KR101510413B1 - １６１ｐ２ｆ１０ｂ 단백질에 결합하는 항체 약물 컨쥬게이트 - Google Patents

１６１ｐ２ｆ１０ｂ 단백질에 결합하는 항체 약물 컨쥬게이트 Download PDF

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아야 자코보비츠
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Abstract

161P2F10B 단백질과 결합하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC's)가 본 명세서에 설명된다. 161P2F10B는 정상 성인 조직에서 조직 특이적 발현을 나타내고, 표 I에서 열거하는 암에서 비정상적으로 발현된다. 결과적으로, 본 발명의 ADC's 는 암 치료를 위한 치료적 조성물을 제공한다.

Description

１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ 단백질에 결합하는 항체 약물 컨쥬게이트{ANTIBODY DRUG CONJUGATES (ADC) THAT BIND TO 161P2F10B PROTEINS}
관련출원과의 상호 참조
이 출원은 2010년 2월 8일 출원된 미국 가출원 제61/302,489호의 우선권을 주장한다. 이 기초출원의 내용은 본 명세서에 전체가 참조로 포함된다.
연방 지원 연구 하의 발명에 대한 권리의 진술
해당 없음.
EFS - WEB 을 통해 제출된 서열 목록에 대한 언급
MPEP §730 II.B.2(a)(C)에 의해 인증되고 제시된 USPTO EFS-WEB 서버를 통한 다음의 서열 목록의 전자적 제출의 완전한 내용은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 포함된다. 서열 목록은 다음과 같은 전자적으로 제출된 텍스트 파일로 확인된다:
Figure 112012072574899-pct00001
발명의 기술분야
본 명세서에서 설명되는 발명은 161P2F10B로 칭해지는 단백질과 결합하는 항체 약물 컨쥬게이트(antibody drug conjugate, ADC)에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 암 치료에서 유용한 예후적이고, 예방적이며 치료적인 방법 및 조성물에 관한 것이다.
암은 관상 동맥질병 다음으로 인간 사망의 두 번째 유발 원인이다. 전 세계적으로 수백만명의 사람들이 매년 암으로 사망한다. 미국암학회(American Cancer Society)에 의해 보고되는 바와 같이 미국에서만 암은 매년 50만명을 넘는 사람들의 사망 원인이며, 1년 당 120만 초과의 새로운 경우가 진단된다. 심장병에 의한 사망이 상당히 감소되었지만, 암으로부터 초래되는 사망은 일반적으로 상승 중에 있다. 다음 세기의 초기에, 암은 사망의 주된 원인이 될 것으로 예측된다.
전세계적으로, 몇몇 암은 주된 살인자로 판명되었다. 거의 예외없이, 암종으로부터의 전이성 질병은 치명적이다. 게다가 초기에 원발성 암으로 생존한 암 환자에서 조차도, 통상적인 경험은 그들의 수명이 극적으로 변경된다는 것을 나타낸다. 다수의 암 환자는 재발 또는 치료 실패에 대한 가능성의 의식에 의해 이끌린 강한 불안감을 경험한다. 다수의 암 환자는 치료 후 신체적 쇠약을 경험한다. 더 나아가, 다수의 암 환자들은 재발을 경험한다.
PSA, PSM, PCTA 및 161P2F10B와 같은 이전에 확인된 마커들이 전립선 암을 진단하고 치료하기 위한 노력을 용이하게 하였지만, 진단 및 치료를 추가로 개선시키기 위하여 전립선 및 관련된 암에 대한 추가적인 마커 및 치료적 표적의 확인을 위한 필요가 있다.
신세포암(Renal Cell Cancer, RCC)은 현재 미국에서 암 사망의 주된 원인으로 10위에 랭크된다. 미국에서 51,190명의 추정되는 사람들이 신세포암으로 매년 진단될 것이고, 2007년에 대략 12,890명이 이 질병으로 사망하였다(미국 암 학회). 역사적으로, 치료는 신적출 후 비특이적 면역치료, 및 때때로 방사선 치료에 주로 중점을 두었다(Hauke, 2006). 비특이적 면역치료는 단일 약제로서 또는 조합으로 사이토카인 인터류킨-2 또는 인터페론-α에 의한 치료를 포함한다. 수술적 절개 후, 20%~30%의 환자는 1년~3년 내에 종종 폐에서 전이성 질병이 생길 것이다. 전이성 질병이 있는 환자의 생존 중앙값은 대략 13개월이다(Cohen and McGovern, 2005).
2005년 이후로, 신세포암의 진보된 치료를 위해 FDA에 의해 6가지 약제가 승인되었다. 이런 진보는 신세포암에 연루된 특이적 경로를 표적화하는 몇몇 약제를 포함한다. 이 약제는 소라페닙(Nexavar® 2005년 12월에 FDA 승인됨), 수니티닙(Sutent® 2006년 1월에 FDA 승인됨), 템시롤리무스(Torisel® 2007년 5월에 FDA 승인됨), 에베롤리무스(Affinitor® 2009년 3월에 FDA 승인됨), 베바시주맙(인터페론 알파와 조합된 Avastin® 2009년 8월에 FDA 승인됨) 및 파조파닙(Votrient®2009년 10월에 FDA 승인됨)을 포함한다. 그러나, 치료의 진보에도 불구하고, 전이성 신세포암은 치료할 수 없는 채로 남아있으며, 단지 템시롤리무스가 전체 생존율의 이점을 기반으로 승인되었다.
추가적으로, 간세포성 암종(즉, 간암)은 모든 간암의 80%~90%를 차지한다. 이 유형의 간암은 여성보다는 남성에게서 더 자주 발생한다. 그것은 보통 50대~60대의 사람들에게서 보인다. 일반적으로 간암의 치료는, 그것이 조기에 진단된다면, 작은 종양 또는 서서히 자라는 종양을 성공적으로 치료할 수 있는 공격적인 수술 또는 간 이식이다. 그러나 조기에 진단되는 환자는 거의 없다. 화학치료 및 방사선 치료는 보통 효과적이지 않다. 그러나 이 치료들은 종양을 줄어들게 하기 위하여 사용되며, 따라서 수술은 더 큰 성공 기회를 가진다. 소라페닙 토실레이트(Nexavar®는 간암이 있는 환자들에 대해 현재 이용가능하다. 간암이 있는 환자들에 대한 예후는 보통 나쁜데, 단지 10%~20%의 간세포성 암종만이 수술을 사용하여 제거될 수 있기 때문이다. 따라서, 간암을 치료하기 위하여 사용되는 약제를 개발할 필요가 있다.
단클론성 항체(monoclonal antibody : mAb) 의 치료적 이용성(G. Kohler and C. Milstein, Nature 256:495-497 (1975))이 인식되고 있다. 단클론성 항체는 현재 이식, 암, 감염성 질병, 심장혈관 질병 및 감염에서의 치료로서 승인되었다. 상이한 아이소타입(isotype)은 상이한 이펙터(effector) 작용을 가진다. 작용에서의 이러한 차이는 다양한 면역글로불린 아이소타입에 대해 별개의 3차원 구조로 반영된다(P.M.　Alzari, et 　 al ., Annual Rev . Immunol ., 6:555-580 (1988)).
마우스는 면역화에 편리하며 대부분의 인간 항원들을 이물질로 인식하기 때문에, 치료적 가능성이 있는 인간 표적에 대한 mAb는 통상적으로 뮤린 유래이다. 그러나, 뮤린 mAb는 인간 치료법으로서 내재적인 단점을 가진다. mAb는 인간에서 인간 항체보다 더 짧은 순환 반감기를 가지기 때문에 그것들은 더 빈번한 투여를 필요로 한다. 더 비판적으로, 인간 면역계에 뮤린 항체의 반복된 투여는 마우스 단백질을 이물질로 인식하고, 인간 항마우스 항체(human anti-mouse antibody : HAMA) 반응을 만들어내게 함으로써 인간 면역계가 반응하도록 야기한다. 이러한 HAMA 반응은 알레르기 반응 및 시스템으로부터 뮤린 항체의 빠른 제거를 초래할 수 있고, 이는 뮤린 항체에 의한 치료를 쓸모없게 만든다. 이러한 영향을 회피하기 위하여, 마우스 내에서 인간 면역계를 만들기 위한 시도가 있었다.
초기의 시도는 인간 서열을 가지는 항체가 있는 항원에 반응할 수 있는 유전자 이식 마우스를 만들기를 희망하였지만(문헌[Bruggemann, et 　 al ., Proc . Nat'l . Acad. Sci . USA 86:6709-6713 (1989)] 참조), 이용가능한 클로닝 비히클에 의해 안정하게 유지될 수 있었던 DNA의 양에 의해 제한되었다. 인공 효모 염색체(yeast artificial chromosome:YAC) 클로닝 벡터의 사용은 유전자 이식 포유류에 인간 Ig 좌위의 거대 생식세포계열 단편을 도입하는 것에 대한 방법을 유도한다. 필수적으로 인간 게놈 및 인간 불변 영역에서 발견된 동일한 간격으로 배열된 인간 V, D, 및 J 영역 유전자의 대부분은 YAC를 사용하여 마우스 내에 도입되었다. 하나의 이러한 유전자이식 마우스 균주는 XenoMouse® 마우스로 알려져 있으며, Amgen Fremont, Inc.(Fremont CA)로부터 상업적으로 이용가능하다.
본 발명은 161P2F10B 단백질과 결합하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 치료제와 컨쥬게이트된 완전한 인간 항체를 포함한다.
본 발명은 다양한 면역원성 또는 치료적 조성물, 예컨대 항체 약물 컨쥬게이트, 및 표 I에서 열거된 조직의 암과 같은 암을 치료하기 위한 전략을 추가로 제공한다.
본 발명은 다음에 관한 것이다:
[1] 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 161P2F10B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하며, 항체는 서열 번호 7의 20부터 142까지의 Vh 영역 및 서열 번호 8의 20 부터 127까지의 Vl 영역의 아미노산 서열을을 포함하며, 상기 항체는 모노메틸 우리스타틴 F(MMAF)에 컨쥬게이트되는 항체 약물 컨쥬게이트.
[2] 항원 결합 단편이 Fab, F(ab')2 또는 Fv 단편인 [1]의 항체 약물 컨쥬게이트.
[3] 항체가 완전한 인간 항체인 [1]의 항체 약물 컨쥬게이트.
[4] 재조합적으로 생성된 [1]의 항체 약물 컨쥬게이트.
[5] 인간 단위 용량 형태로 [1]의 항체 약물 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물.
[6] 암 치료를 위한, [5]의 약제학적 조성물.
[7] 암은 신세포암 또는 간암인 [6]의 약제학적 조성물.
[8] [1]의 항체 약물 컨쥬게이트를 상기 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 암 세포의 성장을 억제하는 방법.
[9] 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 161P2F10B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편에 컨쥬게이트되며, 여기서 항체는 서열 번호 7의 20 부터 142까지의 Vh 영역 및 서열 번호 8의 20 부터 127까지의 Vl 영역의 아미노산 서열을 포함하는 MMAF(들)를 제공하는 단계; 및
항체 약물 또는 단편 약물 컨쥬게이트에 세포를 노출시키는 단계;
를 포함하는, 세포에 세포독성제 또는 진단제를 전달하는 방법.
[10] [1]의 항체 약물 컨쥬게이트의 유효량으로 포유류를 치료하는 단계를 포함하는 포유류 내 종양을 치료하기 위한 방법.
[11] [1]의 항체 약물 컨쥬게이트와 방사선 조합의 유효량으로 포유류를 치료하는 단계를 포함하는 포유류에서 종양 성장을 감소시키기 위한 방법.
[12] [1]의 항체 약물 컨쥬게이트와 화학치료제의 조합의 유효량으로 포유류를 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 종양 성장을 감소시키기 위한 방법.
[13] [1]의 항체 약물 컨쥬게이트와 생물학적으로 활성인 치료제의 조합의 유효량으로 포유류를 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 종양 성장을 감소시키기 위한 방법.
[14] [1]의 항체 약물 컨쥬게이트와 화학치료제의 조합의 유효량으로 포유류를 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 암을 치료하기 위한 방법.
[15] 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)로서, 화학식 L-(LU-D)p를 가지며, 여기서 (a) L은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 161P2F10B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 항체이며, 상기 항체는 서열 번호 7의 20 부터 142까지의 Vh 영역 및 서열 번호 8의 20 부터 127까지의 Vl 영역의 아미노산 서열을 포함하며; (b) LU는 링커이고; (c) D는 약물이 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)인 약물 모이어티이며; (d) p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12인 항체 약물 컨쥬게이트.
[16] 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)로서, 다음의 화학식을 가지며, Ab-S는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 161P2F10B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 항체이며, 상기 항체는 서열 번호 7의 20 부터 142까지의 Vh 영역 및 서열 번호 8의 20 부터 127까지의 Vl 영역의 아미노산 서열을 포함하며; p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12인 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
Figure 112012072574899-pct00002
[17] 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 161P2F10B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하며, 여기서 항체는 서열 번호 7의 20 부터 468까지의 중쇄 및 서열 번호 8의 20 부터 233까지의 경쇄의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체는 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)에 컨쥬게이트된 항체 약물 컨쥬게이트.
[18] 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)로서, 화학식 L-(LU-D)p를 가지며, 여기서 (a) L은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 161P2F10B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를포함하는 항체이고, 상기 항체는 서열 번호 7의 20 부터 468까지의 중쇄 및 서열 번호 8의 20 부터 233까지의 경쇄의 아미노산 서열을 포함하며; (b) LU는 링커이고; (c) D는 약물이 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)인 약물 모이어티이며; (d) p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12인 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
[19] 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)로서, 다음의 화학식을 가지며, Ab-S는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 161P2F10B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 항체이고, 상기 항체는 서열 번호 7의 20 부터 468까지의 중쇄 및 서열 번호 8의 20 부터 233까지의 경쇄의 아미노산 서열을 포함하며; p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12인 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
Figure 112012072574899-pct00003
도 1. 161P2F10B의 cDNA 및 아미노산 서열을 도 1a 내지 도 1c에 나타낸다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하는 핵산 44~2671로부터 연장한다.
도 2. 161P2F10B 항체의 핵산 및 아미노산.
도 2A. H16-7.8 중쇄의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄은 리더 서열이며, 이중선은 중쇄 가변 영역이다. 파선은 인간 IgG2 불변 영역을 나타낸다.
도 2B. H16-7.8 경쇄의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄은 리더 서열이며, 이중선은 경쇄 가변 영역이다. 파선은 인간 Ig 카파 불변 영역을 나타낸다.
도 3. 161P2F10B 항체의 아미노산 서열.
도 3A. H16-7.8 중쇄의 아미노산 서열. 밑줄은 리더 서열이며, 이중선은 중쇄 가변영역이다. 파선은 인간 IgG2 불변 영역을 나타낸다.
도 3B. H16-7.8 경쇄의 아미노산 서열. 밑줄은 리더 서열이며, 이중선은 경쇄 가변 영역이다. 파선은 인간 Ig 카파 불변 영역을 나타낸다.
도 4. 인간 생식세포계열에 대한 H16-7.8 항체의 배열.
도 4A. 인간 생식세포계열 VH4-31/D5-12/JH6에 대한 H16-7.8 중쇄의 배열.
도 4B. 인간 생식세포계열 A26/JK1에 대한 H16-7.8 경쇄의 배열.
도 5. CHO 세포에서 H16 -7.8 재조합 발현. H16-7.8 중쇄 및 경쇄 서열을 발현 벡터에 클로닝하였다. 벡터를 CHO 세포에 트랜스펙션하였다. 3T3-대조군 및 3T3-161P2F10B 세포를 하이브리도마 또는 CHO 세포 중 하나로부터 H16-7.8로 염색하였다. 결합을 유세포분석기로 검출하였다. 결과는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 H16-7.8이 분비되고 세포 표면 161P2F10B에 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
도 6. H16 -7.8 및 H16 -7.8 mcMMAF 의 세포 결합 및 친화도. H16-7.8 및 H16-7.8mcMMAF를 Ku812 세포 상에서 내인성으로 발현된 161P2F10B에 대한 결합 친화도에 대해 시험하였다. 간략하게, H16-7.8 또는 H16-7.8mcMMAF의 11개의 희석물을 Ku812 세포(웰 당 50,000세포)와 함께 밤새 4℃에서 160nM 내지 0.0001nM의 최종 농도로 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 마지막에 세포를 세척하였고, 항-hIgG-PE 검출 항체와 함께 45분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 비결합 검출 항체를 세척한 후, 세포를 FACS로 분석하였다. 평균 형광 강도(Mean Florescence Intensity : MFI) 값을 얻었다(표 IV를 참조). MFI 값을 Graphpad Prisim 소프트웨어에 입력하였고 Y=Bmax*X/(Kd+X)의 한 자리 결합(쌍곡선) 방정식을 사용하여 분석하여 도 6에서 나타내는 H16-7.8 또는 H16-7.8mcMMAF 포화 곡선을 만들었다. Bmax는 161P2F10B에 대한 H16-7.8 또는 H16-7.8mcMMAF의 최대 결합에서 MFI 값이고, Kd는 절반의 최대 결합에 필요한 H16-7.8 또는 H16-7.8mcMMAF의 농도인 H16-7.8 또는 H16-7.8mcMMAF 결합 친화도이다. Ku812 세포의 표면 상에서 내인성으로 발현된 161P2F10B 상에서 H16-7.8 및 H16-7.8mcMMAF의 계산된 친화도(Kd)는 각각 0.06nM 및 0.19nM이다.
도 7. 신장 암 세포에 대한 H16 -7.8 및 H16 -7.8 mcMMAF 의 결합. 인간 UGK-3 세포(투명 세포 신장암 환자로부터 유래) 및 RXF-393 세포(투명 세포 신장암)을 10 ㎍/ml의 천연 H16-7.8, H16-7.8mcMMAF, 또는 이소타입 대조군 인간 IgG2로 염색하였고, FACS로 평가하였다. 도 7의 결과(좌측 패널)는 H16-7.8(회색선)로 2개의 상이한 신장 종양 세포의 강한 염색을 나타내지만, 대조군 MAb(채워진 히스토그램)으로는 그렇지 않다. 우측의 패널은 H16-7.8mcMMAF로 동일한 신장 종양 세포의 유사한 강한 염색을 나타낸다(회색선). (도 7; 우측 패널). 이 결과는 H16-7.8 및 H16-7.8mcMMAF는 둘 다 인간 암 세포 표면 상에서 발현된 천연 161P2F10B 항원과 결합한다는 것을 나타낸다. H16-7.8mcMMAF를 만들기 위한 천연 H16-7.8의 컨쥬게이션은 인간 암 세포 상에서 발현된 천연 161P2F10B 항원에 대한 그것의 세포 표면 결합을 변경하지 않았다.
도 8. H16 -7.8 mcMMAF 에 의한 세포 독성. 2000개의 가시적 KU812 세포를 제0일에 3회 플레이팅하였고 밤새 회수하였다. 다음날, mcMMAF와 컨쥬게이트된 H16-7.8mcMMAF 또는 대조군 MAb의 단계적 1:4 희석물의 상이한 로트를 첨가하여 최종 농도를 얻었다. 세포를 6일 동안 인큐베이션하였고, 그 때에 알라마르 블루(Alamar blue) 20μl를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 추가 4시간 동안 인큐베이션하였고 540nM의 여기 파장 및 620nM의 방출 파장을 사용하여 형광 플레이트 판독기에서 형광 강도를 판독하였다. 결과는 H16-7.8mcMMAF 로트가 둘 다 KU812 세포의 증식을 강하게 억제한다는 것을 나타낸다. 로트 (1) 및 로트 (2)에 대해 각각 0.2nM 및 0.1nM이 되도록 IC 50을 결정하였다. KU812 세포와 결합하지 않은 완전한 인간 대조군 MAb를 mcMMAF와 컨쥬게이트하여 3.9(+/-　0.2)의 DAR을 수득하였다. 대조군 ADC(대조군 mcF)는 세포독성의 특이성을 추가로 증명하는 KU812 세포 증식을 억제하지 않았다. 따라서, 이 결과는 H16-7.8mcMMAF가 161P2F10B 발현 세포에 대한 세포독성 약물을 선택적으로 전달하여 그것의 사멸을 유발할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 9. SCID 마우스에서 피하로 확보된 인간 신세포암 이종이식 UG - K3 에서 H16 -7.8 mcMMAF 의 효능. 이 실험에서, 환자 유래 인간 신세포암 이종이식 UG-K3를 SCID 마우스에서 단계적 통과로 얻었다. 저장 종양을 멸균으로 수확하였고 작은 조각으로 갈았다. 종양 조직을 Liberase Blendzyme(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 효소적으로 분해하였다. 1.5　x　106 세포를 개개의 SCID 마우스의 옆구리에 주사하였고, 종양을 그것들이 대략 100mm3의 부피에 도달할 때까지 미처리(untreated) 성장시켰다. 동물을 다음의 코호트(cohort)로 무작위로 할당하였다: H16-7.8mcMMAF 처리군, H16-7.8 대조군 및 5% 덱스트로스 대조군. H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8을 정맥 볼루스 주사로 제0일에 1회 10mg/kg으로 투여하였다. 투여한 H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8의 양은 투여 바로 전 얻은 각 동물의 개개의 체중을 기준으로 하였다. 5% 덱스트로스 대조군에는 동물 당 150 ㎕를 투여하였다. 연구의 마지막까지 3일 내지 4일마다 캘리퍼(caliper) 측정을 사용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 종양 부피를 넓이2　x　길이/2로 계산하며, 이때 넓이는 가장 작은 크기이며 길이는 가장 긴 것이다. 대조군의 동물을 종양이 대략 1000mm3에 도달하였을 때 인도적으로 안락사시켰다. H16-7.8mcMMAF 처리군의 동물을 희생 전 추가 2주 동안 모니터링하였다. 대조군 둘 다에 대한 데이터가 이용가능할 때 최종 시점에 α=0.05인 Kruskal-Wallis 시험을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다.
결과는 H16-7.8mcMMAF를 사용한 UG-K3 신장 투명 세포 이종이식 종양의 처리는 시험한 모든 투여량과 스케쥴에서 SCID 마우스의 종양 성장의 상당한 억제를 초래하였다.
도 10. H16 -7.8 mcMMAF 에 의해 확보된 정위이식 UG - K3 이종이식의 성장 억제
정위이식으로 성장된 확보된 신장 종양의 성장을 억제하기 위한 H16-7.8mcMMAF의 능력을 환자 유래된 UG-K3 종양 이종이식을 사용하여 평가하였다. 간략하게, UG-K3 종양의 저장액을 효소적으로 분해하였고, 150만개의 가시적인 세포를 제0일에 수컷 SCID 마우스의 신장에 수술로 이식하였다. 7일 동안 종양을 성장시켰으며, 이 때 동물은 4가지의 상이한 처리군(그룹 당 n=10)으로 무작위 추출하였다. 5mpk로 대조군 ADC를 받은 그룹 A, 3mg/kg로 H16-7.8mcMMAF를 받은 그룹 B 및 5mg/kg로 H16-7.8mcMMAF를 받은 그룹 C로 무작위 추출된 동물에게 총 4회 투여 동안 4일마다 투여하였다. 그룹 D는 10mg/kg으로 1회 H16-7.8mcMMAF를 받았다. 연구의 마지막 날(제41일), 동물을 희생시켰고, 우측 및 좌측 신장을 전자 저울에서 칭량하였다. 그래프 상에서 플롯팅한 종양 무게를 종양 함유 우측 신장의 무게로부터 종양이 없는 대측성(contralateral) 신장의 무게를 차감하여 결정하였다.
결과는 시험한 모든 투여량과 스케줄에서 H16-7.8mcMMAF를 사용한 UG-K3 신장 투명 이종이식 종양의 처리가 종양 성장의 극적인 억제를 초래하였다는 것을 증명하였다. 모든 H16-7.8mcMMAF 처리군(B, C 및 D)에서 종양 무게는 대조 처리된군에서 종양 무게의 1% 미만이었다. 이 차이점은 통계적으로 매우 유의하다(p< 0.0001, ANOVA).
도 11. SCID 마우스에서 피하로 확보된 인간 신장암 이종이식 RXF -393 내 H16 -7.8 mcMMAF 의 효능. 이 실험에서, 인간 신장 암세포 RXF-393(마우스 당 0.5　x　106 세포)을 개개의 마우스의 옆구리에 주사하였고, 종양을 그것들이 대략 100mm3의 부피에 도달할 때까지 처리하지 않고 성장시켰다. 다음으로 동물을 다음의 코호트로 무작위로 할당하였다: H16-7.8mcMMAF 처리군, H16-7.8 처리군 및 5% 덱스트로스 대조군. H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8을 정맥 볼루스 주사에 의해 총 2회 투여 동안 1주일에 1회 10mg/kg으로 투여하였다. 투여한 H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8은 투여 바로 전 얻은 각 동물의 개별 체중을 기준으로 하였다. 5% 덱스트로스 대조군은 동물 당 150 ㎕로 투여되었다. 연구의 마지막날까지 3일 내지 4일 마다 캘리퍼 측정을 사용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 종양 부피는 폭2　x　길이/2로 계산하며, 폭은 가장 작은 치수이고, 길이는 가장 큰 것이다. 종양이 대략 1000mm3에 도달하였을 때 대조군 동물을 인도적으로 안락사시켰다.
결과는 시험한 모든 투여량 및 스케줄의 H16-7.8mcMMAF을 사용한 RFX-393 인간 신장암 이종이식의 처리가 SCID 마우스에서 종양 성장의 상당한 억제를 초래하였다. 통계적 분석은 대조군 둘 다의 데이터를 이용가능하게 되었을 때 α=0.05로 Kruskal-Wallis 시험을 사용하여 수행하였다.
도 12. SCID 마우스에서 피하로 확보한 인간 신장암 SKRC -01에서 H16 -7.8 mcMMAF 와 비교한 H16 -7.8의 효율 연구. 인간 신장암 세포 SKRC-01(마우스 당 0.8　x　106 세포)을 개개의 마우스의 옆구리에 주사하였다. 종양을 그것들이 대략 100mm3의 부피에 도달할 때까지 처리하지 않고 성장시켰다. 제0일에 종양이 100mm3에 도달하였을 때, 동물을 다음의 코호트에 무작위로 할당하였다: H16-7.8mcMMAF 처리군, H16-7.8 처리군 및 5% 덱스트로스 대조군. H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8을 정맥 볼루스 주사에 의해 총 4회 투여 동안 4일 마다 4mg/kg을 투여하였다. 투여한H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8양은 투여 바로 전 얻은 각 동물의 개개의 체중을 기준으로 하였다. 5% 덱스트로스 대조군에는 동물 당 150 ㎕를 투여하였다. 3일 내지 4일 마다 캘리퍼 측정을 사용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 종양 부피를 폭2　x　길이/2로 계산하였고, 폭은 가장 작은 치수이며, 길이는 가장 큰 것이다.
결과는 ADC H16-7.8mcMMAF가 SKRC-01 종양 형성의 성장을 상당히 억제한 반면 네이키드 MAb H16-7.8는 효과가 없음을 나타낸다. 따라서, ADC H16-7.8mcMMAF는 네이키드 H16-7.8보다 상당히 더 현저한 효과를 가진다.
도 13. H16-7.8mcMMAF의 효능 연구를 SCID 마우스에서 피하로 확보한 다른 161P2F10B 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)와 비교하였다. 다른 실험에서, 인간 신장암 세포 UG-K3(마우스 당 1.5　x　106 세포)를 개개 마우스의 옆구리에 주사하였다. 종양을 그것들이 대략 100mm3의 부피에 도달할 때까지 처리하지 않고 성장시켰다. 제0일에 종양이 100mm3에 도달하였을 때, 동물을 다음의 코호트에 무작위로 할당하였다: H16-7.8mcMMAF, H16-7.8vcMMAE, 및 H16-1.11mcMMAF, 및 H16-1.11vcMMAE, PBS 대조군, 및 대조군 MAb-vcMMAE 처리군. 모든 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 제0일에 1회 10mg/kg으로 투여하였다. 투여한 각 ADC의 양은 투여 바로 전 얻은 각 동물의 개개의 체중을 기준으로 하였다. PBS 대조군에는 동물 당 150 ㎕를 투여하였다. 종양 성장을 3일 내지 4일 마다 캘리퍼 측정을 사용하여 모니터링하였다. 종양 부피를 폭2　x　길이/2로 계산하였고, 폭은 가장 작은 치수이며, 길이는 가장 큰 것이다.
결과는 ADC H16-7.8vcMMAE 및 H16-1.11vcMMAE이 종양 성장을 억제하지 않았다는 것을 나타낸다. 추가적으로, H16-7.8mcMMAF 및 H16-1.11mcMMAF는 처음 30일 동안 UG-K3 종양 형성의 성장을 상당히 억제하였다. 30일 후 H16-7.8mcMMAF는 H16-1.11mcMMAF와 비교하였을 때 상당히 더 현저한 효과를 가졌다.
도 14. H16 -7.8 mcMMAF 및 H16 -7.8의 펩티드 맵. 얻은 H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8를 디티오트레이톨(DTT)로 처리하여 이황화 결합을 감소시킨 후 얻은 유리 시스테인을 알킬화하였다. 이 단계에서 구아니딘을 사용하여 단백질의 완전한 변성을 보장하였다. 구아니딘을 제거하기 위한 투석 후, 샘플을 특정 엔도프로테이나제, 즉 Lys-C로 분해하였다. Lys-C는 리신 잔기의 C-말단측 상의 펩티드 결합을 절단한다. 얻은 펩티드를 질량 분석법과 결합한 역상크로마토그래피에 의해 분석하였다. 역상 체류 시간 및 피크의 관찰된 질량 대 하전 비를 H16-7.8mcMMAF와 H16-7.8 간에 비교하였다. LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분석법) 분석을 WATERS Q-TOF 질량 분석기와 결합한 WATERS Acquity UPLC를 사용하여 수행하였다. 분해한 샘플을 YMC C18 컬럼에 적용하였고, 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴 구배로 용리하였다. 결과는 별표로 표시한 피크 강도가 천연 항체와 비교하여 컨쥬게이트 항체에서 감소되었다는 것을 나타낸다. 화살표로 표시한 피크는 컨쥬게이트된 항체 펩티드 맵 상에 나타난 새로운 피크를 표시한다. 구체적으로, 별표 또는 화살표로 표시한 피크는 각각 컨쥬게이트 예정인 펩티드와 결과의 컨쥬게이트된 펩티드인 것으로 믿어진다.
도 15. 피크의 질량 (*)스펙트럼. 결과는 도 14의 별표로 표시한 피크의 질량 스펙트럼의 일부를 나타낸다. 컨쥬게이션 동안 변화된 신호의 질량 값은 "+" 표시로 나타낸다. 대략 970.4(+3 하전 상태)의 m/z를 가지는 이 펩티드를 중쇄의 힌지영역으로부터 유래되며 예상 컨쥬게이션 자리를 함유하는 C225-K250로 확인하였다.
도 16. 619.4m/z에서 H16 -7.8 mcMMAF 및 H16 -7.8에 대한 펩티드 맵 상의 MSE 의 추출된 이온 크로마토그램( XIC ). 상기 도 14에서 컨쥬게이트된 펩티드인 것으로 믿어지는 새로 나타난 피크를 확인하기 위하여, 상승 에너지(MSE) 데이트 취득 기법을 사용하여 LC-MS분석을 수행하였다. 이 도면은 619.4의 m/z를 사용하여 H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8의 펩티드 맵에 대해 추출된 이온 크로마토그램(XIC)을 나타낸다. 이 이온은 약물 모이어티의 단편 이온에 대응한다. 619.4에서 XIC의 관찰된 피크는 도 14의 화살표로 표시한 피크와 거의 동일하다. 더 나아가, 이러한 피크는 천연 항체의 크로마토그램에서 검출되지 않았다. 이 관찰은 619.4의 m/z에서 XIC의 검출 피크는 명백하게 약물 컨쥬게이트된 펩티드이며, 그것의 무결함 질량 값에 의해 확인된다는 것을 제안한다. 결과를 표 V에 요약하였다. 이 결과는 컨쥬게이트의 경우, 현저한 펩티드는 중쇄의 힌지 영역 상의 2가지 약물에 컨쥬게이트된다는 것을 제안한다. 이 데이터는 DAR 분석과 같은 다른 정위(orthogonal)으로 얻은 데이터와 일치한다.
도 17. 탈글리코실화된 H16 -7.8 mcMMAF ADC 의 질량 프로파일을 나타내는 예시적 스펙트럼. 탈글리코실화된 H16-7.8mcMMAF의 전체 질량을 전자 분무 이온화 비행시간형 분석(electrospray ionization time-of-flight: ESI-TOF) 질량 스펙트럼에 의해 결정하였다. 시험 샘플을 250mM 인산 나트륨 완충제로, pH 7.5로 희석한 다음 37℃에서 밤새 글리코펩티다제 F와 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 PLRPTM 컬럼(Varian Technology)에 주입하였고, 90℃에서 평형상태로 만든 다음, 아세토니트릴/물 구배로 용리하였다. 샘플 피크를 WATERS Synapt 질량 분석기(Waters)와 결합한 Acquity UPLC 시스템으로 분석하였고 MaxEnt1 소프트웨어에 의해 원(raw) 데이터로부터 질량을 재구성하였다. 탈글리코실화된 H16-7.8mcMMAF 에 대한 예시적 질량 분석 프로파일을 나타낸다. 현저한 약물 컨쥬게이트된 항체는 4-약물 부하 종이었다. H16-7.8mcMMAF에서 컨쥬게이트되지 않은 항체의 풍부함을 포함하는 이런 관찰은 다른 정위적 방법, 예컨대 RP-HPLC에 의한 DAR, 펩티드 맵핑, 및 HIC 분석에 의해 얻은 결과와 일치하였다.
도 18. H16 -7.8 mcMMAF 의 약물 항체 비율( DAR ) 프로파일. 각 경쇄 및 중쇄의 약물 부하의 상대적 양의 정량적 HPLC 결정을 위해 DAR 분석을 수행하였다. PLRP-S 분석 컬럼(2.1mm > 50mm), 2.0% 포름산으로 이루어진 이동상A 및 2.0% 포름산 + 90% 아세토니트릴로 이루어진 이동상 B를 사용하여 DAR 분석을 수행하였다. H16-7.8mcMMAF에 대한 대표적인 DAR 프로파일을 나타낸다. DAR 값은 4.0이다. 샘플을 이 방법의 동일한 HPLC 조건을 사용하는 LC-MS 분석을 받게하여 관찰 피크를 확인하였다. 결과를 표 VI에 요약한다. 이 방법의 정량화 동안 얻은 DAR 결과의 피크 확인은 정위로 LC-MS로 확인하였다.
섹션의 개요
I.) 정의
II.) 161P2F10B 항체
III.) 항체 약물 컨쥬게이트 개괄
III(A). 아우리스타틴(Auristatin) 및 돌로스타틴(Dolostatin)
IV.) 161P2F10B와 결합하는 항체 약물 컨쥬게이트
V.) 링커 유닛
VI.) 스트레처(Stretcher) 유닛
VII.) 아미노산 유닛
VIII.) 스페이서 유닛
IX.) 약물 유닛
X.) 약물 부하
XI.) ADC의 세포독성 효과의 결정 방법
XII.) 암(들)의 치료
XIII.) 항체 기반 치료를 위한 표적으로서 161P2F10B
XIV.) 161P2F10B ADC 칵테일
XV.) 조합 치료
XVI.) 키트/제조 품목
I.) 정의:
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어, 명명 및 다른 과학적 용어 및 전문용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 보통 이해되는 의미를 가지는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 보통 이해되는 의미는 명확성 및/또는 용이한 기준을 위해 본 명세서에서 정의되며, 본 명세서에서 이러한 정의의 포함은 필연적으로 당업계에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 실질적인 차이를 나타내는 것으로 이해되어서는 안 된다. 본 명세서에서 설명되거나 참고되는 다수의 기술 및 방법은 당업자에 의해 통상적인 방법, 예컨대 문헌[Sambrook, et　al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y]에서 설명되는 널리 이용되는 분자 클로닝 방법을 사용하여 용이하게 이해되고 흔히 채용된다. 적절하다면 상업적으로 이용가능한 키트 및 시약의 사용을 수반하는 방법이 달리 지시되지 않는다면, 제조업자의 정의된 프로토콜 및/또는 변수에 따라서 일반적으로 수행된다.
상표명이 본 명세서에서 사용될 때, 상표명에 대한 기준은 또한 내용에 의해 달리 표시되지 않는다면, 상표명 제품의 제품 조제물, 일반적 약물, 활성 약제학적 성분(들)을 말한다.
용어 "진행된 암", "국소적으로 진행된 암", "진행된 질병" 및 "국소적으로 진행된 질병"은 적절한 조직 캡슐을 통해 확장된 암을 의미하며, 미국비뇨기과학회(American Urological Association : AUA) 체계 하의 단계 C 질병, 위트모어-주잇(Whitmore-Jewett) 체계 항의 단계 C1-C2 질병, 및 TNM(종양, 림프절, 전이(tumor, node, metastasis)) 체계 하의 단계 T3-T4 및 N+ 질병을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로 수술은 국소적으로 진행된 질병을 가지는 환자에 대해 추천되지 않으며, 이 환자들은 임상적으로 국소화된(기관-국한) 암을 가지는 환자와 비교하여 실질적으로 덜 호의적인 결과를 가진다.
약어 "AFP"는 디메틸발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-페닐알라닌-p-페닐렌디아민을 말한다(하기 화학식 XVI를 참조).
약어 "MMAE"는 모노메틸 아우리스타틴 E를 말한다(하기 화학식 XI를 참조).
약어 "AEB"는 아우리스타틴 E를 파라아세틸 벤조산과 반응시킴으로써 생성된 에스테르를 말한다(하기 화학식 XX를 참조).
약어 "AEVB"는 아우리스타틴 E를 벤조일발레르산과 반응시킴으로써 생성된 에스테르를 말한다(하기 화학식 XXI를 참조).
약어 "MMAF"는 돌발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-페닐알라닌을 말한다(하기 화학식 XVIV를 참조).
달리 언급되지 않는다면, 용어 "알킬"은 약 1개 내지 약 20개의 탄소 원자를 가지는 포화된 직선 또는 분지된 탄화수소를 말하며(그것의 탄소 원자의 범위 및 특정 수의 모든 조합 및 하위조합), 약 1개 내지 약 8개의 탄소 원자가 바람직하다. 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, iso-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, 2-메틸-2-부틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, 3-메틸-2-부틸, 3-메틸-1-부틸, 2-메틸-1-부틸, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3-메틸-3-펜틸, 2-메틸-3-펜틸, 2,3-디메틸-2-부틸, 및 3,3-디메틸-2-부틸이다.
알킬 기는, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 하나 이상의 기, 바람직하게는 1개 내지 3개의 기(및 할로겐으로부터 선택된 임의의 추가적인 치환체)로 선택적으로 치환될 수 있으며, 제한되는 것은 아니지만, -할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN를 포함하며, 각각의 R'은 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 독립적으로 선택되고, 상기 -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, 및 -C2-C8 알키닐 기는, 이에 제한되는 것은 아니지만, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2 , -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN를 포함하는 하나 이상의 기로 선택적으로 더 치환될 수 있으며, 각각의 R"은 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 독립적으로 선택된다.
달리 언급되지 않는다면, 용어 "알케닐" 및 "알키닐"은 약 2개 내지 약 20개의 탄소 원자를 가지는 직쇄 및 분지쇄 탄소를 말하며(그것의 탄소 원자의 범위 및 특정 수의 모든 조합 및 하위조합), 약 2개 내지 약 8개의 탄소 원자가 바람직하다. 알케닐 쇄는 쇄 내에 적어도 하나의 이중 결합을 가지며, 알키닐 쇄는 쇄 내에 적어도 하나의 삼중 결합을 가진다. 알케닐 기의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 에틸렌 또는 비닐, 알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, -이소부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-1-부테닐, -2-메틸-2-부테닐, 및 -2,3-디메틸-2-부테닐을 포함한다. 알키닐 기의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아세틸렌, 프로파르길, 아세틸레닐, 프로피닐, -1-부티닐, -2-부티닐, -1-펜티닐, -2-펜티닐, 및 -3-메틸-1 부티닐을 포함한다.
알케닐 및 알키닐 기는, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 하나 이상의 기, 바람직하게는 1개 내지 3개의 기(및 할로겐으로부터 선택된 임의의 추가적인 치환체)로 선택적으로 치환될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, -할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하고, 각각의 R'은 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 독립적으로 선택되며 상기 -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, 및 -C2-C8 알키닐 기는 선택적으로, 이에 제한되는 것은 아니지만, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 및 -CN을 포함하는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환될 수 있으며, 각각의 R"은 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 독립적으로 선택된다.
달리 언급되지 않는다면, 용어 "알킬렌"은 약 1개 내지 약 20개의 탄소 원자(및 그것의 탄소 원자의 범위 및 특정 수의 모든 조합 및 하위조합)를 가지는 포화 분지쇄 또는 직쇄 탄화수소 라디칼을 말하며, 약 1개 내지 약 8개의 탄소 원자가 바람직하며, 모 알칸의 동일 또는 상이한 탄소 원자에서 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유래된 2개의 1가의 라디칼 중심을 가진다. 통상적인 알킬렌은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌, 옥틸렌, 노닐렌, 데칼렌, 1,4-사이클로헥실렌 등을 포함한다. 알킬렌 기는, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 이에 제한되는 것은 아니지만, -할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하는 하나 이상의 기, 바람직하게는 1개 내지 3개의 기(및 할로겐으로부터 선택된 임의의 추가적인 치환체)로 선택적으로 치환될 수 있으며, 각각의 R'은 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 독립적으로 선택되며 상기 -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, 및 -C2-C8 알키닐 기는 추가로, 이에 제한되는 것은 아니지만, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 및 -CN을 포함하는 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되며, 각각의 R"은 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 독립적으로 선택된다.
달리 언급되지 않는다면, 용어 "알케닐렌"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 알킬렌 기를 말함다. 예시적인 알케닐렌 기는, 예를 들어, 에테닐렌(-CH=CH-) 및 프로페닐렌(-CH=CHCH2-)을 포함한다.
달리 언급되지 않는다면, 용어 "알키닐렌"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선택적으로 치환된 알킬렌 기를 말한다. 예시적인 알키닐렌 기는, 예를 들어 아세틸렌(-C≡C-), 프로파르길(-CH2C≡C-), 및 4-펜티닐 (-CH2CH2CH2C≡CH-)을 포함한다.
달리 언급되지 않는다면, 용어 "아릴"은 모 방향족 환 시스템의 단일 탄소 원자에서 하나의 수소 원자의 제거에 의해 유래된 6개 내지 20개의 탄소 원자 (및 그것의 탄소 원자의 범위 및 특정 수의 모든 조합 및 하위조합)의 1가의 방향족 탄화수소 라디칼을 말한다. 일부 아릴 기는 예시적인 구조 "Ar"로서 표시된다. 통상적인 아릴 기는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 벤젠, 치환된 벤젠, 페닐, 나프탈렌, 안트라센 비페닐 등으로부터 유래된 라디칼을 포함한다.
아릴 기는, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 이에 제한되는 것은 아니지만, -할로겐, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -NO2, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하는 하나 이상, 바람직하게는 1개 내지 5개, 또는 심지어 1개 내지 2개의 기로 선택적으로 치환될 수 있으며, 각각의 R'은 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 독립적으로 선택되고, 상기 -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), 및 -아릴 기는 추가로, 이에 제한되는 것은 아니지만, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2 , -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3 , -NH2, -NH(R"), -N(R")2 및 -CN을 포함하는 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있으며, 각각의 R"은 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 독립적으로 선택된다.
달리 언급되지 않는다면, 용어 "아릴렌"은 2가인(즉, 모 방향족 환 시스템의 동일 또는 2개의 상이한 탄소 원자에서 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유래된) 선택적으로 치환된 아릴 기를 말하며, 예시적인 아릴 기로서 페닐을 가지는 다음의 구조에서 나타내는 바와 같은 오르소, 메타 또는 파라 배치일 수 있다.
Figure 112012072574899-pct00004
통상적인 "-(C1-C8 알킬렌)아릴," "-(C2-C8 알케닐렌)아릴", "및 -(C2-C8 알키닐렌)아릴" 기는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸에텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등을 포함한다.
달리 언급되지 않는다면, 용어 "헤테로사이클"은 3개 내지 14개의 환 원자를 가지는 1고리, 2고리, 또는 다고리 환 시스템(또한 고리 구성원으로서 언급됨)을 말하며, 적어도 하나의 환 내의 적어도 하나의 환 원자는 N, O, P, 또는 S로부터 선택된 헤테로원자이다(및 그것의 탄소 원자 및 헤테로원자의 범위 및 특정 수의 모든 조합 및 하위조합). 헤테로사이클은 N, O, P, 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 4개의 환 헤테로원자를 가질 수 있다. 헤테로사이클 내 하나 이상의 N, C, 또는 S 원자는 산화될 수 있다. 1고리 헤테로사이클은 바람직하게는 3개 내지 7개의 환 구성원(예를 들어 2개 내지 6개의 탄소 원자 및 N, O, P, 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 3개의 헤테로원자)를 가지고, 2고리 헤테로사이클은 바람직하게는 5개 내지 10개의 고리 구성원(예를 들어, 4개 내지 9개의 탄소 원자 및 1개 내지 3개의 헤테로원자는 N, O, P, 또는 S로부터 독립적으로 선택된다)을 가진다. 헤테로원자를 포함하는 환은 방향족 또는 비방향족일 수 있다. 달리 언급되지 않는다면, 헤테로사이클은 안정한 구조를 초래하는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 그것의 현수된 기에 부착된다.
헤테로사이클은 문헌[Paquette, "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), 특히 Chapters 1, 3, 4, 6, 7, 및 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds , A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), 특히 Volumes 13, 14, 16, 19 및 28; and J. Am . Chem . Soc . 82:5566　(1960)]에서 설명된다.
"헤테로사이클" 기의 예는, 예로서 제한없이, 피리딜, 디히드로 피리딜, 테트라히드로피리딜(피페리딜), 티아졸릴, 피리미디닐, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 테트라졸릴, 벤조푸라닐, 티아나프탈레닐, 인돌릴, 인돌레닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 피페리디닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 2-피롤리도닐, 피롤리닐, 테트라히드로푸라닐, 비스-테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐, 비스-테트라히드로피라닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 데카히드로퀴놀리닐, 옥타히드로이소퀴놀리닐, 아조시닐, 트리아지닐, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 2H,6H-1,5,2-디티아지닐, 티에닐, 티안트레닐, 피라닐, 이소벤조푸라닐, 크로메닐, 잔테닐, 페녹사티닐, 2H-피롤릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 피라지닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 1H-인다졸릴, 퓨리닐, 4H-퀴놀리지닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프테리디닐, β-카볼리닐, 페난트리디닐, 아크리디닐, 피리미디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페난트리디닐, 아크리디닐, 피리미디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 푸라자닐, 페녹사지닐, 이소크로마닐, 크로마닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피페라지닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 퀴뉴클리디닐, 모르폴리닐, 옥사졸리디닐, 벤조 트리아졸릴, 벤즈이속사졸릴, 옥스인돌릴, 벤족사졸리닐 및 이사티노일을 포함한다. 바람직한 "헤테로사이클" 기는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 벤조푸라닐, 벤조티오페닐, 인돌릴, 벤조피라졸릴, 쿠마리닐, 이소퀴놀리닐, 피롤릴, 티오페닐, 푸라닐, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 퀴놀리닐, 피리미디닐, 피리디닐, 피리도닐, 피라지닐, 피리다지닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴 및 테트라졸릴을 포함한다.
헤테로사이클 기는, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 이에 제한되는 것은 아니지만, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하는 하나 이상의 기, 바람직하게는 1개 내지 2개의 기로 선택적으로 치환될 수 있으며, 각각의 R'은 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 독립적으로 선택되며, 상기 -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 및 -아릴 기는 추가로, 이에 제한되는 것은 아니지만, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐),
-O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2 , -C(O)NHR",
-C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3 , -NH2, -NH(R"), -N(R")2 및 -CN을 포함하는 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있으며, 각각의 R"는 -H, -C1-C8 알킬,
-C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 독립적으로 선택된다.
예로서 제한없이, 탄소 결합된 헤테로사이클은 다음의 위치에 결합될 수 있다: 피리딘의 위치2, 3, 4, 5, 또는 6; 피리다진의 위치 3, 4, 5, 또는 6; 피리미딘의 위치2, 4, 5, 또는 6; 피라진의 위치 2, 3, 5, 또는 6; 푸란, 테트라히드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라히드로피롤의 위치 2, 3, 4, 또는 5; 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4, 또는 5; 이속사졸, 피라졸 또는 이소티아졸의 위치 3, 4, 또는 5; 아지리딘의 위치 2 또는 3; 아제티딘의 위치 2, 3, 또는 4 ; 퀴놀린의 위치2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8; 또는 이소퀴놀린의 위치1, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8. 훨씬 더 통상적으로 탄소 결합된 헤테로사이클은 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 5-피리딜, 6-피리딜, 3-피리다지닐, 4-피리다지닐, 5-피리다지닐, 6-피리다지닐, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐, 6-피리미디닐, 2-피라지닐, 3-피라지닐, 5-피라지닐, 6-피라지닐, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 또는 5-티아졸릴을 포함한다.
예로서 제한없이, 질소 결합된 헤테로사이클은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 또는 1H-인다졸의 위치 1에 결합될 수 있고; 이소인돌, 또는 이소인돌린의 위치 2; 모르폴린의 위치 4; 및 카바졸 또는 β-카볼린의 카볼린의 위치 9에 결합될 수 있다. 훨씬 더 통상적으로, 질소 결합된 헤테로사이클은 1-아지리딜, 1-아제테딜, 1-피롤릴, 1-이미다졸릴, 1-피라졸릴, 및 1-피페리디닐을 포함한다.
달리 언급되지 않는다면, 용어 "카르보사이클"은 3개 내지 14개의 환 원자로부터 가지는 포화된 또는 불포화된 비방향족 1고리, 2고리, 또는 다고리 환 시스템을 말하며(및 그것의 탄소원자의 범위 및 특정 수의 모든 조합 및 하위조합), 모든 환 원자는 탄소 원자이다. 1고리 카르보사이클은 바람직하게는 3개 내지 6개의 환 원자, 훨씬 더 바람직하게는 5개 또는 6개의 환 원자를 가진다. 2고리 카르보사이클은 바람직하게는 예를 들어 비시클로[4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로서 배열된 7개 내지 12개의 환 원자, 또는 비시클로[5,6] 또는 [6,6]시스템으로서 배열된 9개 또는 10개의 환 원자를 가진다. 용어 "카르보사이클"은, 예를 들어 아릴 환에 융합된 1개의 고리 카르보사이클 환(예를 들어 벤젠 환에 융합된 1고리 카르보사이클 환)을 포함한다. 카르보사이클은 바람직하게는 3개 내지 8개의 탄소 환 원자를 가진다.
카르보사이클 기는, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 -할로겐, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하는 하나 이상의 기, 바람직하게는 1개 또는 2개의 기(및 할로겐으로부터 선택된 임의의 추가적인 치환체)로 선택적으로 치환될 수 있으며, 각각의 R'은 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 독립적으로 선택되고, 상기 -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), 및 -아릴 기는 이에 제한되는 것은 아니지만, 추가로 -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 및 -CN을 포함하는 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있고, 각각의 R"는 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 독립적으로 선택된다.
1고리 카르보고리 치환체의 예는 -사이클로프로필, -사이클로부틸, -사이클로펜틸, -1-사이클로펜트-1-에닐, -1-사이클로펜트-2-에닐, -1-사이클로펜트-3-에닐, 사이클로헥실, -1-사이클로헥스-1-에닐, -1-사이클로헥스-2-에닐, -1-사이클로헥스-3-에닐, -사이클로헵틸, -사이클로옥틸, -1,3-사이클로헥사디에닐, -1,4-사이클로헥사디에닐, -1,3-사이클로헵타디에닐, -1,3,5-사이클로헵타트리에닐 , 및 -사이클로옥타디에닐을 포함한다.
"카르보사이클로"는, 단독이든 다른 기의 부분이든, 2가인(즉, 모 카르보고리 환 시스템의 동일 또는 2개의 상이한 탄소 원자에서 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유래된) 위에 정의된 바와 같은 선택적으로 치환된 카르보사이클 기를 말한다.
문맥에 의해 달리 표시되지 않는다면, 하이폰(-)은 현수된 분자에 대한 부착 지점을 지정한다. 따라서, 용어 "-(C1-C8 알킬렌)아릴" 또는 "-C1-C8 알킬렌(아릴)"은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 C1-C8 알킬렌 라디칼을 말하며, 알킬렌 라디칼은 알킬렌 라디칼의 임의의 탄소 원자에서 현수된 분자에 부착되고, 알킬렌 라디칼의 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 하나는 본 명세서에서 정의하는 바와 같은 아릴 라디칼로 대체된다.
특정 기가 "치환된"일 때, 기는 치환체의 열거로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체, 바람직하게는 1개 내지 5개 치환체, 더 바람직하게는 1개 내지 3개 치환체, 가장 바람직하게는 1개 내지 2개의 치환체를 가질 수 있다. 그러나 기는 일반적으로 할로겐으로부터 선택된 임의의 수의 치환체를 가질 수 있다. 치환된 기가 그렇게 표시된다.
분자 내 특정 위치에서 임의의 치환체 또는 변수의 정의는 분자 내 다른 곳에서 그것의 정의와 독립적인 것으로 의도된다. 본 발명의 화합물의 치환체 및 치환 패턴은 당업자에 의해 선택되어 화합물을 제공할 수 있으며, 이는 당업계에 알려진 기법뿐만 아니라 본 명세서에서 설명되는 방법에 의해 용이하게 합성될 수 있는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 보호기는 다작용성 화합물에서 일시적으로 또는 영구적으로 하나의 반응 자리를 선택적으로 차단하는 기를 말한다. 본 발명에서 사용을 위한 적합한 히드록시 보호기는 약제학적으로 허용가능하며, 화합물이 활성이 되도록 하기 위하여 피험자에 투여 후 모 화합물로부터 절단될 필요가 있을 수도 있고, 필요가 없을 수도 있다. 절단은 신체 내 정상 대사 과정을 통한다. 히드록시 보호기는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에 전체가 참고로, 모든 목적을 위해 포함되는 문헌[Protective Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene 및 P. G. M. Wuts (John Wiley & sons, 3rd Edition)]을 참조하며, 예를 들어, 에테르(예를 들어, 알킬 에테르 및 실릴 에테르, 예를 들어, 디알킬실릴에테르, 트리알킬실릴에테르, 디알킬알콕시실릴에테르를 포함), 에스테르, 카르보네이트, 카르바메이트, 술포네이트, 및 포스페이트 보호기를 포함한다. 히드록시 보호기의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 메틸 에테르; 메톡시메틸 에테르, 메틸티오메틸 에테르, (페닐디메틸실릴)메톡시메틸 에테르, 벤질옥시메틸 에테르, p-메톡시벤질옥시메틸 에테르, p-니트로벤질옥시메틸 에테르, o-니트로벤질옥시메틸 에테르, (4-메톡시페녹시)메틸 에테르, 구아이아콜메틸 에테르, t-부톡시메틸 에테르, 4-펜테닐옥시메틸 에테르, 실록시메틸 에테르, 2-메톡시에톡시메틸 에테르, 2,2,2-트리클로로에톡시메틸 에테르, 비스(2-클로로에톡시)메틸 에테르, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸 에테르, 멘톡시 메틸 에테르, 테트라히드로피라닐 에테르, 1-메톡시사이클로헥실 에테르, 4-메톡시테트라히드로티오피라닐 에테르, 4-메톡시테트라히드로티오피라닐 에테르 S,S-디옥사이드, 1-[(2-클로로-4-메틸)페닐]-4-메톡시피페리딘-4-일 에테르, 1-(2-플루오로페닐)-4-메톡시피페리딘-4-일 에테르, 1,4-디옥산-2-일 에테르, 테트라히드로푸라닐 에테르, 테트라히드로티오푸라닐 에테르; 치환된 에틸 에테르, 예컨대 1-에톡시에틸 에테르, 1-(2-클로로에톡시)에틸 에테르, 1-[2-(트리메틸실릴)에톡시]에틸 에테르, 1-메틸-1-메톡시에틸 에테르, 1-메틸-1-벤질옥시에틸 에테르, 1-메틸-1-벤질옥시-2-플루오로에틸 에테르, 1-메틸-1페녹시에틸 에테르, 2-트리메틸실릴 에테르, t-부틸 에테르, 알릴 에테르, 프로파르길 에테르, p-클로로페닐 에테르, p-메톡시페닐 에테르, 벤질 에테르, p-메톡시벤질 에테르 3,4-디메톡시벤질 에테르, 트리메틸실릴 에테르, 트리에틸실릴 에테르, 트리프로필실릴에테르, 디메틸이소프로필실릴 에테르, 디에틸이소프로필실릴 에테르, 디메틸헥실실릴 에테르, t-부틸디메틸실릴 에테르, 다이페닐메틸실릴 에테르, 벤조일포르메이트 에스테르, 아세테이트 에스테르, 클로로아세테이트 에스테르, 디클로로아세테이트 에스테르, 트리클로로아세테이트 에스테르, 트리플루오로아세테이트 에스테르, 메톡시아세테이트 에스테르, 트리페닐메톡시아세테이트 에스테르, 페닐아세테이트 에스테르, 벤조에이트 에스테르, 알킬 메틸 카르보네이트, 알킬 9-플루오레닐메틸 카르보네이트, 알킬 에틸 카르보네이트, 알킬 2,2,2,-트리클로로에틸 카르보네이트, 1,1,-디메틸-2,2,2-트리클로로에틸 카르보네이트, 알킬술포네이트, 메탄 술포네이트, 벤질술포네이트, 토실레이트, 메틸렌 아세탈, 에틸리덴 아세탈, 및 t-부틸메틸리덴 케탈을 포함한다. 바람직한 보호기는 화학식 -Ra, -Si(Ra)(Ra)(Ra), -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)NH(Ra), -S(O)2Ra, -S(O)2OH, P(O)(OH)2, 및 -P(O)(OH)ORa에 의해 표시되며, Ra는 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, C2-C20 알키닐, -C1-C20 알킬렌(카르보사이클), -C2-C20 알케닐렌(카르보사이클), -C2-C20 알키닐렌(카르보사이클), -C6-C10 아릴, -C1-C20 알킬렌(아릴), -C2-C20 알케닐렌(아릴), -C2-C20 알키닐렌(아릴), -C1-C20 알킬렌(헤테로사이클), -C2-C20 알케닐렌(헤테로사이클), 또는 -C2-C20 알키닐렌(헤테로사이클)이고, 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 아릴, 카르보사이클, 및 헤테로사이클 라디칼은, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 선택적으로 치환된다.
"천연 글리코실화 패턴의 변경"은 (화학적 및/또는 효소적 수단에 의해 근본적인 글리코실화 자리를 제거하거나 또는 글리코실화를 결실시킴으로써) 천연 서열 161P2F10B에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키는 것 및/또는 천연 서열 161P2F10B에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 자리를 첨가하는 것을 의미하는 것으로 본 명세서의 목적에 대해 의도된다. 추가로, 이 어구는 존재하는 다양한 탄수화물 모이어티의 특성 및 비율의 변화를 수반하는 천연 단백질의 글리코실화의 정량적 변화를 포함한다.
용어 "유사체"는 구조적으로 유사하거나 다른 분자와 유사하거나 대응하는 속성(attributes)을 공유하는 분자(예를 들어, 161P2F10B-관련 단백질)를 말한다. 예를 들어, 161P2F10B 단백질의 유사체는 161P2F10B와 특이적으로 결합하는 항체 또는 T 세포에 의해 특이적으로 결합될 수 있다.
용어 "항체"는 달리 명확하게 표시되지 않는다면 가장 넓은 의미로 사용된다. 따라서, "항체"는 자연적으로 발생하거나 또는 사람이 만든, 예컨대 통상적인 하이브리도마 기법에 의해 생성된 단클론성 항체일 수 있다. 161P2F10B 항체는 단클론성 및 다클론성 항체뿐만 아니라 항원결합 도메인 및/또는 이 항체의 하나 이상의 상보적 결정 영역을 함유하는 단편을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "항체"는 161P2F10B와 특이적으로 결합하고/결합하거나 원하는 생물학적 활성을 나타내며, 그것들이 161P2F10B와 특이적으로 결합하고/결합하거나 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 특이적으로 단클론성 항체(전장 단클론성 항체를 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 다루는 임의의 항체 또는 그 단편의 임의의 형태를 말한다. 임의의 특정 항체가 본 명세서에서 제공되는 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구체예에서 용어 "항체"는 함께 표적 항원에 대해 특이적 결합 자리를 형성하는 경쇄 면역글로불린 분자로부터 적어도 하나의 가변 영역 및 및 중쇄 분자로부터 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는 분자를 포함한다. 하나의 구체예에서, 항체는 IgG 항체이다. 예를 들어, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 본 방법 및 조성물에서 유용한 항체는 세포 배양물, 파지, 또는 이에 제한되는 것은 아니지만, 소, 토끼, 염소, 마우스, 래트, 햄스터, 기니아 피그, 양, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지, 유인원을 포함하는 다양한 동물에서 만들어질 수 있다. 따라서, 하나의 구체예에서, 본 발명의 항체는 포유류 항체이다. 파지 기법은 초기 항체를 분리하기 위해 또는 변경된 특이성 또는 결합활성(avidity) 특성을 가지는 변이체를 만들기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기법은 일상적이며, 당업계에 잘 알려져 있다. 하나의 구체예에서, 항체는 당업계에 알려진 재조합 수단에 의해 생성된다. 예를 들어 재조합 항체는 항체를 암호화하는 DNA서열을 포함하는 벡터로 숙주 세포를 트랜스펙션하는 것에 의해 생성될 수 있다. 하나 이상의 벡터는 숙주 세포 내 적어도 하나의 VL 및 하나의 VH 영역을 발현시키는 DNA 서열을 트랜스펙션하기 위해 사용될 수 있다. 항체 발생 및 생성의 재조합 수단의 예시적인 설명은 문헌[Delves, Antibody Production : Essential Techniques (Wiley, 1997); Shephard, et 　 al ., Monoclonal Antibodies (Oxford University Press, 2000); Goding, Monoclonal Antibodies : Principles And Practice (Academic Press, 1993); Current Protocols In Immunology (John Wiley & Sons, most recent edition)]을 포함한다. 본 발명의 항체는 원하는 작용을 매개하는 항체의 효능을 증가시키기 위한 재조합 수단에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 항체가 재조합 수단을 사용하여 치환에 의해 변형될 수 있는 것은 본 발명의 범주 내이다. 통상적으로, 치환은 보존적 치환일 것이다. 예를 들어, 항체의 불변 영역 내 적어도 하나의 아미노산은 상이한 잔기로 대체될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호, 미국 특허 제6,194,551호, 출원 WO 제9958572호; 및 문헌[Angal, et 　 al ., Mol . Immunol . 30: 105-08 (1993)]을 참조한다. 아미노산의 변형은 아미노산의 결실, 첨가 및 치환을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 변화는 원치않는 활성, 예를 들어 보체 의존적 세포독성을 감소시키도록 만들어진다. 빈번하게, 항체들은, 공유적으로 또는 비공유적으로 결합함으로써 검출가능한 신호를 제공하는 물질을 표지한다. 매우 다양한 표지 및 컨쥬게이션 기법이 알려져 있으며, 과학적 및 특허 문헌 둘 다에서 광범위하게 보고된다. 이 항체들은 정상 또는 결함의 161P2F10B에 결합을 위해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어 문헌[Antibody Engineering : A Practical Approach (Oxford University Press, 1996)]을 참조한다. 원하는 생물학적 활성을 가지는 적합한 항체는 이에 제한되는 것은 아니지만 다음의 시험관 내 분석: 증식, 이동, 부착, 연한천(soft agar) 성장, 혈관신생, 세포-세포 전달, 아포토시스(apoptosis), 수송, 신호전달, 직역화, 항체 매개된 제2 사멸, 및 다음의 생체 내 분석, 예컨대 종양 성장의 억제로 확인될 수 있다. 본 명세서에 제공된 항체는 ADC의 중간체로서 유용할 수 있다. 또한 본 명세서에 제공된 항체는 진단 용도에 유용할 수 있다. 포획 또는 비무력화 항체(non-neutralizing antibody)로서, 그것들은 항원의 수용체 결합 또는 생물학적 활성을 억제하지 않고 특정 항원에 결합하는 능력을 위해 스크리닝될 수 있다. 무력화 항체로서, 항체들은 경쟁적 결합 분석에 유용할 수 있다. 그것들은 또한 161P2F10B 또는 그것의 수용체를 정량화하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 항체의 "항원 결합 부분" 또는 "항체 단편"(또는 단순히 "항체 부분")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 161P2F10B 항체(예를 들어, 161P2F10B; 도 1)의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 작용은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 용어 "항원-결합 부분" 내에 포함된 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL and CH1 도메인으로 이루어진 1가의 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가의 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward, et al . (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보적 결졍 영역(CDR)을 포함한다. 더 나아가, Fv 단편, 즉 VL 및 VH 중 2개의 도메인은 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 그것들은 VL 및VH 영역이 1가의 분자를 형성하도록 짝지어지는 단일 단백질 쇄(단일 쇄 Fv (scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌[Bird, et al . (1988) Science 242:423-426; 및 Huston, et al . (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883]을 참조)로서 만들어지는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 사용하여 결합된다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 이 항체 단편은 당업자에게 알려진 통상적인 기법을 사용하여 얻어지며, 단편은 무결함 항체와 같은 동일한 방식에서 이용을 위해 스크리닝된다.
본 명세서에 사용되는 임의의 형태의 "항원"은 161P2F10B에 특이적인 항체는 만들기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 유발 항원은 단일 에피토프, 다중 에피토프, 또는 완전한 단백질 단독 또는 당업계에 알려진 하나 이상의 면역원성 향상제와 조합일 수 있다. 유발 항원은 분리된 전장 단백질, 세포 표면 단백질(예를 들어 항원의 적어도 일부로 트랜스펙션된 세포로 면역화), 또는 가용성 단백질(예를 들어, 단지 단백질의 세포밖 도메인 부분으로 면역화)일 수 있다. 항원은 유전적으로 변형된 세포 중에서 생성될 수 있다. 항원을 암호화하는 DNA는 게놈 또는 비게놈성일 수 있으며(예를 들어, cDNA) 세포밖 도메인의 적어도 일부를 암호화한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "일부"는 적절하다면 관심 항원의 면역원성 에피토프를 구성하는 최소 수의 아미노산 또는 핵산을 말한다. 관심 세포의 형질전환에 적합한 임의의 유전적 벡터는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아데노바이러스 벡터, 플라스미드, 및 비 바이러스 벡터, 예컨대 양이온성 지질을 포함하여 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 명세서의 방법 및 조성물의 항체는 관심의 161P2F10B의 세포밖 도메인의 적어도 일부에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에 제공된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 "생활성제"와 컨쥬게이션될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "생활성제"는 항원과 결합하고/결합하거나 원하는 생물학적 효과를 향상시키거나 매개하여 세포살해 독소를 향상시키는 임의의 합성 또는 자연적으로 발생하는 화합물을 말한다. 하나의 구체예에서, 본 발명에 유용한 결합 단편은 생물학적으로 활성인 단편이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적으로 활성인"은 원하는 항원 에피토프와 결합할 수 있고, 생물학적 효과를 직접 또는 간접적으로 발휘하는 항체 또는 항체 단편을 말한다. 직접 효과는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 성장 신호의 조절, 자극 및/또는 억제, 항아포토시스 신호의 조절, 자극 및/또는 억제, 아포토시스 또는 괴저성 신호의 조절, 자극, 및/또는 억제, ADCC 캐스케이드의 조절, 자극 및/또는 억제 및 CDC 캐스케이드의 조절, 자극 및/또는 억제를 포함한다.
본 명세서의 단클론성 항체는 "키메라" 항체를 포함하며, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래된 또는 특정 항체 분류 또는 하위분류에 속하는 항체에서 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지는 그것들이 표적 항원에 특이적으로 결합하고/결합하거나 원하는 생물학적 활성을 나타내는한, 다른 종으로부터 유래된 또는 다른 항체 분류 또는 하위분류에 속하는 항체뿐만 아니라 이러한 항체의 단편에서 대응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성이다(미국특허 제4,816,567호; 및 Morrison, et　al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81: 6851-6855 (1984)).
용어 "화학치료제"는 종양 성장을 억제하는 것에 효과적인 모든 화학적 화합물을 말한다. 화학치료제의 비제한적 예는 알킬화제; 예를 들어 질소 머스타드, 에틸렌이민 화합물 및 알킬 술포네이트; 항대사제, 예를 들어 폴산, 퓨린 또는 피리미딘 길항제; 유사분열 억제제, 예컨대 항 튜불린제, 예컨대 빈카 알칼로이드, 아우리스타틴 및 포도필로톡신의 유도체; 세포독성 억제제; DNA 발현 또는 복제를 손상시키거나 방해하는 화합물, 예를 들어 DNA 마이너 그루브 결합제; 및 성장 인자 수용체 길항제를 포함한다. 게다가, 화학치료제는 세포독성제(본 명세서에서 정의하는 바와 같음), 항체, 생물학적 분자 및 소분자를 포함한다.
용어 "화합물"은, 명확하게 언급되든 그렇지 않든, 문맥이 다음을 제외하는 것으로 달리 명확하게 나타내지 않는다면, 화학적 화합물 그 자체뿐만 아니라 다음을 의미하며 포함한다: 다형체 형태를 포함하는 화합물의 무정질 및 결정질 형태, 이 형태는 혼합물 또는 분리물의 부분일 수 있다; 화합물의 유리산 및 유리 염기 형태, 이는 통상적으로 본 명세서에서 제공된 구조로 나타나는 형태이다; 광학 이성질체, 호변체 이성질체를 나타내는 화합물의 이성질체, 광학 이성질체는 거울상체 및 부분입체이성질체, 키랄 이성질체 및 비키랄 이성질체를 포함하며, 광학 이성질체는 분리된 광학 이성질체뿐만 아니라 라세미 및 비라세미 혼합물을 포함하는 광학 이성질체의 혼합물을 포함하고, 이성질체는 분리된 형태로 또는 하나 이상의 다른 이성질체와 혼합물로 있을 수 있다; 듀테륨 및 트리튬 함유 화합물을 포함하고, 치료적으로 및 진단적으로 효과적인 방사성 동위원소를 포함하는 방사성 동위원소를 함유하는 화합물을 포함하는, 화합물의 동위원소; 다이머, 트리머 등의 형태를 포함하는 화합물의 다형체 형태; 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함하며, 유기 반대이온 및 무기 반대이온을 가지는 염을 포함하고, 양쪽성 이온 형태를 포함하는 화합물의 염, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 염, 화합물이 2개 이상의 반대이온과 결합되는 경우, 2 이상의 반대이온은 동일하거나 상이할 수 있다; 및 헤미솔베이트, 모노솔베이트, 디솔베이트 등을 포함하며, 유기 솔베이트 및 무기 솔베이트를 포함하고, 상기 무기 솔베이트는 수화물을 포함하는, 화합물의 용매화합물; 화합물이 2이상의 용매 분자와 결합된다면, 2이상의 용매 분자는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 예에서, 본 발명의 화합물에 대해 본 명세서에서 만들어진 기준은 상기 형태, 예를 들어 염 및/또는 솔베이트 또는 상기 형태 중 하나에 대한 명확한 기준을 포함할 것이지만, 그러나 이 기준은, 단지 강조를 위한 것이며, 상기 확인한 것과 같은 상기 형태외 다른 것을 배제하는 것으로 해석되지 않는다.
용어 "세포독성제"는 세포의 발현 활성, 세포의 작용을 억제하거나 막고/막거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 말한다. 본 용어는 방사성활성 동위원소, 화학치료제, 및 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소적으로 활성인 독소를 포함하며, 그것의 단편 및/또는 변이체를 포함하는 것으로 의도된다. 세포독성제의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아우리스타틴(예를 들어, 아우리스타틴 e, 아우리스타틴 f, MMAE 및 MMAF), 아우로마이신, 메이탄시노이드, 리신, 리신 A쇄, 콤브레타스타틴, 듀오카르마이신, 돌라스타틴, 독소루비신, 다우노루비신, 탁솔, 시스플라틴, cc1065, 브롬화에티듐, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디히드록시안트라신 디온, 악티노마이신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 엑소톡신 (PE) A, PE40, 아브린, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 큐리신, 크로틴, 칼리케아마이신, 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis) 억제제, 및 글루코코르티코이드 및 기타 화학치료제뿐만 아니라 방사성동위원소, 예컨대 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 또는 213, P32 및 Lu177을 포함하는 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 또한 항체는 프로드러그를 그것의 활성 형태로 전환시킬 수 있는 항암 프로드러그 활성화 효소에 컨쥬게이트될 수 있다.
161P2F10B-발현 세포 상에서 161P2F10B 결합제의 효과의 내용에서 용어 "고갈시키다"는 161P2F10B-발현 세포의 수의 감소 또는 제거를 말한다.
"유전자 생성물"은 본 명세서에서 펩티드/단백질 또는 mRNA를 표시하는기 위해 사용된다. 예를 들어 "본 발명의 유전제 생성물"은 본 명세서에서 때때로 "암 아미노산 서열", "암 단백질", "표 I에서 열거된 암 단백질", "암 mRNA", "표 I에서 열거된 암의 mRNA" 등으로서 언급된다. 하나의 구체예에서, 암 단백질은 도 1의 핵산에 의해 암호화된다. 암 단백질은 단편, 또 다르게는 도 1의 핵산에 의해 암호화된 전장 단백질일 수 있다. 하나의 구체예에서, 암 아미노산 서열은 서열 동일성 또는 유사성을 결정하는데 사용된다. 다른 구체예에서, 서열은 도 1의 핵산에 의해 암호화된 단백질의 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체이다. 다른 구체예에서, 서열은 본 명세서에서 추가로 설명되는 서열 변이체이다.
"헤테로컨쥬게이트" 항체는 본 방법 및 조성물에서 유용하다. 본 명세서에서 용어 "헤테로컨쥬게이트 항체"는 2개의 공유적으로 결합된 항체를 말한다. 이러한 항체는 가교제를 사용하는 것을 포함하는 합성 단백질 화학에서 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제4,676,980호.
용어 "상동체"는, 예를 들어 대응하는 위치에서 동일 또는 유사한 화학적 잔기의 서열을 가지는 다른 분자에 상동성을 나타내는 분자를 말한다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 항체는 "인간 항체"이다. 본 명세서에서, 용어 "인간 항체"는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 경쇄 서열과 중쇄 서열의 전체 서열들이 본질적으로 사람의 유전자로부터 유래된 항체를 말한다. 한가지 구체예에서, 인간의 단클론성 항체는 트리오마 기법, 인간의 B 세포 기법(예컨대, Kozbor, et 　 al ., Immunol . Today 4: 72 (1983), EBV 형질전환 기술(예컨대, Cole, et 　 al . MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77-96 (1985) 참조), 또는 파지 디스플레이 기법(예컨대, Marks, et 　 al ., J. Mol . Biol . 222:581 (1991) 참조)을 이용하여 제조된다. 특정 구체예에서, 인간 항체는 트랜스제닉 마우스에서 생성된다. 이러한 부분적 내지 완전한 인간 항체의 제조 기술은 기술 분야에 공지이며 이러한 기술 중 어느 것이든 이용가능하다. 특히 바람직한 구체예에서는, 전적으로 인간 유래의 항체 서열을 인간의 중쇄 및 경쇄 항체 유전자를 발현하도록 조작된 트랜스제닉 마우스에서 만든다. 사람의 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스의 제조에 관한 예시적인 설명은 WO 제02/43478호 및 미국특허 제6,657,103호(Abgenix) 및 그의 관련 출원에서 찾아볼 수 있다. 원하는 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스로부터 얻은 B 세포를 융합시켜 항체의 연속 제조를 위한 하이브리도마 세포주를 만든다. 예컨대, 미국특허 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호; 및 제5,545,806호; 및 Jakobovits, Adv. Drug Del . Rev . 31:33-42 (1998); Green, et 　 al ., J. Exp . Med . 188:483-95 (1998).
본 명세서에서 용어 "억제하다" 또는 "억제"는 측정가능한 양으로 감소시키거나 또는 전적으로 방지하는 것을 의미한다.
적절한 "표지(label)"로는 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 모이어티, 화학발광 모이어티, 자기 입자 등을 포함한다. 이러한 표지의 사용 기술을 설명하는 특허로는 미국특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호를 포함한다. 또한, 본 명세서에서 제공되는 항체들은 형광체의 항원 결합 성분으로서 사용될 수도 있다. 예를 들어, 문헌[Zeytun, et 　 al ., Nat . Biotechnol . 21:1473-79 (2003)]을 참조한다.
용어 "전이성 암" 및 "전이성 질환"은 근위 임파절이나 원위부까지 확산된 암을 의미하며, AUA 시스템 하에서 D 단계 질환 및 TNM 시스템 하에서 TxNxM+ 단계를 포함하는 것으로 의미된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "조절자" 또는 "테스트 화합물" 또는 "약물 후보" 또는 동등물은 암 표현형, 암 서열, 예컨대 핵산 또는 단백질 서열, 또는 암 서열의 효과(예컨대, 신호, 유전자 발현, 단백질 상호반응 등)를 직접 또는 간접적으로 변경시키는 능력에 대해 시험되는 임의의 분자, 예컨대 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 등을 설명한다. 하나의 양태에서, 조절자는 본 발명의 암 단백질의 효능을 무력화시킬 것이다. "무력화"라 함은 어떤 단백질의 활성이 저해 또는 차단되면서 결과적으로 세포에 그러한 효과를 미침을 가리킨다. 또 다른 관점에서, 조절자는 상기 단백질의 수준을 정상화시킴으로써, 본 발명의 유전자 및 그에 대응하는 단백질의 효과를 무력화시킬 것이다. 바람직한 구체예에서, 조절자는 본 발명에 제공된 발현 프로파일, 또는 발현 프로파일 핵산 또는 단백질 또는 하류의 이펙터 경로를 변경시킨다. 일례에서, 조절자는 암의 표현형을, 예컨대, 정상적인 조직 핑거프린트로 억제한다. 또 다른 구체예에서, 조절자는 암 표현형을 유도하였다. 일반적으로, 다수의 분석 혼합물을 상이한 약제 농도와 병행하여 다양한 농도에 대한 상이한 반응을 얻는다. 통상적으로, 이러한 농도들 중 한가지는 음성 대조군, 즉, 0 농도 또는 검출 수준 미만에서 작용한다.
조절자, 약물 후보 또는 테스트 화합물은 일반적으로 유기 분자, 바람직하게는, 분자량이 100달톤보다 크고 약 2,500달톤 미만인 소형 유기 화합물인 경우가 많지만, 광범위한 화학물질을 포괄한다. 바람직한 소형 분자는 분자량이 2000달톤 미만, 또는 1500달톤 미만 또는 1000달톤 미만 또는 500달톤 미만이다. 후보 물질은 단백질과 구조적으로 상호반응하는데 필요한 작용기, 특히 수소 결합, 및 일반적으로 적어도 하나의 아민, 카르보닐, 히드록실 또는 카르복실기, 바람직하게는, 적어도 두개의 작용성 화학기를 포함한다. 후보 물질은 종종 고리형 탄소 또는 헤테로시클릭 구조 및/또는 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함하여 이들은 하나 이상의 전술한 관능기로 치환된다. 조절자는 또한 펩티드, 다당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 그것의 유도체, 구조적 유사체 또는 조합체와 같은 생분자도 포함한다. 특히 바람직한 것은 펩티드이다. 조절자의 한 부류는 예컨대 약 5개 내지 35개 아미노산, 바람직하게는 약 5개 내지 약 20개 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 7개 내지 약 15개 아미노산의 펩티드이다. 바람직하게는, 암 조절 단백질은 가용성인 것이 좋고, 막관통 영역을 포함하고/포함하거나, 가용성을 보조하기 위한 N-말단 Cys를 가진다. 하나의 구체예에서, 그 단편의 C-말단은 유리산으로서 유지되고 N-말단은 예컨대 시스테인에 대한 커플링 보조를 위한 유리 아민이다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 암 단백질은 본 발명에서 논의된 면역원성 제제에 컨쥬게이트된다. 하나의 구체예에서, 암 단백질은 BSA에 컨쥬게이트된다. 예를 들어 바람직한 길이의 본 발명의 펩티드는 서로 연결되거나 다른 아미노산에 연결되어 보다 긴 펩티드/단백질을 만들어낸다. 조절 펩티드는 위에서 개략한 바와 같은 천연 단백질, 무작위 펩티드 또는 "편향된(biased)" 무작위 펩티드의 절편일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 펩티드/단백질 기재 조절자는 상기 정의된 바와 같은 항체, 및 그의 단편이다.
본 명세서에서 "단클론성 항체"라 함은 실제로 동질의 항체들의 집단, 즉, 그 집단을 이루는 항체들이, 소량으로 존재하는 자연발생적 돌연변이의 가능성을 제외하고 서로 동일한 항체들의 집단으로부터 얻어진 항체를 가리킨다. 단클론성 항체는 단일 항원 에피토프에 대해 고도로 특이적이면서 그것과 관련되어 있다. 대조적으로, 통상적인(다클론성) 항체 제제는 일반적으로 여러가지 상이한 에피토프에 관련된(또는 그에 특이적인) 항체를 복수개 포함한다. 일례에서, 폴리클로날 항체는 복수개의 항원 에피토프를 함유하는 단일 항원 내에서 상이한 에피토프 특이성, 친화성, 또는 결합활성을 갖는 단클론성 항체들을 복수개 함유한다. 변형자 "단클론성"은 그 항체의 특징이 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터 얻어졌음을 의미하며, 어떤 특정 방법에 의해 항체를 생산할 것이 요구되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는 문헌[Kohler et 　 al ., Nature 256: 495 (1975)]에 의해 최초로 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조되거나, 또는 재조합 DNA 방법(예컨대, 미국특허 제4,816,567호를 참조)에 의해 제조될 수 있다. "단클론성 항체"는 또한 예컨대, 문헌[Clackson, et 　 al ., Nature 352: 624-628 (1991) 및 Marks, et 　 al ., J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1991)]에 설명된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 이들 단클론성 항체들은 보통 ELISA로 측정시 대개 적어도 약 1 μM의, 더욱 일반적으로는 적어도 약 300nM, 일반적으로는 적어도 약 30nM, 바람직하게는 적어도 약 10nM, 더욱 바람직하게는 적어도 약 3nM의 Kd와 결합한다.
"약제학적 부형제"에는 애쥬번트, 담체, pH 조절제 및 완충제, 등장성 조절제, 습윤제, 보존제 등과 같은 물질이 포함된다.
"약제학적으로 허용가능한"은 비독성, 불활성 및/또는 인간 또는 다른 포유류와 생리적으로 혼용가능한 조성물을 지칭하는 것이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 적어도 10개의 염기 또는 염기쌍인 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 이러한 뉴클레오티드 중 어느 한 종류의 변형체인 뉴클레오티드의 폴리머 형태로서, DNA 및/또는 RNA의 단일 및 이중가닥 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 기술 분야에서, 이 용어는 "올리고뉴클레오티드"와 종종 상호호환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대 도 1에 나타내는 바와 같이, 티미딘(T)이 우라실(U)일 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고; 이러한 정의는 DNA와 RNA의 화학적 구조 간의 차이에 기인하는 것으로, 특히 RNA의 4개의 주요 염기 중 하나가 티미딘(T) 대신 우라실(U)인 경우 관찰된다.
용어 "폴리펩티드"는 적어도 약 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 아미노산의 폴리머를 의미한다. 명세서 전체를 통해, 표준 3개 또는 1개의 문자가 아미노산을 지시하기 위해 사용되었다. 당업계에서는 이 용어는 종종 "펩티드" 또는 "단백질"과 상호호환적으로 사용된다.
"재조합" DNA 또는 RNA 분자는 생체내에서 분자 조작된 DNA 또는 RNA 분자이다.
본 명세서 사용된 용어 "특이적", "특이적으로 결합한다" 및 "특이적으로 결합하는"은 표적 항원 에피토프에 대해 선택적으로 항체 결합하는 것을 지칭한다. 항체들의 결합 특이성은 주어진 조건 하에서 적절한 항원에 대한 결합과, 무관한 항원 또는 항원 혼합물에 대한 결합을 비교함으로써 시험될 수 있다. 항체가 무관한 항원 또는 항원 혼합물보다 적어도 2배, 5배, 7배, 바람직하게는 10배 더 많이 적절한 항원에 결합한다면, 특이적인 것으로 간주된다. 하나의 구체예에서, 특이적 항체는 161P2F10B-관련 항원(특히 161P2F10B)에 결합하고, 무관한 항원에는 결합하지 않는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "치료되는" 또는 "치료적" 및 그와 문법적으로 관련된 용어들은 생존의 연장, 사망률의 저하와 같은 어떤 질병의 결과의 개선 및/또는 대체 치료 양상의 부산물인 부작용의 감소를 지칭하고; 당업계에서 이미 인정되는 바와 같이, 질병의 완전한 근절은 바람직하기는 하지만 치료 행위의 필요조건은 아니다.
본 명세서의 "161P2F10B - 관련 단백질"은 본 명세서에서 구체적으로 정의된 것(도 1 참조)뿐만 아니라, 본 명세서에서 개략적으로 설명되는 방법을 따라 과도한 실험 없이 또는 당업계에서 용이하게 이용할 수 있는 방법으로 분리/제조 및 특징지어질 수 있는 대립형질 변종, 보존적 치환 변종, 아날로그와 호모로그를 포함한다. 161P2F10B 단백질의 융합 단백질과 이종성 폴리펩티드뿐만 아니라, 서로 다른 161P2F10B 단백질 또는 그 단편의 부분을 조합한 융합 단백질도 또한 포함된다. 이러한 161P2F10B 단백질은 총괄해서 161P2F10B 관련 단백질, 본 발명의 단백질 또는 161P2F10B 로 언급된다. 용어 "161P2F10B-관련 단백질"은 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 또는 25개 초과의 아미노산; 또는 적어도 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개, 120개, 125개, 130개, 135개, 140개, 145개, 150개, 155개, 160개, 165개, 170개, 175개, 180개, 185개, 190개, 195개, 200개, 225개, 250개, 275개, 300개, 325개, 330개, 335개, 339개 또는 그 이상의 아미노산의 폴리펩티드 단편 또는 161P2F10B의 단백질 서열을 말한다.
II.) 161P2F10B 항체
본 발명의 ADC에 대한 항체는 161P2F10B 단백질에 특이적으로 결합하고, 생리적 조건 하에서 161P2F10B-관련 단백질이 아닌 펩티드 또는 단백질에 결합하지 않는다(또는 약하게 결합한다).
항체, 특히 특정 단클론성 항체를 제조하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 항체는 161P2F10B 관련 단백질, 펩티드 또는 단편을 이용하여 적절한 포유동물 숙주를 면역화함으로써 분리된 또는 면역 콘쥬게이트된 형태로 제조될 수 있다 (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, 및 Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). 또한 161P2F10B GST 융합 단백질과 같은 161P2F10B의 융합 단백질도 역시 사용될 수 있다. 특정 실시의 형태에서, 도 1의 아미노산 서열의 모두 또는 대부분으로 이루어지는 GST 융합 단백질이 제조되어 적절한 항체를 생산하기 위한 면역원으로 사용된다. 또 다른 실시의 형태에서, 161P2F10B관련 단백질이 합성되어 면역원으로 사용된다.
또한, 당업계에 알려진 네이키드-DNA(naked-DNA) 면역화 기술이 암호화된 면역원에 대한 면역 반응을 만들기 위해(정제된161P2F10B 관련 단백질 또는 161P2F10B 발현 세포를 사용하거나 사용하지 않고) 사용된다(문헌[Donnelly, et 　 al ., 1997, Ann . Rev . Immunol . 15: 617-648]을 참조).
도 1에 도시된 161P2F10B 단백질의 아미노산 서열은 항체를 생산하기 위해 161P2F10B 단백질의 특정 영역을 선택하기 위해 분석될 수 있다. 예를 들면 161P2F10B 아미노산 서열의 소수성 및 친수성 분석이 161P2F10B 구조에서 친수성 영역을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 다른 영역 및 도메인뿐만 아니라 면역원의 구조를 나타내는161P2F10B 단백질의 영역은 Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz 또는Jameson-Wolf 분석 등의 당업계에 공지된 다양한 다른 방법을 사용하여 쉽게 확인될 수 있다. 친수성 프로파일은 문헌[Hopp, T.P. 및 Woods, K.R., 1981, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 78:3824-3828]의 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 소수성 프로파일은 문헌[Kyte, J. 및 Doolittle, R.F., 1982, J. Mol . Biol . 157:105-132]의 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 접근가능한 잔기 프로파일%는 문헌[Janin J., 1979, Nature 277:491-492]의 방법을 사용하여 만들 수 있다. 평균 유연성 프로파일은 문헌[Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept . Protein Res. 32:242-255]의 방법으로 만들 수 있다. 베타 턴 프로파일은 문헌[Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294.]의 방법을 사용하여 만들 수 있다. 따라서, 이들 중 어떤 프로그램 또는 방법에 의해 확인된 각각의 영역도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 161P2F10B 항체의 제조를 위한 바람직한 방법은 본 명세서의 실시예에 의해 추가로 제시된다. 면역원으로서 사용하기 위한 단백질 또는 폴리펩티드의 제조를 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. BSA, KLH 또는 다른 캐리어 단백질 등의 캐리어와 단백질의 면역성 컨쥬게이트를 만들기 위한 방법 역시 당업계에 잘 알려져 있다. 어떤 환경에서는 예를 들면 카르보디이미드 시약을 사용하는 직접 콘쥬게이션이 효과적이고, 다른 경우에는 문헌[Pierce Chemical Co., Rockford, IL]에 의해 공급되는 것과 같은 링킹 시약의 사용이 효과적이다. 161P2F10B 면역원은 당업계에서 이해되는 바와 같이 적절한 시간 간격을 두고, 적절한 애주번트와 함께 주사 투여된다. 면역화 스케쥴 동안, 항체 형성의 적절성을 결정하기 위해 항체의 역가가 취해질 수 있다.
바람직한 실시의 형태에서 본 발명의 ADC에 대한 161P2F10B MAbs는 H16-7.8로 지정되는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역(도 3 참조), 또는 H16-7.8의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 대한 상동체인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 항체는 본 발명의 161P2F10B MAb의 바람직한 작용적 특성(특히 161P2F10B 에 대한 결합 활성)을 보유한다 H16-7.8의 중쇄 가변 영역은 서열 번호 7의 20번째 Q 잔기에서 142번째 S 잔기까지의 아미노산 서열로 이루어지고, H16-7.8 의 경쇄 가변 영역은 서열 번호 8의 20번째 E 잔기에서 127번째 R 잔기까지의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 발명의 항체의 불변 영역으로서, 불변 영역의 임의의 서브클래스가 선택될 수 있다. 바람직하게는, 중쇄 불변 영역으로서 인간 IgG2 불변 영역이, 경쇄 불변 영역으로서 인간 Ig 카파 불변부가 사용될 수 있다. 161P2F10B 단백질과 161P2F10B MAb의 반응성(결합 활성)은 웨스턴 블롯, 면역침강법, ELISA 및 161P2F10B 단백질, 161P2F10B-발현 세포 또는 그것의 추출물을 사용하는 FACS 분석를 포함하는 다수의 잘 알려진 수단에 의해 확립될 수 있다.
하나의 구체예에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역의 시스테인 잔기의 수가 변경, 즉 증가 또는 감소되도록 변형된다.이 접근은 Bodmer et al .에 의한 미국특허 제5,677,425호에서 더 상세하게 설명된다. CH1의 힌지 영역에서 시스테인 잔기의 수는 예를 들면 경쇄 또는 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 161P2F10B MAb의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다.
다른 실시의 형태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 161P2F10B MAb의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 더 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역으로 도입되어 항체는 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 대해 결합하는 손상된 스타필로코실 단백질 A(Staphylococcyl protein A)(SpA)를 갖는다. 이 접근은 Ward et al .에 의한 미국특허 제6,165,745호에 더 상세하게 설명된다.
다른 실시의 형태에서, 161P2F10B MAb는 생물학적 반감기가 증가하도록 변형된다. 이에 대해 다양한 접근이 가능하다. 예를 들면, 돌연변이는 Ward의 미국특허 제6,277,375호에서 설명된 바와 같이 도입될 수 있다. 또는, 반감기를 증가시키기 위해, Presta et al . 에 의한 미국특허 제5,869,046호 및 제6,121,022호에 설명된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 두 개의 루프에서 취해진 에피토프와 결합하는 샐비지(salvage) 수용체를 함유하도록 항체는 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.
또 다른 실시의 형태에서, Fc 영역은 161P2F10B MAb의 이펙터 기능(들)을 변경시키도록 적어도 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들면, 아미노산 특정 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은, 항체가 이펙터 리간드에 대한 변경된 친화성을 갖지만 모항체의 항원 결합 능력은 유지하도록 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화성이 변경될 수 있는 이펙터 리간드는, 예를 들면, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분이 될 수 있다. 이 접근은 Winter et al .에 의한 미국특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호에 더 상세하게 설명된다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 ADC에 대한 항체는 당업계에 알려진 재조합 수단에 의해 생성된다. 예를 들어, 재조합 항체는 항체를 암호화하는 DNA서열을 포함하는 벡터로 숙주 세포를 트랜스펙션함으로써 생성될 수 있다. 하나 이상의 벡터는 숙주 세포 내에서 적어도 하나의 VL 및 하나의 VH영역을 발현시키는 DNA서열을 트랜스펙션하는데 사용될 수 있다. 항체 발생 및 생성의 재조합 수단의 예시적 설명은 문헌 [Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shephard, et 　 al ., Monoclonal Antibodies(Oxford University Press, 2000); Goding, Monoclonal Antibodies : Principles And Practice (Academic Press, 1993); Current Protocols In Immunology (John Wiley & Sons, most recent edition)]을 포함한다.
본 발명의 ADC에 대한 항체는 본 명세서에 개신된 중쇄 가변영역 및 경쇄가변영역 상에서 서열 정보를 기준으로 당업계에 흔히 알려진 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 ADC에 대한 항체의 중쇄 가변 아미노산을 암호화하는 염기 서열을 가지는 중쇄 가변영역 유전자 단편(서열 번호 7의 20 내지 142), 및 본 발명의 ADC에 대한 항체의 경쇄 가변 아미노산을 암호화하는 염기 서열을 가지는 경쇄 가변영역 유전자 단편(서열 번호 8, 20 내지 127)이 제공된다. 그 다음, 가변 영역 유전자를 인간 항체의 적절한 부류 내 불변 영역 유전자에 결합하여 항체 유전자를 제조한다. 다음으로, 이 항체 유전자를 적절한 발현 벡터에 결합하고 배양된 세포에 도입한다. 최종적으로 이 배양된 세포를 배양하고. 이에 의해 항체를 배양물 상청액으로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산을 암호화하는 각각의 상기 설명한 가변 영역 단편(서열 번호 7의 20 내지 142 및 서열 번호 8의 20 내지 127)은 당업계에 흔히 알려진 유전자 합성 방법을 사용하여 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기준으로(서열 번호 7의 20 내지 142 및 서열 번호 8의 20 내지 127), 또는 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 염기 서열을 기준으로, 서열 번호 4의 91 내지 459 및 서열 번호 6의 100 내지 423으로 나타내는, 설계한 염기 서열에 의해 제조될 수 있다. 이와 같은 유전자 합성의 방법, 당업자에게 분명한 다양한 방법, 예컨대 WO 제90/07861호에서 설명되는 항체 유전자 합성 방법이 사용될 수 있다. 다음으로, 상기 설명한 가변 영역 유전자 단편 및 인간 항체의 불변 영역 유전자가 결합되어 항체 유전자를 제조한다. 불변영역의 임의의 서브클래스가 사용된 인간 항체의 불변 영역으로 선택될 수 있지만, 중쇄 불변 영역으로서 인간 Ig[감마]2, 및 경쇄 불변 영역으로 인간 Ig[카파] 가 바람직하게 사용될 수 있다.
서열 번호 7의 20 내지 142로 나타낸 중쇄 가변 영역 유전자와 인간 Ig[감마]2 중쇄 불변 영역 유전자의 결합에 의해 얻은 본 발명의 ADC에 대한 항체의 바람직한 항체 중쇄 유전자로서, 서열 번호 7의 20 내지 468로 나타내는 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 포함하는 유전자, 더 바람직하게는 서열 번호 4의 91 내지 1437에 의해 나타낸 염기 서열을 포함하는 유전자가 언급될 수 있다. 서열 번호 8의 20 내지 127로 나타낸 경쇄 가변 영역 유전자와 인간 Ig[카파]2 경쇄 불변 영역 유전자의 결합에 의해 얻은 본 발명의 ADC에 대한 항체의 바람직한 항체 경쇄 유전자로서, 서열 번호 8의 20 내지 233으로 나타내는 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 포함하는 유전자, 더 바람직하게는 서열 번호 6의 100 내지 741에 의해 나타낸 염기 서열을 포함하는 유전자가 언급될 수 있다. 서열 번호 4의 91 내지 1437에 의해 나타내는 염기 서열을 포함하는 중쇄 유전자 및 서열 번호 6의 100 내지 741에 의해 나타내는 염기 서열을 포함하는 경쇄 유전자에 의해 암호화되는 본 발명의 ADC에 대한 항체로서, H16-7.8이 이하의 실시예에서 설명되며, 언급될 수 있다.
이 항체 유전자의 제조에 후속하여, 발현 벡터에 항체 유전자의 도입, 배양한 세포에 발현 벡터의 도입, 배양한 세포의 경작, 항체 등의 정제는 당업계에 흔히 알려진 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 발현 벡터는, 항체 유전자를 발현시킬 수 있는 한, 제한을 받지 않는다. AG-[감마]2 또는 AG-[카파]와 같은 인간 Ig 불변 영역 유전자를 이미 가지는 발현 벡터를 이용가능것이 가능한데, 항체 가변 영역 유전자가 그것이 삽입될 때 단순히 항체 유전자를 가지는 발현 벡터가 되기 때문이다.
상기 설명한 발현 벡터는, 예를 들어 칼슘 포스페이트 방법 등에 의해 배양 세포에 도입된다. 발현 벡터가 도입되는 배양 세포의 예로서, CHO 세포와 같은 배양 세포가 사용될 수 있고, 그것들은 통상적인 방법에 의해 배양될 수 있다. 상기 설명한 배양 후, 배양물 상청액 내 축적된 항체는, 예를 들어 단백질 A 컬럼을 사용하는 다양한 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
이렇게 얻은 161P2F10B 항체의 161P2F10B 단백질과 반응성(결합 활성)은 웨스턴 블롯, 면역침강법, ELISA 및 161P2F10B 단백질, 161P2F10B-발현 세포 또는 그것의 추출물을 사용하는 FACS 분석를 포함하는 다수의 잘 알려진 수단에 의해 확립될 수 있다. 이렇게 얻은 항체 또는 필요하다면 추가 정제 후 항체에 기인하여 활성을 보유하는 항체 단편은 ADC에 대한 항체로 제조될 수 있다. 161P2F10B 항체 또는 그것의 단편은 검출가능한 마커로 표지되거나 제2 분자에 컨쥬게이트될 수 있다. 적당한 검출가능한 마커는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생발광성 화합물, 화학발광성 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소를 포함한다. 추가로, 2 이상의 161P2F10B 에피토프에 특이적인 2특이성 항체는 당업계에 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 생성된다. 호모다이머 항체가 또한 당업계에 알려진 교차결합 기법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, Wolff, et 　 al ., Cancer Res . 53: 2560-2565).
또 다른 실시의 형태에서, 본 발명의 ADC에 대해 161P2F10B MAb는 H16-7.8로 지정된 항체의 중쇄 및 경쇄을 포함하는 항체이다. H16-7.8의 중쇄는 서열 번호 7의 20번째 Q잔기에서 468번째 K잔기까지의 아미노산 서열로 이루어지고, H16-7.8의 경쇄는 서열 번호 8 서열의 20번째 E잔기에서 233번째 C잔기까지의 아미노산 서열로 이루어진다. 상기 서열은 도 2 및 도 3에 도시된다. 바람직한 실시의 형태에서, H16-7.8는 세포독성제와 컨쥬게이트된다.
III.) 항체-약물 컨쥬게이트 개괄
다른 양태에서, 본 발명은 MMAF와 같은 세포독성제에 컨쥬게이트된 항체를 포함하는, 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 ADC를 사용하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, ADC는 세포독성제에 공유적으로 부착된 상기 161P2F10B MAb 중 어떤 것을 포함한다.
세포독성제 또는 세포분열 억제제, 즉 암의 치료에서 종양세포를 죽이거나 저해하는 약물(Syrigos 및 Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz 및 Springer (1997) Adv . Drg Del . Rev. 26:151-172; 미국특허 제4,975,278호)의 국소 전달을 위한 항체 약물 컨쥬게이트의 사용은, 약물 모이어티의 종양에 대한 타켓화된 전달과 세포 내 축적을 가능하게 하여, 이들 비컨쥬게이트 약제의 전신 투여로 인해 제거해야 할 종양 세포 뿐 아니라 정상 세포에 대해서도 수용불가능한 독성 수준을 초래할 수 있다(Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera, et al . (ed.s), pp.　475-506). 따라서 최소 독성을 갖는 최대 효능이 추구된다. 다클론성 항체와 단클론성 항체는 모두 이들 전략에서 유리한 것으로 보고된다.(Rowland et al., (1986) Cancer Immunol . Immunother., 21:183-87). 이들 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트와 빈데신(Rowland et al ., (1986) supra)을 포함한다. 항체-독소 컨쥬게이트에 사용되는 독소는 디프테리아 독소 등의 박테리아 독소, 리신과 같은 식물 독소, 겔다나마이신(Mandler, et al. (2000) Jour . of the Nat . Cancer Inst . 92(19):1573-1581; Mandler, et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem . Letters 10:1025-1028; Mandler, et al. (2002) Bioconjugate Chem . 13:786-791), 메이탄시노이드(EP 제1391213호; Liu, et al. (1996) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:8618-8623), 및 칼리케마이신(Lode et al (1998) Cancer Res . 58:2928; Hinman et al(1993) Cancer Res. 53:3336-3342)과 같은 소분자 독소를 포함한다. 상기 독소는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 저해를 포함하는 매커니즘에 의해 그들의 세포독성 및 세포 분열 억제 효과를 나타낼 수 있다. 어떤 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드와 컨쥬게이트될 때 비활성화되거나 활성이 작아지는 경향을 보인다.
항체 약물 컨쥬게이트의 예는 정상 및 악성 B 림프구 표면에서 발견되는 CD20 항원을 지향하는 뮤린IgG1 카파 단클론성 항체와, 티오요소 링커-킬레이터에 의해 결합된 111In 또는 90Y 방사성 동위원소로 구성되는 항체-방사성 동위원소 컨쥬게이트인 ZEVALIN® 이브리투모맙 튜세탄, Biogen/Idec)이다(Wiseman, et al. (2000) Eur . Jour . Nucl . Med . 27(7):766-77; Wiseman, et al. (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig, et al. (2002) J. Clin . Oncol . 20(10):2453-63; Witzig, et al. (2002) J.　 Clin . Oncol . 20(15):3262-69).
또한, 칼리케마이신에 결합된 hu CD33 항체로 구성된 항체 약물 컨쥬게이트인 MYLOTARGTM 겜투주맙-오조가마이신, Wyeth Pharmaceuticals)은 급성 골수성 백혈병 주사 치료용으로 2000년에 승인되었다(Drugs of the Future (2000) 25(7):686; 미국특허 제4970198호; 제5079233호; 제5585089호; 제5606040호; 제5693762호; 제5739116호; 제5767285호; 제5773001호).
또한, 다이설파이드 링커 SPP를 통해 메이탄시노이드 약물 모이어티, DM1에 결합된 huC242 항체로 이루어진 항체 약물 컨쥬게이트인, 칸투주맙 메탄신(Cantuzumab mertansine, Immunogen, Inc.)은 CanAg을 발현하는, 결장, 췌장, 위장 및 기타 암의 치료에 대한 2상 시험에 진입하였다.
추가로, MLN-2704(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)는 메이탄시노이드 약물 모이어티, DM1에 결합된 항전립성 특정 멤브레인 항원(PSMA) 모노클로날 항체로 구성된 항체 약물 컨쥬게이트로서, 전립선암의 잠재적 치료를 위해 개발 중이다.
마지막으로, 아우리스타틴 펩티드, 아우리스타틴 E(AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE), 도라스탄틴의 합성 유사체는 (암종에서 루이스 Y에 특정한) 키메라 모노클로날 항체 cBR96 및 (혈액 종양에서 CD30에 특정한) 및 cAC10 에 컨쥬게이트되며(Doronin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784), 치료적 개발이 진행 중이다.
III(A). 아우리스타틴 및 돌로스타틴
돌로스타틴 및 아우리스타틴은 미소세관 역학, GTP 가수분해 및 핵과 세포의 분열을 방해하는 것으로 알려져 있고(Woyke et al.(2001) Antimicrob . Agents and Chemother . 45(12):3580-3584), 항암 활성(미국특허 제5663149호) 및 항진균 활성(Pettit et al. (1998) Antimicrob . Agents Chemother. 42:2961-2965)을 갖는 것으로 알려져 있다. 돌로스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드 약물 모이어티의 N(아미노) 말단 또는 C(카르복실) 말단을 통하여 항체에 부착될 수 있다(WO 제02/088172호).
예시적 아우리스타틴의 구체예는 N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 들 수 있고, 문헌 [Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented March 28, 2004]에 개시되어 있고, 이들 기재는 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.
예시적인 아우리스타틴 구체예는 MMAE이며, 물결선은 항체 약물 컨쥬게이트의 링커(L)에 대한 공유적 부착을 나타낸다.
Figure 112012072574899-pct00005
MMAE
다른 예시적인 아우리스타틴 구체예는 MMAF이며, 물결선은 항체 약물 컨쥬게이트의 링커(L)에 공유적 부착을 나타낸다(미국특허 제2005/0238649호):
Figure 112012072574899-pct00006
MMAF
MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 요소들(본 명세서에 추가로 설명됨)을 포함하는 추가의 예시적 구체예는 이하의 구조 및 약자를 포함한다(여기서 Ab는 항체를 의미하고 p는 1 내지 약 12이다):
Figure 112012072574899-pct00007
Ab-MC-vc-PAB-MMAF
Figure 112012072574899-pct00008
Ab-MC-vc-PAB-MMAE
Figure 112012072574899-pct00009
Ab-MC-MMAF
본 발명의 ADC는 MMAF를 포함한다. 바람직한 구체예에서 본 발명의 ADC는 링커로서 말레이미도카프로일(mc) 및 약물로서 MMAF를 포함한다.
IV.) 161P2F10B에 결합하는 항체-약물 컨쥬게이트 화합물
본 발명은 특히 약물의 표적화된 전달을 위한 항체-약물 컨쥬게이트 화합물을 제공한다. 본 발명의 발명자들은 항체-약물 컨쥬게이트 화합물이 161P2F10B를 발현하는 세포에 대하여 강력한 세포 독성 및/또는 세포 증식 억제 활성을 가진다는 것을 발견하였다. 상기 항체-약물 컨쥬게이트 화합물들은 하나 이상의 약물 유닛과 공유 결합으로 연결된 항체 유닛을 포함한다. 약물 유닛은 직접적으로 또는 링커 유닛(-LU-)을 통하여 공유적으로 연결된다.
일부 구체예에서, 항체 약물 컨쥬게이트 화합물은 하기 화학식:
L - (LU-D)p (I)
또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화합물을 가지며;
L은 항체 유닛, 예컨대 본 발명의 161P2F10B MAb이고,
(LU-D)는 링커 유닛-약물 유닛 모이어티이고,
LU-는 링커 유닛이고,
-D는 표적 세포에 대하여 세포 증식 억제 활성 또는 세포 독성 활성을 가지는 약물 유닛이고,
p는 정수 1 내지 20이다.
일부 구체예에서, p는 1 내지 12, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2의 범위이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, p는 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4 또는 2 내지 3의 범위이다. 다른 구체예에서, p는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 구체예에서, p는 2 또는 4이다.
일부 구체예에서, 항체 약물 컨쥬게이트 화합물은 다음의 화학식:
L - (Aa-Ww-Yy-D)p ( II )
또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화합물을 가지며:
L은 항체 유닛, 예컨대 161P2F10B MAb이고;
-Aa-Ww-Yy-는 링커 유닛 (LU)이고,
-A-는 스트레쳐 유닛이며,
a는 0 또는 1이고,
각각의 -W-는 독립적으로 아미노산 유닛이며,
w는 0 내지 12 범위의 정수이고,
-Y-는 자기 희생적(self-immolative) 스페이서 유닛이고,
y는 0, 1 또는 2이며;
-D는 표적 세포에 대하여 세포 증식 억제 활성 또는 세포 독성 활성을 가지는 약물 유닛이고;
p는 정수 1 내지 20이다.
일부 구체예에서, a는 0 또는 1이며, w는 0 또는 1이고, y는 0, 1 또는 2이다. 일부 구체예에서, a는 0 또는 1이며, w는 0 또는 1이고, 및 y는 0 또는 1이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, p는 1 내지 12, 1 내지10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2의 범위이다. 일부 구체예에서, p는 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4 또는 2 내지 3의 범위이다. 다른 구체예에서, p는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, p는 2 또는 4이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, w가 0이 아닌 경우, y는 1 또는 2이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, w가 1 내지 12인 경우, y는 1 또는 2이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, w는 2 내지 12이고 y는 1 또는 2이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, a는 1이고 w 및 y는 0이다.
다수의 항체들을 포함하는 조성물용으로, 약물 부하(drug loading)는 항체당 평균 약물 분자수인 p로 나타낸다. 약물 부하는 항체당 1 내지 20 약물(drugs, (D))의 범위이다. 컨쥬게이션 반응의 제조에 있어서 항체당 평균 약물 수는 질량 분광법, ELISA 시험 및 HPLC과 같은 종래 수단에 의하여 파악될 수 있다. p에 대해서 항체-약물 컨쥬게이트의 정량적 분포가 또한 결정될 수 있다. 몇 가지 예로서, 다른 약물 부하를 가지는 항체-약물 컨쥬게이트로부터 특정 p값을 가지는 균질 항체-약물 컨쥬게이트를 분리, 정제 및 특징화하는 것은 역상 HPLC 또는 전기 영동법으로 이루어질 수 있다. 예시적인 구체예에서, p는 2 내지 8이다.
항체-약물 컨쥬게이트 화합물의 생성은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 간단히, 항체-약물 컨쥬게이트 화합물은 항체 유닛으로서 161P2F10B MAb, 약물 및 필요에 따라 약물에 연결되는 링커 및 결합제를 포함한다. 양호한 실시 상태에 있어서, 항체는 전술된 항체 지정 H16-7.8의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 161P2F10B MAb이다. 더욱 양호한 실시 상태에 있어서, 항체는 전술된 항체 지정 H16-7.8의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 161P2F10B MAb이다. 다양한 많은 반응을, 약물 및/또는 링커와 결합제의 공유적 결합에 이용할 수 있다. 이것은 종종 결합제의 아미노산 잔기의 반응에 의하여 이루어질 수 있으며, 예컨대 항체 분자, 예컨대 리신의 아민기, 글루타민산 및 아스파르트산의 자유 카르복실산기, 시스테인의 술프하이드릴기 및 방향족 아미노산의 다양한 모이어티 등이다. 공유 결합에 가장 흔하게 사용되는 불특정 방법 중 하나는 화합물의 카르복시기(또는 아미노기)를 항체의 아미노기(또는 카르복시기)와 연결시키는 카르보디이미드 반응이다. 추가로, 2작용성 작용물질들, 예컨대 디알데히드 또는 이미도에스테르는 화합물의 아미노기와 항체 분자의 아미노기를 연결시키는 데 사용된다. 쉬프(Schiff) 염기 반응도 역시 약물과 결합제의 부착에 이용된다. 이 방법은 클리콜 또는 히드록시기를 함유하는 약물의 과요오드산염 산화를 수반하고, 그러므로 알데히드를 형성하여 결합제와 뒤이어 반응하게 된다. 결합은 결합제의 아미노기를 가지는 쉬프 염기의 형성을 통하여 일어난다. 이소티아사이아네이트도 역시 약물과 결합제의 공유적 결합을 위한 커플링제로 사용될 수 있다. 기타의 방법들이 본 발명의 범위 내에서 당업자에게 알려져 있다.
특정한 실시 상태에 있어서, 링커의 전구체인 매개자는 적절한 조건 하에서 약물과 반응한다. 특정한 실시 상태에 있어서, 반응기는 약물 및/또는 중간체 상에서 사용된다. 약물과 중간체 사이의 반응 생성물, 또는 유도체화된 약물은 후속하여 적절한 조건 하에서 161P2F10B MAb와 반응한다.
항체-약물 컨쥬게이트 화합물의 각 특정 유닛은 본 명세서에서 더욱 상세하게 기술하고 있다. 예시적인 링커 유닛, 스트레쳐 유닛, 아미노산 유닛, 자기 희생적 스페이서 유닛 및 약물 유닛의 합성 및 구조도 역시 미국출원 공개 제2003-0083263호, 제2005-0238649호 및 제2005-0009751호에 기재되어 있고, 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참조로 그 전문이 포함된다.
V.) 링커 유닛
통상적으로, 항체-약물 컨쥬게이트 화합물은 약물 유닛과 항체 유닛 간에 링커 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 세포 내 조건 하에서는 절단가능하므로, 링커의 분리에 의하여 세포 내 환경에서 항체로부터 약물 유닛을 방출한다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 링커 유닛은 절단가능하지 않고 약물은, 예컨대 항체 분해에 의하여 방출된다.
일부 구체예에서, 링커는 세포 내 환경에(예컨대, 리소좀 또는 엔도좀 또는 포낭내에) 존재하는 분리제에 의하여 절단가능하다. 링커는, 예컨대 세포 내 펩티드 분해효소 또는 단백질 분해 효소에 의하여 분해되는 펩티드 링커일 수 있으며 상기 분해 효소는 리소좀의 또는 엔도좀의 단백질 분해 효소를 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 펩티드 링커는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 적어도 3개의 아미노산 길이이다. 분리제는 카텝신 B 및 D 및 플라즈민을 포함할 수 있고, 이들 모두는 디펩티드 약물 유도체들을 가수분해하는 것으로 알려져 있어 표적 세포 안으로 활성 약물을 방출하는 결과를 나타낸다(예컨대, 문헌[Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123]을 참조). 161P2F10B -발현 세포에 존재하는 효소에 의하여 절단가능한 펩티드 링커가 가장 일반적이다. 예컨대, 암 조직에서 다량 발현되는 티올 의존성 단백질 분해 효소 카텝신-B에 의하여 절단가능한 펩티드 링커가 사용될 수 있다 (예컨대, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 링커(서열 번호 25)). 이러한 링커들의 다른 예가, 예컨대 U.S. 특허 제6,214,345호에 개시되어 있고, 모든 목적을 위하여 전체가 본 명세서에 포함된다. 특정 실시 상태에 있어서, 세포 내 단백질 분해 효소에 의하여 절단가능한 펩티드 링커는 Val-Cit 링커 또는 Phe-Lys 링커 (예컨대, U.S. 특허 제6,214,345호, 여기에는val-cit 링커를 포함하는 독소루비신의 합성이 개시되어 있다)이다. 치료제가 세포 내의 단백질 분해에 의하여 방출되는 경우의 한 가지 장점은 컨쥬게이트시 일반적으로 약독성이고 통상 컨쥬게이트의 혈청 안정성이 높다는 점이다.
다른 구체예에서, 절단가능한 링커는 pH 민감성, 즉, 특정 pH 값에서 가수분해에 민감하다. 통상적으로, pH 민감성 링커는 산성 조건 하에서 가수분해가능하다. 예를 들면, 리소좀에서 가수분해될 수 있는 산-불안정 링커(예를 들면, 히드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아코니트 아미드, 오르토에테르, 아세탈, 케탈 등)가 사용될 수 있다(예를 들면, 미국특허 제5,122,368호; 제5,824,805호; 제5,622,929호; Dubowchik 및 Walker, 1999, Pharm . Therapeutics 83:67-123; Neville, et al ., 1989, Biol . Chem . 264:14653-14661를 참조). 그러한 링커들은 혈액과 같은 중성 pH 조건 하에서 상대적으로 안정하지만, 리소좀의 근사 pH인 pH 5.5 미만 또는 5.0에서는 불안정하다. 어떤 구체예에서는, 가수분해가능한 링커는 티오에테르 링커 (예를 들면, 아실히드라존 결합을 통해 치료제에 결합된 티오에테르)이다(미국특허 5,622,929를 참조).
또 다른 실시의 형태에서, 상기 링커는 환원 조건 하에서 절단가능하다(즉, 디설파이드 링커). SATA(N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트), SPDP(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT(N-숙신이미딜-옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔), SPDB 및 SMPT를 이용하여 형성될 수 있는 것을 포함하는 다양한 디설파이드 링커가 업계에 알려져 있다(예를 들면, Thorpe, et al ., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak, et al ., In Immunoconjugates : Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. 또한 미국특허 제4,880,935호를 참조) 참조).
또 다른 특정 구체예에서, 링커는 말로네이트 링커(Johnson, et al ., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), 말라이미도 벤조일 링커(Lau, et al ., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), 또는 3'-N-아미드 유사체(Lau, et al ., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12)이다.
또 다른 실시의 형태에서, 상기 링커 유닛은 절단가능하지 않고, 약물은 항체 붕괴에 의해 방출된다(본 명세서에 전문이 모든 목적을 위하여 참조로 포함되는 미국 공개 제2005/0238649호를 참조). 바람직한 구체예에서, 링커 유닛은 말레이미도카프로일(mc)이다.
통상적으로, 링커는 실질적으로 세포밖 환경에 민감하지 않다. 여기서 사용되는 바와 같이, 링커의 맥락에서 "세포밖 환경에 실질적으로 민감하지 않다"는 것은 항체-약물 컨쥬게이트 화합물이 세포외 환경(예를 들면 혈장)에 존재할 때, 샘플 항체-약물 컨쥬게이트 화합물에서 20% 이하, 통상적으로 15% 이하, 더욱 통상적으로는 10% 이하, 더욱 더 통상적으로는 5% 이하, 3% 이하 또는 1% 이하의 링커가 절단된다는 의미이다. 링커가 세포밖 환경에 실질적으로 민감하지 않은지 여부는 예를 들면, 사전결정된 시간 기간(예를 들면 2시간, 4시간, 8시간, 16시간 또는 24시간)으로 항체-약물 컨쥬게이트 화합물을 혈장과 함께 배양하여 혈장 내에 존재하는 자유 약물의 양을 정량함으로써 결정될 수 있다.
다른, 상호 비배타적인 구체예에서, 링커는 세포 내재화를 증진한다. 어떤 실시의 형태에서는, 링커는 치료제와 컨쥬게이트될 때(즉, 본 명세서에 설명된 바와 같은 항체-약물 컨쥬게이트 화합물의 링커-치료제 모이어티의 환경에서), 세포 내재화를 촉진한다. 또 다른 실시의 형태에서, 링커는 아우리스타틴 화합물과 161P2F10B MAb 양자에 컨쥬게이트될 때 세포 내재화를 촉진한다.
본 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 다양한 예시적인 링커들이 WO 제2004-010957호, 미국특허 공개 제2006/0074008호, 제2005/0238649호, 및 제2006/0024317호에 설명된다(이들 각각은 전체가 본 명세서에 모든 목적을 위하여 참고로서 포함된다).
"링커 유닛"(LU)은 약물 유닛과 항체 유닛을 결합하여 항체-약물 컨쥬게이트 화합물을 형성하는데 사용될 수 있는 2작용성 화합물이다. 일부 구체예에서, 링커 유닛은 하기의 화학식을 가진다.
-Aa-Ww-Yy-
상기 식에서:-A-는 스트레처 유닛이고,
a는 0 또는 1이며,
각각의 -W- 는 독립적으로 아미노산 유닛이고,
w는 0 내지 12의 정수이며,
-Y-는 자가희생적 스페이서 유닛이고,
y는 0, 1 또는 2이다.
일부 구체예에서, a는 0 또는 1이며, w는 0 또는 1이고, y는 0, 1 또는 2이다. 일부 구체예에서, a는 0또는 1, w는 0 또는 1이고 y는 0 또는 1이다. 일부 구체예에서, w는 1 내지 12이며, y는 1 또는 2이다. 일부 구체예에서, w는 2 내지 12이고 y는 1 또는 2이다. 일부 구체예에서, a는 1이고 w 및 y는 0이다.
VI.) 스트레처 유닛
스트렛쳐 유닛(A)은 존재할 경우, 항체 유닛을 (존재하는 경우) 아미노산 유닛(-W-)에, (존재하는 경우) 스페이서 유닛(-Y-)에결합시킬 수 있으며; 또는 약물 유닛(-D)에 결합시킬 수 있다. 161P2F10B MAb에 존재할 수 있는 유용한 작용기(예컨대 H16-7.8)의 비제한적인 예로는 천연의 것이거나 또는 화학 합성된 것이거나, 술프히드릴, 아미노, 히드록실, 탄수화물의 아노머형 히드록실기 및 카르복실을 들 수 있다. 적절한 관능기는 술프히드릴과 아미노이다. 일례에서, 술프히드릴기는 161P2F10B MAb의 분자내 디술파이드 결합을 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 술프히드릴기는 161P2F10B MAb의 리신 모이어티의 아미노기를 2-이미노티올란(Traut 시약) 또는 다른 술프히드릴 발생 시약과 반응시킴으로써 만들 수 있다. 특정 구체예에서, 161P2F10B MAb는 재조합 항체이며 유전자 조작되어 하나 이상의 리신을 운반한다. 또 다른 특정 구체예에서, 재조합161P2F10B MAb는 유전자 조작되어 부가적인 술프히드릴 기, 예를 들어 부가적인 시스테인을 운반한다.
하나의 구체예에서, 스트렛쳐 유닛은 항체 유닛의 황 원자와 결합을 형성한다. 황 원자는 항체의 술프히드릴기로부터 유래할 수 있다. 이러한 구체예의 대표적인 스트렛쳐 유닛은 화학식 IIIa 및 IIIb의 꺾쇠괄호 안에 그려진 것으로서, 여기서, L-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기 정의된 바와 같고, R17 은 -C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알케닐렌-, -C1-C10 알키닐렌-, 카르보사이클로-,
-O-(C1-C8 알킬렌)-, O-(C1-C8 알케닐렌)-, -O-(C1-C8 알키닐렌)-, -아릴렌-,
-C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -C2-C10 알케닐렌-아릴렌, -C2-C10 알키닐렌-아릴렌, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -아릴렌-C2-C10 알케닐렌-, -아릴렌-C2-C10 알키닐렌-, -C1-C10 알킬렌-(카르보사이클로)-, -C2-C10 알케닐렌-(카르보사이클로)-, -C2-C10 알키닐렌-(카르보사이클로)-, -(카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -(카르보사이클로)-C2-C10 알케닐렌-, -(카르보사이클로)-C2-C10 알키닐렌, -헤테로사이클로-, -C1-C10 알킬렌-(헤테로사이클로)-, -C2-C10 알케닐렌-(헤테로사이클로)-, -C2-C10 알키닐렌-(헤테로사이클로)-, -(헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -(헤테로사이클로)-C2-C10 알케닐렌-, -(헤테로사이클로)-C1-C10 알키닐렌-, -(CH2CH2O)r-, 또는 -(CH2CH2O)r-CH2-으로부터 선택되고, r은 1~10의 범위의 정수이며, 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 아릴, 카르보사이클, 카르보사이클로, 헤테로사이클로, 및 아릴렌 라디칼은, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 선택적으로 치환된다. 일부 구체예에서, 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 아릴, 카르보사이클, 카르보사이클로, 헤테로사이클로, 및 아릴렌 라디칼은, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 비치환된다. 일부 구체예에서, R17은 -C1-C10 알킬렌-, - 카르보사이클로-, -O-(C1-C8 알킬렌)-, -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(카르보사이클로)-, -(카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 헤테로사이클로-, -C1-C10 알킬렌-(헤테로사이클로)-, -(헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -(CH2CH2O)r-, 및 -(CH2CH2O)r-CH2-로부터 선택되고; r은 1~10 범위의 정수이며, 상기 알킬렌 기는 비치환되고, 기의 나머지는 선택적으로 치환된다.
모든 예시적인 구체예 전반에 걸쳐서, 명확하게 나타나지 않은 경우 조차도, 항체 하나에 1개 내지 12개의 약물 모이어티가 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다(p = 1~12).
Figure 112012072574899-pct00010
예시적인 스트레처 유닛은 R17이 -(CH2)5-이인 화학식 IIIa이다:
Figure 112012072574899-pct00011
다른 스트레처 유닛은 R17이 -(CH2CH2O)r-CH2-이고; r은 2인 화학식 IIIa이다:
Figure 112012072574899-pct00012
예시적인 스트레처 유닛은 R17은 -아릴렌- 또는 아릴렌-C1-C10 알킬렌-인 화학식 IIIa이다. 일부 구체예에서, 아릴 기는 비치환된 페닐 기이다.
또 다른 예시적 스트레처 유닛은 R17이 -(CH2)5-인 화학식 IIIb이다:
Figure 112012072574899-pct00013
특정 구체예에서, 스트렛쳐 유닛은 항체 유닛의 황 원자와 스트렛쳐 유닛의 황 원자 사이의 디술파이드 결합을 통해 항체 유닛에 결합된다. 이 구체예의 대표적인 스트렛쳐 유닛은 화학식 IV의 꺾쇠괄호 안에 그려져 있으며, R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기 정의된 바와 같다.
Figure 112012072574899-pct00014
IV
본 발명 전반에 걸쳐, 하기 화학식의 S 모이어티는 달리 언급하지 않는 한, 항체 유닛의 황 원자를 말하는 것으로 이해되어야 한다.
Figure 112012072574899-pct00015
또 다른 구체예에서, 스트렛쳐 유닛은 항체의 일차 또는 이차 아미노기와 결합을 형성할 수 있는 반응성 부위를 함유한다. 이러한 반응성 부위의 비제한적인 예로는 활성화된 에스테르, 예컨대 숙신아미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 클로라이드, 술포닐 클로라이드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 들 수 있다. 이 구체예의 대표적인 스트렛쳐 유닛은 화학식 Va와 Vb에서 꺾쇠괄호 안에 표시된 것이며, -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기 정의된 바와 같다;
Figure 112012072574899-pct00016
일부 구체예에서, 스트렛쳐 유닛은 항체에 존재할 수 있는 변형된 탄수화물의 (-CHO)기와 반응하는 반응성 부위를 함유한다. 예컨대, 탄수화물은 소듐 페리오데이트와 같은 시약을 이용하여 온화하게 산화시킨 다음 이 산화된 탄수화물의 결과적인 (-CHO) 유닛을 관능기, 예컨대 히드라지드, 옥심, 일차 또는 이차 아민, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카복실레이트 및 예컨대 문헌[Kaneko, et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2:133-41]에 설명된 바와 같은 아릴히드라지드를 함유하는 스트렛쳐 유닛과 축합시킬 수 있다. 이러한 구체예의 대표적인 스트렛쳐 유닛은 화학식 VIa, VIb, VIc의 꺾쇠괄호 내에 도시되어 있으며, 여기서 -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기 정의된 바와 같다.
Figure 112012072574899-pct00017
VII.) 아미노산 유닛
아미노산 유닛(-W-)은 존재할 경우, 스트렛쳐 유닛을 스페이서 유닛(스페이서 유닛이 존재하는 경우)에 결합시키고, 스트렛쳐 유닛을 약물 모이어티에 결합시키며(스페이서 유닛이 없는 경우), 항체 유닛을 약물 유닛에 결합시킨다(스트렛쳐 유닛 및 스페이서 유닛이 없는 경우).
Ww-는 예컨대, 모노펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 노나펩티드, 데카펩티드, 운데카펩티드 또는 도데카펩티드 유닛일 수 있다. 각각의 -W- 유닛은 독립적으로 아래 꺾쇠 괄호 내에 표시된 화학식을 가지며, w는 0 내지 12의 정수이다:
Figure 112012072574899-pct00018
, 또는
Figure 112012072574899-pct00019
R19는 수소, 메틸, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, 벤질, p 히드록시벤질, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-피리딜메틸-, 3-피리딜메틸-, 4-피리딜메틸-, 페닐, 사이클로헥실,
Figure 112012072574899-pct00020
이다.
일부 구체예에서, 아미노산 유닛은 암 또는 종양관련 단백질 분해 효소를 포함하는 하나 이상의 효소에 의해 효소적으로 절단되어, 약물 유닛(-D)을 방출시키며, 하나의 구체예에서 생체 내에서 방출시 양성자되어 약물(D)을 제공한다.
특정 구체예에서, 아미노산 유닛은 천연 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 아미노산 유닛은 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 예시적인 Ww 유닛은 화학식 (VII) 내지 (IX)로 표시된다:
Figure 112012072574899-pct00021
Figure 112012072574899-pct00022
예시적인 아미노산 유닛은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 화학식 VII의 단위를 포함하며: R20은 벤질이고 R21은 -(CH2)4NH2이며; R20은 이소프로필이고 R21은 -(CH2)4NH2이며; 또는 R20은 이소프로필이고 R21은 -(CH2)3NHCONH2이다. 다른 예시적인 아미노산 유닛은 화학식 VIII의 단위이며, R20은 벤질이고, R21은 벤질이며, R22는 -(CH2)4NH2이다.
유용한 -Ww- 유닛은 특정 효소, 예를 들어 종양-관련 단백질 분해 효소에 의한 효소적 절단에 대해 그 선택성이 설계되고 최적화될 수 있다. 하나의 구체예에서, -Ww - 단위는 카텝신 B, C 및 D 또는 플라스민 단백질 분해 효소에 의해 촉매된 절단이 있다.
하나의 구체예에서, -Ww-는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드이다. R19, R20, R21, R22 또는 R23이 수소 이외일 때, R19, R20, R21, R22 또는 R23이 부착된 탄소 원자는 키랄이다.
R19, R20, R21, R22 또는 R23이 부착된 각 탄소 원자는 독립적으로 (S) 또는 (R) 입체배치이다.
아미노산 유닛의 한가지 구체예에서, 아미노산 유닛은 발린-시트룰린(vc 또는 val-cit)이다. 또 다른 구체예에서, 아미노산 유닛은 페닐알라닌-리신(즉, fk)이다. 아미노산 유닛의 또 다른 구체예에서, 아미노산 유닛은 N-메틸발린-시트룰린이다. 또 다른 구체예에서, 아미노산 유닛은 5-아미노발레르산, 호모페닐알라닌 리신, 테트라이소퀴놀린카르복실레이트 리신, 시클로헥실알라닌 리신, 이소네페코트산(isonepecotic acid) 리신, 베타-알라닌 리신, 글리신 세린 발린 글루타민 및 이소네페코트산이다.
VIII.) 스페이서 유닛
스페이서 유닛(-Y-)은 존재할 경우, 아미노산 유닛을 약물 유닛에 결합시킨다(아미노산 유닛이 존재할 경우). 대안으로 스페이서 유닛은 스트렛쳐 유닛을 약물 유닛에 결합시킨다(아미노산 유닛이 없는 경우). 스페이서 유닛은 또한 약물 유닛을 항체 유닛에 결합시킨다(아미노산 유닛과 스트렛쳐 유닛이 없는 경우).
스페이서 유닛에는 일반적으로 2가지 종류가 있는데: 비자기 희생적(non self-immolative) 또는 자기 희생적이 그것이다. 비자기 희생적 스페이서 유닛은, 스페이서 유닛의 전부 또는 일부가 항체-약물 컨쥬게이트로부터의 아미노산 유닛의 분해, 특히 효소적 분해 후에도 약물 모이어티에 결합된 채로 남아있는 것이다. 비자기 희생적 스페이서 유닛의 예로는 (글리신-글리신) 스페이서 유닛 및 글리신 스페이서 유닛(두 가지 모두 반응식 1에 도시함)(후술됨)을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 글리신-글리신 스페이서 유닛 또는 글리신 스페이서 유닛을 함유하는 컨쥬게이트가 효소(예컨대, 종양-세포 관련-단백질 분해 효소, 암-세포-관련 단백질 분해 효소 또는 림프구-관련 단백질 분해 효소)를 통하여 효소적으로 분해되는 경우, 글리신-글리신-약물 모이어티 또는 글리신-약물 모이어티가 L-Aa-Ww-로부터 절단된다. 한 가지 구체예에서, 표적 세포 내에서 독립적인 가수분해 반응이 일어나서, 글리신-약물 모이어티 결합을 절단하고 약물을 방출시킨다.
반응식 1
Figure 112012072574899-pct00023
일부 구체예에서, 비자기 희생적 스페이서 유닛(-Y-)은 -Gly-이다. 몇 가지 구체예에서, 비자기 희생적 스페이서 유닛 (-Y-)은 -Gly-Gly-이다.
하나의 구체예에서, 한가지 구체예에서, 스페이서 유닛이 없는 (y=0) 약물-링커 컨쥬게이트, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 용매화합물이 제공된다.
대안으로, 자기 희생적 스페이서 유닛을 함유하는 컨쥬게이트는 -D를 방출할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "자기희생적 스페이서"는 안정한 2 스페이스의 화학적 모이어티와 함께 3부(tripartite) 분자에 공유적으로 연결할 수 있는 2작용성 화학적 모이어티를 말한다. 이는 제1 모이어티에 대한 결합이 절단된다면 제2 화학적 모이어티로부터 자발적으로 분리될 것이다.
일부 구체예에서, -Yy-는 p-아미노벤질 알코올(PAB) 유닛(반응식 2 및 3 참조)으로서, 여기서 페닐렌 부분은 Qm으로 치환되어 있고, Q는 -C1-C8 알킬, -C1-C8 알케닐, -C1-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C1-C8 알케닐), -O-(C1-C8 알키닐), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이며; m은 0 내지 4의 정수이다. 알킬, 알케닐 및 알키닐기는 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 선택적으로 치환될 수 있다.
일부 구체예에서, -Y-는 PAB기의 아미노 질소 원자를 통하여 -Ww -에 결합되고, 카르보네이트, 카바메이트 또는 에테르기를 통하여 -D에 직접 연결된 PAB 기이다. 특정 이론이나 메카니즘에 구애됨이 없이, 반응식 2에는 문헌[Toki et al., 2002, J. Org. Chem. 67:1866-1872]에 설명된 바와 같이 카바메이트 또는 카르보네이트기를 통하여 -D에 직접 결합된 PAB기의 약물 방출의 가능한 메카니즘이 도시되어 있다.
반응식 2
Figure 112012072574899-pct00024
반응식 2에서, Q는 -C1-C8 알킬, -C1-C8 알케닐, -C1-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C1-C8 알케닐), -O-(C1-C8 알키닐), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이며; m은 0~4 범위의 정수이고; p는 1 내지 약 12의 범위에 있다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 기는, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 선택적으로 치환될 수 있다.
특정 이론이나 메카니즘에 구속되지 않고, 반응식 3에는 에테르 또는 아민 결합을 경유하여 -D에 직접 부착된 PAB기의 가능한 약물 방출 메카니즘이 도시되어 있는데, D는 약물 유닛의 부분인 산소 또는 질소 기를 포함하는 것이다.
반응식 3
Figure 112012072574899-pct00025
반응식 3에서, Q는 -C1-C8 알킬, -C1-C8 알케닐, -C1-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C1-C8 알케닐), -O-(C1-C8 알키닐), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이며; m은 0~4 범위의 정수이고; p는 1 내지 약 12의 범위에 있다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 기는, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 선택적으로 치환될 수 있다.
자기 희생적 스페이서의 다른 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체(Hay, et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) 및 오르토 또는 파라-아미노벤질아세탈처럼, PAB기와 전자적으로 유사한 방향족 화합물을 포함한다. 스페이서는 치환 및 비치환 4-아미노부티르산 아미드(Rodrigues, et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), 적절히 치환된 바이시클로[2.2.1] 및 바이시클로[2.2.2] 환 시스템(Storm, et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드(Amsberry, et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867)와 같이 아미드 결합 가수분해에 의해 고리화를 수행하는데 이용될 수 있다. 글리신의 α-위치에서 치환된 아민 함유 약물의 제거(Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447) 역시도 자기 희생적 스페이서의 예가 된다.
하나의 구체예에서, 스페이서 유닛은 반응식 4에 도시된 바와 같은 분지된 비스(히드록시메틸)-스티렌(BHMS) 유닛으로서, 이것은 다수의 약물을 포함하고 방출하는데 이용될 수 있다
반응식 4
Figure 112012072574899-pct00026
반응식 4에서, Q는 -C1-C8 알킬, -C1-C8 알케닐, -C1-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C1-C8 알케닐), -O-(C1-C8 알키닐), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이며; m은 0~4 범위의 정수이고; n은 0또는 1이고; p는 1 내지 약 12의 범위에 있다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 기는, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 선택적으로 치환될 수 있다.
일부 구체예에서, -D 모이어티는 동일하다. 또 다른 구체예에서, -D 부분은 서로 다르다.
하나의 양태에서, 스페이서 유닛(-Yy-)은 화학식 X 내지 XII로 표시된다:
Figure 112012072574899-pct00027
X
상기 식에서 Q는 -C1-C8 알킬, -C1-C8 알케닐, -C1-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C1-C8 알케닐), -O-(C1-C8 알키닐), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이며; m은 0~4 범위의 정수다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 기는, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 선택적으로 치환될 수 있다.
Figure 112012072574899-pct00028
XI
및
Figure 112012072574899-pct00029
XII.
항체-약물 컨쥬게이트 화합물을 함유하는 화학식 I 및 II의 구체예는 다음을 포함할 수 있다:
Figure 112012072574899-pct00030
w 및 y는 각각 0, 1 또는 2이고,
Figure 112012072574899-pct00031
식 중 w 및 y는 각각 0이다,
Figure 112012072574899-pct00032
Figure 112012072574899-pct00033
, 및
Figure 112012072574899-pct00034
IX.) 약물 유닛
약물 모이어티ㅎ(D)는 세포독성제, 세포증식억제제 또는 면역조절제(예컨대 면역억제제) 또는 약물일 수 있다. D는 스페이서 유닛, 아미노산 유닛, 스트렛쳐 유닛 또는 항체 유닛과 결합을 형성할 수 있는 원자를 갖는 약물 유닛(모이어티)이다. 몇 가지 구체에에서, 약물 유닛 D는 스페이서 유닛과 결합을 형성할 수 있는 질소 원자이다. 본 발명에서 "약물 유닛"과 "약물 모이어티"이라는 용어는 동의어이며 상호 호환적으로 사용된다.
세포독성제 또는 면역조절제의 유용한 부류의 예로는 항튜뷸린제, DNA 마이너 그루브 바인더, DNA 복제 억제제 및 알킬화제를 들 수 있다.
일부 구체예에서, 약물은 아우리스타틴 E와 같은 아우리스타틴(기술 분야에서는 돌라스타틴-10의 유도체라고도 알려져 있다) 또는 그의 유도체이다. 아우리스타틴은 예컨대 아우리스타틴 E와 케토산 사이에 형성된 에스테르일 수 있다. 예를 들어, 아우리스타틴 E을 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응시켜서 각각 AEB와 AEBV를 생산한다. 다른 통상적인 아우리스타틴에는 AFP, MMAF, 및 MMAE가 포함된다. 예시적인 아우리스타틴의 합성방법과 구조가 미국 특허출원 공개 제2003-0083263호, 제2005-0238649호 및 제2005-0009751호; 국제특허공개 WO 제04/010957호, 국제특허공개 WO 제02/088172호, 및 미국특허 제6,323,315호; 제6,239,104호; 제6,034,065호; 제5,780,588호; 제5,665,860호; 제5,663,149호; 제5,635,483호; 제5,599,902호; 제5,554,725호; 제5,530,097호; 제5,521,284호; 제5,504,191호; 제5,410,024호; 제5,138,036호; 제5,076,973호; 제4,986,988호; 제4,978,744호; 제4,879,278호; 제4,816,444호; 및 제4,486,414호에 설명되어 있으며 이들 문헌은 본 명세서에서 전체가 모든 목적을 위하여 참조된다.
아우리스타틴은 미세관(microtubule) 동력학과 핵 및 세포 분할을 간섭하며 항암 활성을 갖는 것으로 나타나다. MMAF는 튜불린에 결합하여 161P2F10B -발현 세포에 대하여 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 나타낸다. 아우리스타틴 또는 결과적인 항체-약물 컨쥬게이트가 목적하는 세포주에 대해 세포증식 억제효과 또는 세포독성 효과를 갖는지를 측정하는데 사용가능한 분석법이 당업계에 여러가지 알려져 있다.
화합물이 튜불린에 결합하는지를 알아내는 방법이 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Muller, et al., Anal. Chem 2006, 78, 4390-4397; Hamel, et al., Molecular Pharmacology, 1995 47: 965-976; 및 Hamel, et al., The Journal of Biological Chemistry, 1990 265:28, 17141-17149]을 참조한다. 본 발명의 목적을 위해, 튜불린에 대한 화합물의 상대적 친화성을 측정할 수 있다. 본 발명의 몇 가지 바람직한 아우리스타틴은 튜불린에 결합하는데 그 결합 친화도는 MMAAE의 튜불린에 대한 결합 친화도의 10분의 1(즉 약한 친화도) 내지, MMAE의 튜불린에 대한 친화도의 10배, 20배 또는 심지어 100배에 달하는 친화도(높은 친화도)에 이르기까지 다양하다.
일부 구체예에서, -D는 화학식 DE 또는 DF:의 아우리스타틴:
Figure 112012072574899-pct00035
DE
Figure 112012072574899-pct00036
DF
또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화합물이다;
각각의 위치에서 독립적으로:
물결선은 결합을 나타내고;
R2는 -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, 또는 -C2-C20 알키닐이며;
R3은 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, -C2-C20 알키닐, -카르보사이클, -C1-C20 알킬렌 (카르보사이클), -C2-C20 알케닐렌(카르보사이클), -C2-C20 알키닐렌(카르보사이클), -아릴, -C1-C20 알킬렌(아릴), -C2-C20 알케닐렌(아릴), -C2-C20 알키닐렌(아릴), 헤테로사이클, -C1-C20 알킬렌(헤테로사이클), -C2-C20 알케닐렌(헤테로사이클), 또는 -C2-C20 알키닐렌(헤테로사이클)이고;
R4는 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, -C2-C20 알키닐, 카르보사이클, -C1-C20 알킬렌 (카르보사이클), -C2-C20 알케닐렌(카르보사이클), -C2-C20 알키닐렌(카르보사이클), 아릴, -C1-C20 알킬렌(아릴), -C2-C20 알케닐렌(아릴), -C2-C20 알키닐렌(아릴), -헤테로사이클, -C1-C20 알킬렌(헤테로사이클), -C2-C20 알케닐렌(헤테로사이클), 또는 -C2-C20 알키닐렌(헤테로사이클)이며;
R5는 -H 또는 -C1-C8 알킬이고;
또는 R4 및 R5는 결합하여 카르보고리 환을 형성하고, 화학식 (CRaRb)s 를 가지며, Ra 및 Rb 독립적으로 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, -C2-C20 알키닐, 또는 -카르보사이클이고 s는 2, 3, 4, 5 또는 6이며,
R6 은 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, 또는 -C2-C20 알키닐이고;
R7은 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, -C2-C20 알키닐, 카르보사이클, -C1-C20 알킬렌 (카르보사이클), -C2-C20 알케닐렌(카르보사이클), -C2-C20 알키닐렌(카르보사이클), -아릴, -C1-C20 알킬렌(아릴), -C2-C20 알케닐렌(아릴), -C2-C20 알키닐렌(아릴), 헤테로사이클, -C1-C20 알킬렌(헤테로사이클), -C2-C20 알케닐렌(헤테로사이클), 또는 -C2-C20 알키닐렌(헤테로사이클)이며;
각각의 R8은 독립적으로 -H, -OH, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, -C2-C20 알키닐, -O-(C1-C20 알킬), -O-(C2-C20 알케닐), -O-(C1-C20 알키닐), 또는 -카르보사이클이며;
R9는 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, 또는 -C2-C20 알키닐이고;
R24는 -아릴, -헤테로사이클, 또는 -카르보사이클이며;
R25는 -H, C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, -C2-C20 알키닐, -카르보사이클, -O-(C1-C20 알킬), -O-(C2-C20 알케닐), -O-(C2-C20 알키닐), 또는 OR18이고R18은 -H, 또는 히드로실 보호기, 또는 직접 결합이며 OR18은 =O이고;
R26은 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, 또는 -C2-C20 알키닐, -아릴, -헤테로사이클, 또는 -카르보사이클이며;
R10은 -아릴 또는 -헤테로사이클이고;
Z는 -O, -S, -NH, 또는 -NR12이며 R12는 -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, 또는 -C2-C20 알키닐이고;
R11은 -H, -C1-C20 알킬, --C2-C20 알케닐, -C2-C20 알키닐, -아릴, -헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2이며;
m 은 1~1000 범위의 정수이고;
R13 은 -C2-C20 알킬렌, -C2-C20 알케닐렌, 또는 -C2-C20 알키닐렌이며;
R14 는 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, 또는 -C2-C20 알키닐이고;
각 경우의 R15는 독립적으로 -H, -COOH, (CH2)n-N(R16)2, (CH2)n-SO3H, (CH2)n-SO3-C1-C20 알킬, (CH2)n-SO3-C2-C20 알케닐, 또는 (CH2)n-SO3-C2-C20 알키닐이고;
각 경우의 R16은 독립적으로 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐,
-C2-C20 알키닐 또는 (CH2)n-COOH이며;
n 은 0 내지 6 범위의 정수이고;
상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 아릴, 카르보사이클, 및 헤테로사이클 라디칼은, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든, 선택적으로 치환된다.
화학식 DE의 아우리스타틴은 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 아릴, 카르보사이클, 및 헤테로사이클 라디칼이 비치환된 것을 포함한다.
화학식 DE의 아우리스타틴은 R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9의 기는 비치환되고, R19, R20 및 R21의 기는 본 명세서에 설명된 바와 같이 선택적으로 치환된 것을 포함한다.
DE 의 아우리스타틴 및 그것의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화합물은 다음을 포함한다:
R2은 C1-C8 알킬이고;
R3, R4 및 R7은 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, -C2-C20 알키닐, 1고리 C3-C6 카르보사이클, -C1-C20 알킬렌(1고리 C3-C6 카르보사이클), -C2-C20 알케닐렌(1고리 C3-C6 카르보사이클), -C2-C20 알키닐렌(1고리 C3-C6 카르보사이클), C6-C10 아릴, -C1-C20 알킬렌(C6-C10 아릴), -C2-C20 알케닐렌(C6-C10 아릴), -C2-C20 알키닐렌(C6-C10 아릴), 헤테로사이클, -C1-C20 알킬렌(헤테로사이클), -C2-C20 알케닐렌(헤테로사이클), 또는 -C2-C20 알키닐렌(헤테로사이클)로부터 독립적으로 선택되며; 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 카르보사이클, 아릴 및 헤테로사이클 라디칼은 선택적으로 치환되고;
R5는 -H이며;
R6은 -C1-C8 알킬이고;
각각의 R8은 -OH, -O-(C1-C20 알킬), -O-(C2-C20 알케닐), 또는 -O-(C2-C20 알키닐)로부터 독립적으로 선택되며, 상기 알킬, 알케닐, 및 알키닐 라디칼이 선택적으로 치환되고;
R9는 -H 또는 -C1-C8 알킬이며;
R24는 선택적으로 치환된 -페닐이고;
R25는 -OR18이며; R18은 H, 히드록실 보호기, 또는 직접 결합이며 OR18은 =O을 나타내며;
R26은 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, -C2-C20 알키닐, 또는 -카르보사이클로부터 선택되고; 상기 알킬, 알케닐, 알키닐 및 카르보사이클 라디칼은 선택적으로 치환된다.
화학식 DE의 아우리스타틴 및 그것의 약제학적으로 허용가능한 염은 다음을 포함한다:
R2는 메틸이고;
R3은 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, 또는 C2-C8 알키닐이며, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐 라디칼은 선택적으로 치환되며;
R4는 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 1고리 C3-C6 카르보사이클, -C6-C10 아릴, -C1-C8 알킬렌(C6-C10 아릴), -C2-C8 알케닐렌(C6-C10 아릴), -C2-C8 알키닐렌(C6-C10 아릴), -C1-C8 알킬렌(1고리 C3-C6 카르보사이클), -C2-C8 알케닐렌(1고리 C3-C6 카르보사이클), -C2-C8 알키닐렌(1고리 C3-C6 카르보사이클)이며; 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 아릴 및 카르보사이클 라디칼은, 단독이든 또는 다른 기의 부분이든 선택적으로 치환되고;
R5는 -H이고;
R6은 메틸이며;
R7은 -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐 또는 -C2-C8 알키닐이고;
각각의 R8은 메톡시이고;
R9는 -H 또는 -C1-C8 알킬이며;
R24는 -페닐이고;
R25는 -OR18이며; R18은 H, 히드록실 보호기, 또는 직접 결합이며 OR18은 =O을 나타내고;
R26은 메틸이다.
화학식 DE 의 아우리스타틴 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화합물 형태는 다음을 포함한다:
R2는 메틸이고; R3은 -H 또는 -C1-C3 알킬이며; R4는 -C1-C5 알킬이고; R5는 -H이며; R6은 메틸이고; R7은 이소프로필 또는 sec-부틸이고; R8은 메톡시이고; R9는 -H 또는 -C1-C8 알킬이고; R24는 페닐이며; R25는 -OR18이며; R18은 -H, 히드록실 보호기, 또는 직접 결합이며, OR18은 =O를 나타내고; R26은 메틸이다.
화학식 DE의 아우리스타틴 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염 형태는 다음을 포함한다:
R2는 메틸 또는 C1-C3 알킬이고,
R3은 -H 또는 -C1-C3 알킬이며;
R4는 -C1-C5 알킬이고;
R5는 H이며;
R6은 C1-C3 알킬이고;
R7은 -C1-C5 알킬이며;
R8은 -C1-C3 알콕시이고;
R9는 -H or -C1-C8 알킬이며;
R24는 페닐이고;
R25는 -OR18이며; R18은 -H, 히드록실 보호기, 또는 직접 결합이고, OR18 은 =O을 나타내며;
R26은 -C1-C3 알킬이다.
화학식 DF의 아우리스타틴 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염은 다음을 포함한다
R2 는 메틸;
R3, R4, 및 R7은 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, -C2-C20 알키닐, 1고리 C3-C6 카르보사이클, -C1-C20 알킬렌(1고리 C3-C6 카르보사이클), -C2-C20 알케닐렌(1고리 C3-C6 카르보사이클), -C2-C20 알키닐렌(1고리 C3-C6 카르보사이클), -C6-C10 아릴, -C1-C20 알킬렌(C6-C10 아릴), -C2-C20 알케닐렌(C6-C10 아릴), -C2-C20 알키닐렌(C6-C10 아릴), 헤테로사이클, -C1-C20 알킬렌(헤테로사이클), -C2-C20 알케닐렌(헤테로사이클), 또는 -C2-C20 알키닐렌(헤테로사이클)로부터 독립적으로 선택되며; 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 카르보사이클, 아릴 및 헤테로사이클 라디칼은 단독이든 또는 다른 기의 부분이든 선택적으로 치환되며;
R5는 -H이고;
R6은 메틸이며;
각각의 R8은 메톡시이고;
R9는 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, 또는 -C2-C20 알키닐이며; 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐 라디칼은 선택적으로 치환되며;
R10은 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로사이클이며;
Z는 -O-, -S-, -NH-, 또는 -NR12이며, R12는 -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, 또는 -C2-C20 알키닐이고, 이것의 각각은 선택적으로 치환되며;
R11은 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, -C2-C20 알키닐, -아릴, -헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2이며, 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 및 헤테로사이클 라디칼은 선택적으로 치환되고;
m은 1-1000범위의 정수이며 또는 m = 0이고;
R13은 -C2-C20 알킬렌, -C2-C20 알케닐렌, 또는 -C2-C20 알키닐렌이며, 이것의 각각은 선택적으로 치환되고;
R14는 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, 또는 -C2-C20 알키닐이며, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐 라디칼은 선택적으로 치환되고;
R15의 각 경우는 독립적으로 -H, -COOH, (CH2)n-N(R16)2, (CH2)n-SO3H, (CH2)n-SO3-C1-C20 알킬, (CH2)n-SO3-C2-C20 알케닐, 또는 (CH2)n-SO3-C2-C20 알키닐이며, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐 라디칼은 선택적으로 치환되고;
R16의 각 경우는 독립적으로 -H, -C1-C20 알킬, -C2-C20 알케닐, -C2-C20 알키닐 또는 (CH2)n-COOH이며, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐 라디칼은 선택적으로 치환되고;
n 은 0 내지 6 범위의 정수이다.
이것의 특정 구체예에서, R10 은 선택적으로 치환된 페닐이다.
화학식 DF의 아우리스타틴은 R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9 기가 비치환되고, R10 및 R11의 기는 본 명세서에서 설명하는 바와 같은 것을 포함한다.
화학식 DF의 아우리스타틴은 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 아릴, 카르보사이클, 및 헤테로사이클 라디칼이 비치환된 것을 포함한다.
화학식 DF 의 아우리스타틴 및 그것의 약제학적으로 허용가능한 염은 다음을 포함하며:
R2는 -C1-C3 알킬이고; R3은 -H 또는 -C1-C3 알킬이며; R4는 -C1-C5 알킬이며; R5는 -H이고; R6은 -C1-C3 알킬; R7은 -C1-C5 알킬이고; R8은 -C1-C3 알콕시; R9는 -H 또는 -C1-C8 알킬이고; R10은 선택적으로 치환된 페닐이고; Z는-O-, -S-, 또는 -NH-이며; R11은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
DF의 아우리스타틴 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염은 다음을 포함한다:
R2는 메틸이며; R3은 -H 또는 -C1-C3 알킬이고; R4는 -C1-C5 알킬; R5는 -H이고; R6은 메틸; R7은 이소프로필 또는 sec-부틸이고; R8은 메톡시; R9는 -H 또는 -C1-C8 알킬이고; R10은 선택적으로 치환된 페닐이고; Z는 -O-, -S-, 또는 -NH-이며; R11은 본명세서에 정의된 바와 같다.
화학식 DF의 아우리스타틴 및 그것의 약제학적으로 허용가능한 염은 다음을 포함한다:
R2는 메틸이고; R3은 -H 또는 -C1-C3 알킬이며; R4는 -C1-C5 알킬이고; R5는 -H이며; R6은 메틸이고; R7은 이소프로필 또는 sec-부틸이며; R8은 메톡시이고; R9는 -H 또는 C1-C8 알킬이며; R10은 페닐이고; Z는 -O- 또는 -NH-이며 R11은 본 명세서에서 정의된 바와 같고, 바람직하게는 수소이다.
화학식 DF의 아우리스타틴 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염은 다음을 포함한다:
R2는 -C1-C3 알킬이고; R3은 -H or -C1-C3 알킬이며; R4는 -C1-C5 알킬이고; R5는 -H이며; R6은 -C1-C3 알킬이고; R7은 -C1-C5 알킬이며; R8은 -C1-C3 알콕시이고; R9는 -H 또는 -C1-C8 알킬이고; R10은 페닐이며; Z는 -O- 또는 -NH-이고 R11은 본 명세서에 정의된 바와 같고, 바람직하게는 수소이다.
화학식 DE 또는 DF의 아우리스타틴은 R3, R4 및 R7이 독립적으로 이소프로필 또는 sec-부틸이며R5는 -H인 것을 포함한다. 예시적인 구체예에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필이며, R5는 H이고, R7은 sec-부틸이다. 치환체의 나머지는 본 명세서에 정의되는 바와 같다.
화학식 DE 또는 DF의 아우리스타틴은 R2 및 R6이 각각 메틸이고, R9 는 H인 것을 포함한다. 치환체의 나머지는 본 명세서에 정의되는 바와 같다.
화학식 DE 또는 DF의 아우리스타틴은 각 경우의 R8이 OCH3인 것을 포함한다. 치환체의 나머지는 본 명세서에 정의되는 바와 같다.
화학식 DE 또는 DF의 아우리스타틴은 R3 및 R4가 각각 이소프로필이고, R2 및 R6이 각각 메틸이며, R5는 H이고, R7은 sec-부틸이며, 각 경우의 R8은 -OCH3이고, R9는 H인 것을 포함한다. 치환체의 나머지는 본 명세서에 정의되는 바와 같다.
화학식 DF의 아우리스타틴은 Z는 -O- 또는 -NH-인 것을 포함한다. 치환체의 나머지는 본 명세서에 정의되는 바와 같다.
화학식 DF의 아우리스타틴은 R10이 아릴인 것을 포함한다. 치환체의 나머지는 본 명세서에 정의되는 바와 같다.
화학식 DF의 아우리스타틴은 R10이 -페닐인 것을 포함한다. 치환체의 나머지는 본 명세서에 정의되는 바와 같다.
화학식 DF의 아우리스타틴은 Z는 -O-이고, R11은 H, 메틸 또는 t-부틸인 것을 포함한다. 치환체의 나머지는 본 명세서에 정의되는 바와 같다.
화학식 DF의 아우리스타틴은 Z는 -NH-이고, R11은 -(R13O)m-CH(R15)2이며, R15는 -(CH2)n-N(R16)2이고 R16은 -C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH인 것을 포함한다. 치환체의 나머지는 본 명세서에 정의되는 바와 같다.
화학식 DF의 아우리스타틴은 Z는 -NH-, R11은 (R13O)m-CH(R15)2이고, R15는 -(CH2)n-SO3H인 것을 포함한다. 치환체의 나머자는 본 명세서에 정의되는 바와 같다.
바람직한 구체예에서, D가 화학식 DE의 아우리스타틴일 때, w는 1 내지 12, 바람직하게는 2 내지 12 범위의 정수이고, y는 1 또는 2이고, 바람직하게는 1이다.
일부 구체예에서, D는 화학식 DF,의 아우리스타틴이며, a는 1이고 w 및 y는 0이다.
예시적인 약물 유닛(-D)은 다음 구조를 가지는 약물 유닛 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다:
Figure 112012072574899-pct00037
Figure 112012072574899-pct00038
Figure 112012072574899-pct00039
하나의 양태에서, 이에 제한되는 것은 아니지만 트리에틸렌 글리콜 에스테르(TEG)와 같은 친수성기는 R11에서 약물 유닛에 부착될 수 있다. 특정 이론에 구속되지 않고, 친수성기는 약물 유닛의 내면화(internalization) 및 비응집화에 기여한다.
일부 구체예에서, 약물 유닛은 TZT-1027이 아니다. 몇 가지 구체예에서, 약물 유닛은 아우리스타틴 E, 돌라스타틴 10, 또는 아우리스타틴 PE가 아니다.
바람직한 구체예에서, 항체-약물 컨쥬게이트 화합물은 다음 구조를 가지며, "L" 또는 "mAb-s-"는 본 명세서에서 제시하는 161P2F10B MAb 지정된 H16-7.8을 나타낸다.
Figure 112012072574899-pct00040
일부 구체예에서, 약물 유닛은 칼리케아미신, 캄토테신, 메이탄시노이드 또는 안트라사이클린이다. 몇 가지 구체예에서 약물은 탁산, 호변이성질체 억제제, 빈카 알칼로이드 등이다.
일부 통상적인 구체예에서, 적절한 세포독성제의 예로는 DNA 마이너 그루브 바인더(예컨대, 엔디인 및 렉시트롭신, CBI 화합물; 미국특허 6,130,237 참조), 듀오카르마이신, 탁산(예컨대, 파크리탁셀 및 도세탁셀)), 퓨로마이신 및 빈카 알칼로이드를 포함한다. 기타 세포독성제의 예로는, CC-1065, SN-38, 토포테칸, 모폴리노-독소루비신, 리족신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 에치노마이신, 콤브레스타틴, 네트롭신, 에포틸론 A 및 B, 에스트라무스틴, 크립토피진, 세마도틴, 메이탄시노이드, 디스코데르몰리드, 엘레우테로빈 및 미토잔트론을 포함한다.
일부 구체예에서, 약물은 항-튜불린제이다. 항-튜불린제의 예로는 아우리스타틴, 탁산(예컨대, Taxol®(파클리탁셀), Taxotere®(도세탁셀)), T67 (Tularik) 및 빈카 알킬로이드(예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈)를 들 수 있다. 기타 항튜불린제의 예로는 바카틴 유도체, 탁산 유사체(예컨대, 에포틸론 A 및 B), 노코다졸, 콜히친 및 콜시미드, 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 메이탄시노이드, 콤브레스타틴, 디스코데몰리드 및 엘로이트로빈을 포함한다.
특정 구체예에서, 세포독성제는 메이탄시노이드, 기타 그룹의 항-튜불린제이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 메이탄시노이드는 메이탄신 또는 DM-1 (ImmunoGen, Inc.; 또한 문헌[Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131]을 참조)이다.
특정 구체예에서, 세포독성제 또는 세포증식억제제는 돌라스타틴이다. 특정 구체예에서, 세포독성제 또는 세포증식억제제는 아우리스타틴 부류의 것이다. 따라서, 특정 구체예에서, 세포독성제 또는 세포증식억제제는 MMAE(화학식 XI)이다. 또 다른 특정 구체예에서, 세포독성제 또는 세포증식억제제는 AFP(화학식 XVI)이다.
Figure 112012072574899-pct00041
특정 구체예에서, 세포독성제 또는 세포증식억제제는 화학식 XII 내지 XXI의 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염이다:
Figure 112012072574899-pct00042
Figure 112012072574899-pct00043
Figure 112012072574899-pct00044
p는1 내지 12이다. 더 바람직한 구체예에서, 항체-약물 컨쥬게이트 화합물은 다음의 구조를 가지며, "mAb-s-"는 본 명세서에 제시된 161P2F10B MAb 지정된 H16-7.8을 표시하고, p는 4이다:
Figure 112012072574899-pct00045
특정 구체예에서, 세포독성제 또는 세포증식억제제는MMAF(화학식 XVIV)이다.
X.) 약물 부하
약물 부하는 p로 나타내어지는데, 이는 분자 중 항체 당 약물 모이어티의 평균 개수이다. 약물 부하는 항체 당 1 내지 20 약물 모이어티 (D) 범위일 수 있다. 본 발명의 ADC는 1 내지 20의 약물 모이어티 범위와 컨쥬게이트된 항체의 컬렉션을 포함한다. 컨쥬게이션 반응으로부터의 ADC 제조에 있어서, 항체 당 약물 모이어티의 평균 개수는 질량 분광 및 ELISA 분석과 같은 통상적인 수단에 의해 특성화될 수 있다. p 의 관점에서 ADC의 정량적 분배 또한 결정될 수 있다. 몇몇 예에서, 다른 약물이 부하된 ADC로부터 p가 일정 값인 균일성 ADC의 분리, 정제 및 특성화는 전기 영동과 같은 수단에 의하여 달성될 수 있다.
몇몇 항체-약물 컨쥬게이트에 대하여, p는 항체 위의 부착 부위의 개수에 의해 제한될 수 있다. 예컨대, 상기 예시적 구체예들에서와 같이, 그 부착이 시스테인 티올인 경우, 항체는 단 하나 또는 수개의 시스테인 티올 그룹을 가질 수 있으며, 또는 링커가 부착될 수 있는 충분히 반응성인 단 하나 또는 수개의 티올 그룹을 가질 수도 있다. 특정 구체예에서, 높은 약물 부하, 즉 p >5는 뭉침, 비 용해성, 독성 또는 특정 항체-약물 컨쥬게이트의 세포 내 투과성의 상실을 야기할 수 있다. 특정 구체예에서 본 발명의 ADC에 대한 약물 부하는 1내지 약 12, 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 약 3 내지 약 5; 약 3 내지 약 4; 약 3.1 내지 약 3.9; 약 3.2 내지 약 3.8;약 3.2 내지 약 3.7;약 3.2 내지 약 3.6;약 3.3 내지 약 3.8; 또는 약 3.3 내지 약 3.7의 범위이다. 실제로, 특정 ADC에 대하여 항체 당 적정 약물 모이어티 비율은 8 미만일 수 있다고, 그리고 약 2 내지 약 5일 수 있다고 나타났다. 미국 제2005-0238649호 A1(전체가 참고로서 본 명세서에 포함됨)을 참조한다.
특정 구체예에서, 컨쥬게이션 반응 동안에 이론적 최대치보다 적은 약물 모이어티가 항체에 컨쥬게이트되었다. 항체는 아래에서 논의할 바와 같이 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는, 예컨대 리신 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로 항체들은 약물 모이어티와 결합할 수 있는 다수의 자유롭고 반응성인 시스테인 티올 그룹을 포함하지 않는다; 실제로 항체 내 대부분의 시스테인 티올 잔기는 이황화 결합으로서 존재한다. 특정 구체예에서 반응성인 시스테인 티올 그룹을 발생시키기 위하여, 부분적 또는 전체적 환원 조건하에서 디티오트레이톨(dithiothreitol: DTT) 또는 트리카르보닐에틸포스핀(tricarbonylethyl포스핀: TCEP)과 같은 환원제로 항체를 환원시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 리신 또는 시스테인 같은 반응성인 친핵성 그룹을 노출시키기 위하여 항체를 변성 조건하에 둔다.
ADC의 부하(약물/항체 비율)는 여러 방식으로 조절될 수 있는데, 예컨대, (i) 항체와 비교하여 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 몰적 과잉을 제한, (ii) 컨쥬게이션 반응 시간 또는 온도를 제한, (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 환원 조건을 일부 또는 제한, (iv) 링커-약물 부착의 개수 및/또는 위치 조절을 위하여 시스테인 잔기의 개수 및 위치가 변형되도록 재조합 기술에 의해 항체의 아미노산 서열을 유전자 조작(예컨대 WO 제2006/034488호(전체가 참고로서 본 명세서에 포함됨) 및 본 명세서에 기술된 바에 따라 제조된 티오Mab 또는 티오Fab)에 의하여 조절될 수 있다.
두개 이상의 친핵성 그룹이 약물 모이어티 시약이 따라오는 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하는 경우에, 생성된 산물은 항체에 부착된 하나 이상의 약물 모이어티의 분포를 갖는 ADC 화합물들의 혼합물인 것으로 이해된다. 항체 당 평균 약물 수는 이중 ELISA 항체 분석법에 의하여 혼합물로부터 계산될 수 있는데, 이는 항체에 대하여 특이적이고 약물에 대하여 특이적이다. 개개의 ADC 분자는 질량 분석법에 의하여 혼합물 중에서 확인될 수 있으며, HPLC, 예컨대 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의하여 분리될 수 있다(예컨대, 문헌[Hamblett, K.J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate," Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27 31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004]을 참조). 특정 구체예에서 단일 부하 값을 갖는 균일한 ADC는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의하여 컨쥬게이션 혼합물로부터 분리될 수 있다.
XI.) ADC 세포독성 효능 결정 방법
약물 또는 항체-약물 컨쥬게이트가 세포에 세포증식억제 및/또는 세포독성 효능을 행사하는지 여부를 결정하는 방법은 알려져 있다. 일반적으로 항체 약물 컨쥬게이트의 세포독성 또는 세포증식억제 활성은 항체 약물 컨쥬게이트의 표적 단백질을 발현하는 포유류 세포를 세포 배양 배지에 노출시키고; 약 6시간으로부터 약 5일까지의 기간 동안 세포를 배양하고: 그리고 세포 생존도를 측정함에 의하여 측정될 수 있다. 생존능력(증식), 세포독성, 및 항체 약물 컨쥬게이트의 아포토시스 유발(카스파제 활성화)을 측정하기 위하여 세포-기반 시험관내 분석법이 사용될 수 있다.
항체 약물 컨쥬게이트가 세포증식억제 효과를 행사하는지 여부를 결정하기 위하여 티미딘 혼입 분석법이 사용될 수 있다. 예컨대, 타겟 항원을 96 웰 플레이트의 5,000 셀/웰의 밀도로 발현하는 암세포를 72시간의 기간 동안 배양하고 72시간의 기간 중 마지막 8시간 동안 0.5μCi의 3H-티미딘에 노출시킬 수 있다. 배양 세포 속으로의 3H-티미딘의 혼입은 항체 약물 컨쥬게이트의 존재 또는 부재에서 측정된다.
세포 독성을 결정하기 위하여, 네크로시스(necrosis) 또는 아포토시스(프로그램된 세포 사멸)를 측정할 수 있다. 네크로시스는 통상적으로 세포막의 증가된 투과성, 세포의 팽창 및 세포막의 파열을 수반한다. 아포토시스는 통상적으로 막 수포화, 세포질의 응축 및 내인성 엔도뉴클레아제의 활성화에 의해 특징지어진다. 암세포에 대한 이러한 영향 중 어느 하나의 확정은 항체 약물 컨쥬게이트가 암 치료에 유용하다는 것을 나타낸다.
세포 생존도는 중성 레드, 트리판 블루 또는 ALAMAR™ 블루(예컨대 Page, et al., 1993, Intl. J. Oncology 3:473-476 참조)와 같은 염료의 세포 내 섭취를 결정하여 측정될 수 있다. 그러한 분석에 있어서, 세포를 염료를 포함한 배지에서 배양하고, 세포를 세척하고, 그리고 염료의 세포적 섭취를 반영하는 남아있는 염료를 분광학적으로 측정한다. 단백질 결합 염료 설포호다민 B(SRB) 또한 세포독성을 측정하기 위하여 사용될 수 있다(Skehan, et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-12).
대안으로, 죽은 세포가 아닌 살아 있는 세포의 측정에 의한 포유류 세포의 생존 및 증식에 대한 정량적 색도 분석법에서, MTT와 같은 테트라졸리움 염이 사용된다(예컨대, 문헌[Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63] 참조).
아포토시스는 예컨대, DNA 단편화를 측정하여 정량화될 수 있다. DNA 단편화를 정량적으로 생체내 측정 하기 위한 상업적인 광도 측정법이 이용가능하다. TUNEL(단편화된 DNA 중의 표지된 뉴클레오티드의 혼입을 검출) 및 ELISA-기반 분석법을 포함하는 이와 같은 분석법의 예시가 문헌[Biochemica, 1999, No. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals)]에 설명되어 있다.
아포토시스는 또한 세포 중의 형태학상의 변화를 측정하여 결정되어 질 수 있다. 예를 들어, 네크로시스와 같이, 세포막의 완결성의 상실은 특정 염료(예컨대, 아크릴 오렌지 또는 에티디움 브로마이드와 같은 형광 염료)의 섭취를 측정하여 결정될 수 있다. 아폽토시스 세포 개수의 측정 방법은 듀크 및 코헨의 문헌[Current Protocols in Immunology(Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16)]에 기술되었다. 세포는 또한 DNA 염료(예로 아크리딘 오렌지, 에티디움 브로마이드 또는 프로피디움 요오드)로 표지될 수 있고, 크로마틴 응축 및 핵막 내부를 따라 생기는 가장자리화에 대해 관찰된다. 아포토시스를 결정하기 위하여 측정되는 다른 형태적 변화는 예컨대, 세포질 응축, 증가된 막 수포화 및 세포 수축을 포함한다.
아포토시스 세포의 존재는 배양물의 부착된 구획 및 "부유하는" 구획 둘 모두에서 측정될 수 있다. 예를 들어 두 구획은 상등액 제거, 부착된 세포의 트립신처리, 표본의 조합 및 뒤이은 원심 분리 세척 단계(예로 2000 rpm에서 10분) 및 아포토시스 탐지(예로, DNA 단편을 측정함에 의하여)에 의하여 수집될 수 있다(예컨대, 문헌[Piazza, et al., 1995, Cancer Research 55:3110-16]을 참조).
생체 내, 161P2F10B 치료용 조성물의 영향은 적당한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 예를 들어 이종 개체 암 모델을 사용할 수 있는데, 여기에서 암 이식체 또는 변통된 이종 이식 조직은 누드 또는 SCID 마우스와 같이 면역을 저하시킨 동물 안으로 도입된다(Klein, et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). 예를 들어 PCT 특허출원 WO 제98/16628호 및 미국특허 제6,107,540호는 일차 종양의 발전, 미소전이 및 후기 단계 질병의 특징인 조골 세포 전이 형성을 재현할 수 있는 능력이 있는 다양한 인간 전립선 암 이종 이식 모델을 기술한다. 종양 형성의 억제, 종양의 퇴행 또는 전이 등을 측정하는 분석법을 사용하여 효능을 예측할 수 있다.
아폽토시스 촉진을 평가하는 생체 내 분석법은 치료적 조성물을 평가하는데에 있어 유용하다. 일 구체예에서 치료용 조성물로 처리된 종양 포함 마우스로부터 유래한 이종 이식체는 아포토시스성 병소의 존재를 위해 시험되고, 처리되지 않은 대조군 이종이식-포함 마우스와 비교될 수 있다. 처리된 마우스의 종양 내 아포토시스성 병소가 발견되는 범위는 조성물의 치료적 효능에 대한 표시를 제공한다.
상기 방법의 실행에 사용된 치료적 조성물은 목적하는 전달 방법을 위해 적합한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 조제될 수 있다. 적합한 담체는 치료적 조성물과 조합되었을 때 치료적 조성물의 항-종양 기능을 보유하고, 환자의 면역 시스템에 일반적으로 비 반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예를 들면, 살균 포스페이트 완충된 염수 용액, 제균수 등과 같은 수많은 표준 약제학적 담체 중 어느 하나를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다(일반적으로, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980 참조).
치료적 제형은 용해되고, 종양 부위로 치료적 조성물을 운반할 수 있는 그 어떠한 경로를 통해서라도 투여될 수 있다. 잠재적으로 효과적인 투여 경로는 정맥 내, 비경구적, 복막 내, 근육 내, 종양 내, 피부 내, 기관 내, 오르토토픽(orthotopic) 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 정맥 내 주입을 위한 바람직한 제형은 보존된 제균수, 살균 비보존수 중의 치료적 조성물, 및/또는 0.9%의 주사용 멸균 염화나트륨, USP를 포함하는 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 백 중에 희석된 치료적 조성물을 포함한다. 치료적 단백질 조제물은 냉동 건조되어 멸균 파우더로서 바람직하게는 진공하에서 보관될 수 있고, 그 다음 주입에 앞서 제균수(예컨대, 벤질 알코올 보존제를 포함하는) 또는 살균수 중으로 재 용해시킬 수 있다.
상기 방법을 이용한 암 치료용 투약 및 투여 프로토콜은 방법 및 표적 암과 함께 변동될 것이고, 당업계에서 고려되는 수 개의 다른 인자에 일반적으로 의존적일 것이다.
XII.) 암(들)의 치료
제한된 조직 세트 중에서 정상적으로 발현되지만, 또한 표 I에 열거한 것과 같은 암 세포 중에서도 발현하는 단백질로서 161P2F10B의 확인은, 그와 같은 암의 치료에 대한 다수의 치료적 접근법을 열었다.
흥미롭게도, 표적화된 단백질이 정상 조직에서, 심지어는 핵심적 정상 기관 조직에서 발현하는 경우에도 표적화된 항종양 치료법이 유익하여 왔다. 핵심적 기관은 심장 또는 대장과 같이 생명 유지에 필수적인 것이다. 비 핵심적 기관은 제거되어도 개인이 여전히 생존할 수 있는 것이다. 비 핵심적 기관의 예로 난소, 유방 및 전립선이 있다.
정상 조직 중, 심지어 핵심 정상 조직 중에서의 표적 단백질의 발현은, 그 단백질이 또한 과발현되는 특정 종양에 대한 치료법으로서 그 단백질에 대한 표적화제의 이용성을 좌절시키지 않는다. 예를 들어 핵심 기관 중의 발현은 그 자체로 불이익이지 않다. 또한 전립선 및 난소와 같이 제거가능한 것으로 여겨지는 기관은 죽음에 영향을 미치지 않고 제거될 수 있다. 마지막으로, 몇몇 핵심 기관들은 면역 특권 때문에 정상 기관 발현에 의하여 영향받지 않는다. 면역 특권화된(immunoprivileged) 기관이란 혈-기관 장벽에 의하여 혈액으로부터 보호되어 면역 치료법에 접근할 수 없는 기관이다. 면역 특권화된 기관의 예로는 뇌 및 고환이 있다.
따라서, 161P2F10B 단백질의 활성을 억제하는 치료적 접근법은 161P2F10B를 발현하는 암에 걸린 환자에게 유용하다. 이러한 치료적 접근법은 일반적으로 3개의 군으로 분류된다. 첫 번째 군은 종양 세포 성장의 억제 또는 지연 또는 그것의 사멸을 이끌면서 종양 세포 성장과 관련되어, 161P2F10B의 기능을 조절한다. 두 번째 군은 161P2F10B 단백질의 그 결합 파트너 또는 다른 단백질과의 결합 또는 연합 억제를 위한 다양한 방법을 포함한다. 세 번째 군은 161P2F10B 유전자의 전사 또는 161P2F10B mRNA 번역 억제를 위한 다양한 방법을 포함한다.
따라서, 암 환자는 바람직하게는 암조직의 면역조직화학 분석법, 정량적인 161P2F10B 이미지화, 또는 161P2F10B 발현의 존재 또는 정도를 신뢰할 수 있게 지시하는 다른 기술을 사용하여, 161P2F10B 발현의 존재 또는 수준을 평가받을 수 있다. 종양 생검 또는 수술적 표본에 대한 면역조직화학적 분석법이 이 목적을 위하여 바람직하다. 종양 조직에 대한 면역조직화학적 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다.
XIII.) 항체-근간 치료를 위한 타겟으로서 161P2F10B
161P2F10B는 항체-근간 치료적 전략을 위한 매력적인 타겟이다. 수개의 항체 전략이 세포 외 및 세포 내 분자 모두의 타겟화에 대하여 당업계에 알려져 있다(예컨대 인트라바디의 사용뿐만 아니라, 보체 및 ADCC 매개성 사멸을 참조). 161P2F10B가 대응 정상 세포와 관련 있는 다양한 계통의 암세포에 의해 발현되기 때문에, 161P2F10B-면역활성 조성물의 전신 투여가 준비되고, 비-표적 기관 및 조직에 면역활성 조성물이 결합함에 의해 야기되는 독성, 비-특이적 및/또는 비-표적화 효과 없이 우수한 민감성을 나타내었다. 161P2F10B의 도메인과 특이적으로 반응하는 항체들은 암(바람직하게는 표I의 암, 좀 더 바람직하게는 신장암 및/또는 간암)을 전신적으로 치료하는데에 유용한데, 바람직하게는 컨쥬게이트가 톡신 또는 치료제와 함께인 것인 항체 약물 컨쥬게이트(즉, ADC)로서 유용하다.
당업자들은, 도 1에서 보여지는 것과 같은 161P2F10B 서열의 면역원 영역과 같은 면역원 분자를 특이적으로 타겟화 및 결합하는데에 항체가 사용될 수 있다는 것을 이해한다. 또한, 당업자들은 항체를 세포독성 약제에 컨쥬게이트 시키는 것이 흔하다는 것을 이해한다(참고로, 예컨대 Slevers, et al., Blood 93:11 3678-3684(1999년 6월 1일)). 세포독성 및/또는 치료제가, 세포가 발현하는 분자(예컨대, 161P2F10B)에 특이적인 항체와 그들을 컨쥬게이트 시킴에 의한 것과 같이, 세포에 직접적으로 전달될 때, 세포독성 약제는 그것의 알려진 생물학적 효과(즉, 세포독성)를 그 세포 상에서 발휘할 것이다.
세포를 사멸시키기 위하여 항체-세포독성 약제 컨쥬게이트를 사용하는 방법 및 다양한 종류의 조성물이 당업계에 알려져 있다. 암의 맥락에 있어서, 통상적인 방법은 세포 표면 상에서 발현되거나, 결합에 접근성이 있거나, 또는 국소화된 항원(예컨대, 161P2F10B)에 결합하는 표적화제(예컨대, 161P2F10B MAb, 바람직하게는 H16-7.8)와 연결된 선택된 세포독성제 및/또는 치료제를 포함하는 컨쥬게이트의 생물학적 유효량을 종양을 가진 포유류에게 투여하는 것을 수반한다. 통상적인 구체예는 세포독성 및/또는 치료제를 161P2F10B를 발현하는 세포에 전달하는 방법인데, 이는 세포독성 약제를 면역특이적으로 161P2F10B 에피토프에 결합하는 항체에 컨쥬게이트 시키는 것, 및 세포를 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)에 노출시키는 것을 포함한다. 또 다른 설명적 구체예는 전이된 암으로부터 고통받는 것으로 의심되는 개인을 치료하는 방법인데, 이는 세포독성 및/또는 치료제에 컨쥬게이트된 항체의 치료적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 상기 개인에게 비경구적으로 투여하는 단계를 포함한다.
대장암(Arlen, et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), 복합 골수종(Ozaki, et al., 1997, Blood 90:3179-3186, Tsunenari, et al., 1997, Blood 90:2437-2444), 위암(Kasprzyk, et al., 1992, Cancer Res. 52:2771-2776), B-세포 림프종(Funakoshi et　al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), 백혈병(Zhong et　al., 1996, Leuk. Res. 20:581-589), 결장직장암(Moun et　al., 1994, Cancer Res. 54:6160-6166; Velders et　al., 1995, Cancer Res. 55:4398-4403) 및 유방암(Shepard et　al., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다른 종류의 암 치료에 성공적으로 적용되어 온 다양한 접근법에 따라서, 161P2F10B 항체를 이용한 암 면역치료를 행할 수 있다. 몇몇 치료학적 접근은 Y91 또는 I131를 항-CD20 항체(예컨대, ZevalinTM, IDEC Pharmaceuticals Corp. 또는 BexxarTM, Coulter Pharmaceuticals)에 각각 컨쥬게이션하는 것과 같은, 네이키드 항체를 톡신 또는 방사능 동위원소에 컨쥬게이션시키는 것과 관련되는 반면에, 다른 접근법들은 파클리탁셀(Genentech, Inc.)과 함께 헤르셉틴TM(trastuzu MAb)과 같은 다른 치료제와 항체를 공동-투여하는 것과 관련된다.
바람직한 구체예에서, 항체는 세포독성 약제, 상기 바람직하게는 MMAE(Seattle Genetics)로 지정된 아우라스타틴(aurastatin) 유도체에 컨쥬게이트될 것이다.
따라서, 본 발명의 치료적 방법에 사용되는 바람직한 단클론성 항체는 완전히 인간이고 높은 친화력으로 표적 161P2F10B 항원에 특이적으로 결합하는 것이다.
XIV.) 161P2F10B ADC 칵테일
본 발명의 치료적 방법은 다른 MAb(즉, 161P2F10B MAb 또는 다른 단백질에 결합하는 Mab)의 조합 또는 칵테일뿐만 아니라, 단일 161P2F10B ADC의 투여를 의도한다. 이와 같은 MAb 칵테일은 다른 에피토프를 표적화하거나, 다른 효과기 메커니즘을 개척하거나 또는 세포독성 MAb를 면역 이펙터 기능성에 의존하는 MAb와 직접적으로 결합시키는 MAb들을 포함하는 만큼 특정한 이점을 가질 수 있다. 이와 같은 조합된 MAb들은 상승 효과적인 치료 효과를 나타낼 수 있다. 또한 161P2F10B MAb는 다양한 화학치료적 또는 생물학적 약제, 안드로겐-차단제, 면역 조절제(예컨대, IL-2, GM-CSF), 수술 또는 방사능을 포함하며 이에 제한되지 않는 다른 치료적 형태와 함께 부수적으로 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 161P2F10B MAb는 컨쥬게이트된 형태로 투여된다.
161P2F10B ADC 제제는 항체를 종양 세포에 전달할 수 있는 임의의 경로를 통해 투여된다. 투여 경로는 정맥 내, 복막 내, 근육 내, 종양 내, 피부 내 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 치료는 일반적으로 정맥 내 주입과 같이 수용가능한 투여 경로를 통하여, 통상적으로 0.1mg/kg, 0.2mg/kg, 0.3mg/kg, 0.4mg/kg, 0.5mg/kg, 0.6mg/kg, 0.7mg/kg, 0.8mg/kg, 0.9mg/kg, 1mg/kg, 2mg/kg, 3mg/kg, 4mg/kg, 5mg/kg, 6mg/kg, 7mg/kg, 8mg/kg, 9mg/kg, 10mg/kg, 15mg/kg, 20mg/kg 또는 25mg/kg(체중)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 투여량으로 161P2F10B ADC 조제물을 반복적으로 투여하는 것과 관련된다. 일반적으로 주당 10-1000mg MAb 범위의 투여량이 효과적이고 잘 수용된다.
전이성 유방암 치료에서 헤르셉틴®(Trastuzumab)을 이용한 임상적 경험에 근거한, MAb 조제물의 초기 부하 투여량 약 4mg/kg(환자 체중 IV)와 이를 따르는 주당 투여량 약 2mg/kg IV는 수용가능한 섭생을 나타낸다. 바람직하게는, 초기 부하 투여량은 90분 또는 더 긴 주입으로 투여된다. 주기적인 유지 투여량은 초기 투여량이 잘 수용되는 것을 조건으로, 30분 또는 더 긴 주입으로 투여된다. 당업자들에 의해 고려되듯이, 다양한 인자가 특정 경우에 있어 이상적인 투여 계획에 영향을 미칠 수 있다. 이와 같은 인자는 특정 환자의 건강 상태뿐만 아니라, 예를 들면 사용된 MAb의 결합 친화력 및 반감기, 환자 중의 161P2F10B 발현 정도, 순환하는 쉐드(shed) 161P2F10B 항원의 정도, 목적하는 정상 상태 항체 농도 수준, 처리의 빈도 및 본 발명의 치료 방법과 조합하여 사용되는 화학적 치료 또는 다른 약제의 영향을 포함한다.
선택적으로, 가장 효과적인 투여 계획 등의 결정을 돕기 위하여, 환자는 주어진 시료 내 161P2F10B의 수준(예컨대, 순환하는 161P2F10B 항원 및/또는 161P2F10B 발현 세포의 수준)을 평가받아야 한다. 이와 같은 평가는 치료 전체를 통해 모니터링 목적으로 또한 사용되며, 다른 파라미터(예를 들면, 방광암 치료에 있어 소변 세포학 및/또는 면역Cyt 레벨, 또는 유사하게, 전립선 암 치료에 있어서 혈장 PSA 레벨)의 평가와 결합하여 치료적 성공을 평가하는데에 유용하다.
본 발명의 목적은 161P2F10B ADC를 제공하는데 있는데, 이는 종양 세포, 바람직하게는 표I의 종양 세포들의 성장을 억제 또는 지연시킨다. 본 발명의 다른 목적은 상기 161P2F10B ADC를 사용하여, 특히 다른 약제 또는 면역학적으로 활성인 치료법과 조합한 상기 161P2F10B ADC를 사용하여, 혈관신생 및 다른 생물학적 작용을 억제한 결과 포유류, 바람직하게는 인간 내의 종양 성장을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
XV.) 조합치료
하나의 구체예에서, 인간 종양을 포함하는 종양을 화학치료제 또는 방사능 또는 이들의 조합과 결합시킨 161P2F10B ADC으로 처리하는 경우 상승 효과가 있다. 다시 말해, 161P2F10B ADC에 의한 종양 성장의 억제는 화학치료제 또는 방사능 또는 이들의 조합과 결합시키는 경우 기대보다 더 많이 향상된다. 상승효과는 예를 들어, 단지 161P2F10B ADC의 처리로부터 기대되는 것 또는 161P2F10B ADC 및 화학치료제 또는 방사능을 이용한 치료의 합산 효과로부터 기대되는 것보다, 조합된 치료에 의한 종양 성장의 더 큰 억제에 의하여 나타날 수 있다. 바람직하게는, 상승효과는 암의 감쇠에 의하여 나타내어지는데, 여기에서 감쇠는 161P2F10B ADC로부터, 또는 161P2F10B ADC 및 화학치료제 또는 방사능의 추가적 조합을 사용한 치료로부터는 기대할 수 없는 것이다.
161P2F10B ADC 및 화학치료 또는 방사능 또는 양자의 조합을 사용하여 종양 세포 성장을 억제하는 방법은, 화학치료 또는 방사능 치료를 시작하기 전, 중간 또는 이후 또는 이들의 그 어떠한 조합(즉, 화학치료 및/또는 방사능 치료를 시작하기 전 및 동안, 전 및 이후, 중간 및 이후, 또는 전, 중간 및 이후)에 161P2F10B ADC를 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 161P2F10B ADC는 통상적으로 방사능 치료 및/또는 화학적 치료를 시작하기에 앞서 1일 내지 60일, 바람직하게는 3일 내지 40일, 보다 바람직하게는 5일 내지 12일에, 투여된다. 그러나 치료 프로토콜 및 특정 환자의 필요에 따라서, 상기 방법은 가장 효과적인 치료를 제공하고 환자의 수명을 최대로 연장할 수 있는 방식으로 수행된다.
화학치료제의 투여는 비경구 및 경구적 경로에 의한 전신 투여를포함하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 일 구현예에서, 161P2F10B ADC 및 화학치료제는 분리된 분자로서 투여된다. 화학치료제 또는 화학치료법의 특정한 예로는 시스플라틴(cisplatin), 다카바진(dacarbazine, DTIC), 닥티노마이신(dactinomycin), 메클로레타민(mechlorethamine, nitrogen mustard), 스트렙토조신(streptozocin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 카무스틴(carmustine, BCNU), 로무스틴(lomustine, CCNU), 독소루비신(doxorubicin, adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 프로카바진(procarbazine), 미토마이신(mitomycin), 시타라빈(cytarabine), 에토포사이드(etoposide), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 블레오마이신(bleomycin), 파클리탁셀(paclitaxel, 탁솔(taxol)), 도세탁셀(docetaxel, 탁소텔(taxotere)), 알데스루킨(aldesleukin), 아스파라기나세(asparaginase), 부설판(busulfan), 카보플라틴(carboplatin), 클라드리빈(cladribine), 다카바진(dacarbazine), 플록수리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 히드록시우레아(hydroxyurea), 이포스파미드(ifosfamide), 인터페론 알파(interferon alpha), 루프로리드(leuprolide), 메게스트롤(megestrol), 멜팔란(melphalan), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 플리카마이신(plicamycin), 미토탄(mitotane), 페가스파가세(pegaspargase), 펜토스타틴(pentostatin), 피포브로만(pipobroman), 플리카마이신(plicamycin), 스트렙토조신(streptozocin), 타목시펜(tamoxifen), 테니포시드(teniposide), 테스토락톤(testolactone), 티오구아닌(thioguanine), 티오테파(thiotepa), 우라실 머스타드(uracil mustard), 비노렐빈(vinorelbine), 클로로암부실(chlorambucil), 탁솔(taxol) 및 이들의 조합을 포함한다.
161P2F10B ADC와 조합으로 사용되는 방사선의 공급원은 치료되는 환자의 외부 또는 내부일 수 있다. 공급원이 환자의 외부인 경우, 치료법은 외부 빔 방사 치료(EBRT)로 알려져있다. 방사선의 공급원이 환자 내부인 경우, 그 치료법은 방사선 물질 주입 치료법(brachytherapy, BT)으로 불린다.
상기 기술된 치료적 계획은 추가적인 암 치료제 및/또는 섭생과 추가적으로 결합될 수 있는데, 예를 들면 추가적인 화학치료법, 암 백신, 신호 전달 억제제, 비정상적 세포 성장 또는 암 치료에 유용한 약제, 항체(예컨대, WO/2005/092380에 기술되어 있는 항-CTLA-4 항체(Pfizer)) 또는 IGF-1R 및 사이토카인에의 결합에 의하여 암 성장을 억제하는 다른 리간드가 있다.
포유류가 추가적인 화학치료법을 받는 경우, 상기에서 설명한 화학치료제들이 사용될 수 있다. 추가적으로, 성장 인자 억제제, 생물학적 반응 변형제, 항-호르몬 치료, 선택적 에스트로겐 수용체 조절자(SERM), 혈관신생 억제제 및 항-안드로겐이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-호르몬, 예컨대 Nolvadex(타목시펜)과 같은 항-에스트로겐 또는 Casodex(4'-시아노-3-(4-플루오로페닐설포닐)-2-히드록시-2-메틸-3-'-(트리플루오로메틸)프로피온아닐리드))와 같은 항-안드로겐이 사용될 수 있다.
상기 치료적 접근법들은 다양한 범위의 수술적, 화학치료, 또는 방사선 치료 섭생 중의 어느 하나와 조합될 수 있다. 본 발명의 치료적 접근법은 화학치료법(또는 다른 치료)의 감소된 투여량의 사용 및/또는 덜 빈번한 투여를 가능하게 하는데, 이는 모든 환자, 특히 화학치료적 약제의 독성에 잘 순응하지 않는 환자들에게 유리하다.
XVI.) 키트/제조 품목
본 명세서에 기술된 실험실적, 예후적, 예방적, 진단적 및 치료적 응용에 사용되기 위하여, 키트는 본 발명의 범위에 속한다. 이와 같은 키트는 바이알 및 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하기 위하여 구획된 캐리어, 포장 또는 용기를 포함하는데, 각각의 용기는 본 명세에 기술된 사용과 같은 사용을 위한 지시를 포함하는 라벨 또는 삽입물과 함께, 본 방법에 사용되기 위한 분리된 요소 중 하나를 포함한다. 예를 들어, 용기(들)는 탐지가능하게 표지된 또는 표지될 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 키트는 약물 유닛을 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 상기 키트는 도 2 또는 도 3의 아미노산 서열 또는 그의 유사체, 또는 그와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 통상적으로, 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기; 캐리어, 포장, 용기, 바이알 및/또는 내용물을 열거하는 튜브 라벨 및/또는 사용을 위한 설명서, 및 사용을 위한 설명서와 함께 포장 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 물질을 포함하는, 상기 설명한 용기 및 그와 결합할 수 있는 하나 이상의 다른 용기를 포함할 것이다.
라벨은, 조성물이 특정 치료 또는 예후적, 예방적, 진단적 또는 실험실적 응용과 같은 비치료적 용도에 사용됨을 나타내기 위하여 용기 상에 또는 그와 함께 존재할 수 있으며, 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 생체내 또는 시험관내 사용을 위한 지시를 표시할 수 있다. 지시 및 또는 다른 정보는 또한 키트 상에 또는 그와 함께 포함되는 삽입물(들) 또는 라벨(들) 상에 포함될 수 있다. 상기 라벨은 용기 상에 또는 그와 결합되어 있을 수 있다. 라벨은 라벨을 형성하는 문자, 숫자 또는 다른 글자가 용기 자체에 몰딩되거나 또는 새겨진 경우 용기 상에 있을 수 있다; 라벨은 그것이 예컨대 포장 삽입물과 같은, 용기를 또한 보유할 수 있는 저장소 또는 캐리어 내부에 존재하는 경우에, 용기와 결합될 수 있다. 라벨은 조성물이 표 I에 나타낸 조직의 암과 같은 상태의 진단, 치료, 예방 및 예상을 위하여 사용된다는 것을 표시할 수 있다.
용어 "키트" 및 "제조 품목"은 동의어로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 항체 또는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)와 같은 조성물, 예컨대, 표 I에 나타난 것과 같은 조직의 암의 진단, 예상, 예방 및/또는 치료에 유용한 물질을 포함하는 제조 품목(들)이 제공된다. 상기 제조 품목은 통상적으로 적어도 하나의 용기 및 적어도 하나의 라벨을 포함한다. 적절한 용기는 예컨대, 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리, 금속 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 아미노산 서열(들), 소분자, 핵산 서열(들), 세포 개체(들) 및/또는 항체(들)를 보유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 용기는 또한 세포 및 조직 중의 161P2F10B 단백질 발현을 평가하는데 사용하기 위한, 또는 관련된 실험실적, 예후적, 진단적, 예방적 및 치료적 목적을 위한 항체, 그의 결합 단편 또는 특이적인 결합 단백질을 포함한다: 시약 및 다른 조성물 또는 이러한 목적을 위한 도구가 포함될 수 있는 것처럼, 그와 같은 사용을 위한 지시 및/또는 지침서가 상기 용기 상에 또는 그와 함께 포함될 수 있다.
용기는 대안으로 질환의 치료, 진단, 예상 및 예방에 효과적인 조성물을 보유할 수 있으며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 피하 주사 바늘에 의하여 관통될 수 있는 마개를 가지는 정맥 용액백 또는 바이알일 수 있다). 조성물의 활성 성분은 161P2F10B 에 특이적으로 결합하는 항체 약물 컨쥬게이트일 수 있다.
제조 품목은 인산염-완충 염수, 링거 용액 및/또는 덱스트로스 용액과 같이 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 2차 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 교반기, 바늘, 주사기, 및/또는 사용을 위한 지시 및/또는 설명서가 있는 포장 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질들을 추가적으로 포함할 수 있다.
실시예 :
본 발명의 다양한 관점은 하기에 기술될 수개의 실시예의 방법에 의해 추가적으로 설명되고 예시되는데, 이들은 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도가 아니다.
실시예 1 161 P2F10B 항원
당업계에 알려진 SSH(Suppression Subtractive Hybridization) 방법을 사용하여 161P2F10B 유전자 서열을 밝혀내었다. 표준 방법을 사용하여 신장암 환자로부터 유래된 cDNA로부터 182 bp의 161P2F10B SSH 서열을 확인하였다. 신장암 환자 표본으로부터 161P2F10B 에 대한 전장 cDNA 클론을 분리하였다. 상기 cDNA 는 3858bp 길이이고, 875 아미노산 ORF를 인코딩한다(도 1 참조). 161P2F10B 는 ENPP3에 상동성을 보였다(문헌[Buhring, et. al., Blood 97:3303-3305 (2001)] 참조). 161P2F10B 는 크로모좀 6q22에 공지된 표준 방법을 사용하여 맵핑된다. 추가적인 참고로는 미국특허 제7,279,556호(Agensys, Inc., Santa Monica, CA), 미국특허 제7,405,290호(Agensys, Inc., Santa Monica, CA), 미국특허 제7,067,130호(Agensys, Inc., Santa Monica, CA) 및 미국특허 제7,226,594호(Agensys, Inc., Santa Monica, CA)를 참조한다.
실시예 2 161 P2F10B 단클론성 항체 ( MAb )의 발생
하나의 구체예에서, 161P2F10B 에 대한 치료적 단클론성 항체("MAb")는 161P2F10B의 생물학적 기능에 결합, 내재화, 방해 또는 조절할 단백질에 특이적인 에피토프와 반응하는 것, 예를 들면 리간드, 기질 및 결합 파트너와의 결합을 방해하는 것을 포함한다. 이와 같은 MAb의 발생을 위한 면역원은 세포외 도메인 또는 161P2F10B 단백질 서열전체, 및 아미노산 서열의 컴퓨터 분석으로부터 항원성인 것으로 예측된 기능적 모티프를 포함하는 것으로 예측되는 영역을 인코딩하거나 또는 포함하도록 설계된 것들을 포함한다. 면역원은 tag5-161P2F10B, His 태그된 단백질로부터 유래한 정제된 포유류 세포와 같은 펩타이드 및 재조합 단백질을 포함한다. 또한, RAT1-161P2F10B와 같은 높은 수준의 161P2F10B 을 발현하도록 레트로바이러스의 형질도입을 통하여 유전자 조작된 세포가 마우스를 면역화하기 위해 사용한다.
161P2F10B 에 대한 MAb는 마우스 중쇄 및 카파 경쇄 자리가 불활성화되어 있고, 인간 중쇄 및 카파 경쇄 면역 글로불린 자리의 대다수가 삽입되어 있는 XenoMouse® 기술(Amgem Fremont)을 사용하여 생성시켰다. MAb 지정된 H16-7.8는 Tag5-161P2F10B 세포를 갖는 인간 γ2 생성 XenoMice를 면역화하여 발생시켰다.
161P2F10B MAb H16-7.8는 재조합 161P2F10B(서열 번호 2) 발현 세포 및 암 이종이식 세포에서 발현된 내인성 세포 표면 161P2F10B에 특이적으로 결합한다.
161P2F10B MAb H16-7.8에 대한 DNA 코딩 서열은 TRIzol® 시약(Life Technologies, Gibco BRL)을 사용하여 각각의 하이드로마 세포로부터 mRNA를 분리한 후에 결정하였다.
항-161P2F10B H16-7.8 중쇄 및 경쇄 가변 핵산 서열은 다음의 프로토콜을 사용하여 하이드로마 세포로부터 시퀀싱하였다. H16-7.8 분비 하이드로마 세포를 TRIzol® 시약(Life Technologies, Gibco BRL)으로 용해하였다. 총 RNA를 정제하고 정량화하였다. Gibco-BRL Superscript Preamplification 시스템을 사용한 올리고 (dT)12-18 프라이밍으로 총 RNA로부터 cDNA의 첫번째 가닥을 생성시켰다. 첫번째 cDNA 가닥을 인간 면역글로불린 가변 중쇄 프라이머 및 인간 면역 글로불린 가변 경쇄 프리아머를 사용하여 증폭시켰다. PCR 산물을 시퀀싱하고, 가변 경쇄 및 중쇄 영역을 결정하였다.
가변 중쇄 및 경쇄 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 도 2 및 도 3에서 열거하였다. H16-7.8의 중쇄 가변 영역은 중쇄 가변 영역은 서열 번호 7의 20번째 Q 잔기에서 142번째 S 잔기까지의 아미노산 서열로 이루어지고, H16-7.8 의 경쇄 가변 영역은 서열 번호 8의 20번째 E 잔기에서 127번째 R 잔기까지의 아미노산 서열로 이루어진다. H16-7.8 의 중쇄는 서열 번호 7의 20번째 Q잔기에서 468번째 K잔기까지의 아미노산 서열로 이루어지고, H16-7.8 의 경쇄는 서열 번호 8 서열의 20번째 E잔기에서 233번째 C잔기까지의 아미노산 서열로 이루어진다. 인간 VH4-31/D5-12/JH6 생식 세포 및 인간 A26/JK1 생식 세포에 대한 H16-7.8의 정렬은 도 4a 내지 4b에 나타내었다.
실시예 3 재조합 DNA 방법을 사용하는 H16 -7.8의 발현
트랜스펙션된 세포 중에 재조합적으로 H16-7.8을 발현시키기 위하여, H16-7.8 중쇄 및 경쇄 서열(서열 번호 7의 20 내지 468 및 서열 번호 8의 경쇄, 20 내지 233)을 발현 벡터 내로 각각 클로닝하였다. 완전한 H16-7.8 인간 중쇄 및 경쇄 카세트를 클로닝 벡터 중의 CMV 프로모터/인핸서의 하류에 클로닝하였다. 폴리아데닐화 영역을 MAb 코딩 서열의 다운스트림에 포함시켰다. 재조합 H16-7.8 발현 구성체를 CHO세포 속으로 주입하고 재조합 H16-7.8가 CHO 세포로부터 분비되었다. IgG 역가를 ELISA에 의해 측정하였다. 결과는 IgG 및 중쇄 및 경쇄의 발현 및 양호한 공동발현을 확인하였다. 유세포 분석기를 이용하여 재조합 H16-7.8의 세포 표면 161P2F10B에의 결합을 평가하였다(도 5). H16-7.8 중쇄 및 경쇄 벡터 구성체로 트랜스펙션한 하이드로마 또는 CHO 세포로부터 유래한 재조합 H16-7.8 로 3T3-대조군 및 3T3-161P2F10B 세포를 염색하였다.
유세포 분석기로 결합을 측정하였다. 그 결과, CHO 세포 내에서 발현된 재조합적으로 발현되는 H16-7.8이 분비되고 세포 표면161P2F10B 에 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다(도 5).
재조합 H16-7.8는 그것의 펩티드 서열에 대해 특징화하였다. H16-7.8의 펩티드 맵핑 분석은 H16-7.8의 추론된 아미노산 서열이 LC-MS/MS로 Lys-C 분해, LC-MS/MS로 Asp-N 분해를 사용하여 결정한 서열 및 Edman분해에 의해 N-말단 서열에 대해 정확하다는 것을 확인하였다.
실시예 4 H16 -7.8의 항체 약물 컨쥬게이션
H16-7.8(도 2)을 이하에 설명하는 말레이미도카프릴(mc)비절단성 링커를 사용하여 돌라발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-페닐알라닌(아우라스타틴 유도체) 지정 MMAF(Formula XVIV; 모노메틸 아우리스타틴 F)에 컨쥬게이트하였다:
Figure 112012072574899-pct00046
MMAF에 대한 말레이미도카프로일(mc)의 절단가능하지 않은 링커(Seattle Genetics, Seattle, WA)의 합성을 표 VI에서 제시한 합성 방법을 사용하여 완료하여(SAFC, Madison, WI) 세포독성 mcMMAF를 말들었다.
다음으로, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트(ADC) 지정 H16-7.8mcMMAF를 다음 프로토콜을 사용하여 만들었다.
간략하게, pH 4.5에서 10mM 숙시네이트 중에서 10mg/mL 용액의 H16-7.8을 정용여과에 의해 완충제 교환하였다. 완충제 교환의 목적은 H16-7.8 조제물 완충제 성분을 제거하고, 이후의 "환원" 단계를 최적화하기 위한 더 양립가능한 완충제로 대체하는 것이다. 항체를 6디아볼륨(diavolume: DV)의 붕산나트륨 완충제에 대해 정용여과하고 10±1mg/ml로 농축하고, 시스템으로부터 플러쉬하며, 7.5mg/ml로 희석하고 0.2μm를 여과하였다.
후속하여, EDTA를 반응 혼합물 내 5mM 최종 농도로 첨가하였다. 다음을 H16-7.8의 이황화 결합을 부분적으로 트리-(2-카르복시에틸)-포스핀 히드로클로라이드 (TCEP)로 환원시켜 유리 티올(SH)을 형성하였다. 이 절차를 37℃에서 수행한다. EDTA는 임의의 2가 금속 양이온을 킬레이트하여 이 반응동안 5mm 농도로 존재하며, 이는 원치않는 SH 재산화를 야기할 수 있었다. 환원 단계의 마지막에, 반응 용액의 온도를 20℃로 낮추고 유리 SH의 몰비를 결정하도록 분석하였고, MAb 당 ≥3.9 SH를 보장하도록 만들었다. 컨쥬게이션을 위해, 약물-링커 mcMMAF를 분리기에서 칭량하였고, DMSO 중에서 용해하여 5.5mg/ml 농도로 용해하였다.
부분적으로 환원된 H16-7.8 상의 SH 기를 약물-링커 mcMMAF와 반응시켜 컨쥬게이트, H16-7.8mcMMAF를 형성하였다. DMSO 내 mcMMAF를 항체에 대해 약물의 설정된 몰 당량으로 첨가하였다. 이 단계를 20℃에서 수행하였다. 1시간 인큐베이션 후, 반응 내에서 임의의 과량의 약물 링커를 N-아세틸-시스테인으로 퀀칭하였고, 따라서 임의의 반응성 약물 링커를 제거하고 이를 제거와 분석 방법에 의한 검출이 더 용이한 부가물로 변화시켰다. 다음으로 혼합물을 mcMMAF에 대해서 1몰 당량의 N-아세틸-시스테인의 첨가 후 추가 15분 동안 교반한다.
다음으로, 초미세여과/정용여과를 수행하여 DMSO, 과정 불순물을 제거하고 조제물 완충제로 ADC의 완충제 교환을 수행한다.
따라서 과량의 퀀칭한 mcMMAF를 pH 5.2 조제물 완충제, 8 디아볼륨의 20mM 히스티딘으로 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 초미세여과/정용여과하여 제거한다. 8번째 디아볼륨의 완료 후, 용액을 재순환시키고 단백질 농축을 위해 분석하였다.
컨쥬게이트는 20mM 히스티딘, 10% 트레할로스, pH 5.2 완충제로 6±0.5mg/ml로 조절된다. 폴리소르베이트 20을 다음에 첨가하고, 균질하게 혼합하고, 0.2μm 필터를 통해 무균성으로 여과한다.
결과 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)는 H16-7.8mcMMAF를 지정하며, 하기 화학식을 가진다:
Figure 112012072574899-pct00047
상기 식에서 MAb는 H16-7.8(도 2 및 도 3)이며 p는 1 내지 12이다.
실시예 5
H16-7.8 및 H16-7.8mcMMAF의 특성화
H16-7.8를 실시예 2 "161P2F10B 단클론성 항체 (MAb)의 발생"에서 제시한 방법을 사용하여 만들었다. 추가적으로, 161P2F10B와 결합하는 항체 약물 컨쥬게이트를 "H16-7.8의 항체 약물 컨쥬게이션" 실시예에서 제시한 방법을 사용하여 만들었다. H16-7.8 및 H16-7.8mcMMAF ADC를 스크리닝하고, 확인하고, 당업계에 알려진 분석의 조합을 사용하여 특성화하였다.
A. FACS에 의한 세포 결합 및 친화도 결정
H16-7.8 및 H16-7.8mcMMAF를 Ku812 세포 상에서 내인성으로 발현된 161P2F10B에 대한 결합 친화도에 대해 시험하였다. 간략하게, H16-7.8 또는 H16-7.8mcMMAF의 11개의 희석물을 Ku812 세포(웰 당 50,000세포)와 함께 밤새 4℃에서 160nM 내지 0.0001nM의 최종 농도로 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 마지막에, 세포를 세척하였고, 항-hIgG-PE 검출 항체와 함께 45분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 비결합 항체를 세척한 후, 세포를 FACS로 분석하였다. 평균 형광 강도(MFI) 값을 얻었다(표 IV를 참조). MFI 값을 Graphpad Prisim 소프트웨어에 입력하였고 Y=Bmax*X/(Kd+X)의 한 자리 결합(쌍곡선) 방정식을 사용하여 분석하여 도 6에서 나타내는 H16-7.8 또는 H16-7.8mcMMAF 포화 곡선을 만들었다. Bmax는 161P2F10B에 대한 H16-7.8 또는 H16 7.8mcMMAF의 최대 결합에서 MFI 값이고; Kd는 절반의 최대 결합에 필요한 H16-7.8 또는 H16-7.8mcMMAF의 농도인 H16-7.8 또는 H16-7.8mcMMAF 결합 친화도이다.
Ku812 세포의 표면 상에서 내인성으로 발현된 161P2F10B-관련 단백질 상에서 H16-7.8 및 H16-7.8mcMMAF의 계산된 친화도(Kd)는 각각 0.06nM 및 0.19nM이다.
신장암 세포의 표면 상에서 발현된 내인성 161P2F10B-관련 단백질에의 H16-7.8 및 H16-7.8mcMMAF의 결합을 측정하기 위하여 인간 UGK-3 세포(투명 세포 신장암 환자로부터 유래) 및 RXF-393 세포(투명 세포 신장암)을 10 ㎍/ml의 천연 H16-7.8, H16-7.8mcMMAF, 또는 이소타입 대조군 인간 IgG2로 염색하였고, FACS로 평가하였다.
도 7의 결과(좌측 패널)는 H16-7.8(회색선)로 2개의 상이한 신장 종양 세포의 강한 염색을 나타내지만, 대조군 MAb(채워진 히스토그램)으로는 그렇지 않다. 우측의 패널은 H16-7.8mcMMAF로 동일한 신장 종양 세포의 유사한 강한 염색을 증명한다(회색선). (도 7; 우측 패널). 이 결과는 H16-7.8 및 H16-7.8mcMMAF는 둘 다 인간 암 세포 표면 상에서 발현된 천연 161P2F10B 항원과 결합한다는 것을 나타낸다. H16-7.8mcMMAF를 만들기 위한 천연 H16-7.8의 컨쥬게이션은 인간 암 세포 상에서 발현된 천연 161P2F10B 항원에 대한 그것의 세포 표면 결합을 변경하지 않았다.
실시예 6 H16 -7.8 mcMMAF 에 의해 세포 매개된 세포독성
161P2F10B-의존적 세포독성을 매개하기 위한 H16-7.8mcMMAF의 능력을 161P2F10B를 발현시키기 위해 유전자조작된 KU812 세포 중에서 평가하였다. 이 분석을 위해, 2000개의 가시적 KU812 세포를 제0일에 3회 플레이팅하였고 밤새 회수하였다. 다음날, mcMMAF와 컨쥬게이트된 H16-7.8mcMMAF 또는 대조군 MAb의 단계적 1:4 희석물의 상이한 로트를 첨가하여 도 8에 나타난 최종 농도를 얻었다. 세포를 6일 동안 인큐베이션하였고, 그 때에 알라마르 블루(Alamar blue) 20μl 를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 추가 4시간 동안 인큐베이션하였고 540nM의 여기 파장 및 620nM의 방출 파장을 사용하여 형광 플레이트 판독기에서 형광 강도를 판독하였다.
도 8의 결과는 H16-7.8mcMMAF 로트가 둘 다 KU812 세포의 증식을 강하게 억제한다는 것을 나타낸다. 로트(1) 및 로트 (2)에 대해 각각 0.2nM 및 0.1nM이 되도록 IC 50을 결정하였다. KU812 세포와 결합하지 않은 완전한 인간 대조군 MAb를 mcMMAF와 컨쥬게이트하여 3.9 (+/- 0.2)의 DAR을 수득하였다. 대조군 ADC는 세포독성의 특이성을 추가로 증명하는 KU812 세포 증식을 억제하지 않았다. 따라서, 이 결과는 H16 7.8mcMMAF가 161P2F10B 발현 세포에 대한 세포독성 약물을 선택적으로 전달하여 그것의 사멸을 유발할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 7 H16 -7.8 mcMMAF 는 생체 내 종양 성장을 억제한다
종양 조직의 세포 표면 상에서 161P2F10B 의 현저한 발현은 정상 조직 중에서 그의 제한된 발현과 결합하여, 161P2F10B 를 항체 치료법 및 이와 유사하게 ADC를 통한 치료법의 좋은 표적으로 만든다. 따라서 인간 신장암 이종 이식 마우스 모델에서의 H16-7.8mcMMAF의 치료적 효능을 평가한다.
종양 성장 및 전이 형성에 대한 항체 약물 컨쥬게이트의 효능은 마우스 암 이종 이식 모델에서 연구된다(예컨대, 피하(subcutaneous) 및 정위로(orthotopically)).
피하의(s.c.) 종양은 1:1의 희석으로 Matrigel(Collaborative Research)과 혼합된 5 x 104~106개의 암세포를 수컷 SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 주입하여 발생된다. 종양 형성에 대한 ADC 효능을 시험하기 위하여, 즉 ADC의 주입은 종양 세포 주입과 동일한 날에 시작한다. 대조군으로서, 정제된 인간 IgG 또는 PBS; 또는 인간 세포 중에서 발현되지 않는 관계없는 항원을 인식하는 정제된 MAb를 마우스에 주입한다. 예비 연구에서 대조군IgG 또는 PBS의 종양 성장에 대한 차이가 발견되지 않았다. 종양의 크기는 캘리퍼스 방법으로 측정하고, 종양의 부피는 길이 x 폭 x 높이로서 계산한다. 직경 1.5cm보다 더 큰 피하 종양을 갖는 마우스는 희생시킨다.
수컷 SCID 마우스에 피하로 이식한 150만개 내지 2백만개 세포의 주사에 의해 마우스 내 신장암 성장을 수행한다. 마우스의 일반적인 건강, 신체적 활동성 및 외관을 사멸 직전까지 관찰한다. 희생시키는 때에, 종양의 적하를 측정을 위하여 복막 공동을 관찰할 수 있고, 먼 부분까지의 전이를 평가하기 위하여 다른 기관을 적출할 수 있다. 또는 사망을 종말점으로 사용할 수 있다. 그 다음 적절한 처치를 위하여 마우스를 그룹으로 분리하고, 161P2F10B 또는 대조군 MAb을 정맥내(i.v.)로 주사한다.
이종 이식 암 모델의 이점은 신생혈관화 및 혈관신생을 연구할 수 있는 능력이다. 종양의 성장은 신생혈관 발전에 부분적으로 의존적이다. 혈관 시스템 및 발전하는 혈관 네트워크가 숙주 유래이기는 하지만 신생혈관계의 개시 및 축조는 이종 이식 종양에 의해 조절된다(Davidoff, et al., Clin Cancer Res. (2001) 7:2870; Solesvik, et al., Eur J Cancer Clin Oncol. (1984) 20:1295). 신생혈관화에 미치는 항체 및 소분자의 영향은 종양 조직 및 그들 주변 미세 환경의 IHC 분석과 같은, 당업계에서 알려진 절차에 따라 연구된다.
H16-7.8mcMMAF는 이종이식 대장암의 형성을 억제한다. 이러한 결과는 국소적 및 발전된 단계의 암 및 바람직하게는 표 I에 나타난 암의 치료에 있어서 H16-7.8mcMMAF의 이용성을 지시한다.
161P2F10B ADCs:
"161P2F10B 단클론성 항체(MAb)의 발생"이라는 제목의 실시예에서 설명한 바에 따라 161P2F10B에 대해 단클론성 항체를 상승시켰다. 추가적으로 "H16-7.8의 항체 약물 컨쥬게이션" 이라는 제목의 실시예에서 설명함 바와 같이 MAb를 독소에 컨쥬게이션하여 H16-7.8mcMMAF를 형성한다. H16-7.8mcMMAF는 FACS 및 161P2F10B에 결합하는 능력을 결정하는 당업계의 알려진 다른 방법에 의하여 특성화된다.
세포주 및 이종이식:
RFX-393 세포를 RPMI에서 유지하고, L-글루타민 및 10% FBS로 보충하였다. UG-K3 및 SKRC-01 이종이식을 SCID 마우스에서 일련의 증식에 의해 유지한다.
SCID 마우스에서 피하로 확보한 인간 신장암 이종이식 UG-K3 내 H16-7.8mcMMAF의 효능.
이 실험에서, 환자 유래 인간 신세포암 이종이식 UG-K3을 SCID 마우스에서 단계적 통과로 유지하였다. 저장 종양을 멸균으로 수확하였고 작은 조각으로 갈았다. 종양 조직을 Liberase Blendzyme(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 효소적으로 분해하였다. 1.5 x 106 세포를 개개의 SCID 마우스의 옆구리에 주사하였고, 종양을 그것들이 대략 100mm3의 부피에 도달할 때까지 처리하지 않고 성장시켰다. 동물을 다음의 코호트(cohort)로 무작위로 할당하였다: H16-7.8mcMMAF 처리군, H16-7.8 대조군 및 5% 덱스트로스 대조군. H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8을 정맥 볼루스 주사로 제0일에 1회 10mg/kg으로 투여하였다. 투여한 H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8의 양은 투여 바로 전 얻은 각 동물의 개개의 체중을 기준으로 하였다. 5% 덱스트로스 대조군에는 동물 당 150μL를 투여하였다. 연구의 마지막까지 3일 내지 4일마다 캘리퍼(caliper) 측정을 사용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 종양 부피를 넓이2 x 길이/2로 계산하며, 이때 넓이는 가장 작은 크기이며 길이는 가장 긴 것이다. 대조군의 동물을 종양이 대략 1000mm3에 도달하였을 때 인도적으로 안락사시켰다. H16-7.8mcMMAF 처리군의 동물을 희생 전 추가 2주 동안 모니터링하였다. 대조군 둘 다에 대한 데이터가 이용가능할 때 최종 시점에 α=0.05인 Kruskal-Wallis 시험을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다.
결과는 H16-7.8mcMMAF로 UG-K3 신장 투명 세포 이종이식 종양의 처리는 시험한 모든 투여량과 스케쥴에서 SCID 마우스의 종양 성장의 상당한 억제를 초래하였다는 것을 증명하였다(도 9).
H16-7.8mcMMAF에 의한 확립된 정위 UG-K3 이종이식의 성장 억제
이 실험에서, 정위이식으로 성장된 확보된 신장 종양의 성장을 억제하기 위한 H16-7.8mcMMAF의 능력을 환자 유래된 UG-K3 종양 이종이식을 사용하여 평가하였다. 간략하게, UG-K3 종양의 저장액을 효소적으로 분해하였고, 150만개의 가시적인 세포를 제0일에 수컷 SCID 마우스의 신장에 수술로 이식하였다. 7일 동안 종양을 성장시켰으며, 이 때 동물은 4가지의 상이한 처리군(그룹 당 n=10)으로 무작위 추출하였다. 5mpk로 대조군 ADC를 받은 그룹 A, 3mg/kg로 H16-7.8mcMMAF를 받은 그룹 B 및 5mg/kg로 H16-7.8mcMMAF을 받은 그룹 C으로 무작위 추출된 동물을 총 4회 투여 동안 4일마다 투여하였다. 그룹 D는 10mg/kg에서 1회 H16-7.8mcMMAF를 받았다. 연구의 마지막 날(제41일), 동물을 희생시켰고, 우측 및 좌측 신장을 전자 저울에서 칭량하였다. 그래프 상에서 플롯팅한 종양 무게를 종양 함유 우측 신장의 무게로부터 종양이 없는 대측성 신장의 무게를 차감하여 결정하였다.
결과는 시험한 모든 투여량과 스케줄에서 H16-7.8mcMMAF를 사용한 UG-K3 신장 투명 이종이식 종양의 처리가 종양 성장의 극적인 억제를 초래하였다는 것을 증명하였다(도 10). 모든 H16-7.8mcMMAF 처리군(B, C 및 D)에서 종양 무게는 대조 처리된군의 종양 무게의 1% 미만이었다. 이 차이점은 통계적으로 매의 유의하다(p< 0.0001, ANOVA).
SCID 마우스에서 피하로 확보한 인간 신장암 이종이식 RXF-393 내 H16-7.8mcMMAF의 효능.
이 실험에서, 인간 신장 암세포 RXF-393 (마우스 당 0.5 x 106 세포)를 개개의 마우스의 옆구리에 주사하였고, 종양을 그것들이 대략 100mm3의 부피에 도달할 때까지 처리하지 않고 성장시켰다. 다음으로 동물을 다음의 코호트로 무작위로 할당하였다: H16-7.8mcMMAF 처리군, H16-7.8 처리군 및 5% 덱스트로스 대조군. H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8을 정맥 볼루스 주사에 의해 총 2회 투여 동안 1주일에 1회 10mg/kg으로 투여하였다. 투여한 H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8의 양은 투여 바로 전 얻은 각 동물의 개별 체중을 기준으로 하였다. 5% 덱스트로스 대조군은 동물 당 150μL가 투여되었다. 연구의 마지막 날까지 3일 내지 4일 마다 캘리퍼 측정을 사용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 종양 부피는 폭2 x 길이/2로 계산하며, 폭은 가장 작은 치수이며, 길이는 가장 큰 것이다. 종양이 대략 1000mm3에 도달하였을 때 대조군 동물을 인도적으로 안락사시켰다. H16-7.8mcMMAF 처리군 동물들을 희생전 추가 2주동안 모니터링하였다.
결과는 (단일 투여를 포함하는) 시험한 모든 투여량 및 스케줄의 H16-7.8mcMMAF를 사용한 RFX-393 인간 신장암 이종이식의 처리가 SCID 마우스에서 종양 성장의 상당한 억제를 초래하였다. 통계적 분석은 대조군 둘 다의 데이터를 이용가능하게 되었을 때 마지막 시점에α=0.05로 Kruskal-Wallis 시험을 사용하여 수행하였다(도 11).
SCID 마우스에서 피하로 확보한 인간 신장암 SKRC-01 내 H16-7.8mcMMAF와 비교한 H16-7.8의 효능 연구
다른 실험에서, 인간 신장암 세포 SKRC-01(마우스 당 0.8 x 106 세포)를 개개의 마우스의 옆구리에 주사하였다. 종양을 그것들이 대략 100mm3의 부피에 도달할 때까지 처리하지 않고 성장시켰다. 제0일에 종양이 100mm3에 도달하였을 때, 동물을 다음의 코호트에 무작위로 할당하였다: H16-7.8mcMMAF 처리군, H16-7.8 처리군 및 5% 덱스트로스 대조군. H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8을 정맥 볼루스 주사에 의해 총 4회 투여 동안 4일 마다 4mg/kg을 투여하였다. 투여한H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8의 양은 투여 바로 전 얻은 각 동물의 개개의 체중을 기준으로 하였다. 5% 덱스트로스 대조군에는 동물 당 150μL를 투여하였다. 3일 내지 4일 마다 캘리퍼 측정을 사용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 종양 부피를 폭2 x 길이/2로 계산하였고, 폭은 가장 작은 치수이며, 길이는 가장 큰 것이다.
결과는 ADC H16-7.8mcMMAF가 (단일 투여를 포함하는) 모든 투여량에서 KRC-01 종양 형성의 성장을 상당히 억제한 반면 네이키드 MAb H16-7.8는 효과가 없음을 나타낸다. 따라서, ADC H16-7.8mcMMAF는 네이키드 H16-7.8보다 상당히 더 현저한 효과를 가진다(도 12).
SCID 마우스에서 피하 확립된 UG-K3 내 다른 161P2F10B 항체 약물 컨쥬게이트와 비교한 H16-7.8mcMMAF의 효능 연구
다른 실험에서, 인간 신장암 세포 UG-K3(1.5 x 106 세포/마우스)을 수컷 SCID마우스 옆구리에 주사하였다. 종양을 그것들이 대략 100mm3의 부피에 도달할 때까지 처리하지 않고 성장시켰다. 제0일에 종양이 100mm3에 도달하였을 때, 동물을 다음의 코호트에 무작위로 할당하였다: H16-7.8mcMMAF, H16-7.8vcMMAE, 및 H16-1.11mcMMAF, 및 H16-1.11vcMMAE, PBS 대조군, 및 대조군 MAb-vcMMAE 처리군. 모든 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 제0일에 1회 10mg/kg으로 투여하였다. 투여한 각 ADC의 양은 투여 바로 전 얻은 각 동물의 개개의 체중을 기준으로 하였다. PBS 대조군에는 동물 당 150 μ/L를 투여하였다. 종양 성장을 3일 내지 4일 마다 캘리퍼 측정을 사용하여 모니터링하였다. 종양 부피를 폭2 x 길이/2로 계산하였고, 폭은 가장 작은 치수이며, 길이는 가장 큰 것이다.
결과는 ADC H16-7.8vcMMAE 및 H16-1.11vcMMAE이 종양 성장을 억제하지 않았다는 것을 나타낸다. 추가적으로, H16-7.8mcMMAF 및 H16-1.11mcMMAF는 처음 30일 동안 UG-K3 종양 형성의 성장을 상당히 억제하였다. 30일 후 H16-7.8mcMMAF는 H16-1.11mcMMAF와 비교하였을 때 상당히 더 현저한 효과를 가졌다(도 13).
실시예 8 161 P2F10B ADC 의 사용을 통한 인간 암의 치료 및 진단을 위한 인간 임상 시험
특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 161P2F10B ADC 를 사용하고, 특정 종양, 바람직하게는 표 I에 열거된 것들의 치료에 사용한다. 이러한 각각의 지시와 관련하여 두 가지 임상적 접근법이 성공적으로 추구된다.
I.) 애주번트 치료: 애주번트 치료에서, 환자는 화학적 치료 또는 항-종양성 약제 및/또는 방사선 치료 또는 이들의 결합과 조합하여 161P2F10B ADC로 처리된다. 표 I에 열거된 것과 같은 일차 암 타겟을 161P2F10B ADC을 표준 첫째 및 둘째행 치료에 부가하는 것에 의하여 표준 프로토콜하에서 처리하였다. 다음의 실시예에서 검토된 바와 같이, 프로토콜 디자인이 표준 화학치료 및 다른 생물학적 약제의 일반적 투여량을 감소시키는 능력뿐만 아니라, 일차 또는 전이성 병변의 암 질량 감소, 증가된 자유 생존 발전, 전체적 생존, 환자 건강의 개선, 질병 안정화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 효과를 다룬다. 이러한 투여량의 감소는 화학치료 또는 생물학적 약제의 투여량 관련 독성을 감소시킴에 의하여 추가되고/추가되거나 연장된 치료를 허용한다. 161P2F10B ADC는 화학치료적 또는 항-종양성 약제와 조합하여 수개의 보조적 임상 시험에서 활용된다.
II.) 단독 치료: 종양의 단일 치료법에서 161P2F10B ADC의 사용과 관련하여, 화학치료적 또는 항-종양성 약제 없이 161P2F10B ADC를 환자에게 투여한다. 일 구현예에서 단독 치료는 광범위한 전이성 질병을 가진 말기-단계 환자에게 임상적으로 수행된다. 다음의 실시예에서 검토된 바와 같이, 프로토콜 디자인이 표준 화학치료 및 다른 생물학적 약제의 일반적 투여량을 감소시키는 능력뿐만 아니라, 일차 또는 전이성 병변의 암 질량 감소, 증가된 자유 생존 발전, 전체적 생존, 환자 건강의 개선, 질병 안정화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 효과를 다룬다.
투약량
투여 계획은 최적화된 목적하는 반응을 제공하기 위하여 조절될 수 있다. 예를 들어 1회의 볼루스(bolus)로 투여할 수도 있고, 수개의 분할된 투여량을 시간에 걸쳐 투여할 수도 있고, 또는 치료적 상황의 위급함에 의해 지시되는 바에 따라 비례하여 투여량을 감소 또는 증가시킬 수도 있다. 투여의 용이함 및 투약의 일정함을 위하여 비경구적 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것은 특히 유익하다. 본 명세서에서 사용되는 투여 단위 형태란 치료하고자 하는 포유류 대상체를 위한 단일 투약으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미한다; 각각의 단위는 목적하는 치료적 효과를 발생시키기 위하여 계산된, 활성 화합물의 미리 정해진 양을 요구되는 약제학적 담체와 함께 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태의 세목은 (a) 항체의 특유한 성질 및 달성하고자 하는 특정 치료적 또는 예방적 효과 및 (b) 개인에 있어 민감성의 치료를 위한 상기 활성 화합물을 조합하는 기술 분야의 고유한 제한에 의해 지시되고, 직접적으로 의존한다.
본 발명에 따라 조합하여 투여되는 161P2F10B ADC 의 치료적 유효량의 예시적이고, 제한되지 않은 범위는 약 0.5mg/kg 내지 약 10mg/kg, 약 1mg/kg 내지 약 5mg/kg, 적어도 1mg/kg, 적어도 2mg/kg, 적어도 3mg/kg, 또는 적어도 4mg/kg이다. 다른 예시적이고 제한되지 않은 범위는 예컨대 약 0.5mg/kg 내지 약 5mg/kg, 또는 예컨대 약 0.8mg/kg 내지 약 5mg/kg, 또는 예컨대 약 1mg/kg 내지 약 7.5mg/kg이다. 본 발명의 높은 투여량의 구현에는 10mg/kg 초과의 투여량과 관련된다. 투여량 값은 완화시키고자 하는 상태의 종류 및 심각성에 따라 변할 수 있으며, 단일 또는 다수의 투여량을 포함할 수 있음을 주목할 것이다. 더 나아가, 특정 대상체에 대하여 특정한 투여량 계획은 개인의 요구 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 자의 전문적인 판단에 따라 시간에 걸쳐 조절되어야 하고, 본 명세서에서 기술된 투여량 범위는 오직 예시적인 것이며, 청구된 조성물의 범위 또는 활용을 제한하고자 하는 의도가 아니라는 것이 이해될 것이다.
임상적 진행 계획(CDP)
CDP는 애주번트 치료 또는 단독 치료와 관련한 161P2F10B ADC의 처리를 따르고 발전시킨다. 초기에, 임상전 독성 연구를 당업계에 알려진 표준 프로토콜을 사용하여 비인간 피험자(예를 들어, 마우스, 원숭이 등)에서 수행한다. H16-7.8mcMMAF는 비인간 독성 연구에서 잘 견뎌진다는 것을 증명하였다. 인간 임상시험은 처음으로 안전성을 증명하였고, 그 이후의 반복 투여에서 효능을 확인하였다. 시험은 표준 화학치료와 표준 치료 + 161P2F10B ADC를 비교하는 개방 표지(open label) 시험이다. 인식될 바와 같이 환자 등록과 관련되어 이용될 수 있는 비 제한적 기준은 생검에 의해 결정되는 바와 같은 그들의 종양에서 161P2F10B 발현 수준이다.
임의의 단백질 또는 항체 주입 기반 치료로, 안전성은 (i) 사이토카인 방출 증후군, 즉, 저혈압, 열, 떨림, 오한; (ii) 물질에 대한 면역원성 반응의 진행(즉, 항체 치료, 또는 HAHA 반응에 대해 환자에 의한 인간 항체의 발생); 및 (iii) 161P2F10B을 발현하는 정상 셀에 대한 독성과 일차적으로 관련된다. 표준 시험 및 팔로업을 이용하여 상기 안전성각각을 모니터링한다. 161P2F10B MAb은 인간 투여시 안전한 것으로 발견된다.
실시예 9 H16 -7.8 MAb 특성화의 항체 약물 컨쥬게이션
I) 질량 스펙트럼에 의한 펩티드 맵핑
펩티드 맵핑 분석을 수행하였다. 이 방법은 H16-7.8mcMMAF의 아이덴티티(identity) 확인 및 천연 항체(H16-7.8) 구별을 위해 사용된다. 얻은 H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8을 다이티오트레이톨(DTT)로 처리하여 이황화 결합을 환원시킨 후 결과 유리 시스테인을 알킬화한다. 이 단계에서 구아니딘을 사용하여 단백질의 완전한 변성을 보장하였다. 구아니딘을 제거하기 위한 투석 후, 샘플을 특이적 엔도프로테이나제, Lys-C로 분해하였다. Lys-C는 리신 잔기의 C-말단 측 상의 펩티드 결합을 절단한다. 결과 펩티드를 질량 분석법과 결합한 역상 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 역상 체류시간 및 피크의 관찰한 질량 대 전하 비를 H16-7.8mcMMAF와 H16-7.8 간에 비교하였다. LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 스팩트럼) 분석을 WATERS Q-TOFp 질량 분석기와 결합한 WATERS Acquity UPLC를 사용하여 수행하였다. 분해 샘플을 YMC C18 컬럼에 적용하고 트리플루오로 아세트산을 함유하는 아세토니트릴 구배로 용리하였다. H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8에 대한 대표적인 펩티드 맵을 도 14에 나타낸다.
도 14의 모든 3개의 크로마토그램은 별표 및 화살표로 표시한 피크를 제외하고 동일하다. 도면에서 나타내는 바와 같이, 별표로 표시한 피크 강도는 천연 항체와 비교하여 컨쥬게이트된 항체에서 감소되었다. 화살표로 표시한 피크는 컨쥬게이트된 항체 펩티드 맵에서 나타난 새로운 피크를 나타낸다. 구체적으로 별표 및 화살표 중 하나로 표시한 피크들은 각각 컨쥬게이트될 펩티드와 얻어진 컨쥬게이트 펩디드라고 생각된다.. 도 15는 별표로 표시한 피크의 질량 스펙트럼의 일부를 나타낸다. 컨쥬게이션 동안 변화된 신호의 질량 값은 +" 표시로 나타낸다. 대략 970.4 (+3 하전 상태)의 m/z를 가지는 이 펩티드를 중쇄의 힌지영역으로부터 유래되며 예상 컨쥬게이션 자리를 함유하는 C225-K250로 확인하였다.
상기 도 14에서 컨쥬게이트된 펩티드인 것으로 믿어지는 새로 나타난 피크를 확인하기 위하여, 상승 에너지(MSE) 데이터 취득 기법을 사용하여 LC-MS분석을 수행하였다. 도 16은 619.4의 m/z를 사용하여 H16-7.8mcMMAF 및 H16-7.8의 펩티드 맵에 대해 추출된 이온 크로마토그램(XIC)을 나타낸다. 이 이온은 약물 모이어티의 단편 이온에 대응한다. 619.4에서 XIC의 관찰된 피크는 도 14의 화살표로 표시한 피크와 거의 동일하다. 더 나아가, 이러한 피크는 천연 항체의 크로마토그램에서 검출되지 않았다. 이 관찰은 619.4의 m/z에서 XIC의 검출 피크는 명백하게 약물 컨쥬게이트된 펩티드이며, 그것의 무결함 질량 값에 의해 확인된다는 것을 제안한다. 결과를 표 V에 요약하였다. 이 결과는 컨쥬게이트의 경우, 현저한 펩티드는 중쇄의 힌지 영역 상의 2가지 약물에 컨쥬게이트된 것이라는 것을 나타낸다. 이 데이터는 DAR 분석과 같은 다른 정위로 얻은 데이터와 일치한다.
II) LC-MS에 의한 무결함 질량 분석
탈글리코실화된 H16-7.8mcMMAF의 전체 질량을 전자 분무 이온화 비행시간형 분석(electrospray ionization time-of-flight : ESI-TOF) 질량 스펙트럼에 의해 결정하였다. 시험 샘플을 250mm 인산 나트륨 완충제로, pH 7.5로 희석한 다음 37℃에서 밤새 글리코펩티다제 F와 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 PLRPTM 컬럼(Varian Technology)에 주입하였고, 90℃에서 평형상태로 만든 다음, 아세토니트릴/물 구배로 용리하였다. 샘플 피크를 WATERS Synapt 질량 분석기(Waters)와 결합한 Acquity UPLC 시스템으로 분석하였고 MaxEnt1 소프트웨어에 의해 원 데이터로부터 재구성하였다. 탈글리코실화된 H16-7.8mcMMAF 에 대한 예시적 질량 스펙트럼 프로파일을 도 17에서 나타낸다. 현저한 약물 컨쥬게이트된 항체는 4-약물 부하 종이었다. H16-7.8mcMMAF에서 컨쥬게이트되지 않는 항체의 풍부함을 포함하는 이런 관찰은 다른 정위적 방법, 예컨대 RP-HPLC에 의한 DAR, 펩티드 맵핑, 및 HIC 분석에 의해 얻은 결과와 일치하였다.
III) RP-HPLC에 의한 약물 대 항체 비(DAR) 분석
각 경쇄 및 중쇄의 약물 부하의 상대적 양의 정량적 HPLC 결정을 위해 DAR 분석을 수행하였다. PLRP-S 분석 컬럼(2.1mm × 50mm), 2.0% 포름산으로 이루어진 이동상A 및 2.0% 포름산 + 90% 아세토니트릴로 이루어진 이동상 B를 사용하여 DAR 분석을 수행하였다. 샘플 제조를 위해, 약물 컨쥬게이트된 항체를 DTT에 의해 완전히 환원시킨 다음 H 쇄 약물 부하량을 기준으로 L쇄, 약물 컨쥬게이트된 L쇄, H쇄 및 약물 컨쥬게이트된 H쇄로 분리하였다. 50μg의 샘플을 0.5ml/분의 유속, 280nm에서 검출을 사용하여 용리하였다. 약물 대 항체 비(DAR)의 몰 비는 하기 식으로 정의한다.
Figure 112012072574899-pct00048
여기서
DAR - 약물 대 항체 몰 비
n - Ab 쇄 당 mcMMAF의 수
AUCLight,n, AUCHeavy,n - 각각 n개 약물에 의한 경쇄 또는 중쇄 항체에 대한 곡선하 면적;
AUCTotal, Light(Heavy) - 경쇄 또는 중쇄의 곡선하 피크 면적.
이 방법은 H16-7.8mcMMAF의 물질을 사용하여 정성화하였다. 평가한 변수는 특이성, 정확성, 반복 가능성, 중간체 정확성을 포함하였다. H16-7.8mcMMAF에 대한 대표적인 DAR 프로파일은 도 18에 나타낸다. DAR 값은 4.0이다. 샘플을 이 방법의 동일한 HPLC 조건을 사용하는 LC-MS 분석을 받게하여 관찰 피크를 확인하였다. 결과를 표 VI에 요약한다. 이 방법의 정성화 동안 얻은 DAR 결과의 피크 확인은 정위로 LC-MS로 확인하였다.
IV) 결합 친화도
H16-7.8 및 H16-7.8mcMMAF를 KU812 세포 상에서 발현한 161P2F10B에 대한 그것들의 결합 친화도에 대해 시험하였다(인간 만성 골수성 백혈병, ATCC). 간략하게 H16-7.8 또는 H16-7.8mcMMAF의 12개의 희석물을 KU812 세포(웰 당 50,000 세포)와 함께 밤새 4℃에서 160nM 내지 0.004nM의 최종 농도로 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 마지막에, 세포를 세척하였고, 항- hIgG-PE 검출 항체와 함께 45분 동안 4℃에서 인큐베이션한다. 미결합 검출 항체를 세척한 후, 세포를 FACS로 분석한다.
MFI 값을 Graphpad Prisim 소프트웨어에 입력하였고, Y=Bmax*X/(Kd+X)의 한 자리 결합(쌍곡선) 방정식을 사용하여 분석하여H16-7.8 또는 H16-7.8mcMMAF 포화 곡선을 만들었다. Bmax는 KU812에 대한 H16-7.8 또는 H16 7.8mcMMAF의 최대 결합에서 MFI 값이고; Kd는 절반의 최대 결합에 필요한 H16-7.8 또는 H16-7.8mcMMAF의 농도인 H16-7.8 또는 H16-7.8mcMMAF 결합 친화도이다. Ku812 세포의 표면 상에서 발현된 161P2F10B 상에서 H16-7.8 및 H16-7.8mcMMAF의 계산된 친화도(Kd)는 각각 0.08nM 및 0.25nM이다(n=4).
V) 세포 독성
H16-7.8, H16-7.8mcMMAF 및 음성 대조군 ADC를 별개로 단계 희석시키고, KU812 세포를 함유하는 96-웰 플레이트에 첨가하여, 세포 표면 상에서 내인성으로 161P2F10B을 발현시켰다. 인큐베이션 6일 후, Alamar Blue® 시약을 항체-세포 혼합물에 첨가한다. AlamarBlue®는 레자주린을 형광성 분자인 레조루핀으로 전환시키는 살아있는 세포의 천연 환원력을 사용하는 세포 생존도 인디케이터이다. 레자주린은 레조루핀으로 환원되며, 이는 매우 밝은 적색 형광을 만든다. 살아있는 세포는 계속하여 레자주린을 레조루핀으로 전환하고, 따라서 생존도-및 세포독성의 정량적 측정을 만든다. H16-7.8mcMMAF의 세포독성 %는 Synergy 4 Hybrid Multi-Mode Microplate 판독기(540/35, 620/40nm)를 사용하여 스펙트럼으로 얻은 형광 단위를 사용하여 평가한다. 분석의 선형 범위는 대략 3.9ng/ml 내지 1000ng/ml이다. 표준 곡선에 9개 점이 있다: H16-7.8mcMMAF의 가장 높은 농도는 1000ng/ml이며, 다음으로 8개의 연속 1:2 희석물 및 블랭크(0)이다.
이하의 식을 사용하여 생존%를 계산한다:
생존% = (X - 블랭크) / (미처리 - 블랭크) x 100
KU812 세포 상의 H16-7.8mcMMAF의 특이적 세포독성 활성: IC50 0.15nM.
H16-7.8 및 ADC 대조군(항체(비-항-161P2F10B 항체)-mcMMAF)는 KU812 세포 상에서 세포독성 활성을 가지지 않았다.
본 발명 전반에 걸쳐, 다양한 웹사이트 데이터 내용, 간행물, 특허 출원 및 특허문헌들이 참고되었다(웹사이트는 월드 와이드 웹상에 주소를 가지고 Uniform Resource Locator 또는 URL에 의하여 참고된다). 상기의 각각의 참고 문헌에서 개시된 내용은 그 전체가 참조로서 본 출원에 통합된다.
본 발명은 본 발명의 개별적 측면의 하나의 예로서 의도된 본 명세서에 기재된 구체적인 예에 의하여 제한되지 않으며, 이와 기능적으로 균등하다고 생각되는 모든 것은 본 발명의 범위 내이다. 본 명세서에 기재된 것에 추가하여, 본 발명의 모델 및 방법에 대한 다양한 변형은 앞서 기술하고 교시한 것으로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 자에게는 명백할 것이고, 본 발명의 범위 내에 속하게 된다. 그러한 변형 또는 기타의 구체예들은 본 발명의 진정한 범위와 사상으로부터 벗어나지 않고 수행될 수 있다.
표
표 I: 악성종양일 때 161 P2F10B 를 발현시키는 조직.
신장
결장
폐
난소
유방
림프종
뼈
자궁
췌장
간
전립선
표 II : 아미노산 약어
Figure 112012072574899-pct00049

표 III : 아미노산 치환 매트릭스
GCG 소프트웨어 9.0 BLOSUM62 아미노산 치환 매트릭스 (블록 치환 매트릭스)로부터의 적합화. 더 높은 값은 관련된 천연 단백질에서 발견되는 치환의 가능성이 더 높다.
Figure 112012072574899-pct00050

표 IV : Ku812 세포 상의 FACS MFI 값
Figure 112012072574899-pct00051

표 V: 약물 컨쥬게이트된 펩티드 상에서 피크 확인 결과의 용액, 잠재적 컨쥬게이션 자리(시스테인 잔기)는 볼드체로 설명하고 밑줄표시 한다.
Figure 112012072574899-pct00052

표 VI : LC - MS 에 의한 DAR 분석의 피크 확인 결과
Figure 112012072574899-pct00053

표 VII : mcMMAF 의 합성 반응식
Figure 112012072574899-pct00054
SEQUENCE LISTING <110> AGENSYS, INC. TORGOV, Michael MORRISON, Robert Kendall JAKOBOVITS, Aya GUDAS, Jean AN, Zili <120> ANTIBODY DRUG CONJUGATES (ADC) THAT BIND TO 161P2F10B PROTEINS <130> 511582006274 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 61/302,489 <151> 2010-02-08 <160> 12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 3858 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)...(3858) <223> 161P2F10B variant 2 <220> <221> CDS <222> (44)...(2671) <400> 1 ctactttatt ctgataaaac aggtctatgc agctaccagg aca atg gaa tct acg 55 Met Glu Ser Thr 1 ttg act tta gca acg gaa caa cct gtt aag aag aac act ctt aag aaa 103 Leu Thr Leu Ala Thr Glu Gln Pro Val Lys Lys Asn Thr Leu Lys Lys 5 10 15 20 tat aaa ata gct tgc att gtt ctt ctt gct ttg ctg gtg atc atg tca 151 Tyr Lys Ile Ala Cys Ile Val Leu Leu Ala Leu Leu Val Ile Met Ser 25 30 35 ctt gga tta ggc ctg ggg ctt gga ctc agg aaa ctg gaa aag caa ggc 199 Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys Leu Glu Lys Gln Gly 40 45 50 agc tgc agg aag aag tgc ttt gat gca tca ttt aga gga ctg gag aac 247 Ser Cys Arg Lys Lys Cys Phe Asp Ala Ser Phe Arg Gly Leu Glu Asn 55 60 65 tgc cgg tgt gat gtg gca tgt aaa gac cga ggt gat tgc tgc tgg gat 295 Cys Arg Cys Asp Val Ala Cys Lys Asp Arg Gly Asp Cys Cys Trp Asp 70 75 80 ttt gaa gac acc tgt gtg gaa tca act cga ata tgg atg tgc aat aaa 343 Phe Glu Asp Thr Cys Val Glu Ser Thr Arg Ile Trp Met Cys Asn Lys 85 90 95 100 ttt cgt tgt gga gag acc aga tta gag gcc agc ctt tgc tct tgt tca 391 Phe Arg Cys Gly Glu Thr Arg Leu Glu Ala Ser Leu Cys Ser Cys Ser 105 110 115 gat gac tgt ttg cag agg aaa gat tgc tgt gct gac tat aag agt gtt 439 Asp Asp Cys Leu Gln Arg Lys Asp Cys Cys Ala Asp Tyr Lys Ser Val 120 125 130 tgc caa gga gaa acc tca tgg ctg gaa gaa aac tgt gac aca gcc cag 487 Cys Gln Gly Glu Thr Ser Trp Leu Glu Glu Asn Cys Asp Thr Ala Gln 135 140 145 cag tct cag tgc cca gaa ggg ttt gac ctg cca cca gtt atc ttg ttt 535 Gln Ser Gln Cys Pro Glu Gly Phe Asp Leu Pro Pro Val Ile Leu Phe 150 155 160 tct atg gat gga ttt aga gct gaa tat tta tac aca tgg gat act tta 583 Ser Met Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu Tyr Thr Trp Asp Thr Leu 165 170 175 180 atg cca aat atc aat aaa ctg aaa aca tgt gga att cat tca aaa tac 631 Met Pro Asn Ile Asn Lys Leu Lys Thr Cys Gly Ile His Ser Lys Tyr 185 190 195 atg aga gct atg tat cct acc aaa acc ttc cca aat cat tac acc att 679 Met Arg Ala Met Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Thr Ile 200 205 210 gtc acg ggc ttg tat cca gag tca cat ggc atc att gac aat aat atg 727 Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Asn Met 215 220 225 tat gat gta aat ctc aac aag aat ttt tca ctt tct tca aag gaa caa 775 Tyr Asp Val Asn Leu Asn Lys Asn Phe Ser Leu Ser Ser Lys Glu Gln 230 235 240 aat aat cca gcc tgg tgg cat ggg caa cca atg tgg ctg aca gca atg 823 Asn Asn Pro Ala Trp Trp His Gly Gln Pro Met Trp Leu Thr Ala Met 245 250 255 260 tat caa ggt tta aaa gcc gct acc tac ttt tgg ccc gga tca gaa gtg 871 Tyr Gln Gly Leu Lys Ala Ala Thr Tyr Phe Trp Pro Gly Ser Glu Val 265 270 275 gct ata aat ggc tcc ttt cct tcc ata tac atg cct tac aac gga agt 919 Ala Ile Asn Gly Ser Phe Pro Ser Ile Tyr Met Pro Tyr Asn Gly Ser 280 285 290 gtc cca ttt gaa gag agg att tct aca ctg tta aaa tgg ctg gac ctg 967 Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Ser Thr Leu Leu Lys Trp Leu Asp Leu 295 300 305 ccc aaa gct gaa aga ccc agg ttt tat acc atg tat ttt gaa gaa cct 1015 Pro Lys Ala Glu Arg Pro Arg Phe Tyr Thr Met Tyr Phe Glu Glu Pro 310 315 320 gat tcc tct gga cat gca ggt gga cca gtc agt gcc aga gta att aaa 1063 Asp Ser Ser Gly His Ala Gly Gly Pro Val Ser Ala Arg Val Ile Lys 325 330 335 340 gcc tta cag gta gta gat cat gct ttt ggg atg ttg atg gaa ggc ctg 1111 Ala Leu Gln Val Val Asp His Ala Phe Gly Met Leu Met Glu Gly Leu 345 350 355 aag cag cgg aat ttg cac aac tgt gtc aat atc atc ctt ctg gct gac 1159 Lys Gln Arg Asn Leu His Asn Cys Val Asn Ile Ile Leu Leu Ala Asp 360 365 370 cat gga atg gac cag act tat tgt aac aag atg gaa tac atg act gat 1207 His Gly Met Asp Gln Thr Tyr Cys Asn Lys Met Glu Tyr Met Thr Asp 375 380 385 tat ttt ccc aga ata aac ttc ttc tac atg tac gaa ggg cct gcc ccc 1255 Tyr Phe Pro Arg Ile Asn Phe Phe Tyr Met Tyr Glu Gly Pro Ala Pro 390 395 400 cgc atc cga gct cat aat ata cct cat gac ttt ttt agt ttt aat tct 1303 Arg Ile Arg Ala His Asn Ile Pro His Asp Phe Phe Ser Phe Asn Ser 405 410 415 420 gag gaa att gtt aga aac ctc agt tgc cga aaa cct gat cag cat ttc 1351 Glu Glu Ile Val Arg Asn Leu Ser Cys Arg Lys Pro Asp Gln His Phe 425 430 435 aag ccc tat ttg act cct gat ttg cca aag cga ctg cac tat gcc aag 1399 Lys Pro Tyr Leu Thr Pro Asp Leu Pro Lys Arg Leu His Tyr Ala Lys 440 445 450 aac gtc aga atc gac aaa gtt cat ctc ttt gtg gat caa cag tgg ctg 1447 Asn Val Arg Ile Asp Lys Val His Leu Phe Val Asp Gln Gln Trp Leu 455 460 465 gct gtt agg agt aaa tca aat aca aat tgt gga gga ggc aac cat ggt 1495 Ala Val Arg Ser Lys Ser Asn Thr Asn Cys Gly Gly Gly Asn His Gly 470 475 480 tat aac aat gag ttt agg agc atg gag gct atc ttt ctg gca cat gga 1543 Tyr Asn Asn Glu Phe Arg Ser Met Glu Ala Ile Phe Leu Ala His Gly 485 490 495 500 ccc agt ttt aaa gag aag act gaa gtt gaa cca ttt gaa aat att gaa 1591 Pro Ser Phe Lys Glu Lys Thr Glu Val Glu Pro Phe Glu Asn Ile Glu 505 510 515 gtc tat aac cta atg tgt gat ctt cta cgc att caa cca gca cca aac 1639 Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Arg Ile Gln Pro Ala Pro Asn 520 525 530 aat gga acc cat ggt agt tta aac cat ctt ctg aag gtg cct ttt tat 1687 Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Val Pro Phe Tyr 535 540 545 gag cca tcc cat gca gag gag gtg tca aag ttt tct gtt tgt ggc ttt 1735 Glu Pro Ser His Ala Glu Glu Val Ser Lys Phe Ser Val Cys Gly Phe 550 555 560 gct aat cca ttg ccc aca gag tct ctt gac tgt ttc tgc cct cac cta 1783 Ala Asn Pro Leu Pro Thr Glu Ser Leu Asp Cys Phe Cys Pro His Leu 565 570 575 580 caa aat agt act cag ctg gaa caa gtg aat cag atg cta aat ctc acc 1831 Gln Asn Ser Thr Gln Leu Glu Gln Val Asn Gln Met Leu Asn Leu Thr 585 590 595 caa gaa gaa ata aca gca aca gtg aaa gta aat ttg cca ttt ggg agg 1879 Gln Glu Glu Ile Thr Ala Thr Val Lys Val Asn Leu Pro Phe Gly Arg 600 605 610 cct agg gta ctg cag aag aac gtg gac cac tgt ctc ctt tac cac agg 1927 Pro Arg Val Leu Gln Lys Asn Val Asp His Cys Leu Leu Tyr His Arg 615 620 625 gaa tat gtc agt gga ttt gga aaa gct atg agg atg ccc atg tgg agt 1975 Glu Tyr Val Ser Gly Phe Gly Lys Ala Met Arg Met Pro Met Trp Ser 630 635 640 tca tac aca gtc ccc cag ttg gga gac aca tcg cct ctg cct ccc act 2023 Ser Tyr Thr Val Pro Gln Leu Gly Asp Thr Ser Pro Leu Pro Pro Thr 645 650 655 660 gtc cca gac tgt ctg cgg gct gat gtc agg gtt cct cct tct gag agc 2071 Val Pro Asp Cys Leu Arg Ala Asp Val Arg Val Pro Pro Ser Glu Ser 665 670 675 caa aaa tgt tcc ttc tat tta gca gac aag aat atc acc cac ggc ttc 2119 Gln Lys Cys Ser Phe Tyr Leu Ala Asp Lys Asn Ile Thr His Gly Phe 680 685 690 ctc tat cct cct gcc agc aat aga aca tca gat agc caa tat gat gct 2167 Leu Tyr Pro Pro Ala Ser Asn Arg Thr Ser Asp Ser Gln Tyr Asp Ala 695 700 705 tta att act agc aat ttg gta cct atg tat gaa gaa ttc aga aaa atg 2215 Leu Ile Thr Ser Asn Leu Val Pro Met Tyr Glu Glu Phe Arg Lys Met 710 715 720 tgg gac tac ttc cac agt gtt ctt ctt ata aaa cat gcc aca gaa aga 2263 Trp Asp Tyr Phe His Ser Val Leu Leu Ile Lys His Ala Thr Glu Arg 725 730 735 740 aat gga gta aat gtg gtt agt gga cca ata ttt gat tat aat tat gat 2311 Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Ile Phe Asp Tyr Asn Tyr Asp 745 750 755 ggc cat ttt gat gct cca gat gaa att acc aaa cat tta gcc aac act 2359 Gly His Phe Asp Ala Pro Asp Glu Ile Thr Lys His Leu Ala Asn Thr 760 765 770 gat gtt ccc atc cca aca cac tac ttt gtg gtg ctg acc agt tgt aaa 2407 Asp Val Pro Ile Pro Thr His Tyr Phe Val Val Leu Thr Ser Cys Lys 775 780 785 aac aag agc cac aca ccg gaa aac tgc cct ggg tgg ctg gat gtc cta 2455 Asn Lys Ser His Thr Pro Glu Asn Cys Pro Gly Trp Leu Asp Val Leu 790 795 800 ccc ttt atc atc cct cac cga cct acc aac gtg gag agc tgt cct gaa 2503 Pro Phe Ile Ile Pro His Arg Pro Thr Asn Val Glu Ser Cys Pro Glu 805 810 815 820 ggt aaa cca gaa gct ctt tgg gtt gaa gaa aga ttt 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ggaaggaaag aataaaagtt gatagctccc tgattgggaa aaaatgcaca 3181 attaataaag aatgaagatg aaagaaagca tgcttatgtt gtaacacaaa aaaaattcac 3241 aaacgttggt ggaaggaaaa cagtatagaa aacattactt taactaaaag ctggaaaaat 3301 tttcagttgg gatgcgactg acaaaaagaa cgggatttcc aggcataaag ttggcgtgag 3361 ctacagaggg caccatgtgg ctcagtggaa gacccttcaa gattcaaagt tccatttgac 3421 agagcaaagg cacttcgcaa ggagaagggt ttaaattatg ggtccaaaag ccaagtggta 3481 aagcgagcaa tttgcagcat aactgcttct cctagacagg gctgagtggg caaaatacga 3541 cagtacacac agtgactatt agccactgcc agaaacaggc tgaacagccc tgggagacaa 3601 gggaaggcag gtggtgggag ttgttcatgg agagaaagga gagttttaga accagcacat 3661 ccactggaga tgctgggcca ccagacccct cccagtcaat aaagtctggt gcctcatttg 3721 atctcagcct catcatgacc ctggagagac cctgatacca tctgccagtc cccgacagct 3781 taggcactcc ttgccatcaa cctgaccccc cgagtggttc tccaggctcc ctgccccacc 3841 cattcaggcc ggaattc 3858 <210> 2 <211> 875 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)...(875) <223> 161P2F10B variant 2 <400> 2 Met Glu Ser 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atc tat tac agt ggg agc acc tac tac aac ccg tcc ctc aag agt cga 294 Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg 75 80 85 gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aac cag ttc tcc ctg aag ctg 342 Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu 90 95 100 aac tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gtg ttt tac tgt gcg aga gtg 390 Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys Ala Arg Val 105 110 115 gct ata gtg act acg atc ccg ggc ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg 438 Ala Ile Val Thr Thr Ile Pro Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly 120 125 130 135 acc acg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc 486 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 140 145 150 ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg agc acc tcc gag agc aca gcg gcc ctg 534 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 155 160 165 ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg 582 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 170 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Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 Val Phe Tyr Cys Ala Arg Val Ala Ile Val Thr Thr Ile Pro Gly Gly 115 120 125 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 145 150 155 160 Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 165 170 175 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 180 185 190 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr 210 215 220 Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val 225 230 235 240 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 245 250 255 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 305 310 315 320 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 5 <211> 744 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)...(744) <223> H16-7.8 light chain <220> <221> CDS <222> (43)...(744) <400> 5 aggagtagaa aatgagcaaa actgacaagt caaggcagga ag atg ttg cca tca 54 Met Leu Pro Ser 1 caa ctc att ggg ttt ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc tcc agg ggt gaa 102 Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala Ser Arg Gly Glu 5 10 15 20 att gtg ctg act cag tct cca gac ttt cag tct gtg act cca aag gag 150 Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu 25 30 35 aaa gtc acc atc acc tgc cgg gcc agt cag agc att ggt att agc tta 198 Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ile Ser Leu 40 45 50 cac tgg tac cag cag aaa cca gat cag tct cca aag ctc ctc atc aag 246 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys 55 60 65 tat gct tcc cag tcc ttc tca ggg gtc ccc tcg agg ttc agt ggc agt 294 Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 70 75 80 gga tct ggg aca gat ttc acc ctc acc atc aat agc ctg gaa gct gaa 342 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu 85 90 95 100 gat gct gca acg tat tac tgt cat cag agt agg agt ttc ccg tgg acg 390 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Arg Ser Phe Pro Trp Thr 105 110 115 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cga act gtg gct gca cca 438 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 120 125 130 tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act 486 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 135 140 145 gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa 534 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 150 155 160 gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag 582 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 165 170 175 180 agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc 630 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 185 190 195 acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc 678 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 200 205 210 tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc 726 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 215 220 225 aac agg gga gag tgt tag 744 Asn Arg Gly Glu Cys 230 <210> 6 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)...(233) <223> H16-7.8 light chain <400> 6 Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val 20 25 30 Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Gly Ile Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser 85 90 95 Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Arg Ser 100 105 110 Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 7 <211> 468 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)...(468) <223> H16-7.8 heavy chain <400> 7 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 Val Phe Tyr Cys Ala Arg Val Ala Ile Val Thr Thr Ile Pro Gly Gly 115 120 125 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 145 150 155 160 Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 165 170 175 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 180 185 190 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr 210 215 220 Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val 225 230 235 240 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 245 250 255 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 305 310 315 320 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 8 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)...(233) <223> H16-7.8 light chain <400> 8 Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val 20 25 30 Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Gly Ile Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser 85 90 95 Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Arg Ser 100 105 110 Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed light chain peptide <400> 9 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed heavy chain peptide <400> 10 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Gly Pro Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 <210> 11 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)...(369) <223> H16-7.8 heavy chain variable region <400> 11 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggatcatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgaactctgt gactgccgcg gacacggccg tgttttactg tgcgagagtg 300 gctatagtga ctacgatccc gggcggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 12 <211> 452 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)...(452) <223> H16-7.8 light chain variable region <400> 12 gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60 atcacctgcc gggccagtca gagcattggt attagcttac actggtacca gcagaaacca 120 gatcagtctc caaagctcct catcaagtat gcttcccagt ccttctcagg ggtcccctcg 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240 gaagatgctg caacgtatta ctgtcatcag agtaggagtt tcccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg ga 452

Claims (14)

  1. 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 161P2F10B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하며, 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호 7의 잔기 20 내지 142의 Vh 영역의 아미노산 서열 및 서열 번호 8의 잔기 20 내지 127의 Vl 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 또는 그것의 단편은 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)에 컨쥬게이트된 항체 약물 컨쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서, 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2 또는 Fv 단편인 항체 약물 컨쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, 항체는 완전한 인간 항체인 항체 약물 컨쥬게이트.
  4. 제1항에 있어서, 재조합적으로 생성된 항체 약물 컨쥬게이트.
  5. 약제학적 부형제 및 인간 단위 용량 형태로 제1항의 항체 약물 컨쥬게이트를 포함하는 암 치료용 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 대상체 내의 암세포 성장을 억제하기 위한, 제1항의 항체 약물 컨쥬게이트를 포함하는 조성물.
  9. 세포에 세포독성제 또는 진단제를 전달하는 것에 의하여 대상체 내의 암 세포의 성장을 억제하기 위한, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 161P2F10B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 단편에 컨쥬게이트된 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)를 포함하는 조성물로서,
    항체 또는 그것의 단편은 서열 번호 7의 잔기 20 내지 142의 Vh 영역의 아미노산 서열 및 서열 번호 8의 잔기 20 내지 127의 Vl 영역의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  10. 포유류에서 종양의 치료를 위한, 제1항의 항체 약물 컨쥬게이트를 포함하는 조성물.
  11. 방사선과의 조합으로 포유류에서 종양 성장을 감소시키기 위한, 제1항의 항체 약물 컨쥬게이트를 포함하는 조성물.
  12. 화학치료제와의 조합으로 포유류에서 종양 성장을 감소시키기 위한, 제1항의 항체 약물 컨쥬게이트를 포함하는 조성물.
  13. 약물 또는 생물학적으로 활성인 치료제와의 조합으로 포유류에서 종양 성장을 감소시키기 위한, 제1항의 항체 약물 컨쥬게이트를 포함하는 조성물.
  14. 화학치료제와의 조합으로 포유류에서 암의 치료를 위한, 제1항의 항체 약물 컨쥬게이트를 포함하는 조성물.
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