎 추출물이 IL-1β의 생성 촉진에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 12는 타히보 및 인삼잎 추출물이 IL-6 의 생성 촉진에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 13는 타히보 및 인삼잎 추출물이 TNF-α의 생성 촉진에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 타히보(Taheebo)(Tabebuia Avellanedae) 추출물 및 인삼잎(Ginseng leaf)(Panax ginseng C. A. Meyer) 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 면역 증강이 필요한 개체에 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로서 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역 증강 방법에 관한 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 투여는 본 명세서에 개시된 투여방법 또는 투여량에 따르거나 통상의 기술자가 용이하게 적용할 수 있는 투여에 따르는 것일 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 면역 증강이 필요한 개체는 동물일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 동물은 개, 고양이, 침팬지 등을 포함하는 포유류일 수 있으며, 구체적으로 동물은 애견일 수 있고, 더 구체적으로 동물은 5세 이상의 노견일 수 있다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로서 포함하는 조성물의 면역 증강 용도에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 면역을 증강시키는데 사용하기 위한 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로서 포함하는 조성물에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 세포 내 아질산염(nitrite) 생성 촉진용 조성물에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 대식세포 활성화용 조성물에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 iNOS 또는 COX-2 단백질 또는 mRNA 발현 촉진용 조성물에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 NF-κB 활성화용 조성물에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 NF-κB 활성화 경로 촉진용 조성물에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 p65 인산화용 또는 IκBα 분해용 조성물에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 MAPKs 활성화용 조성물에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 사이토카인 생성 촉진용 조성물에 관한 것일 수 있다.

구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물은 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물일 수 있다. 더 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 : 인삼잎 추출물의 중량비는 1:0.1 내지 1:10 일 수 있으며, 구체적으로 중량비는 1:0.1 이상, 1:0.2 이상, 1:0.3 이상, 1:0.5 이상, 1:0.7 이상, 1:0.8 이상, 1:0.9 이상, 1:1 이상, 1:1.1 이상, 1:1.2 이상, 1:1.5 이상, 1:1.7 이상, 1:2 이상, 1:5 이상, 또는 1:10 이상일 수 있으며, 1:10 이하, 1:9 이하, 1:5 이하, 1:3 이하, 1:2 이하, 1:1.7 이하, 1:1.5 이하, 1:1.2 이하, 1:1.1 이하, 1:1 이하, 1:0.9 이하, 1:0.8 이하, 1:0.7 이하, 1:0.5 이하, 1:0.3 이하, 1:0.2 이하, 또는 1:0.1 이하일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물은 유효성분을 조성물 전체 부피를 기준으로 1 μg/ml 내지 10g/ml로 포함할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물에 포함된 유효성분의 농도는 1 μg/ml 이상, 5 μg/ml 이상, 7 μg/ml 이상, 10 μg/ml 이상, 15 μg/ml 이상, 20 μg/ml 이상, 30 μg/ml 이상, 40 μg/ml 이상, 45 μg/ml 이상, 50 μg/ml 이상, 55 μg/ml 이상, 60 μg/ml 이상, 70 μg/ml 이상, 80 μg/ml 이상, 90 μg/ml 이상, 100 μg/ml 이상, 110 μg/ml 이상, 130 μg/ml 이상, 150 μg/ml 이상, 170 μg/ml 이상, 200 μg/ml 이상, 300 μg/ml 이상, 400 μg/ml 이상, 500 μg/ml 이상, 600 μg/ml 이상, 1000 μg/ml 이상, 10 mg/ml 이상, 100 mg/ml 이상, 1 g/ml 이상, 5 g/ml 이상, 또는 10 g/ml 이상일 수 있으며, 10 g/ml이하, 5 g/ml이하, 1 g/ml이하, 100 mg/ml 이하, 10 mg/ml 이하, 1000 μg/ml 이하, 600 μg/ml 이하, 500 μg/ml 이하, 400 μg/ml 이하, 300 μg/ml 이하, 200 μg/ml 이하, 170 μg/ml 이하, 150 μg/ml 이하, 130 μg/ml 이하, 110 μg/ml 이하, 100 μg/ml 이하, 90 μg/ml 이하, 80 μg/ml 이하, 70 μg/ml 이하, 60 μg/ml 이하, 50 μg/ml 이하, 40 μg/ml 이하, 30 μg/ml 이하, 20 μg/ml 이하, 10 μg/ml 이하, 또는 1 μg/ml 이하 일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보는 태베부이아 아벨레인데에(Tabebuia Avellanedae)의 내부 수피, 잎, 꽃, 열매, 줄기 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으며, 구체적으로 타히보는 태베부이아 아벨레인데에의 내부 수피 일 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보 추출물은 태베부이아 아벨레인데에(Tabebuia Avellanedae)의 내부 수피, 잎, 꽃, 열매, 줄기 및 뿌리 추출물 중 하나 이상일 수 있으며. 이들 추출물의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 또는 인삼잎 추출물은 물, 유기용매 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 추출물인 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 유기용매는 C₁~C₆의 저급 알코올, 부틸렌글리콜, 및 프로필렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으며, 더 구체적으로 저급 알코올은 에탄올일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보 추출물을 포함하는 조성물은 타히보 추출물의 총 중량을 기준으로 10mg/g 내지 60mg/g의 6-O-(3,4-디메톡시-벤조일)-아주골; 또는 10mg/g 내지 200mg/g의 6-O-(4-메톡시-벤조일)-아주골을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 또는 이를 포함하는 조성물은 6-O-(3,4-디메톡시-벤조일)-아주골(TH4)을 타히보 추출물의 총 중량을 기준으로 10mg/g 이상, 20mg/g 이상, 22mg/g 이상, 24mg/g 이상, 26mg/g 이상, 28mg/g 이상, 30mg/g 이상, 32mg/g 이상, 34mg/g 이상, 36mg/g 이상, 38mg/g 이상, 40mg/g 이상, 45mg/g 이상, 50mg/g 이상, 또는 60mg/g 이상 포함하거나 60mg/g 이하, 50mg/g 이하, 45mg/g 이하, 40mg/g 이하, 38mg/g 이하, 36mg/g 이하, 34mg/g 이하, 32mg/g 이하, 30mg/g 이하, 28mg/g 이하, 26mg/g 이하, 24mg/g 이하, 22mg/g 이하, 20mg/g 이하, 또는 10mg/g 이하로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 또는 이를 포함하는 조성물은 6-O-(4-메톡시-벤조일)-아주골(TH5)을 타히보 추출물의 총 중량을 기준으로 10mg/g 이상, 20mg/g 이상, 30mg/g 이상, 50mg/g 이상, 60mg/g 이상, 65mg/g 이상, 67mg/g 이상, 69mg/g 이상, 70mg/g 이상, 71mg/g 이상, 73mg/g 이상, 75mg/g 이상, 77mg/g 이상, 79mg/g 이상, 80mg/g 이상, 85mg/g 이상, 90mg/g 이상, 100mg/g 이상, 또는 200mg/g 이상 포함하거나 300mg/g 이하, 200mg/g 이하, 150mg/g 이하, 100mg/g 이하, 90mg/g 이하, 85mg/g 이하, 80mg/g 이하, 79mg/g 이하, 77mg/g 이하, 75mg/g 이하, 73mg/g 이하, 71mg/g 이하, 70mg/g 이하, 69mg/g 이하, 67mg/g 이하, 65mg/g 이하, 63mg/g 이하, 61mg/g 이하, 60mg/g 이하, 50mg/g 이하, 30mg/g 이하, 20mg/g 이하, 또는 10mg/g 이하로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 인삼잎 추출물을 포함하는 조성물은 인삼잎 추출물의 총 중량을 기준으로 7 내지 12mg/g의 진세노사이드 Rg1; 0.5 내지 2.0mg/g의 진세노사이드 Rb1; 0.001 내지 0.01mg/g의 진세노사이드 Rg3; 또는 진세노사이드 Rg1, Rb1, 및 Rb3의 합이 8 내지 15mg/g인 진세노사이드들을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 인삼잎 추출물 또는 이를 포함하는 조성물은 진세노사이드 Rg1을 인삼잎 추출물의 총 중량을 기준으로 1mg/g 이상, 3mg/g 이상, 5mg/g이상, 7mg/g 이상, 8mg/g이상, 9mg/g이상, 10mg/g이상, 11mg/g이상, 12mg/g이상, 13mg/g이상, 15mg/g이상, 또는 20mg/g이상으로 포함할 수 있으며 20mg/g이하, 15mg/g이하, 13mg/g이하, 12mg/g이하, 11mg/g이하, 10mg/g이하, 9mg/g이하, 8mg/g이하, 7mg/g이하, 5mg/g이하, 3mg/g이하, 1mg/g이하로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 인삼잎 추출물 또는 이를 포함하는 조성물은 진세노사이드 Rb1을 인삼잎 추출물의 총 중량을 기준으로 0.1mg/g 이상, 0.3mg/g 이상, 0.5mg/g 이상, 0.6mg/g 이상, 0.7mg/g 이상, 0.8 mg/g 이상, 0.9mg/g 이상, 1.0mg/g 이상, 1.1mg/g 이상, 1.2 mg/g 이상, 1.3mg/g 이상, 1.4mg/g 이상, 1.5mg/g 이상, 1.6mg/g 이상, 1.7mg/g 이상, 1.8mg/g 이상, 1.9mg/g 이상, 2.0mg/g 이상, 3.0mg/g 이상, 4.0mg/g 이상, 또는 5.0mg/g 이상으로 포함할 수 있으며 5.0mg/g 이하, 4.0mg/g 이하, 3.0mg/g 이하, 2.0mg/g 이하, 1.9mg/g 이하, 1.8mg/g 이하, 1.7mg/g 이하, 1.6mg/g 이하, 1.5mg/g 이하, 1.4mg/g 이하, 1.3mg/g 이하, 1.2mg/g 이하, 1.1mg/g 이하, 1.0mg/g 이하, 0.9mg/g 이하, 0.8mg/g 이하, 0.7mg/g 이하, 0.6mg/g 이하, 0.5mg/g 이하, 0.3mg/g 이하, 또는 0.1mg/g 이하로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 인삼잎 추출물 또는 이를 포함하는 조성물은 진세노사이드 Rg3을 인삼잎 추출물의 총 중량을 기준으로 0.001mg/g 이상, 0.005mg/g 이상, 0.01mg/g 이상, 0.02mg/g 이상, 0.03mg/g 이상, 0.04mg/g 이상, 0.05mg/g 이상, 0.06mg/g 이상, 0.07mg/g 이상, 0.08mg/g 이상, 0.09mg/g 이상, 0.1mg/g 이상, 0.2mg/g 이상, 0.3mg/g 이상, 0.4mg/g 이상, 또는 0.5mg/g 이상으로 포함하거나 0.5mg/g 이하, 0.4mg/g 이하, 0.3mg/g 이하, 0.2mg/g 이하, 0.1mg/g 이하, 0.09mg/g 이하, 0.08mg/g 이하, 0.07mg/g 이하, 0.06mg/g 이하, 0.05mg/g 이하, 0.04mg/g 이하, 0.03mg/g 이하, 0.02mg/g 이하, 0.01mg/g 이하, 또는 0.005mg/g 이하로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 인삼잎 추출물 또는 이를 포함하는 조성물은 인삼잎 추출물의 총 중량을 기준으로 진세노사이드 Rg1, Rb1, 및 Rb3의 합이 5mg/g 이상, 6mg/g 이상, 7mg/g 이상, 8mg/g 이상, 8.5mg/g 이상, 9mg/g 이상, 9.5mg/g 이상, 10mg/g 이상, 10.5mg/g 이상, 11mg/g 이상, 11.5mg/g 이상, 12mg/g 이상, 12.5mg/g 이상, 13mg/g 이상, 13.5mg/g 이상, 14mg/g 이상, 15mg/g 이상, 20mg/g 이상, 또는 25mg/g 이상이거나 25mg/g 이하, 20mg/g 이하, 15mg/g 이하, 14mg/g 이하, 13.5mg/g 이하, 13mg/g 이하, 12.5mg/g 이하, 12mg/g 이하, 11.5mg/g 이하, 11mg/g 이하, 10.5mg/g 이하, 10mg/g 이하, 9.5mg/g 이하, 9mg/g 이하, 8.5mg/g 이하, 8mg/g 이하, 7.5mg/g 이하, 7mg/g 이하, 6mg/g 이하, 또는 5mg/g 이하인 진세노사이드들을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물은 약학 또는 식품 조성물 일 수 있으며, 구체적으로 식품 조성물은 건강 식품 조성물 또는 동물 사료 조성물 일 수 있다. 더 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 동물 사료는 모든 동물에 대한 사료를 포함하나, 구체적으로 애견용 사료 조성물 일 수 있으며, 특히 5세 이상의 노견용 사료 조성물일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물은 동물용 조성물 일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, “노견”은 태어난지 5년 이상 된 애완견을 의미한다.

본 발명의 일 측면에 있어서, “면역 증강”은 개체의 면역력 또는 면역 시스템을 강화시키는 것을 의미한다. 생체 내에서 병원균 등에 의해 질병이 발생하는 것은 개체의 면역력과 병원균의 병원성의 상관관계에 있어서 개체의 면역력에 비해 병원균의 병원성이 우세하는 것으로 볼 수 있다. 따라서 개체의 면역력 또는 면역 시스템을 강화시키게 되면 생체 내에 병원균등이 침입한 경우에도 질병이 발생하지 않고 면역 시스템에 의해서 병원균 등이 사멸될 수 있을 것이다. 그러므로, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 개체의 면역을 증강시켜 질병으로부터 개체를 보호하는 효과를 추가적으로 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서,“추출물"은 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고, 천연물의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 모두 포함하는 것이며 또한 천연물의 성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함하는 광범위한 개념이며, 구체적으로 상기 가공 또는 처리는 추출물을 추가적으로 발효, 또는 효소처리 하는 것일 수 있다. 따라서 본 명세서에서 추출물은 발효물, 농축물, 건조물을 포함하는 광범위한 개념이며, 구체적으로 본 명세서에서 추출물은 발효물일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서,“타히보 추출물” 또는 “인삼잎 추출물”은 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고, 타히보 또는 인삼잎의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 모두 포함하는 것이며 그 성분을 뽑아내는 과정에서 열, 산(acid), 염기(base), 효소 등으로 처리하는 공정을 포함하는 추출 방법을 통해 얻어진 물질을 포함하며 또한 타히보 또는 인삼잎의 성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함하는 광범위한 개념이다. 구체적으로 상기 가공 또는 처리는 타히보 또는 인삼잎 추출물을 추가적으로 발효 또는 효소처리 등을 하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보 또는 인삼잎추출물은 발효물 일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, “타히보” 또는 “인삼잎”는 추출물의 형태이거나, 생(生) 타히보 또는 인삼잎, 생약 자체의 분쇄물, 생약의 건조물, 생약의 건조 분쇄물, 타히보 또는 인삼잎의 발효물 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 명세서에서 사용되는 타히보 또는 인삼잎은 그 입수 방법에 제한이 없으며, 재배하여 사용하거나 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있으며, 타히보의 경우 타베부이아 아벨레인데에(Tabebuia Avellanedae)의 지상부 또는 뿌리부의 일부 또는 전부를 사용할 수 있으며 인삼잎의 경우 인삼의 지상부로서 잎을 사용할 수 있다. 더 구체적으로 타히보는 타베부이아 아벨레인데에(Tabebuia Avellanedae)의 내부 수피, 잎, 꽃, 열매, 줄기 및 뿌리로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이 사용될 수 있으며, 더욱 구체적으로 내부 수피가 사용될 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보 또는 인삼잎의 경우 반드시 건조를 통해서 제조되는 것은 아니며 타히보 또는 인삼잎의 유효 성분을 추출하기에 적절한 형태의 원료라면 제한되지 않는다.

본 발명에서 이용되는 타히보(Taheebo)는 능소화과의 수목(Tabebuia Avellanedae)으로 아마존의 일부 지역에서만 자생하고, 고대 잉카제국시대에 원주민들이 “신의 은총을 받은 약목”이라는 뜻에서 타히보라고 불리어 왔으며, 고대 잉카 제국의 인디오들은 건강유지를 위해 이 수목차를 즐겨 마셨다고 한다. 타히보의 역사는 1500년 전 고대 잉카제국 원주민들이 타히보 약목에 버섯과 곰팡이가 번식하지 못할 정도로 탁월한 살균력이 있어 해충이 접근을 못하는 데에서 힌트를 얻어 껍질을 벗겨 내부수피를 차로 끓여 애음하여 각종 질병의 토속치료제로 사용해왔다. 때로는 주변국가와 금으로 물물교환을 했을 정도로 귀중품으로 취급되었다고 전해지고 있다. 타베뷔아속은 남아메리카에 100 종류 이상 자생하지만, 그 중에서도 특히 남미 브라질 일부 지역에만 자생하며 빨강 보라색의 꽃이 피는 높이 30m, 줄기 직경 50cm ~ 1.5m 정도의 거대 수목인 태베부이아 아벨레인데에만 타히보의 원료가 된다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 물은 증류수 또는 정제수를 포함하고, 유기 용매는 C₁~C₅의 저급 알코올을 예로 들 수 있는 알코올, 아세톤, 에테르, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 에틸메틸케톤 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 또는 인삼잎 추출물은 타히보-C₁~C₆ 알코올 추출물 또는 인삼잎-C₁~C₆ 알코올 추출물을 포함할 수 있고, 구체적으로 상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 또는 인삼잎 추출물은 타히보 또는 인삼잎을 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합물로 추출하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 수득될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 또는 인삼잎 추출물은 물, 유기용매, 및 이들이 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 용매의 조추출물일 수 있다. 상기 유기용매는 C₁-C₆ 알코올일 수 있으며, 구체적으로 C₁-C₆ 알콜은 메탄올 또는 에탄올 일 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 또는 인삼잎을 용매로 추출 시, 타히보 또는 인삼잎의 약 5 내지 15배 정도에 해당하는 용매를 가하여 추출하는 것이 바람직하며, 구체적으로 약 10 배의 용매를 가하여 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 추출은 열수 추출, 에탄올 추출, 가열 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 환류냉각 추출, 또는 초음파 추출 등이 이용될 수 있으며, 당업자에게 자명한 추출법이라면 제한이 없으며, 구체적으로 추출은 열수추출 또는 에탄올 추출 일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 추출은 실온에서 수행할 수도 있으나, 보다 효율적인 추출을 위해서는 가온 조건 하에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 약 40 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 약 80℃의 온도에서 추출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추출시간은 약 2 내지 약 14시간, 구체적으로는 8시간 내지 14시간, 더욱 구체적으로는 11시간 내지 13시간, 가장 구체적으로는 12시간 동안 수행할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 추출 용매 및 추출 온도 등의 조건에 따라 달라질 수 있다. 상기 추출은 활성성분을 보다 다량 수득하기 위해 1 회 이상 여러 번 추출할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 5회, 더욱 바람직하게는 3회 연속추출하여 합한 추출액을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 타히보 추출물 또는 인삼잎 추출물은 상기와 같이 타히보 또는 인삼잎의 조추출물을 포함할 수 있고, 상기 조추출물을 극성이 낮은 유기 용매로 더욱 추출하여 얻어진 유기 용매의 가용성 분획물로서 포함할 수도 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 유기 용매로는 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸 아세테이트, n-부탄올 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 방법으로 추출한 추출물 또는 그 추출물의 가용성 분획물은 그대로 사용할 수도 있으나, 여과 후 농축하여 엑기스 형태로 사용할 수 있으며, 농축 후 건조하여 건조물의 형태로서 사용할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 건조는 증발 건조, 분무 건조, 동결 건조일 수 있으며, 구체적으로 동결 건조시에는 -50 내지 -70℃ 에서 3~4일 동안 동결 건조를 수행할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 연질 또는 경질 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎, 바람직하게는 1~100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 피부 외용제, 좌제, 주사제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 주사제 또는 피부 외용제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 경피(trandermally), 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 조성물은, 통상의 기술자가 용이하게 적용할 수 있는 다양한 경로로 투여될 수 있다. 특히 본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물은 피부 외용제로서 피부 표면에 도포되는 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 드링크제와 같은 액제, 캐러멜, 겔, 바 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 5000mg/kg/일, 보다 구체적으로는 50 mg/kg/일 내지 500 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.

상기 외에 본 발명의 일 측면에 있어서, 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 일 측면에 있어서, 기능성 식품 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 일 측면에 있어서, 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 포함되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 타히보 추출물의 제조

타베부이아 아벨레인데에의 내부수피를 수확한 뒤 이를 세척 및 열풍건조하고 분쇄하여 분말화 하였다. 얻어진 타히보 분말 1kg에 70% 에탄올 3L를 가하여 상온에서 4시간 동안 환류추출한 다음, 여과한 후 40℃에서 감압 농축하여 타히보 추출물을 수득하였다. 하기 실험에서는 ㈜하티(강원도 홍천군, 대한민국)에서 구입한 타히보 추출물을 사용하였다.

[실시예 2] 인삼잎 추출물의 제조

인삼잎을 수확한 뒤 이를 세척 및 열풍건조하고 분쇄하여 분말화 하였다. 얻어진 인삼잎 분말 1kg에 70% 에탄올 3L를 가하여 상온에서 4시간 동안 환류추출한 다음, 여과한 후 40℃에서 감압 농축하여 인삼잎 추출물을 수득하였다. 하기 실험에서는 ㈜하티(강원도 홍천군, 대한민국)에서 구입한 인삼잎 추출물을 사용하였다.

[실시예 3] 타히보 추출물과 인삼잎 추출물의 혼합물 제조

실시예 1의 타히보 추출물과 실시예 2의 인삼잎 추출물을 각각 1 : 2 의 중량비로 혼합하며 타히보 추출물과 인삼잎 추출물의 혼합물을 제조하였다.

[실험예 1] 타히보 추출물과 인삼잎 추출물 지표물질의 분석

(1) 타히보 추출물 지표물질의 분리, 구조분석 및 함량 분석

타히보 추출물을 TLC(Thin layer chromatography), column chromatograph, GC 및 HPLC를 수행하여 분리하였다. 분리 결과는 도 1과 같다.

먼저 타히보 추출물을 Si MPLC를 이용하여 9개의 서브프렉션으로 나눈 뒤 이중 5번 프렉션을 다시 R.P prep HPLC을 통해 6개의 물질을 분리하였다.

각 조건은 다음과 같다.

Si MPLC , flow : 5mL/min

CHCl3 : MeOH = 95 : 5, 4 hours CHCl3 : MeOH = 91 : 9, 4 hours

CHCl3 : MeOH = 90 : 10, 4 hours CHCl3 : MeOH = 80 : 20, 4 hours

CHCl3 : MeOH = 50 : 50, 8 hours

R.P prep HPLC

40~55% MeOH for 40min

55~100% MeOH for 45min

~100% MeOH for 65min

도 1에서 나타난 지표물질 중 TA4 및 TA5의 구조 분석을 위해 분광학적 분석법 NMR(Nuclear Magnetic Resonance)을 통해 물질의 화학구조를 확인하였다. NMR 기기는 Bruker DPX 400 MHz (9.4T)를 사용하였으며, ¹H-NMR은 400 MHz, ¹³C-NMR은 100 MHz에서 측정하여 화학구조를 규명하였다. 물질의 구조를 분석한 결과는 도 2와 같다.

이러한 TA4 및 TA5가 타히보 추출물에 얼마나 함유되어 있는 지 확인하기 위하여 HPLC를 수행하였으며, 수행조건은 하기 표 1과 같다.

Column	Shim-pack, VP-ODS, 4.6*250 mm, anal.
HPLC solvent condition	30~55% MeOH for 40min, gradient 55~100% MeOH for 45min, gradient ~100% MeOH for 65min, isocratic.
Flow	1ml/min
UV	260nm

HPLC에 따른 결과는 도 3과 같으며, 이를 표로 나타내면 하기 표 2와 같다.

로트(lot)별 지표물질의 함량 분석
	함량 (mg/g)			평균 (mg/g)	표준편차 (mg/g)
	1회	2회	3회
TA-4	32.15	32.13	32.48	32.25	0.196
TA-5	68.71	69.74	72.28	70.25	1.837

(2) 인삼잎 추출물의 진세노사이드 함량 분석

	1차 추출농축액		2차 추출농축액
	평균(mg/g)	편차	평균(mg/g)	편차
Rg1	10.914	0.03	10.568	0.654
Re	26.459	0.06	21.661	1.564
Rb1	0.807	0.04	1.599	0.16
Rf	1.123	0.02	1.011	0.069
Rc	1.035	0.07	1.095	0.11
Rb2+Rb3	4.483	0.11	4.415	0.333
Rg2	1.908	0.09	1.151	0.188
Rh1	0.911	0.05	0.518	0.108
Rd	3.847	0.31	3.304	0.533
F1	2.834	0.10	3.095	0.186
Rg3	0.067	0.02	0.031	0.022
Ck	0.103	0.01	0.053	0.008
Rh2	0.147	0.06	0.036	0.027
합계	54.636	0.83	48.537	3.583
Rg1+Rb1+Rg3	11.787	0.03	12.197	0.79

[실험예 2] 세포배양 및 세포독성시험과 NO 생성량 측정

(1) 세포배양

RAW 264.7 세포(ATCC에서 구입)는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)(FBS) 및 항생제 (100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)과 100 U/ml 페니실린(penicillin))가 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified eagle's medium)으로 37℃, 7% CO2 배양기에서 100 mm 배양조로 배양하였고 2일에서 3일에 한 번씩 분주함과 동시에 배양액을 갈아주었다.

(2) 세포독성시험

6 웰 플레이트에 1×10⁶ 세포(cells)/ml로 세포를 동일하게 분주하고 24시간 동안 배양한 후 실시예 3에 따른 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물의 혼합물을 0ug/ml, 10ug/ml, 50ug/ml, 100ug/ml, 200ug/ml의 농도로 DMEM(10중량% FBS + 1중량% PS)배지에 희석하여 각 플레이트에 첨가 하였다. 24시간이 지난 후 MTT시약(Sigma사에서 구입)을 넣고 4시간 동안 어두운 곳에서 배양한 후 상등액을 제거하고 형성된 MTT 포르마잔(formazan)을 이소프로판올(isopropanol) 1 ml에 첨가하여 녹였다. 10분 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이러한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 따르면 실시예 3에 따른 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물의 혼합물은 200ug/ml의 농도에서도 0.5ug/ml 농도의 LPS보다 더 높은 세포 생존력을 나타내었으며, 모든 농도에서 세포생존력이 90%이상 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물의 혼합물은 세포 독성이 없는 것을 확인할 수 있으며, 이는 타히보 추출물과 인삼잎 추출물 각각을 처리한 경우에도 유사하게 나타날 것이다.

(3) NO 생성량 측정

RAW 264.7 세포(ATCC)에 실시예 3에 따른 추출물(0ug/ml, 10ug/ml, 100ug/ml, 200ug/ml)과 양성대조군으로서 LPS(0.5ug/ml)를 처리한 후 18시간동안 배양 하였다. 얻어진 세포 배양액으로 그리스 시약 시스템(Griess reagent system)을 이용하여 아질산염(Nitrite)(니트라이트)를 측정하였다. 이러한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 따르면 실시예 3에 따른 추출물의 농도가 높아질수록 아질산염의 생성량이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 아질산염은 외부 자극으로부터 각 사이토카인이 활성화 되면 분비되는 인자로서 면역활성에 관여하고 있다. 따라서 아질산염의 양이 증가하게 되면 면역활성을 촉진시킨다는 것을 의미하게 된다. 그러므로, 타히보 추출물과 인삼잎 추출물의 혼합물이 그 농도가 증가할수록 아질산염의 생성량이 증가하는 것으로 보아, 이러한 추출물들은 면역 증강 효과가 있음을 확인할 수 있다.

[실험예 3] 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물의 면역 증강 여부 실험

(1) 웨스턴 블롯 분석

세포내에서 존재하는 단백질들은 분석하기 위하여 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 이용하였다. 전기영동을 위해 실시예 3에 따른 추출물과 양성대조군으로서 LPS를 첨가한 세포들을 라이시스 버퍼(lysis buffer) (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% NP-40, 0.25% 소디움 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 μg/ml 류펩틴(leupeptin), 1 mM Na3VO₄, 1 mM NaF) 에 녹인 후 4℃ 에서 30분 동안 배양(incubation) 하였다. 그 후 소니케이션(sonication) 되어 13,500rpm에서 15분간 원심 분리하여 상층액만 모았다. 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacylamide geel electrophoresis) 로 분리시킨 후, 단백질을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 트랜스퍼(transfer)하였다. 이 막을 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해 블로킹 버퍼(blocking buffer) (10% 무지방 분유(non-fat dry milk)와 0.1% Tween 20을 함유한 TBS용액)에서 2시간 동안 반응시켰다. TBST(137mM NaCl, 20mM Tris-HCL, pH7.6, 0.1%(v/v) Tween 20)로 10분씩 3번 세척한 후 iNOS(Rabbit, BD), COX-2(Goat, Santa Cruz), ERK(Rabbit, Cell Signalling), p-ERK(Rabbit, Cell Signalling), p38(Rabbit, Cell Signalling), p-p38(Rabbit, Cell Signalling), JNK(Rabbit, Cell Signalling), p-JNK(Rabbit, Cell Signalling), p-p65(Rabbit, Cell Signalling), IκBα(Rabbit, Cell Signalling), β-actin(Goat, Santa Cruz) 항체(antibody)로 4℃에서 하룻 밤 동안(overnight) 반응시킨 후 TBST로 10분씩 3번 닦은 후 1/10,000으로 희석(dilution)한 퍼옥시다아제-결합 안티-폴리클로날 래빗, 고트 IgG 항체(peroxidase-conjugated anti-polyclonal rabbit, goat IgG antibody)로 다시 2시간 동안 반응시켰다. 항체와 반응하고 있는 항원은 ECL(enhanced chemiluminescence) 기질과 반응시켜 X 선 필름(X-ray film)을 덮어서 감광시켰다. iNOS 및 COX-2에 대한 웨스턴 블롯 결과는 도 6, p65, IκBα, 및 β-actin에 대한 결과는 도 7, 나머지 ERK, p-ERK, p38, p-p38, JNK, 및 p-JNK 에 대한 결과는 도 8에 나타내었다.

도 6에 따르면, 실시예 3에 따른 추출물의 농도가 높아질수록 iNOS 및 COX-2의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 대식세포가 활성화되면 iNOS 와 COX-2의 발현이 증가하게 된다. 따라서, 본 발명의 일측면에 따른 조성물은 대식세포를 활성화시켜 현저한 면역 증강 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

도 7에 따르면 실시예 3에 따른 추출물을 15분 동안 처리하는 경우에 NF-κB가 가장 활성화 되는 것을 확인하였으며(A), 농도 의존적으로 p65와 IκBα의 분해가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(B). 이러한 결과에 따르면 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 NF-κB 경로를 활성화 시킨다. NF-κB는 염증반응, 면역반응 등 다양한 유전자 발현에 관여하는 전사인자에 해당하며, 이러한 경로를 촉진하면 대식세포를 화성화시키게 되므로 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 현저한 면역 증강 효과 및 대식세포 활성화 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

도 8에 따르면 실시예 3에 따른 추출물은 15분 처리하는 경우에 단백질들을 가장 활성화시켰으며(A), 농도 의존적으로 ERK, p38, JNK의 인산화를 증가시키는 것을 확인할 수 있다(B). MAPKs는 ERK, p38, 및 JNK로 이루어져 있으며, 활성화되면 세포 활성, 분화 등을 조절하는 신호전달 단백질에 해당한다. 따라서 상기 결과에 따르면 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 MAPKs 경로를 촉진시키는 것을 확인할 수 있으며 이로 인하여 대식세포를 활성화 시키게 되므로 현저한 면역 증강 효과 및 대식세포 활성화 효과를 나타낸다.

(2) 실시간 PCR 분석

실시예 3에 따른 추출물과 양성대조군으로서 LPS를 첨가한 RAW 264.7 세포(ATCC)에서 트리아졸 시약 키트(Trizol reagent kit)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 분리 추출된 RNA (2 μg)은 10,000 U 역전사효소(reverse transcriptase)와 0.5g/L 올리고(oligo)-(dT)15 프라이머(primer)로 역전사 과정을 실시한 후 SYBER Green과 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6, IL-1β, β-actin의 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 실시하였다. 실시간 PCR은 초기변성 95℃ 30초, 변성은 95℃ 5초, 어닐링(annealing)은 55℃ 15초, 신장반응은 72℃ 10초로 하여 40 사이클을 진행했다. 용해곡선은 55℃에서 시작하여 95℃를 종말점으로 0.5℃씩 상승시키며 80번을 반응하여 원하는 형광 값을 검출하였다. 프라이머 서열은 하기 표 4와 같다. iNOS, 및 COX-2에 대한 mRNA 발현 측정 결과는 도 9에 나타내었으며, TNF-α, IL-6, IL-1β, β-actin에 대한 결과는 도 10에 나타내었다.

iNOS	정방향 프라이머(Forward primer)	TTCCAGAATCCCTGGACAAG(SEQ ID NO: 1)
	역방향 프라이머(Reverse primer)	TGGTCAAACTCTTGGGGTTC(SEQ ID NO: 2)
COX-2	정방향 프라이머	AGAAGGAAATGGCTGCAGAA(SEQ ID NO: 3)
	역방향 프라이머	GCTCGGCTTCCAGTATTGAG(SEQ ID NO: 4)
TNF-α	정방향 프라이머	AGCCCCCAGTCTGTATCCTT(SEQ ID NO: 5)
	역방향 프라이머	CATTCGAGGCTCCAGTGAAT(SEQ ID NO: 6)
IL-6	정방향 프라이머	CAAGAAAGACAAAGCCAGAGTCCTT(SEQ ID NO: 7)
	역방향 프라이머	TGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC(SEQ ID NO: 8)
IL-1β	정방향 프라이머	GGGCCTCAAAGGAAAGAATC(SEQ ID NO: 9)
	역방향 프라이머	TACCAGTTGGGGAACTCTGC(SEQ ID NO: 10)
β-actin	정방향 프라이머	AGTGTGACGTTGACATCCGTAAAGA(SEQ ID NO: 11)
	역방향 프라이머	GGACAGTGAGGCCAGGATGG(SEQ ID NO: 12)

도 9에 따르면 농도의존적으로 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 대식세포가 활성화되면 iNOS 와 COX-2의 발현이 증가하게 된다. 따라서, 본 발명의 일측면에 따른 조성물은 대식세포를 활성화시켜 현저한 면역 증강 효과를 나타냄을 확인할 수 있다

도 10에 따르면 농도의존적으로 β-actin에 대한 비율로서 TNF-α, IL-6, 및 IL-1β의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 대식세포가 활성화되면 TNF-α, IL-6, 및 IL-1β의 발현이 증가하게 된다. 따라서, 본 발명의 일측면에 따른 조성물은 대식세포를 활성화시켜 현저한 면역 증강 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

(3) ELISA

샌드위치(Sandwich) ELISA 를 이용하여 TNF-α, IL-6, IL-1β의 발현을 측정하였다. R＆D 시스템을 이용하여 실험을 수행하였다. 먼저 캡쳐 항체(capture antibody)를 96 웰에 2 μg/ml 되게 넣었고 37℃에서 2시간 배양 한 후 PBST로 3회 세척 하였다. 블로킹 용액(Blocking solution) (1% BSA in PBS)을 400 μl씩 넣어준 후 37℃에서 1시간 배양 한 후 양성 대조군으로서 LPS(0.5ug/ml)와 실시예1(50ug/ml, 200ug/ml), 실시예 2(50ug/ml, 200ug/ml), 실시예 3(50ug/ml, 200ug/ml)에 따른 추출물을 첨가한 시료 세포 배양액을 각 웰에 넣어 준 후 37℃에서 2시간 배양하였다. PBST로 3회 세척 한 후, 디텍션 항체(detection antibody)를 각 웰당 100 ng/ml 넣고, 37℃에서 2시간 배양 한 후 PBST 로 3회 세척 하였고 스트렙타아비딘(streptavidin)이 컨쥬게이션(conjugation) 된 HRP(horseradish peroxidase)를 200:1 로 희석하여 각 웰에 50 μl 넣었다. 37℃ 에서 30분간 배양 한 후 PBST 로 3회 세척 하였다. TMB 용액을 50 μl 넣고 상온에서 30분간 배양 한 후 반응 정지 용액(stop solution)을 TMB 용액과 1:1 이 되게 넣어 주었다. 이 후 450 nm에서 흡광도를 ELISA 리더(reader)로 측정하였다. 이러한 결과는 도 11 내지 도 13에 나타내었다.

도 11에 따르면 본 발명의 일 측면에 따른 조성물로서 타히보 추출물(타, 이하 도면에서 동일), 인삼잎 추출물(잎, 이하 도면에서 동일) 및 타히보 추출물과 인삼잎 추출물의 혼합물(타+잎, 이하 도면에서 동일)의 IL-1β 생성 촉진효과를 확인할 수 있다. 타히보 추출물의 경우 200ug/ml를 처리한 경우 IL-1β 생성 촉진효과를 나타내었으며 인삼잎 추출물의 경우 50ug/ml와 200ug/ml에서 모두 생성 촉진효과를 나타내었다. 특히 타히보와 인삼잎 추출물의 혼합물은 각각의 추출물 보다 뛰어난 IL-1β 생성 촉진 효과를 나타내었으며, 특히 200ug/ml에서는 LPS와 유사한 수준의 촉진효과를 나타내었다.

도 12에 따르면 본 발명의 일 측면에 따른 조성물들의 IL-6 생성 촉진효과를 확인할 수 있다. 특히 인삼잎 추출물의 경우 50ug/ml 및 200ug/ml에서 LPS와 유사한 수준으로 IL-6의 생성을 촉진하는 효과를 나타내었으며, 타히보 추출물과 인삼잎 추출물의 혼합물은 이보다 더 뛰어난 생성 촉진효과를 나타내었다.

도 13에 따르면 본 발명의 일 측면에 따른 조성물들의 TNF-α생성 촉진효과를 확인할 수 있다. 타히보 추출물의 경우 200ug/ml에서 TNF-α생성 촉진 효과를 나타내었으며, 특히 인삼잎 추출물의 경우 50ug/ml 및 200ug/ml에서 모두 LPS와 비슷하거나 이보다 뛰어난 TNF-α생성 촉진 효과를 나타내었으며 타히보 추출물과 인삼잎 추출물의 혼합물의 경우 그보다 더 뛰어난 효과를 나타내었다.

따라서, 상기 결과를 살펴보면 본 발명의 일 측면에 따른 타히보 추출물과 인삼잎 추출물 각각은 현저한 면역 증강 효과를 나타낸다는 점을 확인할 수 있으며, 이들의 혼합물은 그보다 더 뛰어난 면역 증강효과를 가진다는 점을 확인할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 연질 캡슐

실시예 3의 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 8mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 팜유 2mg, 식물성 경화유 8mg, 황납 4mg 및 레시틴 9mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 혼합하여 연질 캡슐 충진액을 제조한다. 1 캡슐당 400㎎씩 충진하여 연질 캡슐을 제조한다. 그리고, 상기와 별도로 젤라틴 66 중량부, 글리세린 24 중량부 및 솔비톨액 10 중량부의 비율로 연질 캡슐 시트를 제조하고 상기 충진액을 충진시켜 본 발명의 일 측면에 따른 조성물 400mg이 함유된 연질 캡슐을 제조한다.

[제형예 2] 정제

실시예 3의 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 8mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 갈락토올리고당 200㎎, 유당 60㎎ 및 맥아당 140㎎을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스테르(sugar ester) 6㎎을 첨가한다. 이들 조성물 500mg을 통상의 방법으로 타정하여 정제를 제조한다.

[제형예 3] 드링크제

실시예 3의 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 8mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 올리고당 25g을 혼합한 후 정제수 300㎖를 가하여 각 병에 200㎖씩 되도록 충진한다. 병에 충진한 후 130℃에서 4∼5초간 살균하여 드링크제를 제조한다.

[제형예 4] 과립제

실시예 3의 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물 8mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 무수결정 포도당 250㎎ 및 전분 550㎎을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하여 과립제를 제조한다.

[제형예 5] 주사제

하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 주사제를 제조하였다.

배합 성분	함량
실시예 3의 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물	10-50 mg
주사용 멸균 증류수	적량
pH 조절제	적량

[제형예 6] 건강기능식품

하기 표 6에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 건강기능식품을 제조하였다.

배합 성분	함량
실시예 3의 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물	20mg
비타민 A 아세테이트	70μg
비타민 E	1.0mg
비타민 B1	0.13mg
비타민 B2	0.15mg
비타민 B6	0.5mg
비타민 B12	0.2μg
비타민 C	10mg
비오틴	10μg
니코틴산아미드	1.7mg
엽산	50μg
판토텐산 칼슘	0.5mg
황산 제1철	1.75mg
산화아연	0.82mg
탄산마그네슘	25.3mg
제1인산칼륨	15mg
제2인산칼슘	55mg
구연산칼륨	90mg
탄산칼슘	100mg
염화마그네슘	24.8mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

[제형예 7] 건강 음료

하기 표 7에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 건강음료를 제조하였다.

배합 성분	함량
실시예 3의 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물	1000mg
구연산	1000mg
올리고당	100 g
타우린	1g
정제수	잔량

통상의 건강 음료 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균한다.

[제형예 8] 애견용 사료

하기 표 8에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 애견용 사료 조성물을 제조하였다.

배합 성분	함량(중량%)
실시예 3의 타히보 추출물 및 인삼잎 추출물	1
대두박	15
쌀	5
우육골분	15
L-카르니틴	0.05
비타민 C	0.2
식염	0.25
옥수수분말	잔량(사료 조성물이 100중량%가 되도록)

통상의 애견용 사료 조성물의 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음 익스트루더(Extruder)에 투입하고 압출 후 절단한 다음 건조하여 애견용 사료 조성물을 제조하였다.

<110> Hongcheon Institute of Medicinal Herb <120> COMPOSITION FOR IMMUNE ENHANCEMENT COMPRISING TAHEEBO EXTRACT OR GINSENG LEAF EXTRACT <130> 14p259ind <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of iNOS <400> 1 ttccagaatc cctggacaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of iNOS <400> 2 tggtcaaact cttggggttc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of COX-2 <400> 3 agaaggaaat ggctgcagaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of COX-2 <400> 4 gctcggcttc cagtattgag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of TNF-alpha <400> 5 agcccccagt ctgtatcctt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of TNF-alpha <400> 6 cattcgaggc tccagtgaat 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of IL-6 <400> 7 caagaaagac aaagccagag tcctt 25 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of IL-6 <400> 8 tggatggtct tggtccttag cc 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of IL-1 beta <400> 9 gggcctcaaa ggaaagaatc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of IL-1 beta <400> 10 taccagttgg ggaactctgc 20 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of beta-actin <400> 11 agtgtgacgt tgacatccgt aaaga 25 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of beta-actin <400> 12 ggacagtgag gccaggatgg 20

Claims (15)

1. 타히보(Taheebo) 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 타히보(Taheebo) 추출물 및 인삼잎 추출물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 대식세포 활성화용 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   타히보 추출물 및 인삼잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   타히보 추출물 및 인삼잎 추출물의 중량비는 1:0.1 내지 1:10인 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   타히보 추출물 및 인삼잎 추출물의 중량비는 1:0.5 내지 1:2인 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   유효성분은 조성물 전체 부피를 기준으로 1 μg/ml 내지 500 μg/ml인 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   타히보는 태베부이아 아벨레인데에(Tabebuia Avellanedae)의 내부 수피, 잎, 꽃, 열매, 줄기 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   타히보는 태베부이아 아벨레인데에의 내부 수피인 조성물.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   타히보 추출물 또는 인삼잎 추출물은 물, 유기용매 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 추출물인 조성물.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    타히보 추출물을 포함하는 조성물은 타히보 추출물의 총 중량을 기준으로
    10mg/g 내지 60mg/g의 6-O-(3,4-디메톡시-벤조일)-아주골; 또는
    10mg/g 내지 200mg/g의 6-O-(4-메톡시-벤조일)-아주골을 포함하는 조성물.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    인삼잎 추출물을 포함하는 조성물은 인삼잎 추출물의 총 중량을 기준으로
    7 내지 12mg/g의 진세노사이드 Rg1;
    0.5 내지 2.0mg/g의 진세노사이드 Rb1;
    0.001 내지 0.01mg/g의 진세노사이드 Rg3; 또는
    진세노사이드 Rg1, Rb1, 및 Rb3의 합이 8 내지 15mg/g인 진세노사이드들을 포함하는 조성물.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    조성물은 약학 또는 식품 조성물인 조성물.
13. 제12항에 있어서,
    식품 조성물은 건강 식품 조성물 또는 동물 사료 조성물인 조성물.
14. 제13항에 있어서,
    동물 사료 조성물은 애견용 사료 조성물인 조성물.
15. 제14항에 있어서,
    애견용 사료 조성물은 5세 이상의 노견용 사료 조성물인 조성물.

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