KR101473271B1 - 항균제 - Google Patents
항균제 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101473271B1 KR101473271B1 KR1020117006983A KR20117006983A KR101473271B1 KR 101473271 B1 KR101473271 B1 KR 101473271B1 KR 1020117006983 A KR1020117006983 A KR 1020117006983A KR 20117006983 A KR20117006983 A KR 20117006983A KR 101473271 B1 KR101473271 B1 KR 101473271B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- lys
- leu
- gly
- ala
- arg
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/02—Local antiseptics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Apparatus For Disinfection Or Sterilisation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
본 발명은 막 또는 LPS 분열 활성을 갖는 펩티드 스트레치가 융합된 엔도리신을 포함하는 엔도리신 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 엔도리신 변이체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약제, 특히 진단 수단, 살균제 또는 화장용 물질로서 그람음성균 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제로서 사용하기 위한 상기 개질된 엔도리신 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 식품, 식품 가공 장비, 식품 가공 공장, 식품과 접촉하는 표면, 의료 장치, 병원 및 수술실의 표면의 그람음성균 오염의 제거, 감소 또는 예방에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 의약, 식품 또는 사료의 진단 수단, 또는 환경 진단으로서 상기 엔도리신 변이체의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 상기 개질된 엔도리신 변이체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 그람음성균에 대한 항균 작용이 개선된 개질된 엔도리신(endolysin) 변이체에 관한 것이다. 상기 개질된 엔도리신 변이체는 엔도리신 및 상기 엔도리신에 융합된 양이온성 펩티드를 포함하며, 이에 따라 상기 엔도리신의 양이온성이 강화된다. 본 발명은 또한 양이온성이 강화된 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 미생물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유기체를 제조할 때 본 발명에 따른 엔도리신 변이체를 인코딩하는 핵산으로 형질전환된 미생물을 사용하여 엔도리신 변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 막 또는 LPS 분열 활성을 갖는 펩티드 스트레치(peptide stretch)가 융합된 엔도리신을 포함하는 엔도리신 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 엔도리신 변이체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약제, 특히 진단 수단, 살균제 또는 화장용 물질로서 그람음성균 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제로서 사용하기 위한 상기 개질된 엔도리신 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 식품, 식품 가공 장비, 식품 가공 공장, 식품과 접촉하게 되는 표면, 의료 장치, 병원 및 수술실의 표면의 그람음성균 오염의 제거, 감소 또는 예방에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 의약, 식품 또는 사료의 진단 수단, 또는 환경 진단으로서 상기 엔도리신 변이체의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 상기 개질된 엔도리신 변이체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
엔도리신은 박테리오파지(또는 세균 바이러스)에 의해 인코딩되는 펩티도글리칸 가수분해효소이다. 이는 파지 증식의 용균 사이클에서 후기 유전자 발현 동안 합성되며, 박테리아 펩티도글리칸의 분해를 통해 감염된 세포로부터 파생(progeny) 비리온의 방출을 매개한다. 이는 β(1,4)-글리코실라제(리소자임), 트랜스글리코실라제, 아미다제 또는 엔도펩티다제이다. 엔도리신의 항균 적용은 이미 Gasson에 의해 1991년에 제안되었다(GB2243611). 비록 엔도리신의 살균 능력이 오랫동안 알려져 왔으나, 이러한 효소의 항균제로서의 용도는 항생물질의 성공과 우월함 때문에 무시되었다. 다수의 항생물질에 내성인 세균의 출현 이후에 비로소 엔도리신으로 인간 병원균을 방지하는 이러한 단순 개념이 관심을 받았다. 완전히 신규한 군의 항균제를 개발하고자 하는 강렬한 요구가 나타났으며, '효소'와 '항생물질'의 혼성 용어인 '엔지비오틱스(enzybiotics)'로서 사용되는 엔도리신은 이러한 요구를 완전히 충족시켰다. 2001년에 Fischetti와 그의 동료들은 처음으로 그룹 A 스트렙토코시에 대한 박테리오파지 C1 엔도리신의 치료적 효능을 입증하였다(Nelson et al., 2001). 그 이후로 다수의 문헌에서 특히 그람양성균에 의한, 세균 감염을 제어하는 매력적이고 상호보완적인 대안으로서 엔도리신이 인정되었다. 그 후, 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Loeffler et al., 2001), 바실루스 안트라시스(Schuch et al., 2002), S. 아갈락티애(Cheng et al., 2005) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Rashel et al, 2007)와 같은 다른 그람양성 병원균에 대한 다양한 엔도리신이 엔지비오틱스로서 그의 효능을 입증하였다. 최근에 엔도리신 치료법의 가장 중요한 과제는 엔도리신의 외인성 작용에 대한 그람음성균의 무감각에 있는데, 그 이유는 외막이 펩티도글리칸으로부터 엔도리신의 접근을 보호하기 때문이다. 이는 현재 중요한 그람음성 병원균에 대해 효과적인 엔도리신의 범위의 확장을 방지한다.
그람음성균은 홀마크로서 특징적인 비대칭 이중층을 갖는 외막을 갖는다. 외막 이중층은 인지질(주로 포스파티딜 에탄올아민)을 포함하는 내부 단층과 주로 단일 당지질, 지질다당류(LPS)로 구성된 외부 단층으로 이루어진다. 박테리아계에는 LPS 구조의 광범위한 다양성이 존재하며, LPS 구조는 우세한 환경 조건에 대응하여 개질될 수 있다. LPS 층의 안정성과 다른 LPS 분자 사이의 상호작용은 LPS 분자의 음이온 성분(지질 A 및 내부핵의 인산기와 KDO의 카르복실기)과 2가 이온(Mg2+, Ca2+)의 정전기 상호작용에 의해 주로 달성된다. 따라서, 양이온-결합 부위는 외막의 완전성에 필수적이다(Vaara, 1992). 폴리-L-리신 폴리머(20개 이상의 잔기)와 같은 다가양이온성 제제는 이러한 안정화된 2가 양이온을 대체함으로써 외막 투과성을 증가시킨다. 또한, 이는 소위 '자가-촉진 흡수(self-promoted uptake)' 메카니즘을 수행한다(Hancock and Wong, 1984). 이의 벌크성(bulkiness) 때문에, 외막의 정상적인 차단 기능이 방해받으며, 그 자신의 흡수를 촉진하면서 일시적 크랙을 생성한다(Vaara and Vaara, 1983). 또한, 불포화 지방산의 부재에 의해 선호되는, 지질 A의 소수성 부분의 밀집되고 정렬된 패킹은 점도가 높은 강성(rigid) 구조를 형성한다. 이는 친유성 분자에 대해 덜 투과성이 되도록 하며, 외막(OM)에 대해 부가적인 안정성을 부여한다.
그러나, 항생물질에 대해 증가되고 있는 미생물의 내성은 세균에 의해 야기되는 점점더 많아지는 감염을 치료하는데 있어서 어려움이 발생하고 있다. 특히 슈도모나스 에루지노사 및 엔테로박테리아세애와 같은 그람음성균에 의해 야기되는 감염에 대해 어려움이 발생한다.
따라서, 그람음성균에 대한 신규한 항균제가 요구된다.
이러한 목적은 특허청구범위에 기재된 발명에 의해 해결된다.
본원에서 "단백질"은 "폴리펩티드"와 동일한 의미로 나타낸다. 본원에서 "단백질"은 특이적 서열의 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 선형 폴리머를 나타낸다. 단백질의 아미노산 잔기는 예컨대 탄수화물과 인산과 같은 다양한 기들의 공유 결합에 의해 개질될 수 있다. 헴 또는 지질과 같은 다른 물질들이 폴리펩티드쇄와 더 느슨하게 결합될 수 있으며, 이는 본원에서 사용되는 "단백질"이라는 용어에 의해 구성되는 복합 단백질을 생성한다. 특히 알파 나선 및 베타-주름 시트의 존재와 관련하여 폴리펩티드쇄 폴드(fold)가 설명되는 다양한 방법들이 있다. 본원에서 "단백질"은 전부 알파, 전부 베타, 알파/베타, 및 알파 플러스 베타인 4개의 군의 단백질 모두를 나타낸다.
본원에서 "융합 단백질"은 2개의 핵산 서열의 융합으로부터 생성된 발현 산물을 나타낸다. 상기 단백질은 예컨대 재조합 DNA 발현 시스템에서 제조될 수 있다. 또한, 본원에서 "융합 단백질"은 일차 아미노산 서열, 특히 엔도리신, 오토리신 및/또는 다른 펩티도글리칸 가수분해효소와 이차 또는 추가의 아미노산 서열의 융합을 나타낸다. 상기 이차 또는 추가의 아미노산 서열은 바람직하게는 펩티드 스트레치, 특히 양이온성 및/또는 다가양이온성 펩티드이다. 바람직하게는, 상기 이차 및/또는 추가의 아미노산 서열은 일차 아미노산 서열의 임의의 도메인에 대해 이질적이고, 실질적으로 상동적이지 않다.
본원에서 "개질된 엔도리신 변이체"는 "엔도리신 변이체"와 동일한 의미로 사용된다. 상기 두 용어는 엔도리신 및 펩티드 스트레치, 특히 양이온성 및/또는 다가양이온성 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 나타낸다.
본원에서 "펩티드 스트레치(peptide stretch)"는 엔도리신, 오토리신 및/또는 펩티도글리칸 가수분해효소와 같은 단백질에 연결된 임의 종류의 펩티드를 나타낸다. 특히 본원에서 "펩티드 스트레치"는 양이온성 펩티드 및/또는 다가양이온성 펩티드를 나타낸다. 그러나, 본 발명의 의미 내에서 펩티드 스트레치는 His-tag, Strep-tag, Avi-tag, Myc-tag, Gst-tag, JS-tag, 시스테인-tag, FLAG-tag 또는 당업계에 알려진 다른 tag들, 티오레독신 또는 말토스 결합 단백질(MBP)을 나타내지 않는다. 본원에서 "펩티드 스트레치"와 대조적으로 "tag"라는 용어는, tag가 하기 나열된 촉진 중 하나를 위해 유용하도록 하는 기능이 상기 펩티드의 양전하에 의해 야기되지 않는 한, 폴리펩티드의 발현 및/또는 친화성 정제를 촉진시키기 위해, 폴리펩티드를 표면에 고정화시키기 위해, 또는 예컨대 다른 ELISA 어세이 포맷에서 항체 결합에 의해 폴리펩티드를 탐지하기 위한 마커 또는 라벨 부분으로 제공하기 위해 이용할 수 있는 펩티드를 나타낸다. 그러나, His-tag는 각 pH에 따라 양으로 하전될 수도 있지만, 고정화된 2가 양이온에 결합될 때 친화성 정제 도구로서 사용되며 본 발명에 따른 펩티드 스트레치로서 사용되지 않는다.
본원에서 "펩티드"는 약 2 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 약 4 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 약 5 내지 30개의 아미노산 잔기로 이루어진 짧은 폴리펩티드를 나타내며, 여기에서 하나의 아미노산 잔기의 아미노기는 펩티드 결합에 의해 다른 아미노산 잔기의 카르복실기에 결합된다. 펩티드는 특이적 기능을 가질 수 있다. 펩티드는 자연적으로 발생한 펩티드이거나, 또는 합성에 의해 설계되고 제조된 펩티드일 수 있다. 펩티드는 예를 들어 효소적 또는 화학적 분할에 의해 천연 단백질로부터 유래되거나 제거될 수 있으며, 또는 통상의 펩티드 합성법(예컨대, 고체상 합성) 또는 분자생물학 기법(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 합성에 의해 제조된 펩티드는 예컨대 양이온성 또는 다가양이온성 펩티드가 바람직하다.
본원에서 "양이온성 펩티드"는 양으로 하전된 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 나타낸다. 바람직하게는, 양이온성 펩티드는 pKa 값이 9.0 또는 그 이상이다. 통상적으로, 양이온성 펩티드의 아미노산 잔기의 4개 이상이 양으로 하전될 수 있으며 예를 들어 리신 또는 아르기닌이다. "양으로 하전된"은 대략 생리학적 조건에서 순(net) 양전하를 갖는 아미노산 잔기의 측쇄를 나타낸다. 본원에서 "양이온성 펩티드"는 또한 다가양이온성 펩티드를 나타낸다.
본원에서 "다가양이온성 펩티드"는 양으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 리신, 아르기닌 및/또는 히스티딘 잔기, 더 바람직하게는 리신 및/또는 아르기닌 잔기로 주로 구성된, 합성에 의해 설계되고 제조된 펩티드를 나타낸다. 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 약 100 %의 아미노산 잔기가 양으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 리신 및/또는 아르기닌 잔기라면, 펩티드는 주로 양으로 하전된 아미노산 잔기로 구성된다. 양으로 하전된 아미노산 잔기가 아닌 아미노산 잔기는 중성으로 하전된 아미노산 잔기 및/또는 음으로 하전된 아미노산 잔기 및/또는 소수성 아미노산 잔기일 수 있다. 바람직하게는, 양으로 하전된 아미노산 잔기가 아닌 아미노산 잔기는 중성으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 세린 및/또는 글리신이다.
본원에서 "엔도리신(endolysin)"은 세균의 세포벽을 가수분해하는데 적합한 효소를 나타낸다. "엔도리신"은 하나 이상의 하기 활성을 갖는 하나 이상의 "효소적 활성 도메인(EAD)"으로 이루어진다: 엔도펩티다제, N-아세틸-뮤라모일-L-알라닌-아미다제(아미다제), N-아세틸-뮤라미다제, N-아세틸-글루코사미니다제(리소자임) 또는 트랜스글리코실라제. 또한, 엔도리신은 효소적으로 불활성이고 숙주 세균의 세포벽에 결합하는 영역, 소위 CBD(세포벽 결합 도메인)를 포함할 수도 있다. 엔도리신은 한개, 두개 또는 그 이상의 CBD를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 "엔도리신"은 또한 하나 이상의 EAD를 갖지만 CBD는 갖지 않는 효소를 나타낸다. 일반적으로, 세포벽 결합 도메인은 세균의 표면상에서 다른 성분들을 결합할 수 있다. 바람직하게는, 세포벽 결합 도메인은 펩티도글리칸 결합 도메인이며, 세균의 펩티도글리칸에 결합한다.
본원에서 "세포벽"은 그람음성균의 외부 세포 인클로저(enclosure)를 형성함에 따라 세포의 완전한 상태를 보장하는 모든 성분들을 나타낸다. 특히, 본원에서 "세포벽"은 펩티도글리칸, 지질다당류를 갖는 그람음성균의 외막, 세균의 세포막을 나타내며, 또한 예컨대 캡슐, 외부 단백질 층 또는 점액으로서 펩티도글리칸에 부착된 부가층을 나타낸다.
본원에서 "오토리신(autolysin)"은 엔도리신과 연관된 효소이지만, 세균에 의해 인코딩되며 예컨대 세포 분할 및 세포벽 대사에 관여하는 효소이다. 오토리신에 대한 개요는 "Bacterial peptidoglycan (murein) hydrolases. Vollmer W, Joris B, Charlier P, Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar; 32(2): 259-86"에서 찾을 수 있다.
본원에서 "EAD"는 엔도리신의 효소적 활성 도메인을 나타낸다. EAD는 세균의 펩티도글리칸을 가수분해하는 원인이 된다. 이는 엔도리신의 하나 이상의 효소적 활성을 나타낸다. EAD는 또한 한개보다 많은 효소적 활성 모듈(module)로 구성될 수도 있다. 본원에서 "EAD"는 "촉매 도메인"과 동일한 의미로 사용된다.
본원에서 "삭제"는 각 출발 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 제거를 나타낸다.
본원에서 "삽입" 또는 "부가"는 각 출발 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 부가를 나타낸다.
본원에서 "치환"은 특정 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 다른 잔기로 교환하는 것을 나타낸다.
본 발명은 지질다당류(LPS) 분열 활성 또는 일반적으로 막 분열 활성을 갖는 펩티드에 융합된 엔도리신을 포함하는, 개질된 엔도리신 변이체의 경우, 그람음성균에 대한 개선된 항균제에 관한 것이다. LPS는 그람음성균의 외막의 주요 성분이다. 이는 세포막의 음전하를 증가시키고 특정 종류의 화학적 공격으로부터 막을 보호한다. 또한, 상기 LPS는 어느 정도까지는 그람음성균의 막을 세균의 외부로부터 부가된 엔도리신으로부터 보호한다. 그러나, LPS는 예컨대 양으로 하전된 펩티드로서 LPS 분열 활성을 갖는 펩티드 스트레치에 의해 분열될 수 있다. 또한, 상기 펩티드 스트레치는 외막 단백질 운반 메카니즘, 구조적 외막 단백질의 불안정화 및/또는 지질-의존 불안정화에 관여할 수 있다. 본 발명자들은 놀랍게도 LPS 분열 활성 또는 일반적으로 막 분열 활성을 갖는 펩티드 스트레치가 그람음성균의 외막을 통해 상기 펩티드 스트레치에 융합된 엔도리신의 통과를 촉진한다는 것을 발견하였다. 그람음성균의 외막을 통한 엔도리신의 촉진된 통과 후에, 펩티도글리칸 층의 분해에 이어서 세균의 내부 세포 압력이 더이상 견딜 수 없을 때 삼투적 용해에 기인하여 엔도리신에 의해 그람음성균의 세포벽은 더 용이하게 분열 또는 분해될 수 있다.
따라서, 본 발명은 그람음성균의 세포벽을 분해하는 활성을 갖는 엔도리신과 막 분열 활성을 갖는 펩티드 스트레치로 구성된 융합 단백질에 관한 것이며, 상기 펩티드 스트레치는 N-말단 및/또는 C-말단에서 효소에 융합된다. 본 발명에 따른 상기 융합 단백질은 개질된 엔도리신 변이체 또는 단순하게 엔도리신 변이체 또는 개질된 엔도리신이라고도 지칭된다.
개질된 엔도리신 변이체의 엔도리신 부분은, 엔테로박테리아세애(에스케리키아, 특히 대장균, 살모넬라, 쉬겔라, 시트로박터, 에드워드시엘라, 엔테로박터, 하프니아, 클레브시엘라, 특히 K. 뉴모니애, 모르가넬라, 프로테우스, 프로비덴시아, 세라티아, 예르시니아), 슈도모나다세애(슈도모나스, 특히 P. 에루지노사, 버크홀데리아, 스테노트로포모나스, 슈와넬라, 스핀고모나스, 코마모나스), 네이세리아, 모락셀라, 비브리오, 에어로모나스, 브루셀라, 프란시셀라, 보르데텔라, 레지오넬라, 바르토넬라, 콕시엘라, 해모필루스, 파스퇴렐라, 만헤이미아, 악티노바실루스, 가르드네렐라, 스피로채타세애(트레포네마 및 보렐리아), 렙토스피라세애, 캄필로박터, 헬리코박터, 스피릴룸, 스트렙토바실러스, 박테로이다세애(박테로이데스, 푸소박테리움, 프레보텔라, 포르피로모나스), 아시네토박터, 특히 A. 바우마니 등의 인간 또는 동물에 병원성인 균주를 포함하는 세균 군, 과, 속 또는 종의 그람음성균과 같은 그람음성균에 대해 특이적인 박테리오파지에 의해 인코딩되는 것이 바람직하다.
또한, 엔도리신은 엔테로박테리아세애(에스케리키아, 특히 대장균, 살모넬라, 쉬겔라, 시트로박터, 에드워드시엘라, 엔테로박터, 하프니아, 클레브시엘라, 특히 K. 뉴모니애, 모르가넬라, 프로테우스, 프로비덴시아, 세라티아, 예르시니아), 슈도모나다세애(슈도모나스, 특히 P. 에루지노사, 버크홀데리아, 스테노트로포모나스, 슈와넬라, 스핀고모나스, 코마모나스), 네이세리아, 모락셀라, 비브리오, 에어로모나스, 브루셀라, 프란시셀라, 보르데텔라, 레지오넬라, 바르토넬라, 콕시엘라, 해모필루스, 파스퇴렐라, 만헤이미아, 악티노바실루스, 가르드네렐라, 스피로채타세애(트레포네마 및 보렐리아), 렙토스피라세애, 캄필로박터, 헬리코박터, 스피릴룸, 스트렙토바실러스, 박테로이다세애(박테로이데스, 푸소박테리움, 프레보텔라, 포르피로모나스), 아시네토박터, 특히 A. 바우마니 등의 인간 또는 동물에 병원성인 균주를 포함하는 세균 군, 과, 속 또는 종의 그람음성균에 대해 세포벽 분해 활성을 갖는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 엔도리신 부분은 하기 표에 기재된 파지 또는 야생형(wild type) 엔도리신으로부터 유래된다.
슈도모나스 에루지노사 파지 ΦKZ 및 EL, 슈도모나스 푸티다 파지 OBP, 파지 LUZ24의 엔도리신으로부터, 또는 T4 리소자임, gp61 뮤라미다제 및 PSP3 엔도리신으로부터 유래된 엔도리신 부분이 또한 바람직하다.
더 바람직하게는, 엔도리신 부분은 서열번호:1에 따른 phiKZgp144, 서열번호:2에 따른 ELgp188, 서열번호:3에 따른 살모넬라 엔도리신, 서열번호:4에 따른 엔테로박테리아 파지 T4 엔도리신, 서열번호:5에 따른 아시네토박터 바우마니 엔도리신, 서열번호:6에 따른 대장균 파지 K1F 엔도리신, 서열번호:7에 따른 OBPgpLYS, 서열번호:8에 따른 PSP3 살모넬라 엔도리신(PSP3gp10) 및 서열번호:9에 따른 대장균 파지 P2 엔도리신(P2gp09)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 엔도리신 또는 개질된 엔도리신 변이체는 아미노산 서열의 변형 및/또는 변이를 포함한다. 상기 변형 및/또는 변이는 삭제, 삽입 및 부가, 치환 또는 이의 조합과 같은 돌연변이, 및/또는 비오틴화, 아세틸화, 페길화(PEGylation)와 같은 아미노산 잔기의 화학적 변화, 아미노기, SH 기 또는 카르복실기의 화학적 변화를 포함할 수 있다. 상기 변형 및/또는 변이된 엔도리신은 각각의 야생형 엔도리신의 용균 활성을 나타낸다. 그러나, 상기 활성은 각각의 야생형 엔도리신의 활성보다 더 높거나 더 낮을 수 있다. 상기 활성은 각각의 야생형 엔도리신의 활성의 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 약 200 %, 또는 그 이상일 수 있다. 상기 활성은 예컨대 [Briers et al., J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533, (2007)]에 기재된 액체 용균 어세이 또는 플레이트 용균 어세이와 같이 당업계에서 통상의 기술자에게 잘 알려진 어세이들에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 막 및/또는 LPS 분열 활성을 갖는 펩티드는 양으로 하전된 아미노산으로서 리신, 아르기닌 및/또는 히스티딘을 하나 이상 포함하는 양으로 하전된 펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 펩티드에서 아미노산의 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 바람직하게는 100%가 양으로 하전된 아미노산이다. 유리하게는, 양이온성 펩티드는 엔도리신 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단 끝에 융합되며, 이에 따라 이후의 단백질의 양이온성을 증대시킨다. 본 발명의 또다른 구현예에서, 엔도리신에 융합된 양이온성 펩티드는 5개 이상, 더 바람직하게는 9개 이상의 아미노산 길이를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 엔도리신 변이체는 엔도리신 및 엔도리신에 융합된 펩티드를 포함하며, 상기 펩티드는 약 3 내지 약 50개, 더 바람직하게는 약 5 내지 약 20개, 예를 들어 약 5 내지 약 15개의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 아미노산 잔기의 적어도 20, 30, 40, 50, 60 또는 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 90%가 아르기닌 또는 리신 잔기이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 엔도리신 변이체는 엔도리신 및 엔도리신에 융합된 펩티드를 포함하며, 상기 펩티드는 약 3 내지 약 50개, 더 바람직하게는 약 5 내지 약 20개, 예를 들어 약 5 내지 약 15개의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 아미노산 잔기는 아르기닌 또는 리신 잔기이다.
바람직하게는, 개질된 엔도리신 변이체의 펩티드 스트레치는 엔도리신의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합된다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 펩티드 스트레치는 엔도리신의 N-말단에만 융합된다. 그러나, N-말단과 C-말단 모두에서 펩티드 스트레치를 갖는 개질된 엔도리신 변이체가 또한 바람직하다. N-말단 및 C-말단 상의 상기 펩티드 스트레치는 동일하거나 구별되는 펩티드 스트레치일 수 있다.
본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체의 펩티드 스트레치는 바람직하게는 효소에 공유결합된다. 바람직하게는, 상기 펩티드 스트레치는 적어도 5개, 더 바람직하게는 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99개 또는 적어도 100개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 특히 약 5 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 약 5 내지 약 50개 또는 약 5 내지 약 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 스트레치가 바람직하다. 약 6 내지 약 42개의 아미노산 잔기, 약 6 내지 약 39개의 아미노산 잔기, 약 6 내지 약 38개의 아미노산 잔기, 약 6 내지 약 31개의 아미노산 잔기, 약 6 내지 약 25개의 아미노산 잔기, 약 6 내지 약 24개의 아미노산 잔기, 약 6 내지 약 22개의 아미노산 잔기, 약 6 내지 약 21개의 아미노산 잔기, 약 6 내지 약 20개의 아미노산 잔기, 약 6 내지 약 19개의 아미노산 잔기, 약 6 내지 약 16개의 아미노산 잔기, 약 6 내지 약 14개의 아미노산 잔기, 약 6 내지 약 12개의 아미노산 잔기, 약 6 내지 약 10개의 아미노산 잔기 또는 약 6 내지 약 9개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 스트레치가 더 바람직하다.
본 발명의 일측면에서, 상기 융합된 펩티드 스트레치는 리신, 아르기닌 및/또는 히스티딘, 특히 리신 및/또는 아르기닌의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하는 양이온성 및/또는 다가양이온성 펩티드이다. 바람직하게는, 상기 펩티드 스트레치에서 아미노산 잔기의 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99 % 이상이 양으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 리신 및/또는 아르기닌 잔기이다. 약 100 %의 양으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 아르기닌 및/또는 리신 잔기로 이루어진 펩티드 스트레치가 특히 바람직하며, 여기서 바람직하게는 약 60 % 내지 약 70 %의 상기 양으로 하전된 아미노산 잔기가 리신 잔기이고 약 30 % 내지 약 40 %의 상기 양으로 하전된 아미노산 잔기가 아르기닌 잔기이다. 약 100 %의 양으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 아르기닌 및/또는 리신 잔기로 이루어진 펩티드 스트레치가 더 바람직하며, 여기서 바람직하게는 약 64 % 내지 약 68 %의 상기 양으로 하전된 아미노산 잔기가 리신이고 약 32 % 내지 약 36 %의 상기 양으로 하전된 아미노산 잔기가 아르기닌이다. 아르기닌만으로 또는 리신만으로 이루어진 펩티드 스트레치가 또한 바람직하다.
서열번호:10(KRKKRK)에 따른 하나 이상의 모티브(motive)를 포함하는 양이온성 및/또는 다가양이온성 펩티드 스트레치가 특히 바람직하다. 특히, 서열번호:10(KRKKRK)에 따른 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 모티브를 포함하는 양이온성 펩티드 스트레치가 바람직하다. 하나 이상의 KRK 모티브(lys-arg-lys), 바람직하게는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 또는 33개의 KRK 모티브를 포함하는 양이온성 펩티드 스트레치가 더 바람직하다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 양이온성 펩티드 스트레치는 양으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 리신 및/또는 아르기닌 잔기 외에, 중성으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 글리신 및/또는 세린 잔기를 포함한다. 약 70 % 내지 약 100 %, 또는 약 80 % 내지 약 95 %, 또는 약 85 % 내지 약 90 %의 양으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 리신, 아르기닌 및/또는 히스티딘 잔기, 더 바람직하게는 리신 및/또는 아르기닌 잔기와 약 0 % 내지 약 30 %, 또는 약 5 % 내지 약 20 %, 또는 약 10 % 내지 약 20 %의 중성으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 글리신 및/또는 세린 잔기로 이루어진 양이온성 펩티드 스트레치가 바람직하다. 약 4 % 내지 약 8 %의 세린 잔기, 약 33 % 내지 약 36 %의 아르기닌 잔기, 및 약 56 % 내지 약 63%의 리신 잔기로 이루어진 폴리펩티드 스트레치가 바람직하다. 특히, 서열번호:32(KRXKR)에 따른 하나 이상의 모티브를 포함하는 폴리펩티드 스트레치가 바람직하며, 여기에서 X는 리신, 아르기닌 및 히스티딘과 다른 임의의 아미노산이다. 특히, 서열번호:33(KRSKR)에 따른 하나 이상의 모티브를 포함하는 폴리펩티드 스트레치가 바람직하다. 서열번호:32(KRXKR) 또는 서열번호:33(KRSKR)에 따른 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 약 20개의 모티브를 포함하는 양이온성 스트레치가 더 바람직하다.
약 9 내지 약 16 %의 글리신 잔기, 약 4 내지 약 11 %의 세린 잔기, 약 26 내지 약 32 %의 아르기닌 잔기, 및 약 47 내지 약 55 %의 리신 잔기로 이루어진 폴리펩티드 스트레치가 또한 바람직하다. 특히, 서열번호:34(KRGSG)에 따른 하나 이상의 모티브를 포함하는 폴리펩티드 스트레치가 바람직하다. 서열번호:34(KRGSG)에 따른 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 약 20개의 모티브를 포함하는 양이온성 스트레치가 더 바람직하다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 양이온성 펩티드 스트레치는 양으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 리신 및/또는 아르기닌 잔기 외에, 소수성 아미노산 잔기, 특히 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 시스테인, 알라닌, 티로신, 히스티딘, 트레오닌, 세린, 프롤린 및 글리신 잔기, 더 바람직하게는 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌 및/또는 트립토판 잔기를 포함한다. 약 70 % 내지 약 100 %, 또는 약 80 % 내지 약 95 %, 또는 약 85 % 내지 약 90 %의 양으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 리신 및/또는 아르기닌 잔기와 약 0 % 내지 약 30 %, 또는 약 5 % 내지 약 20 %, 또는 약 10 % 내지 약 20 %의 소수성 아미노산 잔기, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 시스테인, 알라닌, 티로신, 히스티딘, 트레오닌, 세린, 프롤린 및 글리신 잔기, 더 바람직하게는 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌 및/또는 트립토판 잔기로 이루어진 양이온성 펩티드 스트레치가 바람직하다.
특히, 하기의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 스트레치가 바람직하다.
바람직하게는, 펩티드 스트레치는 His-tag, Strep-tag, Avi-tag, Myc-tag, Gst-tag, JS-tag, 시스테인-tag, FLAG-tag 또는 당업계에 알려진 다른 tag들과 같은 tag가 없으며, 티오레독신 또는 말토스 결합 단백질(MBP)이 없다. 그러나, 본 발명에 따른 펩티드 스트레치 및/또는 개질된 엔도리신 변이체는 상기 tag 또는 tag들을 포함할 수도 있다.
바람직하게는, 펩티드 스트레치는 그람음성균의 외막을 통해 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체를 유도하는 기능을 갖지만, 효소에 융합되지 않고 투여될 때 활성이 없거나 낮다. 그람음성균의 외막을 통해 개질된 엔도리신 변이체를 유도하는 기능은 상기 펩티드 스트레치의 외막 또는 LPS 분열 활성 능력에 의해 야기된다.
특히, 하기의 개질된 엔도리신 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 개질된 엔도리신 변이체가 바람직하다.
본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체, 특히 서열번호:35 내지 49, 53, 57, 61 내지 64, 및 66 내지 78에 따른 바람직한 개질된 엔도리신 변이체는 예컨대 정제용 tag를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는 개질된 엔도리신 변이체의 C-말단에서 His6-tag가 바람직하다. 상기 tag는 예컨대 클로닝의 이유 때문에 부가적 아미노산 잔기에 의해 개질된 엔도리신 변이체에 연결될 수 있다. 바람직하게는, 상기 tag는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 부가적 아미노산 잔기에 의해 개질된 엔도리신 변이체에 연결될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 개질된 엔도리신 변이체는 부가적 아미노산 잔기인 리신 및 글리신(Lys-Gly) 또는 류신 및 글루탐산(Leu-Glu)에 의해 개질된 엔도리신 변이체에 연결된 C-말단에서 His6-tag를 포함한다.
특히, 하기에 기재된 실시예에서 사용되는 개질된 엔도리신 변이체가 바람직하다. 실시예에서 사용되는 서열번호:35 내지 42, 53, 57 및 61에 따른 개질된 엔도리신 변이체는 부가적 아미노산 잔기인 리신 및 글리신(Lys-Gly)에 의해 각각의 개질된 엔도리신 변이체에 연결된 C-말단에서 His6-tag를 포함한다. 실시예에서 사용되는 서열번호:43 내지 49 및 75에 따른 개질된 엔도리신 변이체는 부가적 아미노산 잔기인 류신 및 글루탐산(Leu-Glu)에 의해 각각의 개질된 엔도리신 변이체에 연결된 C-말단에서 His6-tag를 포함한다.
융합 단백질은 예컨대 [Sambrook et al. 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual]에 기재되어 있는 표준 클로닝 기법을 사용하여 둘 이상의 핵산 서열을 연결함으로써 구축된다. 상기 단백질은 예컨대 재조합 DNA 발현 시스템에서 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 융합 단백질은 엔도리신 및 각각의 펩티드 스트레치에 대한 핵산을 융합함으로써 수득될 수 있다.
일부 융합 단백질은 세균에서 발현에 따라 독성일 수도 있고 단백질 분해에 기인하여 상동적이지 않을 수도 있기 때문에, 전략은 다른 부가적 단백질에 결합되거나 융합된 이러한 융합 단백질을 발현하는 것일 수 있다. 이러한 다른 부가적 단백질에 대한 예는 티오레독신이며, 이는 대장균에서 독성 항균 펩티드의 발현을 중재하는 것으로 나타났다(TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4 from multiple joined genes in Escherichia coli. Zhou L, Zhao Z, Li B, Cai Y, Zhang S. Protein Expr Purif. 2009 Apr; 64(2): 225-230).
융합 단백질의 항균 기능을 위해, 부가적 융합 단백질을 단백질 분해에 의해 제거할 필요성이 있을 수 있다. 예컨대 사용되는 단백질분해 효소에 따라 융합 단백질의 N-말단을 예를 들어 MGS에서 AMGS(서열번호:31)로 개질하기 위해, pET32 발현 시스템(Novagen)과 같은 시판되는 키트가 필요할 수 있으며, 남아있는 알라닌 잔기는 도입된 엔테로키나제 분해 분위로부터 생성된 것이었다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체의 펩티드 스트레치는 아미노산 서열의 변형 및/또는 변이를 포함한다. 상기 변형 및/또는 변이는 삭제, 삽입 및 부가, 치환 또는 이의 조합과 같은 돌연변이, 및/또는 비오틴화, 아세틸화, 페길화(PEGylation)와 같은 아미노산 잔기의 화학적 변화, 아미노기, SH 기 또는 카르복실기의 화학적 변화를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 분리된(isolated) 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 본 발명에 따른 상기 개질된 엔도리신 변이체의 구성적 또는 유도 발현을 가능하게 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 개질된 엔도리신 변이체를 발현하는 유전적으로 개질된 적합한 숙주 세포와 같은 미생물로부터 상기 개질된 엔도리신 변이체를 수득하는 방법에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 미생물, 예컨대 세균 또는 효모 또는 균류, 또는 예컨대 포유류 세포, 특히 인간 세포와 같은 동물 세포일 수 있다. 본 발명의 일구현예에서, 효모 세포는 피치아 파스토리스 세포이다. 숙주는 예컨대 수율, 가용성, 비용 등의 단순한 생명공학적 이유에 기인하여 선택될 수 있지만, 또한 의료적 관점, 예컨대 비-병리학적 세균 또는 효모, 인간 세포로부터 선택될 수도 있다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체의 발현을 얻기 위해 적합한 숙주 세포를 유전적으로 형질전환하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 유전적 물질을 숙주 세포로 도입함으로써 숙주 세포가 유전적으로 개질되며, 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전공학 방법에 의해 번역 및 발현을 수행한다.
본 발명의 또다른 측면은, 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체 및/또는 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 벡터로 형질전환된 숙주를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약학 조성물에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 예컨대 EDTA, TRIS, 락트산, 락토페린, 폴리믹신, 시트르산 및/또는 예컨대 [Vaara (Agents that increase the permeability of the outer membrane. Vaara M. Microbiol Rev. 1992 Sep; 56(3): 395-441)]에 기재된 다른 물질들과 같은 금속 킬레이터와 같이 그람음성균의 외막을 투과할 수 있는 제제를 부가적으로 포함할 수 있다. 상기 언급된 투과성 제제의 조합을 포함하는 조성물이 또한 바람직하다. 특히, 약 10 μM 내지 약 100 mM EDTA, 더 바람직하게는 약 50 μM 내지 약 10 mM EDTA, 더 바람직하게는 약 0.5 mM 내지 약 10 mM EDTA, 더 바람직하게는 약 0.5 mM 내지 약 2 mM EDTA, 더 바람직하게는 약 0.5 mM 내지 1 mM EDTA를 포함하는 조성물이 바람직하다. 그러나, 약 10 μM 내지 약 0.5 mM EDTA를 포함하는 조성물이 또한 바람직하다. 약 0.5 mM 내지 약 2 mM EDTA, 더 바람직하게는 약 1 mM EDTA 및 부가적으로 약 10 내지 약 100 mM TRIS를 포함하는 조성물이 또한 바람직하다.
또한, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체 및/또는 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 숙주에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은, 병원성 그람음성균과 관련된 장애, 질환 또는 상태의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체 및/또는 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주의 용도에 관한 것이다. 특히, 상기 장애, 질환 또는 상태의 치료 및/또는 예방은 엔테로박테리아세애(에스케리키아, 특히 대장균, 살모넬라, 쉬겔라, 시트로박터, 에드워드시엘라, 엔테로박터, 하프니아, 클레브시엘라, 특히 K. 뉴모니애, 모르가넬라, 프로테우스, 프로비덴시아, 세라티아, 예르시니아), 슈도모나다세애(슈도모나스, 특히 P. 에루지노사, 버크홀데리아, 스테노트로포모나스, 슈와넬라, 스핀고모나스, 코마모나스), 네이세리아, 모락셀라, 비브리오, 에어로모나스, 브루셀라, 프란시셀라, 보르데텔라, 레지오넬라, 바르토넬라, 콕시엘라, 해모필루스, 파스퇴렐라, 만헤이미아, 악티노바실루스, 가르드네렐라, 스피로채타세애(트레포네마 및 보렐리아), 렙토스피라세애, 캄필로박터, 헬리코박터, 스피릴룸, 스트렙토바실러스, 박테로이다세애(박테로이데스, 푸소박테리움, 프레보텔라, 포르피로모나스), 아시네토박터, 특히 A. 바우마니 등의 인간 또는 동물에 병원성인 균주를 포함하는 세균 군, 과, 속 또는 종의 그람음성균에 의해 야기될 수 있다. 바람직하게는, 상기 장애, 질환 또는 상태는 슈도모나스, 특히 슈도모나스 에루지노사 및/또는 슈도모나스 푸티다, 버크홀데리아, 특히 버크홀데리아 슈도말레이 및/또는 버크홀데리아 솔라나세아룸, 살모넬라, 특히 살모넬라 티피무리움 및/또는 살모넬라 엔테리티디스, 아시네토박터, 특히 아시네토박터 바우마니, 대장균 및/또는 클레브시엘라, 특히 클레브시엘라 뉴모니애에 의해 야기될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체 및/또는 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 숙주를 포함하는 약제에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 치료 및/또는 예방이 요구되는 대상체의 장애, 질환 또는 상태를 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 유효량의 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체 및/또는 유효량의 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 숙주, 또는 본 발명에 따른 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 대상체는 인간 또는 동물일 수 있다.
바람직하게는, 상기 치료방법은 그람음성균, 특히 상기 기재된 그람음성균에 의해 야기된 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 것일 수 있다. 특히, 상기 치료방법은 피부, 연조직, 호흡기 시스템, 폐, 소화관, 눈, 귀, 치아, 비인두, 입, 뼈, 질의 감염, 그람음성균, 특히 상기 기재된 그람음성균에 의해 야기된 균혈증 및/또는 심내막염의 상처의 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 치료(또는 예방) 방법에 사용되는 투여량 및 투여 경로는 치료하려는 특정 질환/감염 부위에 의존한다. 투여 경로는 예를 들어 경구, 국부, 비인두, 비경구, 흡입, 정맥내, 근육내, 척추강내, 척수내, 기관지내, 폐내, 골내, 심장내, 관절내, 직장, 질 또는 임의의 다른 투여 경로일 수 있다.
본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체 및/또는 유효량의 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 숙주, 또는 본 발명에 따른 조성물을 감염 부위(또는 감염될 위험이 있는 부위)에 적용하기 위하여, 단백질분해 효소, 산화, 면역 반응 등과 같은 환경의 영향으로부터 보호하는 제형이 사용될 수 있다. 따라서, 상기 제형은 캡슐, 당제, 정제, 분말, 좌약, 유제, 현탁액, 겔, 로션, 크림, 연고, 주사액, 시럽, 스프레이, 흡입제, 또는 임의의 다른 의학적으로 적합한 추출 제형일 수 있다. 바람직하게는, 상기 추출 제형은 적합한 담체, 안정화제, 향료, 완충액 또는 다른 적합한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 국부 적용을 위한 제형은 로션, 크림, 겔, 연고 또는 반창고일 수 있으며, 비인두 적용을 위한 제형은 스프레이를 통해 코에 적용되는 염류 용액일 수 있다. 예컨대 장에서 특정 감염 부위의 치료 및/또는 예방의 경우에 경구 투여를 위해, 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체가 감염 부위에 도달할 때까지 위장관의 강력한 소화 환경으로부터 보호할 필요가 있을 수 있다. 따라서, 위에서 소화의 초기 단계에서 생존하고 나중에 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체가 장의 환경으로 분비하는, 담체로서의 세균이 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 슈도모나스, 특히 슈도모나스 에루지노사에 의해 야기된 장애, 질환 또는 상태, 특히 장 질환, 특히 유아에서, 뇌척수막의 감염, 예컨대 뇌막염 자반병, 중이의 감염, 피부(농창 농피증), 특히 화상, 요로, 비염, 균혈증 폐렴의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체 및/또는 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주의 용도에 관한 것이며, 특히 환자는 낭포성 섬유증 또는 혈액학적 악성종양, 예컨대 백혈병, 또는 면역억제요법으로부터의 호중구감소증, 특히 장기간 정맥내 또는 요로 카테터삽입, 침습성 수술 과정 및 중화상에 의한 패혈증, 심내막염으로 고통받으며, 특히 환자는 정맥 약물 사용자이거나 또는 개심수술로부터의 합병증, 특히 오염된 안과 용액의 사용 후의 고도의 파괴적인 안구 감염, 또는 안면 중화상, 특히 오염된 의상을 통한 심각한 외상 또는 자창의 결과로서 뼈연골염을 앓는 환자이다.
본 발명의 또다른 특정 구현예에서, 상기 장애, 질환 또는 상태는 버크홀데리아 슈도말레이에 의해 야기되며, 특히 휘트모어병, 만성 폐렴, 패혈증이며, 특히 환자는 외상을 초래하는 피부 병변을 갖는다.
본 발명의 또다른 특정 구현예에서, 상기 장애, 질환 또는 상태는 살모넬라 티피무리움 및 살모넬라 엔테리티디스에 의해 야기되며, 특히 급성 위장염 및 국소 화농성 과정, 특히 골수염, 심내막염, 담낭염이며, 특히 살모넬라 티피무리움에 의해 야기되는 뇌막염이며, 특히 환자는 두 살 미만이다.
본 발명의 또다른 특정 구현예에서, 상기 장애, 질환 또는 상태는 아시네토박터 바우마니에 의해 야기되며, 특히 기관지염, 폐렴, 특히 정맥내 카테터삽입의 결과로서 상처 감염 및 패혈증이다.
본 발명의 또다른 특정 구현예에서, 상기 장애, 질환 또는 상태는 대장균에 의해 야기되며, 특히 추가 장 감염, 특히 맹장염, 화농성 담낭염, 복막염, 화농성 뇌막염, 및 요로의 감염, 장내 대장균 감염, 특히 유행성 장염, 및 이질과 유사한 감염성 질환, 패혈증, 장성독혈증, 유선염 및 이질이다.
본 발명의 또다른 특정 구현예에서, 상기 장애, 질환 또는 상태는 클레브시엘라 뉴모니애에 의해 야기되며, 특히 폐렴, 균혈증, 뇌막염 및 요로의 감염이다. 바람직하게는, 만일 치료(또는 예방)하려는 감염이 다중 내성 세균 균주, 특히 스트렙토마이신, 테트라시클린, 세팔로틴, 젠타마이신, 세포탁심, 세팔로스포린, 세프타지딤 또는 이미페넴의 항생물질의 하나 이상에 대해 내성인 균주에 의해 야기된다면, 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체는 의료적 치료에 사용된다. 또한, 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체는 통상의 항균 제제, 예컨대 항생물질, 란티바이오틱, 박테리오신 또는 엔도리신 등과 조합하여 투여함으로써 치료방법에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 구획을 포함하는 약학적 팩(pack)에 관한 것으로서, 상기 하나 이상의 구획은 본 발명에 따른 하나 이상의 개질된 엔도리신 변이체 및/또는 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 하나 이상의 숙주, 또는 본 발명에 따른 조성물을 포함한다.
본 발명의 또다른 측면은 약학 조성물의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 하나 이상의 개질된 엔도리신 변이체 및/또는 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 하나 이상의 숙주를 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명에 따른 조성물은 화장용 조성물이다. 수개의 세균 종들은 피부와 같은 환자의 신체의 환경적으로 노출된 표면에 자극을 야기할 수 있다. 상기 자극을 예방하기 위하여, 또는 상기 세균성 병원균의 작은 발현을 제거하기 위하여, 충분한 양의 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체를 포함하는 특정 화장용 제제가 이미 존재하거나 새롭게 침전된 병원성 그람음성균을 분해하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 약물, 식품 또는 사료의 진단 수단 또는 환경의 진단으로서, 특히 그람음성균에 의해 야기되는 세균 감염의 진단을 위한 진단 수단으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체는 병원성 세균, 특히 그람음성 병원성 세균을 특이적으로 분해하는 도구로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체에 의한 세균 세포의 분해는 트리톤 X-100과 같은 세제 또는 폴리믹신 B와 같은 세균 세포 엔벨로프를 약화시키는 다른 첨가제를 부가함으로써 지지될 수 있다. 특이적 세포 분해는 핵산 기초 방법, 예컨대 PCR, 핵산 혼성화 또는 NASBA(핵산 서열 기초 증폭), 면역학적 방법, 예컨대 IMS, 면역형광법 또는 ELISA 기법, 또는 세균 세포의 세포 함량에 의존하는 다른 방법들, 예를 들어 구별되는 세균 군 또는 종에 대해 특이적인 단백질을 이용하는 효소 어세이(예컨대, 엔테로박테리아에 대해 β-갈락토시다제, 또는 응고효소 양성 균주에 대해 응고효소)를 사용하여 이후에 세균을 특이적으로 검출하기 위한 초기 단계로서 필요하다.
본 발명의 또다른 측면은 식품, 식품 가공 장비, 식품 가공 공장, 선반 및 식품 보관소와 같은 식품과 접촉하게 되는 표면, 및 모든 다른 상황에서 그람음성균 오염의 제거, 감소 및/또는 예방을 위한, 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체의 용도에 관한 것으로서, 병원성 세균, 조건적 병원성 세균 또는 원하지 않는 다른 세균은 식재료, 의료 장치 및 병원과 수술실의 모든 종류의 표면을 잠재적으로 감염시킬 수 있다.
특히, 본 발명의 개질된 엔도리신 변이체는 살균제로서 예방적으로 사용될 수 있다. 상기 살균제는 수술 전 또는 후에 사용될 수 있거나, 예를 들어 혈액투석하는 동안 사용될 수 있다. 또한, 조산아 및 면역약화된 환자, 또는 보철장치를 필요로 하는 대상체는 본 발명의 개질된 엔도리신 변이체로 처치될 수 있다. 상기 처치는 예방적으로 이루어질 수도 있고 급성 감염 동안 이루어질 수도 있다. 동일한 맥락에서, 병원 감염, 특히 항생물질 내성 균주, 예컨대 슈도모나스 에루지노사(FQRP), 아시네토박터 종 및 엔테로박테리아세애, 예컨대 대장균, 살모넬라, 쉬겔라, 시트로박터, 에드워드시엘라, 엔테로박터, 하프니아, 클레브시엘라, 모르가넬라, 프로테우스, 프로비덴시아, 세라티아 및 예르시니아 종에 의한 병원 감염은 본 발명의 개질된 엔도리신 변이체에 의해 예방적으로 처치될 수도 있고 급성 단계 동안 처치될 수도 있다. 따라서, 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체는 또한 살균액, 예컨대 세제(detergent), 텐시드, 용매, 항생물질, 란티바이오틱 또는 박테리오신에서 유용한 다른 성분들과 조합하여 살균제로서 사용될 수도 있다.
살균제로서 예컨대 병원, 치과, 동물병원, 주방 또는 욕실에서 본 발명에 따른 개질된 엔도리신 변이체의 사용을 위해, 개질된 엔도리신 변이체는 예컨대 유체, 분말, 겔 형태의 조성물, 또는 습윤 와이프(wet wipe) 또는 살균 시트 제품의 성분으로 제조될 수 있다. 상기 조성물은 그의 각 용도 및 형태를 위해 적합한 담체, 첨가제, 희석제 및/또는 부형제 뿐만 아니라 항균 활성을 지지하는 제제, 예컨대 EDTA 또는 융합 단백질의 항균 활성을 증대시키는 제제를 각각 부가적으로 포함할 수 있다. 융합 단백질은 또한 통상의 살균제, 예컨대 알코올, 알데히드, 산화제, 페놀수지, 사차 암모늄 화합물 또는 UV-광과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어 표면, 물체 및/또는 장치를 살균하기 위해, 개질된 엔도리신 변이체는 상기 표면, 물체 및/또는 장치에 적용될 수 있다. 예를 들어 살균 조성물을 의류 또는 천과 같은 임의의 수단에 스프레이 또는 주입하여 습윤시킴으로써 적용할 수 있다. 융합 단백질은 각각의 적용 및 완전한 항균 활성을 얻기 위한 "반응 시간"에 따라 농도를 변화시켜 사용될 수 있다.
본 발명의 적용가능성의 추가 범위는 하기의 상세한 설명으로부터 명확해질 것이지만, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내는 것이고 단지 예로서만 제공되며, 당업계의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 상세한 설명으로부터 본 발명의 취지 및 범위 내에서 다양한 수정 및 변형을 명백하게 할 수 있다는 점이 이해되어야 한다. 전술한 상세한 설명과 후술하는 상세한 설명은 모두 예시적이고 설명적일 뿐이며, 이는 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
하기의 도는 본 발명을 설명한다.
도 1은 (POLY)n-gp144((POLY)n-KZ144)의 재조합 생성을 위한 플라스미드 구축을 보여주는 도식도이다. 사전에, pEXP5CT/POLY-gp144(pEXP5CT/POLY-KZ144)는 테일(tail) PCR에 의해 구축되었다(5' 테일(tail) 프라이머에서 BamHI 제한 부위 및 일차 다가양이온 카세트(cassette)를 가짐). 플라스미드는 BamHI에 의해 선형화되었으며, 탈인산화되었으며, 돌출된 BamHI 말단을 포함하는 카세트와 결합되었다. 이러한 카세트는 2개의 상보적 올리고뉴클레오티드의 혼성화로부터 유래하며 9개의 양으로 하전된 잔기들을 인코딩한다. 하나의 부가적 양성 아르기닌 잔기가 세린과 함께 일차 카세트와 이차 카세트 사이의 접합 부위에서 생성된다. 더 긴 pEXP5CT/(POLY)n-gp144(pEXP5CT/(POLY)n-KZ144) 변이체가 반복 사이클에 의해 유사하게 구축되었다.
도 2는 피치아 파스토리스에 의한 POLY-gp144의 발현 및 분비를 나타낸다. P. 파스토리스 X33 발현 배양[1일 후(사각형), 3일 후(삼각형) 및 4일 후(원형)]의 30 μl의 상청액이 270 μl의 클로로포름-투과 P. 에루지노사 PAO1p 세포에 첨가된다. 완충 조건은 POLY-gp144(KH2PO4/K2HP04) I = 120 mM pH 6.2의 최적의 효소적 조건이었다. 그 후, 광밀도가 분광광도법에 의해 기록되었다. 광밀도의 하락은 P. 파스토리스에 의한 뮤라리틱(muralytic) 효소의 분비를 나타낸다. 음성대조군으로서, P. 파스토리스 X33 미발현 플라스미드가 포함된다(다이아몬드형).
도 3은 슈도모나스 에루지노사 PAO1p 세포에 대해, 비개질된 phiKZgp144 및 ELgp188 엔도리신의 항균 활성, 9개의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 스트레치를 포함하는 개질된 변이체 POLY-gp144 및 POLY-gp188의 항균 활성, 및 18개의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 스트레치를 포함하는 개질된 변이체 (POLY)2-gp144 및 (POLY)2-gp188의 항균 활성을 그래프 도식으로 나타낸다. 에러 바는 평균의 표준편차를 나타낸다.
도 4는 비개질된 엔도리신 PSP3gp10 및 그의 개질된 엔도리신 변이체 PKPSP3gp10의 발현 및 정제의 결과를 보여주는 쿠마시-염색 SDS-PAGE의 사진을 나타낸다. LMW 레인은 사이즈 마커와 관련된다(LMW 사다리). 옆의 3개의 레인은 Ni2+ 친화성 크로마토그래피 후에 용리 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 500 mM 이미다졸)에서 정제된 단백질의 단백질 분획과 관련된다. FT 레인은 플로우 스루(flow through)와 관련되며, W 레인은 폐기 분획(waste fraction)과 관련된다. 정제된 단백질 분획에서 단지 작은(minor) 이차 밴드가 보여지며, 이는 고순도의 재조합 단백질(>90%)을 나타낸다.
도 5a 내지 d는 실온에서 흔들지 않고 배양한 후에 여러 개의 지수성장(exponential growing) 그람음성균에 대해 다른 조성물에서 비개질된 PSP3gp10 및 개질된 PKPSP3gp10의 항균 활성을 그래프 도식으로 나타낸다. 그람음성균의 각 종들은 30분 동안 0.5 mM의 EDTA를 포함하지만 엔도리신을 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 비개질된 PSP3gp10을 포함하지만 EDTA를 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 개질된 PKPSP3gp10을 포함하지만 EDTA를 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 비개질된 PSP3gp10 및 0.5 mM의 EDTA를 포함하는 조성물로, 1.315 μM의 개질된 PKPSP3gp10 및 0.5 mM의 EDTA를 포함하는 조성물로 배양되었다. 도 5a에 P. 에루지노사 PAO1p 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 5b에 P. 에루지노사 Br667 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 5c에 대장균 WK 6 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 5d에 살모넬라 티피무리움 세포에 대한 항균 활성이 나타난다. "△"는 각각의 PSP3gp10 및 PKPSP3gp10 샘플 사이의 활성의 차이를 나타낸다. 에러 바는 평균의 표준편차를 나타낸다.
도 6은 비개질된 엔도리신 P2gp09 및 그의 개질된 엔도리신 변이체 PKP2gp09의 발현 및 정제의 결과를 보여주는 쿠마시-염색 SDS-PAGE의 사진을 나타낸다. LMW 레인은 사이즈 마커와 관련된다(LMW 사다리). 옆의 3개의 레인은 Ni2+ 친화성 크로마토그래피 후에 용리 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 500 mM 이미다졸)에서 정제된 단백질의 단백질 분획과 관련된다. FT 레인은 플로우 스루(flow through)와 관련되며, W 레인은 폐기 분획(waste fraction)과 관련된다. 정제된 단백질 분획에서 단지 작은 이차 밴드가 보여지며, 이는 고순도의 재조합 단백질(>95%)을 나타낸다.
도 7a 내지 f는 실온에서 흔들지 않고 배양한 후에 여러 개의 지수성장(exponential growing) 그람음성균에 대해 다른 조성물에서 비개질된 P2gp09 및 개질된 PKP2gp09의 항균 활성을 그래프 도식으로 나타낸다. 그람음성균의 각 종들은 30분 동안 0.5 mM의 EDTA를 포함하지만 엔도리신을 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 비개질된 P2gp09를 포함하지만 EDTA를 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 개질된 PKP2gp09를 포함하지만 EDTA를 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 비개질된 P2gp09 및 0.5 mM의 EDTA를 포함하는 조성물로, 1.315 μM의 개질된 PKP2gp09 및 0.5 mM의 EDTA를 포함하는 조성물로 배양되었다. 도 7a에 P. 에루지노사 PAO1p 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 7b에 P. 에루지노사 Br667 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 7c에 대장균 WK 6 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 7d에 버크홀데리아 슈도말레이 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 7e에 슈도모나스 푸티다 G1 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 7f에 살모넬라 티피무리움 LT2(SGSC N˚2317) 세포에 대한 항균 활성이 나타난다. "△"는 각각의 P2gp09 및 PKP2gp09 샘플 사이의 활성의 차이를 나타낸다. 에러 바는 평균의 표준편차를 나타낸다.
도 8은 비개질된 엔도리신 OBPgpLYS 및 그의 개질된 엔도리신 변이체 PKOBPgpLYS의 발현 및 정제의 결과를 보여주는 쿠마시-염색 SDS-PAGE의 사진을 나타낸다. LMW 레인은 사이즈 마커와 관련된다(LMW 사다리). 옆의 3개의 레인은 Ni2+ 친화성 크로마토그래피 후에 용리 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 500 mM 이미다졸)에서 정제된 단백질의 단백질 분획과 관련된다. FT 레인은 플로우 스루(flow through)와 관련되며, W 레인은 폐기 분획(waste fraction)과 관련된다. 정제된 단백질 분획에서 단지 작은 이차 밴드가 보여지며, 이는 고순도의 재조합 단백질(>90%)을 나타낸다.
도 9a 내지 f는 실온에서 흔들지 않고 배양한 후에 여러 개의 지수성장(exponential growing) 그람음성균에 대해 비개질된 OBPgpLYS 및 개질된 PKOBPgpLYS의 다른 조성물의 항균 활성을 그래프 도식으로 나타낸다. 그람음성균의 각 종들은 30분 동안 0.5 mM의 EDTA를 포함하지만 엔도리신을 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 비개질된 OBPgpLYS를 포함하지만 EDTA를 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 개질된 PKOBPgpLYS를 포함하지만 EDTA를 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 비개질된 OBPgpLYS 및 0.5 mM의 EDTA를 포함하는 조성물로, 1.315 μM의 개질된 PKOBPgpLYS 및 0.5 mM의 EDTA를 포함하는 조성물로 배양되었다. 도 9a에 대장균 WK6 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 9b에 살모넬라 티피무리움 LT2(SGSC N˚2317) 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 9c에 슈도모나스 에루지노사 PAO1p 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 9d에 슈도모나스 에루지노사 Br667 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 9e에 슈도모나스 푸티다 G1 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 9f에 버크홀데리아 슈도말레이 세포에 대한 항균 활성이 나타난다. "△"는 각각의 OBPgpLYS 및 PKOBPgpLYS 샘플 사이의 활성의 차이를 나타낸다. 에러 바는 평균의 표준편차를 나타낸다.
도 1은 (POLY)n-gp144((POLY)n-KZ144)의 재조합 생성을 위한 플라스미드 구축을 보여주는 도식도이다. 사전에, pEXP5CT/POLY-gp144(pEXP5CT/POLY-KZ144)는 테일(tail) PCR에 의해 구축되었다(5' 테일(tail) 프라이머에서 BamHI 제한 부위 및 일차 다가양이온 카세트(cassette)를 가짐). 플라스미드는 BamHI에 의해 선형화되었으며, 탈인산화되었으며, 돌출된 BamHI 말단을 포함하는 카세트와 결합되었다. 이러한 카세트는 2개의 상보적 올리고뉴클레오티드의 혼성화로부터 유래하며 9개의 양으로 하전된 잔기들을 인코딩한다. 하나의 부가적 양성 아르기닌 잔기가 세린과 함께 일차 카세트와 이차 카세트 사이의 접합 부위에서 생성된다. 더 긴 pEXP5CT/(POLY)n-gp144(pEXP5CT/(POLY)n-KZ144) 변이체가 반복 사이클에 의해 유사하게 구축되었다.
도 2는 피치아 파스토리스에 의한 POLY-gp144의 발현 및 분비를 나타낸다. P. 파스토리스 X33 발현 배양[1일 후(사각형), 3일 후(삼각형) 및 4일 후(원형)]의 30 μl의 상청액이 270 μl의 클로로포름-투과 P. 에루지노사 PAO1p 세포에 첨가된다. 완충 조건은 POLY-gp144(KH2PO4/K2HP04) I = 120 mM pH 6.2의 최적의 효소적 조건이었다. 그 후, 광밀도가 분광광도법에 의해 기록되었다. 광밀도의 하락은 P. 파스토리스에 의한 뮤라리틱(muralytic) 효소의 분비를 나타낸다. 음성대조군으로서, P. 파스토리스 X33 미발현 플라스미드가 포함된다(다이아몬드형).
도 3은 슈도모나스 에루지노사 PAO1p 세포에 대해, 비개질된 phiKZgp144 및 ELgp188 엔도리신의 항균 활성, 9개의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 스트레치를 포함하는 개질된 변이체 POLY-gp144 및 POLY-gp188의 항균 활성, 및 18개의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 스트레치를 포함하는 개질된 변이체 (POLY)2-gp144 및 (POLY)2-gp188의 항균 활성을 그래프 도식으로 나타낸다. 에러 바는 평균의 표준편차를 나타낸다.
도 4는 비개질된 엔도리신 PSP3gp10 및 그의 개질된 엔도리신 변이체 PKPSP3gp10의 발현 및 정제의 결과를 보여주는 쿠마시-염색 SDS-PAGE의 사진을 나타낸다. LMW 레인은 사이즈 마커와 관련된다(LMW 사다리). 옆의 3개의 레인은 Ni2+ 친화성 크로마토그래피 후에 용리 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 500 mM 이미다졸)에서 정제된 단백질의 단백질 분획과 관련된다. FT 레인은 플로우 스루(flow through)와 관련되며, W 레인은 폐기 분획(waste fraction)과 관련된다. 정제된 단백질 분획에서 단지 작은(minor) 이차 밴드가 보여지며, 이는 고순도의 재조합 단백질(>90%)을 나타낸다.
도 5a 내지 d는 실온에서 흔들지 않고 배양한 후에 여러 개의 지수성장(exponential growing) 그람음성균에 대해 다른 조성물에서 비개질된 PSP3gp10 및 개질된 PKPSP3gp10의 항균 활성을 그래프 도식으로 나타낸다. 그람음성균의 각 종들은 30분 동안 0.5 mM의 EDTA를 포함하지만 엔도리신을 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 비개질된 PSP3gp10을 포함하지만 EDTA를 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 개질된 PKPSP3gp10을 포함하지만 EDTA를 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 비개질된 PSP3gp10 및 0.5 mM의 EDTA를 포함하는 조성물로, 1.315 μM의 개질된 PKPSP3gp10 및 0.5 mM의 EDTA를 포함하는 조성물로 배양되었다. 도 5a에 P. 에루지노사 PAO1p 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 5b에 P. 에루지노사 Br667 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 5c에 대장균 WK 6 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 5d에 살모넬라 티피무리움 세포에 대한 항균 활성이 나타난다. "△"는 각각의 PSP3gp10 및 PKPSP3gp10 샘플 사이의 활성의 차이를 나타낸다. 에러 바는 평균의 표준편차를 나타낸다.
도 6은 비개질된 엔도리신 P2gp09 및 그의 개질된 엔도리신 변이체 PKP2gp09의 발현 및 정제의 결과를 보여주는 쿠마시-염색 SDS-PAGE의 사진을 나타낸다. LMW 레인은 사이즈 마커와 관련된다(LMW 사다리). 옆의 3개의 레인은 Ni2+ 친화성 크로마토그래피 후에 용리 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 500 mM 이미다졸)에서 정제된 단백질의 단백질 분획과 관련된다. FT 레인은 플로우 스루(flow through)와 관련되며, W 레인은 폐기 분획(waste fraction)과 관련된다. 정제된 단백질 분획에서 단지 작은 이차 밴드가 보여지며, 이는 고순도의 재조합 단백질(>95%)을 나타낸다.
도 7a 내지 f는 실온에서 흔들지 않고 배양한 후에 여러 개의 지수성장(exponential growing) 그람음성균에 대해 다른 조성물에서 비개질된 P2gp09 및 개질된 PKP2gp09의 항균 활성을 그래프 도식으로 나타낸다. 그람음성균의 각 종들은 30분 동안 0.5 mM의 EDTA를 포함하지만 엔도리신을 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 비개질된 P2gp09를 포함하지만 EDTA를 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 개질된 PKP2gp09를 포함하지만 EDTA를 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 비개질된 P2gp09 및 0.5 mM의 EDTA를 포함하는 조성물로, 1.315 μM의 개질된 PKP2gp09 및 0.5 mM의 EDTA를 포함하는 조성물로 배양되었다. 도 7a에 P. 에루지노사 PAO1p 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 7b에 P. 에루지노사 Br667 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 7c에 대장균 WK 6 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 7d에 버크홀데리아 슈도말레이 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 7e에 슈도모나스 푸티다 G1 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 7f에 살모넬라 티피무리움 LT2(SGSC N˚2317) 세포에 대한 항균 활성이 나타난다. "△"는 각각의 P2gp09 및 PKP2gp09 샘플 사이의 활성의 차이를 나타낸다. 에러 바는 평균의 표준편차를 나타낸다.
도 8은 비개질된 엔도리신 OBPgpLYS 및 그의 개질된 엔도리신 변이체 PKOBPgpLYS의 발현 및 정제의 결과를 보여주는 쿠마시-염색 SDS-PAGE의 사진을 나타낸다. LMW 레인은 사이즈 마커와 관련된다(LMW 사다리). 옆의 3개의 레인은 Ni2+ 친화성 크로마토그래피 후에 용리 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 500 mM 이미다졸)에서 정제된 단백질의 단백질 분획과 관련된다. FT 레인은 플로우 스루(flow through)와 관련되며, W 레인은 폐기 분획(waste fraction)과 관련된다. 정제된 단백질 분획에서 단지 작은 이차 밴드가 보여지며, 이는 고순도의 재조합 단백질(>90%)을 나타낸다.
도 9a 내지 f는 실온에서 흔들지 않고 배양한 후에 여러 개의 지수성장(exponential growing) 그람음성균에 대해 비개질된 OBPgpLYS 및 개질된 PKOBPgpLYS의 다른 조성물의 항균 활성을 그래프 도식으로 나타낸다. 그람음성균의 각 종들은 30분 동안 0.5 mM의 EDTA를 포함하지만 엔도리신을 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 비개질된 OBPgpLYS를 포함하지만 EDTA를 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 개질된 PKOBPgpLYS를 포함하지만 EDTA를 포함하지 않는 조성물로, 1.315 μM의 비개질된 OBPgpLYS 및 0.5 mM의 EDTA를 포함하는 조성물로, 1.315 μM의 개질된 PKOBPgpLYS 및 0.5 mM의 EDTA를 포함하는 조성물로 배양되었다. 도 9a에 대장균 WK6 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 9b에 살모넬라 티피무리움 LT2(SGSC N˚2317) 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 9c에 슈도모나스 에루지노사 PAO1p 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 9d에 슈도모나스 에루지노사 Br667 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 9e에 슈도모나스 푸티다 G1 세포에 대한 항균 활성이 나타나며, 도 9f에 버크홀데리아 슈도말레이 세포에 대한 항균 활성이 나타난다. "△"는 각각의 OBPgpLYS 및 PKOBPgpLYS 샘플 사이의 활성의 차이를 나타낸다. 에러 바는 평균의 표준편차를 나타낸다.
하기의 실시예는 본 발명을 설명하는 것이지만, 이에 한정되는 것으로 고려되어서는 안 된다. 달리 나타내지 않는다면, 예컨대 [Sambrock et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]에 기재된 것과 같은 분자생물학적 표준 기법이 사용되었다.
실시예 1: 개질된 phiKZgp144 및 ELgpgp188 엔도리신 변이체의 클로닝, 발현 및 정제
서열번호:1로 표시되는 phiKZgp144 및 서열번호:2로 표시되는 ELgp188은 N-말단 펩티도글리칸 결합 도메인 및 C-말단 촉매 도메인을 갖는 슈도모나스 에루지노사 파지 φKZ 및 EL로부터 유래된 모듈(modular) 엔도리신이다(Briers et al., 2007).
phiKZgp144 및 ELgp188의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 증폭을 위해, 기준(standard) 5' 프라이머(phiKZgp144에 대해 5' ATGAAAGTATTACGCAAA 3'(서열번호:83); ELgp188에 대해 5' ATGAACTTCCGGACGAAG 3'(서열번호:65))와 서열번호:81 및 82에 따른 기준(standard) 3' 프라이머(phiKZgp144에 대해 TTTTCTATGTGCTGCAAC(서열번호:81); ELgp188에 대해 ATACGAAAT AACGTGACGA(서열번호:82))가 적용되었으며 PCR이 사용되었다. 9개의 양으로 하전된 잔기(Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys ― 서열번호:11)를 인코딩하는 유전자 단편으로 phiKZgp144 또는 ELgp188을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 5' 말단을 연장하기 위하여, 연장된 5' 프라이머(phiKZgp144에 대해 5' ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAA CGCAAAAAAGTATTACGCAAAG 3'(서열번호:79); ELgp188에 대해 5' ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAA CGCAAAAACTTCCGGACGAAG 3'(서열번호:80))와 서열번호:81 및 82에 따른 기준(standard) 3' 프라이머와 테일(tail) PCR이 적용되었다. PCR 산물은 제조사의 프로토콜에 따라 pEXP5CT/TOPO® 발현 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 클로닝되었다. tRNA 손실(depletion)을 피하고 프레임시프트의 위험을 감소시키기 위하여, 아르기닌 트리플렛(triplet)이 리신 트리플렛 외에 포함되었다(리신에 대해 유일한 2개의 이용가능한 트리플렛은 AAA 및 AAG이며, 이는 긴 A-스트레치를 유발함). 계획된 BamHI 제한 부위로 부가적인 다가양이온성 카세트의 삽입은 추가의 양이온성 잔기로 테일(tail)을 길어지게 한다. 이러한 삽입은 각각의 접합 부위에서 아르기닌 및 세린 트리플렛을 생성한다(도 1). 4개까지의 다가양이온성 펩티드 스트레치가 phiKZgp144 및 ELgp188에 융합되었으며, (POLY)n-gp144 또는 (POLY)n-gp188(n=1, 2, 3, 4)가 설계되었으며, N-말단에서 각각 9, 19, 29 및 39개의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함한다. 이에 따라, 하기의 구축물이 대장균 BL21 (DE3) pLysS 세포에서 발현되었다(37℃에서 세포의 지수성장(exponentially growing), 1mM IPTG를 사용한 유도, 37℃에서 4시간 동안 발현).
개질된 엔도리신 변이체 POLY-gp144(서열번호:35), (POLY)2-gp144(서열번호:36), POLY-gp188(서열번호:39) 및 (POLY)2-gp188(서열번호:40)는 추가 연구를 위해 사용되었다. 상기 단백질은 C-말단 6xHis-tag를 사용하여 Ni2+ 친화성 크로마토그래피(1ml His-trap Ni-NTA 컬럼을 사용한 악타 패스트 단백질 액체 크로마토그래피)에 의해 정제되었다. 대장균 발현 배양물 리터 당 총수율은 정제된 모액(stock solution)의 총부피 및 단백질 농도의 분광광도 측정에 의해 결정되었다. gp188 유도체의 정제는 gpl44 유도체의 조건(50mM 이미다졸)보다 더 엄격한 조건(65 mM 이미다졸)에서 수행디어, 고순도가 보장되었다. 대장균 발현 배양물 리터 당 총수율은 표 1에 나타난다.
| 융합 | 엔도리신 | |
| phiKZgp144 | ELgp188 | |
| POLY | 2 mg | 48 mg |
| (POLY)2 | 0.5 mg | 0.06 mg |
정제된 모액의 순도는 약 90%였다. POLY-유도체의 정제된 용액의 질량분석은 미량의 대장균 50S 리보솜 소단위 단백질 L2 및 16S rRNA 우리딘-516 유사(pseudo)-우리딜레이트 신타제를 나타내었다. 모든 phiKZgp144 유도체는 β-메르캅토에탄올의 첨가에 의해 모노머로 전환될 수 있는 멀티머 형성을 보여주었으며, 이는 이황화 결합이 멀티머화를 야기하는 것을 나타낸다.
실시예 2: 개질된 phiKZgp144 및 ELgp188 변이체의 항균 활성
지수적(약 106/ml) P. 에루지노사 PAO1p 세포(Pirnay JP et al. (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202)는 100배 희석되었으며(최종 밀도는 약 106/ml였음), 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 0.5 M 이미다졸)에서 100 μg/ml의 최종 농도에서, 각각의 10 μg의 투석되지 않은 단백질(비개질된 엔도리신 phiKZgp144(서열번호:1) 및 ELpg188(서열번호:2) 및 개질된 엔도리신 변이체 POLY-gp144(서열번호:35), (POLY)2-gp144(서열번호:36), POLY-gp188(서열번호:39) 및 (POLY)2-gp188(서열번호:40))로 실온에서 배양되었다. 1시간 후에, 세포 현탁액은 PBS 완충액(10e-5, 10e-4 및 10e-3)에서 희석되었으며, 플레이팅되었다(표준 LB-배지, 37℃에서 밤새 배양됨). 또한, PBS 완충액에서 세포를 포함하는 음성대조군이 플레이팅되었다. 잔여 콜로니가 밤샌 배양 이후에 카운팅되었다. 카운팅된 세포수에 기초하여, 상대적 불활성(%)(=100-(Ni/N0)*l00, 여기서 N0= 비처리된 세포의 수, Ni= 처리된 세포의 수)으로서 로그 단위(=log10N0/Ni)의 항균 활성이 산출되었다(표 2). 모든 샘플은 6배로 복제되었다. 평균/표준편차가 나타난다. 통계학적 분석이 스튜던트 t-테스트를 이용하여 수행되었다.
비개질된 엔도리신 phiKZgp144 및 ELgp188은 음성대조군에 비해 세포수를 유의적으로 감소시키지 않는다. 이러한 관찰은 엔도리신이 그람음성균의 세포벽을 분해하는 장벽으로서 외막의 효능을 설명한다. 표 2에서 보여지는 것처럼 대조적으로, 개질된 엔도리신 POLY-gp144, (POLY)2-gp144, POLY-gp188 및 (POLY)2-gp188에 의한 배양은 세균 세포수(POLY-gp144에 대해 99.85±0.09 %, POLY-gp188에 대해 98.0±0.2 %)의 유의적인 감소(α= 0.05)를 야기한다. 다가양이온성 펩티드 스트레치의 길이의 증가는 특히 phiKZgp144의 경우에 항균 활성을 증대시키는 경향이 또한 있다(99.98±0.02 % 또는 3.7±0.3 로그 단위까지의 감소가 (POLY)2-gp144에 대해 1시간 내에 달성된다). 또한, 본 실험들은 phiKZgp144의 개질된 엔도리신이 ELgp188의 개질된 엔도리신보다 더 높은 항균 활성을 갖는다는 점을 입증하였다.
| 지수 성장 세포 | 엔도리신 | |||
| phiKZgp144 | ELgp188 | |||
| % | log | % | log | |
| 비개질된 엔도리신 | 0±15 | 0.00±0.06 | 10±13 | 0.05±0.06 |
| POLY | 99.85±0.09 | 2.9±0.3 | 98.0±0.2 | 1.7±0.1 |
| (POLY)2 | 99.98±0.02 | 3.7±0.3 | 98.9±0.4 | 2.0±0.2 |
따라서, 본 실시예는 phiKZgp144(서열번호:1)에 대해 N-말단으로 9개의 양이온성 잔기의 짧은 펩티드 스트레치의 부가는 1시간 내에 거의 99.9%의 세포를 사멸시키는데 이미 충분하다는 점을 입증하였다. 폴리-L-리신도 고유의 항균 활성을 갖지만, 이러한 성질은 지금까지 20개 이상의 잔기의 폴리머에만 해당하는 것으로 여겨진다(Vaara and Vaara, 1983a, 1983b). 그러나, 다가양이온성 펩티드 스트레치 및 엔도리신의 공동 작용은 세포를 사멸시킨다.
추가 실험에서, 개질된 엔도리신 POLY-gp144는 50 mM KH2P04/K2HP04 pH 7로 투석되었으며, 상기 기재된 바와 같은 투석되지 않은 단백질 용액을 대신하여 사용되었다. 이에 의해, 불활성화 수준은 부가적으로 2.9±0.3 로그 단위에서 3.9±0.2 로그 단위로 증가되었다.
실시예 3: 비독성 재조합 생성을 위해 숙주로서 피치아 파스토리스에서 개질된 phiKZgp144 및 ELgp188 변이체의 발현
POLY-gp144(서열번호:35)를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임은 pPICZaA 셔틀 벡터(Invitrogen)에서 클로닝되었으며, 그 후 상동 재조합에 의해 P. 파스토리스 게놈에 통합되었다(제조사의 지시에 따름; P. 파스토리스 X33 세포, Invitrogen). 유전자 발현은 BMMY-배지에서 메탄올(1%)에 의해 유도되었으며, 상청액은 1일, 3일 및 4일 후에 효소 활성의 존재를 위해 분석되었다. 따라서, P. 파스토리스 발현 배양의 30 μl의 상청액이 1일, 3일 및 4일 후에 270 μl의 클로로포름-투과 P. 에루지노사 PAO1p 세포에 첨가되었다(완충 조건: KH2PO4/K2HP04 I = 120 mM pH 6.2)(Pirnay JP et al. (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202). 그 후, 광밀도가 분광광도법에 의해 기록되었다(도 2). 광밀도의 하락은 P. 파스토리스에 의한 뮤라리틱(muralytic) 효소의 분비를 나타낸다. 음성대조군으로서, P. 파스토리스 X33 미발현 플라스미드가 포함되었다. 따라서, 상청액 샘플의 부가에 따른 기질의 용해는 P. 파스토리스에 의한 POLY-gp144(서열번호:35)의 성공적인 재조합 생성 및 분비에 대한 측정이다. 1일 후에, 제한된 효소 활성이 검출될 수 있었다. 상청액에서 활성의 유의적인 증가가 4일째에 관찰되지 않았기 때문에, 최대 활성은 3일 후에 관찰되었다. P. 파스토리스의 세포 밀도에 대해 어떠한 독성 효과도 관찰되지 않았다.
P. 파스토리스에 의한 발현 동안, 벡터의 α-분비 신호는 주위 배지로 재조합 단백질의 분비를 야기하며, 이는 다른 단백질의 한정된 수만 분비되기 때문에 단순화된 정제를 가능하게 한다. 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에서 BamHI 제한 부위는 부가적 다가양이온성 펩티드 스트레치를 인코딩하는 더 많은 카세트의 부가를 가능하게 한다.
실시예 4: 다른 다가양이온성 펩티드 스트레치들을 갖는 더 개질된 엔도리신 phiKZgp144 변이체
phiKZgp144의 다가양이온성 펩티드 변이체와 다른 엔도리신의 능력을 시험하고 비교하기 위하여, 단백질의 N-말단 끝에서 다른 다가양이온성 펩티드를 갖는 인코딩 유전자들이 합성되었다. 펩티드 스트레치 변이는 길이, 조성물 및 링커(linker) 서열의 삽입과 관련된다. 한편으로는, KRK 모티브의 N-말단 복합체(multiple)를 갖는 추가 다가양이온성 펩티드 스트레치가 제조되었다. 다른 한편으로는, 아르기닌(R) 또는 리신(K)으로만 이루어진 다가양이온성 펩티드 스트레치가 제조되었다. 또한, 긴 다가양이온성 펩티드 스트레치들의 번역을 증가시키기 위하여, 링커 서열을 포함하는 다가양이온성 펩티드 스트레치가 제조되었다.
다른 산물들이 pET32b 발현 벡터(Novagen, Darmstadt, Germany)에서 클로닝되었다. pET32b는 대장균 숙주에 대한 다가양이온성 펩티드의 잠재적 독성을 감소시키기 위해 사용되었다. 벡터-인코딩된 융합 단백질(티오레독신)은 다가양이온성 펩티드를 감추며(mask), 정제 과정 동안 제거될 수 있다.
이에 따라, OD600nm=0.6의 광밀도에 도달할 때까지 하기의 개질된 엔도리신 변이체들이 37℃에서 대장균 BL21(DE3) 세포에서 발현되었다. 그 후, 단백질 발현은 1 mM의 IPTG(최종 농도)에 의해 유도되었으며, 발현은 4시간 동안 수행되었다. 이어서, 대장균 세포는 6000g에서 20분 동안 원심분리에 의해 수확되었으며, 세포 분열 및 단백질 정제는 S-tag 정제 키트(Novagen, Darmstadt, Germany)에 따라 수행되었다:
모든 단백질들은 S-Tag™ rEK 정제 키트(Novagen, Darmstadt, Germany)를 이용하여 정제되었다. pET32b 벡터를 이용할 때, 발현된 단백질은 숙주에 독성이 아니었으며 생성된 단백질의 고순도를 가져왔다. 정제된 모액들은 고순도를 나타내었다.
지수적(약 106/ml) P. 에루지노사 PAO1p 세포(화상 분리주(Burn wound isolate), Queen Astrid 병원, Brussels; Pirnay JP et al. (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202)는 100배 희석되었으며(최종 밀도는 약 106/ml였음), 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 0.5 M 이미다졸)에서 100 μg/ml의 최종 농도에서 상기 기재된 각각의 10 μg의 투석되지 않은 단백질과 실온에서 배양되었다. 1시간 후에, 세포 현탁액은 1:100으로 희석되었으며, LB에 플레이팅되었다. 또한, 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 0.5 M 이미다졸)을 사용하여 음성대조군이 플레이팅되었다. 잔여 콜로니가 37℃에서 밤새 배양된 후에 카운팅되었다. 카운팅된 세포수에 기초하여, 상대적 불활성(%)(=100-(Ni/N0)*l00, 여기서 N0= 비처리된 세포의 수, Ni= 처리된 세포의 수)으로서 항균 활성이 산출되었다(표 3). 모든 샘플은 적어도 4배로 복제되었다.
| 개질된 엔도리신 변이체 | 펩티드 스트레치의 서열 | 감소[%] |
| phiKZgp144 (서열번호:1) |
0 | |
| KKZ144pET32b (서열번호:43) |
KRKKRKKRKK (서열번호:14) |
99 - 99.9 |
| RK_6_pET32b (서열번호:44) |
RKKRK (서열번호:10) |
99.9 |
| RK_12_pET32b (서열번호:45) |
RKKRKKRKKRK (서열번호:15) |
99 - 99.9 |
| RK_14_pET32b (서열번호:46) |
RKKRKKRKKRKKR (서열번호:16) |
99.9 |
| 9_pET32b (서열번호:47) |
RRRRRRRR (서열번호:12) |
99 |
| 8_pET32b (서열번호:48) |
KKKKKKK (서열번호:13) |
99 |
| K2KZ144_pET32b_mod3 (서열번호:49) |
RKKRKKRKRGSGSGKRKKRKKRKGSGSGKRKKRKKRK (서열번호:28) |
99.9 |
비개질된 phiKZgp144는 음성대조군에 비해 세포수를 유의적으로 감소시키지 않는다. 또한, KRK 모티브의 N-말단 복합체(multiple)의 다가양이온성 펩티드를 갖는 개질된 phiKZgp144 변이체는 항균 효과를 현저하게 증가시킨다. 그러나, 리신 또는 아르기닌의 호모머(homomer) 펩티드 스트레치를 갖는 변이체는 또한 측정된 비개질된 phiKZgp144에 비해 세포의 유의적인 감소를 나타낸다. 또한, 38 아미노산 잔기의 다가양이온성 펩티드 스트레치를 가지며 링커 서열을 포함하는 변이체는 항균 효과를 현저하게 증가시킨다.
실시예 5: 살모넬라 티피무리움 파지 PSP3의 개질된 엔도리신 변이체
서열번호:8에 따른 PSP3gp10은 촉매 람다-유사 뮤라미다제 도메인을 갖는 살모넬라 티피무리움 파지 PSP3으로부터 유래된 165개의 아미노산 잔기를 갖는 구형 엔도리신이다. BLASTp 및 Pfam 분석에 의해 예측된 바와 같이, PSP3gp10 엔도리신은 대략 아미노산 잔기 34 내지 대략 아미노산 잔기 152의 범위에서 그의 촉매 도메인을 포함한다.
파지 PSP3의 정제된 게놈성 DNA는 하기의 PCR 파라미터를 사용하여 핫 스타트(Hot Start) Taq 중합효소 PCR 반응(Qiagen, Germany)에서 PSP3gp10의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 증폭을 위한 주형으로서 사용되었다:
상기 PCR을 위해, 기준(standard) 5' 프라이머(5' ATGGGATCCCCGGTCATTAATACTCACCAG 3'(서열번호:50)) 및 기준(standard) 3' 프라이머(5' TGCCATCACCCCGCCAGCCGTG 3'(서열번호:51))가 사용되었다. 다가양이온성 9-머 펩티드 Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys(서열번호:11)를 인코딩하는 유전자 단편으로 PSP3gp10을 인코딩하는 ORF의 5' 말단을 연장하기 위하여, 연장된 5' 프라이머(5' ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAA GAAACGCAAACCGGTCATTAATACTCACCAG 3'(서열번호:52))와 서열번호:51에 따른 기준(standard) 3' 프라이머와 테일(tail) PCR(동일한 파라미터에 의한 핫 스타트 Taq 중합효소 PCR)이 적용되었다. 원래의 비개질된 PSP3gp10 PCR 단편과 PK-연장된 단편은 모두 제조사의 TA-클로닝 프로토콜에 따라 pEXP5CT/TOPO® 발현 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 연결되었다.
서열번호:8에 따른 PSP3gp10 및 서열번호:53에 따른 PKPSP3gp10의 재조합 발현은, 4시간의 주기 동안 37℃에서 1 mM의 IPTG(이소프로필티오갈락토시드)와의 배양 후에 지수성장 대장균 BL21(λDE3) pLysS 세포(Invitrogen)에서 수행된다. pEXP5CT/TOPO® 발현 벡터에 의해 인코딩된 상기 단백질 모두는 C-말단 6xHis-tag를 사용하여 Ni2+ 친화성 크로마토그래피(Akta FPLC, GE Healthcare)에 의해 정제되었다. Ni2+ 친화성 크로마토그래피는 4개의 일련의 단계로 수행되며, 이러한 단계 모두는 실온에서 이루어진다:
1. 유속(flow rate) 0.5 ml/min에서 10 컬럼 부피의 세척 완충액(60 mM 이미다졸, 0.5 mM NaCl 및 pH 7.4의 20 mM NaH2P04-NaOH)에 의한 Histrap HP 1 ml 컬럼(GE Healthcare)의 평형.
2. 유속 0.5 ml/min에서 Histrap HP 1 ml 컬럼상에 전체 용해물(원하는 엔도리신이 포함됨)의 로딩.
3. 유속 1 ml/min에서 15 컬럼 부피의 세척 완충액에 의한 컬럼의 세척.
4. 유속 0.5 ml/min에서 10 컬럼 부피의 용리 완충액(500 mM 이미다졸, 5 mM NaCl 및 pH 7.4의 20 mM NaH2P04-NaOH)에 의해 컬럼으로부터 결합된 엔도리신의 용리.
대장균 발현 배양물 리터 당 두개의 정제된 재조합 단백질의 총수율은 표 4에 나타난다. 상기 값은 파장 280 nm에서 정제된 모액(stock solution)의 총부피 및 단백질 농도의 분광광도 측정에 의해 결정되었다. 용리 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 500 mM 이미다졸)에서 각각 PSP3gp10 및 PKPSP3gp10으로 이루어진 정제된 모액은 SDS-PAGE 겔에서 시각적으로 측정될 때 90% 이상의 순도를 나타내었다.
| 엔도리신 | 발현율 |
| PSP3gp10(서열번호:8) | 2.15 mg |
| PKPSP3gp10(서열번호:53) | 5.56 mg |
서열번호:53에 따른 PKPSP3gp10 엔도리신의 항-그람음성 스펙트럼을 측정하기 위하여, 1.315 μM의 PKPSP3gp10 엔도리신 및 0.5 mM의 EDTA의 조합이 임상의 P. 에루지노사 균주 PAO1p 및 Br667, 대장균 WK6, 및 살모넬라 티피무리움에 대해 테스트되었다(표 5 참조). 지수성장 세균 세포(OD600nm: 0.6)는 각 균주의 최종 밀도 약 106/ml로 100배 희석되었으며, 각각 0.5 mM의 EDTA와 조합하거나 조합하지 않은 비개질된 엔도리신 PSP2gp10(서열번호:8) 및 개질된 엔도리신 PKPSP3gp10(서열번호:53)와 실온에서 30분 동안 흔들지 않고 배양되었다. 배양을 위해, 엔도리신은 각각 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 0.5 M 이미다졸)에서 사용되었으며, 배양은 엔도리신의 최종 농도 1.315 μM에서 발생되었다. 대조군으로서 각각의 균주는 엔도리신 없이 0.5 mM의 EDTA(상기 기재된 것과 동일한 완충액)와 30분 동안 배양되었다.
| 그람음성 균주 | 소스(source) | 참조 |
| 슈도모나스 에루지노사 PAO1p | 화상 분리주(isolate), Queen Astrid 병원, Brussels | Pirnay et al., 2003* |
| 슈도모나스 에루지노사 Br667 | 화상 분리주(isolate), Queen Astrid 병원, Brussels | Pirnay et al., 2003* |
| 대장균 WK 6 | 표준 실험실(Standard laboratory) 발현 균주 | Prof. C. Michiels |
| 살모넬라 티피무리움 LT2 | SGSC N°2317 | Prof. C. Michiels |
*Pirnay JP et al. (2003). Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa colonization in a burn unit: persistence of a multidrug-resistant clone and a silver sulfadiazine-resistant clone. J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202.
배양 후에, 세포 현탁액은 3배(각각 105-104-103 세포/ml) 희석되었으며, 100 μl의 각 희석액은 LB-배지에 플레이팅되었다. 잔여 콜로니가 37℃에서 밤새 배양된 후에 카운팅되었다. 카운팅된 세포수에 기초하여, 로그 단위(=log10N0/Ni, 여기서 N0= 비처리된 세포의 수, Ni= 처리된 세포의 수)의 상대적 불활성으로서 항균 활성이 산출되었다(표 6).
| 0.5 mM EDTA | 1.315 μM PSP3gp10 |
1.315 μM PKPSP3gp10
|
1.315 μM PSP3gp10 + 0.5 mM EDTA | 1.315 μM PKPSP3gp10 + 0.5 mM EDTA | |
| P. 에루지노사 PAO1p | 0.146 +/- 0.002 | 0.383 +/- 0.015 | 0.344 +/- 0.163 | 3.552 +/- 0.536 | > 4.146 |
| P. 에루지노사 Br667 | 0.223 +/- 0.038 | 0.375 +/- 0.056 | 0.353 +/- 0.086 | 0.571 +/- 0.035 | 0.891 +/- 0.118 |
| 살모넬라 티피무리움 | 0.104 +/- 0.049 | 0.283 +/- 0.038 | 0.327 +/- 0.057 | 0.690 +/- 0.036 | 0.850 +/- 0.032 |
| 대장균 WK 6 | 0.393 +/- 0.035 | 0.190 +/- 0.029 | 0.205 +/- 0.088 | 0.387 +/- 0.014 | 0.584 +/- 0.024 |
모든 샘플은 3배로 복제되었다. 평균+/-표준편차가 나타난다. 관찰되는 최대 감소는 10 세포/ml의 검출 수준 및 초기 세포 밀도에 의존한다. PAO1p에 대해, EDTA는 비개질된 PSP3gp10 엔도리신 및 그의 개질된 변이체 PKPSP3gp10 모두와 상승적으로 작용한다.
실시예 6: 대장균 파지 P2의 개질된 엔도리신 변이체
서열번호:9에 따른 P2gp09는 촉매 람다-유사 뮤라미다제 도메인을 갖는 대장균 파지 P2로부터 유래된 165개의 아미노산 잔기의 구형 엔도리신이다. BLASTp 및 Pfam 분석에 의해 예측된 바와 같이, P2gp09 엔도리신은 대략 아미노산 잔기 34 내지 대략 아미노산 잔기 152의 범위에서 그의 촉매 도메인을 포함한다.
파지 P2의 정제된 게놈성 DNA는 하기의 PCR 파라미터를 사용하여 Pfu 중합효소에 의한 표준 PCR 반응(Fermentas)에서 P2gp09의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 증폭을 위한 주형으로서 사용되었다:
상기 PCR을 위해, 기준(standard) 5' 프라이머(5' ATGGGATCCCCGGTAATTAACACGCATC 3'(서열번호:54)) 및 기준(standard) 3' 프라이머(5' AGCCGGTACGCCGCCAGCGGTACGC 3'(서열번호:55))가 사용되었다. 다가양이온성 9-머 펩티드 Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys(서열번호:11)를 인코딩하는 유전자 단편으로 P2gp09를 인코딩하는 ORF의 5' 말단을 연장하기 위하여, 연장된 5' 프라이머(5' ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGC AAACCGGTAATTAACACGCATC 3'(서열번호:56))와 서열번호:55에 따른 기준(standard) 3' 프라이머와 테일(tail) PCR(상기 표준 PCR과 파라미터가 동일함)이 적용되었다. 원래의 비개질된 P2gp09 PCR 단편과 연장된 단편은 모두 제조사의 TA-클로닝 프로토콜에 따라 pEXP5CT/TOPO® 발현 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 연결되었다.
서열번호:9에 따른 P2gp09 및 서열번호:57에 따른 PKP2gp09의 재조합 발현은, 4시간의 주기 동안 37℃에서 1 mM의 IPTG(이소프로필티오갈락토시드)와의 배양 후에 지수성장 대장균 BL21(λDE3) pLysS 세포(Invitrogen)에서 수행된다. pEXP5CT/TOPO® 발현 벡터에 의해 인코딩된 상기 단백질 모두는 C-말단 6xHis-tag를 사용하여 Ni2+ 친화성 크로마토그래피(Akta FPLC, GE Healthcare)에 의해 정제되었다. Ni2+ 친화성 크로마토그래피는 4개의 일련의 단계로 수행되며, 이러한 단계 모두는 실온에서 이루어진다:
1. 유속 0.5 ml/min에서 10 컬럼 부피의 세척 완충액(60 mM 이미다졸, 0.5 mM NaCl 및 pH 7.4의 20 mM NaH2P04-NaOH)에 의한 Histrap HP 1 ml 컬럼(GE Healthcare)의 평형.
2. 유속 0.5 ml/min에서 Histrap HP 1 ml 컬럼상에 전체 용해물(원하는 엔도리신이 포함됨)의 로딩.
3. 유속 1 ml/min에서 15 컬럼 부피의 세척 완충액에 의한 컬럼의 세척.
4. 유속 0.5 ml/min에서 10 컬럼 부피의 용리 완충액(500 mM 이미다졸, 5 mM NaCl 및 pH 7.4의 20 mM NaH2P04-NaOH)에 의해 컬럼으로부터 결합된 엔도리신의 용리.
대장균 발현 배양물 리터 당 두개의 정제된 재조합 단백질의 총수율은 표 7에 나타난다. 상기 값은 파장 280 nm에서 정제된 모액(stock solution)의 총부피 및 단백질 농도의 분광광도 측정에 의해 결정되었다. 용리 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 500 mM 이미다졸)에서 각각 P2gp09 및 PKP2gp09로 이루어진 정제된 모액은 SDS-PAGE 겔에서 시각적으로 측정될 때 95% 이상의 순도를 나타내었다.
| 엔도리신 | 발현율 |
| P2gp09(서열번호:9) | 5.52 mg |
| PKP2gp09(서열번호:57) | 3.40 mg |
서열번호:57에 따른 PK2gp09 엔도리신의 항-그람음성 스펙트럼을 측정하기 위하여, 1.315 μM의 PK2gp09 엔도리신 및 0.5 mM의 EDTA의 조합이 임상의 P. 에루지노사 균주 PAO1p 및 Br667, 및 대장균 WK6에 대해 테스트되었다(표 9 참조). 지수성장 세균 세포(OD600nm: 0.6)는 각 균주의 최종 밀도 약 106/ml로 100배 희석되었으며, 각각 0.5 mM의 EDTA와 조합하거나 조합하지 않은 비개질된 엔도리신 P2gp09(서열번호:9) 및 개질된 엔도리신 PKP2gp09(서열번호:57)와 실온에서 30분 동안 흔들지 않고 배양되었다. 배양을 위해, 엔도리신은 각각 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 0.5 M 이미다졸)에서 사용되었으며, 배양은 엔도리신의 최종 농도 1.315 μM에서 발생되었다. 대조군으로서 각각의 균주는 엔도리신 없이 0.5 mM의 EDTA(상기 기재된 것과 동일한 완충액)와 30분 동안 배양되었다. 배양 후에, 세포 현탁액은 3배(각각 105-104-103 세포/ml) 희석되었으며, 100 μl의 각 희석액은 LB-배지에 플레이팅되었다. 잔여 콜로니가 37℃에서 밤새 배양된 후에 카운팅되었다. 카운팅된 세포수에 기초하여, 로그 단위(=log10N0/Ni, 여기서 N0= 비처리된 세포의 수, Ni= 처리된 세포의 수, 상기 둘다 배양 후에 카운팅됨)의 상대적 불활성으로서 항균 활성이 산출되었다(표 8).
| 0.5 mM EDTA | 1.315 μM P2gp09 | 1.315 μM PKP2gp09 | △ | 1.315 μM P2gp09 + 0.5 mM EDTA | 1.315 μM PKP2gp09 + 0.5 mM EDTA | △ | |
| P. 에루지노사 PAO1p | 0.330 +/- 0.146 | 0.374 +/- 0.084 | 0.326 +/- 0.069 | -0.038 | 2.840 +/- 0.079 | 3.172 +/- 0.056 | 0.332 |
| P. 에루지노사 Br667 | 0.003 +/- 0.051 | 0.246 +/- 0.042 | 0.300 +/- 0.062 | 0.054 | 0.582 +/- 0.074 | 0.952 +/- 0.213 | 0.370 |
| P. 푸티다 G1 | 0.072 +/- 0.084 | 0.419 +/- 0.024 | 1.014 +/- 0.139 | 0.595 | 3.919 +/- 0.118 | > 4,386 | > 0.467 |
| 버크홀데리아 슈도말레이 | 0.206 +/- 0.151 | 0.769 +/- 0.110 | 1.163 +/- 0.073 | 0.394 | 3.890 +/- 0.056 | 4.255 +/- 0.001 | 0.365 |
| 대장균 WK6 | 0.153 +/- 0.046 | 0.751 +/- 0.053 | 1.104 +/- 0.039 | 0.353 | 0.784 +/- 0.071 | 1.545 +/- 0.102 | 0.749 |
모든 샘플은 3배로 복제되었다. 평균+/-표준편차가 나타난다.
관찰되는 최대 감소는 10 세포/ml의 검출 수준 및 초기 세포 밀도에 의존한다.
| 그람음성 균주 | 소스(source) | 참조 |
| 슈도모나스 에루지노사 PAO1p | 화상 분리주(isolate), Queen Astrid 병원, Brussels | Pirnay et al., 2003* |
| 슈도모나스 에루지노사 Br667 | 화상 분리주(isolate), Queen Astrid 병원, Brussels | Pirnay et al., 2003* |
| 버크홀데리아 슈도말레이 | 임상 분리주(clinical isolate), UZ Gasthuisberg, Leuven | Prof J. Verhaegen |
| 대장균 WK 6 | 표준 실험실(Standard laboratory) 발현 균주 | Prof C. Michiels |
| 슈도모나스 푸티다 G1 | 토양 분리주, Moskow | Prof V.Krylov |
*Pirnay JP et al. (2003). Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa colonization in a burn unit: persistence of a multidrug-resistant clone and a silver sulfadiazine-resistant clone. J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202.
실시예 7: 슈도모나스 푸티다 파지 OBP의 개질된 엔도리신 변이체
서열번호:7에 따른 OBPgpLYS는 추정상의 N-말단 펩티도글리칸 결합 도메인 및 C-말단 촉매 키티나제 도메인을 갖는 슈도모나스 푸티다 파지 OBP로부터 유래된 328개 아미노산 잔기의 모듈(modular) 엔도리신이다. BLASTp 및 Pfam 분석에 의해 예측된 바와 같이, OBPgpLYS 엔도리신은 대략 아미노산 잔기 126 내지 대략 아미노산 잔기 292의 범위에서 그의 촉매 도메인을 포함하며, 대략 아미노산 잔기 7 내지 96의 범위에서 N-말단 펩티도글리칸 결합 도메인을 포함한다.
파지 OBP의 정제된 게놈성 DNA는 하기의 PCR 파라미터를 사용하여 Pfu 중합효소에 의한 표준 PCR 반응(Fermentas, Ontario, Canada)에서 OBPgpLYS의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 증폭을 위한 주형으로서 사용되었다:
따라서, 기준(standard) 5' 프라이머 (5' ATGAAAAATAGCGAGAAGAAT 3'(서열번호:58)) 및 기준(standard) 3' 프라이머(5' AACTATTCCGAGTGCTTTCTTTGT 3'(서열번호:59))가 사용되었다. 다가양이온성 9-머 펩티드 Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys(서열번호:11)를 인코딩하는 유전자 단편으로 OBPgpLYS를 인코딩하는 ORF의 5' 말단을 연장하기 위하여, 연장된 5' 프라이머(5' ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAAAAATAGCGAG AAGAAT 3'(서열번호:60))와 서열번호:59에 따른 기준(standard) 3' 프라이머와 테일(tail) PCR(상기 표준 PCR과 파라미터가 동일함)이 적용되었다. 원래의 비개질된 OBPgpLYS PCR 단편과 연장된 단편은 모두 제조사의 TA-클로닝 프로토콜에 따라 pEXP5CT/TOPO® 발현 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 연결되었다.
서열번호:7에 따른 OBPgpLYS 및 서열번호:61에 따른 PKOBPgpLYS의 재조합 발현은, 4시간의 주기 동안 37℃에서 1 mM의 IPTG(이소프로필티오갈락토시드)와의 배양 후에 지수성장 대장균 BL21(λDE3) pLysS 세포(Invitrogen)에서 수행된다. pEXP5CT/TOPO® 발현 벡터에 의해 인코딩된 상기 단백질 모두는 C-말단 6xHis-tag를 사용하여 Ni2+ 친화성 크로마토그래피(Akta FPLC, GE Healthcare)에 의해 정제되었다. Ni2+ 친화성 크로마토그래피는 4개의 일련의 단계로 수행되며, 이러한 단계 모두는 실온에서 이루어진다:
1. 유속 0.5 ml/min에서 10 컬럼 부피의 세척 완충액(60 mM 이미다졸, 0.5 mM NaCl 및 pH 7.4의 20 mM NaH2P04-NaOH)에 의한 Histrap HP 1 ml 컬럼(GE Healthcare)의 평형.
2. 유속 0.5 ml/min에서 Histrap HP 1 ml 컬럼상에 전체 용해물(원하는 엔도리신이 포함됨)의 로딩.
3. 유속 1 ml/min에서 15 컬럼 부피의 세척 완충액에 의한 컬럼의 세척.
4. 유속 0.5 ml/min에서 10 컬럼 부피의 용리 완충액(500 mM 이미다졸, 5 mM NaCl 및 pH 7.4의 20 mM NaH2P04-NaOH)에 의해 컬럼으로부터 결합된 엔도리신의 용리.
대장균 발현 배양물 리터 당 두개의 정제된 재조합 단백질의 총수율은 표 10에 나타난다. 상기 값은 파장 280 nm에서 정제된 모액(stock solution)의 총부피 및 단백질 농도의 분광광도 측정에 의해 결정되었다. 용리 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 500 mM 이미다졸)에서 각각 OBPgpLYS 및 PKOBPgpLYS로 이루어진 정제된 모액은 SDS-PAGE 겔에서 시각적으로 측정될 때 90% 이상의 순도를 나타내었다.
| 엔도리신 | 발현율 |
| OBPgpLYS(서열번호:7) | 3.3 mg |
| PKOBPgpLYS(서열번호:61) | 4.7 mg |
서열번호:61에 따른 PKOBPgpLYS 엔도리신의 항-그람음성 스펙트럼을 측정하기 위하여, 1.313 μM의 PKOBPgpLYS 엔도리신 및 0.5 mM의 EDTA의 조합이 임상의 다중 내성 P. 에루지노사 균주 Br667, 슈도모나스 푸티다 G1(파지 OBP의 숙주) 및 다른 범위의 그람음성 병원균(대장균 WK6, 살모넬라 티피무리움 LT2 및 버크홀데리아 슈도말레이)에 대해 테스트되었다(표 12 참조). 지수성장 세균 세포(OD600nm: 0.6)는 각 균주의 최종 밀도 약 106/ml로 100배 희석되었으며, 각각 0.5 mM의 EDTA와 조합하거나 조합하지 않은 비개질된 엔도리신 OBPgpLYS(서열번호:7) 및 개질된 엔도리신 PKOBPgpLYS(서열번호:61)와 실온에서 30분 동안 흔들지 않고 배양되었다. 배양을 위해, 엔도리신은 각각 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 0.5 M 이미다졸)에서 사용되었으며, 배양은 엔도리신의 최종 농도 1.313 μM에서 발생되었다. 대조군으로서 각각의 균주는 엔도리신 없이 0.5 mM의 EDTA(상기 기재된 것과 동일한 완충액)와 30분 동안 배양되었다. 배양 후에, 세포 현탁액은 3배(각각 105-104-103 세포/ml) 희석되었으며, 100 μl의 각 희석액은 LB-배지에 플레이팅되었다. 잔여 콜로니가 37℃에서 밤새 배양된 후에 카운팅되었다. 카운팅된 세포수에 기초하여, 로그 단위(=log10N0/Ni, 여기서 N0= 비처리된 세포의 수, Ni= 처리된 세포의 수, 상기 둘다 배양 후에 카운팅됨)의 상대적 불활성으로서 항균 활성이 산출되었다(표 11). 모든 샘플은 3배로 복제되었다. 평균+/-표준편차가 나타난다. 관찰되는 최대 감소는 10 세포/ml의 검출 수준 및 초기 세포 밀도에 의존한다.
| 0.5 mM EDTA | 1.313 μM OBPgpLYS | 1.313 μM PKOBPgpLYS | 1.313 μM OBPgpLYS + 0.5 mM EDTA | 1.313 μM PKOBPgpLYS + 0.5 mM EDTA | |
| P. 에루지노사 PAO1p | 0.130 +/- 0.023 | 2.531 +/- 0.173 | 3.079 +/- 0.015 | 4.357 +/- 1.857 | > 5.687 |
| P. 에루지노사 Br667 | 0.031 +/- 0.023 | 1.082 +/- 0.083 | 1.163 +/- 0.063 | 3.144 +/- 0.223 | 5.272 +/- 0.573 |
| P. 푸티다 G1 | 0.412 +/- 0.055 | 0.141 +/- 0.027 | 0.904 +/- 0.079 | 4.891 +/- 0.000 | > 4.891 |
| 버크홀데리아 슈도말레이 | 0.220 +/- 0.081 | 0.997 +/- 0.131 | 1.806 +/- 0.287 | 4.08 +/- 0.301 | > 4.861 |
| 대장균 WK6 | 0.592 +/- 0.113 | 0.681 +/- 0.032 | 1.434 +/- 0.018 | 1.179 +/- 0.200 | 1.695 +/- 0.147 |
| 살모넬라 티피무리움 | 0.054 +/- 0.048 | 0.076 +/- 0.011 | 0.127 +/- 0.013 | 0.774 +/- 0.052 | 0.908 +/- 0.037 |
| 그람음성 균주 | 소스(source) | 참조 |
| 슈도모나스 에루지노사 PAO1p | 화상 분리주(isolate), Queen Astrid 병원, Brussels | Pirnay et al., 2003* |
| 슈도모나스 에루지노사 Br667 | 화상 분리주(isolate), Queen Astrid 병원, Brussels | Pirnay et al., 2003* |
| 슈도모나스 푸티다 G1 | 토양 분리주, Moskow | Prof V.Krylov |
| 버크홀데리아 슈도말레이 | 임상 분리주(clinical isolate), UZ Gasthuisberg, Leuven | Prof J. Verhaegen |
| 대장균 WK 6 | 표준 실험실(Standard laboratory) 발현 균주 | Stratagene |
| 살모넬라 티피무리움 LT2 | SGSC N°2317 | Prof C. Michiels |
*Pirnay JP, De Vos D, Cochez C, Bilocq F, Pirson J, Struelens M, Duinslaeger L, Cornelis P, Zizi M, Vanderkelen A. (2003). Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa colonization in a burn unit: persistence of a multidrug-resistant clone and a silver sulfadiazine-resistant clone. J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202.
OBPgpLYS 처치의 전반적인 효과가 종에 의존적인 반면, 표 11의 결과는 비개질된 OBPgpLYS에 비해 PKOBPgpLYS의 부가된 효과가 0.5 mM의 EDTA의 부재 및 존재 모두에서 테스트된 모든 세균 종들에 대해 나타암을 보여준다. 슈도모나스 및 버크홀데리아 종들에 대해, EDTA와의 명백한 상승 효과가 PKOBPgpLYS 활성에 대해 관찰된다.
실시예 8: OBPgpLYS 및 PKOBPgpLYS의 항균 활성에 대한 다른 EDTA 농도의 효과
비개질 및 개질된 엔도리신의 항균 활성에 대한 EDTA의 영향을 확인하기 위하여, 다른 농도의 EDTA 및 엔도리신을 사용하여 비개질된 OBPgpLYS 엔도리신(서열번호:7) 및 PKOBPgpLYS 엔도리신(서열번호:61)의 항균 활성이 슈도모나스 에루지노사 PAO1p 세포에 대해 테스트되었다(Pirnay JP et al. J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202 (2003)). 지수성장 세균 세포(OD600nm: 0.6)는 최종 밀도 약 106/ml로 100배 희석되었으며, 비개질된 엔도리신 OBPgpLYS(서열번호:7) 및 개질된 엔도리신 PKOBPgpLYS(서열번호:61)와 실온에서 30분 동안 흔들지 않고 배양되었다. 배양을 위해, 엔도리신은 엔도리신의 최종 농도 0.013 μM, 0.131 μM 및 1.315 μM에서 각각 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 0.5 M 이미다졸)에서 사용되었다. 이에 따라, 0 mM, 0.05 mM, 0.5 mM 및 10 mM의 다른 EDTA 농도가 사용되었다. 대조군으로서, 하나의 샘플이 엔도리신 없이 30분 동안 배양되었으며, 대신 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 0.5 M 이미다졸)이 부가되었다. 배양 후에, 세포 현탁액은 3배(각각 105-104-103 세포/ml) 희석되었으며, 100 μl의 각 희석액은 LB-배지에 플레이팅되었다. 잔여 콜로니가 37℃에서 밤새 배양된 후에 카운팅되었다. 카운팅된 세포수에 기초하여, 로그 단위(=log10N0/Ni, 여기서 N0= 비처리된 세포의 수, Ni= 처리된 세포의 수)의 상대적 불활성으로서 항균 활성이 산출되었다(표 13). 모든 샘플은 3배로 복제되었다. 평균+/-표준편차가 나타난다. 관찰되는 최대 감소(5.69 로그 단위)는 10 세포/ml의 검출 수준 및 초기 세포 밀도에 의존한다. PAO1p에 대해, EDTA는 비개질된 PSP3gp10 엔도리신 및 그의 개질된 변이체 PKPSP3gp10 모두와 상승적으로 작용한다. "△"는 각각의 OBPgpLYS 및 PKOBPgpLYS 샘플 사이의 활성의 차이를 나타낸다.
| EDTA-Na 2 의 농도(mM) | ||||
| 0 | 0.05 | 0.5 | 10 | |
| 엔도리신 부재 | / | 0.028 +/- 0.008 | 0.130 +/- 0.023 | 1.827 +/- 0.052 |
| 0.013 μM OBPgpLYS | 0.956 +/- 0.110 | / | 4.626 +/- 0.287 | / |
| 0.013 μM PKOBPgpLYS | 0.992 +/- 0.181 | / | 5.204 +/- 0.000 | / |
| △ | 0.036 | 0.578 | ||
| 0.131 μM OBPgpLYS | 2.158 +/- 0.027 | / | 4.599 +/- 0.275 | / |
| 0.131 μM PKOBPgpLYS | 2.529 +/- 0.184 | / | 5.671 +/- 0.000 | / |
| △ | 0.371 | 1.072 | ||
| 1.315 μM OBPgpLYS | 2.531 +/- 0.173 | 2.762 +/- 0.091 | 4.357 +/- 1.857 | 4.888 +/- 0.275 |
| 1.315 μM PKOBPgpLYS | 3.079 +/- 0.015 | 4.145 +/- 0.015 | > 5.687 | > 5.687 |
| △ | 0.548 | 1.383 | > 1.330 | > 0.799 |
표 13에서 보여진 바와 같이, 비개질된 엔도리신 OBPgpLYS는 음성대조군에 비해 세포수를 1.315 μM에 대해서는 2.5 로그 단위 이상, 0.013 μM에 대해서는 +/- 1 로그 단위로 유의적으로 감소시킨다. 개질된 엔도리신 PKOBPgpLYS는 지수성장 PAO1p 세포에 대해 추가적 0.5 로그 단위 감소를 유발한다. 관찰된 항균 효과는 0.5 및 10 mM EDTA의 농도에서 외막 투과제(permeabilizer) EDTA-Na2와 PKOBPgpLYS를 조합함으로써 5.69 로그 단위 감소(검출 수준보다 낮음)에 따라 더 증가될 수 있다. 비개질된 OBPgpLYS와 PK-개질된 OBPgpLYS 사이의 활성의 차이는 부가되는 엔도리신의 양을 증가시킴으로써 커진다(0.013 - 1.315 μM 엔도리신).
실시예 9: 다른 그람음성균에 대한 개질된 phiKZgp144 변이체의 항균 활성
phiKZgp144의 다가양이온성 펩티드 변이체와 다른 엔도리신의 능력을 시험하고 비교하기 위하여, 단백질의 N-말단 끝에서 다른 다가양이온성 펩티드를 갖는 인코딩 유전자들이 합성되었다.
다른 산물들이 pET32b 발현 벡터(Novagen, Darmstadt, Germany)에서 클로닝되었다. pET32b는 대장균 숙주에 대한 다가양이온성 펩티드의 잠재적 독성을 감소시키기 위해 사용되었다. 벡터-인코딩된 융합 단백질(티오레독신)은 다가양이온성 펩티드를 감추며(mask), 정제 과정 동안 제거될 수 있다.
smi01(YP_001712536) 및 KRK9_smi01(서열번호:75)를 인코딩하는 유전자들이 완전히 합성되었으며(Entelechon, Regensburg, Germany), pET32b로 클로닝되었다.
이에 따라, OD600nm=0.6의 광밀도에 도달할 때까지 하기의 개질된 엔도리신 변이체들이 37℃에서 대장균 BL21(DE3) 세포에서 발현되었다: smi01(YP_001712536), KRK9_smi01(서열번호:75), phiKZgp144(서열번호:1), pKKZ144pET32b(서열번호:43) 및 POLYKZ144(서열번호:35). 단백질 발현은 1 mM의 IPTG(최종 농도)에 의해 유도되었으며, 발현은 4시간 동안 수행되었다. 이어서, 대장균 세포는 6000g에서 20분 동안 원심분리에 의해 수확되었으며, 세포 분열 및 단백질 정제는 S-tag™ rEK 정제 키트(Novagen, Darmstadt, Germany)를 이용하여 수행되었다. pET32b 벡터를 이용할 때, 발현된 단백질은 숙주에 독성이 아니었으며 제조된 단백질의 고순도를 가져왔다. 정제된 모액들은 고순도를 나타내었다.
비교를 위한 참조로서 시험하기 위하여, phiKZgp144 및 POLYgp144가 실시예 1에서 기재된 바에 따라 합성되고 정제되었다.
P. 에루지노사 PAO1p의 지수적(약 106/ml) 성장 세포(화상 분리주(Burn wound isolate), Queen Astrid 병원, Brussels; Pirnay JP et al. (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202), 아시네토박터 바우마니(DSMZ 30007) 또는 버크홀데리아 솔라나세움(Prof. C. Michiels에서 제공된 분리주)는 100배 희석되었으며(최종 밀도는 약 106/ml였음), 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 0.5 M 이미다졸)에서 100 μg/ml의 최종 농도에서 상기 기재된 각각의 10 μg의 투석되지 않은 단백질과 실온에서 배양되었다. 1시간 후에, 세포 현탁액은 1:100으로 희석되었으며, LB에 플레이팅되었다. 또한, 완충액(20 mM NaH2P04-NaOH pH 7.4; 0.5 M NaCl; 0.5 M 이미다졸)을 사용하여 음성대조군이 플레이팅되었다. 잔여 콜로니가 37℃에서 밤새 배양된 후에 카운팅되었다. 카운팅된 세포수에 기초하여, 상대적 불활성(%)(=100-(Ni/N0)*l00, 여기서 N0= 비처리된 세포의 수, Ni= 처리된 세포의 수)으로서 항균 활성이 산출되었다(표 3). 모든 샘플은 적어도 4배로 복제되었다.
| 단백질 | 세균 종 | 감소[%] |
| smi01(YP_001712536) | 아시네토박터 바우마니 DSMZ 30007 | 0 |
| KRK9_smi01 | 아시네토박터 바우마니 DSMZ 30007 | 50 |
| phiKZgp144 | 슈도모나스 에루지노사 | 0 |
| pKKZ144pET32b | 슈도모나스 에루지노사 | 99 - 99.9 |
| phiKZgp144 | 아시네토박터 바우마니 DSMZ 30007 | 0 |
| pKKZ144pET32b | 아시네토박터 바우마니 DSMZ 30007 | 99.9 |
| phiKZgp144 | 버크홀데리아 솔라나세아룸 | 0 |
| POLYKZ144 | 버크홀데리아 솔라나세아룸 | 99 - 99.9 |
비개질된 엔도리신 phiKZgp144 및 smi01(YP_001712536)은 음성대조군에 비해 세포수를 유의적으로 감소시키지 않는다. 이러한 관찰은 또한 엔도리신이 그람음성균의 세포벽을 분해하는 장벽으로서 외막의 효능을 설명한다. 표 14에서 보여지는 것처럼 대조적으로, 개질된 엔도리신 KRK9_smi01, pKKZ144pET32b 및 POLY-gp144에 의한 배양은 아시네토박터 바우마니(KRK_smi01에 대해 50%; pKKZ144pET32b에 대해 99.9%), 슈도모나스 에루지노사(pKKZ144pET32b에 대해 90-99.9%) 및 버크홀데리아 솔라나세움(POLYKZ144에 대해 90-99.9%)에 대해 세균 세포수의 유의적인 감소를 야기한다.
본 실험들은 다른 엔도리신에 대한 양이온성/다가양이온성 융합의 접근 적용가능성을 입증한다. 또한, 본 실험들은 개질된 엔도리신이 다양한 세균들에 대해 작용함을 입증하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> Katholieke Universiteit Leuven K.U. Leuven R & D
<120> Antimicrobial Agents
<130> IP20111685/DE
<150> GB 0815484.1
<151> 2008-08-26
<160> 83
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 260
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> phiKZgp144
<400> 1
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 2
<211> 292
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> ELgp188
<400> 2
Met Asn Phe Arg Thr Lys Asn Gly Tyr Arg Asp Leu Gln Ala Leu Val
1 5 10 15
Lys Glu Leu Gly Leu Tyr Thr Gly Gln Ile Asp Gly Val Trp Gly Lys
20 25 30
Gly Thr Ser Ser Ser Thr Glu Thr Leu Leu Arg Gly Tyr Ala Glu Val
35 40 45
Val Gly Lys Asn Thr Gly Gly Ile Gly Leu Pro Thr Thr Ser Asp Ala
50 55 60
Ser Gly Tyr Asn Val Ile Thr Ala Leu Gln Arg Asn Leu Ala Phe Leu
65 70 75 80
Gly Leu Tyr Ser Leu Thr Val Asp Gly Ile Trp Gly Asn Gly Thr Leu
85 90 95
Ser Gly Leu Asp Lys Ala Phe Glu Val Tyr Lys Glu Arg Tyr Arg Thr
100 105 110
Pro Thr Tyr Asp Ile Ala Trp Ser Gly Lys Val Ser Pro Ala Phe Thr
115 120 125
Ala Lys Val Lys Asp Trp Cys Gly Val His Val Pro Asn His Arg Ala
130 135 140
Pro His Trp Leu Met Ala Cys Met Ala Phe Glu Thr Gly Gln Thr Phe
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ile Lys Asn Ala Ala Gly Ser Glu Ala Tyr Gly Leu Ile
165 170 175
Gln Phe Met Ser Pro Ala Ala Asn Asp Leu Asn Val Pro Leu Ser Val
180 185 190
Ile Arg Ser Met Asp Gln Leu Thr Gln Leu Asp Leu Val Phe Lys Tyr
195 200 205
Phe Glu Met Trp Met Lys Arg Gly Lys Arg Tyr Thr Gln Leu Glu Asp
210 215 220
Phe Tyr Leu Thr Ile Phe His Pro Ala Ser Val Gly Lys Lys Ala Asp
225 230 235 240
Glu Val Leu Phe Leu Gln Gly Ser Lys Ala Tyr Leu Gln Asn Lys Gly
245 250 255
Phe Asp Val Asp Lys Asp Gly Lys Ile Thr Leu Gly Glu Ile Ser Ser
260 265 270
Thr Leu Tyr Thr Thr Tyr Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Glu Asn Arg His
275 280 285
Val Ile Ser Tyr
290
<210> 3
<211> 181
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Salmonella endolysin
<400> 3
Met Lys Pro Lys Asp Glu Ile Phe Asp Glu Ile Leu Gly Lys Glu Gly
1 5 10 15
Gly Tyr Val Asn His Pro Asp Asp Lys Gly Gly Pro Thr Lys Trp Gly
20 25 30
Ile Thr Glu Lys Val Ala Arg Ala His Gly Tyr Arg Gly Asp Met Arg
35 40 45
Asn Leu Thr Arg Gly Gln Ala Leu Glu Ile Leu Glu Thr Asp Tyr Trp
50 55 60
Tyr Gly Pro Arg Phe Asp Arg Val Ala Lys Ala Ser Pro Asp Val Ala
65 70 75 80
Ala Glu Leu Cys Asp Thr Gly Val Asn Met Gly Pro Ser Val Ala Ala
85 90 95
Lys Met Leu Gln Arg Trp Leu Asn Val Phe Asn Gln Gly Gly Arg Leu
100 105 110
Tyr Pro Asp Met Asp Thr Asp Gly Arg Ile Gly Pro Arg Thr Leu Asn
115 120 125
Ala Leu Arg Val Tyr Leu Glu Lys Arg Gly Lys Asp Gly Glu Arg Val
130 135 140
Leu Leu Val Ala Leu Asn Cys Thr Gln Gly Glu Arg Tyr Leu Glu Leu
145 150 155 160
Ala Glu Lys Arg Glu Ala Asp Glu Ser Phe Val Tyr Gly Trp Met Lys
165 170 175
Glu Arg Val Leu Ile
180
<210> 4
<211> 163
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Enterobacteria phage T4 endolysin
<400> 4
Met Asn Ile Phe Glu Met Leu Arg Ile Asp Glu Gly Leu Arg Leu Lys
1 5 10 15
Ile Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Tyr Tyr Thr Ile Gly Ile Gly His Leu
20 25 30
Leu Thr Lys Ser Pro Ser Leu Asn Ala Ala Lys Ser Glu Leu Asp Lys
35 40 45
Ala Ile Gly Arg Asn Cys Asn Gly Val Ile Thr Lys Asp Glu Ala Glu
50 55 60
Lys Leu Phe Asn Gln Asp Val Asp Ala Ala Val Arg Gly Ile Leu Arg
65 70 75 80
Asn Ala Lys Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg
85 90 95
Cys Ala Leu Ile Asn Met Val Phe Gln Met Gly Glu Thr Gly Val Ala
100 105 110
Gly Phe Thr Asn Ser Leu Arg Met Leu Gln Gln Lys Arg Trp Asp Glu
115 120 125
Ala Ala Val Asn Leu Ala Lys Ser Arg Trp Tyr Asn Gln Thr Pro Asn
130 135 140
Arg Ala Lys Arg Val Ile Thr Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala
145 150 155 160
Tyr Lys Asn
<210> 5
<211> 280
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Acinetobacter baumanii endolysin
<400> 5
Met Glu Tyr Asp Met Ile Leu Lys Phe Gly Ser Lys Gly Asp Ala Val
1 5 10 15
Ala Thr Leu Gln Lys Gln Leu Ala Lys Met Gly Tyr Lys Gly Val Lys
20 25 30
Asp Lys Pro Leu Ser Val Asp Gly His Phe Gly Glu Ser Thr Glu Phe
35 40 45
Ala Val Ile Gln Leu Gln Arg Lys Phe Gly Leu Val Ala Asp Gly Lys
50 55 60
Val Gly Asp Lys Thr Arg Gln Ala Leu Ala Gly Asp Ser Val Ser Lys
65 70 75 80
Phe Leu Lys Asp Glu Asp Tyr Lys Lys Ala Ala Ile Arg Leu Lys Val
85 90 95
Pro Glu Leu Val Ile Arg Val Phe Gly Ala Val Glu Gly Leu Gly Val
100 105 110
Gly Phe Leu Pro Asn Gly Lys Ala Lys Ile Leu Phe Glu Arg His Arg
115 120 125
Met Tyr Phe Tyr Leu Cys Gln Ala Leu Gly Lys Thr Phe Ala Asn Ser
130 135 140
Gln Val Lys Ile Thr Pro Asn Ile Val Asn Thr Leu Thr Gly Gly Tyr
145 150 155 160
Lys Gly Asp Ala Ala Glu Tyr Thr Arg Leu Ser Met Ala Ile Asn Ile
165 170 175
His Lys Glu Ser Ala Leu Met Ser Thr Ser Trp Gly Gln Phe Gln Ile
180 185 190
Met Gly Glu Asn Trp Lys Asp Leu Gly Tyr Ser Ser Val Gln Glu Phe
195 200 205
Val Asp Gln Gln Gln Leu Asn Glu Gly Asn Gln Leu Glu Ala Phe Ile
210 215 220
Arg Phe Ile Glu Trp Lys Pro Gly Leu Leu Glu Ala Leu Arg Lys Gln
225 230 235 240
Asp Trp Asp Thr Val Phe Thr Leu Tyr Asn Gly Lys Asn Tyr Lys Lys
245 250 255
Leu Gly Tyr Gln Ala Lys Phe Gln Lys Glu Trp Asp His Leu Glu Pro
260 265 270
Ile Tyr Arg Glu Lys Thr Ala Ala
275 280
<210> 6
<211> 152
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> E. coli K1F endolysin
<400> 6
Met Val Ser Lys Val Gln Phe Asn Pro Arg Ser Arg Thr Asp Ala Ile
1 5 10 15
Phe Val His Cys Ser Ala Thr Lys Pro Glu Met Asp Ile Gly Val Glu
20 25 30
Thr Ile Arg Met Trp His Lys Gln Gln Ala Trp Leu Asp Val Gly Tyr
35 40 45
His Phe Ile Ile Lys Arg Asp Gly Thr Val Glu Glu Gly Arg Pro Val
50 55 60
Asn Val Val Gly Ser His Val Lys Asp Trp Asn Ser Arg Ser Val Gly
65 70 75 80
Val Cys Leu Val Gly Gly Ile Asn Ala Lys Gly Gln Phe Glu Ala Asn
85 90 95
Phe Thr Pro Ala Gln Met Asn Ser Leu Arg Asn Lys Leu Asp Asp Leu
100 105 110
Lys Val Met Tyr Pro Gln Ala Glu Ile Arg Ala His His Asp Val Ala
115 120 125
Pro Lys Ala Cys Pro Ser Phe Asp Leu Gln Arg Trp Leu Ser Thr Asn
130 135 140
Glu Leu Val Thr Ser Asp Arg Gly
145 150
<210> 7
<211> 328
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> OBPgpLYS
<400> 7
Met Lys Asn Ser Glu Lys Asn Ala Ser Ile Ile Met Ser Ile Gln Arg
1 5 10 15
Thr Leu Ala Ser Leu Ser Leu Tyr Gly Gly Arg Ile Asp Gly Leu Phe
20 25 30
Gly Glu Lys Cys Arg Gly Ala Ile Ile Leu Met Leu Asn Lys Val Tyr
35 40 45
Pro Asn Phe Ser Thr Asn Lys Leu Pro Ser Asn Thr Tyr Glu Ala Glu
50 55 60
Ser Val Phe Thr Phe Leu Gln Thr Ala Leu Ala Gly Val Gly Leu Tyr
65 70 75 80
Thr Ile Thr Ile Asp Gly Lys Trp Gly Gly Thr Ser Gln Gly Ala Ile
85 90 95
Asp Ala Leu Val Lys Ser Tyr Arg Gln Ile Thr Glu Ala Glu Arg Ala
100 105 110
Gly Ser Thr Leu Pro Leu Gly Leu Ala Thr Val Met Ser Lys His Met
115 120 125
Ser Ile Glu Gln Leu Arg Ala Met Leu Pro Thr Asp Arg Gln Gly Tyr
130 135 140
Ala Glu Val Tyr Ile Asp Pro Leu Asn Glu Thr Met Asp Ile Phe Glu
145 150 155 160
Ile Asn Thr Pro Leu Arg Ile Ala His Phe Met Ala Gln Ile Leu His
165 170 175
Glu Thr Ala Cys Phe Lys Tyr Thr Glu Glu Leu Ala Ser Gly Lys Ala
180 185 190
Tyr Glu Gly Arg Ala Asp Leu Gly Asn Thr Arg Pro Gly Asp Gly Pro
195 200 205
Leu Phe Lys Gly Arg Gly Leu Leu Gln Ile Thr Gly Arg Leu Asn Tyr
210 215 220
Val Lys Cys Gln Val Tyr Leu Arg Glu Lys Leu Lys Asp Pro Thr Phe
225 230 235 240
Asp Ile Thr Ser Ser Val Thr Cys Ala Gln Gln Leu Ser Glu Ser Pro
245 250 255
Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ser Gly Tyr Phe Trp Arg Phe Ile Lys Pro
260 265 270
Lys Leu Asn Glu Thr Ala Asp Lys Asp Asp Ile Tyr Trp Val Ser Val
275 280 285
Tyr Val Asn Gly Tyr Ala Lys Gln Ala Asn Pro Tyr Tyr Pro Asn Arg
290 295 300
Asp Lys Glu Pro Asn His Met Lys Glu Arg Val Gln Met Leu Ala Val
305 310 315 320
Thr Lys Lys Ala Leu Gly Ile Val
325
<210> 8
<211> 165
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> PSP3gp10
<400> 8
Met Pro Val Ile Asn Thr His Gln Asn Ile Ala Ala Phe Leu Asp Met
1 5 10 15
Leu Ala Tyr Ser Glu Gly Thr Ala Asn His Pro Leu Thr Lys Asn Arg
20 25 30
Gly Tyr Asp Val Ile Val Thr Gly Phe Asp Gly Ser Pro Glu Ile Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Ser Asp His Pro Phe Ala His Gly Arg Pro Pro Lys Val
50 55 60
Phe Asn Arg Arg Gly Glu Lys Ser Thr Ala Ser Gly Arg Tyr Gln Gln
65 70 75 80
Leu Tyr Ile Phe Trp Pro His Tyr Lys Lys Gln Leu Ala Leu Pro Asp
85 90 95
Phe Ser Pro Leu Ser Gln Asp Lys Leu Ala Ile Gln Leu Ile Arg Glu
100 105 110
Arg Gly Ala Ile Asp Asp Ile Arg Ala Gly Arg Ile Glu Arg Ala Val
115 120 125
Ser Arg Cys Arg Asn Ile Trp Ala Ser Leu Pro Gly Ala Gly Tyr Gly
130 135 140
Gln Arg Glu His Ser Leu Glu Lys Leu Val Thr Val Trp Arg Thr Ala
145 150 155 160
Gly Gly Val Met Ala
165
<210> 9
<211> 165
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> P2gp09
<400> 9
Met Pro Val Ile Asn Thr His Gln Asn Ile Ala Ala Phe Leu Asp Met
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Glu Gly Thr Ala Asn His Pro Leu Thr Lys Asn Arg
20 25 30
Gly Tyr Asp Val Ile Val Thr Gly Leu Asp Gly Lys Pro Glu Ile Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Ser Asp His Pro Phe Ala His Gly Arg Pro Ala Lys Val
50 55 60
Phe Asn Arg Arg Gly Glu Lys Ser Thr Ala Ser Gly Arg Tyr Gln Gln
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Phe Trp Pro His Tyr Arg Lys Gln Leu Ala Leu Pro Asp
85 90 95
Phe Ser Pro Leu Ser Gln Asp Arg Leu Ala Ile Gln Leu Ile Arg Glu
100 105 110
Arg Gly Ala Leu Asp Asp Ile Arg Ala Gly Arg Ile Glu Arg Ala Ile
115 120 125
Ser Arg Cys Arg Asn Ile Trp Ala Ser Leu Pro Gly Ala Gly Tyr Gly
130 135 140
Gln Arg Glu His Ser Leu Glu Lys Leu Val Thr Val Trp Arg Thr Ala
145 150 155 160
Gly Gly Val Pro Ala
165
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 10
Lys Arg Lys Lys Arg Lys
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 11
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 12
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 13
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 14
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 15
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
1 5 10
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 16
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg
1 5 10
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 17
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 18
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 19
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 20
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Lys Lys Lys
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 21
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys
20
<210> 22
<211> 21
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 22
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Lys
20
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 23
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Lys
20
<210> 24
<211> 22
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 24
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser Gly Lys Arg Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Lys Arg Lys
20
<210> 25
<211> 24
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 25
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser Gly Ser Gly Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
20
<210> 26
<211> 25
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 26
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
20 25
<210> 27
<211> 31
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 27
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
20 25 30
<210> 28
<211> 38
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 28
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser Gly Ser Gly Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Gly Ser Gly Ser Gly Lys Arg Lys
20 25 30
Lys Arg Lys Lys Arg Lys
35
<210> 29
<211> 39
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 29
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg
20 25 30
Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
35
<210> 30
<211> 42
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 30
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg
20 25 30
Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
35 40
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 31
Ala Met Ser Gly
1
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> wherein Xaa is any other amino acid residue than lysine, arginine
and histidine
<400> 32
Lys Arg Xaa Lys Arg
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 33
Lys Arg Ser Lys Arg
1 5
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 34
Lys Arg Gly Ser Gly
1 5
<210> 35
<211> 271
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> POLY-gp144
<400> 35
Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Val Leu Arg
1 5 10 15
Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn
20 25 30
Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn
35 40 45
Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser
50 55 60
Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr
65 70 75 80
Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys
85 90 95
Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr
100 105 110
Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala
115 120 125
Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe
130 135 140
Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met
145 150 155 160
Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro
165 170 175
Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn
180 185 190
Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr
195 200 205
Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr
210 215 220
Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala
225 230 235 240
Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln
245 250 255
Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
260 265 270
<210> 36
<211> 282
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> (POLY)2-gp144
<400> 36
Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly
20 25 30
Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp
35 40 45
Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val
50 55 60
Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly
65 70 75 80
Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro
85 90 95
Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala
100 105 110
Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln
115 120 125
Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile
130 135 140
Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly
145 150 155 160
Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu
165 170 175
Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu
180 185 190
Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val
195 200 205
Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe
210 215 220
Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu
225 230 235 240
Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe
245 250 255
Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu
260 265 270
Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
275 280
<210> 37
<211> 293
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> (POLY)3-gp144
<400> 37
Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
20 25 30
Arg Lys Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln
35 40 45
Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp
50 55 60
Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys
65 70 75 80
Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala
85 90 95
Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro
100 105 110
Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn
115 120 125
Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe
130 135 140
Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser
145 150 155 160
Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met
165 170 175
Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly
180 185 190
Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu
195 200 205
Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro
210 215 220
Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala
225 230 235 240
Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe
245 250 255
Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly
260 265 270
Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val
275 280 285
Ala Ala His Arg Lys
290
<210> 38
<211> 304
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> (POLY)4-gp144
<400> 38
Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
20 25 30
Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Val Leu
35 40 45
Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu
50 55 60
Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn
65 70 75 80
Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp
85 90 95
Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys
100 105 110
Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn
115 120 125
Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala
130 135 140
Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser
145 150 155 160
Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp
165 170 175
Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly
180 185 190
Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp
195 200 205
Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met
210 215 220
Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu
225 230 235 240
Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr
245 250 255
Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln
260 265 270
Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile
275 280 285
Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
290 295 300
<210> 39
<211> 303
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> POLY-gp188
<400> 39
Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Asn Phe Arg Thr
1 5 10 15
Lys Asn Gly Tyr Arg Asp Leu Gln Ala Leu Val Lys Glu Leu Gly Leu
20 25 30
Tyr Thr Gly Gln Ile Asp Gly Val Trp Gly Lys Gly Thr Ser Ser Ser
35 40 45
Thr Glu Thr Leu Leu Arg Gly Tyr Ala Glu Val Val Gly Lys Asn Thr
50 55 60
Gly Gly Ile Gly Leu Pro Thr Thr Ser Asp Ala Ser Gly Tyr Asn Val
65 70 75 80
Ile Thr Ala Leu Gln Arg Asn Leu Ala Phe Leu Gly Leu Tyr Ser Leu
85 90 95
Thr Val Asp Gly Ile Trp Gly Asn Gly Thr Leu Ser Gly Leu Asp Lys
100 105 110
Ala Phe Glu Val Tyr Lys Glu Arg Tyr Arg Thr Pro Thr Tyr Asp Ile
115 120 125
Ala Trp Ser Gly Lys Val Ser Pro Ala Phe Thr Ala Lys Val Lys Asp
130 135 140
Trp Cys Gly Val His Val Pro Asn His Arg Ala Pro His Trp Leu Met
145 150 155 160
Ala Cys Met Ala Phe Glu Thr Gly Gln Thr Phe Ser Pro Ser Ile Lys
165 170 175
Asn Ala Ala Gly Ser Glu Ala Tyr Gly Leu Ile Gln Phe Met Ser Pro
180 185 190
Ala Ala Asn Asp Leu Asn Val Pro Leu Ser Val Ile Arg Ser Met Asp
195 200 205
Gln Leu Thr Gln Leu Asp Leu Val Phe Lys Tyr Phe Glu Met Trp Met
210 215 220
Lys Arg Gly Lys Arg Tyr Thr Gln Leu Glu Asp Phe Tyr Leu Thr Ile
225 230 235 240
Phe His Pro Ala Ser Val Gly Lys Lys Ala Asp Glu Val Leu Phe Leu
245 250 255
Gln Gly Ser Lys Ala Tyr Leu Gln Asn Lys Gly Phe Asp Val Asp Lys
260 265 270
Asp Gly Lys Ile Thr Leu Gly Glu Ile Ser Ser Thr Leu Tyr Thr Thr
275 280 285
Tyr Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Glu Asn Arg His Val Ile Ser Tyr
290 295 300
<210> 40
<211> 314
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> (POLY)2-gp188
<400> 40
Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Asn Phe Arg Thr Lys Asn Gly Tyr Arg
20 25 30
Asp Leu Gln Ala Leu Val Lys Glu Leu Gly Leu Tyr Thr Gly Gln Ile
35 40 45
Asp Gly Val Trp Gly Lys Gly Thr Ser Ser Ser Thr Glu Thr Leu Leu
50 55 60
Arg Gly Tyr Ala Glu Val Val Gly Lys Asn Thr Gly Gly Ile Gly Leu
65 70 75 80
Pro Thr Thr Ser Asp Ala Ser Gly Tyr Asn Val Ile Thr Ala Leu Gln
85 90 95
Arg Asn Leu Ala Phe Leu Gly Leu Tyr Ser Leu Thr Val Asp Gly Ile
100 105 110
Trp Gly Asn Gly Thr Leu Ser Gly Leu Asp Lys Ala Phe Glu Val Tyr
115 120 125
Lys Glu Arg Tyr Arg Thr Pro Thr Tyr Asp Ile Ala Trp Ser Gly Lys
130 135 140
Val Ser Pro Ala Phe Thr Ala Lys Val Lys Asp Trp Cys Gly Val His
145 150 155 160
Val Pro Asn His Arg Ala Pro His Trp Leu Met Ala Cys Met Ala Phe
165 170 175
Glu Thr Gly Gln Thr Phe Ser Pro Ser Ile Lys Asn Ala Ala Gly Ser
180 185 190
Glu Ala Tyr Gly Leu Ile Gln Phe Met Ser Pro Ala Ala Asn Asp Leu
195 200 205
Asn Val Pro Leu Ser Val Ile Arg Ser Met Asp Gln Leu Thr Gln Leu
210 215 220
Asp Leu Val Phe Lys Tyr Phe Glu Met Trp Met Lys Arg Gly Lys Arg
225 230 235 240
Tyr Thr Gln Leu Glu Asp Phe Tyr Leu Thr Ile Phe His Pro Ala Ser
245 250 255
Val Gly Lys Lys Ala Asp Glu Val Leu Phe Leu Gln Gly Ser Lys Ala
260 265 270
Tyr Leu Gln Asn Lys Gly Phe Asp Val Asp Lys Asp Gly Lys Ile Thr
275 280 285
Leu Gly Glu Ile Ser Ser Thr Leu Tyr Thr Thr Tyr Tyr Lys Gly Leu
290 295 300
Leu Pro Glu Asn Arg His Val Ile Ser Tyr
305 310
<210> 41
<211> 325
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> (POLY)3-gp188
<400> 41
Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
20 25 30
Arg Lys Asn Phe Arg Thr Lys Asn Gly Tyr Arg Asp Leu Gln Ala Leu
35 40 45
Val Lys Glu Leu Gly Leu Tyr Thr Gly Gln Ile Asp Gly Val Trp Gly
50 55 60
Lys Gly Thr Ser Ser Ser Thr Glu Thr Leu Leu Arg Gly Tyr Ala Glu
65 70 75 80
Val Val Gly Lys Asn Thr Gly Gly Ile Gly Leu Pro Thr Thr Ser Asp
85 90 95
Ala Ser Gly Tyr Asn Val Ile Thr Ala Leu Gln Arg Asn Leu Ala Phe
100 105 110
Leu Gly Leu Tyr Ser Leu Thr Val Asp Gly Ile Trp Gly Asn Gly Thr
115 120 125
Leu Ser Gly Leu Asp Lys Ala Phe Glu Val Tyr Lys Glu Arg Tyr Arg
130 135 140
Thr Pro Thr Tyr Asp Ile Ala Trp Ser Gly Lys Val Ser Pro Ala Phe
145 150 155 160
Thr Ala Lys Val Lys Asp Trp Cys Gly Val His Val Pro Asn His Arg
165 170 175
Ala Pro His Trp Leu Met Ala Cys Met Ala Phe Glu Thr Gly Gln Thr
180 185 190
Phe Ser Pro Ser Ile Lys Asn Ala Ala Gly Ser Glu Ala Tyr Gly Leu
195 200 205
Ile Gln Phe Met Ser Pro Ala Ala Asn Asp Leu Asn Val Pro Leu Ser
210 215 220
Val Ile Arg Ser Met Asp Gln Leu Thr Gln Leu Asp Leu Val Phe Lys
225 230 235 240
Tyr Phe Glu Met Trp Met Lys Arg Gly Lys Arg Tyr Thr Gln Leu Glu
245 250 255
Asp Phe Tyr Leu Thr Ile Phe His Pro Ala Ser Val Gly Lys Lys Ala
260 265 270
Asp Glu Val Leu Phe Leu Gln Gly Ser Lys Ala Tyr Leu Gln Asn Lys
275 280 285
Gly Phe Asp Val Asp Lys Asp Gly Lys Ile Thr Leu Gly Glu Ile Ser
290 295 300
Ser Thr Leu Tyr Thr Thr Tyr Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Glu Asn Arg
305 310 315 320
His Val Ile Ser Tyr
325
<210> 42
<211> 336
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> (POLY)4-gp188
<400> 42
Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
20 25 30
Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Asn Phe Arg
35 40 45
Thr Lys Asn Gly Tyr Arg Asp Leu Gln Ala Leu Val Lys Glu Leu Gly
50 55 60
Leu Tyr Thr Gly Gln Ile Asp Gly Val Trp Gly Lys Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Ser Thr Glu Thr Leu Leu Arg Gly Tyr Ala Glu Val Val Gly Lys Asn
85 90 95
Thr Gly Gly Ile Gly Leu Pro Thr Thr Ser Asp Ala Ser Gly Tyr Asn
100 105 110
Val Ile Thr Ala Leu Gln Arg Asn Leu Ala Phe Leu Gly Leu Tyr Ser
115 120 125
Leu Thr Val Asp Gly Ile Trp Gly Asn Gly Thr Leu Ser Gly Leu Asp
130 135 140
Lys Ala Phe Glu Val Tyr Lys Glu Arg Tyr Arg Thr Pro Thr Tyr Asp
145 150 155 160
Ile Ala Trp Ser Gly Lys Val Ser Pro Ala Phe Thr Ala Lys Val Lys
165 170 175
Asp Trp Cys Gly Val His Val Pro Asn His Arg Ala Pro His Trp Leu
180 185 190
Met Ala Cys Met Ala Phe Glu Thr Gly Gln Thr Phe Ser Pro Ser Ile
195 200 205
Lys Asn Ala Ala Gly Ser Glu Ala Tyr Gly Leu Ile Gln Phe Met Ser
210 215 220
Pro Ala Ala Asn Asp Leu Asn Val Pro Leu Ser Val Ile Arg Ser Met
225 230 235 240
Asp Gln Leu Thr Gln Leu Asp Leu Val Phe Lys Tyr Phe Glu Met Trp
245 250 255
Met Lys Arg Gly Lys Arg Tyr Thr Gln Leu Glu Asp Phe Tyr Leu Thr
260 265 270
Ile Phe His Pro Ala Ser Val Gly Lys Lys Ala Asp Glu Val Leu Phe
275 280 285
Leu Gln Gly Ser Lys Ala Tyr Leu Gln Asn Lys Gly Phe Asp Val Asp
290 295 300
Lys Asp Gly Lys Ile Thr Leu Gly Glu Ile Ser Ser Thr Leu Tyr Thr
305 310 315 320
Thr Tyr Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Glu Asn Arg His Val Ile Ser Tyr
325 330 335
<210> 43
<211> 272
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> pKKZ144pET32b
<400> 43
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Val Leu
1 5 10 15
Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu
20 25 30
Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn
35 40 45
Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp
50 55 60
Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys
65 70 75 80
Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn
85 90 95
Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala
100 105 110
Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser
115 120 125
Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp
130 135 140
Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly
145 150 155 160
Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp
165 170 175
Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met
180 185 190
Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu
195 200 205
Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr
210 215 220
Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln
225 230 235 240
Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile
245 250 255
Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
260 265 270
<210> 44
<211> 269
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> KRK_6_pET32b
<400> 44
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Val Leu Arg Lys Gly
1 5 10 15
Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys
20 25 30
Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe
35 40 45
Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly
50 55 60
Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro
65 70 75 80
Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg
85 90 95
Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val
100 105 110
Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp
115 120 125
Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe
130 135 140
Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr
145 150 155 160
Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile
165 170 175
Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu
180 185 190
Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala
195 200 205
His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln
210 215 220
Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro
225 230 235 240
Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val
245 250 255
Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
260 265
<210> 45
<211> 275
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> KRK_12_pET32b
<400> 45
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln
20 25 30
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
35 40 45
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
50 55 60
Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
65 70 75 80
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
85 90 95
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
100 105 110
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
115 120 125
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
130 135 140
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
145 150 155 160
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
165 170 175
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
180 185 190
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
195 200 205
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
210 215 220
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
225 230 235 240
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
245 250 255
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
260 265 270
His Arg Lys
275
<210> 46
<211> 277
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> KRK_14_pET32b
<400> 46
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln
20 25 30
Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp
35 40 45
Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys
50 55 60
Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala
65 70 75 80
Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro
85 90 95
Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn
100 105 110
Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe
115 120 125
Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser
130 135 140
Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met
145 150 155 160
Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly
165 170 175
Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu
180 185 190
Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro
195 200 205
Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala
210 215 220
Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe
225 230 235 240
Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly
245 250 255
Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val
260 265 270
Ala Ala His Arg Lys
275
<210> 47
<211> 272
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> R9_pET32b
<400> 47
Ala Met Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Val Leu
1 5 10 15
Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu
20 25 30
Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn
35 40 45
Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp
50 55 60
Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys
65 70 75 80
Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn
85 90 95
Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala
100 105 110
Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser
115 120 125
Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp
130 135 140
Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly
145 150 155 160
Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp
165 170 175
Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met
180 185 190
Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu
195 200 205
Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr
210 215 220
Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln
225 230 235 240
Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile
245 250 255
Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
260 265 270
<210> 48
<211> 271
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> K8_pET32b
<400> 48
Ala Met Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Val Leu Arg
1 5 10 15
Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn
20 25 30
Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn
35 40 45
Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser
50 55 60
Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr
65 70 75 80
Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys
85 90 95
Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr
100 105 110
Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala
115 120 125
Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe
130 135 140
Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met
145 150 155 160
Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro
165 170 175
Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn
180 185 190
Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr
195 200 205
Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr
210 215 220
Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala
225 230 235 240
Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln
245 250 255
Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
260 265 270
<210> 49
<211> 302
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> pK2KZ144_pET32b_mod3
<400> 49
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser Gly
20 25 30
Ser Gly Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Val Leu Arg Lys
35 40 45
Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu
50 55 60
Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr
65 70 75 80
Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp
85 90 95
Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser
100 105 110
Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser
115 120 125
Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly
130 135 140
Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe
145 150 155 160
Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln
165 170 175
Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys
180 185 190
Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg
195 200 205
Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile
210 215 220
Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu
225 230 235 240
Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly
245 250 255
Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn
260 265 270
Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu
275 280 285
Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
290 295 300
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer PSP3gp10 forw r
<400> 50
atgggatccc cggtcattaa tactcaccag 30
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer PSP3gp10 rev
<400> 51
tgccatcacc ccgccagccg tg 22
<210> 52
<211> 57
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer PKPSP3gp10 forw
<400> 52
atgggatcca aacgcaagaa acgtaagaaa cgcaaaccgg tcattaatac tcaccag 57
<210> 53
<211> 176
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> PKPSP3gp10
<400> 53
Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Pro Val Ile Asn
1 5 10 15
Thr His Gln Asn Ile Ala Ala Phe Leu Asp Met Leu Ala Tyr Ser Glu
20 25 30
Gly Thr Ala Asn His Pro Leu Thr Lys Asn Arg Gly Tyr Asp Val Ile
35 40 45
Val Thr Gly Phe Asp Gly Ser Pro Glu Ile Phe Thr Asp Tyr Ser Asp
50 55 60
His Pro Phe Ala His Gly Arg Pro Pro Lys Val Phe Asn Arg Arg Gly
65 70 75 80
Glu Lys Ser Thr Ala Ser Gly Arg Tyr Gln Gln Leu Tyr Ile Phe Trp
85 90 95
Pro His Tyr Lys Lys Gln Leu Ala Leu Pro Asp Phe Ser Pro Leu Ser
100 105 110
Gln Asp Lys Leu Ala Ile Gln Leu Ile Arg Glu Arg Gly Ala Ile Asp
115 120 125
Asp Ile Arg Ala Gly Arg Ile Glu Arg Ala Val Ser Arg Cys Arg Asn
130 135 140
Ile Trp Ala Ser Leu Pro Gly Ala Gly Tyr Gly Gln Arg Glu His Ser
145 150 155 160
Leu Glu Lys Leu Val Thr Val Trp Arg Thr Ala Gly Gly Val Met Ala
165 170 175
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer SP2gp09 forw
<400> 54
atgggatccc cggtaattaa cacgcatc 28
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer P2gp09 rev
<400> 55
agccggtacg ccgccagcgg tacgc 25
<210> 56
<211> 54
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer PKP2gp09 forw
<400> 56
atgggatcca aacgcaagaa acgtaagaaa cgcaaaccgg taattaacac gcat 54
<210> 57
<211> 176
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> PKP2gp09
<400> 57
Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Pro Val Ile Asn
1 5 10 15
Thr His Gln Asn Ile Ala Ala Phe Leu Asp Met Leu Ala Val Ser Glu
20 25 30
Gly Thr Ala Asn His Pro Leu Thr Lys Asn Arg Gly Tyr Asp Val Ile
35 40 45
Val Thr Gly Leu Asp Gly Lys Pro Glu Ile Phe Thr Asp Tyr Ser Asp
50 55 60
His Pro Phe Ala His Gly Arg Pro Ala Lys Val Phe Asn Arg Arg Gly
65 70 75 80
Glu Lys Ser Thr Ala Ser Gly Arg Tyr Gln Gln Leu Tyr Leu Phe Trp
85 90 95
Pro His Tyr Arg Lys Gln Leu Ala Leu Pro Asp Phe Ser Pro Leu Ser
100 105 110
Gln Asp Arg Leu Ala Ile Gln Leu Ile Arg Glu Arg Gly Ala Leu Asp
115 120 125
Asp Ile Arg Ala Gly Arg Ile Glu Arg Ala Ile Ser Arg Cys Arg Asn
130 135 140
Ile Trp Ala Ser Leu Pro Gly Ala Gly Tyr Gly Gln Arg Glu His Ser
145 150 155 160
Leu Glu Lys Leu Val Thr Val Trp Arg Thr Ala Gly Gly Val Pro Ala
165 170 175
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer OBPgpLYS forward
<400> 58
atgaaaaata gcgagaagaa t 21
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer OBPgpLYS reverse
<400> 59
aactattccg agtgctttct ttgt 24
<210> 60
<211> 54
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer PKOBPgpLYS forward
<400> 60
atgggatcca aacgcaagaa acgtaagaaa cgcaaaaaaa atagcgagaa gaat 54
<210> 61
<211> 339
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> PKOBPgpLYS
<400> 61
Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Asn Ser Glu
1 5 10 15
Lys Asn Ala Ser Ile Ile Met Ser Ile Gln Arg Thr Leu Ala Ser Leu
20 25 30
Ser Leu Tyr Gly Gly Arg Ile Asp Gly Leu Phe Gly Glu Lys Cys Arg
35 40 45
Gly Ala Ile Ile Leu Met Leu Asn Lys Val Tyr Pro Asn Phe Ser Thr
50 55 60
Asn Lys Leu Pro Ser Asn Thr Tyr Glu Ala Glu Ser Val Phe Thr Phe
65 70 75 80
Leu Gln Thr Ala Leu Ala Gly Val Gly Leu Tyr Thr Ile Thr Ile Asp
85 90 95
Gly Lys Trp Gly Gly Thr Ser Gln Gly Ala Ile Asp Ala Leu Val Lys
100 105 110
Ser Tyr Arg Gln Ile Thr Glu Ala Glu Arg Ala Gly Ser Thr Leu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Ala Thr Val Met Ser Lys His Met Ser Ile Glu Gln Leu
130 135 140
Arg Ala Met Leu Pro Thr Asp Arg Gln Gly Tyr Ala Glu Val Tyr Ile
145 150 155 160
Asp Pro Leu Asn Glu Thr Met Asp Ile Phe Glu Ile Asn Thr Pro Leu
165 170 175
Arg Ile Ala His Phe Met Ala Gln Ile Leu His Glu Thr Ala Cys Phe
180 185 190
Lys Tyr Thr Glu Glu Leu Ala Ser Gly Lys Ala Tyr Glu Gly Arg Ala
195 200 205
Asp Leu Gly Asn Thr Arg Pro Gly Asp Gly Pro Leu Phe Lys Gly Arg
210 215 220
Gly Leu Leu Gln Ile Thr Gly Arg Leu Asn Tyr Val Lys Cys Gln Val
225 230 235 240
Tyr Leu Arg Glu Lys Leu Lys Asp Pro Thr Phe Asp Ile Thr Ser Ser
245 250 255
Val Thr Cys Ala Gln Gln Leu Ser Glu Ser Pro Leu Leu Ala Ala Leu
260 265 270
Ala Ser Gly Tyr Phe Trp Arg Phe Ile Lys Pro Lys Leu Asn Glu Thr
275 280 285
Ala Asp Lys Asp Asp Ile Tyr Trp Val Ser Val Tyr Val Asn Gly Tyr
290 295 300
Ala Lys Gln Ala Asn Pro Tyr Tyr Pro Asn Arg Asp Lys Glu Pro Asn
305 310 315 320
His Met Lys Glu Arg Val Gln Met Leu Ala Val Thr Lys Lys Ala Leu
325 330 335
Gly Ile Val
<210> 62
<211> 283
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> pK2KZ144pET32b
<400> 62
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg
20 25 30
Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr
35 40 45
Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln
50 55 60
Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val
65 70 75 80
Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile
85 90 95
Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala
100 105 110
Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser
115 120 125
Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu
130 135 140
Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr
145 150 155 160
Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val
165 170 175
Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala
180 185 190
Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro
195 200 205
Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe
210 215 220
Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu
225 230 235 240
Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile
245 250 255
Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn
260 265 270
Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
275 280
<210> 63
<211> 294
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> pK3KZ144pET32b
<400> 63
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys
20 25 30
Lys Arg Lys Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys
35 40 45
Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro
50 55 60
Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln
65 70 75 80
Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp
85 90 95
Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile
100 105 110
Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met
115 120 125
Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr
130 135 140
Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr
165 170 175
Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr
180 185 190
Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu
195 200 205
Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu
210 215 220
Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala
225 230 235 240
Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His
245 250 255
Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp
260 265 270
Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys
275 280 285
Val Ala Ala His Arg Lys
290
<210> 64
<211> 305
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> pK4KZ144pET32b
<400> 64
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys
20 25 30
Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Val
35 40 45
Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu
50 55 60
Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly
65 70 75 80
Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu
85 90 95
Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser
100 105 110
Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala
115 120 125
Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn
130 135 140
Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu
145 150 155 160
Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly
165 170 175
Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr
180 185 190
Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys
195 200 205
Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn
210 215 220
Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp
225 230 235 240
Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu
245 250 255
Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala
260 265 270
Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr
275 280 285
Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg
290 295 300
Lys
305
<210> 65
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer gp188 for
<400> 65
Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Cys Gly Ala
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 66
<211> 282
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> KRK_19_pET32b
<400> 66
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly
20 25 30
Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp
35 40 45
Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val
50 55 60
Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly
65 70 75 80
Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro
85 90 95
Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala
100 105 110
Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln
115 120 125
Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile
130 135 140
Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly
145 150 155 160
Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu
165 170 175
Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu
180 185 190
Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val
195 200 205
Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe
210 215 220
Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu
225 230 235 240
Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe
245 250 255
Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu
260 265 270
Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
275 280
<210> 67
<211> 284
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> KRK_21_pET32b
<400> 67
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp
20 25 30
Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly
35 40 45
Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn
50 55 60
Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile
65 70 75 80
Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro
85 90 95
Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala
100 105 110
Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg
115 120 125
Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr
130 135 140
Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu
145 150 155 160
Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly
165 170 175
Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser
180 185 190
Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg
195 200 205
Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His
210 215 220
Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn
225 230 235 240
Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser
245 250 255
Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr
260 265 270
Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
275 280
<210> 68
<211> 288
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> KRK_25_pET32b
<400> 68
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Lys Val Leu
20 25 30
Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu
35 40 45
Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn
50 55 60
Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp
65 70 75 80
Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys
85 90 95
Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn
100 105 110
Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala
115 120 125
Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser
130 135 140
Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp
145 150 155 160
Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly
165 170 175
Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp
180 185 190
Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met
195 200 205
Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu
210 215 220
Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr
225 230 235 240
Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln
245 250 255
Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile
260 265 270
Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
275 280 285
<210> 69
<211> 302
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> KRK_39_pET32b
<400> 69
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
20 25 30
Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Val Leu Arg Lys
35 40 45
Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu
50 55 60
Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr
65 70 75 80
Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp
85 90 95
Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser
100 105 110
Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser
115 120 125
Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly
130 135 140
Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe
145 150 155 160
Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln
165 170 175
Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys
180 185 190
Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg
195 200 205
Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile
210 215 220
Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu
225 230 235 240
Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly
245 250 255
Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn
260 265 270
Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu
275 280 285
Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
290 295 300
<210> 70
<211> 282
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> K19_pET32b
<400> 70
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly
20 25 30
Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp
35 40 45
Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val
50 55 60
Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly
65 70 75 80
Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro
85 90 95
Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala
100 105 110
Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln
115 120 125
Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile
130 135 140
Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly
145 150 155 160
Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu
165 170 175
Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu
180 185 190
Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val
195 200 205
Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe
210 215 220
Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu
225 230 235 240
Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe
245 250 255
Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu
260 265 270
Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
275 280
<210> 71
<211> 279
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> K16_pET32b
<400> 71
Ala Met Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Lys Lys Lys Lys Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val
20 25 30
Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys
35 40 45
Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe
50 55 60
Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr
65 70 75 80
Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr
85 90 95
Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val
100 105 110
Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu
115 120 125
Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys
130 135 140
Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys
145 150 155 160
Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro
165 170 175
Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala
180 185 190
Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg
195 200 205
Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly
210 215 220
Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr
225 230 235 240
His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys
245 250 255
Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly
260 265 270
Lys Val Ala Ala His Arg Lys
275
<210> 72
<211> 294
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> pKKZ-144_K2_pET32b
<400> 72
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Val Leu
1 5 10 15
Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu
20 25 30
Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn
35 40 45
Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp
50 55 60
Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys
65 70 75 80
Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn
85 90 95
Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala
100 105 110
Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser
115 120 125
Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp
130 135 140
Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly
145 150 155 160
Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp
165 170 175
Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met
180 185 190
Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu
195 200 205
Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr
210 215 220
Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln
225 230 235 240
Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile
245 250 255
Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
260 265 270
Leu Glu Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys
275 280 285
Lys Arg Lys Lys Arg Lys
290
<210> 73
<211> 285
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> pK2KZ144_pET32b_mod1
<400> 73
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser
1 5 10 15
Gly Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Val Leu Arg Lys Gly
20 25 30
Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys
35 40 45
Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe
50 55 60
Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly
65 70 75 80
Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro
85 90 95
Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg
100 105 110
Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val
115 120 125
Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp
130 135 140
Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe
145 150 155 160
Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr
165 170 175
Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile
180 185 190
Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu
195 200 205
Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala
210 215 220
His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln
225 230 235 240
Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro
245 250 255
Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val
260 265 270
Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
275 280 285
<210> 74
<211> 287
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> pK2KZ144_pET32b_mod2
<400> 74
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Val Leu Arg
20 25 30
Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn
35 40 45
Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn
50 55 60
Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser
65 70 75 80
Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr
85 90 95
Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys
100 105 110
Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr
115 120 125
Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala
130 135 140
Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe
145 150 155 160
Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met
165 170 175
Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro
180 185 190
Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn
195 200 205
Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr
210 215 220
Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr
225 230 235 240
Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala
245 250 255
Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln
260 265 270
Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
275 280 285
<210> 75
<211> 292
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> smi01_KRK9
<400> 75
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Glu Tyr Asp
1 5 10 15
Met Ile Leu Lys Phe Gly Ser Lys Gly Asp Ala Val Ala Thr Leu Gln
20 25 30
Lys Gln Leu Ala Lys Met Gly Tyr Lys Gly Val Lys Asp Lys Pro Leu
35 40 45
Ser Val Asp Gly His Phe Gly Glu Ser Thr Glu Phe Ala Val Ile Gln
50 55 60
Leu Gln Arg Lys Phe Gly Leu Val Ala Asp Gly Lys Val Gly Asp Lys
65 70 75 80
Thr Arg Gln Ala Leu Ala Gly Asp Ser Val Ser Lys Phe Leu Lys Asp
85 90 95
Glu Asp Tyr Lys Lys Ala Ala Ile Arg Leu Lys Val Pro Glu Leu Val
100 105 110
Ile Arg Val Phe Gly Ala Val Glu Gly Leu Gly Val Gly Phe Leu Pro
115 120 125
Asn Gly Lys Ala Lys Ile Leu Phe Glu Arg His Arg Met Tyr Phe Tyr
130 135 140
Leu Cys Gln Ala Leu Gly Lys Thr Phe Ala Asn Ser Gln Val Lys Ile
145 150 155 160
Thr Pro Asn Ile Val Asn Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Lys Gly Asp Ala
165 170 175
Ala Glu Tyr Thr Arg Leu Ser Met Ala Ile Asn Ile His Lys Glu Ser
180 185 190
Ala Leu Met Ser Thr Ser Trp Gly Gln Phe Gln Ile Met Gly Glu Asn
195 200 205
Trp Lys Asp Leu Gly Tyr Ser Ser Val Gln Glu Phe Val Asp Gln Gln
210 215 220
Gln Leu Asn Glu Gly Asn Gln Leu Glu Ala Phe Ile Arg Phe Ile Glu
225 230 235 240
Trp Lys Pro Gly Leu Leu Glu Ala Leu Arg Lys Gln Asp Trp Asp Thr
245 250 255
Val Phe Thr Leu Tyr Asn Gly Lys Asn Tyr Lys Lys Leu Gly Tyr Gln
260 265 270
Ala Lys Phe Gln Lys Glu Trp Asp His Leu Glu Pro Ile Tyr Arg Glu
275 280 285
Lys Thr Ala Ala
290
<210> 76
<211> 176
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> smi02_KRK9
<400> 76
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Gly Asn Ile
1 5 10 15
Phe Glu Met Leu Arg Ile Asp Glu Gly Leu Arg Leu Lys Ile Tyr Lys
20 25 30
Asp Thr Glu Gly Tyr Tyr Thr Ile Gly Ile Gly His Leu Leu Thr Lys
35 40 45
Ser Pro Ser Leu Asn Ala Ala Lys Ser Glu Leu Asp Lys Ala Ile Gly
50 55 60
Arg Asn Cys Asn Gly Val Ile Thr Lys Asp Glu Ala Glu Lys Leu Phe
65 70 75 80
Asn Gln Asp Val Asp Ala Ala Val Arg Gly Ile Leu Arg Asn Ala Lys
85 90 95
Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg Cys Ala Leu
100 105 110
Ile Asn Met Val Phe Gln Met Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Phe Thr
115 120 125
Asn Ser Leu Arg Met Leu Gln Gln Lys Arg Trp Asp Glu Ala Ala Val
130 135 140
Asn Leu Ala Lys Ser Arg Trp Tyr Asn Gln Thr Pro Asn Arg Ala Lys
145 150 155 160
Arg Val Ile Thr Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala Tyr Lys Asn
165 170 175
<210> 77
<211> 164
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> smi03_KRK9
<400> 77
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Val Ser Lys
1 5 10 15
Val Gln Phe Asn Pro Arg Ser Arg Thr Asp Ala Ile Phe Val His Cys
20 25 30
Ser Ala Thr Lys Pro Glu Met Asp Ile Gly Val Glu Thr Ile Arg Met
35 40 45
Trp His Lys Gln Gln Ala Trp Leu Asp Val Gly Tyr His Phe Ile Ile
50 55 60
Lys Arg Asp Gly Thr Val Glu Glu Gly Arg Pro Val Asn Val Val Gly
65 70 75 80
Ser His Val Lys Asp Trp Asn Ser Arg Ser Val Gly Val Cys Leu Val
85 90 95
Gly Gly Ile Asn Ala Lys Gly Gln Phe Glu Ala Asn Phe Thr Pro Ala
100 105 110
Gln Met Asn Ser Leu Arg Asn Lys Leu Asp Asp Leu Lys Val Met Tyr
115 120 125
Pro Gln Ala Glu Ile Arg Ala His His Asp Val Ala Pro Lys Ala Cys
130 135 140
Pro Ser Phe Asp Leu Gln Arg Trp Leu Ser Thr Asn Glu Leu Val Thr
145 150 155 160
Ser Asp Arg Gly
<210> 78
<211> 194
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> smi04_KRK9
<400> 78
Ala Met Gly Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Gly Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Glu Ile Phe Asp Glu Ile Leu Gly Lys Glu Gly Gly Tyr Val
20 25 30
Asn His Pro Asp Asp Lys Gly Gly Pro Thr Lys Trp Gly Ile Thr Glu
35 40 45
Lys Val Ala Arg Ala His Gly Tyr Arg Gly Asp Met Arg Asn Leu Thr
50 55 60
Arg Gly Gln Ala Leu Glu Ile Leu Glu Thr Asp Tyr Trp Tyr Gly Pro
65 70 75 80
Arg Phe Asp Arg Val Ala Lys Ala Ser Pro Asp Val Ala Ala Glu Leu
85 90 95
Cys Asp Thr Gly Val Asn Met Gly Pro Ser Val Ala Ala Lys Met Leu
100 105 110
Gln Arg Trp Leu Asn Val Phe Asn Gln Gly Gly Arg Leu Tyr Pro Asp
115 120 125
Met Asp Thr Asp Gly Arg Ile Gly Pro Arg Thr Leu Asn Ala Leu Arg
130 135 140
Val Tyr Leu Glu Lys Arg Gly Lys Asp Gly Glu Arg Val Leu Leu Val
145 150 155 160
Ala Leu Asn Cys Thr Gln Gly Glu Arg Tyr Leu Glu Leu Ala Glu Lys
165 170 175
Arg Glu Ala Asp Glu Ser Phe Val Tyr Gly Trp Met Lys Glu Arg Val
180 185 190
Leu Ile
<210> 79
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer PKgp144 for
<400> 79
atgggatcca aacgcaagaa acgtaagaaa cgcaaaaaag tattacgcaa ag 52
<210> 80
<211> 51
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer PKgp188 for
<400> 80
atgggatcca aacgcaagaa acgtaagaaa cgcaaaaact tccggacgaa g 51
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer gp144 rev
<400> 81
ttttctatgt gctgcaac 18
<210> 82
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer gp144 rev
<400> 82
atacgaaata acgtgacga 19
<210> 83
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer gp144 for
<400> 83
atgaaagtat tacgcaaa 18
Claims (23)
- 지질다당류(LPS) 분열 활성을 갖는 양이온성 펩티드 스트레치(peptide stretch)가 융합된 엔도리신을 포함하는 엔도리신 변이체로서,
상기 양이온성 펩티드 스트레치가 5 내지 100개의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 펩티드 스트레치에 포함된 아미노산 잔기의 70% 이상이 아르기닌, 리신, 또는 아르기닌 및 리신이고, 아미노산 잔기의 0% 내지 30%가 세린, 글리신, 또는 세린 및 글리신인 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제1항에 있어서,
상기 펩티드 스트레치가 5 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제1항에 있어서,
상기 펩티드 스트레치가 엔도리신의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단에 융합된 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제1항에 있어서,
상기 엔도리신은 그람음성균의 세포벽을 분해하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제4항에 있어서,
상기 그람음성균은 엔테로박테리아세애, 슈도모나다세애, 네이세리아, 모락셀라, 비브리오, 에어로모나스, 브루셀라, 프란시셀라, 보르데텔라, 레지오넬라, 바르토넬라, 콕시엘라, 해모필루스, 파스퇴렐라, 만헤이미아, 악티노바실루스, 가르드네렐라, 스피로채타세애, 렙토스피라세애, 캄필로박터, 헬리코박터, 스피릴룸, 스트렙토바실러스, 박테로이다세애 및 아시네토박터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제5항에 있어서,
상기 엔테로박테리아세애는 에스케리키아, 살모넬라, 쉬겔라, 시트로박터, 에드워드시엘라, 엔테로박터, 하프니아, 클레브시엘라, 모르가넬라, 프로테우스, 프로비덴시아, 세라티아 및 예르시니아 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제5항에 있어서,
상기 슈도모나다세애는 슈도모나스, 버크홀데리아, 스테노트로포모나스, 슈와넬라, 스핀고모나스 및 코마모나스 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제5항에 있어서,
상기 스피로채타세애는 트레포네마 및 보렐리아 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제5항에 있어서,
상기 박테로이다세애는 박테로이데스, 푸소박테리움, 프레보텔라 및 포르피로모나스 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제5항에 있어서,
상기 아시네토박터는 A. 바우마니인 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제1항에 있어서,
상기 엔도리신이 서열번호:1에 따른 phiKZgp144, 서열번호:2에 따른 ELgp188, 서열번호:3에 따른 살모넬라 엔도리신, 서열번호:4에 따른 엔테로박테리아 파지 T4 엔도리신, 서열번호:5에 따른 아시네토박터 바우마니 엔도리신, 서열번호:6에 따른 대장균 파지 K1F 엔도리신, 서열번호:8에 따른 PSP3 살모넬라 엔도리신 및 서열번호:9에 따른 대장균 파지 P2 엔도리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제1항에 있어서,
상기 펩티드 스트레치가 하나 이상의 KRK 모티브(motive)를 포함하는 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제1항에 있어서,
상기 펩티드 스트레치가 서열번호:10 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제1항에 있어서,
상기 엔도리신 변이체가 서열번호:35 내지 49, 53, 57, 62 내지 64 및 66 내지 78로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제1항에 따른 엔도리신 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
- 제15항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
- 제15항에 따른 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제17항에 따른 숙주 세포에서 엔도리신 변이체의 발현을 포함하는, 제1항에 따른 엔도리신 변이체의 제조방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
약제, 진단 수단, 살균제 또는 화장용 물질로 사용하기 위한 엔도리신 변이체. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
그람음성균 감염의 치료용 약제로 사용하기 위한 엔도리신 변이체. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
식품, 식품 가공 장비, 식품 가공 공장, 식품과 접촉하는 표면, 의료 장비, 병원 및 수술실의 표면의 그람음성균 오염의 제거, 감소 또는 예방을 위한 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
의약, 식품 또는 사료의 진단 수단, 또는 환경 진단으로서 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 엔도리신 변이체. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 엔도리신 변이체를 포함하는 그람음성균 감염의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0815484.1A GB0815484D0 (en) | 2008-08-26 | 2008-08-26 | Antibacterial agents |
| GB0815484.1 | 2008-08-26 | ||
| PCT/EP2009/060947 WO2010023207A2 (en) | 2008-08-26 | 2009-08-25 | Antimicrobial agents |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20110049883A KR20110049883A (ko) | 2011-05-12 |
| KR101473271B1 true KR101473271B1 (ko) | 2014-12-16 |
Family
ID=39846783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020117006983A KR101473271B1 (ko) | 2008-08-26 | 2009-08-25 | 항균제 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9809808B2 (ko) |
| EP (1) | EP2331687B1 (ko) |
| JP (2) | JP5153943B2 (ko) |
| KR (1) | KR101473271B1 (ko) |
| CN (1) | CN102197132B (ko) |
| AU (1) | AU2009286760B2 (ko) |
| BR (1) | BRPI0917508A2 (ko) |
| CA (1) | CA2735077C (ko) |
| DK (1) | DK2331687T3 (ko) |
| EA (1) | EA024794B1 (ko) |
| ES (1) | ES2395357T3 (ko) |
| GB (1) | GB0815484D0 (ko) |
| HK (1) | HK1157818A1 (ko) |
| IL (1) | IL211441A (ko) |
| MX (1) | MX2011001957A (ko) |
| PL (1) | PL2331687T3 (ko) |
| WO (1) | WO2010023207A2 (ko) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0815484D0 (en) | 2008-08-26 | 2008-10-01 | Univ Leuven Kath | Antibacterial agents |
| MX2011013288A (es) | 2009-06-26 | 2012-02-28 | Univ Leuven Kath | Agentes antimicrobianos. |
| SG177704A1 (en) * | 2009-06-26 | 2012-02-28 | Lysando Holding Ag | Antimicrobial agents |
| US8846865B2 (en) * | 2009-08-24 | 2014-09-30 | Lysando Ag | Endolysin OBPgpLYS |
| JP2013532955A (ja) * | 2010-04-27 | 2013-08-22 | リサンド アクチェンゲゼルシャフト | バイオフィルムの低減方法 |
| PL3789031T3 (pl) | 2010-09-17 | 2024-01-15 | Technophage, Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia, Sa | Antybakteryjny fag, peptydy fagowe i sposoby ich zastosowania |
| GB201018518D0 (en) | 2010-11-03 | 2010-12-15 | Univ Leuven Kath | Novel endolysin |
| EP2468856A1 (en) * | 2010-12-23 | 2012-06-27 | Lysando Aktiengesellschaft | Antimicrobial Agents |
| EP3252155A1 (en) * | 2011-04-21 | 2017-12-06 | The Rockefeller University | Streptococcus bacteriophage lysins for detection and treatment of gram positive bacteria |
| EP2993181A1 (en) * | 2011-04-27 | 2016-03-09 | Lysando AG | New antimicrobial agents |
| US9068204B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-06-30 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Peptidoglycan hydrolase antimicrobials for eradicating lactobacilli that contaminate and reduce ethanol yields in biofuel fermentation |
| WO2015070911A1 (en) | 2013-11-14 | 2015-05-21 | Lysando Ag | Modified kz144 endolysin sequence |
| WO2015070912A1 (en) | 2013-11-14 | 2015-05-21 | Lysando Ag | Modified el188 endolysin sequence |
| EP3105322B1 (en) | 2014-02-14 | 2018-12-12 | Lysando AG | Antimicrobial agents |
| EP3129044B1 (en) * | 2014-04-08 | 2022-09-07 | Lysando AG | Peptidoglycan hydrolase for use in the treatment of chronic bacterial infections |
| CN106659748B (zh) * | 2014-06-26 | 2021-08-31 | 洛克菲勒大学 | 不动杆菌属溶素 |
| CN104762285B (zh) * | 2015-04-23 | 2017-10-27 | 武汉菲吉乐科生物科技有限公司 | 一种自内裂解大肠杆菌的裂解酶及其应用 |
| KR102503567B1 (ko) * | 2016-12-16 | 2023-02-24 | 유니베르시다데 도 미노 | 신규한 엔돌리신 |
| CA3059019A1 (en) * | 2017-04-03 | 2018-10-11 | Sasinapas Co., Ltd. | Engineered gram-negative endolysins |
| IL303122A (en) * | 2017-12-12 | 2023-07-01 | Contrafect Corp | Identification of lysines and their derivatives with antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa |
| EP3802814A1 (en) | 2018-05-30 | 2021-04-14 | Lysando AG | Novel antimicrobial proteins |
| JP7515409B2 (ja) | 2018-05-30 | 2024-07-12 | ライサンド アーゲー | 新規抗微生物融合タンパク質 |
| MA55951A (fr) * | 2019-05-08 | 2022-03-23 | Biontech R&D Austria Gmbh | Nouveau gardnerella endolysins et utilisations correspondantes |
| WO2023225518A2 (en) * | 2022-05-16 | 2023-11-23 | The Broad Institute, Inc. | Engineered pnma proteins and delivery systems thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0510907A2 (en) | 1991-04-20 | 1992-10-28 | Agricultural And Food Research Council | Bacteriophage lysins and their applications in destroying and testing for bacteria |
| US20020127220A1 (en) | 1997-10-31 | 2002-09-12 | Vincent Fiochetti | Use of bacterial phage associated lysing enzymes for treating streptococcal infections of the upper respiratory tract- |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989000194A1 (en) | 1987-07-06 | 1989-01-12 | Louisiana State University Agricultural And Mechan | Inhibition of eucaryotic pathogens and neoplasms and stimulation of fibroblasts and lymphocytes with lytic peptides |
| EP0656952B1 (en) | 1992-08-21 | 2003-03-05 | The University Of British Columbia | Cationic peptides and method for production |
| AU3341995A (en) | 1994-09-01 | 1996-03-22 | Novo Nordisk A/S | A basic protein composition for killing or inhibiting microbial cells |
| US6503881B2 (en) * | 1996-08-21 | 2003-01-07 | Micrologix Biotech Inc. | Compositions and methods for treating infections using cationic peptides alone or in combination with antibiotics |
| US5997862A (en) * | 1997-10-31 | 1999-12-07 | New Horizons Diagnostics Corporation | Therapeutic treatment of group A streptococcal infections |
| US6288212B1 (en) | 1998-08-28 | 2001-09-11 | The University Of British Columbia | Anti-endotoxic, antimicrobial cationic peptides and methods of use therefor |
| US5993809A (en) | 1998-11-18 | 1999-11-30 | Children's Hospital Medical Center | Lysozyme fusion proteins in infections |
| EP1194570A1 (en) | 1999-06-23 | 2002-04-10 | PPL Therapeutics (Scotland) Limited | Fusion proteins incorporating lysozyme |
| DE60329382D1 (de) | 2002-04-22 | 2009-11-05 | Dow Global Technologies Inc | Kostengünstige herstellung von peptiden |
| US7566447B2 (en) | 2003-05-15 | 2009-07-28 | Iogenetics, Llc | Biocides |
| AU2004270815B2 (en) | 2003-09-11 | 2011-06-02 | Novozymes Adenium Biotech A/S | Recombinant production of antimicrobial agents |
| WO2005108563A2 (en) | 2004-04-19 | 2005-11-17 | University Of Chicago | Peptidoglycan-hydrolyzing protein encoded by bacteriophage n4 |
| US7572602B1 (en) | 2004-12-03 | 2009-08-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Nucleic acid encoding endolysin fusion protein |
| DE102005040347A1 (de) | 2005-08-25 | 2007-03-01 | Profos Ag | Verfahren und Mittel zur Anreicherung, Entfernung und zum Nachweis von Listerien |
| DE602007007069D1 (de) | 2006-03-31 | 2010-07-22 | Univ St Andrews | Antimikrobielle zusammensetzungen mit einem kationischen peptid und glycylglycin-endopeptidase |
| DE102006061002A1 (de) | 2006-12-22 | 2008-06-26 | Profos Ag | Verfahren und Mittel zur Anreicherung, Entfernung und zum Nachweis von gram-positiven Bakterien |
| CL2008002859A1 (es) | 2007-09-25 | 2009-03-06 | Pastoral Greenhouse Gas Res Limited | Péptido señal con actividad de permeabilización de células microbianas; vector; célula huésped; molécula conjugada que lo comprende; y método para permeabilizar una célula microbiana. |
| CA2706600A1 (en) | 2007-11-26 | 2009-06-04 | Plant Bioscience Limited | Novel polypeptides having endolysin activity and uses thereof |
| AU2009273845B2 (en) | 2008-07-24 | 2016-02-04 | The United State Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Triple acting antimicrobials that are refractory to resistance development |
| EP2157100A1 (en) | 2008-08-19 | 2010-02-24 | Profos AG | Artificial peptidoglycan lysing enzymes and peptidoglycan binding proteins |
| GB0815484D0 (en) | 2008-08-26 | 2008-10-01 | Univ Leuven Kath | Antibacterial agents |
| WO2010091294A2 (en) | 2009-02-05 | 2010-08-12 | The Regents Of The University Of California | New targeted antimicrobial moieties |
| MX2011013288A (es) | 2009-06-26 | 2012-02-28 | Univ Leuven Kath | Agentes antimicrobianos. |
| US8846865B2 (en) | 2009-08-24 | 2014-09-30 | Lysando Ag | Endolysin OBPgpLYS |
| JP2013532955A (ja) | 2010-04-27 | 2013-08-22 | リサンド アクチェンゲゼルシャフト | バイオフィルムの低減方法 |
-
2008
- 2008-08-26 GB GBGB0815484.1A patent/GB0815484D0/en not_active Ceased
-
2009
- 2009-08-25 CN CN200980142373.XA patent/CN102197132B/zh active Active
- 2009-08-25 AU AU2009286760A patent/AU2009286760B2/en active Active
- 2009-08-25 US US13/061,053 patent/US9809808B2/en active Active
- 2009-08-25 EA EA201100312A patent/EA024794B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2009-08-25 JP JP2011524360A patent/JP5153943B2/ja active Active
- 2009-08-25 CA CA2735077A patent/CA2735077C/en active Active
- 2009-08-25 BR BRPI0917508-3A patent/BRPI0917508A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2009-08-25 PL PL09782176T patent/PL2331687T3/pl unknown
- 2009-08-25 ES ES09782176T patent/ES2395357T3/es active Active
- 2009-08-25 DK DK09782176.3T patent/DK2331687T3/da active
- 2009-08-25 WO PCT/EP2009/060947 patent/WO2010023207A2/en active Application Filing
- 2009-08-25 MX MX2011001957A patent/MX2011001957A/es active IP Right Grant
- 2009-08-25 EP EP09782176A patent/EP2331687B1/en active Active
- 2009-08-25 KR KR1020117006983A patent/KR101473271B1/ko active IP Right Grant
-
2011
- 2011-02-27 IL IL211441A patent/IL211441A/en active IP Right Grant
- 2011-11-14 HK HK11112268.7A patent/HK1157818A1/xx unknown
-
2012
- 2012-12-04 JP JP2012265070A patent/JP5571757B2/ja active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0510907A2 (en) | 1991-04-20 | 1992-10-28 | Agricultural And Food Research Council | Bacteriophage lysins and their applications in destroying and testing for bacteria |
| US20020127220A1 (en) | 1997-10-31 | 2002-09-12 | Vincent Fiochetti | Use of bacterial phage associated lysing enzymes for treating streptococcal infections of the upper respiratory tract- |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20110243915A1 (en) | 2011-10-06 |
| CA2735077C (en) | 2019-04-09 |
| WO2010023207A2 (en) | 2010-03-04 |
| EA201100312A1 (ru) | 2011-10-31 |
| AU2009286760A1 (en) | 2010-03-04 |
| US9809808B2 (en) | 2017-11-07 |
| ES2395357T3 (es) | 2013-02-12 |
| EP2331687B1 (en) | 2012-09-19 |
| JP5571757B2 (ja) | 2014-08-13 |
| CN102197132B (zh) | 2016-01-13 |
| CN102197132A (zh) | 2011-09-21 |
| GB0815484D0 (en) | 2008-10-01 |
| CA2735077A1 (en) | 2010-03-04 |
| EA024794B1 (ru) | 2016-10-31 |
| DK2331687T3 (da) | 2013-01-07 |
| HK1157818A1 (en) | 2012-07-06 |
| BRPI0917508A2 (pt) | 2015-08-04 |
| KR20110049883A (ko) | 2011-05-12 |
| AU2009286760B2 (en) | 2015-08-27 |
| EP2331687A2 (en) | 2011-06-15 |
| IL211441A (en) | 2015-04-30 |
| MX2011001957A (es) | 2011-06-20 |
| WO2010023207A3 (en) | 2010-07-15 |
| JP2013081465A (ja) | 2013-05-09 |
| PL2331687T3 (pl) | 2013-02-28 |
| JP5153943B2 (ja) | 2013-02-27 |
| JP2012500642A (ja) | 2012-01-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101473271B1 (ko) | 항균제 | |
| AU2018201931B2 (en) | Antimicrobial Agents | |
| DK2563916T3 (en) | METHOD FOR REDUCING biofilms | |
| JP6034188B2 (ja) | 抗微生物剤 | |
| JP5847081B2 (ja) | エンドリシンＯＢＰｇｐＬＹＳ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171205 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20191202 Year of fee payment: 6 |