JP2017095459A - １６１ｐ２ｆ１０ｂタンパク質に結合する抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ） - Google Patents

１６１ｐ２ｆ１０ｂタンパク質に結合する抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ） Download PDF

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Abstract

【課題】特定のタンパク質に結合する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の提供。【解決手段】抗体またはその抗原結合断片を含む抗体薬物コンジュゲートであって、該抗体または該抗原結合断片が、特定のアミノ酸配列を含む１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質に特異的に結合し、該抗体が、ＶＨ領域およびのＶＬ領域のアミノ酸配列を含み、且つ、該抗体が、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）にマレイミドカプロイルをリンカーとして介してコンジュゲートされている、下式で表される抗体薬物コンジュゲート。好ましくは、前記抗体薬物コンジュゲートを含む薬学的組成物を、癌治療、特に腎癌又は肝癌に用いる方法。（ｐは１〜１２の整数）【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１０年２月８日に出願された米国仮特許出願第６１／３０２，４８９号の利益を主張する。この出願の内容は、本明細書によって全体として参照により援用される。
連邦政府助成研究のもとで行われた発明に対する権利に関する記載
該当なし。
ＥＦＳ−ＷＥＢ経由で提出された配列表に関する参照
ＭＰＥＰ§１７３０ ＩＩ．Ｂ．２（ａ）（Ｃ）に指定および規定されるとおりＵＳＰＴＯ ＥＦＳ−ＷＥＢサーバ経由で電子的に提出した以下の配列表の全内容は、あらゆる目的から全体として参照により本明細書に援用される。配列表は、以下のとおりの電子出願テキストファイルで確認される。
Figure 2017095459
発明の分野
本明細書に記載される発明は、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂと称されるタンパク質を結合する本発明の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。本発明はさらに、予後判定、予防および治療の方法、並びに癌の治療に有用な組成物に関する。
発明の背景
癌は冠疾患に次いで人の死亡原因の第２位である。世界中で毎年何百万人もの人が癌で死亡する。米国癌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ）の報告によると、米国だけでも癌が原因で死亡する人は毎年５０万人を優に上回り、年間１２０万例を超える症例が新たに診断されている。心疾患による死亡が大幅に減少しつつあるなか、癌によって引き起こされる死亡は概して増加傾向にある。次世紀の前半には、癌は死亡原因の第１位になることが予想される。
世界的に、死亡の主因として、いくつかの癌が突出している。ほぼ例外なく、癌腫による転移性疾患は致命的である。さらに、当初その原発性癌から生還している癌患者であっても、一般的な経験としてその生活が一変することが示されている。多くの癌患者が、再発または治療不奏効の可能性を意識することによって駆られる強い不安を覚える。多くの癌患者が治療後に身体的な衰弱を経験する。さらに、多くの癌患者が再発を経験する。
ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡおよび１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂなどのこれまでに同定されているマーカーは、前立腺癌の診断および治療に向けた取り組みを促進しているが、診断および治療法を改善するため、前立腺癌および関連する癌についてのさらなるマーカーおよび治療標的を同定することが必要とされている。
腎細胞癌（ＲＣＣ）は、米国における癌による主要な死亡原因として現在第１０位に位置している。米国では年間推定５１，１９０人が腎細胞癌と診断され、２００７年には約１２，８９０人がこの疾患により死亡した（米国癌協会）。歴史的に、治療は腎摘出術とそれに続く非特異的免疫療法、およびときに放射線療法に主眼が置かれている（Ｈａｕｋｅ，２００６）。非特異的免疫療法には、サイトカインのインターロイキン−２またはインターフェロン−αによる単剤としての、或いは併用での治療が含まれる。外科的に切除した後、患者の２０〜３０％は１〜３年以内に転移性疾患を、多くの場合に肺に発症する（Ｍｏｔｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００６）。転移性疾患を有する患者についての生存期間中央値は約１３ヶ月である（Ｃｏｈｅｎ ａｎｄ ＭｃＧｏｖｅｒｎ，２００５）。
２００５年以降、進行性腎細胞癌の治療用に６種の薬剤がＦＤＡの承認を受けている。これらの進展には、腎細胞癌に関与する特定の経路を標的とするいくつかの薬剤が含まれる。そのような薬剤としては、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）、ＦＤＡが２００５年１２月に承認）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、ＦＤＡが２００６年１月に承認）、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標）、ＦＤＡが２００７年５月に承認）、エベロリムス（Ａｆｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）、ＦＤＡが２００９年３月に承認）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、インターフェロンαとの併用、ＦＤＡが２００９年８月に承認）およびパゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標）ＦＤＡが２００９年１０月に承認）が挙げられる。しかしながら、治療の進展にも関わらず、転移性腎細胞癌は依然として不治であり、全生存における利益に基づき承認されたのはテムシロリムスのみであった。
加えて、肝細胞癌（すなわち、肝臓の癌）は全ての肝癌の８０〜９０％を占める。このタイプの肝癌は女性より男性に頻繁に生じる。これは通常、５０〜６０歳の人に見られる。概して、肝癌の治療は積極的な手術または肝移植であり、これらの治療は小さい腫瘍または成長が遅い腫瘍の治療について、それらが早期に診断される場合には奏効し得る。しかしながら、早期に診断を受ける患者は少ない。化学療法および放射線治療は通常は効果を有しない。しかしながらこれらの治療法を用いると腫瘍が小さくなり、従って手術が奏効する可能性が高まる。トシル酸ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））が現在肝癌患者に利用可能である。肝癌患者は通常予後が不良である。これは、手術を用いては肝細胞癌の１０〜２０％しか摘除できないためである。従って、肝癌の治療に使用される薬剤の開発が必要とされている。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の治療的有用性（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５））は実現されつつある。モノクローナル抗体は現在、移植、癌、感染症、心血管疾患および炎症における治療薬として承認されている。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有する。かかる機能の違いは、様々な免疫グロブリンアイソタイプの個別的な三次元構造に反映されている（Ｐ．Ｍ．Ａｌｚａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５５５−５８０（１９８８））。
マウスは免疫化に都合が良く、ほとんどのヒト抗原を異物と認識するため、潜在的治療能力のあるヒト標的に対するｍＡｂは、典型的にはマウス起源であった。しかしながら、マウスｍＡｂはヒト治療薬としては固有の欠点を有する。マウスｍＡｂは、ヒトにおけるｍＡｂの循環半減期がヒト抗体と比べて短いため、より頻繁な投与が必要となる。さらに重要なことに、マウス抗体をヒト免疫系に反復投与すると、ヒト免疫系がマウスタンパク質を異物として認識することにより反応し、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応が生じる。かかるＨＡＭＡ反応はアレルギー反応を引き起こし、その系からマウス抗体が急速に排除されるため、マウス抗体による治療が効かなくなる。かかる影響を回避するため、マウス内でヒト免疫系を作り出そうとする試みが図られている。
当初の試みは、ヒト配列を有する抗体を用いて抗原に応答する能力を有するトランスジェニックマウスを作り出そうとするものであったが（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６７０９−６７１３（１９８９）を参照のこと）、しかしながら利用可能なクローニング媒体で安定に維持し得るＤＮＡの量による限界があった。酵母人工染色体（ＹＡＣ）クローニングベクターの使用は、ヒトＩｇ遺伝子座の大型の生殖細胞系断片をトランスジェニック哺乳動物に導入する道を開いた。基本的にヒトゲノムで見られるのと同じ間隔で配列されたヒトＶ、Ｄ、およびＪ領域遺伝子の大部分並びにヒト定常領域が、ＹＡＣを使用してマウスに導入された。かかるトランスジェニックマウス系統の一つがＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスとして知られ、Ａｍｇｅｎ Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ ＣＡ）から市販されている。
本発明は、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質に結合する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、治療剤とコンジュゲートした完全ヒト抗体を含む。
本発明はさらに、様々な免疫原性組成物または治療組成物、例えば抗体薬物コンジュゲート、および癌、例えば表１に列挙された組織の癌の治療戦略を提供する。
本発明は以下に関する。
［１］抗体またはその抗原結合断片を含む抗体薬物コンジュゲートであって、該抗体または該抗原結合断片が、配列番号：２のアミノ酸配列を含む１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質に特異的に結合し、且つ、該抗体が、配列番号：７の２０位〜１４２位のＶＨ領域および配列番号：８の２０位〜１２７位のＶＬ領域のアミノ酸配列を含み、且つ該抗体がモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）にコンジュゲートされている、抗体薬物コンジュゲート。
［２］前記抗原結合断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２またはＦｖ断片である、［１］の抗体薬物コンジュゲート。
［３］前記抗体が完全ヒト抗体である、［１］の抗体薬物コンジュゲート。
［４］組換えにより産生される、［１］の抗体薬物コンジュゲート。
［５］ヒト単位用量形態の［１］の前記抗体薬物コンジュゲートを含む、薬学的組成物。
［６］癌治療のための、［５］の薬学的組成物。
［７］前記癌が腎癌または肝癌である、［６］の薬学的組成物。
［８］対象における癌細胞の成長を阻害する方法であって、［１］の抗体薬物コンジュゲートを該対象に投与するステップを含む、方法。
［９］細胞傷害剤または診断剤を細胞に送達する方法であって、以下のステップを含む方法：
抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートされているＭＭＡＦを供給して、抗体薬物コンジュゲートを形成するステップであって、該抗体または該抗原結合断片が、配列番号：２のアミノ酸配列を含む１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質に特異的に結合し、且つ、該抗体が、配列番号：７の２０位〜１４２位のＶＨ領域および配列番号：８の２０位〜１２７位のＶＬ領域のアミノ酸配列を含む、ステップ、並びに
該細胞を該抗体薬物コンジュゲートまたは抗体断片薬物コンジュゲートに曝露するステップ。
［１０］哺乳動物における腫瘍を治療する方法であって、有効量の［１］の抗体薬物コンジュゲートで該哺乳動物を治療するステップを含む、方法。
［１１］哺乳動物における腫瘍成長を低下させる方法であって、［１］の抗体薬物コンジュゲートと放射線との組み合わせの有効量で該哺乳動物を治療するステップを含む、方法。
［１２］哺乳動物における腫瘍成長を低下させる方法であって、［１］の抗体薬物コンジュゲートと化学療法剤との組み合わせの有効量で該哺乳動物を治療するステップを含む、方法。
［１３］哺乳動物における腫瘍成長を低下させる方法であって、［１］の抗体薬物コンジュゲートと薬物または生物学的に活性を有する治療法との組み合わせの有効量で該哺乳動物を治療するステップを含む、方法。
［１４］哺乳動物における癌を治療する方法であって、［１］の抗体薬物コンジュゲートと化学療法剤との組み合わせの有効量で該哺乳動物を治療するステップを含む、方法。
［１５］式Ｌ−（ＬＵ−Ｄ）ｐを有する、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）：式中、（ａ）Ｌは、抗体またはその抗原結合断片を含む抗体であり、該抗体または該抗原結合断片が、配列番号：２のアミノ酸配列を含む１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質に特異的に結合し、且つ、該抗体が、配列番号：７の２０位〜１４２位のＶＨ領域および配列番号８：の２０位〜１２７位のＶＬ領域のアミノ酸配列を含み；（ｂ）ＬＵはリンカーであり；（ｃ）Ｄは薬物成分であり、薬物がモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）であり；（ｄ）ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である。
［１６］以下の式を有する、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）：式中、Ａｂ−Ｓは、抗体またはその抗原結合断片を含む抗体であり、該抗体または該抗原結合断片が、配列番号：２のアミノ酸配列を含む１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質に特異的に結合し、且つ、該抗体が、配列番号：７の２０位〜１４２位のＶＨ領域および配列番号：８の２０位〜１２７位のＶＬ領域のアミノ酸配列を含み；ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である。
Figure 2017095459
［１７］抗体を含む抗体薬物コンジュゲートであって、該抗体が、配列番号：２のアミノ酸配列を含む１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質に特異的に結合し、且つ該抗体が、配列番号：７の２０位〜４６８位の重鎖および配列番号：８の２０位〜２３３位の軽鎖のアミノ酸配列を含み、且つ、該抗体がモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）にコンジュゲートされている、抗体薬物コンジュゲート。
［１８］式Ｌ−（ＬＵ−Ｄ）ｐを有する、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）：式中、（ａ）Ｌは、抗体を含む抗体であり、該抗体が、配列番号：２のアミノ酸配列を含む１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質に特異的に結合し、且つ、該抗体が、配列番号：７の２０位〜４６８位の重鎖および配列番号：８の２０位〜２３３位の軽鎖のアミノ酸配列を含み；（ｂ）ＬＵはリンカーであり；（ｃ）Ｄは薬物成分であり、薬物がモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）であり；（ｄ）ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である。
［１９］以下の式を有する、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）：式中、Ａｂ−Ｓは、抗体を含む抗体であり、該抗体が、配列番号：２のアミノ酸配列を含む１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質に特異的に結合し、且つ、該抗体が、配列番号：７の２０位〜４６８位の重鎖および配列番号：８の２０位〜２３３位の軽鎖のアミノ酸配列を含み；ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である。
Figure 2017095459
１６１Ｐ２Ｆ１０ＢのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を図１に示す。オープンリーディングフレームは終止コドンを含めて核酸４４位から２６７１位にまで及ぶ。 図１−０２は、図１−０１の続きを示す図である。 図１−０３は、図１−０２の続きを示す図である。 １６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体の核酸およびアミノ酸配列。図２Ａは、Ｈ１６−７．８重鎖のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列である。下線部はリーダー配列であり、二重下線部は重鎖可変領域である。破線下線部はヒトＩｇＧ２定常領域を示す。 １６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体の核酸およびアミノ酸配列。図２Ｂは、Ｈ１６−７．８軽鎖のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列である。下線部はリーダー配列であり、二重下線部は軽鎖可変領域である。破線下線部はヒトＩｇκ定常領域を示す。 １６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体のアミノ酸配列。図３Ａは、Ｈ１６−７．８重鎖のアミノ酸配列である。下線部はリーダー配列であり、二重下線部は重鎖可変領域である。破線下線部はヒトＩｇＧ２定常領域を示す。図３Ｂは、Ｈ１６−７．８軽鎖のアミノ酸配列である。下線部はリーダー配列であり、二重下線部は軽鎖可変領域である。破線下線部はヒトＩｇκ定常領域を示す。 ヒト生殖細胞系列に対するＨ１６−７．８抗体のアラインメント。図４Ａは、ヒト生殖細胞系列ＶＨ４−３１／Ｄ５−１２／ＪＨ６に対するＨ１６−７．８重鎖のアラインメントである。 ヒト生殖細胞系列に対するＨ１６−７．８抗体のアラインメント。図４Ｂは、ヒト生殖細胞系列Ａ２６／ＪＫ１に対するＨ１６−７．８軽鎖のアラインメントである。 ＣＨＯ細胞におけるＨ１６−７．８組換え発現。Ｈ１６−７．８重鎖および軽鎖配列を発現ベクターにクローニングした。ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。３Ｔ３−対照細胞および３Ｔ３−１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ細胞を、ハイブリドーマ細胞またはＣＨＯ細胞のいずれかに由来するＨ１６−７．８で染色した。結合をフローサイトメトリーで検出した。結果は、ＣＨＯ細胞において組換えにより発現させたＨ１６−７．８が分泌され、細胞表面１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに特異的に結合することを示している。 Ｈ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの細胞結合および親和性。Ｈ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦを、Ｋｕ８１２細胞で内因的に発現する１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに対する結合親和性について試験した。簡潔に言えば、Ｈ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの１１個の希釈物をＫｕ８１２細胞（ウェル当たり５０，０００細胞）と共に最終濃度１６０ｎＭ〜０．０００１ｎＭとして４℃で一晩インキュベートした。インキュベーションが終わると細胞を洗浄し、抗ｈＩｇＧ−ＰＥ検出抗体と共に４℃で４５分間インキュベートした。未結合の検出抗体を洗浄した後、細胞をＦＡＣＳにより分析した。平均蛍光強度（Ｍｅａｎ Ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）（ＭＦＩ）の値が得られる（表４を参照のこと）。ＭＦＩ値をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｉｍソフトウェアに入力し、１部位結合（双曲線）方程式Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／（Ｋｄ＋Ｘ）を用いて分析して、図６に示すＨ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ飽和曲線を作成した。ＢｍａｘはＨ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂとの最大結合時のＭＦＩ値であり；ＫｄはＨ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ結合親和性であり、これは最大結合の半分に達するのに必要なＨ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの濃度である。Ｈ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの親和性（Ｋｄ）計算値は、Ｋｕ８１２細胞の表面上で内因的に発現する１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに対してそれぞれ０．０６ｎＭおよび０．１９ｎＭである。 Ｈ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの腎癌細胞に対する結合。ヒトＵＧＫ−３細胞（患者由来の腎明細胞癌）およびＲＸＦ−３９３細胞（腎明細胞癌）を１０μｇ／ｍｌの天然Ｈ１６−７．８、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ、またはアイソタイプの対照ヒトＩｇＧ２で染色し、ＦＡＣＳにより評価した。図７の結果（左側のパネル）は、２つの異なる腎腫瘍細胞がＨ１６−７．８（灰色の線）では濃染されるが、対照ＭＡｂ（塗り潰したヒストグラム）では濃染されないことを実証する。右側のパネルは、同じ腎腫瘍細胞がＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ（灰色の線）で同様に濃染されることを実証する（図７；右側のパネル）。これらの結果は、Ｈ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの双方とも、ヒト癌細胞の表面上で発現する天然１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗原を結合することを示している。天然Ｈ１６−７．８のコンジュゲートでＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦを生成することによって、ヒト癌細胞上で発現する天然１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗原に対するその細胞表面結合は変わらなかった。 Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦによる細胞傷害性。２０００個の生存ＫＵ８１２細胞を０日目に3通り播き、一晩回復させた。翌日、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの異なるロットまたはｍｃＭＭＡＦにコンジュゲートした対照ＭＡｂの１：４段階希釈物を添加して最終濃度を得た。細胞を６日間インキュベートしたところで、各ウェルに２０μｌのＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅを添加した。プレートをさらに４時間インキュベートし、蛍光プレートリーダーで５４０ｎＭの励起波長および６２０ｎＭの発光波長を使用して蛍光強度を読み取った。結果は、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの双方のロットとも、ＫＵ８１２細胞の増殖を強力に阻害したことを示している。ＩＣ ５０はロット（１）およびロット（２）についてそれぞれ０．２ｎＭおよび０．１ｎＭであると決定された。ＫＵ８１２細胞を結合しない完全ヒト対照ＭＡｂをｍｃＭＭＡＦとコンジュゲートさせると３．９（±０．２）のＤＡＲが得られた。対照ＡＤＣ（対照ｍｃＦ）はＫＵ８１２細胞増殖を阻害しなかったことから、細胞傷害作用の特異性がさらに実証される。従って、これらの結果は、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦが細胞傷害性薬物を１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現細胞に選択的に送達することができ、その死滅をもたらし得ることを示している。 ＳＣＩＤマウスにおいて皮下に定着させたヒト腎癌異種移植片ＵＧ−Ｋ３におけるＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの有効性。この実験では、患者由来のヒト腎癌異種移植片ＵＧ−Ｋ３をＳＣＩＤマウスで連続継代して維持した。ストック腫瘍を無菌で採取して細片化した。Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して腫瘍片を酵素消化し、単細胞懸濁液とした。１．５×１０６細胞を個々のＳＣＩＤマウスの側腹部に注入し、腫瘍を、その近似容積が１００ｍｍ３に達するまで未処置のまま成長させた。動物は以下のコホートに無作為に割り当てた：Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ処置群、Ｈ１６−７．８対照および５％デキストロース対照。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８は、１０ｍｇ／ｋｇで０日目に１回、静脈内ボーラス注入により投与した。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８の投与量は、投与直前に得た動物毎の個別の体重に基づいた。５％デキストロース対照は動物当たり１５０μＬで投与した。腫瘍成長を試験終了時まで３〜４日毎にノギスを使用して観察した。腫瘍容積は幅２×長さ／２として計算し、ここで幅は最小寸法であり、長さは最大寸法である。腫瘍が約１０００ｍｍ３に達すると、対照群の動物を人道的に安楽死させた。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ処置群の動物はさらに２週間観察してから犠牲にした。統計分析は、双方の対照群についてのデータが利用可能な最終時点で、α＝０．０５とするクラスカル・ワリス検定を使用して実施した。その結果から、ＵＧ−Ｋ３腎明細胞異種移植腫瘍をＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦで処置することにより、調査した全ての用量およびスケジュールでＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長の大幅な阻害が生じたことが実証された。 定着させた同所性ＵＧ−Ｋ３異種移植片のＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦによる成長阻害。同所性に成長させ定着させた腎腫瘍の成長を阻害するＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの能力を、患者由来のＵＧ−Ｋ３腫瘍異種移植片を使用して評価した。簡潔に言えば、ＵＧ−Ｋ３腫瘍のストックを酵素消化し、１５０万個の生細胞を０日目に雄ＳＣＩＤマウスの腎臓に外科的に移植した。腫瘍を７日間成長させたところで、動物を４つの異なる処置群（群当たりｎ＝１０）に無作為化した。動物は、４日毎に投与した合計４用量の５ｍｐｋの対照ＡＤＣを受けたＡ群、３ｍｇ／ｋｇのＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦを受けたＢ群および５ｍｇ／ｋｇのＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦを受けたＣ群に無作為化した。Ｄ群は１０ｍｇ／ｋｇのＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦを１回受けた。試験の終了時（４１日目）に動物を犠牲にし、右腎および左腎を電子天秤で計量した。グラフにプロットする腫瘍重量は、腫瘍を有する右腎の重量から腫瘍のない対側腎の重量を減じることにより決定した。その結果から、ＵＧ−Ｋ３腎明細胞異種移植腫瘍をＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦで処置することにより、調査した全ての用量およびスケジュールで腫瘍成長の劇的な阻害が生じたことが実証された。全てのＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ処置群（Ｂ、Ｃ、およびＤ）の腫瘍重量が、対照処置群の腫瘍重量の１％未満であった。これらの差は高度に統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ）。 ＳＣＩＤマウスにおいて皮下に定着させたヒト腎癌異種移植片ＲＸＦ−３９３におけるＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの有効性。この実験では、ヒト腎癌細胞ＲＸＦ−３９３（マウス当たり０．５×１０６細胞）を個々のマウスの側腹部に注入し、腫瘍を、その近似容積が１００ｍｍ３に達するまで未処置のまま成長させた。次に動物を以下のコホートに無作為に割り当てた：Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ処置群、Ｈ１６−７．８処置群および５％デキストロース対照。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８は１０ｍｇ／ｋｇで週１回、合計２用量を静脈内ボーラス注入により投与した。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８の投与量は、投与直前に得た動物毎の個別の体重に基づいた。５％デキストロース対照は動物当たり１５０μＬで投与した。腫瘍成長を試験終了時まで３〜４日毎にノギスを使用して観察した。腫瘍容積は幅２×長さ／２として計算し、ここで幅は最小寸法であり、長さは最大寸法である。腫瘍が約１０００ｍｍ３に達すると、対照群の動物を人道的に安楽死させた。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ処置群の動物はさらに２週間観察してから犠牲にした。その結果から、ＲＦＸ−３９３ヒト腎癌異種移植腫瘍をＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦで処置することにより、調査した全ての用量およびスケジュールでＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長の大幅な阻害が生じたことが実証された。統計分析は、双方の対照群についてのデータが利用可能な最終時点で、α＝０．０５とするクラスカル・ワリス検定を使用して実施した。 ＳＣＩＤマウスにおいて皮下に定着させたヒト腎癌ＳＫＲＣ−０１におけるＨ１６−７．８のＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦと比較した有効性試験。ヒト腎癌細胞ＳＫＲＣ−０１（マウス当たり０．８×１０６細胞）を個々のマウスの側腹部に注入した。腫瘍を、その近似容積が１００ｍｍ３に達するまで未処置のまま成長させた。０日目に腫瘍が１００ｍｍ３に達すると、動物を以下のコホートに無作為に割り当てた：Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ処置群、Ｈ１６−７．８処置群および５％デキストロース対照。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８は４ｍｇ／ｋｇで４日毎に合計４用量を静脈内ボーラス注入により投与した。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８の投与量は、投与直前に得た動物毎の個別の体重に基づいた。５％デキストロース対照は動物当たり１５０μＬで投与した。腫瘍成長を３〜４日毎にノギスを使用して観察した。腫瘍容積は幅２×長さ／２として計算したが、ここで幅は最小寸法であり、長さは最大寸法である。その結果は、ＡＤＣ Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦがＳＫＲＣ−０１腫瘍形成においての成長を大幅に阻害した一方、ネイキッドＭＡｂ Ｈ１６−７．８は効果を有しなかったことを示している。従って、ＡＤＣ Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦはネイキッド抗体Ｈ１６−７．８と比べて大幅に優れた効果を有した。 ＳＣＩＤマウスにおいて皮下に定着させたＵＧ−Ｋ３におけるＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの他の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と比較した有効性試験。別の実験において、ヒト腎癌細胞ＵＧ−Ｋ３（マウス当たり１．５×１０６細胞）を個々のマウスの側腹部に注入した。腫瘍を、その近似容積が１００ｍｍ３に達するまで未処置のまま成長させた。０日目に腫瘍が１００ｍｍ３に達すると、動物を以下のコホートに無作為に割り当てた：Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ、Ｈ１６−７．８ｖｃＭＭＡＥ、およびＨ１６−１．１１ｍｃＭＭＡＦ、およびＨ１６−１．１１ｖｃＭＭＡＥ、ＰＢＳ対照、および対照ＭＡｂ−ｖｃＭＭＡＥ処置群。全ての抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は１０ｍｇ／ｋｇで０日目に１回投与した。各ＡＤＣの投与量は、投与直前に得た動物毎の個別の体重に基づいた。ＰＢＳ対照は動物当たり１５０μ／Ｌで投与した。腫瘍成長を３〜４日毎にノギスを使用して観察した。腫瘍容積は幅２×長さ／２として計算し、ここで幅は最小寸法であり、長さは最大寸法である。その結果は、ＡＤＣのＨ１６−７．８ｖｃＭＭＡＥおよびＨ１６−１．１１ｖｃＭＭＡＥが腫瘍形成成長を阻害しなかったことを示している。加えて、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−１．１１ｍｃＭＭＡＦの双方が、最初の３０日間にＵＧ−Ｋ３腫瘍形成においての成長を大幅に阻害した。３０日目以降、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦはＨ１６−１．１１ｍｃＭＭＡＦと比較して大幅に優れた効果を有した。 Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８のペプチドマップ。得られたＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８をジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理してジスルフィド結合を還元し、続いて得られた遊離システインをアルキル化した。このステップでは、タンパク質の完全な変性を確実にするためグアニジンを使用した。透析によりグアニジンを除去した後、試料を特異的エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃで消化した。Ｌｙｓ−Ｃはリジン残基のＣ末端側でペプチド結合を切断する。得られたペプチドを質量分析法と併せた逆相クロマトグラフィーにより分析した。逆相保持時間およびピークの質量対電荷比実測値をＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦとＨ１６−７．８との間で比較した。ＷＡＴＥＲＳ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣをＷＡＴＥＲＳ Ｑ−ＴＯＦｐ質量分析器と併せて使用して、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー）分析を行った。消化した試料をＹＭＣ Ｃ１８カラムに加え、トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル勾配で溶出した。結果は、星印で示すピーク強度が天然抗体と比較してコンジュゲート抗体において低下したことを示す。矢印を付したピークは、コンジュゲート抗体ペプチドマップに現れた新しいピークを表す。具体的には、星印または矢印のいずれかを付したピークは、それぞれ、コンジュゲーションの対象とされるペプチドおよび得られたコンジュゲートしたペプチドであると考えられる。 （ ＊ ）ピークの質量スペクトル。この結果は、図１４において星印を付したピークの質量スペクトルの一部分を示す。コンジュゲーション中に変化したシグナルの質量値は「＋」記号で示す。近似ｍ／ｚが９７０．４（＋３荷電状態）のこのペプチドは、重鎖のヒンジ領域に由来するＣ２２５−Ｋ２５０と同定されたとともに、予想コンジュゲーション部位を含む。 ６１９．４ｍ／ｚでのＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８のペプチドマップに関するＭＳＥの抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）。上記図１４のコンジュゲートしたペプチドであると考えられる新しく現れたピークを同定するため、高エネルギー（ＭＳＥ）データ収集技術を使用してＬＣ−ＭＳ分析を行った。この図は、６１９．４のｍ／ｚを使用したＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８のペプチドマップについての抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す。このイオンは薬物成分のフラグメントイオンに対応する。６１９．４のＸＩＣで観測されたピークは、図１４において矢印を付したピークとほぼ同じである。さらに、天然抗体のクロマトグラムにかかるピークは検出されなかった。これらの知見から、６１９．４のｍ／ｚでのＸＩＣにおいて検出されたピークがおそらく薬物とコンジュゲートしたペプチドであったとともに、そのインタクトな質量値により同定されることが示唆される。結果は表５に要約した。これらの結果から、このコンジュゲートの場合、主要なペプチドは重鎖のヒンジ領域で２つの薬物にコンジュゲートしたものであることが示唆される。これらのデータは、ＤＡＲ分析などの他の直交分析により得られたデータと一致する。 脱グリコシル化したＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ ＡＤＣの質量プロファイルを示す例示的なスペクトル。脱グリコシル化したＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの全質量をエレクトロスプレーイオン化飛行時間（ＥＳＩ−ＴＯＦ）質量分析法により決定した。試験試料を２５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５で希釈し、次にグリコペプチダーゼＦと共に３７℃で一晩インキュベートした。試料をＰＬＲＰＴＭカラム（Ｖａｒｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に注入し、９０℃で平衡化し、且つアセトニトリル／水勾配で溶出した。ＷＡＴＥＲＳ Ｓｙｎａｐｔ質量分析器（Ｗａｔｅｒｓ）と併せたＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムにより試料ピークを分析し、ＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアにより生データから質量を再構成した。脱グリコシル化したＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの例示的な質量スペクトルプロファイルを示す。主要な薬物がコンジュゲートした抗体は４つの薬物を負荷する種であった。この知見は、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦにおける非コンジュゲート抗体の存在量を含め、他の直交方法、例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣによるＤＡＲ、ペプチドマッピング、およびＨＩＣアッセイ法により得られた結果と一致した。 脱グリコシル化したＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ ＡＤＣの質量プロファイルを示す例示的なスペクトル。脱グリコシル化したＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの全質量をエレクトロスプレーイオン化飛行時間（ＥＳＩ−ＴＯＦ）質量分析法により決定した。試験試料を２５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５で希釈し、次にグリコペプチダーゼＦと共に３７℃で一晩インキュベートした。試料をＰＬＲＰＴＭカラム（Ｖａｒｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に注入し、９０℃で平衡化し、且つアセトニトリル／水勾配で溶出した。ＷＡＴＥＲＳ Ｓｙｎａｐｔ質量分析器（Ｗａｔｅｒｓ）と併せたＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムにより試料ピークを分析し、ＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアにより生データから質量を再構成した。脱グリコシル化したＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの例示的な質量スペクトルプロファイルを示す。主要な薬物がコンジュゲートした抗体は４つの薬物を負荷する種であった。この知見は、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦにおける非コンジュゲート抗体の存在量を含め、他の直交方法、例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣによるＤＡＲ、ペプチドマッピング、およびＨＩＣアッセイ法により得られた結果と一致した。 Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの薬物抗体比（ＤＡＲ）プロファイル。軽鎖および重鎖の各々における相対薬物負荷量の定量的ＨＰＬＣ測定のため、ＤＡＲ分析を行った。ＤＡＲ分析は、移動相Ａが２．０％ギ酸からなり、且つ移動相Ｂが２．０％ギ酸＋９０％アセトニトリルからなるＰＬＲＰ−Ｓ分析カラム、２．１ｍｍ×５０ｍｍを使用して実施した。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの代表的なＤＡＲプロファイルを示す。ＤＡＲ値は４．０である。この試料を、同じくこの方法のＨＰＬＣ条件を用いたＬＣ−ＭＳ分析に供し、観察されたピークを同定した。結果を表６に要約する。この方法の適格性評価中に得られたＤＡＲ結果のピーク同定は、ＬＣ−ＭＳにより直交的に確認された。
発明の詳細な説明
節の概要
Ｉ．）定義
ＩＩ．）１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体
ＩＩＩ．）抗体薬物コンジュゲートの概要
ＩＩＩ（Ａ）．オーリスタチンおよびドロスタチン（Ｄｏｌｏｓｔａｔｉｎ）
ＩＶ．）１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを結合する抗体薬物コンジュゲート
Ｖ．）リンカー単位
ＶＩ．）ストレッチャー（Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ）単位
ＶＩＩ．）アミノ酸単位
ＶＩＩＩ．）スペーサー単位
ＩＸ．）薬物単位
Ｘ．）薬物負荷
ＸＩ．）ＡＤＣの細胞傷害効果の判定方法
ＸＩＩ．）癌の治療
ＸＩＩＩ．）抗体ベースの治療法の標的としての１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ
ＸＩＶ．）１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣカクテル
ＸＶ．）併用療法
ＸＶＩ．）キット／製品
Ｉ．）定義：
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての当技術分野の用語、表記法および他の科学用語または専門用語は、本発明が関係する技術分野の当業者により一般に理解される意味を有することが意図される。ある場合には、一般に理解される意味を有する用語が、明確にするためおよび／または参照を容易にするため本明細書に定義され、且つ本明細書にかかる定義を含めても、必ずしもそれが当該技術分野で一般に理解されるものとの実質的な違いを表すものと解釈されるべきではない。本明細書において記載および参照される技術および手順の多くは、従来の方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙに記載される広く利用されている分子クローニング法などを使用するもので、当業者により十分に理解され、一般的に用いられている。必要に応じて、市販のキットおよび試薬の使用を伴う手順が、特に注記されない限りは概して製造者が定義するプロトコールおよび／またはパラメータに従い実施される。
本明細書で商標名を使用する場合、その商標名に対する参照は、文脈により特に指示されない限り、製品配合物、ジェネリック薬、および商標名製品の薬学的有効成分もまた参照する。
用語「進行癌」、「局所進行癌」、「進行性疾患」および「局所進行性疾患」は、関連する組織皮膜を通って広がった癌を意味し、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＵＡ）体系に基づく病期Ｃの疾患、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔ体系に基づく病期Ｃ１〜Ｃ２の疾患、およびＴＮＭ（腫瘍、節、転移）体系に基づく病期Ｔ３〜Ｔ４およびＮ＋の疾患を含むことが意図される。一般に、局所進行性疾患患者には手術は推奨されず、こうした患者は、臨床的に局在化した（臓器限局性の）癌を有する患者と比べて転帰が実質的に不良である。
略称「ＡＦＰ」は、ジメチルバリン−バリン−ドライソロイイン（ｄｏｌａｉｓｏｌｅｕｉｎｅ）−ドラプロイン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミンを指す（以下の式ＸＶＩを参照のこと）。
略称「ＭＭＡＥ」はモノメチルオーリスタチンＥを指す（以下の式ＸＩを参照のこと）。
略称「ＡＥＢ」は、オーリスタチンＥをパラアセチル安息香酸と反応させることにより生成されるエステルを指す（以下の式ＸＸを参照のこと）。
略称「ＡＥＶＢ」は、オーリスタチンＥをベンゾイル吉草酸と反応させることにより生成されるエステルを指す（以下の式ＸＸＩを参照のこと）。
略称「ＭＭＡＦ」は、ドバリン（ｄｏｖａｌｉｎｅ）−バリン−ドライソロイイン（ｄｏｌａｉｓｏｌｅｕｉｎｅ）−ドラプロイン−フェニルアラニンを指す（以下の式ＸＶＩＶを参照のこと）。
特に注記されない限り、用語「アルキル」は、約１〜約２０個の炭素原子（並びにその炭素原子の範囲および特定の数のあらゆる組み合わせおよび部分的組み合わせ）を有し、約１〜約８個の炭素原子が好ましい、飽和した直鎖状または分枝状の炭化水素を指す。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、および３，３−ジメチル−２−ブチルである。
アルキル基は、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、１個以上の基、好ましくは１〜３個の基（およびハロゲンから選択される任意のさらなる置換基）で任意で置換されていてもよく、そのような基としては、限定はされないが、−ハロゲン、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ'、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ'、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ'、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ'、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ'）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ'、−ＳＲ'、−ＳＯ３Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）Ｒ'、−ＯＨ、＝Ｏ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ'）、−Ｎ（Ｒ'）２および−ＣＮが挙げられ、ここで、各Ｒ'は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、または−アリールから独立して選択され、且つ、前記−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）基、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）基、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）基、−アリール基、−Ｃ１−Ｃ８アルキル基、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル基、および−Ｃ２−Ｃ８アルキニル基は、１個以上の基で任意でさらに置換されていてもよく、そのような基としては、限定はされないが、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、−ハロゲン、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ"、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ"、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ"、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ"）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ"、−ＳＲ"、−ＳＯ３Ｒ"、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ"、−Ｓ（Ｏ）Ｒ"、−ＯＨ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ"）、−Ｎ（Ｒ"）２および−ＣＮが挙げられ、ここで、各Ｒ"は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、または−アリールから独立して選択される。
特に注記されない限り、用語「アルケニル」および「アルキニル」は、約２〜約２０個の炭素原子（並びにその炭素原子の範囲および特定の数のあらゆる組み合わせおよび部分的組み合わせ）を有し、約２〜約８個の炭素原子が好ましい、直鎖状および分枝状の炭素鎖を指す。アルケニル鎖はその鎖に少なくとも１つの二重結合を有し、アルキニル鎖はその鎖に少なくとも１つの三重結合を有する。アルケニル基の例としては、限定はされないが、エチレンまたはビニル、アリル、−１−ブテニル、−２−ブテニル、−イソブチレニル、−１−ペンテニル、−２−ペンテニル、−３−メチル−１−ブテニル、−２−メチル−２−ブテニル、および−２，３−ジメチル−２−ブテニルが挙げられる。アルキニル基の例としては、限定はされないが、アセチレン系（ａｃｅｔｙｌｅｎｉｃ）、プロパルギル、アセチレニル、プロピニル、−１−ブチニル、−２−ブチニル、−１−ペンチニル、−２−ペンチニル、および−３−メチル−１ブチニルが挙げられる。
アルケニル基およびアルキニル基は、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、１個以上の基、好ましくは１〜３個の基（およびハロゲンから選択される任意のさらなる置換基）で任意で置換されていてもよく、そのような基としては、限定はされないが、−ハロゲン、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ'、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ'、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ'、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ'、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ'）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ'、−ＳＲ'、−ＳＯ３Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）Ｒ'、−ＯＨ、＝Ｏ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ'）、−Ｎ（Ｒ'）２および−ＣＮが挙げられ、ここで、各Ｒ'は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、または−アリールから独立して選択され、且つ、前記−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）基、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）基、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）基、−アリール基、−Ｃ１−Ｃ８アルキル基、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル基、および−Ｃ２−Ｃ８アルキニル基は、１個以上の置換基で任意でさらに置換されていてもよく、該１個以上の置換基としては、限定はされないが、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、−ハロゲン、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ"、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ"、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ"、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ"）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ"、−ＳＲ"、−ＳＯ３Ｒ"、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ"、−Ｓ（Ｏ）Ｒ"、−ＯＨ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ"）、−Ｎ（Ｒ"）２および−ＣＮが挙げられ、ここで、各Ｒ"は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、または−アリールから独立して選択される。
特に注記されない限り、用語「アルキレン」は、約１〜約２０個の炭素原子（並びにその炭素原子の範囲および特定の数のあらゆる組み合わせおよび部分的組み合わせ）を有し、約１〜約８個の炭素原子が好ましく、且つ親アルカンの同じまたは２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を取り除くことにより誘導される２つの一価ラジカル中心を有する飽和した分枝状または直鎖状の炭化水素ラジカルを指す。典型的なアルキレンとしては、限定はされないが、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オシチレン（ｏｃｙｔｙｌｅｎｅ）、ノニレン、デカレン、１，４−シクロへキシレンなどが挙げられる。アルキレン基は、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、１個以上の基、好ましくは１〜３個の基（およびハロゲンから選択される任意のさらなる置換基）で任意で置換されていてもよく、そのような基としては、限定はされないが、−ハロゲン、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ'、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ'、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ'、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ'、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ'）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ'、−ＳＲ'、−ＳＯ３Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）Ｒ'、−ＯＨ、＝Ｏ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ'）、−Ｎ（Ｒ'）２および−ＣＮが挙げられ、ここで、各Ｒ'は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、または−アリールから独立して選択され、且つ、前記−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）基、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）基、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）基、−アリール基、−Ｃ１−Ｃ８アルキル基、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル基、および−Ｃ２−Ｃ８アルキニル基は、１個以上の置換基で任意でさらに置換されていてもよく、そのような置換基としては、限定はされないが、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、−ハロゲン、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ"、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ"、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ"、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ"）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ"、−ＳＲ"、−ＳＯ３Ｒ"、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ"、−Ｓ（Ｏ）Ｒ"、−ＯＨ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ"）、−Ｎ（Ｒ"）２および−ＣＮが挙げられ、ここで、各Ｒ"は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、または−アリールから独立して選択される。
特に注記されない限り、用語「アルケニレン」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む置換されていてもよいアルキレン基を指す。例示的なアルケニレン基としては、例えばエテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）およびプロペニレン（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−）が挙げられる。
特に注記されない限り、用語「アルキニレン」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む置換されていてもよいアルキレン基を指す。例示的なアルキニレン基としては、例えば、アセチレン（−Ｃ≡Ｃ−）、プロパルギル（−ＣＨ２Ｃ≡Ｃ−）、および４−ペンチニル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ−）が挙げられる。
特に注記されない限り、用語「アリール」は、親芳香環系の単一の炭素原子から１つの水素原子を取り除くことにより誘導される６〜２０個の炭素原子（並びにその炭素原子の範囲および特定の数のあらゆる組み合わせおよび部分的組み合わせ）の一価芳香族炭化水素ラジカルを指す。いくつかのアリール基は例示的構造において「Ａｒ」として表される。典型的なアリール基としては、限定はされないが、ベンゼン、置換ベンゼン、フェニル、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導されるラジカルが挙げられる。
アリール基は、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、１個以上の、好ましくは１〜５個の、またはさらには１〜２個の基で任意で置換されていてもよく、そのような基としては、限定はされないが、−ハロゲン、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ'、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ'、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ'、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ'、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ'）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ'、−ＳＲ'、−ＳＯ３Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）Ｒ'、−ＯＨ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ'）、−Ｎ（Ｒ'）２および−ＣＮが挙げられ、ここで、各Ｒ'は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、または−アリールから独立して選択され、且つ、前記−Ｃ１−Ｃ８アルキル基、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル基、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル基、Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）基、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）基、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）基、および−アリール基は、任意で１個以上の置換基で置換されていてもよく、そのような置換基としては、限定はされないが、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、−ハロゲン、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ"、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ"、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ"、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ"）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ"、−ＳＲ"、−ＳＯ３Ｒ"、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ"、−Ｓ（Ｏ）Ｒ"、−ＯＨ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ"）、−Ｎ（Ｒ"）２および−ＣＮが挙げられ、ここで、各Ｒ"は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、または−アリールから独立して選択される。
特に注記されない限り、用語「アリーレン」は、二価の（すなわち、親芳香環系の同じまたは２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を取り除くことにより誘導される）置換されていてもよいアリール基を指し、フェニルを例示的アリール基とした以下の構造に示すとおりのオルト、メタ、またはパラ配置であり得る。
Figure 2017095459
典型的な「−（Ｃ１−Ｃ８アルキレン）アリール」基、「−（Ｃ２−Ｃ８アルケニレン）アリール」基、および「−（Ｃ２−Ｃ８アルキニレン）アリール」基としては、限定はされないが、ベンジル、２−フェニルエタン−１−イル、２−フェニルエテン−１−イル、ナフチルメチル、２−ナフチルエタン−１−イル、２−ナフチルエテン−１−イル、ナフトベンジル、２−ナフトフェニルエタン−１−イルなどが挙げられる。
特に注記されない限り、用語「複素環」は、３〜１４個の環原子（環員とも称される）を有する単環式、二環式、または多環式の環系を指し、ここで少なくとも１つの環における少なくとも１つの環原子は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、またはＳから選択されるヘテロ原子（並びにその炭素原子およびヘテロ原子の範囲および特定の数のあらゆる組み合わせおよび部分的組み合わせ）である。複素環は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、またはＳから独立して選択される１〜４個の環ヘテロ原子を有し得る。複素環の１つ以上のＮ、Ｃ、またはＳ原子は酸化されていてもよい。単環式複素環は、好ましくは３〜７環員（例えば、２〜６個の炭素原子および１〜３個の、Ｎ、Ｏ、Ｐ、またはＳから独立して選択されるヘテロ原子）を有し、且つ二環式複素環は、好ましくは５〜１０環員（例えば、４〜９個の炭素原子および１〜３個の、Ｎ、Ｏ、Ｐ、またはＳから独立して選択されるヘテロ原子）を有する。ヘテロ原子を含む環は芳香族であっても、または非芳香族であってもよい。特に注記されない限り、複素環は、安定した構造をもたらす任意のヘテロ原子または炭素原子でそのペンダント基に結合する。
複素環については、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６８）、特に第１、３、４、６、７、および９章；「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５０年から現在まで）、特に第１３、１４、１６、１９、および２８巻；およびＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８２：５５６６（１９６０）に記載されている。
「複素環」基の例には、限定ではなく例示として、ピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドリル、インドレニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２−ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、ビス−テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ビス−テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチニル、２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、４Ｈ−カルバゾリル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシインドリル、ベンゾオキサゾリニル、およびイサチノイル（ｉｓａｔｉｎｏｙｌ）が含まれる。好ましい「複素環」基としては、限定はされないが、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリル、ベンゾピラゾリル、クマリニル、イソキノリニル、ピロリル、チオフェニル、フラニル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、キノリニル、ピリミジニル、ピリジニル、ピリドニル、ピラジニル、ピリダジニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリルおよびテトラゾリルが挙げられる。
複素環基は、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、１個以上の基、好ましくは１〜２個の基で任意で置換されていてもよく、そのような基としては、限定はされないが、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、−ハロゲン、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ'、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ'、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ'、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ'、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ'）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ'、−ＳＲ'、−ＳＯ３Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）Ｒ'、−ＯＨ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ'）、−Ｎ（Ｒ'）２および−ＣＮが挙げられ、ここで、各Ｒ'は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、または−アリールから独立して選択され、且つ、前記−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）基、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）基、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）基、−Ｃ１−Ｃ８アルキル基、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル基、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル基、および−アリール基は、１個以上の置換基で任意でさらに置換されていてもよく、そのような置換基としては、限定はされないが、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、−ハロゲン、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ"、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ"、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ"、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ"）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ"、−ＳＲ"、−ＳＯ３Ｒ"、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ"、−Ｓ（Ｏ）Ｒ"、−ＯＨ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ"）、−Ｎ（Ｒ"）２および−ＣＮが挙げられ、ここで、各Ｒ"は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、またはアリールから独立して選択される。
限定ではなく例示として、炭素結合複素環は以下の位置に結合することができる：ピリジンの２位、３位、４位、５位、または６位；ピリダジンの３位、４位、５位、または６位；ピリミジンの２位、４位、５位、または６位；ピラジンの２位、３位、５位、または６位；フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロールまたはテトラヒドロピロールの２位、３位、４位、または５位；オキサゾール、イミダゾールまたはチアゾールの２位、４位、または５位；イソオキサゾール、ピラゾール、またはイソチアゾールの３位、４位、または５位；アジリジンの２位または３位；アゼチジンの２位、３位、または４位；キノリンの２位、３位、４位、５位、６位、７位、または８位；またはイソキノリンの１位、３位、４位、５位、６位、７位、または８位。さらにより典型的には、炭素結合複素環としては、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、５−ピリジル、６−ピリジル、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル、５−ピリダジニル、６−ピリダジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、６−ピリミジニル、２−ピラジニル、３−ピラジニル、５−ピラジニル、６−ピラジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、または５−チアゾリルが挙げられる。
限定ではなく例示として、窒素結合複素環は、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、または１Ｈ−インダゾールの１位；イソインドール、またはイソインドリンの２位；モルホリンの４位；およびカルバゾール、またはβ−カルボリンの９位に結合することができる。さらにより典型的には、窒素結合複素環としては、１−アジリジル、１−アゼテジル（ａｚｅｔｅｄｙｌ）、１−ピロリル、１−イミダゾリル、１−ピラゾリル、および１−ピペリジニルが挙げられる。
特に注記されない限り、用語「炭素環」は、３〜１４個の環原子（並びにその炭素原子の範囲および特定の数のあらゆる組み合わせおよび部分的組み合わせ）を有して、その環原子の全てが炭素原子である飽和または不飽和非芳香族の単環式、二環式、または多環式の環系を指す。単環式炭素環は好ましくは３〜６個の環原子、さらにより好ましくは５個または６個の環原子を有する。二環式炭素環は好ましくは、例えばビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］若しくは［６，６］系として配列された７〜１２個の環原子、またはビシクロ［５，６］若しくは［６，６］系として配列された９個若しくは１０個の環原子を有する。用語「炭素環」には、例えば、アリール環と縮合した単環式炭素環の環（例えば、ベンゼン環と縮合した単環式炭素環の環）が含まれる。炭素環は好ましくは３〜８個の炭素環原子を有する。
炭素環基は、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、例えば１個以上の基、好ましくは１個または２個の基（およびハロゲンから選択される任意のさらなる置換基）で任意で置換されていてもよく、そのような基としては、限定はされないが、−ハロゲン、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ'、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ'、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ'、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ'、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ'）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ'、−ＳＲ'、−ＳＯ３Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ'、−Ｓ（Ｏ）Ｒ'、−ＯＨ、＝Ｏ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ'）、−Ｎ（Ｒ'）２および−ＣＮが挙げられ、ここで、各Ｒ'は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、または−アリールから独立して選択され、且つ、前記−Ｃ１−Ｃ８アルキル基、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル基、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル基、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）基、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）基、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）基、および−アリール基は、１個以上の置換基で任意でさらに置換されていてもよく、そのような置換基としては、限定はされないが、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、−ハロゲン、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ８アルキニル）、−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ"、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ"、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ"、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ"）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ"、−ＳＲ"、−ＳＯ３Ｒ"、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ"、−Ｓ（Ｏ）Ｒ"、−ＯＨ、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ"）、−Ｎ（Ｒ"）２および−ＣＮが挙げられ、ここで、各Ｒ"は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、または−アリールから独立して選択される。
単環式炭素環置換基の例としては、−シクロプロピル、−シクロブチル、−シクロペンチル、−１−シクロペンタ−１−エニル、−１−シクロペンタ−２−エニル、−１−シクロペンタ−３−エニル、シクロヘキシル、−１−シクロヘキサ−１−エニル、−１−シクロヘキサ−２−エニル、−１−シクロヘキサ−３−エニル、−シクロヘプチル、−シクロオクチル、−１，３−シクロヘキサジエニル、−１，４−シクロヘキサジエニル、−１，３−シクロヘプタジエニル、−１，３，５−シクロヘプタトリエニル、および−シクロオクタジエニルが挙げられる。
「カルボシクロ」は、単独で使用されてもまたは別の基の一部として使用されても、二価の（すなわち、親炭素環式環系の同じまたは２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を取り除くことにより誘導される）、上記に定義されるとおり置換されていてもよい炭素環基を指す。
文脈によって特に指示されない限り、ハイフン（−）はペンダント分子との結合点を指す。従って、用語「−（Ｃ１−Ｃ８アルキレン）アリール」または「−Ｃ１−Ｃ８アルキレン（アリール）」は、本明細書に定義されるとおりのＣ１−Ｃ８アルキレンラジカルであって、アルキレンラジカルがアルキレンラジカルの炭素原子のいずれかでペンダント分子に結合し、且つアルキレンラジカルの炭素原子に結合した水素原子の１つが本明細書に定義されるとおりのアリールラジカルに置き換えられるＣ１−Ｃ８アルキレンラジカルを指す。
特定の基が「置換されている」場合、当該基は、置換基のリストから独立して選択される１個以上の置換基、好ましくは１〜５個の置換基、より好ましくは１〜３個の置換基、最も好ましくは１〜２個の置換基を有し得る。しかしながら基は、概してハロゲンから選択される任意の数の置換基を有することができる。置換されている基は、そのように指示される。
分子内の特定の位置における任意の置換基または可変基の定義は、当該分子内の他の位置におけるその定義と独立していることが意図される。本発明の化合物上の置換基および置換パターンは、化学的に安定し、且つ当該分野で公知の技術並びに本明細書に示される方法により容易に合成することのできる、化合物が提供されるように、当業者によって選択され得ることが理解される。
保護基は、本明細書で使用される場合、一時的に、或いは永久に、多官能性化合物の１つの反応部位を選択的に遮断する基を指す。本発明での使用に好適なヒドロキシ保護基は、薬学的に許容可能であり、且つ対象への投与後に化合物が活性となるのに親化合物から切断される必要があっても、または必要がなくてもよい。切断は、体内の通常の代謝過程を介する。ヒドロキシ保護基については当該技術分野において公知であり、全体としておよびあらゆる目的から参照により本明細書に援用されるＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ著（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照されたく、例えば、エーテル（例えば、アルキルエーテル類およびシリルエーテル類、例えば、ジアルキルシリルエーテル、トリアルキルシリルエーテル、ジアルキルアルコキシシリルエーテルを含む）、エステル、炭酸、カルバミン酸、スルホン酸、およびリン酸保護基が挙げられる。ヒドロキシ保護基の例としては、限定はされないが、メチルエーテル；メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、ｐ−メトキシベンジルオキシメチルエーテル、ｐ−ニトロベンジルオキシメチルエーテル、ｏ−ニトロベンジルオキシメチルエーテル、（４−メトキシフェノキシ）メチルエーテル、グアヤコールメチルエーテル、ｔ−ブトキシメチルエーテル、４−ペンテニルオキシメチルエーテル、シロキシメチルエーテル、２−メトキシエトキシメチルエーテル、２，２，２−トリクロロエトキシメチルエーテル、ビス（２−クロロエトキシ）メチルエーテル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテル、メントキシメチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、１−メトキシシルコヘキシル（ｍｅｔｈｏｘｙｃｙｌｃｏｈｅｘｙｌ）エーテル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルエーテル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルエーテルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クオロ（ｃｈｏｒｏ）−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イルエーテル、１−（２−フルオロフネイル（ｆｌｕｏｒｏｐｈｎｅｙｌ））−４−メトキシピペリジン−４−イルエーテル、１，４−ジオキサン−２−イルエーテル、テトラヒドロフラニルエーテル、テトラヒドロチオフラニルエーテル；置換エチルエーテル類、例えば１−エトキシエチルエーテル、１−（２−クロロエトキシ）エチルエーテル、１−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］エチルエーテル、１−メチル−１−メトキシエチルエーテル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチルエーテル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチルエーテル、１−メチル−１フェノキシエチルエーテル、２−トリメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテル、プロパルギルエーテル類、ｐ−クロロフェニルエーテル、ｐ−メトキシフェニルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、トリプロピルシリルエーテル、ジメチルイソプロピルシリルエーテル、ジエチルイソプロピルシリルエーテル、ジメチルヘキシルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ジフェニルメチルシリルエーテル、ベンゾイルギ酸エステル、酢酸エステル、クロロ酢酸エステル、ジクロロ酢酸エステル、トリクロロ酢酸エステル、トリフルオロ酢酸エステル、メトキシ酢酸エステル、トリフネイルメトキシ酢酸（ｔｒｉｐｈｎｅｙｌｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔａｔｅ）エステル、フェニル酢酸エステル、安息香酸エステル、アルキルメチルカーボネート、アルキル９−フルオレニルメチルカーボネート、アルキルエチルカーボネート、アルキル２，２，２，−トリクロロエチルカーボネート、１，１，−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、アルキルスルホネート、メタンスルホネート、ベンジルスルホネート、トシレート、メチレンアセタール、エチリデンアセタール、およびｔ−ブチルメチリデンケタールが挙げられる。好ましい保護基は、式−Ｒａ、−Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒａ）（Ｒａ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｒａ）、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、および−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＲａにより表され、式中、Ｒａは、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（炭素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（炭素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（炭素環）、−Ｃ６−Ｃ１０アリール、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（アリール）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（アリール）、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（アリール）、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（複素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（複素環）、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（複素環）であり、ここで前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、炭素環、および複素環ラジカルは、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、置換されていてもよい。
「天然のグリコシル化パターンを変化させること」は、本明細書の目的上、天然配列１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに見られる１つまたは複数の炭水化物成分を欠失させること（基礎をなすグリコシル化部位を取り除くことによるか、或いは化学的および／または酵素的手段によってグリコシル化を消失させることにより）、および／または天然配列１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂには存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位を付加することを意味するように意図される。加えてこの語句は、存在する様々な炭水化物成分の性質および割合の変化を伴う天然タンパク質のグリコシル化の定性的な変化を含む。
用語「類似体」は、別の分子（例えば、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ関連タンパク質）と構造的に同様であるか、または同様の若しくは対応する属性を共有する分子を指す。例えば、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質の類似体には、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに特異的に結合する抗体またはＴ細胞が特異的に結合し得る。
用語「抗体」は、特に明確に指示しない限り最も広義に使用される。従って、「抗体」は天然に存在するものであっても、または従来のハイブリドーマ技術によって産生されたモノクローナル抗体などの人工のものであってもよい。１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体並びにそれらの抗体の抗原結合ドメインおよび／または１つまたは複数の相補性決定領域を含む断片を含む。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを特異的に結合し、且つ／または所望の生物学的な活性を呈する任意の形態の抗体またはその断片を指し、具体的にはモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体断片を、それらが１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを特異的に結合し、且つ／または所望の生物学的な活性を呈する限りにおいて包含する。本明細書に提供される方法および組成物では任意の特異抗体を使用することができる。従って、一実施形態において用語「抗体」は、軽鎖免疫グロブリン分子由来の少なくとも１つの可変領域と重鎖分子由来の少なくとも１つの可変領域とを含む分子であって、それらが組み合わせで標的抗原に対する特異的結合部位を形成する分子を包含する。一実施形態において、抗体はＩｇＧ抗体である。例えば抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。本方法および組成物において有用な抗体は、細胞培養物、ファージ、または限定はされないが、雌ウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、類人猿を含む様々な動物において生成することができる。従って、一実施形態において、本発明の抗体は哺乳動物抗体である。初期抗体の単離、または特異性若しくは結合力特性が変化した変異体の生成には、ファージ技術を用いることができる。かかる技術はルーチンであり、当該技術分野において周知されている。一実施形態において、抗体は当該技術分野において公知の組換え手段により産生される。例えば、組換え抗体は、抗体をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることにより産生することができる。１つまたは複数のベクターを使用して、少なくとも１つのＶＬ領域および１つのＶＨ領域を発現するＤＮＡ配列を宿主細胞にトランスフェクトすることができる。抗体生成および産生の組換え手段についての例示的な説明としては、Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｗｉｌｅｙ，１９９７）；Ｓｈｅｐｈａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，最新版）が挙げられる。本発明の抗体は、組換え手段で改変して、その抗体による所望の機能の媒介効率を高めることができる。従って、抗体が組換え手段を用いて置換により改変され得ることは、本発明の範囲内である。典型的には、置換は保存的置換であり得る。例えば、抗体の定常領域の少なくとも１つのアミノ酸を別の残基に置き換えることができる。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、米国特許第６，１９４，５５１号、出願番号 国際公開公報第９９５８５７２号；およびＡｎｇａｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−０８（１９９３）を参照のこと。アミノ酸の改変には、アミノ酸の欠失、付加、および置換が含まれる。ある場合には、かかる変更は、望ましくない活性、例えば補体依存性細胞傷害作用を低下させるために行われる。多くの場合に抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を、共有結合的に、或いは非共有結合的に結び付けることによって標識される。多種多様な標識およびコンジュゲーション技術が公知であり、科学文献および特許文献の双方に広範な報告がある。これらの抗体は、正常なまたは欠損した１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに対する結合についてスクリーニングすることができる。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）を参照のこと。所望の生物学的な活性を有する好適な抗体は、以下のインビトロアッセイ法、すなわち限定はされないが、増殖、遊走、接着、軟寒天成長、血管形成、細胞間コミュニケーション、アポトーシス、輸送、シグナル伝達、内部移行、抗体媒介性の二次的な死滅、および以下のインビボアッセイ法、例えば腫瘍成長の阻害などで同定することができる。本明細書に提供される抗体はＡＤＣの中間体として有用であり得る。本明細書に提供される抗体はまた、診断用途においても有用であり得る。本抗体は、捕捉抗体または非中和抗体として、抗原の受容体結合活性または生物学的な活性を阻害することなく特定の抗原に結合する能力についてスクリーニングすることができる。本抗体は中和抗体として競合的結合アッセイ法で有用であり得る。本抗体はまた、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂまたはその受容体の定量にも使用することができる。
抗体の「抗原結合部分」または「抗体断片」（または単に「抗体部分」）という用語は、本明細書で使用される場合、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体の１つまたは複数の断片において、抗原（例えば１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ；図１）に特異的に結合する能力を保持する断片を指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によりコードされるが、組換え方法を用いてそれらを一本のタンパク質鎖にすることが可能な合成リンカーでつなぎ合わせることができ、このタンパク質鎖ではＶＬ領域とＶＨ領域とが対になって一価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られ；例えば、Ｂｉｒｄ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）。かかる一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されることが意図される。これらの抗体断片は当業者に公知の従来技術を用いて得られ、それらの断片は、インタクトな抗体と同じように有用性についてスクリーニングされる。
本明細書で使用される場合、任意の形態の「抗原」を使用して１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに特異的な抗体を生成することができる。従って誘発抗原は、単独での、または当該技術分野において公知の１つ以上の免疫原性促進剤と組み合わせた、単一のエピトープ、複数のエピトープ、またはタンパク質全体であり得る。誘発抗原は、単離された完全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、抗原の少なくとも一部分をトランスフェクトした細胞で免疫化する）、または可溶性タンパク質（例えば、タンパク質の細胞外ドメイン部分のみで免疫化する）であってもよい。抗原は、遺伝子改変された細胞で産生されてもよい。抗原をコードするＤＮＡはゲノム性であっても、または非ゲノム性（例えば、ｃＤＮＡ）であってもよく、且つ細胞外ドメインの少なくとも一部分をコードする。本明細書で使用される場合、用語「部分」は、対象とする抗原の免疫原性エピトープを構成する最小数の、適宜アミノ酸または核酸を指す。対象とする細胞の形質転換に好適な任意の遺伝子ベクターを用いることができ、限定はされないが、アデノウイルスベクター、プラスミド、およびカチオン性脂質などの非ウイルス性ベクターが挙げられる。一実施形態において、本明細書における方法および組成物の抗体は、対象とする１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂの細胞外ドメインの少なくとも一部分を特異的に結合する。
本明細書に提供される抗体またはその抗原結合断片は、「生物活性剤」にコンジュゲートされ得る。本明細書で使用される場合、用語「生物活性剤」は、抗原を結合し、且つ／または望ましい生物学的作用を増進若しくは媒介して細胞を死滅させる毒素を増進する任意の合成のまたは天然に存在する化合物を指す。一実施形態では、本発明において有用な結合断片は、生物学的に活性な断片である。本明細書で使用される場合、用語「生物学的に活性」は、所望の抗原エピトープと結合する能力および生物学的効果を直接的または間接的に及ぼす能力を有する抗体または抗体断片を指す。直接的な効果としては、限定はされないが、成長シグナルの調節、刺激、および／または阻害、抗アポトーシスシグナルの調節、刺激、および／または阻害、アポトーシスまたは壊死シグナルの調節、刺激、および／または阻害、ＡＤＣＣカスケードの調節、刺激、および／または阻害、並びにＣＤＣカスケードの調節、刺激、および／または阻害が挙げられる。
本明細書におけるモノクローナル抗体には具体的には「キメラ」抗体が含まれ、キメラ抗体では、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、並びにかかる抗体の断片（それらが標的抗原に特異的に結合し、且つ／または所望の生物学的な活性を呈する限りにおいて）の対応する配列と同一または相同である一方、残りの鎖が、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、並びにかかる抗体の断片の対応する配列と同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
用語「化学療法剤」は、腫瘍成長の阻害に有効なあらゆる化学的化合物を指す。化学療法剤の非限定的な例としては、アルキル化剤；例えば、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物およびスルホン酸アルキル；代謝拮抗薬、例えば、葉酸、プリンまたはピリミジン拮抗薬；有糸***阻害薬、例えば、ビンカアルカロイド、オーリスタチンおよびポドフィロトキシン誘導体などの抗チューブリン剤；細胞傷害性抗生物質；ＤＮＡの発現または複製を傷害または妨害する化合物、例えばＤＮＡ副溝結合剤；および成長因子受容体拮抗薬が挙げられる。加えて、化学療法剤としては、細胞傷害剤（本明細書に定義されるとおり）、抗体、生体分子および小分子が挙げられる。
用語「化合物」は、化学的化合物それ自体、並びに、明示的に記載されるか否かに関わらず、且つそれらを除外することが文脈によって明らかにされない限りは以下に挙げるものを指し、且つ包含する。多形形態を含む、化合物の非晶質形態および結晶形態、ここでこれらの形態は混合物の一部であっても、または分離されていてもよい；化合物の遊離酸および遊離塩基形態、これらは典型的には、本明細書に提供される構造に示される形態である；化合物の異性体、これは光学異性体および互変異性体を指し、ここで光学異性体にはエナンチオマーおよびジアステレオマー、キラル異性体および非キラル異性体が含まれ、且つ光学異性体には、分離された光学異性体、並びにラセミおよび非ラセミ混合物を含む光学異性体の混合物が含まれ；ここで異性体は分離された形態であっても、または１つ以上の他の異性体との混合物であってもよい；化合物の同位体、これには重水素およびトリチウムを含有する化合物が含まれ、且つ放射性同位元素、例えば治療におよび診断に有効な放射性同位元素を含有する化合物が含まれる；化合物の多量体形態、これには二量体、三量体等の形態が含まれる；化合物の塩、好ましくは薬学的に許容可能な塩、これには酸付加塩および塩基付加塩が含まれ、有機対イオンおよび無機対イオンを有する塩が含まれ、且つ双性イオン形態が含まれ、ここで化合物が２個以上の対イオンと会合する場合、その２個以上の対イオンは同じであっても、または異なってもよい；および化合物の溶媒和物、これには半溶媒和物、一溶媒和物、二溶媒和物等が含まれ、有機溶媒和物および無機溶媒和物が含まれ、前記無機溶媒和物には水和物が含まれ；ここで化合物が２個以上の溶媒分子と会合する場合、その２個以上の溶媒分子は同じであっても、または異なってもよい。ある場合には、本明細書において本発明の化合物を参照する場合、それは上記の形態の１つまたは上記の形態の、例えば塩および／または溶媒和物の明示的な参照を含み得るが、しかしながらその参照は強調に過ぎず、上記に特定されるとおりの上記の形態以外を除外するものとして解釈されてはならない。
用語「細胞傷害剤」は、細胞の発現活性、細胞の機能を阻害または妨害し、且つ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語には、その断片および／または変異体を含む、放射性同位体、化学療法剤、および毒素、例えば細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素が含まれることが意図される。細胞傷害剤の例としては、限定はされないが、オーリスタチン（例えば、オーリスタチンｅ、オーリスタチンｆ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）、オーロマイシン（ａｕｒｏｍｙｃｉｎ）、メイタンシノイド、リシン、リシンＡ鎖、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン、カリケアマイシン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害薬、およびグルココルチコイドおよび他の化学療法剤、並びに放射性同位元素、例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２または２１３、Ｐ３２およびＬｕ１７７を含むＬｕの放射性同位体が挙げられる。抗体はまた、プロドラッグをその活性型に変換する能力を有する抗癌プロドラッグ活性酵素にコンジュゲートされてもよい。
用語「枯渇させる」は、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ結合剤の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現細胞に対する効果との関連では、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現細胞の数を減少させること、または１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現細胞を取り除くことを指す。
「遺伝子産物」は、本明細書では、ペプチド／タンパク質またはｍＲＮＡを指して用いられる。例えば、「本発明の遺伝子産物」は本明細書ではときに「癌アミノ酸配列」、「癌タンパク質」、「表１に列挙された癌のタンパク質」、「癌ｍＲＮＡ」、「表１に列挙された癌のｍＲＮＡ」等と称される。一実施形態において、癌タンパク質は図１の核酸によりコードされる。癌タンパク質は断片であっても、またはそれに代えて図１の核酸によりコードされる完全長タンパク質であってもよい。一実施形態では、癌アミノ酸配列は配列の同一性または類似性を判定するために使用される。別の実施形態では配列は、図１の核酸によりコードされるタンパク質の天然に存在する対立遺伝子変異体である。別の実施形態では配列は、本明細書にさらに記載するとおりの配列変異体である。
本方法および組成物では、「ヘテロコンジュゲート」抗体が有用である。本明細書で使用される場合、用語「ヘテロコンジュゲート抗体」は、共有結合的につなぎ合わされた２つの抗体を指す。かかる抗体は、架橋剤の使用を含む、合成タンパク質化学において公知の方法を用いて調製することができる。例えば、米国特許第４，６７６，９８０号を参照のこと。
用語「相同体」は、例えば対応する位置に同じまたは同様の化学的残基配列を有することにより、別の分子との相同性を示す分子を指す。
一実施形態において、本明細書に提供される抗体は「ヒト抗体」である。本明細書で使用される場合、用語「ヒト抗体」は、本質的に軽鎖および重鎖配列の配列全体が、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含め、ヒト遺伝子由来である抗体を指す。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ法、ヒトＢ細胞法（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）を参照のこと、ＥＢＶ形質転換法（例えば、Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ７７−９６（１９８５）を参照のこと）により、またはファージディスプレイ（例えば、Ｍａｒｋｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）を参照のこと）を使用して調製される。特定の実施形態において、ヒト抗体はトランスジェニックマウスで生成される。かかる部分的乃至完全なヒト抗体の作製技法は当該技術分野において公知であり、任意のかかる技法を用いることができる。一つの特に好ましい実施形態によれば、完全ヒト抗体配列は、ヒト重鎖および軽鎖抗体遺伝子を発現するように遺伝子操作されたトランスジェニックマウスで作製される。ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスの調製についての例示的な記載は、出願番号 国際公開公報第０２／４３４７８号、並びに米国特許第６，６５７，１０３号（Ａｂｇｅｎｉｘ）およびその子出願に見られる。次に、所望の抗体を産生するトランスジェニックマウス由来のＢ細胞を融合して、抗体を連続的に産生するためのハイブリドーマ細胞系を作製することができる。例えば、米国特許第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；および同第５，５４５，８０６号；およびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３１：３３−４２（１９９８）；Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−９５（１９９８）を参照のこと。
用語「阻害する」または「〜の阻害」は、本明細書で使用される場合、計測可能な量だけ低減すること、または完全に妨げることを意味する。
好適な「標識」としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害薬、蛍光成分、化学発光成分、磁性粒子などが挙げられる。かかる標識の使用について教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。加えて、本明細書に提供される抗体はフルオロボディ（ｆｌｕｏｒｏｂｏｄｙ）の抗原結合構成要素として有用であり得る。例えば、Ｚｅｙｔｕｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１４７３−７９（２００３）を参照のこと。
用語「転移性癌」および「転移性疾患」は、所属リンパ節または遠隔部位まで及んでいる癌を意味し、ＡＵＡ体系に基づく病期ＤおよびＴＮＭ体系に基づく病期Ｔ×Ｎ×Ｍ＋の疾患を含むことが意図される。
用語「修飾薬」または「試験化合物」または「薬物候補」または文法的に等価な用語は、本明細書で使用される場合、癌表現型または癌配列、例えば核酸配列若しくはタンパク質配列の発現、または癌配列の作用（例えば、シグナル伝達、遺伝子発現、タンパク質相互作用等）を直接的または間接的に変化させる能力について試験される任意の分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、有機小分子、多糖、ポリヌクレオチド等を表す。一態様において、修飾薬は本発明の癌タンパク質の作用を中和し得る。「中和する」は、タンパク質の活性が、結果としてもたらされる細胞への作用を伴い、阻害または遮断されることを意味する。別の態様において、修飾薬は、前記タンパク質のレベルを標準化することにより本発明の遺伝子、およびその対応するタンパク質の作用を中和し得る。好ましい実施形態において、修飾薬は、発現プロファイル、または本明細書に提供される発現プロファイル核酸またはタンパク質、または下流のエフェクター経路を変化させる。一実施形態において、修飾薬は、例えば正常組織のフィンガープリントに向かって、癌表現型を抑制する。別の実施形態において、修飾薬は癌表現型を誘発した。一般に、様々な濃度に対する反応の違いを得るため、異なる薬剤濃度の複数のアッセイ混合物が並行して実行される。典型的には、これらの濃度のうちの一つは陰性対照としての役割を果たし、すなわちゼロ濃度または検出レベル未満である。
修飾薬、薬物候補、または試験化合物は数多くの化学的クラスを包含するが、しかしながら典型的には、分子量が１００ダルトンより大きく約２，５００ダルトンより小さい有機分子、好ましくは有機小化合物である。好ましい小分子は２０００Ｄ未満、または１５００Ｄ未満または１０００Ｄ未満または５００Ｄ未満である。候補薬剤は、タンパク質との構造上の相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくはこれらの官能化学基の少なくとも２つを含む。候補薬剤は多くの場合に、上記の官能基の１つまたは複数で置換された、環状炭素または複素環式構造および／または芳香族若しくは多環芳香族構造を含む。修飾薬はまた、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組み合わせなどの生体分子も含む。ペプチドが特に好ましい。一つの修飾薬クラスは、例えば約５〜約３５アミノ酸のペプチドであり、約５〜約２０アミノ酸が好ましく、且つ約７〜約１５が特に好ましい。好ましくは、癌修飾性タンパク質は可溶性であり、非膜貫通領域を含み、且つ／またはＮ末端Ｃｙｓを有して溶解を促進する。一実施形態において、断片のＣ末端は遊離酸のままとしてＮ末端を遊離アミンとすることにより、カップリング、すなわちシステインとのカップリングが促進される。一実施形態において、本発明の癌タンパク質は、本明細書において考察されるとおりの免疫原性薬剤にコンジュゲートされる。一実施形態において、癌タンパク質はＢＳＡにコンジュゲートされる。本発明のペプチド、例えば好ましい長さのペプチドを互いに、または他のアミノ酸と連結して、より長いペプチド／タンパク質を作り出すことができる。修飾性ペプチドは、上記に概説されるとおりの天然に存在するタンパク質、ランダムペプチド、または「バイアスを有する」ランダムペプチドの消化物であり得る。好ましい実施形態において、ペプチド／タンパク質ベースの修飾薬は、本明細書に定義されるとおりの抗体、およびその断片である。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち少量のみ存在し得る天然に認められる起こり得る突然変異を除いては、その集団を構成する個々の抗体が同じである。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原エピトープを標的とする。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体製剤は、典型的には種々のエピトープを標的とする（またはそれに特異的な）多数の抗体を含む。一実施形態において、ポリクローナル抗体は、複数の抗原エピトープを含む単一の抗原内に種々のエピトープ特異性、アフィニティ、またはアビディティを有する複数のモノクローナル抗体を含む。修飾語「モノクローナル」は、実質的に同種の抗体集団から得られるものとしての抗体の性質を指し、任意の特定の方法による抗体の産生を要するものと解釈されるべきではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）により初めて記載されたハイブリドーマ法により作製されても、または組換えＤＮＡ法により作製されてもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技法を用いてファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。これらのモノクローナル抗体は一般に、通常ＥＬＩＳＡにより決定された、少なくとも約１μＭ、より一般的には少なくとも約３００ｎＭ、典型的には少なくとも約３０ｎＭ、好ましくは少なくとも約１０ｎＭ、より好ましくは少なくとも約３ｎＭまたはそれより良好なＫｄで結合し得る。
「薬学的賦形剤」は、アジュバント、担体、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、防腐剤などの材料を含む。
「薬学的に許容可能な」は、非毒性の、不活性の、および／またはヒト若しくは他の哺乳動物に生理学的に適合する組成物を指す。
用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基長または少なくとも１０塩基対長の、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドのポリマー形態、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変された形態を意味し、一本鎖および二本鎖形態のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むことが意図される。当該技術分野では、この用語は多くの場合に「オリゴヌクレオチド」と同義的に使用される。ポリヌクレオチドは本明細書に開示されるヌクレオチド配列を含むことができ、ここで例えば図１に示されるとおりのチミジン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）でもあり得；この定義はＤＮＡとＲＮＡとの化学構造の違い、詳細にはＲＮＡにおける主要な４塩基のうちの１つがチミジン（Ｔ）ではなくウラシル（Ｕ）であるという知見に関係する。
用語「ポリペプチド」は、少なくとも約４、５、６、７、または８アミノ酸のポリマーを意味する。本明細書全体を通じて、アミノ酸には標準的な３文字記号または１文字記号を使用する。当該技術分野では、この用語は多くの場合に「ペプチド」または「タンパク質」と同義的に使用される。
「組換え」ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、インビトロでの分子操作に供されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
本明細書で使用される場合、用語「特異的な」、「〜を特異的に結合する」および「特異的に〜を結合する」は、抗体の標的抗原エピトープとの選択的な結合を指す。抗体は、所与の一組の条件下で適切な抗原に対する結合を無関係の抗原または抗原混合物に対する結合と比較することにより、結合の特異性について試験することができる。抗体が、無関係な抗原または抗原混合物と比べて適切な抗原に対して少なくとも２倍、５倍、７倍、および好ましくは１０倍多く結合する場合、それは特異的であると見なされる。一実施形態において、特異抗体は、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ関連抗原（特に１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ）には結合するが、無関係な抗原には結合しないものである。
本明細書で使用される場合、「治療すること」または「治療的な」および文法的に関連する用語は、生存の延長、病的状態の低下、および／または代替的な治療モダリティにより副次的に生じる副作用の軽減など、疾患の任意の転帰の任意の改善を指し；当該技術分野において容易に理解されるとおり、治療行為の必要条件ではないものの、疾患の完全な根絶が好ましい。
「１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ関連タンパク質」は、本明細書で具体的に特定されるもの（図１を参照のこと）、並びに本明細書に概説される方法または当該技術分野で容易に利用可能な方法に従い必要以上に実験を行うことなく単離／生成し、且つ特徴付けることができる対立遺伝子変異体、保存的置換変異体、類似体および相同体を含む。異なる１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質またはその断片の一部を組み合わせる融合タンパク質、並びに１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質と異種ポリペプチドとの融合タンパク質もまた含まれる。かかる１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質はまとめて１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ関連タンパク質、本発明のタンパク質、または１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂと称される。用語「１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ関連タンパク質」は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個のアミノ酸、または２５個より多いアミノ酸；または、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３３０、３３５、３３９個のアミノ酸またはそれより多いアミノ酸のポリペプチド断片または１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質配列を指す。
ＩＩ．）１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体
本発明のＡＤＣ用の抗体は、生理学的条件下において１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質に特異的に結合し、且つ１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ関連タンパク質ではないペプチドまたはタンパク質には結合しない（または弱く結合する）。
抗体、具体的にはモノクローナル抗体の様々な調製方法が当該技術分野において周知である。例えば抗体は、好適な哺乳動物宿主を、単離形態またはイムノコンジュゲート形態の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ関連タンパク質、ペプチド、またはその断片を使用して免疫化することにより調製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｄｓ．，Ｈａｒｌｏｗ，ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９））。加えて、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＧＳＴ−融合タンパク質などの、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂの融合タンパク質もまた使用することができる。詳細な実施形態では、図１のアミノ酸配列の全てまたはほとんどを含むＧＳＴ融合タンパク質が産生され、次にそれを免疫原として使用して適切な抗体が生成される。別の実施形態では、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ関連タンパク質は合成され、免疫原として使用される。
加えて、当該技術分野において公知のネイキッドＤＮＡ免疫化法を使用して（精製１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ関連タンパク質または１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現細胞を用いてまたは用いずに）、免疫応答を生じさせることによって免疫原がコードされる（レビューについてはＤｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８を参照のこと）。
図１に示されるとおりの１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質のアミノ酸配列を解析し、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質のなかで抗体を生成するための特定の領域を選択することができる。例えば、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂアミノ酸配列の疎水性および親水性分析を用いて１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ構造中の親水性領域が同定される。１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質のなかで免疫原性構造を示す領域、並びに他の領域およびドメインを、チョウ−ファスマン（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ）、ガルニエ−ロブソン（Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ）、カイト−ドゥーリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、アイゼンベルク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）、カープラス−シュルツ（Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ）またはジェイムソン−ウォルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ）分析などの、当該技術分野において公知の様々な他の方法を用いて容易に同定することができる。親水性プロファイルを、Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８の方法を用いて生成することができる。ハイドロパシシティ（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）プロファイルを、Ｋｙｔｅ，Ｊ．ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２の方法を用いて作成することができる。露出残基プロファイルパーセント（％）を、Ｊａｎｉｎ Ｊ．，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ ２７７：４９１−４９２の方法を用いて生成することができる。平均可動性プロファイルを、Ｂｈａｓｋａｒａｎ Ｒ．，Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ Ｐ．Ｋ．，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５の方法を用いて生成することができる。βターンプロファイルを、Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ Ｂ．，１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：２８９−２９４の方法を用いて生成することができる。従って、これらのプログラムまたは方法のいずれによって同定される各領域も、本発明の範囲内にある。１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体の好ましい生成方法は、本明細書に提供される例によってさらに例示される。免疫原として使用されるタンパク質またはポリペプチドの調製方法は、当該技術分野において周知されている。またタンパク質の、担体、例えばＢＳＡ、ＫＬＨまたは他の担体タンパク質との免疫原性コンジュゲートの調製方法も、当該技術分野において周知されている。ある場合には、例えばカルボジイミド試薬を使用する直接的なコンジュゲーションが用いられ；他の場合には、連結試薬、例えばＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬにより供給されるものなどが有効である。１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ免疫原の投与は、当該技術分野において理解されるとおり、注射によって好適な期間にわたり、且つ好適なアジュバントの使用を伴い行われることが多い。免疫化スケジュールの間、抗体の力価をとることにより抗体形成の妥当性を判断することができる。
好ましい実施形態において、本発明のＡＤＣ用の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂは、Ｈ１６−７．８と命名される抗体の重鎖および軽鎖可変領域（図３を参照のこと）、またはＨ１６−７．８の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を含む重可変領域および軽可変領域を含み、且つ抗体は、本発明の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂの所望の機能特性（特に１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに対する結合活性）を保持する。Ｈ１６−７．８の重鎖可変領域は、配列番号：７の２０番目のＱ残基から１４２番目のＳ残基までの範囲のアミノ酸配列からなり、Ｈ１６−７．８の軽鎖可変領域は、配列番号：８の２０番目のＥ残基から１２７番目のＲ残基までの範囲のアミノ酸配列からなる。本発明の抗体の定常領域としては、任意のサブクラスの定常領域を選択することができる。好ましくは、重鎖定常領域としてヒトＩｇＧ２定常領域が、および軽鎖定常領域としてヒトＩｇκ定常領域が使用され得る。１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂの１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質との反応性（結合活性）は、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現細胞またはその抽出物を使用するウエスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳ分析を含め、多くの公知の手段により確立することができる。
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変化するように、例えば増加または減少するように改変される。この手法については、Ｂｏｄｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数を変化させることで、例えば、軽鎖および重鎖の構築が容易になるか、または１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂの安定性が増加若しくは低下する。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させることにより、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂの生物学的半減期が短縮される。より具体的には、Ｆｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン接合領域に１つまたは複数のアミノ酸突然変異が導入され、それにより抗体のブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合が天然ＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合と比べて減弱される。この手法については、Ｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．による米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂは、その生物学的半減期が増加するように改変される。様々な手法が可能である。例えば、Ｗａｒｄに対する米国特許第６，２７７，３７５号に記載されるとおり突然変異を導入することができる。或いは、Ｐｒｅｓｔａ，ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，８６９，０４６号および同第６，１２１，０２２号に記載されるとおり、生物学的半減期を延長させるため、抗体をＣＨ１領域またはＣＬ領域内において、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含むように変化させることができる。
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置き換えることによりＦｃ領域を変化させて、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂのエフェクター機能を変化させる。例えば、エフェクターリガンドに対する抗体の親和性を変化させ、しかしながら親抗体の抗原結合能は維持するようにして、アミノ酸特異的残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸を別のアミノ酸残基に置き換えることができる。変化させる親和性の対象となるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１構成要素であってもよい。この手法は、双方ともＷｉｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。
一実施形態において、本発明のＡＤＣ用の抗体は、当該技術分野において公知の組換え手段により産生される。例えば、組換え抗体は、抗体をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることにより産生することができる。１つまたは複数のベクターを使用して、少なくとも１つのＶＬ領域および１つのＶＨ領域を発現するＤＮＡ配列を宿主細胞にトランスフェクトすることができる。抗体生成および産生の組換え手段についての例示的な記載としては、Ｄｅｌｖｅｓ，ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ：ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｗｉｌｅｙ，１９９７）；Ｓｈｅｐｈａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，最新版）が挙げられる。
本発明のＡＤＣ用の抗体は、本明細書に開示されるその重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列情報に基づき、当該技術分野において一般に公知の方法を使用して当業者により容易に調製され得る。具体的には、本発明のＡＤＣ用の抗体の重鎖可変領域アミノ酸（配列番号：７の２０位〜１４２位）をコードする塩基配列を有する重鎖可変領域遺伝子断片と、本発明のＡＤＣ用の抗体の軽鎖可変領域アミノ酸（配列番号：８の２０位〜１２７位）をコードする塩基配列を有する軽鎖可変領域遺伝子断片とが調製される。次に、それらの可変領域遺伝子が適切なクラスのヒト抗体の定常領域遺伝子とつなぎ合わされ、抗体遺伝子が調製される。次に、その抗体遺伝子が適切な発現ベクターにつなぎ合わされ、培養細胞に導入される。最後に、その培養細胞が培養され、それにより培養上清から抗体を得ることができる。
本発明の抗体の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸（配列番号：７の２０位〜１４２位および配列番号：８の２０位〜１２７位）をコードする上記の可変領域遺伝子断片の各々は、重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：７の２０位〜１４２位および配列番号：８の２０位〜１２７位）に基づき設計された塩基配列に基づくか、または配列番号：４の９１位〜４５９位および配列番号：６の１００位〜４２３位により示される本発明の抗体の重鎖および軽鎖可変領域の塩基配列に基づき、当該技術分野において一般に公知の遺伝子合成方法を使用して調製することができる。かかる遺伝子合成方法としては、国際公開公報第９０／０７８６１号に記載される抗体遺伝子合成方法などの当業者に自明の様々な方法を用いることができる。次に、上述の可変領域遺伝子断片とヒト抗体の定常領域遺伝子とがつなぎ合わされ、抗体遺伝子が調製される。使用するヒト抗体の定常領域として任意の定常領域サブクラスを選択することができるが、しかしながら好ましくは、重鎖定常領域としてヒトＩｇ［γ］２が、および軽鎖定常領域としてヒトＩｇ［κ］が用いられ得る。
配列番号：７の２０位〜１４２位により示される重鎖可変領域遺伝子とヒトＩｇ［γ］２重鎖定常領域遺伝子とをつなぎ合わせることにより得られる、本発明のＡＤＣ用の抗体の好ましい抗体重鎖遺伝子としては、配列番号：７の２０位〜４６８位により示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子、より好ましくは配列番号：４の９１位〜１４３７位により示される塩基配列を含む遺伝子を挙げることができる。配列番号：８の２０位〜１２７位により示される軽鎖可変領域遺伝子とヒトＩｇ［κ］軽鎖定常領域遺伝子とをつなぎ合わせることにより得られる、本発明のＡＤＣ用の抗体の好ましい抗体軽鎖遺伝子としては、配列番号：８の２０位〜２３３位により示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子、より好ましくは配列番号：６の１００位〜７４１位により示される塩基配列を含む遺伝子を挙げることができる。配列番号：４の９１位〜１４３７位により示される塩基配列を含む重鎖遺伝子と、配列番号：６の１００位〜７４１位により示される塩基配列を含む軽鎖遺伝子とによりコードされる本発明のＡＤＣ用の抗体としてはＨ１６−７．８を挙げることができ、この抗体については下記の実施例に記載する。
この抗体遺伝子の調製に続き、抗体遺伝子の発現ベクターへの導入、発現ベクターの培養細胞への導入、培養細胞の培養、抗体の精製などが、当該技術分野において一般に公知の様々な方法を用いて行われ得る。発現ベクターは、それが抗体遺伝子を発現可能である限り、限定を受けるものではない。ＡＧ−［γ］２またはＡＧ−［κ］などのヒトＩｇ定常領域遺伝子を予め有する発現ベクターを利用することが好ましく、なぜなら、単に抗体可変領域遺伝子をそこに挿入した時点で抗体遺伝子を有する発現ベクターになり得るためである。
上述の発現ベクターは、例えばリン酸カルシウム法などによって培養細胞に導入される。発現ベクターを導入する培養細胞の例として、ＣＨＯ細胞などの培養細胞を使用することができ、そうした培養細胞は従来の方法によって培養され得る。上述の培養後、培養上清に蓄積した抗体は、例えば、プロテインＡカラムを使用する様々なクロマトグラフィーにより、精製することができる。
このように得られた１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質との反応性（結合活性）は、必要に応じて１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現細胞またはその抽出物を使用する、ウエスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳ分析を含め、多くの公知の手段により確立することができる。このように得られた抗体、または必要に応じてさらに精製した後にも抗体による活性を保持する抗体断片が、ＡＤＣ用の抗体として調製され得る。１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体またはその断片を、検出可能マーカーで標識するか、または第２の分子にコンジュゲートさせることができる。好適な検出可能マーカーとしては、限定はされないが、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられる。さらに、２つ以上の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂエピトープに対して特異的な二重特異性抗体が、当該技術分野において一般に公知の方法を用いて生成される。ホモ二量体抗体もまた、当該技術分野において公知の架橋法により生成することができる（例えば、Ｗｏｌｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）。
さらに別の好ましい実施形態において、本発明のＡＤＣ用の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂは、Ｈ１６−７．８と命名される抗体の重鎖および軽鎖を含む抗体である。Ｈ１６−７．８の重鎖は、配列番号：７の２０番目のＱ残基から４６８番目のＫ残基までの範囲のアミノ酸配列からなり、Ｈ１６−７．８の軽鎖は、配列番号：８の配列の２０番目のＥ残基から２３３番目のＣ残基までの範囲のアミノ酸配列からなる。その配列は図２および図３に示す。好ましい実施形態において、Ｈ１６−７．８は細胞傷害剤にコンジュゲートされる。
ＩＩＩ．）抗体−薬物コンジュゲートの概要
別の態様において、本発明は、ＭＭＡＦなどの細胞傷害剤にコンジュゲートされた抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。別の態様において、本発明はさらに、ＡＤＣの使用方法を提供する。一態様においてＡＤＣは、細胞傷害剤に共有結合した上記の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂのいずれかを含む。
細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤、すなわち癌の治療において腫瘍細胞を死滅させるかまたは阻害する薬物を局所送達するための抗体−薬物コンジュゲートの使用により（Ｓｙｒｉｇｏｓ ａｎｄ Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；米国特許第４，９７５，２７８号）、薬物成分を腫瘍に標的化して送達し、且つそこで細胞内蓄積させることが可能となり、ここで未コンジュゲートのそうした薬物の薬剤を全身投与すると、正常細胞への毒性のレベル並びに排除しようとする腫瘍細胞のレベルが許容し難いものとなり得る（Ｂａｌｄｗｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ ｐｐ．（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３−０５；Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）"Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，" Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ'８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．ｓ），ｐｐ．４７５−５０６）。従って、最小の毒性で最大の有効性が求められる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の双方が、これらの戦略に有用であることが報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３−８７）。これらの方法で使用される薬物としては、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびビンデシンが挙げられる（Ｒｏｗｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，（１９８６）上記）。抗体−毒素コンジュゲートに使用される毒素としては、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物性毒素、ゲルダナマイシンなどの小分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊｏｕｒ．ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、メイタンシノイド（ＥＰ １３９１２１３；Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３）、およびカリケアマイシン（Ｌｏｄｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）が挙げられる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含めた機構によるその細胞傷害効果および細胞増殖抑制効果をもたらし得る。一部の細胞傷害性薬物は、より大型の抗体またはタンパク質受容体リガンドにコンジュゲートされる場合に、不活性であるか、または活性が低い傾向がある。
抗体薬物コンジュゲートの例はＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）であり、これは、正常および悪性Ｂリンパ球の表面に見られるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と、チオ尿素リンカー−キレート剤により結合される１１１Ｉｎまたは９０Ｙ放射性同位元素とから構成される抗体−放射性同位元素コンジュゲートである（Ｗｉｓｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２７（７）：７６６−７７；Ｗｉｓｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ ９９（１２）：４３３６−４２；Ｗｉｔｚｉｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：２４５３−６３；Ｗｉｔｚｉｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１５）：３２６２−６９）。
加えて、カリケアマイシンに連結されたｈｕ ＣＤ３３抗体から構成される抗体薬物コンジュゲートであるＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が、注射による急性骨髄性白血病の治療に対して２０００年に承認された（Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ（２０００）２５（７）：６８６；米国特許第４９７０１９８号；同第５０７９２３３号；同第５５８５０８９号；同第５６０６０４０号；同第５６９３７６２号；同第５７３９１１６号；同第５７６７２８５号；および同第５７７３００１号）。
加えて、ジスルフィドリンカーＳＰＰによってメイタンシノイド薬物成分ＤＭ１に連結されたｈｕＣ２４２抗体から構成される抗体薬物コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）が、ＣａｎＡｇを発現する癌、例えば結腸癌、膵癌、胃癌などの治療について第ＩＩ相試験に進んでいる。
加えて、メイタンシノイド薬物成分ＤＭ１に連結された抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体から構成される抗体薬物コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．、ＢＺＬ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）が、前立腺腫瘍の治療可能性について開発段階にある。
最後に、ドラスタチンの合成類似体であるオーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）が、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌腫のルイスＹに特異的）およびｃＡＣ１０（血液系悪性腫瘍のＣＤ３０に特異的）にコンジュゲートされており（Ｄｏｒｏｎｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（７）：７７８−７８４）、治療の開発段階にある。
ＩＩＩ（Ａ）．オーリスタチンおよびドロスタチン（Ｄｏｌｏｓｔａｔｉｎ）
ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、並びに核***および細胞***を妨げ（Ｗｏｙｋｅ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、且つ抗癌活性（米国特許第５６６３１４９号）および抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有することが示されている。ドラスタチンまたはオーリスタチン薬物成分は、ペプチド薬物成分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に結合され得る（国際公開公報第０２／０８８１７２号）。
例示的なオーリスタチンの実施形態には、Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ，"Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，" Ｖｏｌｕｍｅ ４５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６２３に開示され、且つ２００４年３月２８日に発表された（その開示は全体として参照により明示的に援用される）、Ｎ末端連結型のモノメチルオーリスタチン薬物成分ＤＥおよびＤＦが含まれる。
例示的なオーリスタチンの実施形態はＭＭＡＥである（式中、波線は抗体薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）との共有結合を示す）。
Figure 2017095459
別の例示的なオーリスタチンの実施形態はＭＭＡＦであり、式中、波線は抗体薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）との共有結合を示す（米国特許第２００５／０２３８６４９号）。
Figure 2017095459
ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦおよび様々なリンカー構成要素（本明細書にさらに記載される）を含むさらなる例示的実施形態は、以下の構造および略称を有する（式中、Ａｂは抗体を意味し、且つｐは１〜約１２である）。
Figure 2017095459
本発明のＡＤＣはＭＭＡＦを含む。好ましい実施形態で本発明のＡＤＣは、リンカーとしてマレイミドカプロイル（ｍｃ）を、および薬物としてＭＭＡＦを含む。
ＩＶ．）１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを結合する抗体−薬物コンジュゲート化合物
本発明は、とりわけ、薬物を標的化して送達するための抗体−薬物コンジュゲート化合物を提供する。本発明者らは、抗体−薬物コンジュゲート化合物が、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを発現する細胞に対して強力な細胞傷害活性および／または細胞増殖抑制活性を有することを発見した。抗体−薬物コンジュゲート化合物は、少なくとも１つの薬物単位に共有結合的に連結した抗体単位を含む。薬物単位は、直接、またはリンカー単位（−ＬＵ−）を介して、共有結合的に連結され得る。
いくつかの実施形態において、抗体薬物コンジュゲート化合物は、以下の式：
Ｌ−（ＬＵ−Ｄ）ｐ （Ｉ）
、またはその薬学的に許容可能な塩または溶媒和物を有し；式中、
Ｌは抗体単位、例えば本発明の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂであり、且つ
（ＬＵ−Ｄ）はリンカー単位−薬物単位成分であり、式中、
ＬＵ−はリンカー単位であり、且つ
−Ｄは、標的細胞に対して細胞増殖抑制活性または細胞傷害活性を有する薬物単位であり；且つ
ｐは１〜２０の整数である。
いくつかの実施形態において、ｐは、１〜１２、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２の範囲である。いくつかの実施形態において、ｐは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４または２〜３の範囲である。他の実施形態において、ｐは、１、２、３、４、５または６である。いくつかの実施形態において、ｐは２または４である。
いくつかの実施形態において、抗体薬物コンジュゲート化合物は、以下の式：
Ｌ−（Ａａ−Ｗｗ−Ｙｙ−Ｄ）ｐ （ＩＩ）
、またはその薬学的に許容可能な塩または溶媒和物を有し、式中、
Ｌは抗体単位、例えば１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂであり；且つ
−Ａａ−Ｗｗ−Ｙｙ−はリンカー単位（ＬＵ）であり、式中、
−Ａ−はストレッチャー単位であり、
ａは０または１であり、
各−Ｗ−は独立してアミノ酸単位であり、
ｗは０〜１２の範囲の整数であり、
−Ｙ−は自己犠牲型（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）スペーサー単位であり、
ｙは０、１または２であり；
−Ｄは、標的細胞に対して細胞増殖抑制活性または細胞傷害活性を有する薬物単位であり；且つ
ｐは１〜２０の整数である。
いくつかの実施形態において、ａは０または１であり、ｗは０または１であり、且つｙは０、１または２である。いくつかの実施形態において、ａは０または１であり、ｗは０または１であり、且つｙは０または１である。いくつかの実施形態において、ｐは、１〜１２、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２の範囲である。いくつかの実施形態において、ｐは、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４または２〜３の範囲である。他の実施形態において、ｐは、１、２、３、４、５または６である。いくつかの実施形態において、ｐは２または４である。いくつかの実施形態において、ｗが０でない場合、ｙは１または２である。いくつかの実施形態において、ｗが１〜１２である場合、ｙは１または２である。いくつかの実施形態において、ｗは２〜１２であり、ｙは１または２である。いくつかの実施形態において、ａは１であり、ｗおよびｙは０である。
複数の抗体を含む組成物について、薬物負荷は抗体当たりの平均薬物分子数ｐで表される。薬物負荷は抗体当たり１〜１２個の薬物（Ｄ）の範囲であり得る。コンジュゲーション反応の調製における抗体当たりの平均薬物数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ法、およびＨＰＬＣなどの従来の手段によって特徴付けることができる。ｐに関する抗体−薬物コンジュゲートの量的分布もまた決定することができる。ある場合には、ｐが特定の値である同種の抗体−薬物コンジュゲートを、他の薬物負荷を有する抗体−薬物コンジュゲートから分離し、精製し、且つ特徴付けることが、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動法などの手段によって実現され得る。例示的実施形態では、ｐは２〜８である。
抗体−薬物コンジュゲート化合物の生成は、当業者に公知の任意の技法により達成することができる。簡潔に言えば、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、抗体単位としての１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂと、薬物と、任意で、薬物と結合体とをつなぎ合わせるリンカーとを含む。好ましい実施形態において、抗体は、上記に記載されるＨ１６−７．８と命名される抗体の重鎖および軽鎖可変領域を含む１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂである。より好ましい実施形態では、抗体は、上記に記載されるＨ１６−７．８と命名される抗体の重鎖および軽鎖を含む１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂである。薬物および／またはリンカーの結合剤との共有結合には、数多くの異なる反応を利用することが可能である。これは、リジンのアミン基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基および芳香族アミノ酸の様々な成分を含め、結合剤、例えば抗体分子のアミノ酸残基の反応により達成されることが多い。最も一般的に使用される非特異的共有結合方法の一つは、化合物のカルボキシ基（またはアミノ基）を抗体のアミノ基（またはカルボキシ基）と連結するカルボジイミド反応である。加えて、ジアルデヒドまたはイミドエステルなどの二官能性の薬剤を使用して化合物のアミノ基が抗体分子のアミノ基と連結されている。シッフ塩基反応もまた、薬物の結合剤との結合に利用可能である。この方法は、グリコール基またはヒドロキシ基を含む薬物の過ヨウ素酸酸化を伴い、従ってアルデヒドが形成され、次にそれを結合剤と反応させる。結合は、結合剤のアミノ基とシッフ塩基を形成することにより起こる。イソチオシアネートもまた、薬物を結合剤と共有結合させるためのカップリング剤として使用することができる。他の技法が当業者に公知であり、本発明の範囲内にある。
特定の実施形態では、リンカーの前駆体である中間体を適切な条件下で薬物と反応させる。特定の実施形態では、薬物および／または中間体上で反応基が使用される。薬物と中間体との反応による生成物、すなわち誘導体化薬物を、続いて適切な条件下で１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂと反応させる。
抗体−薬物コンジュゲート化合物の特定の単位の各々については、本明細書にさらに詳細に記載される。例示的リンカー単位、ストレッチャー単位、アミノ酸単位、自己犠牲型スペーサー単位、および薬物単位の合成および構造についてはまた、米国特許出願公開第２００３−００８３２６３号、同第２００５−０２３８６４９号および同第２００５−０００９７５１号（各々は、全体としておよびあらゆる目的から参照により本明細書に援用される）にも記載がある。
Ｖ．）リンカー単位
典型的には、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、薬物単位と抗体単位との間にリンカー領域を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは細胞内条件下で切断可能であり、従って細胞内環境においてリンカーの切断により抗体から薬物単位が放出される。さらに他の実施形態において、リンカー単位は切断できないものであり、薬物は、例えば抗体分解により放出される。
いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオレア（ｃａｖｅｏｌｅａ）の範囲内）に存在する切断剤により切断可能である。リンカーは、例えば、限定はされないがリソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含めた、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素により切断されるペプチジルリンカーであってもよい。いくつかの実施形態において、ペプチジルリンカーは少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断剤としてはカテプシンＢおよびＤ並びにプラスミンを挙げることができ、これらはいずれもジペプチド薬物誘導体を加水分解することが知られ、それにより標的細胞内部で活性薬物の放出が起こる（例えば、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７−１２３を参照のこと）。最も典型的には、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現細胞に存在する酵素により切断可能なペプチジルリンカーである。例えば、癌性組織で高度に発現するチオール依存性プロテアーゼのカテプシンＢにより切断可能なペプチジルリンカーを使用することができる（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカー（配列番号：９）。かかるリンカーの他の例が、例えば米国特許第６，２１４，３４５号（全体としておよびあらゆる目的から参照により本明細書に援用される）に記載される。特定の実施形態では、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーはＶａｌ−ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである（例えば、米国特許第６，２１４，３４５号を参照のこと。これはドキソルビシンのｖａｌ−ｃｉｔリンカーとの合成について記載する）。細胞内タンパク質分解性の治療剤放出を用いる一つの利点は、薬剤がコンジュゲートされると典型的には減弱され、且つコンジュゲートの血清安定性が典型的には高いことである。
他の実施形態において、切断可能リンカーはｐＨ感受性であり、すなわちある特定のｐＨ値で加水分解に感受性を有する。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソームにおいて加水分解性である酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シスアコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号；同第５，８２４，８０５号；同第５，６２２，９２９号；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７−１２３；Ｎｅｖｉｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３−１４６６１を参照のこと）。かかるリンカーは、血液のように中性のｐＨ条件下では比較的安定しているが、リソソームの近似ｐＨであるｐＨ５．５または５．０を下回ると不安定になる。特定の実施形態において、加水分解性リンカーはチオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合したチオエーテルなど（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照のこと）である。
さらに他の実施形態において、リンカーは還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが当該技術分野において公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオ酢酸）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを使用して形成することができるものが挙げられる（例えば、Ｔｈｏｒｐｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５９２４−５９３１；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ，ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｐｒｅｓｓ，１９８７を参照のこと。また米国特許第４，８８０，９３５号も参照のこと）。
さらに他の具体的な実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）、または３'−Ｎ−アミド類似体（Ｌａｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
さらに他の実施形態において、リンカー単位は切断できないものであり、薬物は抗体分解によって放出される（全体としておよびあらゆる目的から本明細書に参照により援用される米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号を参照のこと）。好ましい実施形態において、リンカー単位はマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。
典型的には、リンカーは細胞外環境に対して実質的に感受性を有しない。本明細書で使用される場合、「細胞外環境に対して実質的に感受性を有しない」は、リンカーとの関連では、抗体−薬物コンジュゲート化合物が細胞外環境中（例えば、血漿中）にある場合に抗体−薬物コンジュゲート化合物の試料中において切断されるリンカーが約２０％以下、典型的には約１５％以下、より典型的には約１０％以下、およびさらにより典型的には約５％以下、約３％以下、または約１％以下であることを意味する。リンカーが細胞外環境に対して実質的に感受性を有しないかどうかは、例えば、血漿と共に抗体−薬物コンジュゲート化合物を所定の時間（例えば、２、４、８、１６、または２４時間）にわたりインキュベートし、次に血漿中に存在する遊離薬物の量を測ることにより判定することができる。
その他の相互排他的でない実施形態において、リンカーは細胞内在化を促進する。特定の実施形態において、リンカーは、治療剤にコンジュゲートされると（すなわち、本明細書に記載されるとおりの抗体−薬物コンジュゲート化合物のリンカー−治療剤成分の環境において）、細胞内在化を促進する。さらに他の実施形態において、リンカーは、オーリスタチン化合物および１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂの双方にコンジュゲートされると細胞内在化を促進する。
本組成物および方法で使用することのできる様々な例示的リンカーは、国際公開公報第２００４−０１０９５７号、米国特許出願公開第２００６００７４００８号、米国特許出願公開第２００５０２３８６４９号、および米国特許出願公開第２００６００２４３１７号（これらの各々は、全体としておよびあらゆる目的から本明細書に参照により援用される）に記載されている。
「リンカー単位」（ＬＵ）は、抗体−薬物コンジュゲート化合物が形成されるように薬物単位と抗体単位とを連結するために使用することのできる二官能性化合物である。いくつかの実施形態において、リンカー単位は式：
−Ａａ−Ｗｗ−Ｙｙ−
を有し、式中、−Ａ−はストレッチャー単位であり、
ａは０または１であり、
各−Ｗ−は独立してアミノ酸単位であり、
ｗは０〜１２の範囲の整数であり、
−Ｙ−は自己犠牲型スペーサー単位であり、且つ
ｙは０、１または２である。
いくつかの実施形態において、ａは０または１であり、ｗは０または１であり、且つｙは０、１または２である。いくつかの実施形態において、ａは０または１であり、ｗは０または１であり、且つｙは０または１である。いくつかの実施形態において、ｗが１〜１２である場合、ｙは１または２である。いくつかの実施形態において、ｗが２〜１２である場合、ｙは１または２である。いくつかの実施形態において、ａは１であり、ｗおよびｙは０である。
ＶＩ．）ストレッチャー単位
存在する場合にストレッチャー単位（Ａ）は、抗体単位を、存在する場合にアミノ酸単位（−Ｗ−）と、存在する場合にスペーサー単位（−Ｙ−）と；または薬物単位（−Ｄ）と連結する能力を有する。自然に或いは化学的操作によって１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂ（例えばＨ１６−７．８）上に存在し得る有用な官能基としては、限定はされないが、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、炭水化物のアノマーヒドロキシル基、およびカルボキシルが挙げられる。好適な官能基はスルフヒドリルおよびアミノである。一例において、スルフヒドリル基は、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂの分子内ジスルフィド結合を還元することにより生成することができる。別の実施形態では、スルフヒドリル基は、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂのリジン成分のアミノ基を２−イミノチオラン（トラウト試薬）または他のスルフヒドリル生成試薬と反応させることにより生成することができる。特定の実施形態において、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂは組換え抗体であり、１つまたは複数のリジンを有するように遺伝子操作される。特定の他の実施形態において、組換え１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂは、さらなるスルフヒドリル基、例えばさらなるシステインを有するように遺伝子操作される。
一実施形態において、ストレッチャー単位は抗体単位の硫黄原子と結合を形成する。硫黄原子は抗体のスルフヒドリル基に由来し得る。この実施形態の代表的なストレッチャー単位は式ＩＩＩａおよび式ＩＩＩｂの角括弧内に示され、式中、Ｌ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは上記に定義されるとおりであり、且つＲ１７は、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルケニレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキニレン−、カルボシクロ−、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキレン）−、Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルケニレン）−、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキニレン）−、−アリーレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン−アリーレン、−Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン−アリーレン、−アリーレン−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−アリーレン−Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン−、−アリーレン−Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（カルボシクロ）−、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン−（カルボシクロ）−、−Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン−（カルボシクロ）−、−（カルボシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−（カルボシクロ）−Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン−、−（カルボシクロ）−Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン、−ヘテロシクロ−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（ヘテロシクロ）−、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン−（ヘテロシクロ）−、−Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン−（ヘテロシクロ）−、−（ヘテロシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−（ヘテロシクロ）−Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン−、−（ヘテロシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキニレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−から選択され、且つｒは１〜１０の範囲の整数であり、ここで前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、炭素環、カルボシクロ、ヘテロシクロ、およびアリーレンラジカルは、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、炭素環、カルボシクロ、ヘテロシクロ、およびアリーレンラジカルは、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、置換されていない。いくつかの実施形態において、Ｒ１７は、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−カルボシクロ−、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキレン）−、−アリーレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（カルボシクロ）−、−（カルボシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（ヘテロシクロ）−、−（ヘテロシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−から選択され；およびｒは１〜１０の範囲の整数であり、ここで前記アルキレン基は置換されておらず、残りの基は置換されていてもよい。
例示的実施形態の全てから、明示的に指示されない場合であっても１〜１２個の薬物成分が抗体に連結され得る（ｐ＝１〜１２）ことが理解されるべきである。
Figure 2017095459
例示的なストレッチャー単位は、Ｒ１７が−（ＣＨ２）５−である式ＩＩＩａのものである。
Figure 2017095459
別の例示的なストレッチャー単位は、Ｒ１７が−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−であり；且つｒが２である式ＩＩＩａのものである。
Figure 2017095459
例示的なストレッチャー単位は、Ｒ１７が−アリーレン−またはアリーレン−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−である式ＩＩＩａのものである。いくつかの実施形態において、アリール基は非置換フェニル基である。
さらに別の例示的なストレッチャー単位は、Ｒ１７が−（ＣＨ２）５−である式ＩＩＩｂのものである。
Figure 2017095459
特定の実施形態において、ストレッチャー単位は、抗体単位の硫黄原子とストレッチャー単位の硫黄原子との間のジスルフィド結合を介して抗体単位に連結される。この実施形態の代表的なストレッチャー単位は式ＩＶの角括弧内に示され、式中、Ｒ１７、Ｌ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは上記に定義されるとおりである。
Figure 2017095459
本願全体を通じて、文脈によって特に指示されない限り、以下の式中のＳ成分は抗体単位の硫黄原子を指すことに留意すべきである。
Figure 2017095459
さらに他の実施形態において、ストレッチャーは、抗体の第一級または第二級アミノ基と結合を形成することのできる反応部位を含む。そのような反応部位の例としては、限定はされないが、活性化エステル、例えば、スクシンイミドエステル、４ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、スルホニルクロリド、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられる。この実施形態の代表的なストレッチャー単位は式Ｖａおよび式Ｖｂの角括弧内に示され、式中、−Ｒ１７−、Ｌ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは上記に定義されるとおりである。
Figure 2017095459
いくつかの実施形態において、ストレッチャーは、抗体上に存在し得る改変された炭水化物の（−ＣＨＯ）基との反応性を有する反応部位を含む。例えば、炭水化物は、過ヨウ素酸ナトリウムなどの試薬を使用して穏やかに酸化させることができ、得られる酸化炭水化物の（−ＣＨＯ）単位は、Ｋａｎｅｋｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２：１３３−４１により記載されるものなどの、ヒドラジド、オキシム、第一級または第二級アミン、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジンなどの官能性を含むストレッチャーと縮合することができる。この実施形態の代表的なストレッチャー単位は式ＶＩａ、式ＶＩｂ、および式ＶＩｃの角括弧内に示され、式中、−Ｒ１７−、Ｌ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは上記のように定義されるとおりである。
Figure 2017095459
ＶＩＩ．）アミノ酸単位
存在する場合にアミノ酸単位（−Ｗ−）は、スペーサー単位が存在する場合にはストレッチャー単位をスペーサー単位と連結し、スペーサー単位が存在しない場合にはストレッチャー単位を薬物成分と連結し、且つストレッチャー単位およびスペーサー単位が存在しない場合には抗体単位を薬物単位と連結する。
Ｗｗ−は、例えば、モノペプチド、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチド単位であってもよい。各−Ｗ−単位は、独立して、以下で角括弧内に示す式を有し、且つｗは０〜１２の範囲の整数である。
Figure 2017095459
式中、Ｒ１９は、水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジルメチル−、３−ピリジルメチル−、４−ピリジルメチル−、フェニル、シクロヘキシル、
Figure 2017095459
である。
いくつかの実施形態において、アミノ酸単位は、癌関連または腫瘍関連プロテアーゼを含む１つまたは複数の酵素により酵素的に切断されることによって薬物単位（−Ｄ）を遊離させることができ、この薬物単位（−Ｄ）は、一実施形態では放出されると生体内でプロトン化され、薬物（Ｄ）を提供する。
特定の実施形態において、アミノ酸単位は天然アミノ酸を含むことができる。他の実施形態において、アミノ酸単位は非天然アミノ酸を含むことができる。例示的なＷｗ単位は式（ＶＩＩ）〜式（ＩＸ）により表される。
Figure 2017095459
式中、Ｒ２０およびＲ２１は以下のとおりである。
Figure 2017095459
Figure 2017095459
式中、Ｒ２０、Ｒ２１およびＲ２２は以下のとおりである。
Figure 2017095459
Figure 2017095459
式中、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２およびＲ２３は以下のとおりである。
Figure 2017095459
例示的アミノ酸単位としては、限定はされないが式ＶＩＩの単位が挙げられ、式中、Ｒ２０がベンジルであり、且つＲ２１が−（ＣＨ２）４ＮＨ２であるか；Ｒ２０がイソプロピルであり、且つＲ２１が−（ＣＨ２）４ＮＨ２であるか；またはＲ２０がイソプロピルであり、且つＲ２１が−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２である。別の例示的アミノ酸単位は式ＶＩＩＩの単位であり、式中、Ｒ２０はベンジルであり、Ｒ２１はベンジルであり、且つＲ２２は−（ＣＨ２）４ＮＨ２である。
有用な−Ｗｗ−単位は、特定の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼによる酵素的切断についてのその選択性において設計および最適化が行われ得る。一実施形態において、−Ｗｗ−単位は、その切断がカテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼにより触媒されるものである。
一実施形態において、−Ｗｗ−は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチドである。Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２またはＲ２３が水素以外である場合、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２またはＲ２３が結合する炭素原子は不斉である。
Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２またはＲ２３が結合する各炭素原子は、独立して（Ｓ）配置または（Ｒ）配置である。
アミノ酸単位の一態様において、アミノ酸単位はバリン−シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ−ｃｉｔ）である。別の態様において、アミノ酸単位はフェニルアラニン−リジン（すなわちｆｋ）である。アミノ酸単位のさらに別の態様において、アミノ酸単位はＮ−メチルバリン−シトルリンである。さらに別の態様において、アミノ酸単位は５−アミノ吉草酸、ホモフェニルアラニンリジン、テトライソキノリンカルボキシレートリジン、シクロヘキシルアラニンリジン、イソネペコチン酸（ｉｓｏｎｅｐｅｃｏｔｉｃ ａｃｉｄ）リジン、β−アラニンリジン、グリシンセリンバリングルタミンおよびイソネペコチン酸である。
ＶＩＩＩ．）スペーサー単位
存在する場合にスペーサー単位（−Ｙ−）は、アミノ酸単位が存在する場合にアミノ酸単位を薬物単位と連結する。或いは、スペーサー単位は、アミノ酸単位が存在しない場合にストレッチャー単位を薬物単位と連結する。スペーサー単位はまた、アミノ酸単位およびストレッチャー単位の双方が存在しない場合に薬物単位を抗体単位と連結する。
スペーサー単位には２つの一般的な型があり、非自己犠牲型または自己犠牲型である。非自己犠牲型スペーサー単位は、抗体−薬物コンジュゲートからアミノ酸単位が切断された後、特に酵素的に切断された後も、スペーサー単位の一部または全てが薬物成分と結合したまま残るものである。非自己犠牲型スペーサー単位の例としては、限定はされないが、（グリシン−グリシン）スペーサー単位およびグリシンスペーサー単位（双方ともスキーム１に示される）（下記）が挙げられる。グリシン−グリシンスペーサー単位またはグリシンスペーサー単位を含むコンジュゲートが酵素（例えば、腫瘍細胞関連プロテアーゼ、癌細胞関連プロテアーゼまたはリンパ球関連プロテアーゼ）によって酵素的切断を受ける場合、グリシン−グリシン−薬物成分またはグリシン−薬物成分がＬ−Ａａ−Ｗｗ−から切断される。一実施形態では、標的細胞内で独立した加水分解反応が起こることによってグリシン−薬物成分結合が切断され、薬物が遊離する。
Figure 2017095459
いくつかの実施形態において、非自己犠牲型スペーサー単位（−Ｙ−）は−Ｇｌｙ−である。いくつかの実施形態において、非自己犠牲型スペーサー単位（−Ｙ−）は−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−である。
一実施形態では、スペーサー単位が存在しない（ｙ＝０）薬物−リンカーコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物が提供される。
或いは、自己犠牲型スペーサー単位を含むコンジュゲートが−Ｄを放出できる。本明細書で使用される場合、用語「自己犠牲型スペーサー」は、２つの離間した化学的成分を共に共有結合的に連結して安定した３部構成の分子にすることが可能な二官能性の化学的成分を指す。自己犠牲型スペーサーは、第１の成分とのその結合が切断される場合に、第２の化学的成分から自発的に分離し得る。
いくつかの実施形態において、−Ｙｙ−は、フェニレン部分がＱｍで置換されているｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）単位（スキーム２および３を参照）であり、式中、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルケニル、−Ｃ１−Ｃ８アルキニル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキニル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり；且つｍは０〜４の範囲の整数である。アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基は、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、任意で置換されていてもよい。
いくつかの実施形態において、−Ｙ−は、ＰＡＢ基のアミノ窒素原子を介して−Ｗｗ−に連結し、且つカーボネート基、カルバメート基またはエーテル基を介して−Ｄに直接結合するＰＡＢ基である。特定の理論または機構により拘束されるものではないが、スキーム２は、Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：１８６６−１８７２により記載されるとおりの、カルバメート基またはカーボネート基を介して−Ｄに直接結合するＰＡＢ基の可能な薬物放出機構を示す。
Figure 2017095459
スキーム２において、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルケニル、−Ｃ１−Ｃ８アルキニル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキニル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり；ｍは０〜４の範囲の整数であり；且つｐは１〜約１２の範囲である。アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基は、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、任意で置換されていてもよい。
特定の理論または機構により拘束されるものではないが、スキーム３は、エーテル結合またはアミン結合を介して−Ｄに直接結合するＰＡＢ基の可能な薬物放出機構を示し、ここでＤは、薬物単位の一部である酸素基または窒素基を含む。
Figure 2017095459
スキーム３において、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルケニル、−Ｃ１−Ｃ８アルキニル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキニル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり；ｍは０〜４の範囲の整数であり；且つｐは１〜約１２の範囲である。アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基は、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、任意で置換されていてもよい。
自己犠牲型スペーサーの他の例としては、限定はされないが、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（Ｈａｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）およびｏ−またはｐ−アミノベンジルアセタール類などの、電子的にＰＡＢ基と同様の芳香族化合物が挙げられる。置換および非置換４−アミノ酪酸アミド類（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：２２３）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系（Ｓｔｏｒｍ，ｅｔ ａｌ．，１９７２，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：５８１５）および２−アミノフェニルプロピオン酸アミド類（Ａｍｓｂｅｒｒｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：５８６７）などの、アミド結合が加水分解されると環化を受けるスペーサーを使用することができる。グリシンのα位で置換されているアミン含有薬物の脱離（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１４４７）もまた、自己犠牲型スペーサーの例である。
一実施形態において、スペーサー単位は、スキーム４に示すとおりの分枝状ビス（ヒドロキシメチル）−スチレン（ＢＨＭＳ）単位であり、これは複数の薬物の組込みおよび放出に使用することができる。
Figure 2017095459
スキーム４において、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルケニル、−Ｃ１−Ｃ８アルキニル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキニル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり；ｍは０〜４の範囲の整数であり；ｎは０または１であり；且つｐは１〜約１２の範囲である。アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基は、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、任意で置換されていてもよい。
いくつかの実施形態では、−Ｄ成分は同じである。さらに別の実施形態では、−Ｄ成分は異なる。
一態様において、スペーサー単位（−Ｙｙ−）は式（Ｘ）〜式（ＸＩＩ）により表される。
Figure 2017095459
式中、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルケニル、−Ｃ１−Ｃ８アルキニル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキニル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり；且つｍは０〜４の範囲の整数である。アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基は、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、任意で置換されていてもよい。
Figure 2017095459
抗体−薬物コンジュゲート化合物を含む式Ｉおよび式ＩＩの実施形態としては、以下を挙げることができる。
式中、ｗおよびｙは、各々、０、１または２である
Figure 2017095459
並びに、
式中、ｗおよびｙは、各々、０である
Figure 2017095459
Figure 2017095459
ＩＸ．）薬物単位
薬物成分（Ｄ）は、任意の細胞傷害性、細胞増殖抑制性または免疫調節性（例えば免疫抑制性）または薬物であってよい。Ｄは、スペーサー単位、アミノ酸単位、ストレッチャー単位または抗体単位と結合を形成することのできる原子を有する薬物単位（成分）である。いくつかの実施形態において、薬物単位Ｄは、スペーサー単位と結合を形成することのできる窒素原子を有する。本明細書で使用される場合、用語「薬物単位」と用語「薬物成分」とは同義語であり、互いに代替的に使用される。
有用な細胞傷害剤または免疫調節剤クラスとしては、例えば、抗チューブリン剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害薬、およびアルキル化剤が挙げられる。
いくつかの実施形態において、薬物はオーリスタチン、例えばオーリスタチンＥ（当該技術分野ではドラスタチン−１０の誘導体としてもまた公知である）またはその誘導体である。オーリスタチンは、例えば、オーリスタチンＥとケト酸との間に形成されたエステルであり得る。例えば、オーリスタチンＥは、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応することにより、それぞれＡＥＢおよびＡＥＶＢを生成することができる。他の典型的なオーリスタチンには、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、およびＭＭＡＥが含まれる。例示的なオーリスタチンの合成および構造については、米国特許出願公開第２００３−００８３２６３号、同第２００５−０２３８６４９号および同第２００５−０００９７５１号；国際特許公報 国際公開公報第０４／０１０９５７号、国際特許公報 国際公開公報第０２／０８８１７２号、および米国特許第６，３２３，３１５号；同第６，２３９，１０４号；同第６，０３４，０６５号；同第５，７８０，５８８号；同第５，６６５，８６０号；同第５，６６３，１４９号；同第５，６３５，４８３号；同第５，５９９，９０２号；同第５，５５４，７２５号；同第５，５３０，０９７号；同第５，５２１，２８４号；同第５，５０４，１９１号；同第５，４１０，０２４号；同第５，１３８，０３６号；同第５，０７６，９７３号；同第４，９８６，９８８号；同第４，９７８，７４４号；同第４，８７９，２７８号；同第４，８１６，４４４号；および同第４，４８６，４１４号に記載されており、各々が全体としておよびあらゆる目的から本明細書に参照により援用される。
オーリスタチンは、微小管動態並びに核***および細胞***を妨げ、且つ抗癌活性を有することが示されている。ＭＭＡＦはチューブリンを結合し、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現細胞に対して細胞傷害効果または細胞増殖抑制効果を及ぼし得る。オーリスタチンまたは得られた抗体−薬物コンジュゲートが所望の細胞系に対して細胞増殖抑制効果または細胞傷害効果を及ぼすかどうかを判定するために用いることのできるアッセイ法は、当該技術分野において公知の様々なものが数多くある。
化合物がチューブリンを結合するかどうかを判定する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ ２００６，７８，４３９０−４３９７；Ｈａｍｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９５ ４７：９６５−９７６；およびＨａｍｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０ ２６５：２８，１７１４１−１７１４９を参照のこと。本発明の目的上、化合物のチューブリンに対する相対親和性が決定されてもよい。本発明のいくつかの好ましいオーリスタチンは、ＭＭＡＥのチューブリンに対する結合親和性と比べて１０倍低い親和性（より弱い親和性）から、ＭＭＡＥのチューブリンに対する結合親和性と比べて１０倍、２０倍またはさらには１００倍高い親和性（より高い親和性）に至る範囲の親和性でチューブリンを結合する。
いくつかの実施形態において、−Ｄは、式ＤＥまたは式ＤＦのオーリスタチン、またはその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物の形態である。
Figure 2017095459
式中、各位置で独立して：
波線は結合を示し；
Ｒ２は、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニルであり；
Ｒ３は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、−炭素環、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（炭素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（炭素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（炭素環）、−アリール、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（アリール）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（アリール）、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（アリール）、複素環、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（複素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（複素環）、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（複素環）であり；
Ｒ４は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、炭素環、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（炭素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（炭素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（炭素環）、アリール、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（アリール）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（アリール）、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（アリール）、−複素環、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（複素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（複素環）、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（複素環）であり；
Ｒ５は、−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ８アルキルであるか；
またはＲ４およびＲ５は一緒になって炭素環式環を形成し、且つ式−（ＣＲａＲｂ）ｓ−（式中、ＲａおよびＲｂは、独立して、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、または−炭素環であり、且つｓは２、３、４、５または６である）を有し、
Ｒ６は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニルであり；
Ｒ７は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、炭素環、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（炭素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（炭素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（炭素環）、−アリール、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（アリール）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（アリール）、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（アリール）、複素環、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（複素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（複素環）、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（複素環）であり；
各Ｒ８は、独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２０アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ２０アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２０アルキニル）、または−炭素環であり；
Ｒ９は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニルであり；
Ｒ２４は、−アリール、−複素環、または−炭素環であり；
Ｒ２５は、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、−炭素環、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２０アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ２０アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ２０アルキニル）、またはＯＲ１８であり、式中、Ｒ１８は、−Ｈ、ヒドロキシル保護基、またはＯＲ１８が＝Ｏを表す場合に直接結合であり；
Ｒ２６は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、−アリール、−複素環、または−炭素環であり；
Ｒ１０は、−アリールまたは−複素環であり；
Ｚは、−Ｏ、−Ｓ、−ＮＨ、または−ＮＲ１２であり、式中、Ｒ１２は、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニルであり；
Ｒ１１は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、−アリール、−複素環、−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−Ｒ１４、または−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−ＣＨ（Ｒ１５）２であり；
ｍは１〜１０００の範囲の整数であり；
Ｒ１３は、−Ｃ２−Ｃ２０アルキレン、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレンであり；
Ｒ１４は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニルであり；
Ｒ１５は存在ごとに独立して、−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、または−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｃ２−Ｃ２０アルキニルであり；
Ｒ１６は存在ごとに独立して、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニルまたは−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨであり；且つ
ｎは０〜６の範囲の整数であり；
ここで前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、炭素環、および複素環ラジカルは、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、置換されていてもよい。
式ＤＥのオーリスタチンには、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、炭素環、および複素環ラジカルが置換されていないものが含まれる。
式ＤＥのオーリスタチンには、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９の基が置換されておらず、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１の基が本明細書に記載されるとおり置換されていてもよいが含まれる。
式ＤＥのオーリスタチンには、
Ｒ２がＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｒ３、Ｒ４およびＲ７が、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、単環式Ｃ３−Ｃ６炭素環、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（単環式Ｃ３−Ｃ６炭素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（単環式Ｃ３−Ｃ６炭素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（単環式Ｃ３−Ｃ６炭素環）、Ｃ６−Ｃ１０アリール、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、複素環、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（複素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（複素環）、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（複素環）から独立して選択され；ここで前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、炭素環、アリールおよび複素環ラジカルは置換されていてもよく；
Ｒ５が−Ｈであり；
Ｒ６が−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり；
各Ｒ８が、−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２０アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ２０アルケニル）、または−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ２０アルキニル）から独立して選択され、ここで前記アルキル、アルケニル、およびアルキニルラジカルは置換されていてもよく；
Ｒ９が−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｒ２４が置換されていてもよい−フェニルであり；
Ｒ２５が−ＯＲ１８であり；式中、Ｒ１８は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、またはＯＲ１８が＝Ｏを表す場合に直接結合であり；
Ｒ２６が、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、または−炭素環から選択され；ここで前記アルキル、アルケニル、アルキニルおよび炭素環ラジカルは置換されていてもよいもの；またはその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物の形態が含まれる。
式ＤＥのオーリスタチンには、
Ｒ２がメチルであり；
Ｒ３が、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、またはＣ２−Ｃ８アルキニルであり、ここで前記アルキル、アルケニルおよびアルキニルラジカルは置換されていてもよく；
Ｒ４が、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニル、−Ｃ２−Ｃ８アルキニル、単環式Ｃ３−Ｃ６炭素環、−Ｃ６−Ｃ１０アリール、−Ｃ１−Ｃ８アルキレン（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−Ｃ２−Ｃ８アルケニレン（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−Ｃ２−Ｃ８アルキニレン（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−Ｃ１−Ｃ８アルキレン（単環式Ｃ３−Ｃ６炭素環）、−Ｃ２−Ｃ８アルケニレン（単環式Ｃ３−Ｃ６炭素環）、−Ｃ２−Ｃ８アルキニレン（単環式Ｃ３−Ｃ６炭素環）であり；ここで前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリールおよび炭素環ラジカルは、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、置換されていてもよく；
Ｒ５が−Ｈであり；
Ｒ６がメチルであり；
Ｒ７が、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ２−Ｃ８アルケニルまたは−Ｃ２−Ｃ８アルキニルであり；
各Ｒ８がメトキシであり；
Ｒ９が−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｒ２４が−フェニルであり；
Ｒ２５が−ＯＲ１８であり；式中、Ｒ１８は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、またはＯＲ１８が＝Ｏを表す場合に直接結合であり；
Ｒ２６がメチルであるもの；
またはその薬学的に許容可能な塩が含まれる。
式ＤＥのオーリスタチンには、
Ｒ２がメチルであり；Ｒ３が−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ３アルキルであり；Ｒ４が−Ｃ１−Ｃ５アルキルであり；Ｒ５が−Ｈであり；Ｒ６がメチルであり；Ｒ７がイソプロピルまたはｓｅｃ−ブチルであり；Ｒ８がメトキシであり；Ｒ９が−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり；Ｒ２４がフェニルであり；Ｒ２５が−ＯＲ１８であり；式中、Ｒ１８は、−Ｈ、ヒドロキシル保護基、またはＯＲ１８が＝Ｏを表す場合に直接結合であり；且つＲ２６がメチルであるもの、またはその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物の形態が含まれる。
式ＤＥのオーリスタチンには、
Ｒ２がメチルまたはＣ１−Ｃ３アルキルであり；
Ｒ３が−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ３アルキルであり；
Ｒ４が−Ｃ１−Ｃ５アルキルであり；
Ｒ５がＨであり；
Ｒ６がＣ１−Ｃ３アルキルであり；
Ｒ７が−Ｃ１−Ｃ５アルキルであり；
Ｒ８が−Ｃ１−Ｃ３アルコキシであり；
Ｒ９が−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｒ２４がフェニルであり；
Ｒ２５が−ＯＲ１８であり；式中、Ｒ１８は、−Ｈ、ヒドロキシル保護基、またはＯＲ１８が＝Ｏを表す場合に直接結合であり；且つ
Ｒ２６が−Ｃ１−Ｃ３アルキルであるもの；
またはその薬学的に許容可能な塩の形態が含まれる。
式ＤＦのオーリスタチンには、
Ｒ２がメチルであり；
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ７が、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、単環式Ｃ３−Ｃ６炭素環、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（単環式Ｃ３−Ｃ６炭素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（単環式Ｃ３−Ｃ６炭素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（単環式Ｃ３−Ｃ６炭素環）、−Ｃ６−Ｃ１０アリール、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、複素環、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン（複素環）、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン（複素環）、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン（複素環）から独立して選択され；ここで前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、炭素環、アリールおよび複素環ラジカルは、単独であってもまたは別の基の一部としてであっても、置換されていてもよく；
Ｒ５が−Ｈであり；
Ｒ６がメチルであり；
各Ｒ８がメトキシであり；
Ｒ９が、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニルであり；ここで前記アルキル、アルケニルおよびアルキニルラジカルは置換されていてもよく；
Ｒ１０が、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよい複素環であり；
Ｚが、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、または−ＮＲ１２であり、ここで、Ｒ１２は、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニルであり、その各々が置換されていてもよく；
Ｒ１１が、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、−アリール、−複素環、−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−Ｒ１４、または−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−ＣＨ（Ｒ１５）２であり、ここで前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよび複素環ラジカルは置換されていてもよく；
ｍが１〜１０００の範囲の整数であるか、またはｍ＝０であり；
Ｒ１３が、−Ｃ２−Ｃ２０アルキレン、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニレンであり、その各々が置換されていてもよく；
Ｒ１４が、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、または−Ｃ２−Ｃ２０アルキニルであり、ここで前記アルキル、アルケニルおよびアルキニルラジカルは置換されていてもよく；
Ｒ１５が存在ごとに独立して、−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、または−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｃ２−Ｃ２０アルキニルであり、ここで前記アルキル、アルケニルおよびアルキニルラジカルは置換されていてもよく；
Ｒ１６が存在ごとに独立して、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ２０アルキル、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ２０アルキニルまたは−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨであり、ここで前記アルキル、アルケニルおよびアルキニルラジカルは置換されていてもよく；
ｎが０〜６の範囲の整数であるもの；
またはその薬学的に許容可能な塩が含まれる。
これらの実施形態のあるものでは、Ｒ１０は、置換されていてもよいフェニルである。
式ＤＦのオーリスタチンには、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９の基が置換されておらず、且つＲ１０およびＲ１１の基が本明細書に記載されるとおりであるものが含まれる。
式ＤＦのオーリスタチンには、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、炭素環、および複素環ラジカルが置換されていないものが含まれる。
式ＤＦのオーリスタチンには、
Ｒ２が−Ｃ１−Ｃ３アルキルであり；Ｒ３が−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ３アルキルであり；Ｒ４が−Ｃ１−Ｃ５アルキルであり；Ｒ５が−Ｈであり；Ｒ６が−Ｃ１−Ｃ３アルキルであり；Ｒ７が−Ｃ１−Ｃ５アルキルであり；Ｒ８が−Ｃ１−Ｃ３アルコキシであり；Ｒ９が−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり；Ｒ１０が、置換されていてもよいフェニルであり；Ｚが、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−であり；Ｒ１１が本明細書に定義されるとおりであるもの；またはその薬学的に許容可能な塩が含まれる。
式ＤＦのオーリスタチンには、
Ｒ２がメチルであり；Ｒ３が−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ３アルキルであり；Ｒ４が−Ｃ１−Ｃ５アルキルであり；Ｒ５が−Ｈであり；Ｒ６がメチルであり；Ｒ７がイソプロピルまたはｓｅｃ−ブチルであり；Ｒ８がメトキシであり；Ｒ９が−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり；Ｒ１０が、置換されていてもよいフェニルであり；Ｚが、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−であり；且つＲ１１が本明細書に定義されるとおりであるもの；またはその薬学的に許容可能な塩が含まれる。
式ＤＦのオーリスタチンには、
Ｒ２がメチルであり；Ｒ３が−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ３アルキルであり；Ｒ４が−Ｃ１−Ｃ５アルキルであり；Ｒ５が−Ｈであり；Ｒ６がメチルであり；Ｒ７がイソプロピルまたはｓｅｃ−ブチルであり；Ｒ８がメトキシであり；Ｒ９が−ＨまたはＣ１−Ｃ８アルキルであり；Ｒ１０がフェニルであり；且つＺが−Ｏ−または−ＮＨ−であり且つＲ１１が本明細書に定義されるとおりであり、好ましくは水素であるもの；またはその薬学的に許容可能な塩の形態が含まれる。
式ＤＦのオーリスタチンには、
Ｒ２が−Ｃ１−Ｃ３アルキルであり；Ｒ３が−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ３アルキルであり；Ｒ４が−Ｃ１−Ｃ５アルキルであり；Ｒ５が−Ｈであり；Ｒ６が−Ｃ１−Ｃ３アルキルであり；Ｒ７が−Ｃ１−Ｃ５アルキルであり；Ｒ８が−Ｃ１−Ｃ３アルコキシであり；Ｒ９が−Ｈまたは−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり；Ｒ１０がフェニルであり；且つＺが−Ｏ−または−ＮＨ−であり且つＲ１１が本明細書に定義されるとおりであり、好ましくは水素であるもの；またはその薬学的に許容可能な塩の形態が含まれる。
式ＤＥまたはＤＦのオーリスタチンには、Ｒ３、Ｒ４およびＲ７が独立してイソプロピルまたはｓｅｃ−ブチルであり、且つＲ５が−Ｈであるものが含まれる。例示的実施形態において、Ｒ３およびＲ４は各々イソプロピルであり、Ｒ５はＨであり、且つＲ７はｓｅｃ−ブチルである。残りの置換基は本明細書に定義されるとおりである。
式ＤＥまたはＤＦのオーリスタチンには、Ｒ２およびＲ６が各々メチルであり、且つＲ９がＨであるものが含まれる。残りの置換基は本明細書に定義されるとおりである。
式ＤＥまたはＤＦのオーリスタチンには、Ｒ８が存在ごとに−ＯＣＨ３であるものが含まれる。残りの置換基は本明細書に定義されるとおりである。
式ＤＥまたはＤＦのオーリスタチンには、Ｒ３およびＲ４が各々イソプロピルであり、Ｒ２およびＲ６が各々メチルであり、Ｒ５がＨであり、Ｒ７がｓｅｃ−ブチルであり、Ｒ８が存在ごとに−ＯＣＨ３であり、且つＲ９がＨであるものが含まれる。残りの置換基は本明細書に定義されるとおりである。
式ＤＦのオーリスタチンには、Ｚが−Ｏ−または−ＮＨ−であるものが含まれる。残りの置換基は本明細書に定義されるとおりである。
式ＤＦのオーリスタチンには、Ｒ１０がアリールであるものが含まれる。残りの置換基は本明細書に定義されるとおりである。
式ＤＦのオーリスタチンには、Ｒ１０が−フェニルであるものが含まれる。残りの置換基は本明細書に定義されるとおりである。
式ＤＦのオーリスタチンには、Ｚが−Ｏ−であり、且つＲ１１が、Ｈ、メチルまたはｔ−ブチルであるものが含まれる。残りの置換基は本明細書に定義されるとおりである。
式ＤＦのオーリスタチンには、Ｚが−ＮＨ−である場合、Ｒ１１が−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−ＣＨ（Ｒ１５）２であり、式中、Ｒ１５は−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２であり、且つＲ１６は−Ｃ１−Ｃ８アルキルまたは−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨであるものが含まれる。残りの置換基は本明細書に定義されるとおりである。
式ＤＦのオーリスタチンには、Ｚが−ＮＨ−である場合、Ｒ１１が−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−ＣＨ（Ｒ１５）２であり、式中、Ｒ１５は−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈであるものが含まれる。残りの置換基は本明細書に定義されるとおりである。
好ましい実施形態において、Ｄが式ＤＥのオーリスタチンである場合、ｗは、１〜１２、好ましくは２〜１２の範囲の整数であり、ｙは１または２であり、且つａは好ましくは１である。
いくつかの実施形態において、Ｄが式ＤＦのオーリスタチンである場合、ａは１であり、且つｗおよびｙは０である。
例示的な薬物単位（−Ｄ）としては、以下の構造を有する薬物単位、またはその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物が挙げられる。
Figure 2017095459
Figure 2017095459
Figure 2017095459
一態様において、親水基、例えば、限定はされないがトリエチレングリコールエステル（ＴＥＧ）などを、Ｒ１１で薬物単位に結合させることができる。理論によって拘束されるものではないが、親水基は薬物単位の内在化および抗凝集に役立つ。
いくつかの実施形態において、薬物単位はＴＺＴ−１０２７ではない。いくつかの実施形態において、薬物単位は、オーリスタチンＥ、ドラスタチン１０、またはオーリスタチンＰＥではない。
好ましい実施形態において、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、式中「Ｌ」または「ｍＡｂ−ｓ−」が、本明細書に示されるＨ１６−７．８と命名される１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂを表す以下の構造、またはその薬学的に許容可能な塩を有する。
Figure 2017095459
いくつかの実施形態において、薬物単位は、カリケアマイシン、カンプトテシン、メイタンシノイド、またはアントラサイクリンである。いくつかの実施形態において、薬物は、タキサン、トポイソメラーゼ阻害薬、ビンカアルカロイドなどである。
いくつかの典型的な実施形態において、好適な細胞傷害剤としては、例えば、ＤＮＡ副溝結合剤（例えば、エンジインおよびレキシトロプシン、ＣＢＩ化合物；また米国特許第６，１３０，２３７号も参照のこと）、デュオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、ピューロマイシン、およびビンカアルカロイドが挙げられる。他の細胞傷害剤としては、例えば、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡおよびＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、セマドチン、メイタンシノイド、ディスコデルモリド、エリュテロビン、およびミトキサントロンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、薬物は抗チューブリン剤である。抗チューブリン剤の例としては、オーリスタチン、タキサン（例えば、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Ｔｕｌａｒｉｋ）およびビンカアルキロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋｙｌｏｉｄ）（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）が挙げられる。他の抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体（例えば、エポチロンＡおよびＢ）、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルシミド（ｃｏｌｃｉｍｉｄ）、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、およびエリュテロビンが挙げられる。
特定の実施形態において、細胞傷害剤は、別の群の抗チューブリン剤であるメイタンシノイドである。例えば、具体的な実施形態において、メイタンシノイドはメイタンシンまたはＤＭ−１である（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１も参照のこと）。
特定の実施形態において、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤はドラスタチンである。特定の実施形態において、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤はオーリスタチンクラスのものである。従って、具体的な実施形態において、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤はＭＭＡＥ（式ＸＩ）である。別の具体的な実施形態において、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤はＡＦＰ（式ＸＶＩ）である。
Figure 2017095459
特定の実施形態において、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、以下の式ＸＩＩ〜式ＸＸＩの化合物またはその薬学的に許容可能な塩である。
Figure 2017095459
Figure 2017095459
Figure 2017095459
ｐは１〜１２である。より好ましい実施形態において、抗体−薬物コンジュゲート化合物は以下の構造を有し、式中、「ｍＡｂ−ｓ−」は、本明細書に示されるＨ１６−７．８と命名される１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂを表し、且つｐは４である。
Figure 2017095459
特定の実施形態において、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤はＭＭＡＦ（式ＸＶＩＶ）である。
Ｘ．）薬物負荷
薬物負荷はｐにより表され、分子中における抗体当たりの平均薬物成分数である。薬物負荷は抗体当たり１〜２０個の薬物成分（Ｄ）の範囲であり得る。本発明のＡＤＣは、１から２０までの様々な範囲の薬物成分とコンジュゲートした抗体の集合を含む。コンジュゲーション反応からのＡＤＣ調製物中における抗体当たりの平均薬物成分数は、質量分析、およびＥＬＩＳＡアッセイ法などの従来の手段により特徴付けることができる。ｐに関するＡＤＣの量的分布もまた決定することができる。ある場合には、ｐが特定の値である同種のＡＤＣを、他の薬物負荷を有するＡＤＣから分離し、精製し、且つ特徴付けることが、電気泳動法などの手段によって実現され得る。
いくつかの抗体−薬物コンジュゲートについて、ｐが抗体上の結合部位の数によって制限され得る。例えば、上記の例示的実施形態にあるとおり、結合がシステインチオールである場合、抗体はシステインチオール基を１個のみ若しくは数個有し得るか、またはそれを介してリンカーが結合し得る十分な反応性を有するチオール基を１個のみ若しくは数個有し得る。特定の実施形態では、より高い薬物負荷、例えばｐ＞５は、特定の抗体−薬物コンジュゲートの凝集、不溶解、毒性、または細胞透過性の喪失を起こし得る。特定の実施形態において、本発明のＡＤＣの薬物負荷は、１〜約１２；１〜約８；約２〜約６；約３〜約５；約３〜約４；約３．１〜約３．９；約３．２〜約３．８；約３．２〜約３．７；約３．２〜約３．６；約３．３〜約３．８；または約３．３〜約３．７の範囲である。実際、特定のＡＤＣについて、抗体当たりの薬物成分の最適な比は８未満であってよく、および約２〜約５であってよいことが示されている。米国特許第２００５−０２３８６４９ Ａ１号（本明細書に全体として参照により援用される）を参照のこと。
特定の実施形態では、コンジュゲーション反応中、理論上の最大薬物成分より少ない数が抗体にコンジュゲートする。抗体は、以下で考察するとおり、例えば薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しないリジン残基を含み得る。概して抗体は、薬物成分と連結し得る反応性の遊離システインチオール基を多くは含まない。実際には、抗体中のほとんどのシステインチオール残基がジスルフィド架橋として存在する。特定の実施形態では、抗体を部分的または完全な還元条件下でジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤によって還元して、反応性システインチオール基を生成してもよい。特定の実施形態では、抗体を変性条件に供してリジンまたはシステインなどの反応性の求核基を露出させる。
ＡＤＣの負荷（薬物／抗体比）は様々な方法で、例えば以下によって制御することができる：（ｉ）抗体との反応性を有するモル過剰の薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬を抑制すること、（ｉｉ）コンジュゲーション反応時間または温度を抑制すること、（ｉｉｉ）システインチオール改変のための還元条件を部分的または制限的なものとすること、（ｉｖ）リンカー−薬物結合の数および／または位置が制御されるようにシステイン残基の数および位置を改変するため、組換え技術により抗体のアミノ酸配列を遺伝子操作すること（本明細書および国際公開公報第２００６／０３４４８８号（本明細書に全体として参照により援用される）に開示されるとおり調製されるチオＭａｂまたはチオＦａｂなど）。
２個以上の求核基が、薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応し、続いて薬物成分試薬と反応する場合、得られる生成物は、抗体に結合した１つまたは複数の薬物成分の分布を有するＡＤＣ化合物の混合物であることが理解されるべきである。抗体当たりの平均薬物数は、抗体に特異的で且つ薬物に特異的な二重ＥＬＩＳＡ抗体アッセイ法により混合物から計算されてもよい。個々のＡＤＣ分子は混合物において質量分析で同定し、ＨＰＬＣ、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分離し得る（例えば、Ｈａｍｂｌｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．"Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｒｕｇ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ＣＤ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，" Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．６２４，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ ４５，Ｍａｒｃｈ ２００４；Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．"Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，" Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．６２７，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ ４５，Ｍａｒｃｈ ２００４を参照のこと）。特定の実施形態では、単一の負荷値を有する同種ＡＤＣが、コンジュゲーション混合物から電気泳動法またはクロマトグラフィーにより分離され得る。
ＸＩ．）ＡＤＣの細胞傷害効果の判定方法
薬物または抗体−薬物コンジュゲートが細胞に対して細胞増殖抑制効果および／または細胞傷害効果を及ぼすかどうかを判定する方法は公知である。概して、抗体薬物コンジュゲートの細胞傷害活性または細胞増殖抑制活性が、以下により計測され得る。細胞培養培地において抗体薬物コンジュゲートの標的タンパク質を発現する哺乳動物細胞を曝露し；細胞を約６時間〜約５日間にわたり培養し；且つ細胞生存度を計測する。細胞ベースのインビトロアッセイ法を使用して抗体薬物コンジュゲートの生存度（増殖）、細胞傷害性、およびアポトーシス誘導（カスパーゼ活性化）を計測することができる。
抗体薬物コンジュゲートが細胞増殖抑制効果を及ぼすかどうかの判定には、チミジン取込みアッセイ法を用いてもよい。例えば、標的抗原を発現する癌細胞を５，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播き、７２時間の期間にわたり培養し、その７２時間の期間のうちの最後の８時間の間に０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンに曝露することができる。抗体薬物コンジュゲートの存在下および非存在下における培養物の細胞への３Ｈ−チミジンの取込みが計測される。
細胞傷害性を判定するには、壊死またはアポトーシス（プログラム細胞死）を計測することができる。壊死は典型的には、細胞膜透過性の増加；細胞の膨潤、および細胞膜の断裂を伴う。アポトーシスは典型的には、膜の小疱形成、細胞質の凝集、および内因性エンドヌクレアーゼの活性化により特徴付けられる。癌細胞に対するこれらの作用のいずれかを測定することにより、抗体薬物コンジュゲートが癌治療に有用であることが示される。
細胞生存度は、ニュートラルレッド、トリパンブルー、またはＡＬＡＭＡＲ（商標）ブルーなどの色素の細胞中における取込みを測定することにより計測することができる（例えば、Ｐａｇｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３：４７３−４７６を参照のこと）。かかるアッセイ法では、色素を含む培地中で細胞をインキュベートし、細胞を洗浄し、色素の細胞取込みを反映する残留色素を分光光度法で計測する。細胞傷害性の計測のためには、タンパク質結合色素のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）もまた使用することができる（Ｓｋｅｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１０７−１２）。
或いは、死細胞ではなく生細胞を検出することによる、哺乳動物細胞の生存および増殖についての定量的比色アッセイ法において、ＭＴＴなどのテトラゾリウム塩が用いられる（例えば、Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５−６３を参照のこと）。
アポトーシスは、例えばＤＮＡ断片化を計測することによって定量することができる。ＤＮＡ断片化をインビトロで定量的に測定する市販の測光法が利用可能である。かかるアッセイ法の例としては、ＴＵＮＥＬ（断片化したＤＮＡにおける標識ヌクレオチドの取込みを検出する）およびＥＬＩＳＡベースのアッセイ法が挙げられ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，１９９９，Ｎｏ．２，ｐｐ．３４−３７（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に記載されている。
アポトーシスはまた、細胞における形態学的な変化の計測によっても判定することができる。例えば、壊死と同様に、特定の色素（例えば、蛍光色素、例えばアクリジンオレンジまたは臭化エチジウムなど）の取込みを計測することにより、細胞膜の完全性の喪失を判定することができる。アポトーシス細胞数の計測方法については、Ｄｕｋｅ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９９２，ｐｐ．３．１７．１−３．１７．１６）により記載されている。細胞はまた、ＤＮＡ色素（例えば、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、またはヨウ化プロピジウム）で標識し、それらの細胞を、核の内膜に沿ったクロマチンの凝縮および辺縁趨向について観察することができる。アポトーシスを判定するために計測することができる他の形態学的な変化としては、例えば、細胞質凝集、膜の小疱形成の増加、および細胞収縮が挙げられる。
アポトーシス細胞の存在は、培養物の付着した区画と「浮遊した」区画の双方で計測することができる。例えば、双方の区画とも上清を除去して回収し、付着した細胞をトリプシン処理し、遠心分離洗浄ステップ（例えば、２０００ｒｐｍで１０分間）の後に調製物を合わせて1つにし、アポトーシスを（例えば、ＤＮＡ断片化の計測により）検出することができる。（例えば、Ｐｉａｚｚａ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５：３１１０−１６を参照のこと）。
インビボでは、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ治療組成物の効果は好適な動物モデルで評価することができる。例えば異種癌モデルを使用することができ、このモデルでは、癌の外植片または継代された異種移植組織がヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスなどの免疫不全動物に導入される（Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：４０２−４０８）。例えば、ＰＣＴ出願 国際公開公報第９８／１６６２８号および米国特許第６，１０７，５４０号は、原発腫瘍の発生、微小転移、および後期疾患に特徴的な造骨性転移の形成を反復させることが可能なヒト前立腺癌の様々な異種移植モデルについて記載している。腫瘍形成の阻害、腫瘍退縮または転移などを計測するアッセイ法を用いて有効性を予測することができる。
アポトーシスの促進を評価するインビボアッセイ法が、治療組成物の評価に有用である。一実施形態において、治療組成物で処置した腫瘍保有マウス由来の異種移植片をアポトーシス病巣の存在について調べ、未処置の対照異種移植片保有マウスと比較することができる。処置マウスの腫瘍に認められるアポトーシス病巣の程度から、組成物の治療効果の指標が提供される。
前述の方法の実施において使用される治療組成物は、所望の送達方法に好適な担体を含む薬学的組成物に製剤化することができる。好適な担体は、治療組成物と組み合わせた場合に治療組成物の抗腫瘍機能を維持し、且つ概して患者の免疫系との反応性を有しない任意の材料を含む。例としては、限定はされないが、滅菌リン酸緩衝生理食塩水溶液、静菌水などの、数多くの標準的な薬学的担体のいずれかが挙げられる（概して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓａｌ．，Ｅｄ．，１９８０を参照のこと）。
治療製剤は、可溶化し、治療組成物を腫瘍部位に送達可能な任意の経路によって投与することができる。潜在的に有効な投与経路としては、限定はされないが、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、臓器内、同所などが挙げられる。静脈内注射に好ましい製剤は、防腐処理済みの静菌水中の、防腐処理されていない滅菌水の溶液中の、および／または注射用０．９％滅菌塩化ナトリウム、ＵＳＰが入ったポリ塩化ビニル袋またはポリエチレン袋中で希釈された、治療組成物を含む。治療用タンパク質製剤は、滅菌粉末として、好ましくは真空下で凍結乾燥および保存し、その後、注射前に静菌水（例えば、ベンジルアルコール防腐剤を含む）または滅菌水で再構成することができる。
前述の方法を用いて癌を治療するための投薬量および投与プロトコールは、方法および標的とする癌により様々であり、概して当該技術分野で認められている数多くの他の要因に依存し得る。
ＸＩＩ．）癌の治療
１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂが、通常は限られた一群の組織において発現するが、表１に列挙されたものなどの癌においてもまた発現するタンパク質として同定されることで、かかる癌の治療に対して数多くの治療手法が利用可能となる。
注記すべきこととして、標的化されたタンパク質が正常組織、さらには正常な必須臓器の組織で発現する場合であっても、標的化された抗腫瘍療法は有用となっている。必須臓器とは、心臓または結腸などの、生命の維持に必要な臓器である。非必須臓器とは、取り除くことのできる臓器であって、取り除いてもなお個体が生存可能なものである。非必須臓器の例は、卵巣、***、および前立腺である。
正常組織において、さらには正常な必須組織において標的タンパク質が発現することは、該タンパク質も過剰発現する特定の腫瘍に対する治療薬としての該タンパク質についてのターゲティング剤の有用性を無効にするものではない。例えば、必須臓器における発現は、それ自体単独では有害となるものではない。加えて、前立腺および卵巣などの、無くても済むと見なされる臓器は、死亡率に影響を及ぼすことなく取り除くことができる。最後に、いくつかの必須臓器は、免疫特権により正常臓器の発現の影響を受けない。免疫特権を有する臓器は、血液臓器関門により血液から保護されているため免疫療法薬が到達できない臓器である。免疫特権を有する臓器の例は脳および精巣である。
従って、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質の活性を阻害する治療手法は、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを発現する癌に罹患している患者に有用である。こうした治療手法は概して３つのクラスに分類される。第１のクラスは、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂの機能が腫瘍細胞成長に関連する場合、その機能を調節して腫瘍細胞成長の阻害若しくは遅延をもたらすか、またはその死滅を生じさせる。第２のクラスは、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質のその結合パートナーとの、または他のタンパク質との結合または会合を阻害する様々な方法を含む。第３のクラスは、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ遺伝子の転写または１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する様々な方法を含む。
従って、癌患者は、好ましくは腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的な１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂイメージング、または１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現の存在および程度を確実に示す他の技法を用いて、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現の存在およびレベルについて評価され得る。この目的上、腫瘍生検または手術標本の免疫組織化学的分析が好ましい。腫瘍組織の免疫組織化学的分析方法は当該技術分野において公知である。
ＸＩＩＩ．）抗体ベースの治療法のための標的としての１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ
１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂは、抗体ベースの治療戦略の魅力的な標的である。細胞外分子および細胞内分子の双方を標的化する数多くの抗体戦略が当該技術分野において公知である（例えば、補体およびＡＤＣＣにより媒介される死滅並びに細胞内抗体の使用を参照のこと）。１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂは、対応する正常細胞と比べて様々な系統の癌細胞により発現されるため、免疫反応性組成物が標的外の臓器および組織と結合して引き起こされる非特異的なおよび／または標的外の毒性作用なしに優れた感受性を示す１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ免疫反応性組成物の全身投与が準備される。１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂのドメインと特異的な反応性を有する抗体が、好ましくは抗体薬物コンジュゲート（すなわちＡＤＣ）において毒素または治療剤を有するコンジュゲートとして、癌（好ましくは表１の癌、より好ましくは腎癌および／または肝癌）の全身的な治療に有用である。
当業者は、抗体を使用して、図１に示される１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ配列の免疫原性領域などの免疫原性分子を特異的に標的化および結合できることを理解する。加えて、当業者は、抗体の細胞傷害剤とのコンジュゲーションはルーチンであることを理解する（例えば、Ｓｌｅｖｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９３：１１ ３６７８−３６８４（Ｊｕｎｅ １，１９９９）を参照のこと）。細胞傷害剤および／または治療剤を細胞まで、当該の細胞が発現する分子（例えば、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ）に特異的な抗体とコンジュゲートさせるなどして直接送達すると、細胞傷害剤によってその公知の生物学的効果（すなわち、細胞傷害作用）がそれらの細胞に及ぼされ得る。
抗体−細胞傷害剤コンジュゲートを使用して細胞を死滅させる多種多様な組成物および方法が当該技術分野において公知である。癌との関連では、典型的な方法は、腫瘍を有する哺乳動物に対し、細胞表面上で発現する、そこに結合可能である、またはそこに局在化する抗原（例えば、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ）に結合するターゲティング剤（例えば、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂ、好ましくはＨ１６−７．８）と連結された特定の細胞傷害剤および／または治療剤を含む生物学的有効量のコンジュゲートを投与することを伴う。典型的な実施形態は、細胞傷害剤および／または治療剤を１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現細胞に送達する方法であり、これは、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂエピトープに免疫特異的に結合する抗体に細胞傷害剤をコンジュゲートさせるステップと、細胞を抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に曝露するステップとを含む。別の例示的な実施形態は、転移癌に罹患している疑いがある個体を治療する方法であり、これは、細胞傷害剤および／または治療剤にコンジュゲートされた抗体の治療有効量を含む薬学的組成物を前記個体に非経口的に投与するステップを含む。
１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体を使用する癌免疫療法は、限定はされないが、結腸癌（Ａｒｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１３３−１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ ９０：３１７９−３１８６，Ｔｓｕｎｅｎａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ ９０：２４３７−２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐｒｚｙｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２７７１−２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：９３−１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２０：５８１−５８９）、結腸直腸癌（Ｍｏｕｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６１６０−６１６６；Ｖｅｌｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：４３９８−４４０３）、および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７−１２７）を含む他の種類の癌の治療において成功裏に用いられている様々な手法に従い行うことができる。いくつかの治療手法は、ネイキッド抗体の毒素または放射性同位元素とのコンジュゲーション、例えばＹ９１またはＩ１３１の抗ＣＤ２０抗体とのコンジュゲーションなど（例えば、それぞれＺｅｖａｌｉｎ（商標），ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．またはＢｅｘｘａｒ（商標），Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を伴い、他のものは、抗体と他の治療剤との、例えばパクリタキセル（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）併用でのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（トラスツズマブ）との同時投与を伴う。
好ましい実施形態において、抗体は、上掲の細胞傷害剤、好ましくはＭＭＡＦ（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）と命名されるオーリスタチン誘導体とコンジュゲートされ得る。
本発明の治療法で使用される好ましいモノクローナル抗体は、いずれか完全ヒトのもの、および標的１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗原に高親和性で特異的に結合するものである。
ＸＩＶ．）１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣカクテル
本発明の治療法は、単一の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣ、並びに異なるＭＡｂ（すなわち、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂまたは他のタンパク質を結合するＭａｂ）の組み合わせ、すなわちカクテルの投与を企図する。かかるＭＡｂカクテルは、それが異なるエピトープを標的とするＭＡｂを含むため、異なるエフェクター機構を利用するため、または直接的な傷害性ＭＡｂを免疫エフェクター機能に依存するＭＡｂと組み合わせるため、特定の利点を有し得る。かかる組み合わせでのＭＡｂは相乗的な治療効果を呈し得る。加えて、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂは、限定はされないが、様々な化学療法剤および生物製剤、アンドロゲン遮断薬、免疫調節薬（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）、外科的手術または放射線を含めた他の治療モダリティと併用して投与することができる。好ましい実施形態において、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂはコンジュゲート形態で投与される。
１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣ製剤は、抗体を腫瘍細胞に送達可能な任意の経路によって投与される。投与経路としては、限定はされないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内などが挙げられる。概して治療は、静脈内注射（ＩＶ）などの許容可能な投与経路によって１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣ製剤を、典型的には、限定はされないが、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５ｍｇ／ｋｇ体重を含む範囲の用量で反復投与することを伴う。一般には１週当たり１０〜１０００ｍｇ ＭＡｂの範囲の用量が有効であり、十分に耐容される。
転移性乳癌の治療におけるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）での臨床経験に基づけば、約４ｍｇ／ｋｇ患者体重のＩＶ初回負荷用量と、それに続く週１回の約２ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量のＭＡｂ製剤が、許容される投与レジメンとなる。好ましくは、初回負荷用量は９０分以上の注入として投与される。定期的な維持量は３０分以上の注入として投与され、但し初回用量が十分に耐容されることを条件とする。当業者が理解するとおり、具体的な症例における理想的な投与レジメンには様々な要因が影響し得る。かかる要因としては、例えば、使用されるＭＡｂの結合親和性および半減期、患者体内での１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂの発現程度、循環中に流れ出た１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗原の程度、所望の定常状態抗体濃度レベル、治療頻度、および本発明の治療方法と併用される化学療法剤または他の薬剤の影響、並びに特定の患者の健康状態が挙げられる。
任意で、最も効果的な投与レジメンの判断の支援等のため、患者は所与の試料中の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂレベル（例えば、循環中の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗原および／または１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現細胞のレベル）について評価されるべきである。かかる評価はまた、治療全体を通じたモニタリングの目的からも用いられ、且つ他のパラメータ（例えば、尿細胞診および／または膀胱癌療法における免疫細胞レベル、または類推して、前立腺癌療法における血清中ＰＳＡレベル）の評価と組み合わせて治療の奏効を判断するのにも有用である。
本発明の目的は１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣを提供することであり、このＡＤＣは、腫瘍細胞、好ましくは表１の腫瘍細胞の成長を阻害するかまたは遅延させる。本発明のさらなる目的は、かかる１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣを使用して、特にかかる１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣを他の薬物または免疫学的に活性な治療と併用して、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて血管形成および他の生物学的機能を阻害し、それにより腫瘍成長を低下させる方法を提供することである。
ＸＶ．）併用療法
一実施形態において、ヒト腫瘍を含む腫瘍を、化学療法剤または放射線またはそれらの組み合わせと併せて１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣで治療すると、相乗効果がある。換言すれば、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣによる腫瘍成長の阻害が、化学療法剤または放射線またはそれらの組み合わせと併用すると予想以上に高まる。相乗効果は、例えば、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣのみの治療、または１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣと化学療法剤若しくは放射線とによる治療の相加効果から予想され得るものと比べて、併用治療を用いて腫瘍成長がより大きく阻害されることによって示され得る。好ましくは、相乗効果は癌の寛解により実証され、ここで１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣからは、或いは１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣと化学療法剤または放射線との相加的な組み合わせを使用する治療によっては、寛解は期待されない。
１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣおよび化学療法または放射線または双方の併用を用いて腫瘍細胞の成長を阻害する方法は、化学療法または放射線療法の開始前、開始中、および開始後に、並びにそれらの任意の組み合わせで（すなわち、化学療法および／または放射線療法の開始前および開始中、開始前および開始後、開始中および開始後、または開始前、開始中、および開始後に）１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣを投与することを含む。例えば、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣは、典型的には放射線療法および／または化学療法を開始する１〜６０日前、好ましくは３〜４０日前、より好ましくは５〜１２日前に投与される。しかしながら本方法は、治療プロトコールおよび特定の患者の必要性に応じて、最も効果的な治療が提供され、最終的には患者の寿命が延び得るように実施される。
化学療法剤の投与は、非経口経路および腸内経路による全身投与を含め、様々な方法で達成することができる。一実施形態において、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣと化学療法剤とは、別個の分子として投与される。化学療法剤または化学療法の具体的な例としては、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、インターフェロンα、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、タキソールおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣと併用される放射線源は、治療される患者の体外にあっても、或いは体内にあってもよい。線源が患者の体外にある場合、その療法は外部ビーム放射線療法（ＥＢＲＴ）として知られる。放射線源が患者の体内にある場合、その療法は小線源照射療法（ＢＴ）と称される。
上述の治療レジメンは、さらなる癌治療剤および／またはレジメン、例えば、さらなる化学療法、癌ワクチン、シグナル伝達阻害薬、異常な細胞成長または癌の治療において有用な薬剤、抗体（例えば、国際公開公報第２００５／０９２３８０号（Ｐｆｉｚｅｒ）に記載されるとおりの抗ＣＴＬＡ−４抗体）またはＩＧＦ−１Ｒに結合することによって腫瘍成長を阻害する他のリガンド、およびサイトカインとさらに組み合わせることができる。
哺乳動物がさらなる化学療法に供される場合、上記に記載される化学療法剤が用いられ得る。加えて、成長因子阻害薬、生物学的反応調節剤、抗ホルモン療法、選択的エストロゲン受容体修飾薬（ＳＥＲＭ）、血管形成阻害薬、および抗アンドロゲンが用いられ得る。例えば、抗ホルモン、例えばＮｏｌｖａｄｅｘ（タモキシフェン）などの抗エストロゲン、またはＣａｓｏｄｅｘ（４'−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３−'−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリド）などの抗アンドロゲンが用いられ得る。
上記の治療手法は、多種多様な外科的レジメン、化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンのいずれ１つと併用することができる。本発明の治療手法により、低い投薬量の化学療法（または他の療法）および／または少ない投与頻度を用いることが可能となり、これはあらゆる患者にとって、および特に化学療法剤の毒性を十分に耐容しない患者にとって有利である。
ＸＶＩ．）キット／製品
本明細書に記載される実験室、予後判定、予防、診断および治療における適用で使用するため、キットが本発明の範囲内である。かかるキットは、バイアル、試験管などの１つまたは複数の容器であって、各々が本方法で使用される個別的な要素のうちの一つを含む容器を受け入れるように区画化された支持体、パッケージ、または容器を、本明細書に記載される使用などの使用についての説明を含むラベルまたは添付文書とともに含むことができる。例えば、容器が、検出可能であるように標識された、またはそのように標識することのできる抗体を含むことができる。キットは、薬物単位を含む容器を含むことができる。キットは、図２、または図３のアミノ酸配列またはその類似体、またはかかるアミノ酸配列をコードする核酸分子の全てまたは一部を含むことができる。
本発明のキットは、典型的には上記に記載される容器と、それに関連した、緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジを含む商業上の観点および使用者の観点から望ましい材料を含む１つまたは複数の他の容器と、内容物および／または使用説明が記載された、支持体、パッケージ、容器、バイアルおよび／または試験管のラベルと、使用説明を含む添付文書とを含み得る。
ラベルは容器上に、または容器と共に提供され、それによりその組成物が特定の治療法または治療以外の用途、例えば予後判定、予防、診断における適用若しくは実験用途のために使用されることを示すことができ、また本明細書に記載されるものなどの、インビボでの、或いはインビトロでの使用上の指示を示すこともできる。指示およびまたは他の情報はまた、キットと共に、またはキット上に含まれる添付文書またはラベル上に含まれてもよい。ラベルは容器上にあっても、または容器と関連付けられていてもよい。ラベルを形成する文字、数字または他の字が容器それ自体に成形またはエッチングされる場合、ラベルは容器上にあることになり得る。ラベルが、同時に容器も保持する入れ物または支持体の中に、例えば添付文書として存在する場合、ラベルは容器と関連付けられていることになり得る。ラベルは、組成物が表１に示す組織の癌などの病態の診断、治療、予防または予後判定に使用されることを指示し得る。
用語「キット」および「製品」は同義語として用いられ得る。
本発明の別の実施形態において、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などの組成物、例えば、表１に示されるものなどの組織の癌の診断、予後、予防および／または治療に有用な材料を含む製品が提供される。この製品は、典型的には少なくとも１つの容器と少なくとも１つのラベルとを含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラス、金属またはプラスチックなどの様々な材料で形成され得る。容器は、アミノ酸配列、小分子、核酸配列、細胞集団および／または抗体を保持し得る。別の実施形態では、容器はまた、細胞および組織における１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂのタンパク質発現の評価において使用されるか、または関連する実験、予後判定、診断、予防および治療を目的として使用される抗体、その結合断片または特異的結合タンパク質も含み；かかる使用の説明および／または指示がかかる容器上にまたは容器と共に含まれてもよく、同様にこれらの目的に使用される試薬および他の組成物またはツールも含まれ得る。
或いは容器は、病態の治療、診断、予後判定または予防に有効な組成物を保持してもよく、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば容器は、皮下注射針で穿通可能な栓を有する静脈内注射液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の活性薬剤は、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに特異的に結合する抗体薬物コンジュゲートであり得る。
製品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液および／またはデキストロース溶液を含む第２の容器をさらに含むことができる。製品はさらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、スターラー、針、シリンジ、および／または添付文書を含め、商業上の観点および使用者の観点から望ましい他の材料を、使用の指示および／または説明と共に含むことができる。
本発明の様々な態様が、以下のいくつかの例によりさらに説明および例示され、これらの例はいずれも、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１
１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗原
当該技術分野において公知のサプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）方法を用いて１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ遺伝子配列が見出された。腎癌患者に由来するｃＤＮＡから標準方法を用いて１８２ｂｐの１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＳＳＨ配列を同定した。腎癌患者標本から１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂの完全長ｃＤＮＡクローンを単離した。ｃＤＮＡは３８５８ｂｐ長であり、８７５アミノ酸ＯＲＦをコードする（図１を参照のこと）。１６１Ｐ２Ｆ１０ＢはＥＮＰＰ３と相同性を示した（Ｂｕｈｒｉｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９７：３３０３−３３０５（２００１）を参照のこと。当該技術分野において公知の標準方法を用いて１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを染色体６ｑ２２にマッピングする。さらなる参照については、米国特許第７，２７９，５５６号（Ａｇｅｎｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｍｏｎｉｃａ，ＣＡ）、米国特許第７，４０５，２９０号（Ａｇｅｎｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｍｏｎｉｃａ，ＣＡ）、米国特許第７，０６７，１３０号（Ａｇｅｎｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｍｏｎｉｃａ，ＣＡ）、および米国特許第７，２２６，５９４号（Ａｇｅｎｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｍｏｎｉｃａ，ＣＡ）を参照のこと。
実施例２
１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の生成
一実施形態において、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに対する治療用モノクローナル抗体（「ＭＡｂ」）は、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを結合するか、内在化するか、破壊するか、またはその生物学的機能を調節するタンパク質に特異的なエピトープと反応するもの、例えば、リガンド、基質、および結合パートナーとの相互作用を中断させ得るものを含む。かかるＭＡｂを生成するための免疫原としては、細胞外ドメインまたは１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質配列全体、およびアミノ酸配列のコンピュータ解析から抗原性があると予測される機能モチーフを含むことが予測される領域をコードするようにまたは含むように設計されたものが挙げられる。免疫原には、精製された哺乳動物細胞に由来するＨｉｓタグ標識タンパク質のｔａｇ５−１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂなどの、ペプチドおよび組換えタンパク質が含まれる。加えて、ＲＡＴ１−１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂなどの１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを高度に発現するようにレトロウイルス形質導入によって遺伝子操作された細胞を使用してマウスが免疫化される。
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技法（Ａｍｇｅｎ Ｆｒｅｍｏｎｔ）を用いて１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに対するＭＡｂを生成した。この技法では、マウス重鎖およびκ軽鎖遺伝子座が不活性化され、ヒト重鎖およびκ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の大部分が挿入されている。ヒトγ２産生ＸｅｎｏＭｉｃｅを用いてＴａｇ５−１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ細胞で免疫化して、Ｈ１６−７．８と命名されるＭＡｂを生成した。
１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂ Ｈ１６−７．８は、組換え１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ（配列番号：２）発現細胞および癌異種移植細胞で発現する内因性細胞表面１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに特異的に結合する。
それぞれのハイブリドーマ細胞からＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）によってｍＲＮＡを単離した後、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂ Ｈ１６−７．８のＤＮＡコード配列を決定した。
以下のプロトコールを用いてハイブリドーマ細胞から抗１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ Ｈ１６−７．８重鎖および軽鎖可変核酸配列を配列決定した。Ｈ１６−７．８分泌ハイブリドーマ細胞をＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で溶解させた。全ＲＮＡを精製して定量した。全ＲＮＡからＧｉｂｃｏ（登録商標）−ＢＲＬ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステムを用いてオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライミングで第１鎖ｃＤＮＡを生成した。第１鎖ｃＤＮＡを、ヒト免疫グロブリン可変重鎖プライマー、およびヒト免疫グロブリン可変軽鎖プライマーを使用して増幅した。ＰＣＲ産物を配列決定し、可変重鎖および軽鎖領域を決定した。
可変重鎖および軽鎖領域の核酸配列およびアミノ酸配列を図２および図３に記載する。Ｈ１６−７．８の重鎖可変領域は、配列番号：７の２０番目のＱ残基から１４２番目のＳ残基までの範囲のアミノ酸配列からなり、Ｈ１６−７．８の軽鎖可変領域は、配列番号：８の２０番目のＥ残基から１２７番目のＲ残基までの範囲のアミノ酸配列からなる。Ｈ１６−７．８の重鎖は、配列番号：７の２０番目のＱ残基から４６８番目のＫ残基までの範囲のアミノ酸配列からなり、Ｈ１６−７．８の軽鎖は、配列番号：８の２０番目のＥ残基から２３３番目のＣ残基までの範囲のアミノ酸配列からなる。ヒトＶＨ４−３１／Ｄ５−１２／ＪＨ６生殖細胞系列およびヒトＡ２６／ＪＫ１生殖細胞系列に対するＨ１６−７．８のアラインメントを図４Ａ〜図４Ｂに示す。
実施例３
組換えＤＮＡ方法を用いたＨ１６−７．８の発現
Ｈ１６−７．８をトランスフェクト細胞において組換えにより発現させるため、Ｈ１６−７．８重鎖および軽鎖配列（配列番号：７の２０位〜４６８位、および配列番号：８の２０位〜２３３位の軽鎖）を発現ベクターにクローニングした。完全なＨ１６−７．８ヒト重鎖および軽鎖カセットを、クローニングベクターのＣＭＶプロモーター／エンハンサーの下流にクローニングした。ＭＡｂコード配列の下流にポリアデニル化部位が含まれた。組換えＨ１６−７．８を発現するコンストラクトをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、ＣＨＯ細胞から組換えＨ１６−７．８を分泌させた。ＥＬＩＳＡによりＩｇＧ力価を計測した。結果から、ＩｇＧおよび発現並びに重鎖および軽鎖の良好な共発現が確認された。細胞表面１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂとの結合について、組換えＨ１６−７．８をフローサイトメトリーによって評価した（図５）。３Ｔ３−対照細胞および３Ｔ３−１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ細胞を、ハイブリドーマ由来、或いはＨ１６−７．８重鎖および軽鎖ベクターコンストラクトをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞由来の組換えＨ１６−７．８で染色した。
結合をフローサイトメトリーによって検出した。結果は、ＣＨＯ細胞において組換えにより発現させたＨ１６−７．８が分泌され、且つ細胞表面１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに特異的に結合することを示している（図５）。
組換えＨ１６−７．８をそのペプチド配列に関して特徴付けた。Ｈ１６−７．８のペプチドマッピング分析から、Ｈ１６−７．８の推定アミノ酸配列が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでのＬｙｓ−Ｃ消化物、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでのＡｓｐ−Ｎ消化物、およびエドマン分解によるＮ末端配列を使用して決定された配列に対して正しいことが確認された。
実施例４
Ｈ１６−７．８の抗体薬物コンジュゲーション
Ｈ１６−７．８（図２）を、以下に示すマレイミドカプロイル（ｍｃ）切断不可能リンカーを使用して、ＭＭＡＦ（式ＸＶＩＶ；モノメチルオーリスタチンＦ）と命名されるドラバリン−バリン−ドライソロイシン（ｄｏｌａｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）−ドラプロイン−フェニルアラニン（オーラスタチン（ａｕｒａｓｔａｔｉｎ）誘導体）にコンジュゲートさせた。
Figure 2017095459
表６に示す合成方法を用いて、マレイミドカプロイル（ｍｃ）切断不可能リンカーのＭＭＡＦ（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）との合成を完了し（ＳＡＦＣ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、細胞傷害性ｍｃＭＭＡＦを作成した。
次に、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦと命名される本発明の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、以下のプロトコールを使用して作製した。
簡潔に言えば、１０ｍＭスクシネート、ｐＨ４．５中のＨ１６−７．８の１０ｍｇ／ｍＬ溶液について、ダイアフィルトレーションによる緩衝液交換を行った。緩衝液交換の目的は、Ｈ１６−７．８製剤緩衝液構成要素を除去し、それを、続く「還元」ステップに最適化されたより適合性の高い緩衝液に置き換えることである。抗体を６ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）（ＤＶ）のホウ酸ナトリウム緩衝液に対して透析ろ過し、１０±１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、システムからフラッシュし、７．５ｍｇ／ｍｌに希釈して０．２μｍフィルタでろ過した。
続いてＥＤＴＡを、反応混合物において５ｍＭの最終濃度となるよう添加した。次にＨ１６−７．８のジスルフィド結合をトリス−（２−カルボキシエチル）−ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で部分的に還元して遊離チオール（ＳＨ）を形成した。このプロセスは３７℃で実施される。この反応中、ＥＤＴＡは５ｍＭ濃度で存在し、望ましくないＳＨの再酸化を引き起こし得る二価金属カチオンを全てキレート化した。還元ステップが終了したところで反応溶液の温度を２０℃に下げ、分析して遊離ＳＨのモル比を決定し、ＭＡｂ当たり≧３．９のＳＨが生成されていることを確認した。コンジュゲーションのため、薬物−リンカーｍｃＭＭＡＦをアイソレーターに計り取り、５．５ｍｇ／ｍｌの濃度となるようＤＭＳＯ中に溶解した。
部分的に還元されたＨ１６−７．８上のＳＨ基を薬物−リンカーｍｃＭＭＡＦと反応させてコンジュゲートＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦを形成した。ＤＭＳＯ中のｍｃＭＭＡＦを、抗体に対する規定の薬物モル当量で添加した。このステップは２０℃で実施した。１時間のインキュベーション時間後、反応物中の過剰な薬物−リンカーを全てＮ−アセチル−システインでクエンチし、それにより反応性の薬物−リンカーを全て除き、除去および分析的方法による検出がより容易な付加物にした。次に、ｍｃＭＭＡＦに対して１モル当量のＮ−アセチル−システインを添加した後、混合物をさらに１５分間撹拌する。
次に、限外ろ過／ダイアフィルトレーションを実施することによりＤＭＳＯを除去し、不純物を処理し、且つ製剤緩衝液へのＡＤＣの緩衝液交換を行う。
従ってクエンチされた過剰のｍｃＭＭＡＦが、８ダイアボリュームの２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．２の製剤緩衝液による抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の限外ろ過／ダイアフィルトレーションにより除去される。８番目のダイアボリュームが完了した後、溶液を再循環させ、タンパク質濃度についてアッセイする。
コンジュゲートを、２０ｍＭヒスチジン、１０％トレハロース、ｐＨ５．２緩衝液で６±０．５ｍｇ／ｍｌに調整する。次にポリソルベート２０を添加し、均一になるまで混合し、０．２μｍフィルタで無菌ろ過する。
得られた抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）はＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦと命名され、以下の式：
Figure 2017095459
を有し、式中、ＭＡｂはＨ１６−７．８（図２および図３）であり、且つｐは１〜１２である。
実施例５
Ｈ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの特性決定
実施例２「１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の生成」と題される実施例に記載の手順を用いてＨ１６−７．８を生成した。加えて、「Ｈ１６−７．８の抗体薬物コンジュゲーション」と題される実施例に記載の手順を用いて、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを結合する抗体薬物コンジュゲートを生成した。当該技術分野において公知のアッセイ法の組み合わせを用いて、Ｈ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ ＡＤＣをスクリーニングし、同定し、特徴付けた。
Ａ．ＦＡＣＳによる細胞結合および親和性の測定
Ｈ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦを、Ｋｕ８１２細胞上で内因的に発現する１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに対する結合親和性について試験した。簡潔に言えば、Ｈ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの１１個の希釈物をＫｕ８１２細胞（ウェル当たり５０，０００細胞）と共に最終濃度１６０ｎＭ〜０．０００１ｎＭとして４℃で一晩インキュベートする。インキュベーションが終わると細胞を洗浄し、抗ｈＩｇＧ−ＰＥ検出抗体と共に４℃で４５分間インキュベートする。未結合の検出抗体を洗浄した後、細胞をＦＡＣＳにより分析する。平均蛍光強度（Ｍｅａｎ Ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）（ＭＦＩ）の値が得られる（表４を参照のこと）。ＭＦＩ値をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｉｍソフトウェアに入力し、１部位結合（双曲線）方程式Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／（Ｋｄ＋Ｘ）を用いて分析して、図６に示すＨ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ飽和曲線を作成する。Ｂｍａｘは、Ｈ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂとの最大結合時のＭＦＩ値であり；ＫｄはＨ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ結合親和性であり、これは最大結合の半分に達するのに必要なＨ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの濃度である。
Ｋｕ８１２細胞の表面上で内因的に発現する１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ関連タンパク質に対するＨ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの親和性（Ｋｄ）計算値は、それぞれ０．０６ｎＭおよび０．１９ｎＭである。
腎癌細胞の表面上で発現する内因性１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ関連タンパク質に対するＨ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの結合を判定するため、ヒトＵＧＫ−３細胞（患者由来の腎明細胞癌）およびＲＸＦ−３９３細胞（腎明細胞癌）を１０μｇ／ｍｌの天然Ｈ１６−７．８、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ、またはアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ２で染色し、ＦＡＣＳにより評価した。
図７の結果（左側のパネル）は、２つの異なる腎腫瘍細胞がＨ１６−７．８（灰色の線）では濃染されるが、対照ＭＡｂ（塗り潰したヒストグラム）では濃染されないことを実証する。右側のパネルは、同じ腎腫瘍細胞がＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ（灰色の線）で同様に濃染されることを実証する（図７；右側のパネル）。これらの結果は、Ｈ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの双方とも、ヒト癌細胞の表面上で発現する天然１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗原を結合することを示している。天然Ｈ１６−７．８のコンジュゲートでＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦを生成することによって、ヒト癌細胞上で発現する天然１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗原に対するその細胞表面結合は変わらなかった。
実施例６
Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦによって媒介される細胞傷害作用
１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ依存性の細胞傷害作用を媒介するＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの能力について、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを発現するように遺伝子操作したＫＵ８１２細胞で評価した。このアッセイ法のため２０００個の生存ＫＵ８１２細胞を０日目に3通り播き、一晩回復させた。翌日、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの異なるロットまたはｍｃＭＭＡＦにコンジュゲートした対照ＭＡｂの１：４段階希釈物を添加して、図８に示す最終濃度を得た。細胞を６日間インキュベートしたところで、各ウェルに２０μｌのＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅを添加した。プレートをさらに４時間インキュベートし、蛍光プレートリーダーで５４０ｎＭの励起波長および６２０ｎＭの発光波長を使用して蛍光強度を読み取った。
図８の結果は、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの双方のロットとも、ＫＵ８１２細胞の増殖を強力に阻害したことを示している。ＩＣ ５０はロット（１）およびロット（２）についてそれぞれ０．２ｎＭおよび０．１ｎＭであると決定された。ＫＵ８１２細胞を結合しない完全ヒト対照ＭＡｂをｍｃＭＭＡＦとコンジュゲートさせると３．９（±０．２）のＤＡＲが得られた。対照ＡＤＣはＫＵ８１２細胞増殖を阻害しなかったことから、細胞傷害作用の特異性がさらに実証される。従って、これらの結果は、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦが細胞傷害性薬物を１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現細胞に選択的に送達することができ、その死滅をもたらし得ることを示している。
実施例７
Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦは生体内で腫瘍成長を阻害する
１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂは腫瘍組織の細胞表面上で多量に発現するため、その発現が正常組織では限定的であることと併せると、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂは抗体療法および同様にＡＤＣによる治療法に適した標的である。従って、ヒト腎癌異種移植マウスモデルにおけるＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの治療効果を評価する。
腫瘍成長および転移形成に対する抗体薬物コンジュゲートの有効性について、マウス癌異種移植モデル（例えば、皮下および同所）で試験する。
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と１：１希釈で混合した５×１０４〜１０６個の癌細胞を雄ＳＣＩＤマウスの右側腹部に注射することにより、皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍を生成する。腫瘍形成に対するＡＤＣの有効性を試験するため、すなわちＡＤＣ注射は腫瘍細胞注射と同じ日に開始する。対照として、マウスに精製ヒトＩｇＧ若しくはＰＢＳ；またはヒト細胞で発現しない無関係な抗原を認識する精製ＭＡｂのいずれかを注射する。予備試験では、対照ＩｇＧまたはＰＢＳの間で腫瘍成長に違いは認められない。腫瘍サイズはノギスで測定し、腫瘍容積は長さ×幅×高さとして計算する。直径が１．５ｃｍより大きい皮下腫瘍を有するマウスを犠牲にする。
１５０万個〜２００万個の細胞を注射により雄ＳＣＩＤマウスに皮下移植して、マウスにおける腎腫瘍の増殖を行う。マウスは瀕死状態になるまで全般的な健康状態、身体活動、および外観をモニタする。犠牲時にマウスを調べて腫瘍量を測定し、他の臓器を摘出して遠隔部位への転移を評価し得る。或いは、死亡をエンドポイントとして使用することもできる。次にマウスを各群に分け、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂまたは対照ＭＡｂのｉ．ｖ．注射による投与で適宜処置を行う。
異種移植癌モデルの利点は、新血管新生および血管形成の試験が可能なことである。腫瘍成長は、部分的には新血管の発達に依存する。毛細血管系および発達する血液網は宿主起源であるが、新血管系の惹起および構造は異種移植腫瘍によって制限される（Ｄａｖｉｄｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１）７：２８７０；Ｓｏｌｅｓｖｉｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．（１９８４）２０：１２９５）。抗体および小分子の新血管新生に対する効果は、腫瘍組織およびその周囲の微小環境のＩＨＣ分析によるなど、当該技術分野において公知の手順に従い試験される。
Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦは腎癌異種移植片の形成を阻害する。これらの結果は、限局性および進行期の癌並びに好ましくは表１に示される癌の治療におけるＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの有用性を示している。
１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣ：
「１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の生成」と題される実施例に記載のとおり、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに対するモノクローナル抗体を産生した。さらに、「Ｈ１６−７．８の抗体薬物コンジュゲーション」と題される実施例に記載のとおりＭＡｂを毒素とコンジュゲートさせて、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦを形成する。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦをＦＡＣＳおよび他の当該技術分野において公知の方法により特徴付け、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに対するその結合能を判定する。
細胞系および異種移植片：
ＲＦＸ−３９３細胞は、Ｌ−グルタミンと１０％ＦＢＳとを補充したＲＰＭＩに維持する。ＵＧ−Ｋ３およびＳＫＲＣ−０１異種移植片は、ＳＣＩＤマウスにおける連続増殖により維持する。
ＳＣＩＤマウスにおいて皮下に定着させたヒト腎癌異種移植片ＵＧ−Ｋ３におけるＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの有効性
この実験では、患者由来のヒト腎癌異種移植片ＵＧ−Ｋ３をＳＣＩＤマウスで連続継代して維持した。ストック腫瘍を無菌で採取して細片化した。Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して腫瘍片を酵素消化し、単細胞懸濁液とした。１．５×１０６細胞を個々のＳＣＩＤマウスの側腹部に注入し、腫瘍を、その近似容積が１００ｍｍ３に達するまで未処置のまま成長させた。動物は以下のコホートに無作為に割り当てた：Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ処置群、Ｈ１６−７．８対照および５％デキストロース対照。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８は１０ｍｇ／ｋｇで０日目に１回、静脈内ボーラス注入により投与した。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８の投与量は、投与直前に得た動物毎の個別の体重に基づいた。５％デキストロース対照は動物当たり１５０μＬで投与した。腫瘍成長を試験終了時まで３〜４日毎にノギスを使用して観察した。腫瘍容積は幅２×長さ／２として計算し、ここで幅は最小寸法であり、長さは最大寸法である。腫瘍が約１０００ｍｍ３に達すると、対照群の動物を人道的に安楽死させた。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ処置群の動物はさらに２週間観察してから犠牲にした。統計分析は、双方の対照群についてのデータが利用可能な最終時点で、α＝０．０５とするクラスカル・ワリス検定を使用して実施した。
その結果から、ＵＧ−Ｋ３腎明細胞異種移植腫瘍をＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦで処置することにより、調査した全ての用量およびスケジュールでＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長の大幅な阻害が生じたことが実証された（図９）。
定着させた同所性ＵＧ−Ｋ３異種移植片のＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦによる成長阻害
この実験では、同所性に成長させ定着させた腎腫瘍の成長を阻害するＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの能力を、患者由来のＵＧ−Ｋ３腫瘍異種移植片を使用して評価した。簡潔に言えば、ＵＧ−Ｋ３腫瘍のストックを酵素消化し、１５０万個の生細胞を０日目に雄ＳＣＩＤマウスの腎臓に外科的に移植した。腫瘍を７日間成長させたところで、動物を４つの異なる処置群（群当たりｎ＝１０）に無作為化した。動物は、４日毎に投与した合計４用量の５ｍｐｋの対照ＡＤＣを受けたＡ群、３ｍｇ／ｋｇのＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦを受けたＢ群および５ｍｇ／ｋｇのＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦを受けたＣ群に無作為化した。Ｄ群は１０ｍｇ／ｋｇのＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦを１回受けた。試験の終了時（４１日目）に動物を犠牲にし、右腎および左腎を電子天秤で計量した。グラフにプロットする腫瘍重量は、腫瘍を有する右腎の重量から腫瘍のない対側腎の重量を減じることにより決定した。
その結果から、ＵＧ−Ｋ３腎明細胞異種移植腫瘍をＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦで処置すると、調査した全ての用量およびスケジュールで腫瘍成長の劇的な阻害が生じたことが実証された（図１０）。全てのＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ処置群（Ｂ、Ｃ、およびＤ）の腫瘍重量が、対照処置群の腫瘍重量の１％未満であった。これらの差は高度に統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ）。
ＳＣＩＤマウスにおいて皮下に定着させたヒト腎癌異種移植片ＲＸＦ−３９３におけるＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの有効性
この実験では、ヒト腎癌細胞ＲＸＦ−３９３（マウス当たり０．５×１０６細胞）を個々のマウスの側腹部に注入し、腫瘍を、その近似容積が１００ｍｍ３に達するまで未処置のまま成長させた。次に動物を以下のコホートに無作為に割り当てた：Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ処置群、Ｈ１６−７．８処置群および５％デキストロース対照。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８は１０ｍｇ／ｋｇで週１回、合計２用量を静脈内ボーラス注入により投与した。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８の投与量は、投与直前に得た動物毎の個別の体重に基づいた。５％デキストロース対照は動物当たり１５０μＬで投与した。腫瘍成長を試験終了時まで３〜４日毎にノギスを使用して観察した。腫瘍容積は幅２×長さ／２として計算し、ここで幅は最小寸法であり、長さは最大寸法である。腫瘍が約１０００ｍｍ３に達すると、対照群の動物を人道的に安楽死させた。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ処置群の動物はさらに２週間観察してから犠牲にした。
その結果から、ＲＦＸ−３９３ヒト腎癌異種移植腫瘍をＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦで処置することにより、調査した全ての用量およびスケジュールで（単回用量を含む）ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長の大幅な阻害が生じたことが実証された。統計分析は、双方の対照群についてのデータが利用可能な最終時点で、α＝０．０５とするクラスカル・ワリス検定を使用して実施した（図１１）。
ＳＣＩＤマウスにおいて皮下に定着させたヒト腎癌ＳＫＲＣ−０１におけるＨ１６−７．８のＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦと比較した有効性試験
別の実験において、ヒト腎癌細胞ＳＫＲＣ−０１（マウス当たり０．８×１０６細胞）を個々のマウスの側腹部に注入した。腫瘍を、その近似容積が１００ｍｍ３に達するまで未処置のまま成長させた。０日目に腫瘍が１００ｍｍ３に達すると、動物を以下のコホートに無作為に割り当てた：Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ処置群、Ｈ１６−７．８処置群および５％デキストロース対照。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８は４ｍｇ／ｋｇで４日毎に合計４用量を静脈内ボーラス注入により投与した。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８の投与量は、投与直前に得た動物毎の個別の体重に基づいた。５％デキストロース対照は動物当たり１５０μＬで投与した。腫瘍成長を３〜４日毎にノギスを使用して観察した。腫瘍容積は幅２×長さ／２として計算したが、ここで幅は最小寸法であり、長さは最大寸法である。
その結果は、ＡＤＣ Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦが全ての用量（単回用量を含む）でＳＫＲＣ−０１腫瘍形成においての成長を大幅に阻害した一方、ネイキッドＭＡｂ Ｈ１６−７．８は効果を有しなかったことを示している。従って、ＡＤＣ Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦはネイキッド抗体Ｈ１６−７．８と比べて大幅に優れた効果を有した（図１２）。
ＳＣＩＤマウスにおいて皮下に定着させたＵＧ−Ｋ３におけるＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの他の１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と比較した有効性試験
別の実験において、ヒト腎癌細胞ＵＧ−Ｋ３（マウス当たり１．５×１０６細胞）を個々のマウスの側腹部に注入した。腫瘍を、その近似容積が１００ｍｍ３に達するまで未処置のまま成長させた。０日目に腫瘍が１００ｍｍ３に達すると、動物を以下のコホートに無作為に割り当てた：Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ、Ｈ１６−７．８ｖｃＭＭＡＥ、およびＨ１６−１．１１ｍｃＭＭＡＦ、およびＨ１６−１．１１ｖｃＭＭＡＥ、ＰＢＳ対照、および対照ＭＡｂ−ｖｃＭＭＡＥ処置群。全ての抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は１０ｍｇ／ｋｇで０日目に１回投与した。各ＡＤＣの投与量は、投与直前に得た動物毎の個別の体重に基づいた。ＰＢＳ対照は動物当たり１５０μ／Ｌで投与した。腫瘍成長を３〜４日毎にノギスを使用して観察した。腫瘍容積は幅２×長さ／２として計算したが、ここで幅は最小寸法であり、長さは最大寸法である。
その結果は、ＡＤＣ Ｈ１６−７．８ｖｃＭＭＡＥおよびＨ１６−１．１１ｖｃＭＭＡＥが腫瘍形成成長を阻害しなかったことを示している。加えて、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−１．１１ｍｃＭＭＡＦの双方が、最初の３０日間にＵＧ−Ｋ３腫瘍形成においての成長を大幅に阻害した。３０日目以降、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦはＨ１６−１．１１ｍｃＭＭＡＦと比較して大幅に優れた効果を有した（図１３）。
実施例８
１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣの使用によるヒト癌腫の治療および診断についてのヒト臨床試験
本発明に従い１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣが使用され、これは１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに特異的に結合し、特定の腫瘍、好ましくは表１に列挙されたものの治療において使用される。これらの適応の各々に関連して、２つの臨床的手法が成功裏に探求されている。
Ｉ．）アジュバント療法：
アジュバント療法では、患者は、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣを化学療法剤または抗腫瘍剤および／または放射線療法またはそれらの組み合わせと併用して治療される。原発性癌標的、例えば表１に列挙されたものは、標準的な第一次および第二次療法に１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣを加えることにより、標準的なプロトコールに基づき治療される。プロトコール設計は、以下の例、すなわち限定はされないが、一次病巣または転移病巣の腫瘍量の低減、無進行生存、全生存の増加、患者の健康状態の改善、疾患の安定化、並びに標準的な化学療法薬および他の生物製剤の常用量を低減する能力によって評価されるとおりの有効性に取り組むものである。これらの投薬量の低減により化学療法剤または生物製剤の用量依存性の毒性が低減されることで治療法の追加および／または長期化が可能となる。１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣは、いくつかの補助的な臨床試験において化学療法剤または抗腫瘍剤と併用して利用される。
ＩＩ．）単剤療法：
腫瘍の単剤療法における１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣの使用に関連して、１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣは化学療法剤または抗腫瘍剤なしに患者に投与される。一実施形態では、単剤療法は広範囲の転移性疾患を有する末期癌患者で臨床的に実施される。プロトコール設計は、以下の例、すなわち限定はされないが、一次病巣または転移病巣の腫瘍量の低減、無進行生存、全生存の増加、患者の健康状態の改善、疾患の安定化、並びに標準的な化学療法薬および他の生物製剤の常用量を低減する能力によって評価されるとおりの有効性に取り組むものである。
投薬量
投薬量レジメンは、最適な所望の応答をもたらすように調整され得る。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、数回に分割された用量が時間をかけて投与されてもよいか、または治療状況の緊急性により示されるところに従い用量を比例的に減少若しくは増加させてもよい。特に、投与の利便性および投薬量の均一性のため、単位剤形の非経口組成物を製剤化することが有利である。単位剤形は、本明細書で使用される場合、治療される哺乳動物対象に対する単位投薬量として適した物理的に個別の単位を指す。各単位は、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）抗体の固有の特性および実現すべき特定の治療または予防効果、および（ｂ）個体における感受性を治療するためのかかる活性化合物の配合技術に固有の限界によって決まり、且つそれに直接依存する。
本発明により組み合わせで投与される１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣの治療有効量についての例示的で非限定的な範囲は、約０．５〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも４ｍｇ／ｋｇである。他の例示的で非限定的な範囲は、例えば約０．５〜約５ｍｇ／ｋｇ、または例えば約０．８〜約５ｍｇ／ｋｇ、または例えば約１〜約７．５ｍｇ／ｋｇである。本発明の高用量の実施形態は、１０ｍｇ／ｋｇより多い投薬量に関する。投薬量の値は軽減すべき病態の種類および重症度によって様々であり得るとともに、単一用量または複数用量が含まれ得ることは注記されるべきである。さらに、任意の特定の対象について、具体的な投薬量レジメンは時間の経過に伴い、個別の必要性および組成物を投与するまたはその投与を管理する人の専門的な判断に従い調整すべきであること、および本明細書に示される投薬量範囲は例示に過ぎず、特許請求される組成物の範囲または実施を制限する意図はないことが理解されるべきである。
臨床開発計画（ＣＤＰ）
アジュバント療法または単剤療法に関連した１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣの治療にはＣＤＰが続き、それを展開する。初めに、非ヒト対象（例えば、マウス、サル等）で当該技術分野において公知の標準的なプロトコールを用いて前臨床毒性試験が実施される。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦは、非ヒト毒性試験で十分な耐容性を示すことが実証された。ヒト臨床試験では、初めに安全性が実証され、その後、反復用量で有効性が確認される。試験では、標準的な化学療法を標準的な治療法＋１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＡＤＣと非盲検で比較する。理解されるとおり、患者の登録に関連して利用され得る一つの非限定的な基準は、生検により決定されるとおりのその腫瘍における１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ発現レベルである。
タンパク質または抗体の注入に基づく任意の治療法と同様に、安全性についての関心項目は、主として、（ｉ）サイトカイン放出症候群、すなわち、低血圧症、発熱、振戦、悪寒；（ｉｉ）材料に対する免疫原性反応の発生（すなわち、抗体療法薬に対する患者によるヒト抗体の産生、すなわちＨＡＨＡ反応）；および、（ｉｉｉ）１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを発現する正常細胞に対する毒性に関する。標準的な試験および追跡調査を利用して、これらの安全性についての関心項目の各々がモニタされる。１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ ＭＡｂはヒトへの投与時に安全であることが認められる。
実施例９
Ｈ１６−７．８ ＭＡｂの抗体薬物コンジュゲーションの特性決定
Ｉ）質量分析法によるペプチドマッピング
ペプチドマッピング分析を実施した。この方法はＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦのアイデンティティを確認するために用いられ、天然抗体（Ｈ１６−７．８）を区別する。得られたＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８をジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理してジスルフィド結合を還元し、続いて得られた遊離システインをアルキル化した。このステップでは、タンパク質の完全な変性を確実にするためグアニジンを使用した。透析によりグアニジンを除去した後、試料を特異的エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃで消化した。Ｌｙｓ−Ｃはリジン残基のＣ末端側のペプチド結合を切断する。得られたペプチドを質量分析法と併せた逆相クロマトグラフィーにより分析した。逆相保持時間およびピークの質量対電荷比実測値をＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦとＨ１６−７．８との間で比較した。ＷＡＴＥＲＳ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣをＷＡＴＥＲＳ Ｑ−ＴＯＦｐ質量分析器と併せて使用して、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー）分析を行った。消化した試料をＹＭＣ Ｃ１８カラムに加え、トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル勾配で溶出した。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８の代表的なペプチドマップを図１４に示す。
図１４の３つのクロマトグラムは、星印および矢印で示すピークを除き、全て同じであるように見える。この図で分かるとおり、星印で示すピーク強度が、コンジュゲート抗体では天然抗体と比較して低下した。矢印を付したピークは、コンジュゲート抗体ペプチドマップに現れた新しいピークを表す。具体的には、星印または矢印のいずれかを付したピークは、それぞれ、コンジュゲーションの対象となるペプチドおよび得られたコンジュゲートしたペプチドであると考えられる。図１５は、星印を付したピークの質量スペクトルの一部分を示す。コンジュゲーション中に変化したシグナルの質量値は「＋」記号で示す。近似ｍ／ｚが９７０．４（＋３荷電状態）のこのペプチドは、重鎖のヒンジ領域に由来するＣ２２５−Ｋ２５０と同定されたとともに、予想コンジュゲーション部位を含む。
図１４においてコンジュゲートしたペプチドであると考えられる新しく現れたピークを同定するため、高エネルギー（ＭＳＥ）データ収集技術を使用してＬＣ−ＭＳ分析を行った。図１６は、６１９．４のｍ／ｚを使用したＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよびＨ１６−７．８のペプチドマップについての抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す。このイオンは薬物成分のフラグメントイオンに対応する。６１９．４のＸＩＣで観測されたピークは、図１４において矢印を付したピークとほぼ同じである。さらに、天然抗体のクロマトグラムにかかるピークは検出されなかった。これらの知見から、６１９．４のｍ／ｚでのＸＩＣにおいて検出されたピークがおそらく薬物とコンジュゲートしたペプチドであったとともに、そのインタクトな質量値により同定されることが示唆される。結果は表５に要約した。これらの結果から、このコンジュゲートの場合、主要なペプチドは重鎖のヒンジ領域で２つの薬物にコンジュゲートしたものであることが示唆される。これらのデータは、ＤＡＲ分析などの他の直交分析により得られたデータと一致する。
ＩＩ）ＬＣ−ＭＳによるインタクト質量分析
脱グリコシル化したＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの完全質量をエレクトロスプレーイオン化飛行時間（ＥＳＩ−ＴＯＦ）質量分析法により決定した。この技法は、薬物対抗体比（ＤＡＲ）の値に関する直接的な情報を提供する。試験試料を２５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５で希釈し、次にグリコペプチダーゼＦと共に３７℃で一晩インキュベートした。試料をＰＬＲＰＴＭカラム（Ｖａｒｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に注入し、９０℃で平衡化し、且つアセトニトリル／水勾配で溶出した。ＷＡＴＥＲＳ Ｓｙｎａｐｔ質量分析器（Ｗａｔｅｒｓ）と連結したＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムにより試料ピークを分析し、ＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアで生データから質量を再構成した。脱グリコシル化したＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの例示的な質量スペクトルプロファイルを図１７に示す。主要な薬物がコンジュゲートした抗体は４つの薬物を負荷する種であった。この知見は、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦにおける非コンジュゲート抗体の存在量を含め、ＲＰ−ＨＰＬＣによるＤＡＲ、ペプチドマッピングおよびＨＩＣアッセイ法などの、他の直交方法により得られた結果と一致した。
ＩＩＩ）ＲＰ−ＨＰＬＣによる薬物対抗体比（ＤＡＲ）分析
軽鎖および重鎖の各々における相対薬物負荷量の定量的ＨＰＬＣ測定のため、薬物対抗体比（ＤＡＲ）分析を実施した。ＤＡＲ分析は、移動相Ａが２．０％ギ酸からなり、且つ移動相Ｂが２．０％ギ酸＋９０％アセトニトリルからなるＰＬＲＰ−Ｓ分析カラム、２．１ｍｍ×５０ｍｍを使用して実施した。試料を調製するため、薬物がコンジュゲートした抗体をＤＴＴによって完全に還元し、次に薬物負荷量に基づき、Ｌ鎖、薬物がコンジュゲートしたＬ鎖、Ｈ鎖、および薬物がコンジュゲートしたＨ鎖に分離した。０．５ｍｌ／分の流量を用いて、２８０ｎｍでの検出として５０μｇの試料を溶出させた。薬物対抗体比（ＤＡＲ）のモル比は以下の式により定義される。
Figure 2017095459
式中、
ＤＡＲ−薬物対抗体のモル比
ｎ−Ａｂ鎖当たりのｍｃＭＭＡＦ薬物の数
ＡＵＣＬｉｇｈｔ，ｎ、ＡＵＣＨｅａｖｙ，ｎ−ｎ個の薬物を有するそれぞれ抗体軽鎖または重鎖の曲線下面積；
ＡＵＣＴｏｔａｌ，Ｌｉｇｈｔ（Ｈｅａｖｙ）−軽鎖または重鎖のピーク曲線下面積。
Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ由来の材料を使用してこの方法の適格性が評価された。評価するパラメータには、特異性、精度、再現性、中間体の正確さが含まれた。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの代表的なＤＡＲプロファイルを図１８に示す。ＤＡＲ値は４．０である。この試料を、同じこの方法のＨＰＬＣ条件を用いたＬＣ−ＭＳ分析に供し、観察されたピークを同定した。結果を表６に要約する。この方法の適格性評価において得られたＤＡＲ結果のピーク同定は、ＬＣ−ＭＳにより直交的に確認された。
ＩＶ）結合親和性
Ｈ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦを、ＫＵ８１２細胞（ヒト慢性骨髄性白血病細胞、ＡＴＣＣ）上で発現する１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに対するそれらの結合親和性について試験した。簡潔に言えば、Ｈ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの１２個の希釈物をＫＵ８１２細胞（ウェル当たり５０，０００細胞）と共に最終濃度１６０ｎＭ〜０．００４ｎＭとして４℃で一晩インキュベートした。インキュベーションが終わると細胞を洗浄し、抗ｈＩｇＧ−ＰＥ検出抗体と共に４℃で４５分間インキュベートした。未結合の検出抗体を洗浄した後、細胞をＦＡＣＳにより分析する。
ＭＦＩ値をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｉｍソフトウェアに入力し、１部位結合（双曲線）の方程式Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／（Ｋｄ＋Ｘ）を用いて分析して、Ｈ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ飽和曲線を作成した。ＢｍａｘはＨ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦのＫＵ８１２との最大結合時のＭＦＩ値であり；ＫｄはＨ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦ結合親和性であり、これは最大結合の半分に達するのに必要なＨ１６−７．８またはＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの濃度である。Ｈ１６−７．８およびＨ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの親和性（Ｋｄ）計算値は、ＫＵ８１２細胞の表面上で発現する１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂに対してそれぞれ０．０８ｎＭおよび０．２５ｎＭである。（ｎ＝４）。
Ｖ）細胞傷害性
Ｈ１６−７．８、Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦおよび陰性対照ＡＤＣを別個に段階希釈し、細胞表面上で１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを内因的に発現するＫＵ８１２細胞が入った９６ウェルプレートに添加した。６日間インキュベートした後、抗体−細胞混合物にＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を添加する。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）は、レサズリンを蛍光分子のレゾルフィンに変換する生細胞の天然の還元力を用いる細胞生存度の指示薬である。レサズリンはレゾルフィンに還元され、レゾルフィンは極めて鮮明な赤色蛍光を生じるものである。生細胞は常にレサズリンをレゾルフィンに変換し、従って生存度−および細胞傷害作用の定量的尺度をもたらす。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの細胞傷害率は、Ｓｙｎｅｒｇｙ ４ Ｈｙｂｒｉｄ Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅリーダー（５４０／３５、６２０／４０ｎｍ）を使用して分光光度的に得られた蛍光単位を用いて評価される。アッセイ法の線形範囲は約３．９〜１０００ｎｇ／ｍｌである。これらは標準曲線では９ポイントである。Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦの最高濃度は１０００ｎｇ／ｍｌ、それに続き８つの段階的１対２希釈物およびブランク（０）である。
以下の式を使用して生存％を計算する。
生存％＝（Ｘ−ブランク）／（処置無し−ブランク）×１００
Ｈ１６−７．８ｍｃＭＭＡＦのＫＵ８１２細胞に対する特異的な細胞傷害活性：ＩＣ５０ ０．１５ｎＭ。
Ｈ１６−７．８およびＡＤＣ対照（抗体（非抗１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂ抗体）−ｍｃＭＭＡＦ）はＫＵ８１２細胞に対する細胞傷害活性を有しなかった。
本願全体を通して様々なウェブサイトデータのコンテンツ、刊行物、特許出願および特許が参照される（ウェブサイトはワールドワイドウェブ上のアドレスであるそのユニフォームリソースロケータ、すなわちＵＲＬによって参照される）。それらの参照の各々の開示は、本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される。
本発明は本明細書に開示される実施形態により範囲が限定されるものではなく、それらの実施形態は、本発明の個別的な態様の単一の例示として意図され、且つ機能的に等価なものはいずれも本発明の範囲内にある。前述の記載および教示から、本発明のモデルおよび方法の様々な変形例が、本明細書に記載されるものに加えて当業者に明らかとなるであろうとともに、同様に本発明の範囲内に含まれることが意図される。かかる変形例または他の実施形態は、本発明の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施することができる。
（表１）悪性の場合に１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂを発現する組織
腎臓
結腸
肺
卵巣
***
リンパ腫
骨
子宮
膵臓
肝臓
前立腺
（表２）アミノ酸略記
Figure 2017095459
（表３）アミノ酸置換行列
Figure 2017095459
ＧＣＧソフトウェア９．０ ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換行列（ブロック置換行列）をもとに作成。値が大きいほど、関連する天然タンパク質に置換が見出される可能性が高くなる。
（表４）Ｋｕ８１２細胞におけるＦＡＣＳ ＭＦＩ値
Figure 2017095459
（表５）薬物がコンジュゲートしたペプチドに関するピーク同定結果の要約
Figure 2017095459
可能性のあるコンジュゲーション部位（システイン残基）を太字および下線で示す。
（表６）ＬＣ−ＭＳによるＤＡＲ分析のピーク同定結果
Figure 2017095459
（表７）ｍｃＭＭＡＦの合成スキーム
Figure 2017095459

Claims (14)

  1. 抗体またはその抗原結合断片を含む抗体薬物コンジュゲートであって、該抗体または該抗原結合断片が、配列番号：２のアミノ酸配列を含む１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質に特異的に結合し、該抗体が、配列番号：７の２０位〜１４２位のＶＨ領域および配列番号：８の２０位〜１２７位のＶＬ領域のアミノ酸配列を含み、且つ、該抗体が、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）にコンジュゲートされている、抗体薬物コンジュゲート。
  2. 前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２またはＦｖ断片である、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  3. 前記抗体が完全ヒト抗体である、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  4. 組換えにより産生される、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  5. ヒト単位用量形態の請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲートを含む、薬学的組成物。
  6. 癌治療のための、請求項５に記載の薬学的組成物。
  7. 前記癌が腎癌または肝癌である、請求項６に記載の薬学的組成物。
  8. 対象における癌細胞の成長を阻害する方法であって、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲートを該対象に投与するステップを含む、方法。
  9. 細胞傷害剤または診断剤を細胞に送達する方法であって、以下のステップを含む方法：
    抗体またはその断片にコンジュゲートされているＭＭＡＦを供給して、抗体薬物コンジュゲートまたは抗体断片薬物コンジュゲートを形成するステップであって、該抗体または該断片が、配列番号：２のアミノ酸配列を含む１６１Ｐ２Ｆ１０Ｂタンパク質に特異的に結合し、該抗体が、配列番号：７の２０位〜１４２位のＶＨ領域および配列番号：８の２０位〜１２７位のＶＬ領域のアミノ酸配列を含む、ステップ、並びに
    該細胞を該抗体薬物コンジュゲートまたは該抗体断片薬物コンジュゲートに曝露するステップ。
  10. 哺乳動物における腫瘍を治療する方法であって、有効量の請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲートで該哺乳動物を治療するステップを含む、方法。
  11. 哺乳動物における腫瘍成長を低下させる方法であって、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲートと放射線との組み合わせの有効量で該哺乳動物を治療するステップを含む、方法。
  12. 哺乳動物における腫瘍成長を低下させる方法であって、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲートと化学療法剤との組み合わせの有効量で該哺乳動物を治療するステップを含む、方法。
  13. 哺乳動物における腫瘍成長を低下させる方法であって、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲートと薬物または生物学的に活性を有する治療法との組み合わせの有効量で該哺乳動物を治療するステップを含む、方法。
  14. 哺乳動物における癌を治療する方法であって、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲートと化学療法剤との組み合わせの有効量で該哺乳動物を治療するステップを含む、方法。
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