EA024794B1 - Вариант эндолизина со встроенным катионным пептидом с активностью, разрушающей липополисахарид - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к варианту эндолизина, в который встроен катионный пептид с активностью, разрушающей липополисахарид (ЛПС), а также к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант эндолизина, вектору, содержащему молекулу данной нуклеиновой кислоты, и клетке-хозяину, содержащей либо молекулу упомянутой нуклеиновой кислоты, либо упомянутый вектор. Кроме того, заявленное изобретение относится к способу получения упомянутого варианта эндолизина, к применению вышеупомянутого варианта эндолизина в качестве лекарственного препарата для лечения и/или профилактики дисфункций, заболеваний или симптоматики, ассоциируемых с заражением патогенными грамотрицательными бактериями. Наконец, заявленное изобретение относится к фармацевтической композиции с улучшенной антимикробной активностью в отношении грамотрицательных бактерий, содержащей вариант эндолизина.

Description

Изобретение относится к модифицированным вариантам эндолизина с улучшенной антимикробной активностью в отношении грамотрицательных бактерий. Упомянутые модифицированные варианты эндолизина включают эндолизин и катионный пептид, слитый с эндолизином для повышения катионности данного эндолизина. Настоящее изобретение также относится к микроорганизму, трансформированному с использованием нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный вариант эндолизина с улучшенной катионностью. Кроме того, изобретение относится к способу получения варианта эндолизина с использованием микроорганизма, трансформированного с применением нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, и используемого в качестве продуцирующего организма.

В частности, данное изобретение относится к вариантам эндолизина, содержащим эндолизин, с которым слита пептидная цепочка, обладающая активностью, разрушающей мембрану или липополисахарид (ЛПС).

Более того, заявленное изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим упомянутый модифицированный вариант эндолизина, векторам, содержащим молекулы данной нуклеиновой кислоты, и клеткам-хозяинам, содержащим либо молекулы упомянутой нуклеиновой кислоты, либо упомянутые векторы. Кроме того, заявленное изобретение относится к способу получения упомянутого варианта эндолизина, более того - к применению вышеупомянутого варианта эндолизина в качестве лекарственного препарата, в частности, для лечения или профилактики инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, в качестве средства диагностики, дезинфектанта или ингредиента косметических средств. Заявленное изобретение также относится к устранению, уменьшению или предотвращению заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, загрязнению оборудования на предприятиях пищевой отрасли, различных поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, изделий медицинского назначения, рабочих поверхностей в больницах и хирургических блоках. Более того, заявленное изобретение относится к применению вышеупомянутого варианта эндолизина в качестве диагностического средства в медицинской, пищевой отраслях промышленности и охране окружающей среды. Наконец, заявленное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей упомянутый модифицированный вариант эндолизина.

Эндолизины представляют собой пептидогликангидролазы, кодируемые бактериофагами (или бактериальными вирусами). Они синтезируются во время экспрессии поздних генов в литическом цикле мультипликации фагов и опосредуют высвобождение прогенных вирионов из инфицированных клеток путем разрушения бактериального пептидогликана. Они являются либо в(1,4)-гликолазами (лизосимами), трансгликолазами, амидазами или эндопептидазами. Антимикробное применение эндолизинов было предложено Гассоном еще в 1991 г. (патент ОВ2243611). Несмотря на то что антимикробная функция эндолизинов была предметом изучения в течение достаточно длительного периода, применению этих эндолизинов в качестве антибактериальных агентов не уделялось должного внимания вследствие доминировавшего господства антибиотиков. И только после открытия мультирезистентных к антибиотикам бактерий, великолепный в своей простоте принцип применения эндолизинов для борьбы с патогенными организмами, поражающими человека, получил заслуженное признание. Насущной проблемой стала задача разработки абсолютно новых классов антибактериальных агентов, и эндолизины, используемые в качестве энзибиотиков (термин - сочетание энзимов с антибиотиками), явились превосходным решением данной проблемы. В 2001 г. Фискетти и соавторы продемонстрировали в первый раз терапевтический потенциал эндолизина-бактериофага С1 в отношении стрептококков (81гср1ососс1) группы А (№1коп е1 а1., 2001). С тех пор множество публикаций утвердили эндолизины в качестве эффективного и дополнительного замещающего средства для борьбы с бактериальными инфекциями, в частности, вызванными грамположительными бактериями. В последующем, различные эндолизины, эффективные в отношении других грамположительных патогенных организмов, таких как стрептококк пневмонии (§1гер1ососсик рпеитоша) (БоеГПег е1 а1., 2001), возбудитель сибирской язвы (ВасШик апШгашк) (8с1шсН е1 а1., 2002), 8. ада1асйае (Сйепд е1 а1., 2005) и золотистый стафилококк (81арНу1ососсик аигеик) (Какйе1 е1 а1., 2007), подтвердили свою полезность в качестве энзибиотиков. В настоящее время самой насущной проблемой лечения с применением эндолизинов является нечувствительность грамотрицательных бактерий к экзогенному действию эндолизинов, поскольку внешняя мембрана препятствует проникновению эндолизинов из пептидогликана. Данное обстоятельство препятствует расширению сферы эффективного применения эндолизинов в отношении злостных грамотрицательных патогенов.

Грамотрицательные бактерии имеют внешнюю мембрану с характерным асимметричным двойным слоем, выступающим как барьер. Двойной слой внешней мембраны состоит из внутреннего одностороннего слоя, содержащего фосфолипиды (преимущественно, фосфатидил этаноламин), и наружного одностороннего слоя, содержащего преимущественно единичный гликолипид, липополисахарид (ЛПС). Существует множество вариантов структур ЛПС в мире бактерий и строение ЛПС может изменяться в ответ на воздействие условий окружающей среды. Стабильность слоя ЛПС и взаимодействие между различными молекулами ЛПС, по существу, достигаются за счет электростатического взаимодействия бивалентных ионов (Мд²'. Са²') с анионными элементами молекулы ЛПС (фосфатные группы липида А, внутреннее ядро и карбоксильные группы кетодезоксиоктоната (КДО)). В связи с этим, катион- 1 024794 связывающие участки играют очень важную роль в целостности внешней мембраны (Уаага 1992). Поликатионные агенты, такие как поли-Ь-лизин полимеры (с как минимум 20 остатками) повышают проницаемость внешней мембраны путем замещения данных стабилизирующих бивалентных катионов. Кроме того, они запускают механизм так называемой самореализуемого поглощения (Напсоск аиб \Уопд. 1984). Вследствие своей громоздкости, они нарушают нормальную барьерную функцию внешней мембраны и создают промежуточные трещины, тем самым способствуя собственному поглощению (Уаага аиб Уаага, 1983). Более того, плотная и упорядоченная упаковка гидрофобной составляющей липида А, возникновению которой способствует отсутствие ненасыщенных жирных кислот, формирует жесткую структуру с высокой вязкостью, что делает его менее проницаемым для липофильных молекул и придает дополнительную устойчивость внешней мембране (ВМ).

Все чаще, однако, микробная устойчивость к антибиотикам создает трудности в лечении все большего числа инфекций, вызванных бактериями, в особенности, такими как грамотрицательные бактерии, например синегнойная палочка и энтеробактерии.

Таким образом, существует явная потребность в новых антимикробных агентах, эффективных в отношении грамотрицательных бактерий.

Данная цель достигается практической реализацией предмета изобретения, описанного в формуле изобретения.

Следующие фигуры иллюстрируют заявленное изобретение.

Фиг. 1 представляет схематическое описание, показывающее плазмидную структуру рекомбинантного воспроизведения (РОЬ¥)^и-др144 ((ΡΟΤΥ)^η-ΚΖ144). Предварительно, рЕХР5СТ/РОЬ¥-др144 (ρΕΧΡ5ΟΤ/ΡΘΕΥ-ΚΖ144) построили при помощи хвоста ПЦР (с сайтом рестрикции ВатН1 и первой поликатионной кассетой в 5' хвостовом праймере). Плазмид линеаризовали с использованием ВатН1, дефосфорилировали и лигандировали с использованием кассеты, содержащей выступающие концы ВатН1. Данная кассета получена при помощи гибридизации двух комплементарных олигонуклеотидов и кодирует 9 положительно заряженных остатков. Один положительно заряженный остаток аргинина присутствует в сайте соединения между первой и второй кассетами, вместе с серином. Аналогичным образом, путем повторения цикла построили более длинные рЕХР5СТ/(РОЬ¥)^и-др144 (ρΕΧΡ5ΟΤ/(ΡΟΕΥ)^η-ΚΖ144) варианты.

Фиг. 2 представляет экспрессию и секрецию РОЬ¥-др144 в РюЫа раЧопу 30 мкл супернатанта экспрессионной культуры Р. ра81ог18 Х33 [после 1 дня (квадрат), 3 дней (треугольник) и 4 дней (окружность)] добавили к 270 мкл хлороформ-пермеабилизированным клеткам Р. аегидшока РАО1р. В качестве буфера были приняты оптимальные энзиматические условия РОЬ¥-др144 (КН₂РО₄/К₂НРО₄) I = 120 мМ (рН 6,2). Далее, методом спектрофотометрии измерили оптическую плотность. Уменьшение показателей оптической плотности указывает на секрецию муралитического энзима Р. ра81ог18. В качестве отрицательного контроля включили Р. ра81ог18 Х33 без экспрессионного плазмида (алмаз).

Фиг. 3 представляет графическое изображение антибактериальной активности немодифицированных эндолизинов рЫК2др144 и ЕЬдр188, модифицированных вариантов РОЬ¥-др144 и РОЬ¥-др188, состоящих из пептидной цепочки, содержащей 9 положительно заряженных аминокислотных остатков и модифицированных вариантов (РОЬ¥)²-др144 и (РОЬ¥)²-др188, состоящих из пептидной цепочки, содержащей 18 положительно заряженных аминокислотных остатков, в отношении клеток Ркеиботоиак аегидшока РАО1р. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения средних значений.

Фиг. 4 представляет изображение кумасси-помеченных 8Э8-РАСЕ (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) с результатами экспрессии и очистки немодифицированного эндолизина Р8Р3др10 и его модифицированного варианта эндолизина РКР8Р3др10. Дорожка ЬМ^ относится к размерному маркеру (ЬМ^ лесенка). Следующие три дорожки относятся к протеиновым фракциям очищенного белка в элюирующем буфере (20 мМ ЫаН₂РО₄-НаОН рН 7,4; 0,5 М ЫаС1; 500 мМ имидазола) после Νί²⁺ аффинной хроматографии. Дорожка РТ относится к поперечному потоку, а дорожка - к побочным фракциям. На изображении очищенных протеиновых фракций видны единичные вторичные бэнды, что указывает на высокую чистоту рекомбинантных протеинов (>90%).

Фиг. 5А-5Г представляет графическое изображение антибактериальной активности немодифицированного Р8Р3др10 и модифицированного РКР8Р3др10 в различных сочетаниях в отношении некоторых экспоненциально растущих грамотрицательных бактерий после инкубации при комнатной температуре и без встряхивания. Каждый вид грамотрицательных бактерий подвергли инкубации в течение 30 мин с составом, содержащим 0,5 мМ ЭДТК, но без эндолизина, с составом, содержащим 1,315 мкМ немодифицированного Р8Р3др10, но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ модифицированного РКР8Р3др10, но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ ^модифицированного Р8Р3др10 и 0,5 мМ ЭДТК и с составом, содержащим 1,315 мкМ модифицированного РКР8Р3др10 и 0,5 мМ ЭДТК. На фиг. 5А представлена антибактериальная активность в отношении клеток Р. аегидшока РА01р, на фиг. 5Б - антибактериальная активность в отношении клеток Р. аегидшока Вг667, на фиг. 5В - антибактериальная активность в отношении клеток Е.сой \УК 6 и на фиг. 5Г - антибактериальная активность в отношении клеток 8а1тоие11а 1урЫтигшт. А показывает разницу в активности между соответственно образцами Р8Р3др10 и РКР8Р3др10. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения сред- 2 024794 них значений.

Фиг. 6 представляет изображение кумасси-помеченных δΌδ-РАОЕ (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) с результатами экспрессии и очистки немодифицированного эндолизина Р2др09 и его модифицированного варианта эндолизина РКР2др09. Дорожка ЬМ№ относится к размерному маркеру (ЬМ№ лесенка). Следующие три дорожки относятся к протеиновым фракциям очищенного белка в элюирующем буфере (20 мМ №Н₂РО₄-№ЮН рН 7,4; 0,5 М ЫаС1; 500 мМ имидазола) после Νί²⁺ аффинной хроматографии. Дорожка РТ относится к поперечному потоку, а дорожка № - к побочным фракциям. На изображении очищенных протеиновых фракций видны единичные вторичные бэнды, что указывает на высокую чистоту рекомбинантных протеинов (>95%).

Фиг. 7А-7Е представляет графическое изображение антибактериальной активности немодифицированного Р2др09 и модифицированного РКР2др09 в различных сочетаниях в отношении некоторых экспоненциально растущих грамотрицательных бактерий после инкубации при комнатной температуре и без встряхивания. Каждый вид грамотрицательных бактерий подвергли инкубации в течение 30 мин с составом, содержащим 0,5 мМ ЭДТК, но без эндолизина, с составом, содержащим 1,315 мкМ немодифицированного Р2др09, но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ модифицированного РКР2др09, но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ немодифицированного Р2др09 и 0,5 мМ ЭДТК и с составом, содержащим 1,315 мкМ модифицированного РКР2др09 и 0,5 мМ ЭДТК. На фиг. 7А представлена антибактериальная активность в отношении клеток Р. аегидтоза РАО1р, на фиг. 7Б - антибактериальная активность в отношении клеток Р. аегидтоза Вг667, на фиг. 7В - антибактериальная активность в отношении клеток Е.сок №К 6, на фиг. 7Г - антибактериальная активность в отношении клеток ВшкНоИепа рзеиботаПек на фиг. 7Д - антибактериальная активность в отношении клеток Рзеийотоиаз риййа 01 и на фиг. 7Е - антибактериальная активность в отношении клеток 8а1тоие11а 1урЫтигшт ЬТ2 (8О8С № 2317). Δ показывает разницу в активности между соответственно образцами Р2др09 и РКР2др09. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения средних значений.

Фиг. 8 представляет изображение кумасси-помеченных δΌδ-РАОЕ (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) с результатами экспрессии и очистки немодифицированного эндолизина ОВРдрБ-Υδ и его модифицированного варианта эндолизина ΡКΟВΡдр^Υδ. Дорожка ЬМ№ относится к размерному маркеру (ЬМ№ лесенка). Следующие три дорожки относятся к протеиновым фракциям очищенного белка в элюирующем буфере (20 мМ NаН₂ΡΟ₄-NаΟН рН 7,4; 0,5 М №С1; 500 мМ имидазола) после Νί²⁺ аффинной хроматографии. Дорожка РТ относится к поперечному потоку, а дорожка № - к побочным фракциям. На изображении очищенных протеиновых фракций видны единичные вторичные бэнды, что указывает на высокую чистоту рекомбинантных протеинов (>90%).

Фиг. 9А-9Е представляет графическое изображение антибактериальной активности немодифицированного ОВРдрБ-Υδ и модифицированного РКОВРдрБ-Υδ в различных сочетаниях в отношении некоторых экспоненциально растущих грамотрицательных бактерий после инкубации при комнатной температуре и без встряхивания. Каждый вид грамотрицательных бактерий подвергли инкубации в течение 30 мин с составом, содержащим 0,5 мМ ЭДТК, но без эндолизина, с составом, содержащим 1,315 мкМ немодифицированного ОВРдрк-Υδ. но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ модифицированного ΡКΟВΡдр^Υδ, но без ЭДТК, с составом, содержащим 1,315 мкМ немодифицированного ОВРдрБ-Υδ и 0,5 мМ ЭДТК и с составом, содержащим 1,315 мкМ модифицированного РКОВРдрБ-Υδ и 0,5 мМ ЭДТК. На фиг. 9А представлена антибактериальная активность в отношении клеток ЕзсйейсЫа сой №К6, на фиг. 9Б - антибактериальная активность в отношении клеток δа1тоηе11а 1урЫтийит ЬТ2 (δ0δС № 2317), на фиг. 9В - антибактериальная активность в отношении клеток Рзеийотоиаз аегидтоза РАО1р, на фиг. 9Г антибактериальная активность в отношении клеток Рзеийотоиаз аегидтоза Вг667, на фиг. 9Д - антибактериальная активность в отношении клеток Рзеийотоиаз риййа 01 и на фиг. 9Е - антибактериальная активность в отношении клеток ВшкйоШейа рзеиботаПек Δ показывает разницу в активности между соответственно образцами ОВРдрк-Υδ и РКОВРдрБ-Υδ. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения средних значений.

Термин белок в том значении, в котором он используется в описании заявленного изобретения, соотносится синонимично с термином полипептид. Термин белок в том значении, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к линейному полимеру аминокислотных остатков, соединенных пептидными звеньями (цепями) в особой последовательности. Аминокислотные остатки протеина могут модифицироваться, к примеру, ковалентными прикреплениями различных групп, таких, как углеводы и фосфаты. Прочие вещества могут менее прочно присоединяться к полипептидным цепочкам, как, например, гем или липид, образовывая конъюгированные белки, которые также обозначаются термином белок, используемым в описании заявленного изобретения. Это различные способы, которыми выявляются полипептидные цепочки, в частности, что касается присутствия альфаспиралей и бета-складок. Термин белок, используемый в описании заявленного изобретения, относится ко всем четырем классам белков, а именно альфа, бета, альфа/бета и альфа-плюс-бета.

Термин слитый белок, используемый в описании заявленного изобретения, относится к продукту экспрессии, образующемуся в результате слияния двух нуклеиновых последовательностей. Такой проте- 3 024794 ин можно получить, например, в экспрессионной системе рекомбинантной ДНК. Кроме того, термин слитый белок, используемый в описании заявленного изобретения, относится к слиянию первой аминокислотной последовательности, в частности эндолизина, аутолизина и/или другой пептидогликангидролазы, со второй или третьей аминокислотной последовательностью. Вторая или последующая аминокислотная последовательность предпочтительно представляет собой пептидную цепочку, в частности катионный и/или поликатионный пептид. Более предпочтительно, данная вторая и/или последующая аминокислотная последовательность является чужеродной и не гомологична в какой-либо степени по отношению к любым доменам первой аминокислотной последовательности.

Термин модифицированный вариант эндолизина используется в описании заявленного изобретения синонимично с термином вариант эндолизина. Оба термина относятся к слитым белкам, содержащим эндолизин и пептидную цепочку, в частности катионный и/или поликатионный пептид.

Термин пептидная цепочка, используемый в описании заявленного изобретения, относится к любому виду пептида, соединенного с белком, таким как эндолизин, аутолизин и/или пептидогликангидролаза. В частности, термин пептидная цепочка, используемый в описании заявленного изобретения, относится к катионному пептиду и/или поликатионному пептиду. Однако пептидная цепочка в том значении, в котором она трактуется в заявленном изобретении, не относится к Ηίδ-меткам, 81гер-меткам, Ανίметкам, Мус-меткам, Οδΐ-меткам, Ιδ-меткам, цистеин-меткам, РЬАО-меткам или другим меткам, известным из уровня техники, тиоредоксин- или мальтоза-связывающим белкам (МСБ). Термин метка или таг, в отличие от термина пептидная цепочка, используемый в описании заявленного изобретения, относится к пептиду, который применяется для облегчения экспрессии и/или аффинной очистки полипептида, для иммобилизации полипептида на поверхности, или для применения в качестве маркера или меченой составляющей для обнаружения полипептида, например, при помощи связывания антител в различных форматах энзим связанного иммуносорбентного метода исследования (ЕЫ8А), если только функция построения метки, применяемая для любой из вышеперечисленных фасилитаций, не вызвана положительным зарядом упомянутого пептида. Тем не менее, Ηίδ-метка может, в зависимости от соответствующего показателя рН, быть положительно заряженной, но использоваться в качестве средства аффинной очистки вследствие своей способности связываться с иммобилизированными бивалентными катионами, а не как пептидная цепочка, в соответствии с заявленным изобретением.

Термин пептид, используемый в описании заявленного изобретения, относится к коротким полипептидам, состоящим из приблизительно от 2 до 100 аминокислотных остатков, более предпочтительно примерно от 4 до 50 аминокислотных остатков, наиболее предпочтительно примерно от 5 до 30 аминокислотных остатков, причем аминогруппа одного аминокислотного остатка связана пептидной связью с карбоксильной группой другого аминокислотного остатка. Пептид (белок) может выполнять специфическую функцию, может являться естественно построенным белком, или смоделированным и синтезированным в искусственных условиях. Пептид, к примеру, можно получить или выделить из нативного белка путем энзимного или химического расщепления, или построить с помощью обычных методов белкового синтеза (например, твердофазный синтез) или методами молекулярной биологии (8ашЬгоок, Т е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬогаЮгу Мапиа1, СоИ 8ргшд НагЬог Рге88, СоМ 8рппд НагЬог, Ν.Υ. (1989)). Предпочтительно синтетически получаемые пептиды представляют собой, например, катионные или поликатионные пептиды.

В описании заявленного изобретения термин катионный пептид относится к пептиду с положительно заряженными аминокислотными остатками. Предпочтительно катионный пептид имеет значение рКа (отрицательный десятичный логарифм константы диссоциации) равное 9,0 или выше. Как правило, по крайней мере четыре аминокислотных остатка катионного пептида могут быть положительно заряженными, например лизин или аргинин. Термин положительно заряженные относится к боковым цепочкам аминокислотных остатков, которые имеют чистый положительный заряд при физических условиях. Термин катионный пептид, используемый в заявленном изобретении, также относится к поликатионным пептидам. Термин поликатионный пептид, используемый в описании заявленного изобретения, относится к смоделированным и синтезированным пептидам, состоящих преимущественно из положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности, остатков лизина, аргинина и/или гистидина, наиболее предпочтительно остатков лизина и/или аргинина. Пептид состоит преимущественно из положительно заряженных аминокислотных остатков, причем как минимум примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или около 100% аминокислотных остатков представляют собой положительно заряженные аминокислотные остатки, в частности остатки лизина и/или аргинина. Те из аминокислотных остатков, которые не являются положительно заряженными, могут представлять собой нейтрально заряженные аминокислотные остатки и/или отрицательно заряженные аминокислотные остатки и/или гидрофобные аминокислотные остатки. Более предпочтительно, те из аминокислотных остатков, которые не являются положительно заряженными, могут представлять собой нейтрально заряженные аминокислотные остатки, в частности серин и/или глицин.

Термин эндолизин, используемый в описании заявленного изобретения, относится к энзиму, который эффективен для гидролизации стенок бактериальных клеток. Эндолизины состоят как минимум из одного энзим активного домена (ЭАД) с как минимум одной из нижеследующих функций: эндопеп- 4 024794 тидаза, Ν-ацетил-мурамоил-Ь-аланин-амидаза (амидаза), Ν-ацетил-мурамидаза, Ν-ацетилглюкозаминидаза (ликозим) или трансгликолазы. В дополнение, эндолизины могут также содержать энзим неактивные участки, и прикрепляться к клеточной стенке бактерии-хозяина, т.н. ДСКС (домены связывания клеточных стенок). Эндолизин может содержать один, два или более ДСКС. Однако термин эндолизин в том значении, в котором он используется в описании заявленного изобретения, также относится к энзимам, содержащим как минимум один ЭАД, но ни одного ДСКС. Как правило, домен связывания клеточных стенок обладает способностью связывать различные компоненты на поверхности бактерии. Предпочтительно домен связывания клеточных стенок представляет собой пептидогликансвязывающий домен, который связан с пептидогликаном бактерии.

Термин клеточная стенка, используемый в описании заявленного изобретения, относится ко всем компонентам, образующим внешнюю оболочку клетки грамотрицательной бактерии, обеспечивая, таким образом, ее целостность. В частности, термин клеточная стенка в том значении, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к пептидогликану, внешней мембране грамотрицательной бактерии с липополисахаридом, клеточной мембране бактерии, а также к дополнительным слоям на пептидогликане, как, например, капсулы, внешние протеиновые слои или слаймы.

Термин аутолизины, используемый в описании заявленного изобретения, относится к энзимам, а именно эндолизинам, но кодированным бактериями и включенным, например, в процессы деления клеток и метаболизма в клеточной стенке. Описание аутолизинов содержится в издании Вас1епа1 ρορίίйод1усап (тигеш) Ьубго1акек. Уо11тег Σογικ В., СЬагйег Р., Рок1ег δ. РЕМ8 М1сгоЫо1 Кеу. 2008 Маг;

32(2):259-86.

Термин ЭАД, используемый в описании заявленного изобретения, относится к энзим-активному домену эндолизина. ЭАД отвечает за гидролиз бактериальных пептидогликанов, выполняя как минимум одну энзим функцию эндолизина. ЭАД может также состоять из более чем одного энзим-активного модуля. Термин ЭАД используется в описании заявленного изобретения синонимично с термином каталитический домен.

Термин делеция, используемый в описании заявленного изобретения, относится к делеции 1, 2, 3, 4, 5 или более аминокислотных остатков из соответствующей начальной последовательности.

Термин инсерция или аддиция, используемые в описании заявленного изобретения, относится к инсерции или аддиции 1, 2, 3, 4, 5 или более аминокислотных остатков из соответствующей начальной последовательности.

Термин субституция, используемый в описании заявленного изобретения, относится к субституции аминокислотного остатка, локализованного в определенном положении, на другой аминокислотный остаток.

Заявленное изобретение относится к улучшенным антибактериальным агентам, используемым в отношении грамотрицательных бактерий, ίη саки модифицированным вариантам эндолизина, содержащим эндолизин, слитый с пептидом с липополисахаридом (ЛПС) или с фактором, разрушающим общую мембрану. ЛПС является основным компонентом внешней мембраны грамотрицательной бактерии. Он повышает отрицательный заряд клеточной мембраны и защищает мембрану от некоторых видов химического воздействия. В определенной степени, упомянутый ЛПС защищает мембрану грамотрицательной бактерии также и от эндолизинов внешней среды бактерии. Тем не менее, ЛПС можно разрушить пептидными цепочками, обладающими ЛПС-разрушающей способностью, как, например, положительно заряженные пептиды. Кроме того, упомянутые пептидные цепочки могут включаться в механизм транспортировки протеинов внешней мембраны, дестабилизацию структурных протеинов внешней мембраны и/или липид-зависимую дестабилизацию. Авторы заявленного изобретения с удивлением обнаружили, что пептидная цепочка с ЛПС-разрушающей активностью или в общем с разрушающей мембрану активностью, способствует переносу эндолизина, слитого с упомянутой пептидной цепочкой, через внешние мембраны грамотрицательных бактерий. После такого переноса эндолизина сквозь внешние мембраны грамотрицательных бактерий, клеточную стенку грамотрицательной бактерии можно легко повредить или разрушить эндолизином вследствие деградации пептидогликанного слоя, с последующим осмотическим лизисом, вызванным невозможностью противостоять внутреннему клеточному давлению бактерии.

Таким образом, заявленное изобретение относится к слитым протеинам, состоящим из эндолизина с разрушающей клеточные стенки грамотрицательных бактерий активностью и пептидной цепочки с разрушающей мембрану активностью, причем упомянутая пептидная цепочка связана с энзимом в Ν- и/или С-концах. Упомянутые слитые протеины, в соответствии с заявленным изобретением, также называются модифицированными вариантами эндолизина или просто вариантами эндолизина или модифицированными эндолизинами.

Эндолизин как часть модифицированного варианта эндолизина предпочтительно кодируется бактериофагами, характерными для грамотрицательных бактерий, таких как грамотрицательные бактерии бактериальных групп, семейств, родов или видов, включающих штаммы, патогенные для человека или животных, как, например, бактерии ЕйегоЪайепасеае (ЕксЬепсйа, в особенности, Е.сой, 8а1топе11а, δΐιίде11а, СйгоЪайег, ЕфуагйыеПа, Еп1егоЪас1ег. НаТта, К1еЪк1е11а, в особенности К. рпеитошае, Могдапе11а, Рго1еик. Ргоу1Йепс1а, Зеггайа, Уегкина), Ркеийотопайасеае (Ркеийотопак, в особенности Р. аегидшока,

- 5 024794

ВигкНо1бепа. 8(епо(горНотопаз. 8Не\уапе11а. 8рЫпдотопаз. Сотатопаз). №Шспа. Могахе11а, УШпо. Аеготопаз. Вгисе11а. Егапазе11а. Вогбе(е11а. Ьедюпе11а. ВатЮпе11а. Сох1е11а. НаеторЫ1из. Раз(епге11а. МаппНеПша. АсйпоЬасШиз. СагбпегеПа. 8р1госНае1асеае (Тгеропета и ВоггеПа). БерЮзрйасеае. Сатру1оЬас(ег. НеПсоЬас(ег. 8рт11ит. 8(гер1оЬасП1из. ВасЮгсЛбасеае (Вас(егоШез. ЕизоЬас1егтт. Ргеуо(е11а. РогрНуготопаз). Асте(оЬас1ег. в особенности А. ЬаитапП.

Помимо этого. эндолизин предпочтительно обладает разрушающей активностью на клеточные стенки грамотрицательных бактерий бактериальных групп. семейств. родов или видов. включающих штаммы зйатз. патогенные для человека или животных. как. например. бактерии Еп(егоЬас(епасеае (ЕзсНепсЫа. в особенности Е.соП. 8а1топе11а. 81пде11а. СйгоЬас!ег. Ебуагбз1е11а. Еп(егоЬас(ег. НаГта. К1еЬЗ1е11а. в особенности К. рпешпошае. Могдапе11а. Рго(еиз. РгоуИепаа. 8еггайа. Уегзппа). Рзеиботопабасеае (Рзеиботопаз. в особенности Р. аегидшоза. ВигкНо1бепа. 8(епо(горНотопаз. 8Не\уапе11а. 8рНтдотопаз. Сотатопаз). №1ззепа. Могахе11а. У1Ьпо. Аеготопаз. Вгисе11а. Егапс1зе11а. Вогбе(е11а. Ьедюпе11а. Ваг(опе11а. Сох1е11а. НаеторЫ1из. Раз(епге11а. МаппНеПша. АсбпоЬасШиз. Оагбпеге11а. 8рйосНае(асеае (Тгеропета и ВоггеПа). БерЮзрйасеае. Сатру1оЬас(ег. НеПсоЬас(ег. 8рт11ит. 8(гер1оЬасП1пз. ВасЮгспбасеае (ВасЮгспбез. ЕизоЬасЮгтт. Ргеуо(е11а. РогрНуготопаз). Асте(оЬас1ег. в особенности А. ЬаитапП.

Предпочтительно эндолизиновую составляющую получают из фага или природного эндолизина. как приведено в нижеследующей таблице:

Фаг	Упоминание в публикациях	Природный эндолизин	Прогнозируемая функция эндолизина
Ф\Л10	Реггу, Ш апб Арр1еда(е, В.М.	РИМОрЗО	Хитиназа
ЕЕ1_5-1	МсС!е11апб, М. апб ννϊίδοη, Р.К.	5ТМ0907.Ре1зО	Хитиназа
ε15	Кгор|пкз1, А.М. апб МсСоппе!, М.Р.	ерз11оп15р25	Хитиназа
УЦА	Сеуззепв. Р. (ЬаЬогсйогу (ог Сепе 1есппо1<к|у)	УиА20	литический домен трансгликолаза (С) /1 трансмембрана-воздух (Ν)
ВЗ	Вга1б, ΜΌ. апб К№. ех.	ОРР23	литические домены трансгликолаза (С) / 2 трансмембрана-воздух (Ν)
ΒΟΕΡμ	ЗимМег, ЕЛ. апб Уоипд, В.	ВсерМи22	литический домен трансгликолаза (М) /1 трансмембрана-воздух (Ν)
Р116	Вугпе, М. апб Кгорюек!, АМ	Р116р62	мураминидаза (Т4-подобный)
ΡΕί.5-2	МсС1е11апб, М. апб М1зоп, Р.К.	5ТМ2715,$,Ре1з2	мураминидаза (Τ-4-подобный)
Е818	Саз)епз, 5. В. апб Непбпх, Ρ.νν.	др76	мураминидаза (Т4-подобный)
ЗЕТРЗ	ϋβ Ьарре, N апб Сопгисап, М.	ЗРЗЛЗ_др23	мураминидаза (Т4-подобный)
ФЕСО32	ЗауаПа, ϋапб Εβνβιϊηον, К	ρ(ιί32_17	мураминидаза (Т4-подобный)
НК022	биНа1а , К апб Непбпх, ρ.νν.	НК022р54	мураминидаза (лямбдаподобный)
НК97	бипа1а , В апб Непбпх, ρ.υν.	НК97р58	мураминидаза (лямбдаподобный)
НК620	С1агк, АЛ. апб □ήίΙΙοη, Т.5.	НК620р36	мураминидаза (лямбдаподобный)
Ε1	Рюкагб, ϋ. апб Ооидап, 3	7ΙΡ0007	мураминидаза (лямбдаподобный)
8Ρ6	Саз)еп5, 5 апб С1агк,	3(6 р62	мураминидаза (лямбда-

- 6 024794

	А.6.		подобный)
ЗРУ	ΑΙΙίεοη, С.Е. апб Уегта, Ν.Κ.	Р (5(Ур40)	мураминидаза (лямбдаподобный)
ВСЕРС6В	ЗимМег, Εϋ апб Уоипд, К.	9Р22	мураминидаза (лямбдаподобный)
ΒΟΕΡΝΑΖΘυί	ЗимМег, Еб апб Уоипд, К.	Цагди138	мураминидаза (лямбдаподобный)
Р2	СКпаКе, С.Е. апб Са1епбег, Р.	К(Р2р09)	мураминидаза (лямбдаподобный)
УУФ	СЬпзйе, С.Е. апб ЕзрозПо, ϋ.	К (УУрЫОЭ)	мураминидаза (лямбдаподобный)
КУ5	Кгор1П8к'|, А.М. апб ΰοήηεοη	п/5_др085	мураминидаза (лямбдаподобный)
6398	Ζιι6βΓ, 3 апб Эепои, Е.	Ерб398 др116	мураминидаза (Т4-подобный)
13А	ЗачаПа ϋ апб МоПпеих, 1.	дрз.5	мурамоил-Ь-апанин амидаза
ВА14	ЗауаПа, 0 апб МоПпеих, 1.	дрЗ.5	мурамоил-Ь-аланин амидаза
ЕСО031	ЗауаНа, Эапб МоПпеих, 1.	дрЗ.5	мурамоил-Ь-аланин амидаза
К1Р	ЗсЬоН, 0 апб Мегп|, С	СКУ1Р др16	мурамоил-1-аланин амидаза
ТЗ	Ра^ипеп, Μ.Ι. апб МоШпеих, и.	Т3р18	мурамоил-1_-аланин амидаза
СН-1	ΚτορίηεΚ, А.М. апб Коуа1уоуа, Ι.ν.	дН-1р12	мурамоил-Ь-алакин амидаза
К11	МоПпеих, 1. алб ЗауаНа, ϋ.	др3.5	мурамоип-й-аланин амидаза
ΒΙΡ-1	Ни, М апб МШег, б.Р.	Ыр-1р02	лизоцим (Ν) / РСсвязывающий домен (С)
ВМР-1	1би, М апб МЛ1ег, б.Р.	Ьтр-1рО2	лизоцим (Ν) / РСсвязывающий домен (С)
ВРР-1	Ι_ίιι, М апб МЛ1ег, 1Р.	Ьрр2	лизоцим (Ν) / РСсвязывающий домен (С)
ФСТХ	Ыакауата, К апб НауазЫ, Т.	ОРР12	РС-связывающий домен (Ν) / мурамидаза (С)
ВСЕР43	ЗимМег, Еб апб Уоипд, Р.	Всер43-27	РС-связывающий домен (Ν) / мурамидаза (С)
ВСЕР781	ЗимМег, Еб апб Уоипд, Р.	Всер781-27	РС-связывающий домен (Ν) 1 мурамидаза (С)
ВСЕР1	ЗимМег, Еб апб Уоипд, Р.	Всер1-28	РС-связывающий домен (Ν) / мурамидаза(С)
Β0ΕΡΝΥ3	ЗимМег, Еб апб Уоипд, Р.	ВсерЦУЗдепе26	РС-связывающий домен (Ν) / мурамидаза (С)
ФЕ12-2	□еЗЬагег, 0 апб Мегтап, М.С.	др45	РС-связывающий домен (Ν) / мурамидаза (С)
Ф52237	ОеЗЬагег, ϋ апб ПЛегтап, УУ.С.	др28	РС-связывающий домен (Ν) / мурамидаза (С)
ФР27	Реск1епдаа1б, б апб	Р27р30	Эндопептидаза
	5сЬт1б1, Н.
КВ49	Мопоб, С апб КласЬ, Н.М.	РВ49р102	Эндопептидаза
Ф1	АгЫо1, С. апб Сотеаи, А.М.	рМ1-р102	Эндопегтгидаза
Т5	Рапкоча, Ν.ν. апб Кзепгепко, ν.Ν.	1уе (Т5.040)	Эндопептидаза
201ρίιί2-1	ТЬотаз е^а^.ι 2008		РС-связывающий домен (Ν) / неизвестный каталитический домен (С)
АеМ	Мопоб, С апб КласП, Н.М.	АеМрЗЗЭ	мураминидаза (Т4-подобный)
ΥΥΖ-2008	Кгор1п$к1, А.М.	УУгдр45	мураминидаза (лямбдаподобный)

РС - пептидогликан.

Также предпочтительно эндолизиновую составляющую получают из эндолизинов Ркеийотопак аегидтока фага ΡΚΖ и ЕЬ, фага кеийотопак рий4а ОВР, фага ΕυΖ24, или из Т4 лизосомы, др61 мурамидазы и Р8Р3 эндолизина.

Более предпочтительно, эндолизиновую составляющую выбирают из группы, состоящей из р1йКХдр144 в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 1, ЕЬдр188 в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 2, эндолизин 8а1топе11а в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 3, эндолизин Еп1егоЬас1епа фаг Т4 в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 4, эндолизин Асте1оЬас1ег Ьаитапй в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 5, эндолизин Е.соП фаг Κ1Ρ в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 6, 0ВРдрЬУ8 в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 7, Р8Р3 эндолизин 8а1топе11а (Р8Р3др10) в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 8 и эндолизин Е.соП фаг Р2 (Р2др09) в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 9.

При другом предпочтительном практическом воплощении заявленного изобретения, эндолизины модифицированных вариантов эндолизинов согласно заявленному изобретению, включают модификации и/или изменения в аминокислотных последовательностях. Такие изменения и/или модификации могут содержать как мутации, так и делеции, инсерции и аддиции, их субституции или комбинации и/или химические и изменения аминокислотных остатков, например, биотинилирование, ацетилирование, пегилирование, химические изменения амино-, 8Н- или карбоксильных групп. Упомянутые модифицированные и/или измененные энолизины обладают литической активностью, характерной для эндолизина

- 7 024794 природного происхождения. Тем не менее, упомянутая активность может быть выше или ниже активности соответствующего природного эндолизина. Упомянутая активность может быть на уровне примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или примерно 200% и даже более от активности соответствующего природного эндолизина. Активность можно измерить посредством анализов, известных специалистам в данной области техники, а именно анализ лизиса в чашке Петри или жидколизисный анализ (Впеге с1 а1., 1. ВюеНст. Вюрйук МеОюбк 70: 531-533 (2007)).

В одном из аспектов заявленного изобретения пептид с мембраной и/или ЛПС-разрушающей активностью состоит из положительно заряженного пептида, который содержит один или более положительно заряженных аминокислотных остатков - лизина, аргинина и/или гистидина. Предпочтительно более 80%, более предпочтительно более 90%, наиболее предпочтительно 100% аминокислот в данном пептиде являются положительно заряженными аминокислотами. Как дополнительное преимущество, катионный пептид слит в Ν-конце и/или С-конце вариантов эндолизина, тем самым увеличивая катионность данных протеинов. В другом варианте воплощения заявленного изобретения, катионный пептид слит с эндолизином в участке длиной как минимум в 5, наиболее предпочтительно как минимум в 9 аминокислот.

В предпочтительном варианте воплощения заявленного изобретения, вариант эндолизина состоит из эндолизина и пептида, слитых таким образом, что упомянутый пептид содержит от примерно 3 до примерно 50, наиболее предпочтительно от примерно 5 до примерно 20, в частности от примерно 5 до примерно 15 аминокислотных остатков, как минимум 20, 30, 40, 50, 60 или 70%, наиболее предпочтительно как минимум 80%, например, как минимум 90% упомянутых аминокислотных остатков представляют собой остатки аргинина или лизина. В другом предпочтительном варианте воплощения заявленного изобретения, вариант эндолизина состоит из эндолизина и пептида, слитых таким образом, что упомянутый пептид содержит от примерно 3 до примерно 50, наиболее предпочтительно от примерно 5 до примерно 20, в частности от примерно 5 до примерно 15 аминокислотных остатков, а упомянутые аминокислотные остатки представляют собой остатки аргинина или лизина.

Предпочтительно пептидная цепочка модифицированного варианта эндолизина слита с Ν-концом и/или С-концом эндолизина. В наиболее предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, упомянутая пептидная цепочка слита только с Ν-концом эндолизина. Тем не менее, предпочтительными также являются случаи, при которых модифицированные варианты эндолизина имеют пептидную цепочку как на Ν-, так и С-концах. Упомянутые пептидные цепочки на Ν-конце и на С-конце могут быть как одной, так и разными пептидными цепочками.

Пептидная цепочка модифицированного варианта эндолизина, в соответствии с заявленным изобретением, предпочтительно ковалентно связана с энзимом. В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, упомянутая пептидная цепочка состоит как минимум из 5, более предпочтительно как минимум из 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,

26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,

56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,

86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или как минимум 100 аминокислотных остатков. Наиболее предпочтительной является пептидная цепочка, состоящая из примерно от 5 до примерно 100 аминокислотных остатков, от примерно 5 до примерно 50 или от примерно 5 до примерно 30 аминокислотных остатков. Более предпочтительной является пептидная цепочка, состоящая из примерно от 6 до примерно 42 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 39 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 38 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 31 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 25 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 24 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 22 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 21 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 20 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 19 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 16 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 14 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 12 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 10 аминокислотных остатков или от примерно 6 до примерно 9 аминокислотных остатков.

В одном из аспектов заявленного изобретения слитая пептидная цепочка является катионным и/или поликатионным пептидом, который состоит из одного или более положительно заряженных аминокислотных остатков лизина, аргинина и/или гистидина, в частности, лизина и/или аргинина. Предпочтительно более 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% аминокислотных остатков в упомянутой пептидной цепочке представляют собой положительно заряженные аминокислотные остатки, в частности остатки лизина, аргинина и/или гистидина, в частности, лизина и/или аргинина. Наиболее предпочтительными являются пептидные цепочки, состоящие из примерно 100% положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков аргинина и/или лизина, причем предпочтительно примерно от 60% до примерно 70% упомянутых положительно заряженных аминокислотных остатков представляют собой остатки лизина и примерно от 30% до примерно 40% упомянутых положительно заряженных аминокислотных остатков представляют собой остатки аргинина. Более предпочтительной является пептидная цепочка, состоящая из примерно 100% положительно заряженных аминокислотных остатков, в част- 8 024794 ности остатков аргинина и/или лизина, причем предпочтительно от примерно 64% до примерно 68% упомянутых положительно заряженных аминокислотных остатков представляют собой остатки лизина и примерно от 32% до примерно 36% упомянутых положительно заряженных аминокислотных остатков представляют собой остатки аргинина. Также предпочтительными являются пептидные цепочки, состоящие либо только из аргинина, либо только лизина.

Наиболее предпочтительными являются катионные и/или поликатионные пептидные цепочки, состоящие как минимум из одного мотива в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 10 (КККККК). В частности, катионные пептидные цепочки, состоящие как минимум из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 мотивов в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 10 (КККККК) являются предпочтительными. Более предпочтительны - катионные пептидные цепочки, состоящие как минимум из ККК мотива (лизин-аргининлизин), предпочтительно как минимум из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 или 33 ККК мотивов.

В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, катионная пептидная цепочка состоит, помимо положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков лизина и/или аргинина, из нейтрально заряженных аминокислотных остатков, в частности из остатков глицина и/или серина. Предпочтительными являются катионные пептидные цепочки, состоящие из примерно от 70% до примерно 100%, или от примерно 80% до примерно 95%, или от примерно 85% до примерно 90% положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков лизина, аргинина и/или гистидина, более предпочтительно, остатков лизина и/или аргинина и примерно от 0% до примерно 30%, или примерно от 5% до примерно 20%, или примерно от 10% до примерно 20% нейтрально заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков глицина и/или серина. Предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие из примерно от 4% до примерно 8% остатков серина, из примерно от 33% до примерно 36% остатков аргинина и от примерно 56% до примерно 63% остатков лизина. Наиболее предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие как из минимум одного мотива в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 32 (ККХКК), причем X является любой другой аминокислотой, кроме лизина, аргинина и гистидина. Наиболее предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие как минимум из одного мотива в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 33 (КК8КК). Более предпочтительны катионные цепочки, состоящие как минимум из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или примерно 20 мотивов в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 32 (ККХКК) или 8ЕЦ ГО N0: 33 (КК8КК).

Также предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие из примерно от 9 до примерно 16% остатков глицина, от примерно 4 до примерно 11% остатков серина, от примерно 26 до примерно 32% остатков аргинина и примерно от 47 до примерно 55% остатков лизина. Наиболее предпочтительными являются полипептидные цепочки, состоящие как минимум из одного мотива в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 34 (ККО8О). Более предпочтительными являются катионные цепочки, состоящие как минимум из примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или примерно 20 мотивов в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 34 (ККО8О).

В другом варианте предпочтительного воплощения заявленного изобретения, катионная пептидная цепочка состоит, помимо положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков лизина и/или аргинина, из гидрофобных аминокислотных остатков, в частности остатков валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и глицина, более предпочтительно из остатков аланина, валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина и/или триптофана. Предпочтительными являются катионные пептидные цепочки, состоящие из примерно от 70 до примерно 100%, или примерно от 80 до примерно 95%, или от примерно 85 до примерно 90% положительно заряженных аминокислотных остатков, в частности остатков лизина и/или аргинина и от примерно 0 до примерно 30%, или от примерно 5 до примерно 20%, или от примерно 10 до примерно 20% гидрофобных аминокислотных остатков, остатков валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и глицина, более предпочтительно из остатков аланина, валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина и/или триптофана.

Наиболее предпочтительными являются пептидные цепочки, выбираемые из группы, состоящей из следующих последовательностей:

- 9 024794

Пептидная цепочка	Длина	Последовательность, №:
КРКККК	6	ЗЕО Ю ΝΟ: 10
ККККРКККК	9	ЗЕО ГО ΝΟ: 11
КККРВРРКР	9	ЗЕОЮ N0:12
кккккккк	8	ЗЕО Ю N0: 13
КРКККККККК	10	ЗЕО Ю ΝΟ: 14
кпкккккккквк	12	ЗЕО ГО ΝΟ: 15
кпкккккпкккккк	14	ЗЕОЮ N0:16
кккккккккккккккк	16	ЗЕО Ю N0: 17
КПКККККПКККККРККККК	19	ЗЕО Ю N0: 18
КППКПРРККРРКРПППККР	19	ЗЕО Ю ΝΟ: 19
ккккккккккккккккккк	19	ЗЕО ГО ΝΟ: 20
ккккрккрккзккккркккк	20	ЗЕО ГО ΝΟ: 21
КРККРКККККЗКККККККККК	21	ЗЕО ГО ΝΟ: 22
ккккккккккккккккккккк	21	ЗЕО ГО ΝΟ: 23
ккккккккккозеккккккккк	22	ЗЕО ГО N0: 24
ккккккккккозезокккккккпк	24	ЗЕО ГО ΝΟ: 25
ККККККККККККККККККККККККК	25	5ЕО ГО ΝΟ: 26
КККККККККК5КККККККККК8ККККККККК	31	ЗЕО ГО ΝΟ: 27
ККККККККККСЗбЗОКККККККККСЗбЗОККККККККК	38	ЗЕО ГО N0: 28
ККККККККККККККККККККККККККККККККККККККК	39	ЗЕО ГО N0: 29
ккккккккккзккккккккккзккккккккккзккккккккк	42	ЗЕО ГО N0: 30

Предпочтительно пептидная цепочка не является меткой, как, например, Ηίδ-метка, 81гер-метка, Άνί-метка, Мус-метка, Οδΐ-метка, ίδ-метка, цистеин-метка, РЬЛС-метка или прочие метки, известные из уровня техники, и не тиоредоксин- или мальтоза-связывающими протеинами (МСП-МВР). Однако, пептидная цепочка и/или модифицированный вариант эндолизина, в соответствии с заявленным изобретением, могут включать как дополнение такие метки.

В предпочтительном варианте воплощения заявленного изобретения пептидная цепочка выполняет функцию переноса модифицированного варианта эндолизина через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, но обладает нулевой или минимальной активностью в случае отсутствия слития с энзимом. Функция переноса модифицированного варианта эндолизина через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий осуществляется благодаря потенциалу внешней мембраны или ЛПСразрушающей активности упомянутой пептидной цепочки.

Наиболее предпочтительными являются модифицированные варианты эндолизина, выбираемые из группы, состоящей из следующих модифицированных вариантов эндолизина:_

Модифицированный вариант эндолизина	№ последовательности: (модифицированный вариант эндолизина)	Эндолизиновая составляющая	Пептидная цепочка(Νконец, если не указано иначе)
РО1_У-др144	ЗЕО ГО ΝΟ: 35	ЗЕО ГО ΝΟ: 1	ЗЕО ГО N0: 11
(ΡΟΙ-Υ)Αρ144	ЗЕО ГО ΝΟ: 36	ЗЕО ГО ΝΟ: 1	ЗЕО ГО ΝΟ: 21
(РО1.У)3-др144	ЗЕО ГО N0: 37	ЗЕО ГО N0:1	ЗЕО ГО N0: 27
(РО1.У)4-др144	ЗЕО ГО N0: 38	ЗЕО ГО N0: 1	ЗЕО ГО N0: 30
РО1_У-др188	ЗЕО ГО ΝΟ: 39	ЗЕО ГО ΝΟ: 2	ЗЕО ГО ΝΟ: 11
(РОЬУ)<др188	ЗЕО ГО ΝΟ: 40	ЗЕО ГО ΝΟ: 2	ЗЕО ГО ΝΟ: 21
(РО1_УГ-др188	ЗЕО ГО N0: 41	ЗЕО ГО ΝΟ: 2	ЗЕО ГО ΝΟ: 27

- 10 024794

ЗЕО ГО ΝΟ: 2

ЗЕО ГО N0: 1

ЗЕО ГО N0: 1

ЗЕО ГО ΝΟ: 1

ЗЕО ГО N0: 1

ЗЕО ГО N0: 1

ЗЕО ГО ΝΟ: 1

ЗЕО ГО N0: 1

ЗЕО ГО N0; 8

ЗЕО ГО N0: 9

ЗЕО ГО ΝΟ: 7

ЗЕО ГО ΝΟ: 1

ЗЕО ГО N0: 1

ЗЕО ГО N0:1

ЗЕО ГО N0:1

ЗЕО ГО N0: 1

ЗЕО ГО N0: 1

ЗЕО ГО ΝΟ:

ЗЕО ГО ΝΟ:

ЗЕО ГО N0: 10

ЗЕО ГО ΝΟ:

ЗЕО ГО ΝΟ:

ЗЕО ГО N0: 12

ЗЕО ГО ΝΟ: 13

ЗЕО ГО ΝΟ: 28

ЗЕО ГО ΝΟ: 11

ЗЕО Ю N0: 11

ЗЕО ГО N0: 11

ЗЕО ГО ΝΟ: 22

ЗЕО ГО ΝΟ: 27

ЗЕО ГО N0: 30

ЗЕО ГО ΝΟ: 18

ЗЕО ГО ΝΟ: 23

ЗЕО ГО ΝΟ:

- 11 024794

Модифицированные варианты эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, и в частности, наиболее предпочтительные модифицированные варианты эндолизина в соответствии с 8ЕО ГО N0: 35 до 49, 53, 57, 61 до 64 и от 66 до 78, могут дополнительно включать метку, например, для очищения. Предпочтительной является Н1к₆-метка, предпочтительно в С-конце модифицированного варианта эндолизина. Упомянутую метку можно связать с модифицированным вариантом эндолизина при помощи дополнительных аминокислотных остатков, например, вследствие клонирования. Предпочтительно упомянутую метку можно связать с модифицированным вариантом эндолизина при помощи как минимум 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте воплощения заявленного изобретения, модифицированный вариант эндолизина включает Н1к₆-метку, в своем С-конце, связанную с модифицированным вариантом эндолизина при помощи дополнительных аминокислотных остатков лизина и глицина (Ьук-С1у) или лейцина и глутаминовой кислоты (Ьеи-С1и).

В частности, предпочтительными являются модифицированные варианты эндолизина в том виде, в котором они описаны в нижеследующих примерах. Модифицированные варианты эндолизина в соответствии с 8Е0 ГО N0: 35 до 42, 53, 57 и 61, приведенные в примерах, включают Н1к₆-метку в С-конце, связанную с соответствующим вариантом эндолизина при помощи дополнительных аминокислотных остатков лизина и глицина (Ьук-С1у). Модифицированные варианты эндолизина в соответствии с 8Е0 ГО N0: 43 до 49 и 75, приведенные в примерах, включают Н1к₆-метку в С-конце, связанную с соответствующим вариантом эндолизина при помощи дополнительных аминокислотных остатков лейцина и глутаминовой кислоты (Ьеи-С1и).

Слитые протеины образуются путем связывания как минимум двух нуклеиновых последовательностей с использованием стандартных методик клонирования, как описано 8атЬгоок, 1. е1 а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаШгу Мапиа1. Такой протеин можно получить, например, методом рекомбинантных ДНК. Такие слитые протеины в соответствии с заявленным изобретением можно получить слитием/связыванием нуклеиновых кислот с эндолизином и соответствующей пептидной цепочкой.

Поскольку некоторые слитые протеины могут либо проявлять токсическое действие после контакта с бактериями, либо не быть гомогенными вследствие протеиновой деградации, решение может заключаться в экспрессии данных слитых протеинов в слитии или связке с другими дополнительными протеинами. Примерами таких дополнительных протеинов может служить Тиоредоксин, который способствует экспрессии токсичных антимикробных пептидов в клетках Е.сой (ТгхА теШаОпд Гикюп ехргеккюп оГ апДт1сгоЫа1 рерйДе СМ4 Ггот тиШр1е ]ошеД депек ш ЕксйепсЫа сой. 2йои Ь., 2Ьао Ζ., Ы В., Са1 Υ., ΖЬапд 8. Рго1еш Ехрг РштГ. 2009 Арг; 64(2):225-230).

Для усиления антимикробных характеристик слитых протеинов необходимым может представиться удаление дополнительного слитого протеина путем протеолитического расщепления. С данной целью

- 12 024794 возможно использование имеющихся в продаже наборов, как, например, экспрессионная система рЕТ32 (Ыоуадеп), для модификации, например, Ν-конца слитого протеина, в зависимости от используемой протеазы, например из МС8 до ЛМО8 (8ЕЦ ГО N0: 31), если бы остаток аланина явился бы результатом введенного сайта расщепления энтерокиназы.

В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, пептидные цепочки модифицированных вариантов эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, содержат модификации и/или изменения в аминокислотных последовательностях. Такие изменения и/или модификации могут включать мутации, как, например, удаления, вставления или добавления, их замены/субституции или комбинации, и/или химические изменения аминокислотных остатков, например, биотинилирование, ацетилирование, пегилирование, химические изменения амино-, 8Н- или карбоксильных групп.

В дополнение к вышеперечисленному, заявленное изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением. Заявленное изобретение также относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с заявленным изобретением. Упомянутый вектор может способствовать конститутивной или индуцируемой экспрессии упомянутого модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением.

Заявленное изобретение также относится к способу получения упомянутых модифицированных вариантов эндолизина из микроорганизма, такого, как генетически модифицированная стабильная (устойчивая) клетка-хозяин, которая кодирует упомянутый модифицированный вариант эндолизина. Данная клетка-хозяин может представлять собой микроорганизм, как, например, бактерия, или дрожжевая клетка, или грибок, или животная клетка, как, например, клетка млекопитающего, в частности клетка человеческого организма. В одном из вариантов воплощения заявленного изобретения, дрожжевая клетка представляет собой клетку Ρίοΐιία ра81ог18. Хозяина можно выбирать как на основе только биотехнологических параметров, как то выход, растворимость, стоимость и пр., а также целесообразности по медицинским показателям, например, исходя из непатологичности бактерии или дрожжевой клетки, клетки человеческого организма.

В другом аспекте заявленное изобретение относится к способу генетического трансформирования подходящей клетки-хозяина с целью получения методом экспрессии модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, при котором клетку-хозяина подвергают генетической модификации путем введения генетического материала, кодирующего упомянутые модифицированные варианты эндолизина в клетке-хозяине и получения из трансляции и экспрессии при помощи методов генетического инжиниринга, известных специалистам в данной области техники.

В другом аспекте заявленное изобретение относится к композиции, предпочтительно фармацевтической композиции, содержащей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или клетку-хозяина, трансформированную с использованием молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением.

В предпочтительном варианте воплощения заявленного изобретения, упомянутая композиция содержит дополнительные агенты, пермеабилизирующие внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, такие как хелаты металлов, например этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), гидроксиметиламинометан (ТК18), лактовая кислота, лактоферрин, полимиксин, лимонная кислота и/или другие вещества, согласно описанию автора Уаага (Адепт 1На1 шсгеаке 1Не регтеаЬййу о£ 1Не ои!ег шешЬгапе. Уаага М. МюгоЬю1 Кеу. 1992 8ер; 56(3):395-441). Также предпочтительными являются композиции, содержащие комбинации вышеупомянутых пермеабилизирующих агентов. Наиболее предпочтительной является композиция, содержащая примерно от 10 мкМ до примерно 100 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 50 мкМ до примерно 10 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 мМ до примерно 10 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 мМ до примерно 2 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 мМ до 1 мМ ЭДТК. Тем не менее, предпочтительными являются также композиции, содержащие от примерно 10 мкМ до примерно 0,5 мМ ЭДТК. Предпочтительной также является композиция, содержащая от примерно 0,5 мМ до примерно 2 мМ ЭДТК, более предпочтительно примерно 1 мМ ЭДТК и дополнительно от примерно 10 до примерно 100 мМ ТК18.

Заявленное изобретение также относится к модифицированному варианту эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяину, трансформированному с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, для применения в качестве медикаментозного средства.

В расширенном аспекте заявленное изобретение относится к применению модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяину, трансформированному с использованием вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, для применения в производстве медикаментозных средств для лечения и/или профилактики дис- 13 024794 функций, заболеваний или симптоматики, ассоциируемых с заражением патогенными грамотрицательными бактериями. В частности, лечение и/или профилактика тех дисфункций, заболеваний или симптоматики, которые могут вызываться грамотрицательными бактериями бактериальных групп, семейств, родов или видов, включающих Чгаиъ. патогенных для человека или животных, как, например, ЕЩегоЬас(епасеае (ЕксИепсЫа, в особенности Е.соИ, За1топе11а, ЗЫдеПа, СПгоЬас1ег, ЕйтагйыеИа, ЕйегоЬас1ег, НаТта, К1еЬк1е11а, в особенности К. рпеитошае, Могдапе11а, Рго1еик, Ргоу1Йепс1а, ЗеггаИа, Уегыта), Ркеийотоиайасеае (Ркеийотопак, в особенности Р. аегидшока, ВигкИоШепа, З1епоНорИотопак, ЗИе^апеИа, ЗрЫпдотопак, Сотатопак), №1ккепа, Могахе11а, УШпо, Аеготопак, Вгисе11а, Егапс1ке11а, Вогйе1е11а, Ьедюпе11а, Вапопе11а, Сох1е11а, НаеторИИик, Рак1еиге11а, МаппИе1т1а, АсИпоЬасШик, ОагИпеге11а, ЗрИосНаеШсеае (Тгеропета и ВоггеНа), Тер1окрНасеае, Сатру1оЬас1ег, НеНсоЬас1ег, Зрш11ит, З1гер1оЬасИ1ик, Вас(егоШасеае (Вас1его1йек, ЕикоЬас1егшт, Ргеуо1е11а, РогрИуготопак), Асше1оЬас1ег, в особенности А. Ьаитапи. Предпочтительно упомянутые дисфункции, заболевания или симптоматика могут вызываться Ркеийотопак, в особенности Ркеийотопак аегидшока и/или Ркеийотопак риИйа, ВигкИоШепа, в особенности ВиткИоШепа ркеийота11е1 и/или ВигкИоШепа коктасеагипт сальмонелла, в особенности За1топе11а 1\ρ1ιίтшгит и/или За1топе11а ЕпепИФк, Асше1оЬас1ег, в особенности Асше1оЬас1ег Ьаитапшт ЕксИепсЫа соИ и/или К1еЬк1е11а, в особенности К1еЬк1е11а рпеитошае.

Заявленное изобретение также относится к медикаментозному средству, содержащему модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяина, трансформированного с использованием нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением.

В расширенном аспекте заявленное изобретение относится к способу лечения дисфункций, заболеваний или симптоматики у людей или животных при наличии достаточных показаний, причем данный метод включает в себя введение или прием эффективной дозы модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, и/или эффективной дозы хозяина, трансформированного с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением или композицией в соответствии с заявленным изобретением.

Предпочтительно упомянутый способ лечения представляет собой лечение и/или профилактику инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, в частности вышеупомянутыми грамотрицательными бактериями. В частности, упомянутый способ лечения представляет собой лечение и/или профилактику инфекций кожи, мягких тканей, дыхательной системы, легких, пищеварительного тракта, глаз, ушей, зубов, носоглотки, ротовой полости, костной и мочеполовой систем, раневых поверхностей при бактериемии и/или эндокардите, вызванных грамотрицательными бактериями, в частности вышеупомянутыми грамотрицательными бактериями.

Дозировка и путь введения, используемые в способе лечения (или профилактики) в соответствии с заявленным изобретением, зависят от специфики заболевания/места локализации инфекции. Путь введения может, например, быть пероральный, локальный, носоглоточный, парентеральный, ингаляционный, внутривенный, внутримышечный, интратекальный (субарахноидальный), интраспинальный, эндобронхиальный, интрапульмональный, внутрикостный, интракардиальный, внутрисуставной, ректальный, вагинальный или любой другой путь введения.

Для введения модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или эффективной дозы хозяина, трансформированного с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную цепочку, кодирующую модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением или композицию в соответствии с заявленным изобретением, в очаги инфекции (или в места, где присутствует потенциальная вероятность заражения), применяют такую форму упаковки, которая защищает активные компоненты от воздействий внешних факторов, таких как протеазы, окисление, иммунный ответ и т.п., вплоть до достижения ими очага инфекции. Следовательно, лекарственная форма может представлять собой капсулу, драже, таблетку, порошок, суппозиторий, эмульсию, гель, лосьон, крем, мазь, инъекционный раствор, сироп, спрей, состав для ингаляций или любую другую приемлемую по медицинским показаниям упаковку. Предпочтительно фармацевтическая композиция может содержать подобранные носители, стабилизаторы, красители, буферы или другие подходящие реагенты. Например, для местного нанесения лекарственная форма может представлять собой лосьон, крем, гель, мазь или пластырь, для назофарингального применения - физраствор для интраназального нанесения при помощи спрея. Для перорального применения с целью лечения и/или профилактики очага инфекции, к примеру, во внутренних органах, возникает необходимость в дополнительной защите модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением от агрессивного воздействия среды желудочно-кишечного тракта вплоть до проникновения в очаг инфекции. Таким образом, при пероральном введении в очаг инфекции во внутренних органах требуется использование бактерии как носителя, который преодолеет начальные стадии пищеварения в желудке и только после этого секрецируется на модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением.

В одном из узконаправленных воплощений заявленного изобретения использование модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяина, трансформиро- 14 024794 ванного с использованием вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, для применения в производстве медикаментозного средства для лечения и/или профилактики дисфункции, заболевания или симптоматики, вызванных Ркеиботопак, в особенности Ркеиботопак аегидшока в особенности, поражения внутренних органов, в частности у грудных младенцев, инфекционные менингиты, например геморрагический менингит, инфекции среднего уха, кожного покрова (ЕсШута дапдгаепокит), в частности ожоги, мочеполового тракта, риниты, бактериальные пневмонии, в частности, при которых пациент страдает от кистозного фиброза (муковисцидоза) или гематологических осложнений, например, при лейкемии, при развитии нейтропении в период проведения иммунодепрессивной терапии, септицемии, в особенности вследствие длительной внутривенной или мочевой катетеризации, полостных хирургических операций и тяжелых ожоговых поражений, эндокардита, в частности, при котором пациент находится на внутривенном катетерном введении лекарственных препаратов, или пациент с осложнениями после открытого хирургического вмешательства на сердце, при тяжелых инфекциях глаз, в частности, после использования зараженных офтальмологических растворов или тяжелых ожоговых поражений лица, остеохондроза, в частности вследствие тяжелых травм или колотых ран с входным отверстием сквозь грязную одежду.

В другом специализированном варианте практического воплощения заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями ВнгкНоИепа ркенкотаПек в особенности болезнь Уитмора, хроническая пневмония, септицемия, в частности, при которой у пациента наблюдается травматическое поражение кожного покрова.

В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями 8а1топе11а ШурЫтигшт и 8а1топе11а епкегШШк, в особенности острые гастроэнтериты и локальные гнойные процессы, в частности остеомиелит, эндокардит, холецистит и особенно менингит, вызванный бактериями 8а1топе11а (НурЫтипит, при котором возраст пациента менее 2 лет.

В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Асте1оЬас1ег Ьаитаппи, в частности, бронхит, пневмония, раневые инфекции и септицемия, в особенности вследствие внутривенной катетеризации.

В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями ЕксНепсЫа сок, в особенности экстраинтестинальные инфекции, в частности аппендицит, гнойный холецистит, периотонит, гнойный менингит и инфекции мочеполового тракта, интраинтестинальные инфекции, вызванные бактериями Е.соН, в частности эпидемический энтерит, а также инфекционные заболевания, подобные дизентерии, септицемия, энтеротоксемия, мастит и дизентерия.

В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями К1еЬк1е11а рпеитотае, в частности пневмония, бактериемия, менингит и инфекции мочеполового тракта.

Предпочтительно модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением используется как компонент терапии или профилактики, в случае, если инфекция вызвана мультирезистентными бактериальными штаммами, в частности, штаммами, устойчивыми к одному или более из следующей группы антибиотиков: стрептомицин, тетрациклин, цефалотин, гентамицин, цефатоксин, цефалоспорин, цефтазидим или имипенем. Кроме этого, модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением применяют как компонент терапии путем введения в сочетании с традиционными антибактериальными препаратами, такими как антибиотики, лантибиотики, бактериоцины или эндолизины и т.п.

Заявленное изобретение также относится к фармацевтическому препарату, содержащему одно или более отделений, причем как минимум одно отделение содержит один или более модифицированных вариантов эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или один или более хозяинов, трансформированных с использованием нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, или композицию в соответствии с заявленным изобретением.

В другом аспекте практической реализации заявленное изобретение относится к процессу приготовления фармацевтической композиции, причем данный процесс включает добавление путем смешивания одной или более модифицированных вариантов эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или один или более хозяев, трансформированных с использованием нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, с фармацевтически приемлемым растворителем, эксципиентом или носителем.

В более расширенном аспекте композиция в соответствии с заявленным изобретением представляет собой косметическую композицию. Некоторые виды бактерий могут вызывать раздражение на открытых участках тела пациента, например на кожном покрове. Для предотвращения появления таких раздражений кожного покрова или вероятного патогенного влияния упомянутых бактериальных организмов,

- 15 024794 представляется возможным применение специальных косметических составов, которые содержат достаточное количество модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением для разрушения уже размножившихся или потенциально опасных очагов инфекции, вызванных грамотрицательными бактериями.

В расширенном аспекте заявленное изобретение относится к применению модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением в качестве средства диагностики в здравоохранении, пищевой промышленности и природоохранной деятельности, в частности в качестве средства диагностики для диагностирования бактериальных инфекций, вызванных в частности грамотрицательными бактериями.

Модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением можно применять в качестве инструмента направленного разрушения патогенных бактерий, в особенности грамотрицательных патогенных бактерий. Разрушению бактериальных стенок модифицированным вариантом эндолизина в соответствии с заявленным изобретением можно способствовать путем добавления детергентов, как, например, ТгПоп Х-100 или других добавок, которые ослабляют клеточную защиту бактерий, например полимиксин В. Специально направленное разрушение клеток необходимо как начальный этап последующего направленного уничтожения бактерий с использованием НК-методов, как, например, полимеразная цепная реакция (ПЦР), гибридизация нуклеиновой кислоты или амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот, иммунобиологических методов, например, 1М8, иммунофлюоресценции или анализ ЕЫ8А, или методов, основанных на распознавании клеточного материала бактерий, как то энзим-анализы с использованием протеинов, чувствительных к определенным группам или видам бактерий (например, β-галактоидаза для энтеробактерий, коагулаза для коагулаз-позитивных штаммов).

В расширенном аспекте заявленное изобретение относится к использованию модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением, для устранения, уменьшения и/или профилактики заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования на пищеперерабатывающих предприятиях, различных поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, как, например, полки и места хранения пищевых продуктов, а также в любой другой области, где присутствует вероятность заражения пищевых продуктов, медицинского инструментария или прочих поверхностей в клиниках и хирургических блоках патогенными, потенциально болезнетворными и пр. нежелательными бактериями.

В частности, модифицированные варианты эндолизина в соответствии с заявленным изобретением можно применять в профилактических целях в качестве обеззараживающего средства. Такое обеззараживающее средство можно использовать до или после хирургических вмешательств, или, например, во время гемодиализа. Кроме того, модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением можно применять как компонент терапии у недоношенных детей, пациентов с ослабленной иммунной реакцией, или пациентов с протезными устройствами. Данную терапию можно проводить как профилактику, так и в острый период. В этом же контексте, внутрибольничные инфекции, в особенности вызванные резистентными к антибиотикам штаммами, как, например, бактериями Рзеийотопаз аегидтоза (РЦРР), АсшекоЬаскег и энтеробактерии, как, например Е.соН, 8а1топе11а, 8Ыде11а, СНгоЬаскег, ЕфуагНмеПа, ЕйегоЬаскег, НаГша, К1еЬз1е11а, Могдапе11а, Ргокеиз, РгслаНепаа. 8еггаНа и Υе^з^п^а можно лечить - как профилактически, так и в стадии острого обострения - с использованием модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением. В связи с этим, модифицированный вариант эндолизина в соответствии с заявленным изобретением можно использовать в качестве дезинфицирующего средства, а также в сочетании с другими ингредиентами в составе дезинфицирующего раствора, как, например, детергенты, поверхностно-активные вещества, растворители, антибиотики, лантибиотики или бактериоцины.

Применение модифицированного варианта эндолизина в соответствии с заявленным изобретением в качестве дезинфицирующего средства, например, в клиниках, стоматологических и ветеринарных кабинетах, кухне или ванной комнате сопровождается приготовлением состава в виде жидкости, порошка, геля, или ингредиента дезинфицирующих салфеток или простыней. В данный состав можно дополнительно включить подходящий носитель, добавки, растворители и/или эксципиенты для различных способов применения, а также агенты, которые способствуют повышению антимикробной активности, такие, как, например, ЭДТК или агенты, повышающие антимикробную активность слитых протеинов. Слитые протеины можно использовать с традиционными дезинфицирующими агентами, такими как, например, этиловые спирты, альдегиды, окислители, фенолы, четвертичные аммониевые соединения или УФ-излучение. Для дезинфекции, например, поверхностей, объектов и/или приборов, модифицированный вариант эндолизина можно наносить на указанные поверхности, объекты и/или приборы. Нанесение можно осуществлять при помощи мягкой ткани, смоченной в дезинфицирующем составе, нанесенном при помощи спрея или окунания. Слитые протеины можно использовать в различных концентрациях, в зависимости от соответствующего способа нанесения и времени воздействия для достижения эффекта полного обеззараживания.

Далее по тексту описания заявленного изобретения следует расширенное описание применимости

- 16 024794 заявленного изобретения; тем не менее, следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, при том, что таковые служат исключительно цели продемонстрировать примеры практического воплощения заявленного изобретения, не носят ограничительный характер, поскольку различные изменения и модификации, не выходящие за рамки цели и задач изобретения, понятны специалистам в данной области техники. Необходимо понимать, что как описание, так и примеры носят иллюстративный характер и не являются ограничительными касательно сути заявленного изобретения.

Если не указано иначе, в нижеследующих примерах использованы стандартные методики, принятые в молекулярной биологии, как, например, описано в издании 8атЬгоск е1 а1., 1989, Мо1еси1аг С1оти§: А ЬаЬогаШгу Маииа1, 2иб ебйои, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаШгу Рге88, Со1б 8ргшд НагЬог, №\ν ¥огк.

Пример 1. Клонирование, экспрессия и очистка модифицированных вариантов эндолизина рйЖ2др144 и ЕЬдрдр188.

рйЖ2др144, как указано в 8ЕЦ ГО NΟ: 1 и ЕЬдр188 и 8ЕЦ ГО NΟ: 2, представляют собой модифицированные эндолизины, получаемые из фагов Ркеиботоиак аегидшока φΙ<Ζ и ЕЬ с пептидогликансвязью на Ν-конце и каталитическим доменом на С-конце (Впегк е1 а1., 2007).

Для амплификации открытой рамки считывания (ОРС, ОКР) применили рЫ^др144 ЕЬдр188 ПЦР стандартный 5' праймер (для рЫ^др144: 5' АТОАААОТАТТаСоСААА 3' (8ЕЦ ГО NΟ: 83); для ЕЬдр188 5' АТОААСТТССООАСОААО 3' (8ЕЦ ГО NΟ: 65)) и стандартные 3' праймеры в соответствии с 8ЕО ГО Ш: 81 и 82 (для р1и1^ур144: ТТТТСТАТОТОСТОСААС (8ЕО ГО 81); использовали для

ЕЬдр188: АТАСОАААТ ААСОТОАСОА (8ЕЦ ГО NΟ: 82). Для удлинения 5' конца открытой рамки считывания, кодирующей р1йКТдр144 или ЕЬдр188 с фрагментом гена, кодирующего девять положительно заряженных остатков (Еу8-Агд-Еу8-Еу8-Аг§-Еу8-Еу8-Аг§-Еу8 - 8ЕЦ ГО NΟ: 11), применили хвост ПЦР с удлиненным 5' праймером (для рЫ^др144: 5' АТОООАТССАААСОСААОАААСОТААОААА СОСААААААОТАТТАСОСАААО 3' (8ЕО ГО Ш 79); для ЕЬдр188: 5' АТОООАТССАААСОСААОАААСОТААОААА СОСАААААСТТССООАСОААО 3' (8ЕЦ ГО NΟ: 80)) и стандартные 3' праймеры в соответствии с 8ЕЦ ГО NΟ: 81 и 82. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионном векторе рЕХР5СТ/ТОРО® (1иуйгодеи, СагйЬаб, СА, И8А) в соответствии с инструкциями производителя. Задействовали аргининовые триплеты, помимо лизиновых триплетов, с целью избежать 1РНК деплеции и уменьшить риск сдвигов рамки (единственными двумя возможными триплетами для лизина являются ААА и ААО, с последующими длинными А-цепями). Инсерция дополнительных катионных кассет в рестрикционный сайт ВатН1 удлиняет хвост дополнительными катионными остатками. Такая инсерция создает аргининовый и сериновый триплет в каждом сайте соединения (фиг. 1). До четырех поликатионных пептидных цепочек были слиты с рЫ^др144 и ЕЬдр188, маркированными (РОЬ¥)^и-др144 или (РОЬ¥)^и-др188 (и=1, 2, 3, 4), содержащими соответственно 9, 19, 29 и 39 положительно заряженных аминокислотных остатков в Ν-конце. Соответственно, следующие конструкции экспрессировали в клетках Е.сой ВЬ21 (ЮЕ3) рЬу88 (экспоненциально растущие клетки при 37°С, индукция с использованием 1 мМ 1РТО, экспрессия в течение 4 ч при 37°С):_

Модифицированный вариант эндолизина	ЗЕО Ю ΝΟ:	Количество положительно заряженных аминокислотных остатков
Р01?Г-др144	ЗЕО Ю ΝΟ: 35	9
(РО1 У/-др144	ЗЕО Ю ΝΟ: 36	19
(РО1 У)3-др144	ЗЕО Ю ΝΟ: 37	29
(РО1_У)4-др144	ЗЕО Ю ΝΟ: 38	39
РОЬ¥-др188	ЗЕО Ю ΝΟ: 39	9
(РО1¥/-др183	ЗЕО Ю ΝΟ: 40	19
(РСИ¥)3-др188	ЗЕО Ю ΝΟ: 41	29
(РО1.¥)4-др188	ЗЕО Ю ΝΟ: 42	39

Модифицированные варианты эндолизина РОЬ¥-др144 (8ЕЦ ГО NΟ: 35), (РОЬ¥)²-др144 (8ЕЦ ГО Ш: 36), РОЬ¥-др188 (8ЕО ГО 39) и (РОЬ¥)²-др188 (8ЕО ГО 40) использовали для последующих исследований. Упомянутые протеины подвергли очистке с использованием Νί²⁺ аффинной хроматографии с использованием С-конечной 6хН18-метки (Ак1а жидкостная экспресс-хроматография белков с использованием 1 мл Нк-трапа №-№ТА колонки). Общий выход на 1 л экспрессионной культуры Е.сой определили при помощи спектрометрического измерения концентрации протеина и общего объема очищенного раствора. Очистку производных др188 провели при более жестких условиях (65 мМ имидазола) в сравнении с производными др144 (50 мМ имидазола) для обеспечения высокой степени очистки. Данные по общему выходу на 1 л экспрессионной культуры Е.сой приведены в табл. 1.

- 17 024794

Таблица 1

Выход рекомбинантной очистки производных эндолизина на 1 л экспрессионной культуры Е.соН

Слитые протеины	Эндолизин
	рЫК2др144	Е1 др188
ΡΟίΥ	2 мг	48 мг

(ΡΟΙ.Υ)² 0,5 мг 0,06 мг

Очищенные маточные растворы имели чистоту ~90%. Масс-спектрометрический анализ очищенных растворов РОЬУ- производных показал наличие следов Е.соН 508 рибосомного субъединичного протеина Ь2 и 168 γΚΝΆ уридин-516 псевдоуридилат синтазы. Все производные ρΗίΚΖ§ρ144 показали мультимерную формацию, которую можно конвертировать в мономеры путем присоединения βмеркаптоэтанола, что свидетельствует о том, что интерсульфидные связи вызывают мультимеризацию.

Пример 2. Антибактериальная активность модифицированных вариантов ρΗίΚΖ§ρ144 и ЕЬдр188.

Экспоненциальные клетки (~10⁶/мл) Р. аегидшока ΡΑΟ1ρ (Пгпау ΡΡ. е! а1. (2003), ί. С1ш МюгоНюЕ, 41(3): 1192-1202) разбавили 100 х (конечная плотность эквивалентна ~10⁶/мл) и инкубировали при комнатной температуре вместе с 10 мкг недиализированного протеина для каждого образца (немодифицированные варианты эндолизинов ρΗίΚΖ§ρ144 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1) и ΕΕρ§188 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2) и модифицированные варианты эндолизинов ΡΟΕΥ-§ρ144 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 35), (ΡΟΕΥ)²-§ρ144 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 36), ΡΟΕΥ-§ρ188 (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 39) и (ΡΟΕΥ)²-§ρ188 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 40) при конечной концентрации 100 мкг/мл в буфере (20 мМ NаΗ₂ΡΟ₄-NаΟΗ ρΗ 7.4; 0.5 М №С1; 0.5 М имидазола). По истечении 1 ч клеточные суспензии растворили в ФСБ буфере (10е-5, 10е-4 и 10е-3) и поместили в чашку Петри (стандартная среда ЛурияБертани, инкубация в течение ночи при 37°С). Дополнительно, поместили в чашку Петри отрицательный контроль с клетками в ФСБ-буфере. Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации. На основе подсчета числа клеток высчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию (%) (=100-(^/Ыо)х100, где Ν₀ = число необработанных клеток, а Ν₁ = число обработанных клеток) и в логарифмических юнитах (=1од₁₀^/Н) (табл. 2). Все образцы реплицировали в шесть раз. Средние/стандартные девиации приведены. Статистический анализ провели с использованием обычного ΐтеста.

Немодифицированные эндолизины ρΗ^ΚΖдρ144 и ЕЬд|л188 не уменьшают значительно число клеток по сравнению с отрицательным контролем. Данное наблюдение иллюстрирует эффективность функции внешней мембраны как барьера для эндолизина, разрушающего клеточные стенки грамотрицательных бактерий. В отличие от приведенных в табл. 2, инкубация с модифицированными эндолизинами ΡΟΕΥ дρ144, (ΡΟΕΥ)²^ρ144. ΡΟΕΥ^ρ188 и (ΡΟΕΥ)²^ρ188 вызывает значительное снижение (α = 0.05) числа бактериальных клеток (99.85±0.09% для ΡΟΕΥ^ρ144 и 98.0±0.2% для ΡΟΕΥ^ρ188). Увеличение длины поликатионной пептидной цепочки в свою очередь способствует увеличению антибактериальной активности, в особенности в случае ρ1ιίΚΖ£ρ144 (достигается уменьшение до 99,98±0.02% или 3,7±0.3 1од ииНк в течение 1 ч для (ΡΟΕΥ)²^ρ144). Кроме того, испытания показали, что модифицированные эндолизины ρ1ιίΚΖ£ρ144 обладают более высокой антибактериальной активностью по сравнению с модифицированными эндолизинами ЕЬд|э188.

Таблица 2

Антибактериальный эффект эндолизинов - немодифицированных и модифицированных ρ1ύΚΖ^ρ144 и ЕЬд|л188 вариантов

Экспоненциально	Эндолизины
растущие клетки	рЫК2др144	Е1 д	р188
	%	1од	%	Ьод
^модифицированный эндолизин	0± 15	0,00 ± 0,06	10 ± 13	0,05 ± 0,06
ΡΟΙΎ	99,85 ± 0,09	2,9 ±0,3	98,0 ± 0,2	1,7 ±0,1
(ΡΟΙ.Υ)2	99,98 ± 0,02	3,7 ± 0,3	98,9 ±0,4	2,0 ±0,2

Таким образом, пример демонстрирует, что аддиция короткопептидной цепочки из девяти катионных остатков в Ν-конце к ρΗ^ΚΖдρ144 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1) уже само по себе является достаточным для того, чтобы уничтожить почти 99,9% клеток в течение 1 ч. Поли-Ь-лизин также обладает неотъемлемой антибактериальной активностью, хотя это свойство до сих пор приписывалось полимерам как минимум с 20 остатками (Уаага апб Уаага, 1983а, 1983Н). Тем не менее, совместное действие поликатионной пептидной цепочки и эндолизина уничтожает клетки.

В продолжение опыта, модифицированный эндолизин ΡΟΕΥ^ρ144 подвергли диализу до 50 мМ ΚΗ₂ΡΟ₄/Κ₂ΗΡΟ₄ ρΗ 7 и использовали вместо раствора недиализированного протеина, как описано выше. При этом уровень инактивации дополнительно вырос с 2,9±0,3 лог юнитов до 3,9±0,2 лог юнитов.

- 18 024794

Пример 3. Экспрессия модифицированных вариантов ρ1ιίΙ<Ζβρ144 и ЕЬдр188 в Ρίαίιία ракИогН в качестве хозяина для нетоксичного рекомбинантного воспроизведения.

Открытую рамку считывания, кодирующую Р0ЬУ-др144 (8ЕЦ ГО N0: 35), клонировали в ρΡΙΟΖαΛ шаттл-векторе Опуйгодеп), который затем интегрировали в геном Ρ. ракйэпк путем гомологенного рекомбинирования (в соответствии с указаниями компании-производителя; клетки Р. раЛогН Х33, НиНгодеп). Рекомбинирование гена индуцировали при помощи метанола (1%) в ΒΜΜΥ-среде, супернатат проанализировали на предмет наличия энзимной активности по истечении 1, 3 и 4 дней. Затем, супернатат в объеме 30 мкл экспрессионной культуры Ρ. РакИогН добавили к 270 мкл хлороформ-пермеабилизированных клеток Р. аегидшока РА01р (Риму РР. е( а1. (2003), I. СЬи М1сгоЫо1., 41(3):1192-1202) после 1, 3 и 4 дней (буферные условия: КН₂Р0₄/К₂НР0₄ I = 120 мМ рН 6,2). Затем, измерили при помощи спектрофотометрии оптическую плотность (фиг. 2). Снижение показателей оптической плотности свидетельствует о секреции муралитического энзима Р. ра5(оп5. В качестве отрицательного контроля добавили Р. ра5(оп5 Х33 без экспрессионного плазмида. Таким образом, лизис субстрата после добавления образца супернатата является показателем успешного рекомбинантного воспроизводства и секреции Ρ0^Υ-дρ144 (8ЕЦ ГО N0: 35) клетками Р. ракйпк. По истечении 1 дня можно наблюдать ограниченную энзиматическую активность. Максимальную активность наблюдали по истечении 3 дней, поскольку на четвертый день отсутствовали признаки сколь-нибудь значительного повышения активности супернататов. Также не наблюдалось токсического эффекта на плотность клеток Р. раЧогН.

Во время экспрессии Р. ракИогН, α-секреционный сигнал вектора вызывает секрецию рекомбинантного протеина в окружающую среду, что позволяет облегчить очистку, поскольку секрецировалось только ограниченное число других протеинов. Сайт рестрикции ВатН1 в 5' конце открытой рамки считывания позволяет добавить больше кассет, кодирующих дополнительные поликатионные пептидные цепочки.

Пример 4. Модифицированные варианты эндолизина р1йКХдр144 с различными поликатионными пептидными цепочками.

Для испытания и сравнения потенциала поликатионных пептидов ρΗ^КΖдρ144 синтезировали варианты других эндолизинов, кодирующих гены, с различными поликатионными пептидами в Д-конце протеина. Варианты с пептидными цепочками различаются по длине, составу и инсерции связывающих последовательностей. С одной стороны, получили поликатионные пептидные цепочки с мультиплицированными Ц-концами ККК мотива. С другой стороны, получили поликатионные пептидные цепочки, состоящие только из аргинина (К) или лизина (К). Более того, для улучшения трансляции длинных поликатионных пептидных цепочек, получили поликатионные пептидные цепочки, содержащие связывающую последовательность.

В экспрессионном векторе рЕТ32Ь (№уадеп, Эагт51аб1, Оегтапу) клонировали различные продукты для уменьшения потенциальной токсичности поликатионного пептида в отношении хозяина Е.соН. Кодированный в векторе слитый протеин (тиоредоксин) маскирует поликатионный пептид и может быть устранен во время процесса очистки.

Аналогичным образом, следующие модифицированные варианты эндолизина экспрессировали в клетках Е.соН ВЬ21 (ΌΕ3) при 37°С до достижения показателя оптической плотности 0Э_600НМ=0,6. Затем протеиновую экспрессию индуцировали с использованием 1 мМ 1РТО (конечная концентрация) и провели экспрессию в течение 4 ч. Затем вырастили клетки Е.соН центрифугированием в течение 20 мин при 6000, провели разрушение (расщепление) клеток и протеиновую очистку в соответствии с рекомендациями комплекта очистки 8-метки (№уадеп, Эагт51аб1, Оегтапу):

Модифицированный вариант экдолизина	Длина пептидной цепочки	Последовательность пептидной цепочки
рЬ,К7др144 (8ЕО Ю ΝΟ: 1)	0	-
ρΚΚΖ144рЕТ32Ь (6Е0 Ю ΝΟ: 43)	10	КККККККККК (δΕΟ Ю ΝΟ: 14)
ККК 6_рЕТ32Ь (δΕΟ ΙΟ ΝΟ: 44)	6	КККККК (δΕΟ ГО ΝΟ: 10)
ККК 12 рЕТ32Ь (ЗЕО Ю N0: 45)	12	КККККККККККК (ЗЕО ГО N0: 15)
ККК 14 рЕТ32Ь (δΕΟ Ю N0: 46)	14	КККККККККККККК (ЗЕО ГО N0: 16)
К9 рЕТ32Ь (δΕΟ Ю N0: 47)	9	ККККРКККК (ЗЕО ГО N0: 12)
К8 рЕТ32Ь (δΕΟ Ю N0: 48)	8	КККККККК (ЗЕО ГО N0: 13)
ρΚ2ΚΖ144_ρΕΤ326 то03 (ЗЕО Ю ΝΟ: 49)	38	ККККККККΚΚΟ3Θ3ΘΚΚΚΚΚΚΚΚΚΟ3 Θ3ΘΚΚΚΚΚΚΚΡΚ (ЗЕО ГО N0: 28)

Все протеины очистили с использованием 8-Тад™ гЕК РипйсаНоп КН (№уадеп, Эагт51аб1, Оегтапу). При использовании вектора рЕТ32Ь экспрессированные протеины были нетоксичны в отношении хозяина, что привело к более высокому выходу получаемого протеина. Очищенные маточные растворы

- 19 024794 показали высокий уровень очистки.

Экспоненциальные клетки (~10⁶/мл) Р. аегищпоза РАО1р (Виги \νοιιηά ίδοίαίο. Оиееп Αδΐήά ΗοδρίΙαΙ. Вги88е18; Рипау ДР е! а1. (2003), 1. С1ш М1сгоЫо1., 41 (3):1192-1202) разбавили 100 х (конечная концентрация эквивалентна ~10⁶/мл), инкубировали при комнатной температуре вместе с 10 мкг недиализированного протеина для каждого образца (немодифицированные варианты эндолизинов при конечной концентрации в 100 мкг/мл в буфере (20 мМ №Н₂РО₄-№ОН рН 7.4; 0.5 М ЫаС1; 0,5 М имидазола)). По истечении 1 ч клеточные суспензии разбавили 1:100 и поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Дополнительно, поместили в чашку Петри отрицательный контроль с использованием буфера (20 мМ №1Н₂РО₄-№ЮН рН 7.4; 0.5 М ЫаС1; 0,5 М имидазола). Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37°С. На основе подсчета числа клеток высчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию (%) (=100-(Ν₁/Νο)χ 100, где Ν₀ = число необработанных клеток, а Ν₁ = число обработанных клеток) (табл. 3). Все образцы реплицировали как минимум в четыре раза.

Таблица 3

Антибактериальный эффект эндолизинов - немодифицированных и модифицированных ρ1ιίΙ<Ζ§ρ144 и ЕЬдр188 вариантов

Модифицированный , вариант эндолизина	Последовательность пептидном цепочки	Редукция [%]
рП(Кгдр144 (ЗЕО ГО ΝΟ: 1)		0
ρΚΚΖ144ρΕΤ32ό (ЗЕО ГО ΝΟ: 43)	КККККККККК (ЗЕО ГО ΝΟ 14)	99 - 99.9
ККК, 6_рЕТ32Ь (ЗЕО ГО ΝΟ: 44)	КККККК (ЗЕО ГО N0: 10)	99.9
ККК 12_рЕТ32Ь (ЗЕО ГО N0: 45) и	КККККККККККК (ЗЕО ГО ΝΟ 15)	99 - 99.9
ККК 14_рЕТ32Ь (ЗЕО ГО ΝΟ: 46)	кккккккккккккк (ЗЕО ГО ΝΟ: 16)	99.9
К9рЕТ32Ь (ЗЕСГЮ ΝΟ: 47)	КККРККККК (ЗЕО ГО N0: 12)	99
К8_рЁТ32Ь (ЗЕО ГО ΝΟ: 48)	кккккккк (ЗЕО ГО N0 13)	99
рК2К2144д)ЕТ32Ь тойЗ (ЗЕО ГО N0:49)	ккккккккккезсзбккккккккксзсзсккккккккк (ЗЕО ГО N0' 28)	99.9

Немодифицированные р1иКХдр144 не уменьшают значительно число клеток по сравнению с отрицательным контролем. Более того, модифицированные варианты р1иКУдр144 с поликатионнопептидными Ν-конечными мультипликациями ККК мотива значительно увеличивают антибактериальную активность. Тем не менее, варианты с гомомерной пептидной цепочкой лизина или аргинина также показали значительное снижение числа клеток по сравнению с немодифицированными р1иКХдр144. К тому же вариант с поликатионной пептидной цепочкой с 38 аминокислотными остатками и связывающей последовательностью также показал значительное повышение антибактериального эффекта.

Пример 5. Модифицированные варианты эндолизина из За1топе11а (урНипипит фага Р8Р3.

РЗР3др10 в соответствии с ЗЕО ГО NО: 8 представляет собой глобулярный эндолизин со 165 аминокислотными остатками, полученный из За1топе11а (урНипипит фага РЗР3 с каталитическим лямбдамурамидазным доменом. Как показал анализ ВЬАЗТр и РГат, эндолизин РЗР3др10 содержит в себе каталитический домен в пределах от примерно 34 аминокислотного остатка до примерно 152 аминокислотного остатка.

Очищенный геном ДНК фага РЗР3 использовали в качестве образца для амплификации открытой рамки считывания (ОРС) РЗР3др10 в реакции Но! З(аг( Тас.| ро1утега§е ПЦР (01адеп. Сегтапу) со следующими параметрами ПЦР:

Для упомянутого ПЦР применили стандартный 5' праймер (5' АТСССАТССССССТСАТТААТАСТСАССАС 3' (З1Т) ГО 50)) и стандартный 3' праймер (5' ТСССАТСАСССССССАССССТС 3' (ЗЕО ГО NО: 51)). Для удлинения 5' конца открытой рамки считывания, кодирующей РЗР3др10 с фрагментом гена, кодирующего поликатионный 9-мерный пептид Тук-Агд-Тук-Тук-Агд-Тук-Тук-Агд-Ьук (ЗЕО ГО NО: 11), применили хвост ПЦР (Но! З!аг! Тас.| ро1утега§е ПЦР с аналогичными параметрами) с удлиненным 5' праймером (5'АТСССАТССАААСССААСАААССТААСАААСССАААССССТСАТТАА ТАСТСА ССАС 3' (ЗЕО ГО NО: 52)) и стандартный 3' праймер в соответствии с ЗЕО ГО NО: 51. Оригинальный немодифицированный РЗР3др10 ПЦР фрагмент и пируваткиназа(ПК)-удлиненный фрагмент лигандировали в рЕХР5СТ/ТОРО® экспрессионном векторе Дпуйгодеп, СагНЬак, СА, ИЗА), следуя про- 20 024794 токолу ТА-клонирования компании-производителя.

Рекомбинантную экспрессию ΡδΡ3др1О в соответствии с δΕΟ ΙΌ NΟ: 8 РК^Р3др10 в соответствии с δΕΟ ΙΌ NΟ: 53 провели в экспоненциально растущих клетках Е.сок ВЬ21 (АЭЕ3) р^узδ (1пуЬгодеп) после индукции с 1 мМ 1РТ0 (изопропилтиогалактозид) при 37°С в течение 4 ч. Оба протеина подвергли очистке с использованием Νί²⁺ аффинной хроматографии (Ак1а РРЬС, 0Е Неакксаге), применяя Сконечную 6хН1з-метку, кодированную рЕХР5СТ/ТОРО® экспрессионным вектором. Νί²⁺ аффинную хроматографию провели в 4 последующих этапа, все при комнатной температуре.

1. Эквилибрация Шзйар НР 1 мл колонки (0Е Неакксаге) с 10 объемами колонки отмывочного буфера (60 мМ имидазола, 0.5 мМ №С1 и 20 мМ NаН₂ΡΟ₄-NаΟН при рН 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин.

2. Загрузка всего лизата (с требуемым объемом эндолизина) в Шзйар НР 1 мл колонки при скорости потока 0,5 мл/мин.

3. Отмывка колонки с 15 объемами колонки отмывочного буфера при скорости потока 1 мл/мин.

4. Элюирование связанного эндолизина из колонки с 10 объемами колонки элюирующего буфера (500 мМ имидазола, 5 мМ №С1 и 20 мМ NаН₂ΡΟ₄-NаΟН при рН 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин.

Общий выход обоих очищенных рекомбинантных протеинов на 1 л экспрессионной культуры Е.сок приведен в табл. 4. Значения определили при помощи спектрофотометрического измерения протеиновой концентрации, а общий объем очищенного маточного раствора - при длине волны 280 нм. Очищенные маточные растворы, состоящие из ΡδΡ3др10 и ΡКΡδΡ3др10 соответственно, в элюирующем буфере (20 мМ NаН₂ΡΟ₄-NаΟН рН 7,4; 0,5 М №С1; 500 мМ имидазола) показали степень чистоты как минимум 90%, как определено визуально на δΌδ-РАОЕ (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) гелях.

Таблица 4

Выход очищенного рекомбинантного ΡδΡ3др10 эндолизина и его модифицированного варианта РК^Р3др10 на 1 л экспрессионной культуры Е.сок

Эндолизины	Экспрессионный выход
РЗРЗдрЮ (ЗЕО Ю ΝΟ: 8)	2,15 мг
РКРЗРЗдрЮ (ЗЕО Ю ΝΟ: 53)	5,56 мг

Для определения антиграмотрицательного спектра РК^Р3др10 эндолизина в соответствии с δΕ^ ΙΌ NΟ: 53, испытали комбинацию 1,315 мкМ РК^Р3др10 эндолизина и 0,5 мМ ЭДТК на клинических штаммах Р. аегидтоза РАО1р и Вг667, Езсйег1сЫа сой №К6, и δа1тоηе11а 1урЫтигшт (см. табл. 5). Экспоненциально растущие бактериальные клетки (ОО_600пт 0.6), разбавленные в 100 раз до конечной плотности примерно 10⁶/мл каждого штамма, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре без встряхивания, с немодифицированным эндолизином ΡδΡ2др10 (ЬЕЦ ΙΌ NΟ: 8) и модифицированным эндолизином РК^Р3др10 (ЬЕЦ ΙΌ NΟ: 53), каждый образец в комбинации без и вместе с 0,5 мМ ЭДТК. Для инкубации оба эндолизина использовали в буфере (20 мМ NаН₂ΡΟ₄-NаΟН рН 7.4; 0,5 М №С1; 0,5 М имидазола), причем инкубацию провели при конечной концентрации эндолизина 1.315 мкМ. В качестве контроля каждый штамм также подвергли инкубации в течение 30 мин с 0,5 мМ ЭДТК (в таком же, как и вышеупомянутый буфер), но без эндолизина.

Таблица 5

Перечень применяемых грамотрицательных штаммов

Грамотрицательный штамм

Рзеис/отспаз аегидтоза РА01р Рзеиботопаз аегидтоза Вг6б7 ЕзсЬепсЫа соЛ'УУКб

8а1топе11а 1ур1йтипит 1_Т2

Источник

Вигп νκχιηά 1зо1а1е, Оиееп Αείιϊά Нозрйа!, Вгиззе1з Вит «<оипс115о1а(е, Оиееп Аз1пс) Нозр|(а1, Вгиззе1з Стандартный лабораторный экспрессионный штамм

Библиографическая ссылка

Р|гпау е( а!., 2003 Ркпау е( э/„ 2003* РгоГ С. М1сЫе1з

РгоГ. С. М!сЫе1з

563С № 2317 * Р1гпау !Р. е1 а1. (2003). Мо1еси1аг ерДетЫоду оГ Рзеийотопаз аегидтоза со1ош/акоп ίη а Ъит ипЬ: регз,з1епсе оГ а тиШйгид-гез1з1ап1 с1опе апй а зкуег зи1ГаШа/те-гез1з1ап1 с1опе. ί. Скп МкгоЫоЕ, 41 (3):1192-1202.

После инкубации клеточные суспензии разбавили в три раза (соответственно 10⁵-10⁴-10³ клеток/мл) и по 100 мкл каждого раствора поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37°С. На основе подсчета количества клеток рассчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию в логарифмических юнитах (=1Θ§₁₀Ν₀/Ν_ί, где Ν₀ = число необработанных клеток, а Ν₁ = число обработанных клеток) (табл. 6).

- 21 024794

Таблица 6

Антибактериальная активность немодифицированного эндолизина (Р8Р3др10) и его модифицированного варианта (РКР8Р3др10) с и без ЭДТК-№ь в отношении различных экспоненциально растущих грамотрицательных видов бактерий

	0,5 мМ ЭДТК	1,315 мкМ РЗРЗд рЮ	1,315 мкМ РКРЗРЗ др10	1,315 мкМ РЗРЗд р10+ 0,5 мМ ЭДТК	1,315 мкМ РКРЗРЗдрЮ+ 0,5 мМ ЭДТК
Р. аегидтоза РАО1р	0,146 +/- 0,002	0,383 +/- 0,015	0,344 +/0,163	3,552 +/- 0,536	>4,146
Р. аегидтоза Вг667	0,223 +/- 0..038	0,375 +/- 0,056	0,353 +/0,086	0,571 +/- 0,035	0,891+/-0,118
8а1топе11а (урЫтипит	0,104 +Ζ-	0,283 +Ζ-	0,327 +/0,057	0,690 +/- 0,036	0,850 +/- 0,032
	0,049	0,038
ЕзсЬепсМа сой’ЖКб	0,393 +/- 0,035	0,190 +/- 0,029	0,205 +/0,088	0,387 +/- 0,014	0,584 +/- 0,024

Все образцы реплицировали три раза. Представлены средние +/- стандартные девиации. Максимальная наблюдаемая редукция зависит от уровня детекции 10 клеток/мл и первоначальной плотности клеток. В случае РА01р, ЭДТК наблюдается синергическое действие, как с немодифицированным Р8Р3др10 эндолизином, так и с его модифицированным вариантом РКР8Р3др10.

Пример 6. Модифицированные варианты эндолизина из ЕксйейсЫа сой фага Р2.

Р2др09 в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 9 представляет собой глобулярный эндолизин со 165 аминокислотными остатками, полученный из ЕксйейсЫа сой фага Р2 с каталитическим лямбда-мурамидазным доменом. Как показал анализ ВЬАЗТр и РГат, эндолизин Р2др09 содержит в себе каталитический домен в пределах от примерно 34 аминокислотного остатка до примерно 152 аминокислотного остатка.

Очищенный геном ДНК фага Р2 использовали в качестве образца для амплификации открытой рамки считывания (ОРС) Р2др09 в стандартной ПЦР реакции с РГи полимеразой (Регтейак), со следующими параметрами ПЦР:

95°С 15’ 94°С 1* 52°С 1’ 72°С 2' 72°С1Е/ 4°С » циклов

Для упомянутого ПЦР применили стандартный 5' праймер (5' АТСССАТССССССТААТТААСАСССАТС 3' (8ЕЦ ГО N0: 54)) и стандартный 3' праймер (5' АСССССТАСССССССАССССТАССС 3' (8ЕЦ ГО N0: 55)). Для удлинения 5' конца открытой рамки считывания, кодирующей Р2др09 с фрагментом гена, кодирующего поликатионный 9-мерный пептид Рук-Агд-Рук-РукАгд-Рук-Рук-Агд-Рук (8ЕЦ ГО N0: 11), применили хвост ПЦР (с аналогичными параметрами, как и упомянутый выше стандартный ПЦР) с удлиненным 5' праймером (5' АТСССАТССАААСССААСАААССТААСАААСССАААССССТААТТААСАСССАТ С 3' (8ЕЦ ГО N0: 56) и стандартный 3' праймер в соответствии с 8ЕЦ ГО N0 55. Оригинальный немодифицированный Р2др09 ПЦР фрагмент и удлиненный фрагмент лигандировали в рЕХР5СТ/ТОРО® экспрессионном векторе Дпуйгодеп, СайкЪай, СА, И8А), следуя протоколу ТА-клонирования компании-производителя.

Рекомбинантную экспрессию Р2др09 в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 9 и РКР2др09 в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 57 провели в экспоненциально растущих клетках Е.сой ВЬ21 (АОЕ3) рЬукЗ Дпуйгодеп) после индукции с 1 мМ 1РТС (изопропилтиогалактозид) при 37°С в течение 4 ч. Оба протеина подвергли очистке с использованием №²+ аффинной хроматографии (Ак1а РРЬС, СЕ Неаййсаге) применяя Сконечную 6хН1к-метку, кодированную рЕХР5СТ/ТОРО® экспрессионным вектором. Тйе №²+ аффинную хроматографию провели в 4 последующих этапа, все при комнатной температуре.

1. Эквилибрация Нййар НР 1 мл колонки (СЕ Неаййсаге) с 10 объемами колонки отмывочного буфера (60 мМ имидазола, 0,5 мМ №·ιθ и 20 мМ NаН₂Р0₄-Nа0Н при рН 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин.

2. Загрузка всего лизата (с требуемым объемом эндолизина) в Нййар НР 1 мл колонки при скорости потока 0,5 мл/мин.

3. Отмывка колонки с 15 объемами колонки отмывочного буфера при скорости потока 1 мл/мин.

4. Элюирование связанного эндолизина из колонки с 10 объемами колонки элюирующего буфера (500 мМ имидазола, 5 мМ №С’1 и 20 мМ NаН₂Р0₄-Nа0Н при рН 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин.

- 22 024794

Общий выход обоих очищенных рекомбинантных протеинов на 1 л экспрессионной культуры Е.соП приведен в табл. 7. Значения определили при помощи спектрофотометрического измерения протеиновой концентрации, а общий объем очищенного маточного раствора при длине волны 280 нм. Очищенные маточные растворы, состоящие из Р2др09 и РКР2др09 соответственно, в элюирующем буфере (20 мМ NаН₂Р0₄-Nа0Н рН 7.4; 0,5 М №С1; 500 мМ имидазола) показали степень чистоты как минимум 95%, как определено визуально на 8Э8-РАСЕ (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) гелях.

Таблица 7

Выход очищенного рекомбинантного Р2др09 эндолизина и его РК-модифицированного производного РКР2др09 на 1 л экспрессионной культуры Е.соП

Эвдолизины	Экспрессионный выход
Р2др09 (5Е0 Ю ΝΟ: 9)	5,52 мг
РКР2дрО9 (ЗЕО Ю ΝΟ: 57)	3,40 мг

Для определения антиграмотрицательного спектра РК2др09 эндолизина в соответствии с 8ЕО ГО N0: 57, испытали комбинацию 1,315 мкМ РК2др09 эндолизина и 0,5 мМ ЭДТК на клинических штаммах Р. аегидшока РА01р и Вг667 и на ЕксПепсЫа соН \УК6 (см. табл. 9). Экспоненциально растущие бактериальные клетки (0Э_600НМ из 0,6) разбавленные в 100 раз до конечной плотности примерно 10⁶/мл каждого штамма, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре без встряхивания, с немодифицированным эндолизином Р2др09 (8ЕО ГО N0: 9) модифицированным эндолизином РКР2др09 (8Е0 ГО N0: 57) каждый образец в комбинации без и вместе с 0,5 мМ ЭДТК. Для инкубации оба эндолизина использовали в буфере (20 мМ NаН₂Р0₄-Nа0Н рН 7.4; 0,5 М №С1; 0,5 М имидазола) причем инкубацию провели при конечной концентрации эндолизина 1,315 мкМ. В качестве контроля, каждый штамм также подвергли инкубации в течение 30 мин с 0,5 мМ ЭДТК (в таком же, как и вышеупомянутый буфер), но без эндолизина. После инкубации клеточные суспензии разбавили в три раза (соответственно 10⁵-10⁴-10³ клеток/мл) и по 100 мкл каждого раствора поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37°С. На основе подсчета количества клеток рассчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию в логарифмических юнитах (Иодю^/И,, где N = число необработанных клеток, а N = число обработанных клеток, оба показателя рассчитаны после инкубации) (табл. 8).

Таблица 8

Антибактериальная активность немодифицированного эндолизина (Р2др09) и его модифицированного варианта (Р2др09) с и без ЭДТК-Иа₂ в отношении различных экспоненциально растущих грамотрицательных видов бактерий

	0,5 мм ЭДТК	1,315 МкМ Р2др09	1,315 МКМ РКР2дрО9	□	1,315 мкМ Р2дрО9 + 0,5 мМ ЭДТК	1,315 мкМ РКР2дрО9 + 0,5 мМ ЭДТК	□
Р. аегидтоза ΡΑΟΙρ	0,330 +/- 0,146	0,374 +/- 0,084	0,326 +/0,069	0,038	2,840 +/0,079	3,172 +/0,056	0,33 2
Р. аегидтоза В/667	0,003 +/- 0,051	0,246 +/- 0,042	0,300 +/0,062	0,054	0,582 +/0,074	0,952 +/0,213	0,37 0
Р. риИ<1а 61	0,072 +/- 0,084	0,419 +/- 0,024	1,014+/- 0,139	0,595	3,919 +/0,118	> 4,386	>0,4 67
ВигкЬоМег /а рзеш/отэ! №	0,206 +/- 0,151	0,769 +/- 0,110	1,163 +/0,073	0,394	3,890 +/0,056	4,255 +/0,001	0,36 5
ЕзсЬепсЫ а соИЧЧКб	0,153 +/- 0,046	0,751 +/- 0,053	1,104+/- 0,039	0,353	0,784 +/0,071	1,545 ♦ΐΟ,102	0,74 9

Все образцы реплицировали три раза. Представлены средние +/- стандартные девиации. Максимальная наблюдаемая редукция зависит от уровня детекции 10 клеток/мл и первоначальной плотности клеток.

- 23 024794

Перечень применяемых грамотрицательных штаммов

Таблица 9

Грамотрицательный штамм

Источник

Библиографическая ссылка

РзеиРотопаз аегидтоза РАО1р РзеиРотопаз аегидтоза Вг667 ВиМнМепа рзеиРотаНе/ ЕзсРепсЫа соИ ννΚ6

РзеиРотопаз риИРа 61

Вигп «тайпе! 15о1а1е, Оиееп Аз(пс) Но5рйа1, ВгизЕе1з Вит тоипй 15о1а(е, Оиееп ΑϊΙπά Новрйа!, Вгиззе18 СНп!са11во1а1е, ί)Ζ ОазНппаЬегд, Ьеиуеп

Стандартный лабораторный экспрессионный штамм δοί! 18о1а(е, Мовкож

Ртпау е( а/., 2003' Ρίι-пау е1а1„ 2003' РгоТ 1 УегПаедеп

РгоТ С. ΜίοήίβΙβ

Рго1\ЛКгу1оу * РНпау !Р. е1 а1. (2003). Мо1еси1аг ер1йетю1оду оГ Ркеийотопак аегцдшока со1ош/аНоп ίη а Ьит ипй: регк181епсе оГ а тиШйгидге8181ай с1опе апй а кйуег ыПГаШа/те-гетЧат с1опе. ί. СНп МюгоЬю1., 41 (3):1192-1202.

Пример 7. Модифицированные варианты эндолизина из Ркеийотопак ри11Йа фага ОВР.

0ВР§рЬУ8 в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 7 представляет собой модульный эндолизин с 328 аминокислотными остатками, полученный из Ркеийотопак риНйа фага ОВР с рййке Ν-конечными пептидогликан-связывающими доменами и С-конечным каталитическим хитиназным доменом. Как показал анализ ВЬА8Тр и РГат, эндолизин 0ВР§рЬУ8 содержит в себе каталитический домен в пределах от примерно 126 аминокислотного остатка до примерно 292 аминокислотного остатка и Ν-конечный пептидогликан-связывающий домен в пределах примерно с 7 по 96 аминокислотные остатки.

Очищенный геном ДНК фага ОВР использовали в качестве образца для амплификации открытой рамки считывания (ОРС) 0ВРдрЬУ8 в стандартной ПЦР реакции с РГи ро1утегаке (РегтеШак, 0йагю, Сапайа), со следующими параметрами ПЦР:

95“С 2'

95°С 30 56°С 30 72°С 2’30” циклов

72°С 10’

4°С“

Применили стандартный 5' праймер (5' АТОАААААТАОСОАОААОААТ 3' (8ЕЦ ГО N0: 58)) и стандартный 3' праймер (5' ААСТАТТССОАОТОСТТТСТТТОТ 3' (8ЕЦ ГО N0: 59)). Для удлинения 5' конца открытой рамки считывания, кодирующей 0ВРдрЬУ8 с фрагментом гена, кодирующего поликатионный 9-мерный пептид Ьук-Агд-Ьук-Ьук-Агд-Ьук-Ьук-Агд-Ьук- (8ЕЦ ГО N0: 11), применили хвост ПЦР (с аналогичными параметрами, как и упомянутый выше стандартный ПЦР) с удлиненным 5' праймером (5' АТОООАТССАААСОСААОАААСОТААОАААСОСААААААААТАОСОАОААОААТ 3' (8ЕЦ ГО N0: 60)) и стандартный 3' праймер в соответствии с 8ЕЦ ГО N0 59. Оригинальный немодифицированный 0ВРдрЬУ8 ПЦР фрагмент и удлиненный фрагмент лигандировали в рЕХР5СТ/ТОРО® экспрессионном векторе ДпуНгодеп Саг1кЬай, СА, И8А) следуя протоколу ТА-клонирования компаниипроизводителя.

Рекомбинантную экспрессию 0ВРдрЬУ8 в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 7 и РК0ВРдрЬУ8 в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 61 провели в экспоненциально растущих клетках Е.соН ВЬ21 (/ГОЕ3) рЬук8 ДпуНгодеп) после индукции с 1 мМ 1РТ0 (изопропилтиогалактозид) при 37°С в течение 4 ч. Оба протеина подвергли очистке с использованием №²⁺ аффинной хроматографии (Ак1а РРЬС, ОЕ НеаННсаге) применяя Сконечную 6хН18-метку, кодированную рЕХР5СТ/ТОРО® экспрессионным вектором. №²⁺ аффинную хроматографию провели в 4 последующих этапа, все при комнатной температуре.

1. Эквилибрация ШкКар НР 1 мл колонки (ОЕ НеаННсаге) с 10 объемами колонки отмывочного буфера (60 мМ имидазола, 0,5 мМ №-1С1 и 20 мМ NаН₂Ρ0₄-Nа0Н при рН 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин.

2. Загрузка всего лизата (с требуемым объемом эндолизина) в ШкКар НР 1 мл колонки при скорости потока 0,5 мл/мин.

3. Отмывка колонки с 15 объемами колонки отмывочного буфера при скорости потока 1 мл/мин.

4. Элюирование связанного эндолизина из колонки с 10 объемами колонки элюирующего буфера (500 мМ имидазола, 5 мМ №С1 и 20 мМ NаН₂Ρ0₄-Nа0Н при рН 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин.

Общий выход обоих очищенных рекомбинантных протеинов на 1 л экспрессионной культуры Е.соН приведен в табл. 10. Значения определили при помощи спектрофотометрического измерения протеиновой концентрации, а общий объем очищенного маточного раствора при длине волны 280 нм. Очищенные маточные растворы, состоящие из 0ВРдрЬУ8 и РК0ВРдрЬУ8 соответственно, в элюирующем буфере (20 мМ NаН₂Ρ0₄-Nа0Н рН 7,4; 0,5 М №С1; 500 мМ имидазола) показали степень чистоты как минимум

- 24 024794

90%, как определено визуально на 8Э8-РА0Е (аббревиатура метода электрофореза в полиакриламидном геле) гелях.

Таблица 10

Выход очищенного рекомбинантного ΟВРдр^Υ8 эндолизина и его РК-модифицированного производного РКΟВРдр^Υ8 на 1 л экспрессионной культуры Е.соН

Эндолизины	Экспрессионный выход
0ВРдр1_У5 (ЗЕО Ю N0: 7) РК0ВРдр1_У5 (5ЕО ΙΟ ΝΟ: 61)	3,3 мг 4,7 мг

Для определения антиграмотрицательного спектра РКΟВРдр^Υ8 эндолизина в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 61, испытали комбинацию 1,313 мкМ РК 0ВРдр^Υ8 эндолизина и 0,5 мМ ЭДТК на клинических мультирезистентных штаммах Р. аегидтоза Вг667, РзеиНотопаз риНйа 01 (хозяин фага ОВР) и на гамме других грамотрицательных патогенов (ЕзсНепсЫа соН \УК6, 8а1топе11а (урНтшпит ЬТ2 и ВигкНоИепа рзеийотаПеО (см. табл. 12). Экспоненциально растущие бактериальные клетки (ΟΌ_600πιη из 0,6) разбавленные в 100 раз до конечной плотности примерно 10⁶/мл каждого штамма инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре без встряхивания, с немодифицированным эндолизином 0ВРдр^Υ8 (8ЕЦ ГО N0: 7) и модифицированным эндолизином РК0ВРдр^Υ8 (8ЕЦ ГО N0: 61), каждый образец в комбинации без и вместе с 0,5 мМ ЭДТК. Для инкубации оба эндолизина использовали в буфере (20 мМ NаΗ2РΟ4-NаΟΗ рН 7,4; 0,5 М №С1; 0,5 М имидазола), причем инкубацию провели при конечной концентрации эндолизина 1,313 мкМ. В качестве контроля, каждый штамм также подвергли инкубации в течение 30 мин с 0,5 мМ ЭДТК (в таком же, как и вышеупомянутый буфер), но без эндолизина. После инкубации клеточные суспензии разбавили в три раза (соответственно 10⁵-10⁴-10³ клеток/мл) и по 100 мкл каждого раствора поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37°С. На основе подсчета количества клеток, рассчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию в логарифмических юнитах (=1од10^/ЭД, где Ν₀ = число необработанных клеток, а Ν₁ = число обработанных клеток, оба показателя рассчитаны после инкубации) (табл. 11). Все образцы реплицировали в три раза. Средние +/- стандартные девиации приведены. Максимальная редукция зависит от уровня детекции в 10 клеток/мл и первоначальной клеточной плотности.

Таблица 11

Антибактериальная активность немодифицированного эндолизина (0ВРдр^Υ8) и его модифицированного варианта (РК0ВРдр^Υ8) с и без ЭДТК-Ыа₂ на различных экспоненциально растущих грамотрицательных видах бактерий

	0,5 мМ ЭДТК	1,313 мкМ ОВРдр 1_Υ5	1,313 мкМ РКОВРдр ίΥ3	1,313 мкМ ОВРдрЬУЗ + 0,5 мМ ЭДТК	1,313 мкМ РКОВРдр1_У5+ 0,5 мМ ЭДТК
Р. аегидтоза РАО1р	0,130 +/- 0,023	2,531 +/- 0,173	3,079 +/-0,015	4,357 +/- 1,857	> 5,687
Р. аегидтоза Вг667	0,031 +/- 0,023	1,082 ΓΙΟ,083	1,163 +/- 0,063	3,144 +/- 0,223	5,272 +/- 0,573
Р. ри1Ма <31	0,412 +/- 0,055	0,141 +/- 0,027	0,904 +/- 0,079	4,891 +/- 0,000	> 4,891
ВигМюкЛег га рзеидота!	0,220 +/- 0,081	0,997 +/- 0,131	1,806 +/- 0,287	4,08 +/- 0,301	>4,861
ЕзсЬепсЫ а со/ί «Кб	0,592 +/- 0,113	0,681 +/- 0,032	1,434 +/-0,018	1,179 +/- 0,200	1,695 +/- 0,147
5а1топе11а 1урМтили т	0,054 +/- 0,048	0,076 +/- 0,011	0,127 +/-0,013	0,774 +/- 0,052	0,908 +/-0,037

- 25 024794

Таблица 12

Перечень применяемых грамотрицательных штаммов

Грамотрицательный штамм	Источник	Библиографическая ссылка
Рзеис/отопаз аегидтоза РАСИр	Вигп даоипб 1во1а1е, Оиееп Αδίπά НозрЦа!, Вгиз8е1з	Рнпау е? а/, 2003
Рзеиботопаз аегидтоза Вг667	Вигп даоипй 18о1а1е, Оиееп Аз1пс1 Но8р|(а1. Вгиззе1з	Рнпау е1 а/., 2003’
Рзеиботопаз ро/к/а С1	βοίΙ 18о1а1е, Мозкои/	РгоТУ.Кгук^
ВигкЬоШепа рзеисктаНе!	ΟίηίοβΙ 18о1а(е, υΖ 0а51Ни1зЬегд, Ьеиуеп	РгоТ ό. Х/егПаедеп
ЕзскепсЫа соПУУМэ	Стандартный лабораторный экспрессионный штамм	31га1адепе
ЗайпопеНа {урШтипит 1Т2	ЗС5С№2317	РгоТ С. ΜίοΗίβΙβ

* Рнпау ТР., Эе Уок Ό., Соске/ С., Вкосс.] Р., Рпъоп 1., 81гие1епк М.,

Пшпк1аедег Ь., Согпекк Р., Ζίζί М., Уапкегке1еп А. (2003). Мо1еси1аг ерШетю1оду оН Ркеикотопак аегидшока соЮШакоп т а Ьигп ипк: регк!к1епсе оН а тиШкгид-гекМат с1опе апН а ккуег киНа^-итегек1к1ап1 с1опе. I. СНп М1сгоЬю1., 41 (3):1192-1202.

Поскольку общий эффект лечения при помощи ОВРдрЬУ8 зависит от вида бактерий, данные в табл. 11 показывают добавочный эффект РКОВРдрЬУ8 по сравнению с немодифицированным ОВРдрЬУ8 в отношении всех испытуемых видов бактерий, как в отсутствии, так и в присутствии 0,5 мМ ЭДТК. Для РкеиНошопак и ВигкНоИегга, наблюдается выраженный синергический эффект с ЭДТК в активности РКОВРдрЬУ8.

Пример 8. Влияние различной концентрации ЭДТК на антибактериальную активность ОВРдрЬУ8 и РКОВРдрЬУ8.

Для определения влияния ЭДТК на антибактериальную активность немодифицированного и модифицированного эндолизинов, антибактериальную активность немодифицированного ОВРдрЬУ8 эндолизина (8ЕО ГО ЫО: 7) и РКОВРдрЬУ8 эндолизина (8ЕО ГО ЫО: 61) испытали на клетках РкеиНошопак аегидшока РАО1р (Рнпау 1Р е( а1. 1. СНп М1сгоЬю1., 41(3): 1192-1202 (2003)), с использованием различных концентраций ЭДТК и эндолизинов.

Экспоненциально растущие бактериальные клетки (ОО_600НМ из 0,6) разбавили в 100 раз до достижения показателя конечной плотности примерно 10⁶/мл и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре без встряхивания вместе с немодифицированным эндолизином ОВРдрЬУ8 (8ЕО ГО ЫО: 7) и модифицированным эндолизином РКОВРдрЬУ8 (8ЕО ГО ЫО: 61). Для инкубации каждый тип эндолизина использовали в буфере (20 мМ ЫаН2РО4-ЫаОН рН 7,4; 0,5 М ЫаС1; 0,5 М имидазола) при конечных концентрациях эндолизина 0,013; 0,131 и 1,315 мкМ. При этом использовали различные концентрации ЭДТК: 0; 0,05; 0,5 и 10 мМ. В качестве контроля, инкубировали также один образец в течение 30 мин без эндолизина, вместо которого использовали добавочный буфер (20 мМ ЫаН2РО4-ЫаОН рН 7,4; 0,5 М ЫаС1; 0,5 М имидазола). После инкубации клеточные суспензии разбавили в три раза (соответственно, 10⁵-10⁴-10³ клеток/мл) и по 100 мкл каждого раствора поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Пересчитали остаточные колонии после ночной инкубации при 37°С. На основе подсчета числа клеток, рассчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию в логарифмических юнитах (=1од10Ы₀/Ы₁, где Ы₀ = число необработанных клеток, а Ы₁ = число обработанных клеток, расчеты проводились в обоих случаях после инкубации) (табл. 13). Все образцы реплицировали в три раза. Средние +/стандартные девиации приведены. По результатам анализа, максимальное уменьшение (5,69 лог-юнитов) зависит от уровня детекции 10 клеток/мл и первоначальной клеточной плотности. Δ показывает разницу в показателях активности соответствующих образцов ОВРдрЬУ8 и РКОВРдрЬУ8.

- 26 024794

Таблица 13

Антибактериальный эффект немодифицированного эндолизина (ΟΒΡ§ρΕΥδ) и его модифицированного варианта (ΡΚΟΒΡ§ρΕΥδ) в комбинации с различными концентрациями ЭДТК в отношении экспоненциально растущих клеток Ρкеиάотоηак аегидшока ΡΑΟ1ρ

Концентрация ЭДТК-Ма₂ (мМ)

	0	0,05	0,5	10
Без эндолизина	/	0,028 +/0,008	0,130+/- 0,023	1,827 +/0,052
0,013 мкМ ОВРдрЬУЗ	0,956 +/0,110	/	4,626 +/0,287	/
0,013 мкМ РКОВРдрЬУЗ	0,992 +/0,181	/	5,204 +/0,000	/
□	0,036		0,578
0,131 мкМ ОВРдрЬУЗ	2,158+/- 0,027	/	4,599 +/0,275	/
0,131 мкМ РК0ВРдр1 УЗ	2,529 +/0,184	/	5,671 +/0,000	/
□	0,371		1,072
1,315 мкМ ОВРдрЬУЗ	2,531+/- 0,173	2,762 +/0,091	4,357+/- 1,857	4,888 +/0,275
1,315 мкМ РКОВРдрЬУЗ	3,079 +/0,015	4,145 +/0,015	> 5,687	>5,687
□	0,548	1,383	>1,330	> 0,799

Как следует из табл. 13, немодифицированный эндолизин ΟΒΡβρΕΥδ уменьшают значительно число клеток с более чем 2,5 лог-юнитов для 1,315 мкМ и с +/- 1 лог-юнит для 0,013 мкМ, по сравнению с отрицательным контролем. Модифицированный эндолизин ΡΚΟΒΡβρΕΥδ показывает уменьшение в дополнительные 0,5 лог-юнитов в отношении экспоненциально растущих ΡΑΟ1ρ клеток. Наблюдаемый антибактериальный эффект можно увеличить вплоть до редукции в 5,69 лог-юнитов (ниже уровня обнаружения) путем комбинирования ΡΚΟΒΡβρΕΥδ с пермеабилизатором внешней мембраны ЭДТК-Ыа₂ при концентрации 0,5 и 10 мМ ЭДТК. Различие в активности между немодифицированным ΟΒΡβρΕΥδ и пируваткиназа(ПК)-модифицированным ΟΒΡβρΕΥδ повышается при увеличении количества добавляемого эндолизина (начиная с 0,013-1,315 мкМ эндолизина).

Пример 9. Антибактериальная активность модифицированных вариантов ρЫΚΖдρ144 в отношении различных грамотрицательных бактерий.

Для испытания и сравнения потенциала поликатионных пептидов ρ1ιίΚΖ§ρ144 и других эндолизинов, синтезировали кодирующие гены, с различными поликатионными пептидами в Ν-конце протеина.

В экспрессионном векторе ρΕΤ32Ь (Шуадеп, Оагтк1аб1, Сегтапу) клонировали различные продукты, для уменьшения потенциальной токсичности поликатионного пептида в отношении хозяина Е.соН. Кодированный в векторе слитый протеин (тиоредоксин) маскирует поликатионный пептид и может устранении во время процесса очистки.

Гены, кодирующие кпи01 (ΥΡ_001712536) и ΚΚΚ9_кт^01 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 75), полностью синтезировали (Еп1е1есНоп, КедепкЬигд, Сегтапу) и клонировали в ρΕΤ32Ь.

Аналогичным образом, следующие модифицированные варианты эндолизина экспрессировали в клетках Е.соН ВЬ21 ГОЕ3) при 37°С до достижения показателя оптической плотности ΟΌ_600ΗΜ=0,6: ктЮ1 (ΥΡ_001712536), ΚΚΚ9_^01 (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 75), ρΗ^ΚΖдρ144 (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 1), ρΚΚΖ144ρΕΤ32Ь (8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 43) и ΡΟΌΥΚΖ144 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 35). Протеиновую экспрессию индуцировали с использованием 1мМ ГОТС (конечная концентрация) и провели экспрессию в течение 4 ч. Затем вырастили клетки Е.соН центрифугированием в течение 20 мин при 6000д, провели разрушение (расщепления) клеток и протеиновую очистку в соответствии с рекомендациями комплекта очистки 8-Тад™ гЕ1< Ρи^^Γ^саί^оη Κίΐ (Еоуадеп, Оагтк1аН1, Сегтапу). При использовании вектора ρΕТ32Ь, экспрессированные протеины были нетоксичны в отношении хозяина, что привело к более высокому выходу получаемого протеина. Очищенные маточные растворы показали высокий уровень очистки.

Для испытаний и контрольного опыта синтезировали и очистили ρΗ^ΚΖдρ144 и ΡΟ^Υдρ144 в соответствии со способом, описанным в примере 1.

Экспоненциально (~10⁶/мл) растущие клетки Ρ. аегидшока ΡΑΟ1ρ (Вит теоипб 1ко1а1е, Циееп ΑκΙπύ Но^На^ Вгикке1к; Ρίηκιν ΙΡ. е! а1. (2003), 1. СНп МюгоЬюН, 41(3): 1192-1202), Αс^пеΐоЬасΐе^ ЬаитапН (Ό8ΜΖ 30007) или ВигкНоМепа ко1апасеит (ЩоХа’^е ρ^оν^άеά Ьу ΡιόΓ. С. МюН1е1к) разбавили 100 х (конечная плотность эквивалентна ~10⁶/мл), инкубировали при комнатной температуре вместе с 10 мкг недиализированного протеина для каждого образца при конечной концентрации в 100 мкг/мл в буфере (20 мМ

- 27 024794

МаН₂РО₄-МаОН рН 7,4; 0,5 М ЫаС1; 0,5 М имидазола). По истечении 1 ч клеточные суспензии разбавили 1:100 и поместили в чашку Петри на среду Лурия-Бертани. Дополнительно, поместили в чашку Петри отрицательный контроль с использованием буфера (20 мМ №1Н₂РО₄-№ЮН рН 7,4; 0,5 М ЫаС1; 0,5 М имидазола). Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37°С. На основе подсчета числа клеток, рассчитали антибактериальную активность как относительную инактивацию (%) (=100(Ж/Ыо)х100, где Ν₀ = число необработанных клеток, а Ν₁ = число обработанных клеток) (табл. 3). Все образцы реплицировали как минимум в четыре раза.

Таблица 14

Антибактериальный эффект различных модифицированных вариантов эндолизинов (Νί'.ΈΙ количества - в скобках) на различные виды бактерий

Протеин	Вид бактерии	Редукция [%]
5тЮ1 (ΥΡ 001712536)	Асте1оЬас1ег ЬаитаппИ 05ΜΖ 30007	0
КРКЭ втЮ1	Ас!пе1оЬас1ег ЬаитаппИ 05ΜΖ 30007	50
рГнК2др144 ,	РзеиЬотопаз аегиуюоза	0
ρΚΚΖ144ρΕΤ326 “	Раеидотопаа аеп/д^ова	99 - 99.9
рй|Кгдр144	Ас/пв1оЬас(ег ЬаитаппИ 03ΜΖ 30007	0
ρΚΚΖ144ρΕΤ326	Ас1пе1оЬас(ег ЬаитаппИ Ω3ΜΖ 30007	99,9
ρήίΚΖηρ144	ВигкЬо1с1епа зо1апасеагит	0
ΡΟΙ.ΥΚΖ144	ВигкЬок1епа зо1апасеагит	99-99,9

Немодифицированные эндолизины рЫК2др144 и ктЮ1 (УР_001712536) не уменьшают значительно число клеток по сравнению с отрицательным контролем. Данный опыт снова свидетельствует об эффективности внешней мембраны как барьера для разрушающего действия эндолизина на клеточные стенки грамотрицательных бактерий. В сравнении с приведенными в табл. 14 данными, инкубация с модифицированными эндолизинами КРК9_ктЮ1, рКК2144рЕТ32Ь и РОЬУ-др144 вызывает значительную редукцию количества бактериальных клеток в отношении Асше1оЬас1ег Ьаитапи (50% для КРК_ктЮ1; 99,9% для рКК2144рЕТ32Ь), Ркеийотопак аегидшока (90-99,9% для рКК2144рЕТ32Ь) и Вигк1ю1йепа ко1апасеит (90-99,9% для РОЬУК2144).

Данные опыты демонстрируют применимость способа катионного/поликатионного слияния для других эндолизинов. Более того, опыты убедительно продемонстрировали, что модифицированные эндолизины обладают подтвержденной антимикробной активностью в отношении целого ряда бактерий.

- 28 024794

Список последовательностей <110> КАТХОЛИКЕУНИВЕРСИТЕЙТ ЛЁВЕН <120> Антимикробные агенты <1зо> те 1-001 рст <150> СВ 0815484.1 <151> 2008-08-25 <160> 83 <170> Ра1еп11п уегзюп 3.3 <210> 1 <211> 2Θ0 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> рЫКгдр144 <400> 1

меТ 1

ьуз

уа!

ьеи

Агд 5

ьуз

С! у

Азр

дгд

С! у 10

АЗр

С! и

Уа!

Суз

с! η 15

Ьеи

С1п

тНг

ьеи

ьеи 20

АЗП

ьеи

суз

е!у

туг 25

Азр

Уа!

С! у

ьуз

Рго 30

Азр

С! у

11е

РНе

С1у 35

АЗП

АЗП

ТЬг

РЙе

АЗП 40

С! η

уа!

Уа!

ЬУ5

рйе 45

с1п

ьуз

АЗр

АЗП

Суз 50

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у 55

11 е

Уа!

с! у

Ьуз

АЗП 60

тНг

тгр

а! а

с1и

Ьеи 65

рНе

Зег

ьуз

туг

Зег 70

РГО

РГО

ΐΐ е

РГО

ьуз

тНг

т!е

РГО

меТ 80

РГО

тНг

А1а

АЗП

ьуз 85

Зег

Агд

а! а

а! а

а! а 90

тНг

РГО

уа!

МеТ

АЗП 95

А! а

уа!

с!и

АЗП

д1а 100

ТЙГ

Е1у

Уа!

Агд

Зег 105

С1п

ьеи

ьеи

ьеи

ТЬг 110

РНе

А1а

5ег

ΐΐ е

с! и 115

Зег

а! а

рНе

Азр

туг 120

С! и

ΐ! е

ьуз

а! а

ьуз 125

тКг

Зег

Зег

д!а

тНг 130

С1у

тгр

рНе

01 п

рНе 135

ьеи

тНг

С! у

тНг

тгр 140

ьуз

тНг

меТ

т1е

с!и 145

АЗП

туг

С1у

мет

ьуз 150

туг

С! у

уа!

ьеи

тНг 155

Азр

РГО

тНг

С! у

д! а 160

ьеи

дгд

ьуз

Азр

РГО 165

Агд

11 е

Зег

А! а

Ьеи 170

мет

с! у

А! а

С! и

Ьеи 175

11 е

- 29 024794

ьуз

СЗи

АЗП

меС

АЗП

11е

ьеи

лгд

РГО

УаЗ

ьеи

ьуз

дгд

СЗи

РГО

тЬг

180

185

190

АЗр

тЬг

АЗр 195

ьеи

туг

ьеи

АЗа

ΗΊ 5 200

РЬе

РЬе

сЗу

РГО

сЗу 205

АЗа

АЗа

Агд

Агд

РЬе

ьеи

тЬг

ТЬг

СЗу

СЗп

АЗП

СЗи

ьеи

лЗа

лЗа

ТЬг

НТЗ

РЬе

РГО

210

215

220

ЬУ5

СЗи

лЗа

С1п

лЗа

АЗП

РГО

Зег

13 е

РЬе

Туг

АЗП

ьуз

АЗР

сЗу

зег

225

230

235

240

РГО

ьуз

тЬг

11е

сЗп

СЗи

УаЗ

туг

АЗП

ьеи

меТ

АЗр

СЗу

ьуз

уа!

АЗа

245 250 255 дЗа нт 5 дгд ьу5 260 <210> 2 <211> 292 <212> ΡΚΤ <213> неизвестен <220>

<223> ЕЬдр188

Агд ТЬг 5

Ьуз

АЗП

СЗу

Туг Агд Азр 10

ьеи

СЗп

АЗа

ьеи 15

УаЗ

<400> Ме! 1

2 Азп РЬе

ьуз

СЗи

ьеи

СЗу

ьеи

туг

ТЬг

сЗу

сЗп

13 е

АЗР

СЗу

Уа1

тгр

сЗу

ьуз

20

25

30

СЗу

тЬг

Зег 35

Зег

Зег

тЬг

СЗи

тЬг 40

ьеи

ьеи

Агд

СЗ у

АЗа

СЗ и

УаЗ

уаЗ

СЗу

ьуз

АЗП

тЬг

сЗу сЗу

гЗе

СЗу

ьеи

РГО

тЬг

тЬг

Зег

Азр

АЗа

50

55

60

Зег

СЗу

туг

АЗП

УаЗ

Пе

ТЬг

АЗа

ьеи

СЗп

Агд

АЗП

ьеи

АЗа

рЬе

ьеи

65

70

75

80

СЗу

ьеи

туг

Зег

ьеи

тЬг

УаЗ

Азр

СЗу

тЗе

тгр

сЗу

АЗП

сЗу

тЬг

ьеи

85

90

95

Зег

СЗ у

ьеи

Азр

ьуз

аЗ а

рЬе

СЗи

УаЗ

туг

ьуз

СЗи

дгд

туг

дгд

тЬг

100

105

110

Рго

ТЬг

Туг

АЗр

Пе

аЗ а

тгр

Зег

СЗ у

ьуз

УаЗ

Зег

РГО

АЗа

рЬе

тЬг

115

120

125

лЗа

ьуз

УаЗ

ьуз

АЗр

тгр

Суз

сЗу

УаЗ

ΗΊ 5

УаЗ

РГО

АЗП

ΗΊ5

лгд

лЗа

- 30 024794

130

135

140

РГО

Н1 5

тгр

ьеи

мет

а! а

СУ 5

мет

А1а

РЬе

61 и

Тпг

б!у

С1п

тЬг

рЬе

145

150

155

160

Зег

РГО

Зег

11е

1-У5

А5П

д!а

д!а

61 у

Зег

б!и

а! а

туг

б!у

ьеи

Не

165

170

175

61 η

рНе

меТ

5ег

РГО

А1а

А1а

Агп

Агр

Ьеи

Агп

Уа1

РГО

ьеи

Зег

уа!

180

185

190

11 е

Агд

Зег

мет

Агр

С1п

ьеи

ТНг

С1п

Ьеи

Агр

Ьеи

Уа!

РНе

ьуг

туг

195

200

205

рНе

С1и

мет

тгр

мет

ьуг

Агд

61 у

Ьуг

дгд

ту Г

тНг

б!п

ьеи

с1и

дгр

210

215

220

РНе

туг

ьеи

тНг

ίί е

РЬе

ΗΊ 5

РГО

А1а

Зег

уа!

б!у

ьуг

ьуг

д!а

дгр

225

230

235

240

С1и

уа!

ьеи

рНе

ьеи

61 η

61 у

зег

ьуг

д!а

ТУ Г

ьеи

61 п

Агп

ьуг

61 у

245

2 50

255

рНе

Азр

уа1

А5Р

ьуг

Агр

61 у

ьуг

11е

тКг

ьеи

61 у

61 и

Не

Зег

Зег

260

265

270

тЬг

ьеи

туг

ТНг

тКг

туг

туг

ьуг

61 у

ьеи

ьеи

РГО

б1и

Α5Π

Агд

н1 г

275

280

285

уа!

Не

Зег

туг

290 <21 О> 3 <211> 181 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> эндолизин 5а1топеНа <400> 3

мет

ьуг

РГО

ьуг

дгр

61 и

Пе

рКе

дгр

61 и

Пе

ьеи

61 у

ьуг

б!и

61 у

1

5

10

15

61 у

туг

уа!

Агп

Η15

РГО

дгр

Агр

ьуг

б!у

с1у

РГО

тНг

ьуг

тгр

С1у

20

25

30

11е

тНг

С1и

ьуг

Уа!

д!а

Агд

д1а

Нт г

б1у

ту Г

Агд

б!у

Агр

меТ

Агд

35

40

45

Агп

ьеи

ТНг

Агд

61 у

61 п

А1а

ьеи

С1и

Пе

ьеи

С1и

тКг

Агр

Туг

Тгр

50

55

60

- 31 024794

туг

с!у

рго Агд

рКе

Азр

Агд

Уа1

А1а

ьуз

а! а

5ег

РГО АЗр

Уа!

А1а

65

70

75

80

д!а

с! и

ьеи Суз

Азр

ТКг

с!у

Уа!

А5П

мет

с! у

РГО

Зег уа!

а! а

А! а

90 95

ьуз

ме*

ьеи

С! η

Агд

тгр

ьеи

ΑΞΠ

уа!

рКе

АЗП

с! η

с! у

С1у

Агд ьеи

100

105

110

туг

РГО

Азр

ме*

Азр

тКг

Азр

С1у

Агд

Пе

С! у

РГО

дгд

тКг

ьеи азп

115 120 125

а! а

ьеи

дгд

Уа!

туг

ьеи

с! и

ЬУ5

Агд

с! у

ьуз

АЗр

с! у

с1и

дгд

уа!

130

135

140

ьеи

ьеи

уа!

а! а

ьеи

АЗП

суз

тКг

С! η

С! у

с! и

Агд

туг

ьеи

с! и

ьеи

145 150 155 160 д1а С! и ьуз Агд С!и а! а дар С1и Зег рКе Уа1 туг с! у тгр ме* ьуз 165 170 175

С1и дгд Уа! ьеи 11е 180 <210> 4 <211> 163 <212> РКТ <213> неизвестен <220>

<223> эндолизин Еп1еюЬас1епа фаг Т4

<400> 4

Ме* 1

АЗП

Пе

РКе

с! и 5

ме*

ьеи

Агд

11е

Агр 10

с! и

с1у

ьеи

Агд

ьеи 15

Ьуз

Пе

туг

ьуз

А5р 20

ТКг

с! и

с1у

туг

Пг

тКг

Не

е!у

Пе

С1у 30

Н15

ьеи

Ьеи

ТКг

Зег

Рго

Зег

Ьеи

Азп 40

А! а

А1а

Ьуз

Зег

С! и 45

Ьеи

Азр

Ьуз

а! а

Не 50

с1у

Агд

АЗП

суз

АЗП 55

е1у

уа!

11е

тКг

ьуз 60

Азр

с! и

А! а

с! и

Ьеи

РКе

Азп

е!п

А5О 70

Уа!

Азр

а! а

А! а

Уа! 75

Агд с!у

Не

ьеи

Агд 80

АЗП

А! а

ьуз

Ьеи

ьуз 85

Рго

Уа1

туг

А5р

Зег 90

ьеи

А5р А!а

уа1

Агд 95

Агд

Суз

А! а

Ьеи

Пе

Азп

Ме*

Уа!

РКе

С!п

Ме*

с1у

С! и

ТКг

с! у

Уа!

А! а

- 32 024794

100

105

110

с! у

РЬе

тЬг

АЗП

Зег

Ьеи

Агд

мет

Ьеи

с! η

С1п

1У5

Агд

тгр

Азр

С1и

115

120

125

А1а

а’ а

Уа!

Аэп

Ьеи

а! а

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

туг

А5П

б1п

тЬг

РГО

АЗП

130

135

140

Агд

А! а

ЬУ5

Агд

Уа!

11 е

ТЬг

тЬг

РЬе

Агд

тЬг

с!у

ТЬг

тгр

А5р

А1а

145

150

155

160

Туг ЬуЗ А5П <210> 5 <211> 280 <212>РКТ <213> неизвестен

<220> <223> эндолизин АС1пеЬас1ег Ьаитапн <400> 5

ме! 1 а! а

01 и туг Азр

ме! т!е ьеи ьуз

рЬе С! у Зег ьуз 01 у 10

Азр □1 у 30

а! а 15 Уа1

уа! ьуз

тЬг

ьеи с! η 20

ьуз

С! η

ьеи а!а

ьуз 25

ме!

С! у

Туг

ьуз

А5р

цуз

РГО

ьеи

Зег

уа!

Азр

С! у

НТ 3

рЬе

СТу

01 и

Зег

тЬг

01 и

рЬе

35

40

45

А1а

Уа! 50

Пе

С! η

Ьеи

С! η

Агд 55

ьуз

РЬе

01 у

ьеи

Уа1 60

А! а

Азр

01 у

ьуз

Уа!

С! у

Азр

ьуз

тЬг

Агд

01 η

а! а

Ьеи

А1а

С! у

Азр

Зег

Уа!

Зег

Ьуз

65

70

75

80

РЬе

ьеи

ьуз

АЗР

с! и

АЗр

туг

ьуз

ЬУ5

А! а

А! а

Не

Агд

Ьеи

Ьуз

Уа!

35

90

95

РГО

О1и

ьеи

уа! 100

ιΐβ

Агд

уа!

рЬе

$

а! а

уа!

с! и

с! у

ьеи 110

о! у

уа!

С! у

рЬе

ьеи

РГО

АЗП

01 у

ьуз

а! а

ьуз

ίί е

ьеи

РЬе

с! и

Агд

НТ 3

Агд

115

120

125

ме!

туг

рЬе

туг

ьеи

Суз

С! η

А1а

ьеи

о! у

ьуз

ТЬг

РЬе

а! а

АЗП

Зег

130

135

140

С! η

Уа!

ьуз

ίί е

тЬг

РГО

АЗП

ΐ! е

Уа!

АЗП

тЬг

ьеи

ТЬг

О! у С!у

Туг

145

150

155

160

- 33 024794

ьуз СТу Азр д!а А1а С1и

Туг тКг Агд ьеи Зег мет А1а 170

11 е

АЗП 175

ίί е

165

нт 5

ьуз

с!и

Зег

А1а

ьеи

мет

Зег

тКг

Зег

Тгр

01 у

С1п

рНе

01 η

11 е

180

185

190

мег

С1 у

С1и

АЗП

тгр

ьуз

АЗр

ьеи

С1у

туг

Зег

Зег

уа!

с!п

01и

рКе

195

200

205

уа!

Азр

С1п

01 η

С1п

ьеи

АЗП

61 и

01 у

АЗП

01 η

ьеи

С1и

А1а

РНе

г!е

210

215

220

дгд

рЬе

11е

С1и

тгр

ьуз

РГО

С1 у

ьеи

ьеи

с1и

д1а

ьеи

дгд

ьуз

С1п

225

230

235

240

Азр

тгр

Азр

ТЬг

Уа!

РКе

тКг

ьеи

Туг

АЗП

01 у

ьуз

АЗП

туг

ьуз

ьуз

245

250

255

ьеи

С1у

туг

С1п

А1а

ьуз

рКе

01 η

ьуз

01 и

Тгр

АЗР

Нт 5

ьеи

01 и

Рго

260

265

270

11 е

туг

Агд

01 и

ьуз

тКг

А1а

А1а

275

280

<210> 6 <211> 152 <212> РРТ <213> неизвестен <220 <223> эндолизин Е. соН К1Р

<400> 6

ме1

уа!

Зег

ьуз

ναΐ

С1п

рКе

АЗП

РГО

Агд

Зег

Агд

тЬг

АЗр

А1а

т1е

1

5

10

15

рКе

Уа1

нтз

Су5

Зег

А1а

ТКг

ьуз

РГО

01и

Μβΐ

Азр

11 е

01у

Уа!

С1и

20

25

30

тЬг

11 е

дгд

МеТ

Тгр

нт 3

ьуз

С1п

С1п

д1а

тгр

ьеи

Азр

уа!

С1у

Туг

35

40

45

НТ 5

рКе 50

11 е

11е

ьуз

лгд

Азр 55

01 у

тЬг

уа!

01 и

С1и 60

01 у

Агд

РГО

уа!

АЗП

Уа!

Уа1

01 у

Зег

нтз

Уа!

ьуз

АЗр

тгр

АЗП

Зег

Агд

Зег

Уа!

С1у

65

70

75

80

Уа1

Суз

ьеи

Уа1

01 у

о1у

11е

АЗП

А1а

ьуз

С1у

С1п

РЬе

о1и

д1а

АЗП

85

90

95

рНе

тКг

РГО

А1а

С1п

мет

АЗП

Зег

ьеи

Агд

АЗП

ьуз

ьеи

Азр

Азр

ьеи

- 34 024794

100

105

110

ЬуЗ

уа!

меТ

туг

Рго

с! η

а! а

С! и

11 е

Агд

а! а

нтз

НТ 5

Азр

уа!

а! а

115

120

125

РГО

1_уз

а! а

Суз

РГО

Зег

рЬе

АЗр

ьеи

с! η

Агд

тгр

ьеи

Зег

тЬг

АЗП

130

135

140

С1и

ьеи

уа!

тЬг

зег

АЗР

дгд

с! у

145 150 <210> 7 <211> 328 <212>РКТ <213> неизвестен <220>

<223> ОВРдрЬУб

<400> 7	Азп	Зег	с! и 5	ьуз	Азп а!а Зег ιΐβ 11е МеТ Зег т!е С1п	Агд
МеТ 1	ьуз
10	15
тЬг	ьеи	А1а	Зег 20	ьеи	Зег	ьеи Туг С1у С1у Агд 25	11е Азр С1у Ьеи 30	РЬе
С! у	С! и	Ьуз 35	Суз	Агд	С! у	А!а т!е 11е ьеи меТ 40	ьеи Аэп ьуэ Уа1 45	туг
РГО	АЗП 50	РЬе	Зег	тЬг	Азп	ьуз ьеи рго Зег азп 55	тЬг туг с!и А1а 60	С1и
Зег 65	Уа!	РЬе	тЬг	РЬе	ьеи 70	С1п ТЬг л!а ьеи А1а 75	С!у уа! С1у ьеи	Туг 80
тЬг	11е	тЬг	ί! е	АЗР 85	С1у	ьуз тгр С1у С1у тЬг 90	5ег с!п с1у А1а 95	11е
Азр	а! а	ьеи	уа! 100	ЬУ5	Зег	Туг Агд С1п 11е тЬг 105	с! и А1а С1и Агд 110	а! а
С1у	Зег	тЬг 115	Ьеи	Рго	Ьеи	с1у ьеи а!а тЬг уа! 120	мет Зег ьуз нтз 125	МеТ
5ег	11е 130	С1и	С1п	ьеи	лгд	а!а мет ьеи рго тЬг 135	Азр Агд с!п с!у 140	туг
А! а 145	С! и	Уа1	туг	ΐί е	Азр 150	Рго Ьеи Азп е!и тЬг 155	МеТ Азр 11е РЬе	С! и 160
11 е	АЗП	тЬг	РГО	ьеи 165	Агд	11е а!а нтз РЬе мет 170	а! а С1п 11е ьеи 175	НТ 3

- 35 024794

С! и

тЬг

а! а

Суз

рНе

ьуз

туг

тНг

С! и

с! и

ьеи

а! а

бег

С1у

ьуз

д1а

180

185

190

туг

с!и

с! у

дгд

а! а

Азр

ьеи

С! у

АЗП

тНг

Агд

РГО

С1у

АЗр

С! у

РГО

195

200

205

ьеи

рНе

ьуз

С! у

Агд

С! у

ьеи

Ьеи

С! η

Не

ТЬг

С! у

Агд

ьеи

АЗП

туг

210

215

220

Уа1

ьуз

Суз

С1п

Уа1

туг

Ьеи

дгд

С! и

ьуз

ьеи

ьуз

Азр

РГО

ΤίΐΓ

рКе

225

230

235

240

АЗр

т!е

ТНг

бег

Зег

уа!

тНг

Суз

а! а

С1п

С! η

ьеи

бег

С1и

бег

РГО

245

250

255

ьеи

ьеи

а! а

а! а

ьеи

а! а

бег

с! У

туг

рНе

тгр

Агд

РНе

Не

ьуз

РГО

260

265

270

ьуз

ьеи

АЗП

С!и

тНг

а! а

АЗр

ьуз

Азр

Азр

Не

туг

Тгр

Уа!

бег

уа!

275

280

285

туг

уа!

АЗП

С1у

туг

а! а

ьуз

С! η

а! а

АЗП

РГО

туг

туг

РГО

АЗП

Агд

290

295

300

АЗР

ьуз

С! и

РГО

АЗП

ΗΊ 3

Ме!

ЬУ5

е!и

дгд

уа!

С!п

ме!

ьеи

а! а

уа!

305

310

315

320

ТНг ьуз ьуз А1а Ьеи С1у 11е Уа! 325 <210> 8 <211> 165 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> РЗРЗдрЮ <400> 8

ме!

РГО

уа1

Не

АЗП

тНг

нтз

С1п

Азп

Не

а! а

А1а

рНе

ьеи

лзр

ме!

1

5

10

15

Ьеи

а! а

туг

бег

б! и

с! у

тНг

А1а

АЗП

нт 3

Рго

ьеи

тЬг

ьуз

АЗП

Агд

20

25

30

С! у

туг

Азр

Уа!

Не

уа!

тНг

с! у

РНе

Азр

с! у

бег

Рго

С! и

Не

РНе

35

40

45

тНг

Азр

туг

бег

АЗр

НТЗ

РГО

РНе

А! а

НТ 5

С! у

Агд

Рго

Рго

ьуз

Уа!

50

55

60

рНе

АЗП

Агд

Агд

С! у

с! и

Ьуз

бег

тНг

а! а

бег

С! у

Агд

туг

с!п

с!п

- 36 024794

70 75 80

ьеи

туг

ιΐβ

рНе

тгр

РГО

ΗΊ3

туг

суз

суз

сТп

ьеи

л!а

ьеи

РГО

Азр

85

90

95

РНе

бег

РГО

Ьеи

бег

СТ η

А£р

ьуз

ьеи

АТа

11 е

сТп

ьеи

1Те

Агд

СТи

100

105

110

Агд

СТу

АТа

тТе

Авр

Азр

тТе

Агд

АТа

СТу

Агд

тТе

сТи

Агд

АТа

УаТ

115

120

125

бег

Агд

СУ5

Агд

АЗП

11 е

тгр

дТа

бег

ьеи

РГО

СТу

А1а

СТу

туг

СТу

150

115

140

СТп

Агд

С1и

нт 5

бег

Ьеи

СТи

ьуз

Ьеи

УаТ

ТНг

УаТ

Тгр

Агд

ТНг

АТа

145

150

155

160

СТу

СТу

УаТ

МеТ

АТа

165 <210> 9 <211> 165 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> р2др09 <400 9

мет Рго 1

УаТ

11 е

Азп тНг 5

НТ 5

СТп Азп тТе АТа АТа РНе ьеи Азр мет

10

15

ьеи

АТа

УаТ

бег 20

СТ и

СТу

тНг

АТа

АЗП 25

НТ 5

РГО

ьеи

тНг

з&5

АЗП

Агд

с! у

туг

Азр

УаТ

ιΐβ

уа1

тНг

сТу

ьеи

АЗр

СТу

ьуз

РГО

сТи

1Те

рНе

35

40

45

тНг

АЗр

Туг

бег

Азр

НТ 5

рго

РНе

ДТ а

НТ 5

СТу

Агд

РГО

АТа

ьуз

уа!

50

55

60

РНе

АЗП

Агд

Агд

СТу

СТ и

ьуз

бег

ТНг

АТа

бег

СТу

Агд

туг

СТп

СТп

65

70

75

80

ьеи

туг

ьеи

рНе

тгр

РГО

НТ 5

туг

дгд

ьуз

С1п

ьеи

АТа

ьеи

РГО

АЗр

85

90

95

рНе

бег

РГО

ьеи

бег

С1п

Азр

Агд

ьеи

А1а

11 е

СТп

ьеи

1Те

Агд

СТи

100

105

110

Агд

СТу

АТа

ьеи

Азр

Азр

11 е

Агд

АТа

СТу

Агд

ίί е

СТ и

Агд

АТа

тТе

115

120

125

- 37 024794

зег

Агд

суз

Агд

АЗП

11е

тгр

А1а Зег

Ьеи

Рго

СТу

А1а

С1 у

туг

с!у

130

135

140

С1п

Агд

с1и

нт 3

зег

ьеи

сТи

ьуз ьеи

7а1

тЬг

Уа1

тгр

дгд

тКг

а! а

145

150

155

160

С1у

С1 у

уа!

РГО

А1а

165 <210> 10 <211> 6 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 10 ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 11 ьуз Агд ьуз ьуз лгд ьуз ьуз лгд ьуз 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 12

Агд Агд Агд Агд дгд Агд Агд Агд Агд 1 5 <210> 13 <211 = 8 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 13 ьуз ьуз ьуз ьуз ьуз ьуз ьуз ьуз 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> РРТ <213=· неизвестен <220=

- 38 024794 <223> синтетический пептид <400> 14 |_уз Агд ьуз 1_уз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз 15 10 <210> 15 <211> 12 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 15 ьуз дгд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз 15 10 <210> 16 <211> 14 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 16 ьуз дгд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд 1 5 10 <210> 17 <211> 16 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 17 ьуз ьуз ьу5 ьуз ьуэ ьуз ьуз ьуз ьуз ьуз ьуз ьуз ьу5 ьуэ ьуз ьуз 15 10 15 <210> 18 <211> 19 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 16 ьуз Агд ьуз Ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд Ьуэ ьуз

10 15 <210> 19 <211> 19 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид

- 39 024794 <400> 19

<210 23 <211> 21 <212> РРТ <213> неизвестен <220 <223> синтетический пептид <400 23

- 40 024794 ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз Ьуз Агд Ьуз ьуз 15 10 15

Агд ьуз ьуз лгд ьуз 20 <210> 24 <211> 22 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 24 ьуз лгд ьуз ьуз лгд ьуз ьуз лгд ьуз лгд С1у 5ег 01у ьу5 Агд ьуз 15 10 15

Ьуз Агд ьуз Ь^з Агд ьуз <210> 25 <211> 24 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 25 ьуз Агд ьуз ьуз лгд ьуз ьуз лгд ьуз лгд 01у зег с!у зег С1у ьуз 15 10 15 дгд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз лгд ьуз 20 <210> 26 <211> 25 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 26 ьуз Агд ьуз ьуз лгд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз лгд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз 15 10 15

Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз 20 25 <210> 27 <211> 31 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 27

- 41 024794 ьуз лгд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз дгд ьуз дгд Зег ьуз дгд ьуз ьуз дгд 15 10 15 ьуз ьуз дгд ьуз дгд зег ьуз лгд ьуз ьуз лгд ьуз ьуз Агд ьуз 20 25 30 <210> 28 <211> 38 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 28 ьуз дгд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз лгд ьуз Агд с!у Зег С1у Зег С1у ьуз 15 10 15

Агд ьуз ьуз лгд ьуз ьуз Агд ьуз С1у Зег с!у Зег с!у ьуз дгд ьуз 20 25 30 ьуз Агд ьуз ьуз дгд ьуз 35 <210=· 29 <211> 39 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 29 ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуэ ьуэ 15 10 15

Агд ьуз Ьуз Агд ьуз ьуз лгд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз лгд ьуз ьуз лгд 20 25 30 ьуз ьуз лгд ьуз ьуз лгд ьуз <210> 30 <211> 42 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид

<400> 30

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуэ

ьуз

лгд

Ьу5

Агд

Зег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

1

5

10

15

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

лгд

зег

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

Агд

20

25

30

зег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

40 <210> 31 <211> 5 <212> РКТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 31 д1а мет Бег С1у <210 32 <211> 4 <212> РКТ <213> неизвестен <220 <223> синтетический пептид <400 31 <220>

<221 > шизсЭе^чге <222> (3)...(3) <223> в котором Хаа является любой другой аминокислотой, кроме лизина, аргинина и гистидина <400 32

<210> 33 <211> 5 <212> РКТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 33 ьуз дгд Зег ьуз дгд 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> РКТ <213> неизвестен <220>

<223> синтетический пептид <400> 34 ьуз дгд СТу Зег С1у <210> 35 <211> 271 <212>РКТ <213> неизвестен <220>

<223> РОЬУ-др144 <400> 35

- 43 024794

мех 1

61 у

Зег ьуз Агд 5

ьуз

Ьуз Агд ьуз

Й5

Агд ьуз

ьуз

УаТ

ьеи 15

Агд

ьуз

СТу

АЗР

Агд

СТу

Азр

СТ и

УаТ

Суз

С1п

ьеи С1п

тКг

ьеи

ьеи

АЗП

20

25

30

ьеи

Суз

СТу

туг

Азр

УаТ

СТу

ьуз

рго

Азр

С1у Не

рКе

СТу

АЗП

АЗП

35

40

45

тКг

рКе

АЗП

сТп

уаТ

УаТ

ьуз

РКе

СТп

ьуз

Азр АЗП

суз

ьеи

Азр

Зег

50

55

60

Азр

СТу

Пе

УаТ

СТу

ьуз

Азп

ТКг

Тгр

АТ а

СТ и ьеи

РКе

Зег

Ьуз

туг

65

70

75

80

Зег

РГО

РГО

Не

РГО

туг

ьуз

ι Кг

Не

рго

мет рго

тКг

АТа

АЗП

ьуз

85

90

95

зег

Агд

АТа

АТа

А1а

тКг

РГО

уа!

мет

АЗП

А1а УаТ

сТи

АЗП

АТа

тКг

100

105

110

СТ у

Уа1

Агд

Зег

СТп

ьеи

ьеи

ьеи

ТКг

РКе

А1а Зег

Не

СТи

Зег

АТа

115

120

125

РКе

А5р 130

туг

СТи

11 е

ьуз

АТа 135

ьуз

тКг

Зег

Зег л1а 140

ТКг

СТу

тгр

РКе

СТп

РКе

ьеи

ТКг

СТу

тКг

тгр

ьуз

тКг

меТ

Пе СТи

АЗП

туг

СТу

мет

145

150

155

160

ьуз

Туг

С1у

УаТ

ьеи

ТКг

Азр

Рго

ТКг

СТу

АТа ьеи

Агд

ьуз

Азр

РГО

165

170

175

Агд

1Те

5ег

А1а

ьеи

мет

сЗу

АТа

сТи

ьеи

Не ьуз

СТ и

АЗП

мет

АЗП

180

185

190

Не

ьеи

Агд

Рго

УаТ

ьеи

ьуз

Агд

СТ и

Рго

тКг Аэр

ТКг

Азр

Ьеи

Туг

195

200

205

ьеи

АТ а

НТВ

рНе

РКе

СТу

Рго

СТу

А1а

л1 а

Агд Агд

рКе

ьеи

тКг

тКг

210

215

220

&

СТп

АЗП

СТ и

ьеи

лТа

дТа

тКг

НТ 5

рКе

рго ьуз

СТ и

АТа

СТп

АТа

230

235

240

А5П

рго

Зег

1Те

рКе

туг

АЗП

ьуз

АЗР

СТу

5ег рго

ьуз

тКг

Не

СТп

245

250

255

С1и

уаТ

туг

АЗП

ьеи

мет

АЗр

СТу

ьуз

УаТ

АТа А1а

НТ 5

Агд

ьуз

260 265 270 <210> 36 <211> 282 <212> РКТ <213> неизвестен <220>

<223> (РОЬУ) 2-др144 <400> 36

- 44 024794

Μβΐ

С! у

Еег

суз

дгд

суз

суз

Агд

суз

ч;5

Агд

суз

Агд

Ее г

суз

Агд

1

5

10

15

суз

суз

дгд

суз

суз

Агд

суз

ьуз

Уа!

сеи

Агд

суз

С! у

Азр

Агд

С! у

20

25

30

АЗР

с! и

Уа!

суз

С!п

сеи

Οίη

тНг

сеи

сеи

АЗП

сеи

Суз

с! у

туг

дзр

35

40

45

уа!

с! у 50

суз

РГО

АЗр

С1у

т1е 55

рНе

с! у

АЗП

АЗП

тЬг 60

рНе

АЗП

Οίη

уа!

уа!

суз

рНе

С!п

суз

Азр

АЗЛ

Суз

сеи

Азр

Еег

АЗр

С! у

11 е

уа!

С! у

65

70

75

80

|_уз

АЗП

тНг

тгр

а! а

С! и

Сеи

рНе

Еег

суз

Туг

Ее г

РГО

РГО

ιΐε

РГО

85

90

95

туг

Ьуз тНг 11 е 100

РГО

мет

Рго тНг А1а Азп суз 105

Еег

Агд

а! а 110

А1а

а! а

тНг

РГО

уа!

мет

АЗП

а! а

уа!

с! и

АЗП

а! а

тНг

с! у

уа!

лгд

Еег

οίη

115

120

125

сеи

ьеи

сеи

ТНг

РНе

а! а

Ее г

11 е

01 и

Еег

а! а

РНе

Азр

туг

01 и

г1е

130

135

140

суз

а! а

суз

ТНг

Ее г

Ее г

а!а тНг

01 у

тгр

РНе

01 п

РНе

сеи

тНг

01 у 160

145

150

155

ТНг

Тгр

суз

ТНг

мет

ι! е

С! и

АЗП

туг

о! у

мет

суз

Туг

о! у

Уа!

сеи

165

170

175

тНг

Азр

Рго

тНг 180

с! у

а! а

сеи

Агд

ко

Азр

РГО

дгд

11е

Еег 190

а1 а

ьеи

мет

е1у

д1а

01и

сеи

11е

суз

с! и

АЗП

мет

АЗП

11е

сеи

Агд

Рго

Уа!

195

200

205

Сеи

Суз

Агд

С! и

Рго

ТНг

Азр

ТНг

Азр

Сеи

Туг

сеи

а! а

нт 5

РНе

рНе

210

215

220

С! у

РГО

С! у

л! а

а! а

дгд

дгд

рНе

ьеи

тНг

тНг

о! у

Οίη

АЗП

с! и

сеи

225

230

235

240

А1а

а! а

ТНг

Нт 5

РНе

РГО

ьуз

с! и

а! а

οίη

а! а

АЗП

РГО

Еег

11е

рНе

245

250

255

Туг

АЗП

суз

Азр

С! у

Ее г

Рго

ьуз

ТНг

11е

Οίη

о! и

уа!

туг

АЗП

ьеи

260

265

270

мет дар с!у суз уа! а!а а!а нтз дгд ьуз 275 280 <210> 37

- 45 024794 <211> 293 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> (ΡΟΕΥ) 3-др144 <400> 37

МеС

С1у

зег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз Агд

ьуз

ьуз .

Агд

ьуз дгд зег ь

.уз Агд

1

5

10

1

.5

ьуэ

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз Агд

зег

ьуэ Агд

ьуз

ьуз дгд ьуз ьуз

20

25

30

дгд

ьуз

Ьуз

Уа1

Ьеи

Агд

Ьуз

С1у

АЗр

Агд

С1у

Азр

01 и

Уа1

Суз

01 п

35

40

45

ьеи

С1п

ТЬг

ьеи

Ьеи

АЗП

ьеи

Суз

С1у

Туг

АЗр

Уа1

С1у

Ьуз

Рго

Азр

50

55

60

01 у

т1е

рЬе

01 у

АЗП

АЗП

тЬг

РЬе

АЗП

С1п

уа!

Уа1

ьуз

РЬе

С1п

ьуз

65

70

75

80

АЗр

АЗП

Суз

ьеи

Азр 85

Зег

Азр

С1у

11 е

Уа! 90

С1у

ьуз

АЗП

тЬг

тгр 95

А1а

С1и

ьеи

рЬе

Зег

ьуз

туг

Зег

РГО

РГО

ιΐβ

РГО

туг

ьуз

ТЬг

т1е

РГО

100

105

110

мег

РГО

тЬг

л1а

АЗП

ьуз

Зег

Агд

А1а

л!а

д!а

тЬг

Рго

Уа1

ме1

АЗП

115

120

125

а! а

уа1

с!и

АЗП

А1а тЬг

01у

Уа1

Агд

Зег

01 п

ьеи

ьеи

ьеи

тЬг

РЬе

130

135

140

д!а

Зег

11 е

01 и

Зег

А1а

РЬе

А5р

туг

01 и

ίί е

ьуз

А1 а

ьуз

тЬг

Зег

145

150

155

160

Зег

д!а

тЬг

01 у

тгр

рЬе

С1п

РЬе

ьеи

тЬг

01 у

тЬг

тгр

ьуз

тЬг

мег

165

170

175

11 е

01 и

АЗП

туг

С1у

Μθΐ

ьуз

туг

01 у

Уа1

ьеи

тЬг

АЗр

Рго

тЬг

01 у

180

185

190

А1а

ьеи

Агд

ьуэ

Азр

РГО

Агд

11 е

Зег

д!а

ьеи

меТ

С1у

л!а

С1и

Ьеи

195

200

205

- 46 024794

ίί е

ьуз

с!и

АЗП

мет

АЗП

ίί е

ьеи

дгд

РГО

Уа1

ьеи

ьуз

лгд

с!и

РГО

210

215

220

тЬг

АЗр

тЬг

АЗр

ьеи

туг

ьеи

л1а

НТ 5

рЬе

рЬе

с!у

РГО

с1у

л1а

а! а

225

230

235

240

Агд

Агд

рЬе

ьеи

тЬг

тЬг

С1у

С1п

АЗП

С1и

Ьеи

а! а

а! а

тЬг

нт 5

РЬе

245

250

255

Рго

ьуз

С1и

А1а

С1п

А1а

Азп

РГО

Зег

11 е

РЬе

Туг

Азп

ьуз

Азр

СТу

260

265

270

Зег

РГО

ьуз

ТЬг

ίί е

с!п

С1и

уа!

туг

АЗП

ьеи

мет

Азр

С1 у

ьуз

Уа!

275 280 285 д1а д!а нт 5 дгд ьуз 290 <210> 38 <211> 304 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> (РОЬУ) 4-др144 <400> 38

- 47 024794

меТ 1

С1у

Зег

ьуз

Агд

Ьуз

Ьуз

Агд

ьуз

Агд

ьуз

Агд

Зег

Ьуз 15

Агд

ьуз

ьуз

Агд

2Т

ьуз

Агд

ьуз

лгд

Зег 25

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд 30

ьуз

ьуз

дгд

ьуз

Агд

5ег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

дгд

ьуз

ьуз

уа!

ьеи

35

40

45

Агд

ьуз

С! у

АЗр

Агд

С! у

АЗр

С! и

Уа!

Суз

С1п

ьеи

СТп

тНг

ьеи

ьеи

50

55

60

АЗП 65

ьеи

Суз

С1у

туг

АЗр 70

уа!

С! у

РГО

Азр 75

С! у

ΐ! е

РНе

е! у

АЗП 80

АЗП

тНг

рНе

АЗП

СТп

уа!

уа!

Ьуз

РНе

С! η

ьуз

А5р

АЗП

Суз

ьеи

АЗр

85

90

95

Зег

Азр

СТ у

ΐΐ е

уа!

С! у

ьуз

АЗП

тНг

тгр

А1а

С! и

ьеи

рНе

Зег

ьуз

100

105

110

туг

5ег

РГО

РГО

11 е

РГО

туг

ьуз

тНг

ΐ! е

РГО

мет

РГО

тНг

А1а

АЗП

115

120

125

ьуз

Зег

Агд

а! а

А1а

а! а

ТНг

Рго

Уа!

меТ

АЗП

а! а

уа!

С! и

АЗП

а! а

130

135

140

ТНг

С1у

Уа1

Агд

зег

с! η

ьеи

ьеи

ьеи

тНг

РНе

а! а

зег

т!е

с1и

5ег

145

150

155

160

АТа

РНе

АЗр

туг

С1и

т!е

ьуз

а! а

ьуз

тНг

Зег

Зег

а! а

тНг

С1 у

тгр

165

170

175

рНе

С1п

рНе

Ьеи

тНг

с! у

тНг

тгр

ьуз

тНг

меТ

11 е

С! и

АЗП

туг

с! у

180

185

190

мет

ьуз

туг

с! у

Уа!

Ьеи

тНг

Азр

РГО

ТНг

С! у

а! а

Ьеи

Агд

ьуз

Азр

195

200

205

РГО

Агд

11 е

Зег

а! а

ьеи

меТ

С1у

А1а

С! и

ьеи

ΐ! е

ьуз

С! и

АЗП

меТ

210

215

220

АЗП

ΐ! е

ьеи

Агд

РГО

Уа1

ьеи

ьуз

Агд

с! и

РГО

тНг

АЗр

тНг

АЗр

ьеи

225

230

235

240

- 48 024794

туг

ьеи

д1а

НТ 5

рКе

рКе

С1у

РГО

С1у

д!а

д1а

дгд

дгд

рЬе

ьеи

тКг

245

250

255

тЬг

С1у

С1п

АЗП

С1и

ьеи

А1а

д!а

тЬг

НТ 5

рКе

Рго

ьуз

С1и

А1а

С1п

260

265

270

Αΐ а

АЗП

РГО

Зег

х1е

рКе

туг

АЗП

ьуз

Азр

С1у

Зег

РГО

Ьуз

тНг

11 е

275

280

285

ΕΊη

С1и

Уа!

Туг

Азп

Ьеи

Ме!

Азр

С1у

Ьуз

Уа!

А1а

А1а

НТ 3

дгд

ьуз

290 295 300 <210> 39 <211> 303 <212> РРТ

<213> <220> <223> <400>

неизвестен РОЬУ-др188 39

Ме! 1

С1у

Зег

ьуз

Агд 5

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

Ьу5 10

Агд

ьуз

АЗП

рКе

Агд 15

тКг

ьуз

АЗП

С1У

туг 20

Агд

Азр

ьеи

С1п

л!а 25

ьеи

уа1

ьуз

С1и

ьеи 30

С1у

ьеи

туг

тКг

С1у 35

С1п

11 е

Азр

С1у

Уа1 40

тгр

С1у

ьуз

С1у

тКг 45

Зег

5ег

5ег

тКг

С1и 50

тКг

ьеи

ьеи

Агд

С1у 55

туг

А1а

С1и

уа1

уа1 60

01 у

ьуз

АЗП

ТКг

С1 у 65

С1у

х!е

с1у

ьеи

РГО 70

тКг

тКг

Зег

дзр

д!а 75

Зег

С1у

туг

АЗЛ

уа1 80

ίί е

тЬг

д1а

ьеи

С1п 85

Агд

Азп

ьеи

А1а

рКе 90

ьеи

С1у

ьеи

Туг

Зег 95

Ьеи

ТЬг

уа!

Азр

01 у 100

х!е

тгр

01 у

АЗП

01 у 105

тКг

ьеи

зег

С1у

ьеи 110

АЗР

ьуз

А1а

рКе

С1и 115

Уа1

туг

ьуз

С1и

Агд 120

туг

Агд

тКг

Рго

тЬг 125

туг

Азр

11 е

д!а

тгр 130

Зег

С1у

ьуз

уа1

зег 135

РГО

л1а

рКе

тКг

л1а 140

Ьу5

Уа1

ьуз

Азр

Тгр 145

Суз

С1у

уа!

НТ 5

уа! 150

рго

Азп

нт 5

Агд

А1а 155

РГО

НТ 3

тгр

ьеи

ме! 160

- 49 024794

д!а	Суэ	меТ А1а	РНе 165	б!и тНг С1у С1п тНг 170	РНе	Зег	Рго	Зег	Пе 175	ьуз
АЗП	д!а	А1а 61 у	Зег	С1и А1а туг С1у ьеи	Пе	61 п	рНе	меТ	Зег	РГО
		180		185				190
д!а	д1а	АЗП АЗр	ьеи	азп Уа! Рго ьеи Зег	уа!	11е	Агд	Зег	мет	Азр
		195		200			205
61 η	ьеи	тНг С1п	ьеи	Азр ьеи Уа1 РНе ьуз	туг	РНе	б! и	МеТ	Тгр	меТ
	210			215		220
ьуз	Агд	б!у ьуз	Агд	туг тНг С1п ьеи С1и	АЗР	РНе	Туг	ьеи	тНг	11е
225				230	235					240
рНе	Н15	рго д!а	Зег	уа! с!у ьуз ьуз а!а	АЗр	б! и	уа1	ьеи	РНе	ьеи
			245	250					255
С1п	б1у	Зег ьуз	а! а	туг ьеи С1п азп ьуз	б! у	РНе	Азр	уа!	АЗр	ьуз
		260		265				270
Азр	С1у	Ьуз 11е	тНг	ьеи 61 у С1и 11е Зег	Зег	тНг	ьеи	туг	тНг	тНг
		275		280			285
Туг	туг	ьуз 61 у	ьеи	ьеи рго С1и Азп Агд	Н1 5	уа!	11 е	Зег	туг
	290			295		300
<210> 40
<211>	314
<212>РРТ
<213>	неизвестен
<220>
<223> (РОЬУ)2-др188

<400> 40

меТ

61 у

Зег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

Агд

Зег

ьуз

Агд

1

5

10

15

ЬУ5

ЬУ5

Агд

ьуз

ЬУ5

Агд

ьуз

Азп

рНе

Агд

тНг

ЬУ5

АЗП

61 у

туг

Агд

20

25

30

АЗр

ьеи

61 п

А1а

ьеи

уа!

ьуз

С1и

ьеи

61 у

ьеи

туг

тпг

61 у

61 п

Пе

35

40

45

Агр

б1у

уа1

тгр

б!у

ьуз

б!у

тНг

5ег

Зег

Зег

тНг

с!и

тНг

ьеи

ьеи

50

55

60

Агд 65

61 у

туг

А1а

61 и

уа! 70

уа!

61 у

ьуз

АЗП

тКг 75

61 у

61 у

ίί е

61 у

ьеи 80

РГО

тНг

тЬг

5ег

АЗр

А1а

зег

61 у

туг

АЗП

уа!

ίί е

тпг

А1а

ьеи

с!п

85

90

95

Агд

АЗП

ьеи

а! а

рКе

ьеи

с! у

ьеи

туг

Зег

ьеи

тКг

уа!

АЗР

С! у

11е

100

105

110

тгр

с! у

АЗП

С! у

тКг

ьеи

Зег

С! у

ьеи

АЗр

ьуз

а! а

рКе

С1и

Уа!

туг

115

120

125

ЬУ5

С! и

Агд

туг

Агд

тКг

РГО

тЬг

Туг

Азр

ί! е

а! а

тгр

Зег

С! у

ьуз

130

135

140

уа!

Зег

РГО

а! а

рКе

тКг

а! а

ьуз

уа!

ьуз

Азр

тгр

Суз

с! у

Уа!

нтз

145

150

155

160

уа!

РГО

АЗП

НТ 5

лгд

л1а

РГО

нтз

тгр

ьеи

мет

а! а

суз

мет

а! а

рКе

165

170

175

С! и

тКг

С! у

С1п

тКг

РКе

Зег

РГО

Зег

11 е

ьуз

Α5Π

а! а

а! а

С! у

Зег

180

185

190

С! и

а! а

туг

С! у

ьеи

11 е

С1п

рЬе

меТ

Зег

РГО

а! а

а! а

АЗП

АЗр

ьеи

195

200

205

Азп

уа!

РГО

ьеи

Зег

Уа!

11 е

Агд

Зег

МеТ

Азр

С1п

ьеи

тКг

С1п

Ьеи

210

215

220

Азр

ьеи

уа!

рКе

ьуз

туг

РКе

С! и

меТ

тгр

МеТ

ьуз

Дгд

С! у

ьуз

Агд

225

230

235

240

туг

тКг

С! η

Ьеи

С1и

АЗр

рКе

Туг

ьеи

тКг

ί! е

рКе

нт 5

РГО

а! а

Зег

245

250

255

уа!

С! у

ьуз

Ьу5

А1а

АЗР

с! и

уа!

ьеи

РКе

ьеи

с!п

С1у

Зег

ьуз

А1а

260

265

270

туг

ьеи

с! η

АЗП

ьуз

С! у

рКе

АЗр

Уа!

АЗР

ьуз

Азр

с! у

ьуз

ί! е

тКг

275

280

285

Ьеи

с! у

с! и

11е

Зег

Зег

ТЬг

ьеи

Туг

тКг

тКг

Туг

туг

ьуз

С! У

ьеи

290

295

300

ьеи

РГО

С! и

АЗП

Агд

нт 5

Уа!

т!е

Зег

туг

305 310 <210=- 41 <211> 325 <212>ΡΚΤ <213> неизвестен <220>

<223> (РОЬУ)3-др188 <400 41

- 51 024794

ме*

С1у

Зег

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

лгд

Зег

ьуз

лгд

1

5

10

15

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

Агд

Зег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

20

25

30

дгд

ьуз

АЗП

РКе

Агд

тЬг

ьуз

Азп

С! у

туг

Агд

Азр

ьеи

С1п

а! а

ьеи

35

40

45

Уа!

С! и

Ьеи

С! у

ьеи

1Г

ТКг

С! у

С1п

Не

Азр 60

С! у

Уа!

тгр

С1у

ьуз

С1у

тКг

Зег

Зег

Зег

тКг

С! и

тКг

ьеи

ьеи

Агд

С! у

туг

А1а

С1и

65

70

75

80

Уа1

уа!

с! у

ьуз

АЗП

тКг

С! у

С! у

ΐ! е

С! у

ьеи

РГО

тКг

тКг

Зег

Азр

85

90

95

а! а

зег

с!у

туг

Азп

Уа!

Не

ТКг

а! а

ьеи

с!п

Агд

АЗП

ьеи

а! а

РКе

100

105

110

ьеи

С1у

ьеи

туг

Зег

ьеи

тКг

уа!

АЗр

С! у

Пе

тгр

с! у

АЗП

С1у

тКг

115

120

125

Ьеи

Зег

С! у

Ьеи

Азр

Ьуз

А! а

РКе

С! и

Уа!

туг

Ьуз

С! и

Агд

туг

Агд

130

135

140

тКг 145

РГО

тКг

Туг

АЗр

Не 150

а! а

Тгр

Зег

С1 у

Уа!

Зег

РГО

А1а

рКе 160

тйг

а! а

ьуз

Уа!

ьуз

АЗр

тгр

Суз

С1у

Уа!

НТ 5

Уа1

РГО

АЗП

НТ 3

Агд

165

170

175

а! а

РГО

НТ 5

тгр

ьеи

ме*

а! а

Суз

ме*

а! а

рКе

С! и

тКг

С1у

С1п

тКг

180

185

190

рКе

Зег

РГО

Зег

11е

ьуз

АЗП

л1а

А1а

с! у

Зег

с! и

а! а

туг

с! у

ьеи

195

200

205

11 е

С1п

рКе

ме*

Зег

РГО

а! а

а! а

АЗП

Азр

ьеи

АЗП

уа!

РГО

ьеи

Зег

210

215

220

уа!

Не

Агд

Зег

ме*

Азр

С1п

ьеи

тКг

с!п

ьеи

АЗр

ьеи

уа!

рКе

ьуз

225

230

235

240

туг

РКе

с! и

ме*

ме*

ьуз

Агд

С1у

2?0

Агд

туг

ТКг

с!п

Ьеи 255

С! и

Азр

РКе

Туг

Ьеи

ТКг

11 е

РКе

НТ 5

рго

А! а

Зег

уа!

С! у

ьуз

ьуз

А! а

260

265

270

- 52 024794

Азр

с! и

уа!

ьеи

РЬе

ьеи

Οίη

С! у

Зег

ьуз

а! а

туг

ьеи

С!

η

Азп

ьуз

275

280

285

с1у

рНе

АЗр

уа1

дзр

ьуз

Азр

о! у

ьуз

11е

тНг

ьеи

С1у

С!

и

11е

Зег

290

295

300

Зег

ТНг

Ьеи

туг

тЬг

тНг

Туг

Туг

ьуз

с! у

Ьеи

Ьеи

РГО

С!

и

АЗП

Агд

305

310

315

320

нт5 уа! 11е Зег туг 325 <210> 42 <211> 336 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> (РОЬУ)4-др188 <400> 42

Ме1 1

С1у

5ег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз 10

Агд

ьуз

Агд

Зег

ьуз 15

дгд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

Агд

зег

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

20

25

30

Агд

ьуз

Агд 35

Зег

ьуз

Агд

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз 45

АЗП

РНе

Агд

тНг

ьуз

АЗП

С1у

туг

Агд

АЗр

ьеи

С1п

л!а

ьеи

уа1

ьуз

С! и

ьеи

01 у

50

55

60

ьеи

туг

тНг

С1у

С1п

ίί е

Азр

С1у

уа!

тгр

С1 у

ьуз

с1у

тНг

зег

зег

65

70

75

80

Зег

тЬг

с! и

тНг

ьеи

Ьеи

Агд

С1у

туг

л1а

С1и

Уа1

Уа1

С1у

ьуз

АЗП

85

90

95

ТНг

С1у

С! у

ίί е

С! у

ьеи

РГО

тНг

тНг

Зег

АЗР

А1а

Зег

01 у

туг

АЗП

100

105

110

Уа1

11 е

ТНг

А1а

ьеи

Οίη

Агд

АЗЛ

Ьеи

А1а

РНе

ьеи

01 у

Ьеи

туг

Зег

115

120

125

ьеи

тНг

уа!

Азр

С! у

11е

тгр

01 у

АЗП

01 у

тНг

ьеи

5ег

01у

ьеи

АЗР

130

135

140

ьуэ 145

А1а

РНе

О! и

Уа!

туг 150

ьуз

01 и

Агд

туг

Агд 155

тНг

РГО

ТНг

туг

АЗр 160

11е

д!а

тгр

Зег

С! у

ьуз

Уа!

Зег

Рго

д!а

РЬе

тНг

А1а

ьуз

Уа1

ьуз

165

170

175

- 53 024794

Азр тгр Суз 61 у уа! 180

НТ 3 РКе

Уа! б1и

РГО АЗП НТЗ 185

Агд д!а Рго нтз тгр ьеи 190

меТ

д!а

Суэ МеТ 195

д!а

тКг 200

61 у

С1п

тКг

рНе Зег 205

РГО

Зег

11е

Ьу5

Азп

а! а

А! а

С1у

Зег

61 и

а! а

туг

61 у

Ьеи

11е

61 п

РКе

МеТ

Зег

210

215

220

РГО

А1а

а! а

АЗП

Азр

ьеи

АЗП

Уа1

РГО

ьеи

Зег

Уа1

ίί е

Агд

Зег

мет

225

230

235

240

Азр

С1п

ьеи

тКг

61 п

ьеи

АЗр

ьеи

уа!

РКе

ьуз

туг

Рпе

б1и

МеТ

тгр

245

250

255

меТ

ьуз

дгд

61 у

ьуз

Агд

туг

тЬг

б1п

ьеи

61 и

Азр

РКе

туг

ьеи

тКг

260

265

270

ίί е

рНе

нт 3

РГО

д!а

Зег

Уа!

С1у

ьуз

ьуз

д1а

Азр

б1и

уа!

ьеи

рНе

275

280

285

ьеи

61 η

61 у

Зег

ьуз

д!а

туг

ьеи

61 п

АЗП

ьуз

61 у

рпе

Азр

Уа1

Азр

290

295

300

АЗр

б1у

1уз

ίί е

тКг

ьеи

61 у

б!и

ίί е

зег

Зег

тКг

ьеи

туг

тКг

310

315

320

тКг

Туг

туг

ьуз

б!у

ьеи

ьеи

РГО

С1и

АЗЛ

дгд

Нт 3

Уа!

г! е

5ег

туг

325 330 335 <210> 43 <211> 272 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> ρΚΚΖ144рЕТ32Ь <400 43

л1а

Мет

б!у

Зег

ьуз

Агд

1У5

ьуз

Агд

Ьу5

ьуз

дгд

ьуэ

ьуэ

Уа1

ьеи

1

5

10

15

Агд

ьуз

61 у

Азр

Агд

61 у

АЗр

51и

Уа1

Суз

61 п

ьеи

б!п

тКг

ьеи

Ьеи

20

25

30

АЗП

ьеи

суз

61 у

туг

АЗр

уа!

б!у

ьуз

РГО

Азр

61 у

ίί е

РКе

б1у

АЗП

35

40

45

АЗП

тКг

РКе

Азп

61 п

уа!

уа1

ьуз

РКе

б1п

ьуз

Азр

АЗП

Суз

Ьеи

АЗР

50

55

60

- 54 024794

Зег 65

АЗр С1у

11е Уа1

01у ьуз Азп 70

тЬг тгр д!а С1и ьеи РЬе Зег ьуз

75

80

Туг

зег

РГО

РГО

11е

РГО

туг

ьуз

тЬг

11 е

РГО

мет

РГО

тЬг

А1а

АЗП

35

90

95

ьуз

зег

Агд

А1а

А1а

А1а

тЬг

РГО

уа!

мет

АЗЛ

д1а

Уа1

о!и

АЗП

А1а

100

105

110

тЬг

С1у

7а1

Агд

Зег

е1п

ьеи

ьеи

ьеи

тЬг

рЬе

д1а

Зег

11 е

С1и

5ег

115

120

125

л1а

РЬе

АЗр

туг

С1и

ιΐβ

ьуз

А1а

ьуз

тЬг

Зег

Зег

д!а

тЬг

01 у

тгр

130

135

140

РЬе

Οίη

рЬе

ьеи

тЬг

с!у

тЬг

тгр

ьуз

тЬг

мет

11 е

с1и

АЗП

туг

01 у

145

150

155

160

меТ

ьуз

туг

01 у

Уа1 165

ьеи

тЬг

АЗр

РГО

тЬг 170

01 у

д1а

ьеи

Агд

ьуз 175

АЗр

РГО

лгд

ιΐβ

Зег

д!а

ьеи

меТ

С1у

д!а

С1и

ьеи

ιΐβ

ьуз

С1и

АЗП

меТ

130

185

190

АЗП

Не

ьеи

лгд

РГО

уа!

ьеи

ьуз

Агд

01 и

РГО

тЬг

Азр

ТЬг

А5Р

ьеи

195

200

205

Туг

Ьеи 210

А1а

нт 3

РНе

РЬе

С1у 215

РГО

С1у

А1а

д1а

£8

Агд

РЬе

ьеи

тЬг

ТЬг

С1у

Οίη

Азл

С1и

Ьеи

А1а

А1а

ТЬг

Нтз

РЬе

Рго

Ьуз

01и

А1а

с1п

225

230

235

240

А1а

Азп

Рго

Зег

11 е

РЬе

Туг

Азп

ьуз

Азр

01 у

Зег

Рго

Ьуэ

тЬг

Пе

245

250

255

С1п

С1и

уа!

туг 260

АЗП

ьеи

меТ

АЗр

01 у

ьуз

уа!

д!а

д!а

нт 5

дгд

ьуз

265

270

<210 44 <211> 269 <212> РРТ <213> неизвестен <220 <223> КРК_6 рЕТ32Ь <400 44 д!а мет С1у Зег ьуз дгд ьуз ьуз дгд ьуз ьуз ναΐ ьеи дгд ьуз с!у 15 10 15

Азр дгд С1у Аэр 01 и Уа1 Суз 01 η ьеи С1п тЬг ьеи ьеи Азп ьеи Суз 20 25 30

- 55 024794

СТ у

туг

дзр

уа!

СТу

ьуз

РГО

АЗР

СТу

Не

рНе

сТу

АЗП

АЗП

тНг

рНе

35

40

45

АЗП

СТп

уаТ

уаТ

ьуз

рНе

СТп

ьуз

Азр

АЗП

суз

ьеи

АЗр

бег

Азр

СТу

50

55

60

1Те

УаТ

СТу

ьуз

АЗП

тНг

тгр

АТа

СТи

ьеи

РНе

бег

ьуз

туг

бег

РГО

65

70

75

80

Рго

х1е

Рго

туг

ьуз

тНг

ίί е

РГО

мет

РГО

тНг

АТа

АЗП

ьуз

бег

Агд

85

90

95

дТа

АТа

АТа

тНг

РГО

уа!

мет

АЗП

д!а

УаТ

сТи

АЗП

АТа

тНг

СТу

уа!

100

105

110

Агд

бег

СТп

ьеи

ьеи

ьеи

тНг

рНе

дТа

бег

1Те

сТи

бег

АТа

РНе

АЗр

115

120

125

туг

СТ и

1Те

ьуз

дТа

ьуз

тНг

бег

бег

АТа

тНг

СТу

тгр

рНе

СТп

рНе

130

135

140

ьеи

тНг

СТу

тНг

тгр

Ьу5

тНг

мет

11е

СТи

АЗП

туг

СТу

меТ

Ьу5

туг

145

150

155

160

СТу

УаТ

ьеи

тНг

АЗр

РГО

тНг

С1у

АТа

ьеи

Агд

ьуз

Азр

РГО

Агд

11е

165

170

175

бег

лТа

ьеи

меТ

СТу

АТа

СТ и

ьеи

хТе

ьуз

СТ и

АЗП

меТ

АЗП

11 е

ьеи

180

185

190

Агд

РГО

УаТ

Ьеи

ьуз

Агд

СТ и

РГО

тНг

Азр

тНг

АЗр

ьеи

туг

ьеи

АТа

195

200

205

НТ 5

рНе

рНе

сТу

РГО

сТу

АТа

АТа

Агд

дгд

РНе

ьеи

ТЬг

тНг

СТу

СТп

210

215

220

АЗП

сТи

ьеи

дТа

АТа

тНг

НТ 5

рНе

РГО

ьуз

СТи

АТа

СТп

АТа

АЗП

Рго

225

230

235

240

бег

11е

рНе

туг

АЗП

ьуз

АЗР

СТу

бег

РГО

ьуз

ТНг

хТе

СТп

СТи

уа!

245

250

255

туг

АЗП

ьеи

меТ

АЗр

СТу

ьуз

уаТ

АТа

АТа

НТ 5

дгд

ьуз

260 265 <210 45 <211> 275 <212> РРТ <213> неизвестен <220 <223> КРК_12_рЕТ32Ь

- 56 024794 <400> 45

д1а

мет

С! у

Зег

ьуз

дгд

ьуз

ьуз

дгд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

1

5

10

15

ьуз

Уа!

Ьеи

дгд

ьуз

С1у

АЗр

лгд

01 у

АЗр

01 и

уа!

Суз

01 η

ьеи

01 п

20

25

30

ТНг

ьеи

ьеи

АЗП

ьеи

Суз

с!у

туг

Азр

Уа1

с!у

ьуз

Рго

Азр

с1у

11е

35

40

45

РНе

С! у

АЗП

азп

тНг

рНе

АЗП

01 п

Уа!

Уа1

ьуз

рНе

С1п

ьуз

Азр

Азп

50

55

60

Суз

Ьеи

Азр

Зег

Азр

01 у

11е

уа1

01 у

ьуз

АЗП

тНг

тгр

д1а

01 и

ьеи

65

70

75

80

рНе

Зег

ьуз

туг

Зег

РГО

РГО

11е

РГО

туг

ьуз

тНг

11е

РГО

меТ

РГО

85

90

95

тНг

а! а

АЗП

ьуз

Зег

Агд

А1а

А1а

А1а

тНг

РГО

уа!

меТ

А5П

А1а

Уа1

100

105

110

с!и

АЗП

а! а

тНг

01 у

уа1

дгд

Зег

С1п

ьеи

ьеи

ьеи

тНг

рНе

а! а

Зег

115

120

125

11е

с1и 130

Зег

А1а

РНе

АЗР

В?

С1и

11 е

ьуз

д!а

ьуз 140

тНг

Зег

Зег

А1а

тНг

01 у

тгр

рНе

01 η

рНе

ьеи

тЬг

01 у

тНг

тгр

ьуз

тНг

меТ

ιΐε

01и

145

150

155

160

АЗП

туг

01 у

мет

ьуз

туг

01 у

уа!

ьеи

тНг

Азр

РГО

тНг

01 у

д!а

ьеи

165

170

175

дгд

ьуз

АЗр

РГО

лгд

т1е

Зег

л!а

ьеи

меТ

01 у

д!а

01 и

ьеи

т1е

ьуз

180

185

190

о!и

АЗП

мет

АЗП

ίί е

ьеи

Агд

РГО

уа!

ьеи

ьуз

дгд

о!и

РГО

тНг

АЗр

195

200

205

тНг

АЗР

ьеи

туг

ьеи

А1а

нт 3

рНе

РНе

01 у

РГО

01 у

д!а

А1а

Агд

Агд

210

215

220

РЬе

Ьеи

тНг

тНг

С1у

С1п

АЗП

С1и

ьеи

д!а

д1а

ТНг

Нтз

РНе

РГО

ьуз

225

230

235

240

С1и

а! а

С! η

а! а

АЗП

РГО

5ег

1!е

рНе

туг

АЗП

ьуз

АЗР

01 у

Зег

РГО

245

250

255

- 57 024794 ьуз тНг ιΐβ с!п С1и уа! туг дзп ьеи ме! Азр С1у ьуз Уа! д!а д!а

260

265

270

ΗΊ5 Агд

ьуз 275

<210> 46 <211> 277 <212> РРТ <213> неизвестен <220> <223> КРК 14 рЕТ32Ь <400> 46

А!а МеТ 1

С! у

Зег

ьуз 5

лгд

ьуз

ьуз

Агд

Ьуз 10

ЬУЗ

Агд

ьуз

ьуз

дгд 15

ьуз

ьуз лгд

ьуз

уа1 20

ьеи

лгд

ьуз

с! у

АЗр 25

Агд

С1у

Азр

С! и

уа! 30

Суз

С1п

Ьеи с!п

тНг 35

Ьеи

ьеи

АЗП

ьеи

Суз 40

С1у

туг

Азр

Уа!

С1у 45

ьуз

РГО

Азр

С1у ιΐβ 50

рКе

с!у

АЗП

АЗП

тНг 55

рКе

АЗП

С1п

уа!

уа! 60

ьуз

рКе

с!п

ьуз

АЗр АЗП 65

суз

ьеи

АЗр

Зег 70

АЗр

с! у

т!е

уа1

С1у 75

ьуз

ДЗП

тНг

тгр

л! а 80

с!и ьеи

рНе

Зег

ьуз 85

туг

Зег

РГО

РГО

11 е 90

РГО

туг

ьуз

тНг

11е 95

РГО

мет рго

тНг

А1а 100

АЗП

ьуз

Зег

Агд

А! а 105

а! а

А1а

тНг

РГО

уа! 110

мет

АЗП

а! а уа1

С! и 115

АЗП

а! а

ТНг

С! у

Уа1 120

лгд

зег

С1п

ьеи

ьеи 125

ьеи

тНг

рКе

а!а Зег 130

ΐ! е

С1и

Зег

а! а

РНе 135

Азр

туг

С1и

11е

ьуз 140

а! а

ьуз

тНг

Зег

Зег а! а 145

ТЬг

С1у

Тгр

РКе 150

с!п

рКе

ьеи

тНг

01 у 155

тНг

тгр

ьуз

тНг

меТ 160

11е С1и

АЗП

туг

с1 у 165

мет

ьуз

туг

С1у

Уа! 170

Ьеи

тНг

Азр

рго

тНг 175

С! у

А1а ьеи Агд ьуз Азр рго Агд 1!е Зег А1а ьеи меТ С1у л1а С1и ьеи 180 185 190

IIе Ьуз С!и Азп МеТ Азп 11е Ьеи Агд Рго Уа! Ьеи ьуз Агд С1и рго 195 200 205

- 58 024794

ТНг

Азр

ТНг

Азр

ьеи

Туг

ьеи

д1а

нтз

рНе

РНе

С! у

Рго

С! у

а! а

а! а

210

215

220

Агд

Агд

РНе

ьеи

ТНг

тНг

С1у

с!п

АЗП

с! и

ьеи

а! а

а! а

тНг

нтз

рНе

225

230

235

240

Рго

ьуз

С1и

А1а

с! η

А1а

Азп

рго

бег

Пе

рНе

туг

АЗП

ьуз

Азр

С!у

245

250

255

бег

Рго

ьуз

тНг

т!е

С1п

С1и

уа!

туг

АЗП

ьеи

мет

Азр

с! у

ьуз

уа!

260 265 270 д1а А1а нтз Агд ьуз 275 <210> 47 <211> 272 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> Р9_рЕТ32Ь

<400> 47

А! а

Ме!

С! у

бег

Агд

Агд

Агд

Агд

Агд

Агд

Агд

Агд

Агд

ьуз

уа!

ьеи

1

5

10

15

Агд

ьуз

С! у

АЗр 20

Агд

С! у

АЗр

с! и

уа! 25

Суз

с! η

ьеи

С! η

тНг 30

ьеи

ьеи

АЗП

ьеи

Суз

С1у

туг

АЗр

уа!

С! у

ьуз

Рго

Азр

С1у

Не

рНе

С! у

АЗП

35

40

45

АЗП

тНг

РНе

Азп

С1п

Уа!

уа!

ьуз

рНе

С! η

ьуз

Азр

АЗП

Суз

ьеи

лзр

50

55

60

бег 65

АЗР

С! у

Не

уа!

С! у 70

ЬУ5

АЗП

тНг

тгр

а! а 75

с! и

ьеи

рНе

бег

ьуз 80

туг

бег

рго

РГО

Не

РГО

туг

ьуз

тНг

Не

Рго

ме!

РГО

тНг

Д1а

АЗП

85

90

95

ьуз

бег

Агд

А! а

А! а

а! а

тНг

РГО

уа1

ме!

АЗП

а! а

уа!

С1и

АЗП

а! а

100

105

110

тНг

с! у

Уа!

Агд

бег

С! η

ьеи

ьеи

ьеи

тНг

рНе

а! а

бег

Не

с! и

бег

115

120

125

а! а

РНе

Азр

туг

С! и

Не

ьуз

а! а

ьуз

тНг

бег

бег

А! а

тНг

с! у

Тгр

130

135

140

- 59 024794

рНе с!η 145

рНе

Ьеи ТНг СТ у ТНг 150

Тгр Ьуз ТНг МеТ 155

11 е

СТи

Азп

Туг

СТу 160

Μβΐ

ьуз

туг

СТ у

УаТ

ьеи

тНг

АЗр

РГО

тНг

СТ у

АТа

ьеи

Агд

ьуз

Азр

165

170

175

рго

дгд

11е

Зег

АТа

ьеи

мет

СТу

АТа

СТи

Ьеи

1Те

ьуз

сТи

АЗП

мет

180

185

190

АЗП

1Те

ьеи

дгд

РГО

УаТ

ьеи

ьуз

Дгд

СТи

Рго

тНг

дзр

тНг

АЗр

ьеи

195

200

205

туг

ьеи

АТа

НТ 5

рНе

рНе

СТ у

РГО

СТ у

АТа

АТа

дгд

дгд

рНе

ьеи

тНг

210

215

220

тНг

СТу

сТп

АЗП

СТи

ьеи

АТа

АТа

тЬг

НТ 3

рНе

Рго

ьуз

СТи

АТа

с1п

225

230

235

240

дТа

Азп

РГО

5ег

11е

РНе

Туг

Азп

Ьуз

Азр

СТ у

Зег

Рго

Ьуз

тЬг

11е

245

250

255

СТп

СТи

уа!

Туг

АЗП

Ьеи

меТ

Азр

СТ у

Ьуз

уа!

АТа

АТа

нт з

Агд

ьуз

260

265

270

<210> 45 <211> 271 <212> РКТ <213> неизвестен <220>

<223> к8_рЕТ32Ь

<400> 48

а! а

мет

СТ у

Зег

ьуз

ьуз

ьуз

ьуз

«-У5

ьуз

ьуз

ьуз

ьуз

УаТ

ьеи

Агд

1

5

10

15

ьуз

сТу

АЗР

Агд 20

С1у

АЗр

СТ и

УаТ

СТп

Ьеи

СТп

тНг

ьеи 30

ьеи

АЗП

Ьеи

Суз

еТу 35

туг

АЗР

УаТ

СТ у

Ьуз 40

Рго

Азр

СТ у

1Те

рНе 45

СТ у

Азп

Азп

ТНг

РНе

АЗП

С1п

УаТ

УаТ

ьуз

РНе

СТп

ьуз

АЗР

АЗП

Суз

ьеи

Азр

Зег

50

55

60

Азр

С1у

1Те

УаТ

ОТ у

Ьуз

Азп

тЬг

Тгр

АТа

СТи

ьеи

РНе

Зег

Ьуз

туг

65

70

75

ВО

Зег

Рго

рго

ΐΐ е

Рго 85

туг

ьуз

тНг

11 е

РГО 90

мет

РГО

ТНг

АТа

АЗП 95

ьуз

Зег

Агд

АТа

АТа

дТа

тНг

РГО

уа!

меТ

АЗП

дТа

УаТ

сТи

АЗП

АТа

ТНг

100 105 110

- 60 024794

Οίν Уа1 Ага Зег

01 п

ьеи

ьеи

ьеи тЬг РЬе д!а зег 11е с!и Зег А1а

115

120

125

РЬе

А5Р

туг

01 и

ίί е

ьуз

д1а

ьуз

тЬг

5ег

Зег

д1а

тЬг

01 у

тгр

РЬе

130

135

140

01 η

РЬе

ьеи

тЬг

С1у

тЬг

тгр

ьуз

тЬг

мег

т!е

01и

АЗП

туг

С1у

меТ

145

150

155

160

Ьуз

туг

С1у

Уа!

ьеи 165

ТЬг

дзр

РГО

тЬг

01 у 170

д!а

ьеи

Агд

ьуз

АЗр 175

РГО

дгд

11е

зег

А1а

ьеи

мет

01 у

А1а

01 и

ьеи

11е

ьуз

01 и

А5П

мег

АЗП

180

185

190

ίί е

ьеи

дгд

РГО

уа!

ьеи

ьуз

дгд

01 и

РГО

тЬг

АЗР

тЬг

АЗР

ьеи

Туг

195

200

205

ьеи

д1а

ΗΊ 3

РЬе

рЬе

01 у

РГО

01 у

д!а

д!а

дгд

дгд

рЬе

ьеи

тЬг

тЬг

210

215

220

с1у

Οίη

АЗП

01 и

ьеи

А1а А1а

тЬг

ΗΊ3

РЬе

РГО

ьуз

с!и

А1а

Οίη

А1а

225

230

235

240

АЗЛ

РГО

Зег

ίί е

рЬе

туг

АЗП

ьуз

дзр

01 у

Зег

РГО

ьуз

тЬг

ίί е

01п

245

250

255

01 и

уа1

туг

АЗП

ьеи

Μθΐ

АЗР

С1у

ьуз

Уа!

д!а

д!а

нт 5

Агд 270

ьуз

260

265

<210> 49 <211> 302 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> рК2К2144 рЕТ32Ь гттаОЗ <400> 49

А1а 1

МеТ

01 у Зег

ьуз Агд 5

ьуз

ьуз

Агд

ьуз 10

ьуз

Агд

ьуз

лгд

01 у 15

Зег

01 у

Зег

01 у ьуэ 20

лгд ьуз

ьуз

лгд

ьуз 25

ьуз

лгд

ьуз

Агд

01 у 30

Зег

С1у

Зег

01 у

ь^з дгд

ьуз ьуз

лгд

ьуз 40

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

уа1 45

ьеи

лгд

ьуз

С1у

АЗр 50

лгд 01 у

дзр с!и

уа! 55

Суз

01 η

ьеи

01 п

тЬг 60

ьеи

ьеи

АЗП

ьеи

- 61 024794

Суз

СТу

туг

Азр

УаТ

СТу

ьуз

РГО

Азр

СТу

Не

Рпе

СТу

АЗП

АЗП

тКг

65

70

75

80

рКе

АЗП

СТп

УаТ

УаТ

Ьуз

рНе

СТп

ьуз

АЗР

АЗП

суз

ьеи

АЗР

Зег

АЗР

85

90

95

СТу

Не

уаТ

СТу

ьуз

АЗП

тНг

тгр

дТа

С1и

ьеи

рКе

Зег

ьуз

туг

Зег

100

105

110

РГО

РГО

11 е

РГО

туг

ьуз

тКг

ίί е

РГО

мет

РГО

тКг

дТа

АЗП

ьуз

зег

115

120

125

Агд

АТа

АТа

АТа

тКг

Рго

УаТ

меТ

АЗП

АТа

Уа1

СТ и

АЗП

АТа

тКг

СТу

130

135

140

УаТ

Агд

Зег

СТп

Ьеи

ьеи

ьеи

тКг

рпе

дТа

Зег

Не

сТи

Зег

дТа

рКе

145

150

155

160

АЗр

туг

сТи

Не

ьуз

АТа

ьуз

ТКг

Зег

Зег

дТа

тКг

СТу

тгр

РНе

С1п

165

170

175

рКе

ьеи

тКг

сТу

тНг

тгр

ьуз

тКг

меТ

11е

СТ и

АЗП

туг

сТу

мет

ьуз

180

185

190

туг

СТу

уа!

ьеи

тНг

АЗр

РГО

ТКг

СТу

д1а

Ьеи

Агд

ьуз

АЗР

РГО

дгд

195

200

205

11е

Зег

АТа

ьеи

мет

СТу

АТа

СТи

ьеи

1Те

ьуз

СТи

АЗП

меТ

АЗП

Не

210

215

220

ьеи

Агд

РГО

УаТ

ьеи

ьуз

Агд

С1и

РГО

тНг

Азр

тпг

Азр

ьеи

туг

ьеи

225

230

235

240

АТа нтз РКе рКе СТу рго СТу АТа АТа Агд Агд рКе ьеи тКг тЬг СТу 245 250 255

СТп

АЗП

СТи

ьеи

дПа

дТа

τΤιγ

НТ 5

РКе

Рго

Ьуз

СТ и

АТа

СТп

ДТа

Азп

260

265

270

РГО

5ег

11 е

рНе

туг

АЗП

ьуз

АЗр

СТу

Зег

Рго

ьуз

тЬг

Не

СТп

СТ и

275 280 285 уаТ туг азп ьеи меТ Азр СТу ьуз УаТ АТа дТа нтз дгд ьуз 290 295 300 <210> 50 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер Р5РЗдр10 прямой <400> 50

- 62 024794 а!ддда!ссс сдд!са!!аа !ас!сассад 30 <210> 51 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер РЗРЗдрЮ обратный <400 51 !дсса!сасс ссдссадссд !д 22 <210 52 <211> 57 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер РКРЗРЗдрЮ прямой <400> 52 аТдддатсса аасдсаадаа асдтаадааа сдсааассдд ТсаТТааТас Гсассад 57 <210> 53 <211> 176 <212> РРТ <213> неизвестен <220 <223> РКРЗРЗдрЮ <400 53

ме! 1

С1 у

Зег

ьуз

Агд 5

Ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз 10

Агд

ьуз

Рго

Уа1

11 е 15

АЗЛ

тКг

Н13

С1п

АЗП

11 е

А1а

А1а

рНе

Ьеи

Азр

ме!

ьеи

А1а

туг

Зег

С1и

20

25

30

С1 у

тКг

д!а

АЗП

Н1 3

РГО

ьеи

тКг

ьуз

АЗП

дгд

С1у

туг

Азр

Уа!

Не

35

40

45

Уа1

тКг

С1у

рКе

АЗр

С1у

зег

РГО

С1и

т1е

рЬе

тКг

АЗр

туг

Зег

Азр

50

55

60

Η ί 5

Рго

рКе

а! а

ΗΊ 3

С1у

Агд

Рго

РГО

ьуз

Уа1

рКе

АЗП

дгд

дгд

С1у

65

70

75

80

С1и

ьуз

Зег

тКг

д!а 85

Зег

С1у

Агд

туг

С1п 90

С1п

Ьеи

туг

11е

РКе 95

Тгр

РГО

Н13

туг

ьуз

ьуз

С1п

ьеи

А1а

ьеи

РГО

АЗр

рКе

Зег

РГО

ьеи

Зег

100

105

110

С1п

Азр

ьуз

Ьеи

А1а

ίί е

С1п

ьеи

11 е

Агд

С1и

Агд

С1у

А1а

т!е

АЗр

115

120

125

- 63 024794

АЗР

Пе

Агд

а! а

С1у

дгд

11е

С1и

дгд

а! а

уа1

Зег

дгд

Суз

дгд

АЗП

130

135

140

Пе

ТГр

А1а

Зег

ьеи

РГО

С! у

а! а

С1у

туг

с! у

С! η

Агд

С1и

ΗΊ5

Зег

145

150

155

160

ьеи

С1и

ьуз

ьеи

уа!

тНг

Уа!

тгр

Агд

тНг

а! а

с! у

с! у

уа!

мет

а! а

165 170 175 <210 54 <211> 28 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220 <223> праймер ЗР2дрО9 прямой <400 54 атдддатссс сддгаатьаа сасдсаСс 28 <210> 55 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220 <223> праймер р2дрО9 обратный <400> 55 адссддТасд ссдссадсдд Тасдс 25 <210 56 <211> 54 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220 <223> праймер РКР2дрО9 прямой <400 56 аТдддаТсса аасдсаадаа асдТаадааа сдсааассдд ТааССаасас дсаТ 54 <210> 57 <211> 176 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> РКР2дрО9 <400> 57 мет С! у Зег ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз дгд ьуз рго Уа1 Не азп 15 10 15 тНг Н15 с!п А5П Не А1а А1а рНе ьеи Азр мет ьеи д!а Уа! зег с!и 20 25 30

- 64 024794

С1у тНг

А1а азп 35

нтз

рго сеи

тЬг 40

суз

азп Агд С1у туг 45

АЗр

уа!

ι! е

Уа!

тЬг

С! у

сеи

Азр

с! у

суз

РГО

С1и

11 е

РЬе

тНг

Азр

туг

Еег

Азр

50

55

60

НТ 3

РГО

рНе

а! а

НТЗ

с1у

Агд

РГО

д1а

суз

уа!

рНе

АЗП

Агд

Агд

С! у

65

70

75

80

С! и

суз

Еег

ТНг

а! а 85

Еег

С! у

Агд

Туг

с! η 90

С! η

Сеи

туг

сеи

РНе 95

тгр

РГО

НТ £

туг

дгд

суз

С1п

сеи

А1а

сеи

РГО

АЗр

рНе

Еег

РГО

ьеи

Еег

100

105

110

с! η

АЗр

Агд

сеи

а! а

т!е

с! η

сеи

11е

Агд

С1и

Агд

С! у

а! а

сеи

АЗр

115

120

125

Азр

ι! е

Агд

А1а

С1у

дгд

11е

С! и

Агд

а! а

11е

Еег

Дгд

Суз

Агд

АЗП

130

135

140

11 е

тгр

А1а

Еег

Сеи

РГО

С! у

а! а

С1у

туг

С1у

С1п

Агд

с! и

НТЗ

Еег

145

150

155

160

сеи

С! и

суз

сеи

Уа!

ТЬг

Уа!

тгр

Агд

тНг

а! а

С! у

С! у

уа!

РГО

а! а

165

170

175

<210> 58 <211> 21 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер ОВРдрСУЗ прямой <400 58 аСоаааааТа асаааааааа ΐ 21 <210> 59 <211> 24 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер ОВРдрСУЗ обратный <400> 59 аастаттссд адТдсТТТсТ ГЕдТ 24 <210> 80 <211> 54 <212>ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер РКОВРдрЬУЗ прямой <400> 60 агдддатсса аасдсаадаа асдтаадааэ сдсааааааа атадсдадаа даат 54

- 65 024794 <210> 61 <211> 339 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> РКОВРдрЬУЗ

<400>

61

мет

с! у

Зег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

АЗП

зег

С! и

1

5

10

15

ьуе

АЗП

А1а

Зег

ΐί е

х!е

меТ

Зег

ί! е

С! η

Агд

тНг

ьеи

а! а

Зег

ьеи

20

25

30

Зег

ьеи

1Г

с! у

С1 у

лгд

ιΐβ

Азр 40

С! у

Ьеи

РНе

С! у

С1и 45

ьуз

Суз

Агд

С1у

а! а

11е

х1е

ьеи

мет

ьеи

АЗП

ьуз

уа!

туг

РГО

АЗП

РЬе

Зег

тНг

50

55

60

АЗП

ьуз

ьеи

РГО

Зег

АЗП

ТЬг

Туг

С1и

а! а

с! и

Зег

Уа!

рЬе

ТЬг

РНе

65

70

75

80

Ьеи

с! η

тЬг

А1а

ьеи 85

А1а

с! у

Уа!

С1у

ьеи 90

Туг

ТЬг

11е

тЬг

11 е 95

Азр

С1 у

ьуз

тгр

С1у 100

С1у

тЬг

Зег

С1п

с!у 105

А! а

Не

АЗр

а! а

ьеи но

уа!

ьуз

5ег

туг

Агд

с1п

х1е

тЬг

с! и

а! а

С! и

Агд

а! а

с! у

Зег

тЬг

Ьеи

Рго

115

120

125

Ьеи

с! у

ьеи

д1а

тЬг

уа!

мет

Зег

ьуз

нтз

мет

зег

Не

с! и

С! η

ьеи

130

135

140

дгд

а! а

мет

ьеи

рго

тЬг

Азр

лгд

С1п

С! у

туг

д1а

С1и

уа1

туг

х1е

145

150

155

160

Азр

РГО

ьеи

АЗП

С1и

тЬг

мет

Азр

11е

РЬе

с! и

11е

Азп

тЬг

РГО

Ьеи

165

170

175

Агд

11 е

а! а

НТ 5

РЬе

мет

а! а

С1п

11е

ьеи

НТЗ

с! и

тЬг

а! а

Суз

РЬе

180

185

190

ьуз

туг

тЬг

С1и

С1и

Ьеи

а! а

Зег

С! у

ьуз

а!а туг

С! и

С! у Агд а! а

195

200

205

АЗР

ьеи

С1у

АЗП

тЬг

лгд

рго

с! у

Азр

С! у

рго

ьеи

рКе

ьуз

С! у Агд

210

215

220

- 66 024794

01 у

ьеи

ьеи

С! η

т1е

тНг

С! у

лгд

ьеи

АЗП

туг

Уа!

ьуа

Суа

θ! η

Уа!

225

230

235

240

туг

ьеи

Агд

01 и

ьуа

ьеи

ьуз

Аар

рго

тНг

РНе

дар

11е

тНг

зег

Зег

245

250

255

уа!

тНг

Суа

а! а

Οίη

οίη

ьеи

Зег

с! и

зег

РГО

ьеи

ьеи

а! а

А1а

ьеи

260

265

270

а! а

5ег

&

туг

РНе

тгр

Агд

рНе 280

11е

ьуа

РГО

ьуа

ьеи 285

Аап

О! и

тНг

а! а

дар

ьуа

Аар

дар

11е

туг

тгр

уа!

Зег

уа!

туг

уа!

АЗП

01 у

туг

290

295

300

а! а

ьуа

С! η

д1а

АЗП

РГО

туг

тур

РГО

АЗП

дгд

дар

ьуз

01 и

РГО

лап

305

310

315

320

НТ 5

мет

ьуа

о! и

дгд

Уа!

с! η

мет

ьеи

А1а

уа!

тНг

ьуа

ьуа

а! а

ьеи

325

330

335

о! у 11е уа!

<210> Θ2 <211> 283 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> рк2кг144рЕТ32Ь

<400> 62

д1а

мет

с! у

Зег

ьуз

дгд

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

лгд

5ег

ьуз

1

5

10

15

Агд

Ьуз

ьуз

Агд

ьуз

Ьуз

Агд

Ьуз

ьуз

Уа1

Ьеи

Агд

ьуз

О! у

Аар

Агд

20

25

30

61 у

Аар

С! и

Уа!

Суа

61 п

Ьеи

01 п

тНг

Ьеи

Ьеи

Аап

ьеи

Суз

01 у

туг

35

40

45

дар

Уа!

С! у

ьуз

РГО

дар

С! у

Не

рНе

01 у

АЗП

АЗП

тНг

РНе

Аап

Οίη

50

55

60

Уа!

Уа!

Ьуа

рНе

01 п

Ьуа

Аар

Аап

Суз

Ьеи

Аар

Зег

Аар

С! у

Не

Уа!

65

70

75

80

01 у

ьуа

дап

тНг

тгр

а! а

01 и

ьеи

РНе

Зег

ьуа

туг

Зег

рго

РГО

ι! е

85

90

95

- 67 024794

рго

Туг Ьуз тКг 100

Не

Рго Ме* рго тКг д!а дзп ьуз Зег 105

Агд 110

а! а

А1а

а! а

ТКг

РГО

Уа1

ме*

АЗП

а! а Уа!

С! и

АЗП

А1а

тКг

01 у

уа!

лгд

Зег

115

120

125

01 η

ьеи

Ьеи

ьеи

ТКг

РКе

а! а

Зег

ίί е

01 и

Зег

а! а

РКе

Азр

туг

01 и

130

135

140

Не

ьуз

а! а

ьуз

тКг

Зег

Зег

а! а

тКг

с1у

Тгр

РКе

С1п

рКе

ьеи

тКг

145

150

155

160

И у

тКг

тгр

ьуз

тКг

ме*

П е

01 и

АЗП

туг

01 у

ме*

ьуз

туг

01 у

уа!

165

170

175

ьеи

тКг

АЗр

РГО

тКг

С! у

а! а

ьеи

дгд

ьуз

Азр

РГО

дгд

Пе

Зег

д1а

180

185

190

ьеи

ме*

с! у

а! а

с! и

ьеи

Не

ьуз

С! и

АЗП

ме*

АЗП

Пе

ьеи

Агд

рго

195

200

205

уа!

ьеи

ьуз

дгд

С! и

РГО

ТКг

Азр

тКг

Азр

Ьеи

туг

Ьеи

А1а

нт 5

рКе

210

215

220

рКе

С! у

РГО

С! у

а! а

а! а

лгд

дгд

рКе

ьеи

тКг

тКг

С1у

С1п

АЗП

С! и

225

230

235

240

Ьеи

а! а

а! а тКг

НТ 3

РКе

РГО

ьуз

01 и

а! а

01 η

А1а

АЗП

РГО

Зег

11е

245

250

255

РКе

туг

АЗП

ьуз

АЗр

01 у

Зег

РГО

ьуз

ТКг

Не

01 η

01 и

уа!

Туг

А5П

260

265

270

ьеи

ме*

АЗР

С! у

ьуз

уа!

а! а

а! а

НТ 5

лгд

ьуз

275

280

<210> 63 <211> 294 <212> РКТ <213> неизвестен <220>

<223> ркЗкг144рЕТ32Ь <400> Θ3

а! а

ме*

01 у

Зег

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

Агд

Зег

ьуз

1

5

10

15

Агд

ьуз

ьуз

Агд 20

ьуз

ьуз

Агд

Ьуз

Агд 25

зег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз 30

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

уа!

ьеи

лгд

ьуз

0Ί у

Азр

Агд

01 у

АЗР

о! и

Уа!

Суз

35

40

45

- 68 024794

οίη

ьеи 50

Οίη

тЬг

ьеи

ьеи

Азп ьеи Суз 01 у туг Азр Уа1

01 у

ьуз

РГО

55

60

АЗ»

С1у

11е

рЬе

С1у

АЗП

АЗП

ТЬг

рЬе

АЗП

Οίη

уа!

уа!

ьуз

рЬе

Οίη

65

70

75

80

ьуз

АЗр

АЗП

Суз

ьеи 85

АЗр

Зег

АЗр

с1у

ιΐβ 90

уа!

01 у

ьуз

АЗП

тЬг 95

тгр

л!а

С1и

ьеи

рЬе

Зег

ьуз

Туг

Зег

РГО

РГО

11 е

РГО

туг

ьуз

тЬг

11 е

100

105

110

РГО

мет

РГО

тЬг

л!а

АЗП

ьуз

зег

лгд

А1а

л!а

д1а

(Ьг

РГО

Уа1

меТ

115

120

125

АЗП

а! а

уа!

С1и

АЗП

А1а тЬг

01 у

уа!

лгд

Зег

Οίη

ьеи

ьеи

ьеи

ТЬг

130

135

140

РЬе

А1а

Зег

11е

С1и

Зег

А1а

РЬе

А5р

туг

01 и

11е

ьуз

д!а

ьуз

тЬг

145

150

155

160

Зег

Зег

д1а

тЬг

с1у

тгр

рЬе

С1п

РЬе

Ьеи

тЬг

с1у

тЬг

тгр

ьуз

тЬг

165

170

175

мет

11е

с1и

АЗП

Туг

01 у

мет

ьуз

туг

С1 у

уа!

ьеи

ТЬг

Азр

РГО

тЬг

180

185

190

01 у

д!а

ьеи

Агд

ьуз

АЗр

РГО

Агд

11е

Зег

л!а

ьеи

меТ

С1у

А1а

С1и

195

200

205

ьеи

ιΐβ

ьуз

Е1и

АЗП

меТ

АЗП

ιΐβ

ьеи

лгд

РГО

уа1

ьеи

ьуз

лгд

о!и

210

215

220

РГО

тЬг

АЗр

тЬг

Азр

ьеи

туг

ьеи

д!а

нт 3

рЬе

рЬе

01 у

РГО

01 у

д!а

225

230

235

240

д!а

дгд

дгд

рЬе

ьеи

тЬг

тЬг

С1у

Οίη

АЗП

01и

ьеи

д!а

л!а

тЬг

НТ 5

245

250

255

рЬе

РГО

ьуз

О1и

А1а

01 η

А1а

АЗП

РГО

зег

11 е

рЬе

туг

АЗП

ьуз

АЗр

260

265

270

С1у

Зег

Рго

ьуз

тЬг

11е

01 п

С1и

Уа!

туг

АЗП

ьеи

мет

Азр

01 у

ьуз

275

280

285

Уа1 д!а д1а нтз дгд ьуз 290 <210> 64 <211> 305 <212> РРТ <213> неизвестен

- 69 024794 <220>

<223> рК4К2144рЕТ32Ь <400> 64

а! а

меТ

С1у

Зег

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

Агд

зег

ьуз

1

5

10

15

дгд

Ьу5

ьуэ

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

лгд

Зег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

20

25

30

ьуз

дгд

ьуз

Агд

Зег

ьуз

Агд

ьуз

Ьуз

Агд

ЬУ5

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Уа1

35

40

45

ьеи

дгд

ьуз

СТу

АЗР

лгд

с! у

АЗР

С! и

Уа!

Суз

С1п

ьеи

е!п

ТНг

Ьеи

50

55

60

ьеи

АЗП

ьеи

Суз

с! у

туг

АЗР

уа!

С1у

ьуз

РГО

АЗР

с! у

11е

РНе

с! у

65

70

75

80

АЗЛ

А5П

тНг

РНе

АЗП

с!п

уа!

уа!

ьу5

рНе

С1п

ьуэ

АЗр

АЗП

Суз

ьеи

85

90

95

АЗр

Зег

Азр

С1у

ιΐβ

Уа!

С1у

ьуз

АЗП

тНг

тгр

а! а

с! и

ьеи

РНе

Зег

100

105

110

ьуз

туг

5ег

Рго

РГО

11е

РГО

туг

Ьу5

тНг

11е

РГО

мет

РГО

тНг

д!а

115

120

125

АЗП

ьуз

Зег

лгд

А! а

л1а

а! а

ТНг

РГО

уа!

мет

АЗП

а! а

уа!

С! и

АЗП

130

135

140

а! а

тЬг

С1у

Уа!

Агд

зег

С!п

ьеи

ьеи

ьеи

тНг

рНе

А1а

Зег

ΐ! е

С! и

145

150

155

160

Зег

а! а

рНе

Азр

С1и

ι! е

ьуз

а! а

ьуз 170

ТНг

Зег

зег

а! а

тНг 175

С! у

Тгр

рНе

сТп

РНе

ьеи

тНг

с! у

ТНг

тгр

ьуз

тНг

МеТ

ι! е

с! и

Азп

туг

180

185

190

С1у

мет

ьуз

туг

с! у

уа!

ьеи

тНг

АЗр

РГО

ТНг

С1у

а! а

ьеи

лгд

ьуз

195

200

205

Азр

Рго

Агд

ι! е

Зег

а! а

ьеи

мет

с! у

а! а

С! и

Ьеи

11 е

ьуз

С! и

АЗП

210

215

220

меТ

Азп

11 е

ьеи

Агд

Рго

Уа!

ьеи

ьуз

Агд

С1и

РГО

ТНг

Азр

ТНг

Азр

225

230

235

240

- 70 024794

ьеи туг ьеи

Αί а

ΗΊ 3 245

РНе РНе С1у Рго 01 у 250

л!а д!а

Агд

дгд

РНе 255

ьеи

тНг

тНг

О1у

с1п

АЗП

01 и

ьеи

А1а

А1а

тНг

Н1 5

РНе

Рго

ЬУ5

01 и

А1а

260

265

270

с1п

д!а

АЗП

РГО

5ег

ίί е

рНе

туг

АЗП

ьуз

АЗР

С1у

5ег

РГО

ьуз

тНг

275

280

285

ίί е

01 η

01 и

уа!

туг

АЗП

ьеи

мет

Азр

01 у

ьуз

Уа1

А1а

А1а

Н1 5

Агд

290

295

100

ьуз

305

<210>

65

<211>

18

<212>

РРТ

<213>

неизвестен

<220>

<223>

праймер др188 прямой

<400>

65

д!а '

тНг <

31 у л!а А1а Суз тНг тНг Суз Суз 01 у 01 у д!а Суз

01 у

л!а

1

5

10

15

а! а ι

Е1 у

<210>

66

<211>

282

<212>

РРТ

<213>

неизвестен

<220>

<223>

КРК_19_рЕТ32Ь

<400

66

д!а 1

меТ

С1у

5ег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

Агд

ьуз

Ьуз

Агд 15

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

ьуз

Уа1

ьеи

Агд

ьуз

01 у

АЗр

Агд

01 у

20

25

30

АЗр

01 и

Уа!

Суз

01 η

ьеи

С1п

тНг

ьеи

ьеи

АЗП

ьеи

Суз

01 у

туг

Азр

35

40

45

Уа1

01 у

ьуз

РГО

АЗр

С1у

11е

РНе

01 у

АЗП

АЗП

тНг

рНе

АЗП

01 п

Уа1

50

55

60

Уа1

Ьуз

рНе

С1п

ьуз

Азр

АЗП

Суз

ьеи

Азр

5ег

Азр

01 у

11е

уа!

01 у

65

70

75

80

- 71 024794

Ьуз АЗП

тЬг тгр

л!а 85

С1и ьеи РЬе Зег

ьуз туг Зег рго рго 11е рго

90

95

туг

ьуз

тЬг

1!е

РГО

мет

РГО

тЬг

л1 а

АЗП

ьуз

Зег

Агд

д!а

А1а

А1а

100

105

110

ТЬг

Рго

Уа1

меТ

АЗП

А! а

Уа!

С1и

АЗП

А1а

тЬг

С1у

уа1

Агд

Зег

С1п

115

120

125

ьеи

Ьеи

Ьеи

тЬг

РЬе

д! а

Зег

ΐ! е

С1и

Зег

А1а

РЬе

Азр

Туг

С1и

ίί е

130

135

140

ьуз

А1а

ьуз

тЬг

5ег

зег

А1а

тЬг

С1у

тгр

РЬе

С1п

РЬе

ьеи

тЬг

С1у

145

150

155

160

тЬг

тгр

Ьу5

тЬг

меТ

11 е

с! и

АЗП

туг

С1у

МеТ

ьуз

туг

С1у

Уа!

ьеи

165

170

175

тЬг

АЗр

РГО

тЬг

С! у

а! а

ьеи

Агд

ьуз

АЗр

РГО

Агд

ίί е

Зег

А1а

Ьеи

1В0

185

190

меТ

С1у

л!а

С1и

ьеи

1!е

ьуз

С1и

АЗП

меТ

АЗП

т!е

ьеи

дгд

РГО

уа!

195

200

205

ьеи

Ьуз

Агд

С1и

Рго

тЬг

Азр

тЬг

А5р

ьеи

туг

ьеи

л!а

нт 5

рЬе

рЬе

210

215

220

б!у

РГО

С1у

а! а

а! а

Агд

дгд

РЬе

ьеи

тЬг

тЬг

С1у

С1п

АЗП

с!и

ьеи

225

230

235

240

а! а А1а

ТЬг

НТЗ

РЬе

Рго

Ьуз

с!и

А1а

С1п

А1а

АЗП

РГО

5ег

ίί е

рЬе

245

250

255

туг Азп ьуз Азр С1у Зег Рго ьуз тЬг 11е с!п с!и уа! туг азп ьеи 260 265 270 меТ Азр С1у ьуэ Уа! А1а А!а Нтз Агд Ьуз 275 280 <210> 67 <211> 284 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> КРК_21 рЕТ32Ь <400> 67 а!а меТ С1у Зег ьуз Агд ьуз ьуз дгд ьуз ьуз дгд ьуз ьуз дгд ьуз 15 10 15

Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд ьуз Ьуз Уа1 Ьеи Агд ьуз С1у Азр 20 25 30

- 72 024794

Агд С1у Азр

С! и

Уа!

Суз

С! η

Ьеи С1п тНг Ьеи Ьеи Азп Ьеи

Суз

С! у

35

40

45

туг

АЗР

уа!

С! у

ьуз

РГО

Азр

С! у

Пе

РНе

С! у

АЗП

АЗП

ТНг

РНе

Азп

50

55

60

С! η

уа!

уа!

ьуз

рНе

С! η

ьуз

АЗр

АЗП

Суз

ьеи

Азр

бег

АЗр

С! у

Не

65

70

75

80

уа!

С! у

ьуз

АЗП

тНг 85

тгр

а! а

С! и

ьеи

рНе 90

бег

ьуз

туг

бег

РГО 95

РГО

Не

РГО

туг

ьуз

тНг

Не

РГО

ме!

РГО

тНг

а! а

АЗП

ьуз

бег

дгд

л1а

100

105

110

а! а

а! а

тНг

РГО

Уа!

Ме!

АЗП

а! а

уа1

е!и

АЗП

а! а

тНг

с! у

уа!

Агд

115

120

125

бег

с!п

ьеи

ьеи

ьеи

тНг

РНе

а! а

бег

Не

с! и

бег

А1а

рНе

Азр

туг

130

135

140

с! и

Не

ьуз

а! а

ьуз

тНг

бег

бег

а! а

тНг

С1у

Тгр

рНе

с!п

РНе

Ьеи

145

150

155

160

тНг

С1у

тНг

тгр

ьуз

тНг

ме!

Не

С! и

АЗП

туг

С! у

ме!

ьуз

туг

01 у

165

170

175

Уа!

Ьеи

тНг

А5Р

Рго

тНг

С! у

а! а

ьеи

дгд

ьуз

Азр

РГО

Агд

Не

бег

185 190

а! а

ьеи

ме!

с!у

а! а

01и

ьеи

Пе

ьуз

о! и

АЗП

ме!

АЗП

Не

ьеи

Агд

195

200

205

РГО

Уа! 210

ьеи

ьуз

Агд

01 и

РГО 215

тНг

АЗр

тНг

АЗр

ьеи 220

туг

ьеи

А1а

НТЗ

рНе

рНе

С! у

РГО

01 у

л1а

л!а

Агд

лгд

рНе

ьеи

тНг

тНг

01 у

С1п

АЗП

225

230

235

240

01 и

Ьеи

А! а

А1а

ТНг

НТ 5

РНе

Рго

ьуз

01и

а! а

01 п

а! а

АЗП

РГО

бег

245

250

255

Не

рНе

туг

АЗП

ьуз

Азр

01 у

бег

РГО

ьуз

тНг

Пе

01 η

01 и

Уа1

туг

260

265

270

АЗП

ьеи

ме!

Азр

01 у

ьуз

Уа!

А! а

а! а

нтз

Агд

ьуз

275

280

- 73 024794

<210> 68

<211> 288 <212> РРТ

<213> неизвестен

<220>

<223> КРК_25_рЕТ32Ь

<400> 68

д1а

меТ

СТу

бег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

дгд

ьуз

ьуз

дгд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

1

5

10

15

ьуз

Агд

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

дгд

ьуз 25

ЬУ5

дгд

ьуз

ьуз

ьуз 30

уаТ

ьеи

Агд

ьуз

сТу

АБр

Агд

сТу

Азр

сТи

УаТ

Суз

СТп

Ьеи

СТп

ТНг

ьеи

ьеи

35

40

45

АЗП

ьеи

суз

сТу

Туг

Азр

уа1

сТу

ьуз

рго

Азр

СТу

хТе

рНе

СТу

АЗП

50

55

60

АЗП

тНг

рНе

АЗП

сТп

УаТ

УаТ

ьуз

рНе

сТп

ьуз

АЗр

АЗП

Суз

ьеи

лзр

65

70

75

80

бег

Азр

СТу

Не

УаТ

СТу

ьуз

АЗП

тНг

тгр

АТа

сТи

ьеи

РНе

бег

ьуз

85

90

95

Туг

бег

Рго

Рго

Не

Рго

Туг

ьуз

тНг

Пе

РГО

мет

РГО

ТНг

АТа

АЗЛ

100

105

но

ьуз

бег

Агд

лТа

лТа

лТа

тНг

РГО

уа!

меТ

АЗП

лТа

уаТ

СТ и

АЗП

дТа

115

120

125

ТНг

СТу

УаТ

Агд

бег

СТп

ьеи

ьеи

Ьеи

тНг

РНе

АТа

бег

Не

СТ и

бег

130

135

140

д!а

рНе

Азр

туг

сТи

Не

ьуз

АТа

ьуз

тНг

бег

бег

а1 а

тНг

СТу

тгр

145

150

155

160

РНе

СТп

РНе

Ьеи

ТНг

СТ у

тНг

тгр

Ьуз

тНг

МеТ

Не

СТ и

Азп

Туг

СТу

165

170

175

МеТ

ьуз

туг

СТу

Уа1

Ьеи

тНг

АЗР

РГО

ТНг

СТу

АТа

Ьеи

Агд

ьуз

Азр

180

185

190

РГО

Агд

11 е

бег

АТа

ьеи

мет

СТу

АТа

еТи

ьеи

Не

ьуз

СТи

АЗП

мет

195

200

205

АЗП

Не

ьеи

Агд

РГО

УаТ

ьеи

ьуз

дгд

СТ и

РГО

тНг

АЗр

тНг

АЗр

ьеи

210

215

220

туг

ьеи

лТа

нт з

рНе

рНе

СТу

рго

С1у

АТа

лТа

дгд

Агд

рНе

ьеи

тНг

225

230

235

240

- 74 024794

тКг сТу СТп АЗП

сТи ьеи дТа 245

АТа тЬг

нт 3 250

РКе Рго ьуз СТи А1а 255

СТп

д1 а

Азп

Рго

Зег

11е

РЬе

Туг

АЗП

ьуз

АЗр

СТ у

Зег

РГО

ьуз

тКг

11 е

260

265

270

СТп

СТи

УаТ

туг

Азп

ьеи

мет

дзр

СТ у

ьуз

уаТ

дТа

дТа

НТ 5

дгд

ьуз

275 280 285 <210> 69 <211> 302 <212> РКТ <213> неизвестен <220

<223>

ККК_39_рЕТ32

:Ь

<400>

69

АТа 1

МеТ

сТу

зег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз 10

ьуз

дгд

ьуз

ьуз

Агд 15

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

20

25

30

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Уа1

Ьеи

Агд

ьуз

35

40

45

сТу

АЗр 50

дгд

сТу

АЗр

сТи

уаТ 55

Суз

СТп

Ьеи

СТп

тКг 60

ьеи

Ьеи

АЗП

ьеи

Суз

С1у

туг

АЗр

УаТ

СТ у

ьуз

РГО

АЗр

С1 у

1Те

РКе

С1у

АЗП

АЗП

тЬг

65

70

75

80

рНе

АЗП

СТп

УаТ

Уа1

ьуз

РНе

сТп

ьуз

Азр

АЗП

суз

ьеи

Азр

Зег

АЗР

85

90

95

СТ у

11е

уаТ

сТу

ьуз

АЗП

τΤιγ

тгр

АТа

сТи

ьеи

рКе

зег

ьуз

туг

Зег

100

105

110

РГО

РГО

ΐΐ е

РГО

туг

ьуз

τΤιγ

1Те

РГО

меТ

РГО

тКг

дТа

АЗП

ьуз

Зег

115

120

125

Агд

дТа

АТа

АТа

тКг

РГО

уаТ

МеТ

АЗП

АТа

УаТ

СТи

АЗП

А1а

тКг

С1у

130

135

140

УаТ

Агд

Зег

СТп

ьеи

ьеи

ьеи

ТЬг

РНе

АТа

Зег

11 е

СТи

Зег

ДТа

РНе

145

150

155

160

АЗр

туг

СТи

ΐΐ е

ьуз

АТа

ьуз

тЬг

Зег

Зег

АТа

тКг

СТ у

тгр

рКе

С1п

165

170

175

РНе

ьеи

тНг

с1у

тКг

тгр

ьуз

тпг

меТ

ιΐβ

СТи

АЗП

туг

сТу

мет

ьуз

180

185

190

- 75 024794

Туг

сТу

УаТ 195

ьеи

тНг

Азр

РГО

тНг 200

СТу

л1а

ьеи

Агд

ьуз 205

Азр

РГО

Агд

ιΐβ

5ег

а! а

ьеи

меТ

С1 у

А1а

СТи

ьеи

11е

ьуз

бТи

АЗП

меТ

АЗП

Пе

210

215

220

ьеи

дгд

РГО

УаТ

ьеи

ьуз

дгд

сТи

РГО

тНг

АЗр

тНг

АЗр

ьеи

туг

ьеи

225

230

235

240

АТа

НТ 5

РНе

РНе

С1у 245

РГО

СТ у

АТа

АТа

Агд 250

Агд

РНе

ьеи

тНг

тНг 255

СТ у

С1п

А5П

СТи

ьеи

дТа

д1а

тНг

НТ 5

Рпе

РГО

ьуз

СТи

АТа

С1п

АТа

АЗЛ

260

265

270

Рго

Зег

11 е 275

РЬе

туг

Азп

ьуз

Азр 280

СТу

Зег

Рго

ьуз

тНг 285

ХТе

СТп

СТи

уа!

2^0

АЗП

ьеи

МеТ

АЗр

С1у 295

ьуз

уа!

А1а

АТа

НТ 5 300

дгд

ьуз

<210> 70 <211> 282 <212> РКТ <213> неизвестен <220>

<223> К19_рЕТ32Ь

<400> 70

АТа

меТ

с1у

зег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

дгд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

Агд

ьуз

1

5

10

15

ьуз

дгд

ьуз

ьуз

дгд

ьуз

ьуз

ьуз

УаТ

ьеи

Агд

ьуз

СТ у

Азр

Агд

С1у

20

25

30

Азр

СТ и

УаТ

Суз

сТп

ьеи

СТп

тНг

ьеи

ьеи

АЗП

ьеи

Суз

С1у

туг

АЗр

35

40

45

УаТ

С1у

ьуз

РГО

АЗр

С1у

Не

РНе

сТу

АЗП

АЗП

тНг

рНе

АЗП

СТп

уа!

50

55

60

уа!

ьуз

рНе

СТ п

ьуз

А5р

АЗП

Суз

ьеи

Азр

Зег

Азр

сТу

ιΤβ

УаТ

СТ у

65

70

75

80

ьуз

АЗП

тНг

тгр

АТа 85

СТ и

Ьеи

рНе

Зег

туг

Зег

рго

РГО

Пе 95

РГО

туг

ьуз

тНг

Не

РГО

мет

РГО

тНг

АТа

АЗП

ьуз

Зег

дгд

А1а

АТа

а! а

100

105

110

- 76 024794

тНг рго уа!

меТ

АЗП

а! а

уа!

с!и азп а!а тКг с!у уа!

Агд

Еег

с! η

115

120

125

сеи

сеи

Сеи

тНг

рКе

а! а

Еег

11е

с! и

Еег

а! а

рНе

АЗр

туг

С! и

ιΐε

130

135

140

суз

а! а

суз

тНг

Еег

Еег

л1а

тНг

С! у

тгр

рЬе

С1п

рЬе

Сеи

тНг

С! у

145

150

155

160

тНг

тгр

суз

тНг

меТ

11е

С1и

АЗП

туг

С! у

меТ

суз

туг

С! у

уа!

сеи

165

170

175

тНг

Азр

РГО

тНг

С! у

а1 а

сеи

лгд

суз

Азр

РГО

Агд

ι! е

Еег

а! а

сеи

180

185

190

мет

С! у

А1а

с! и

сеи

11 е

суз

С! и

АЗП

мет

АЗП

ι! е

Сеи

Агд

РГО

Уа!

195

200

205

Сеи

суз

Агд

С! и

РГО

тЬг

Азр

тНг

АЗр

сеи

туг

сеи

А1а

НТ 3

рНе

рЬе

210

215

220

С1у

РГО

с! у

д! а

д1а

лгд

дгд

РНе

сеи

тНг

тНг

с! у

С1п

АЗП

с! и

ьеи

225

230

235

240

А1а а!а тНг

НТЗ

рКе

РГО

суз

С! и

А! а

С! η

а! а

АЗП

РГО

Еег

ι! е

рНе

245

250

255

туг АЗП

суз

дзр

с! у

Еег

РГО

суз

тНг

ιΐε

с! η

с! и

уа!

туг

АЗП

сеи

260

265

270

меТ

АЗр

С! у

суз

Уа!

а! а

А1а

нтз

Агд

суз

275

280

<210>

71

<211=-

279

<212>

РРТ

<213>

неизвестен

<220

<223>

К16_рЕТ32Ь

<400

71

д!а

МеТ

С! у

Еег

суз

суз

суз

суз

суз

суз

суз

суз

суз

суз

суз

суз

1

5

10

15

суз

суз

суз

цуз 20

суз

Уа!

ьеи

Агд

суз 25

с! у

АЗр

лгд

С! у

АЗр 30

с! и

Уа!

Суз

С! η

сеи 35

С1п

тНг

сеи

сеи

АЗП 40

сеи

Суз

С1у

туг

Азр 45

Уа1

с! у

суз

РГО

Азр

С! у

11е

рНе

с! у

АЗП

АЗП

тНг

РНе

Азп

С1п

уа!

уа!

суз

рНе

50

55

60

- 77 024794

Оп ьуз 65

АЗР

азп Суз ьеи 70

лзр Зег Азр

Оу Пе уа1 75

Оу

ьуз

АЗП

тКг 80

Тгр

д! а

О и

Ьеи

рКе

Зег

ьуз

туг

Зег

РГО

РГО

Пе

РГО

туг

ьуз

тКг

85

90

95

Пе

рго

ме!

РГО

тКг

а! а

АЗП

ьуз

Зег

дгд

А1а

д!а л!а

тКг

РГО

Уа!

100

105

110

ме!

АЗП

д1а

уа!

О и

АЗП

А1а

тКг

Оу

уа1

лгд

5ег

О η

ьеи

ьеи

ьеи

115

120

125

ТКг

рКе

а! а

Зег

Пе

О и

Зег

А1а

РКе

лзр

туг

О и

11е

ьуз

А1а

ьуз

130

135

140

тКг

Зег

зег

А1а тКг

Оу

тгр

рКе

Оп

РКе

ьеи

ТКг

Оу

тКг

тгр

ьуз

145

150

155

160

ТКг

ме!

Не

О и

Азп 165

туг

Оу

ме!

Ьу5

туг 170

Оу

Уа1

ьеи

тКг

Азр 175

РГО

тКг

Оу

д1а

ьеи

Агд

ьуз

Азр

РГО

Агд

Пе

Зег

л! а

ьеи

ме!

Оу

А1а

180

185

190

О и

ьеи

ίί е 195

ьуз

О и

АЗП

ме!

АЗП 200

Пе

ьеи

Агд

РГО

Уа! 205

ьеи

ьуз

дгд

О и

РГО

тКг

АЗР

тЬг

АЗр

ьеи

туг

ьеи

А1а

НТ 5

рКе

рЬе

Оу

РГО

Оу

210

215

220

А1а

а! а

Агд

Агд

рКе

ьеи

тКг

тКг

Оу

О η

АЗП

О и

ьеи

А1а

д!а

тКг

225

230

235

240

НТ 3

рКе

РГО

ьуз

О и

л!а

О η

д!а

АЗП

РГО

Зег

Не

рКе

туг

АЗП

ьуз

245

250

255

Азр Оу Зег рго ьуз тКг 11е Оп Ои Уа! туг Азп ьеи ме! Азр Оу 260 265 270 ьуз уа! а!а а!а нтз Агд ьуз 275 <21О 72 <211> 294 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> ρΚΚΖ-144 К2_рЕТ32Ь <400 72 ”

- 78 024794

л!а 1

Ме!

С1у Зег ьуз

Агд ьуз ьуз лгд ьуз 10

ьуз дгд

ьуз

ьуз

уа! 15

ьеи

лгд

ьуз

С1у

дзр

лгд

С1у

Азр

с!и

уа1

суз

Οίη

ьеи

01 η

тНг

ьеи

ьеи

20

25

30

АЗП

ьеи

Суз

01 у

туг

АЗр

Уа1

οι у

ьуз

РГО

АЗр

01 у

Пе

рНе

01 у

АЗП

35

40

45

АЗП

тНг

рНе

АЗП

01 η

Уа1

уа!

ЬУ5

РНе

01 η

ьуз

Азр

АЗП

Суз

ьеи

Азр

50

55

60

зег

АЗр

01 у

ίί е

уа!

С1у

Ьуз

АЗП

тНг

тгр

А1а

с!и

ьеи

РНе

Зег

ьуз

65

70

75

80

туг

5ег

РГО

РГО

ιΐβ

РГО

Туг

ьуз

тНг

11е

Рго

ме!

РГО

тНг

д!а

АЗП

85

90

95

ЬУ5

Зег

Агд

л!а А1а

А1а

тНг

РГО

уа1

ме!

АЗП

л!а уа1

01 и

АЗП

л1а

100

105

110

тНг

о1у

уа!

Агд

Зег

01 η

ьеи

ьеи

ьеи

тНг

РНе

а! а

зег

Пе

С1и

зег

115

120

125

А1а

рНе

Азр

туг

с!и

Г1е

ьуз

л!а

ьуз

тНг

Зег

зег

А1а

тНг

01 у

тгр

130

135

140

РНе

οίη

рНе

ьеи

тНг

с1у

тНг

тгр

ЬУ5

тНг

ме!

Не

с!и

АЗП

туг

о!у

145

150

155

160

ме!

ьуз

туг

о! у

уа1

ьеи тНг

Азр

РГО

тНг

С1у

А1а

ьеи

дгд

ьуз

АЗР

165

170

175

Рго

Агд

ίί е

Зег

А1а

ьеи ме!

01 у

А1 а

01и

ьеи

Не

ьуз

С1и

АЗП

ме!

180 185 190

Αδη 11е ьеи Агд рго Уа1 ьеи ьуз Агд 01 и Рго тНг Акр тНг Азр ьеи 195 200 205

туг

ьеи

л1а

НТ 5

рНе

РНе

01 у

РГО

01 у

А1а л!а

лгд

Агд

РНе

ьеи

тНг

210

215

220

ТНг

01 у

οίη

АЗП

01 и

ьеи

д!а

д!а

ТНг

нт з РНе

РГО

ьуз

с!и

Αΐ а

Οίη

225 230 235 240

л1а

АЗП

РГО

Зег

Пе 245

рНе

туг

АЗП

ьуз

АЗР 250

01 у

5ег

РГО

ьуз

тНг 255

Не

οίη

с!и

уа!

туг

АЗП

ьеи

ме!

Азр

с! у

ьуз

Уа!

л!а

А1а

НТ 5

Агд

ьуз

260 265 270

- 79 024794 ьеи С!и ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьу5 Агд Зег ьуз Агд ьуз 275 280 285

Ьуз Агд ьуз Ьуз Агд ьу5 290 <210> 73 <211> 285 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> ρΚ2ΚΖ144_ρΕΤ32Η_ιηοά1 <400> 73

а! а

мет

с! у

Зег

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

ьуз

лгд

ьуз

Агд

01 у

5ег

1

5

10

15

01 у

ьуз

дгд

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

дгд

ьуз

ьуз

Уа1

ьеи

Агд

ьуз

01 у

20

25

30

Азр

дгд

С! у 35

Азр

с! и

Уа1

Суз

с! л 40

ьеи

с!п

тНг

ьеи

ьеи 45

АЗП

ьеи

Суз

О1у

туг

Азр

Уа!

01 у

Ьуз

Рго

АЗр

С1у

Не

рНе

С1 у

АЗП

АЗП

тНг

рНе

50

55

60

АЗП

ΟΊ η

уа!

уа!

ьуз

рНе

с! η

ьуз

дзр

Азп

Суз

Ьеи

АЗр

5ег

Азр

о! у

65

70

75

80

11е

уа!

С1у

ьуз

АЗП

ТНг

тгр

а! а

с! и

ьеи

РНе

Зег

Ьуз

туг

Зег

Рго

85

90

95

РГО

Не

РГО

туг

ьуз

тНг

11е

РГО

мет

РГО

ТНг

А1а

АЗП

ьуз

Зег

Агд

100

105

110

Д1а

А1а

А! а

ТНг

Рго

Уа1

МеТ

Азп

А! а

уа!

С! и

АЗП

л1а

ТНг

01 у

уа!

115

120

125

дгд

Зег

С! η

ьеи

ьеи

ьеи

тНг

рНе

а! а

Зег

Не

01 и

Зег

А! а

рНе

лзр

130

135

140

туг

С! и

Не

ьуз

а! а

Ьуз

тНг

Зег

Зег

а! а

тНг

с! у

тгр

рНе

01 п

рНе

145

150

155

160

Ьеи

тНг

С1у

тНг

тгр

ьуз

тНг

мет

Не

с1и

АЗП

Туг

с! у

мет

ьуз

туг

165

170

175

61 у

Уа!

ьеи

тНг

АЗР

Рго

ТКг

61 у

а! а

ьеи

дгд

ьуз

АЗР

РГО

лгд

Не

180

185

190

Зег

А! а

ьеи

МеТ

С! у

А! а

01 и

ьеи

Не

ьуз

о! и

АЗП

мет

АЗП

ι! е

ьеи

195

200

205

- 80 024794

Агд Рго УаТ ьеи ьуз дгд С1и рго тпг Акр тКг Акр ьеи туг ьеи А1а 210 215 220 нтз рКе рКе СТу рго СТу АТа АТа Агд Агд рКе ьеи тКг тКг сТу сТп 225 230 235 240 азп С1и ьеи дТа дТа тКг нтз РКе Рго ьуз СТ и д1а СТп дТа азп рго 245 250 255

Зег хТе РКе туг азп ьуз дзр сТу Зег Рго ьуз тКг 11е сТп С1и УаТ 260 265 270 туг дзп ьеи меТ дзр СТу ьуз УаТ дТа дТа нтз Агд ьуз

275 280 <210> 74 <211> 287 <212> РКТ <213> неизвестен <220>

<223> ρΚ2ΚΖ144_ρΕΤ32Ρ_πκχΙ2 <400> 74

мет	С1у	Зег	ьуз 5	дгд	ьуз	ьуз
Зег	СТу	ьуз 20	Агд	ьуз	ьуз	Агд
СТу	АЗР 35	дгд	СТу	АЗР	сТи	уа! 40
Суз 50	С1 у	туг	АЗр	УаТ	С1 у 55	ьуз
рКе	АЗП	СТп	Уа1	УаТ 70	ьуэ	рКе
СТу	Не	УаТ	сТу 85	ьуз	АЗП	тКг
РГО	рго	Пе 100	РГО	туг	ьуз	ТКг
Агд	А1а 115	АТа	АТа	тКг	РГО	УаТ 120
Уа1 130	дгд	Зег	СТп	ьеи	ьеи 135	ьеи

ьуз 10	ьуз	Агд	ьуз	Агд	СТу 15	Зег
ьуз	Агд	ьуз	ьуз	уа! 30	ьеи	дгд
СТп	ьеи	СТп	тКг 45	ьеи	ьеи	АЗП
Азр	СТу	Не 60	рКе	СТ у	АЗП	АЗП
ьуз	АЗР 75	АЗП	Суз	ьеи	АЗр	зег 80
дТа 90	С1и	Ьеи	рКе	5ег	ьуз 95	туг
РГО	мет	РГО	тКг	АТа 110	АЗП	ьуз
АЗП	АТа	УаТ	СТ и 125	АЗП	дТа	ТКг
рКе	АТа	Зег 140	Пе	СТи	Зег	АТа

- 81 024794

РНе Азр туг 145

01 и ί!е

ьуэ л!а ьуз тНг бег бег д!а тНг С1у тгр РНе

150

155

160

С! η

рНе

ьеи

тНг

с1у

тНг

тгр

ьуз

тНг

ме!

Не

о! и

АЗП

туг

С! у

ме!

165

170

175

Ьу5

Туг

С! у

Уа1

ьеи

тНг

Азр

Рго

ТЬг

С! у

а! а

ьеи

Агд

ьуз

Азр

РГО

180

185

190

Агд

11 е

бег

А1а

ьеи

ме!

01 у

а! а

01 и

ьеи

Пе

ьуз

01 и

АЗЛ

ме!

АЗП

195

200

205

ίΐ е

ьеи

дгд

РГО

уа!

ьеи

ьуз

Агд

01 и

РГО

тНг

АЗр

тНг

Азр

ьеи

туг

210

215

220

ьеи

л!а

нтз

рНе

рНе

с! у

РГО

01 у

а! а а! а

дгд

дгд

рНе

ьеи

тНг

тНг

225

230

235

240

01 у

01 η

АЗП

01 и

ьеи

а! а

д1а

тНг

нтз

рНе

РГО

ьуз

с! и

д1а

с!п

а! а

245

250

255

АЗП

РГО

бег

Пе

РНе

туг

АЗП

ьуз

АЗР

01 у

бег

РГО

ьуз

тНг

ί! е

с! η

260

265

270

С1и

уа!

туг

АЗП

ьеи

ме!

Азр

01 у

ьуз

уа!

а! а

д!а

НТ 3

дгд

ьуз

275

280

285

<210> 75 <211> 292 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> 8171)01 КРК9 <400> 75

А1а Ме! 01 у Зег ьуз Агд Ьуз ьуз Агд Ьуз Ьуз Агд ьуз С1и Туг Азр 15 10 15

ме!

Не

ьеи

РНе

С1у

бег

ьуз

01 у 25

Азр

а! а

уа1

д1а

ТНг 30

ьеи

с! η

ьуз

01 η

Ьеи

а! а

ьуз

ме!

01 у

туг

ьуз

01 у

Уа1

Ьуз

Азр

ьуз

Рго

Ьеи

35

40

45

бег

уа!

Азр

01 у

нтз

РКе

С1у

с! и

бег

тНг

с! и

РНе

А1а

Уа!

Не

01 η

50

55

60

ьеи

С1п

Агд

ьуз

РНе

01 у

ьеи

Уа1

А1а

АЗР

01 у

ьуз

Уа1

01 у

Азр

ьуз

65

70

75

80

тНг

дгд

С! η

а! а

Ьеи

л1а

С1у

Азр

бег

Уа!

бег

ьуз

рНе

ьеи

ьуз

АЗр

90 95

- 82 024794

с!и дзр туг ьуз ьуз 100

д1а А!а Не Агд ьеи ьуз 105

уа! уа!

рго 01 и 110

Ьеи ьеи

Уа1 РГО

Пе дгд Уа! 115

РНе

С1у

а! а

уа!

С1и 120

с! у

ьеи

С1у

С1у 125

рКе

АЗП

01 у

ьуз

а! а

ьуз

Пе

ьеи

РНе

С! и

Агд

нт 5

лгд

ме*

туг

рНе

туг

130

135

140

ьеи

Суз

С1п

д1а

ьеи

01 у

ьуз

тНг

РНе

а! а

АЗП

зег

С1п

уа1

ьуз

Пе

145

150

155

160

тКг

Рго

Азп

Пе

уа!

Азп

тНг

ьеи

тНг

С! У

01 у

туг

ьуз

01 у

дзр

л1а

165

170

175

д1а

01 и

туг

тКг

дгд

ьеи

Зег

ме*

а! а

11 е

АЗП

Пе

НТ 5

ьуз

01 и

Зег

180

185

190

л1а

ьеи

ме*

Зег

тЬг

Зег

тгр

с! у

С1п

РНе

С1п

Пе

ме*

01 у

с! и

АЗП

195

200

205

тгр

ьуз

АЗр

ьеи

С! у

туг

Зег

Зег

Уа1

01 п

С! и

РНе

уа!

Азр

С1п

С1п

210

215

220

01 п

ьеи

дзп

с! и

С! у

АЗП

01 п

ьеи

01 и

а! а

рНе

Не

Агд

РНе

Пе

о! и

225

230

235

240

тгр

ьуз

РГО

С1у

ьеи

ьеи

с! и

а! а

ьеи

лгд

ьуз

С1п

Азр

тгр

АЗр

тНг

245

250

255

уа!

РНе

ТНг

ьеи

туг

АЗП

01 у

ьуз

АЗП

Туг

ьуз

ьуз

ьеи

01 у

туг

ΟΊ п

260

265

270

а! а

ьуз

рКе

01 п

ьуз

01 и

тгр

АЗр

НТ 5

ьеи

01 и

РГО

ιΐβ

Туг

лгд

0Ί и

275

280

285

ьуз тНг А1а а! а 290 <210> 76 <211> 176 <212> РКТ <213> неизвестен <220>

<223> зтЮ2_ККК9 <400 76 д!а ме* с!у зег ьуз дгд ьуз ьуз дгд ьуз ьуз дгд ьуз о1у дзп те 15 10 15

- 83 024794

РКе

С1и

мет

ьеи

дгд

ΐΐ е

Азр

с!и

С1 у

ьеи

Агд

ьеи

ьуз

ΐΐ е

туг

ьуз

20

25

30

Азр

тЬг

С1и

С1у

туг

Туг

тКг

ΐΐ е

С1у

ΐΐ е

С1 у

нтз

ьеи

ьеи

ТКг

ьуз

35

40

45

зег

РГО

Зег

ьеи

АЗП

л!а

А1а

ьуз

Зег

С1и

ьеи

Азр

ьуз

А1а

11 е

С1у

50

55

60

дгд

АЗП

суз

АЗП

СТу

уа!

11е

тКг

ьуз

Азр

С1и

л1а

С1и

ьуз

Ьеи

рКе

65

70

75

80

А5П

С1п

Азр

Уа!

Азр

д!а

д!а

Уа1

Агд

С1у

11е

ьеи

лгд

АЗП

д!а

ьуз

85

90

95

ьеи

ьуз

РГО

уа!

туг

АЗР

Зег

ьеи

АЗР

л!а

Уа!

дгд

Агд

суз

А1а

ьеи

100

105

110

Пе

АЗП

мет

Уа!

РКе

С1п

мет

С1у

С1и

тКг

Е1у

уа!

л1а

С1у

рКе

тКг

115

120

125

АЗП

Зег

ьеи

Агд

мет

Ьеи

С1п

С1п

ьуз

дгд

тгр

АЗр

С1и

д!а

д!а

уа!

130

135

140

АЗП

ьеи

д!а

ьуз

зег

дгд

тгр

туг

АЗП

С1п

тКг

РГО

АЗП

дгд

А1а

ьуз

145

150

155

160

дгд

уа!

т!е

тКг

ТКг

РКе

Агд

тКг

С1 у

тКг

Тгр

АЗР

А1а

туг

Ьуз

АЗП

165 170 175 <210> 77 <211> 164 <212> РКТ <213> неизвестен <220>

<223> 3γπϊΟ3_ΚΡΚ9 <400 77 д!а мет с!у зег ьуз дгд ьуз ьуз дгд ьуз ьуз дгд ьуз уа! зег ьуз 15 10 15

уа1

С1п

рКе

АЗП

РГО

Агд

Зег

Агд

тКг

АЗр

А1а

Пе

рКе

уа!

НТ 5

Суз

20

25

30

5ег

д!а

тКг 35

ьуз

РГО

С1и

мет

Азр 40

11 е

С1 у

уа!

с!и

тЬг 45

11 е

Агд

мет

тгр

нтз 50

ьуз

С1п

С1п

А1а

тгр 55

ьеи

АЗР

уа!

С1 у

£5Г

нтз

РКе

11е

ΐΐβ

ьуз

Агд

Азр

с!у

тКг

уа!

С1и

с!и

С1у

лгд

РГО

уа!

АЗП

уа!

уа!

С1у

65

70

75

80

- 84 024794

Зег

НТ 3

Уа!

ьуз дзр тгр 85

АЗП

Зег

Агд

Зег Уа! 90

с! у

Уа1

Суз

ьеи 95

уа!

С! у

С! у

11 е

Азп

а! а

ьуз

С1у

С1п

рНе

С1и

а! а

АЗП

РЬе

тКг

РГО

а! а

100

105

110

СТп

МеТ

АЗП

Зег

Ьеи

Агд

Азп

ьуз

Ьеи

Азр

Азр

Ьеи

Ьуз

Уа!

МеТ

Туг

115

120

125

Рго

СТп

а! а

с! и

11 е

Агд

А1а

нтз

нтз

Азр

Уа!

А! а

Рго

Ьуз

а! а

Суз

130

135

140

рго

зег

рНе

лзр

ьеи

□1п

Агд

тгр

ьеи

зег

тНг

АЗП

с! и

ьеи

уа!

тНг

145

150

155

160

5ег Азр дгд с!у <210=- 78

-=211=- 194 <212> РРТ <213> неизвестен <220>

<223> 5тЮ4_КРК9 <400> 78

А1а мет б!у Зег ьуз Агд ьуз ьуз Агд ьуз ьуэ Агд ьуз с!у ьуз Рго 15 10 15 ьуз Азр С1и 11е РНе Азр С1и 11е ьеи С!у ьуз С1и С1у с!у туг уа! 20 25 30

А5п нт 5 рго Азр Азр ьуз С1у с! у Рго тКг ьуэ тгр с1у ι! е тНг е!и 35 40 45 ьуз Уа! д1а дгд д1а Нтз с1у туг Агд с!у дзр мет Агд азп ьеи тНг 50 55 60

Агд СТу е1п А1а Ьеи С1и IIе ьеи С1и тЬг Азр Туг Тгр туг С1у рго 65 70 75 80

Агд РЬе Азр Агд Уа! а! а ьуз а! а 5ег рго лзр Уа! а!а л1а С1и ьеи 85 90 95

Суз Азр тЬг С1у уа! азп меТ С1у рго Зег Уа! д1а а!а ьуз меТ ьеи 100 105 110 с!η Агд тгр ьеи Азп Уа! рНе Азп С1п с!у с!у Агд Ьеи туг рго Азр 115 120 125

- 85 024794

мет

ΪΙ8

ТНг

Азр

С1у

Агд

Пе 135

01 у

РГО

Агд

тЬг

ьеи 140

АЗП

А1а

ьеи

Агд

уа1

Туг

ьеи

с!и

ьуз

Агд

01 у

ьуз

Азр

01 у

о!и

Агд

уа!

ьеи

ьеи

уа!

145

150

155

160

а! а

ьеи

АЗП

Суз

тЬг

01 η

01У

01 и

Агд

туг

ьеи

С1и

ьеи

а! а

01 и

ьуз

165

170

175

дгд

С! и

а! а

Азр 180

с! и

Зег

рКе

уа!

туг 185

01 у

Тгр

мет

Ьуз

с! и 190

Агд

Уа!

ьеи Не <210 79 <211> 52 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер РКдр144 прямой <400> 79 аТдддаТсса аасдсаадаа асдСаадааа сдсаааааад СаЬСасдсаа ад 52 <210> 80 <211=* 51 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер РКдр188 прямой <400 80 аТдддаТсса аасдсаадаа асдТаадааа сдсааааасТ Тссддасдаа д 51 <210> 81 <211> 18 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер др144 обратный <400> 81 ттттстагдт дсгдсаас 18 <210> 82 <211> 19 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер др144 обратный <400> 82 аТасдаааТа асдТдасда 19 <210> 83 <211=* 18 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер др144 прямой <400 83 атдааадтас Тасдсааа 18

- 86 024794

Claims (19)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Вариант эндолизина. в который встроен катионный пептид с активностью. разрушающей липополисахарид (ЛПС). в котором упомянутый катионный пептид состоит из 5-100 аминокислотных остатков и как минимум 70% аминокислотных остатков. содержащихся в катионном пептиде. представляют собой остатки аргинина и/или лизина. а от 0 до 30% - остатки серина и/или глицина.
2. 2. Вариант эндолизина по п.1. в котором катионный пептид состоит из 5-50 аминокислотных остатков. а именно из 5-30 аминокислотных остатков.
3. 3. Вариант эндолизина по п.1 или 2. в котором катионный пептид встроен в Ν-конец и/или С-конец эндолизина. в частности в Ν-конец эндолизина.
4. 4. Вариант эндолизина по любому из предшествующих пунктов. в котором эндолизин обладает разрушающим действием на клеточные стенки грамотрицательных бактерий. в частности на клеточные стенки грамотрицательных бактерий следующих семейств: Еп1егоЬас1епасеае. Рзеиботопабасеае. 8р1госНае1асеае. Б-ерЮзриасеае. Вас1егснбасеае.
5. 5. Вариант эндолизина по любому из пп.1-3. в котором эндолизин обладает разрушающим действием на клеточные стенки грамотрицательных бактерий. в частности на клеточные стенки грамотрицательных бактерий следующей группы: ЕзсПеПсНга. 8а1топе11а. 8Нще11а. СйгоЬас!ег. Ебуагбз1е11а. Еп1егоЬас1ег. НаГша. К1еЬз1е11а. Могдапе11а. Рго!еиз. Рготабепаа. 8еггаПа. Уегзппа. Рзеиботопаз. ВигкНо1бепа. 81епо1горНотопаз. 8Неуапе11а. 8рНгпдотопаз. Сотатопаз. №1ззепа. Могахе11а. УШгю. Аеготопаз. Вгисе11а. Егапазе11а. Вогбе1е11а. БещопеПа. Вайопе11а. Сох1е11а. НаеторНПиз. Раз!еиге11а. МаппНешпа. АсПпоЬасШиз. Оагбпеге11а. Тгеропета. ВоггеПа. Сатру1оЬас1ег. НеПсоЬас1ег. 8рш11ит. 81гер1оЬасП1из. Вас1егслбез. ЕизоЬасЮгтт. Ргехо1е11а. РогрНуготопаз и Асте1оЬас1ег. в частности А. ВаитапП.
6. 6. Вариант эндолизина по любому из предшествующих пунктов. в котором эндолизин выбирают из группы. состоящей из рНгК2§р144 в соответствии с 8ЕО ГО ΝΟ: 1. ЕЬ§р188 в соответствии с 8Е0 ГО ΝΟ: 2. эндолизина 8а1топе11а в соответствии с 8Е0 ГО ΝΟ: 3. эндолизина Еп1егоЬас1епа фага Т4 в соответствии с 8Е0 ГО ΝΟ: 4. эндолизина Асте1оЬас1ег ЬаитапП в соответствии с 8Е0 ГО ΝΟ:5. эндолизина Е.соП фага К1Е в соответствии с 8Е0 ГО ΝΟ: 6. эндолизина Р8Р3 8а1топе11а в соответствии с 8Е0 ГО ΝΟ: 8 и эндолизина Е.соП фага Р2 в соответствии с 8Е0 ГО ΝΟ: 9.
7. 7. Вариант эндолизина по любому из предшествующих пунктов. в котором катионный пептид содержит как минимум один ККК мотив.
8. 8. Вариант эндолизина по пп.1-6. в котором катионный пептид содержит последовательность. выбираемую из группы. состоящей из 8Е0 ГО ΝΟ: 10-30.
9. 9. Вариант эндолизина по любому из предшествующих пунктов. в котором упомянутый вариант эндолизина содержит аминокислотную последовательность. выбираемую из группы. состоящей из 8Е0 ГО ΝΟ: 35-49. 53. 57. 62-64 и 66-78.
10. 10. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты. состоящая из нуклеотидной последовательности. кодирующей вариант эндолизина по любому из пп.1-9.
11. 11. Вектор. содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.10.
12. 12. Клетка-хозяин. содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.10 или вектор по п.11.
13. 13. Клетка-хозяин по п.12. представляющая собой бактериальную клетку или дрожжевую клетку.
14. 14. Способ получения варианта эндолизина по любому из пп.1-9. включающий экспрессию варианта эндолизина в клетке-хозяине по любому из пп. 12. 13.
15. 15. Применение варианта эндолизина по любому из пп.1-9 в качестве лекарственного препарата для лечения и/или профилактики дисфункций. заболеваний или симптоматики. ассоциируемых с заражением патогенными грамотрицательными бактериями.
16. 16. Применение по п.15. в котором лекарственный препарат является ингредиентом косметических средств.
17. 17. Применение варианта эндолизина по любому из пп.1-9 для устранения. уменьшения и/или предотвращения заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов. загрязнения оборудования на предприятиях пищевой отрасли. различных поверхностей. контактирующих с пищевыми продуктами. изделий медицинского назначения. поверхностей в больницах и хирургических блоках.
18. 18. Применение варианта эндолизина по любому из пп.1-9 в качестве диагностического средства для выявления заражения грамотрицательными бактериями.
19. 19. Фармацевтическая композиция с улучшенной антимикробной активностью в отношении грамотрицательных бактерий. содержащая вариант эндолизина по любому из пп.1-9.