KR101463004B1 - 베큘러바이러스에 의하여 발현된 조류파라믹소바이러스-9 재조합 hn 단백질 및 이를 이용한 조류파라믹소바이러스-9의 진단 방법 - Google Patents

베큘러바이러스에 의하여 발현된 조류파라믹소바이러스-9 재조합 hn 단백질 및 이를 이용한 조류파라믹소바이러스-9의 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베큘러바이러스에 의하여 발현된 조류파라믹소바이러스-9 재조합 HN 단백질 및 이를 이용한 조류파라믹소바이러스-9 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 APMV-9 HN 단백질을 발현하는 베큘러바이러스 또는 이에 의하여 형질감염된 곤충세포는 APMV-9 HN 단백질을 고농도로 생산하며, 이를 이용하여 세포배양이 가능한 일반실험실에서도 손쉽게 대량의 항원을 제조할 수 있고, 곤충세포배양법으로 일주일 이내에 항원진단액 제조가 가능하므로 항원진단액 제조기간을 최소 일주일 이상 단축할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 의해 제조한 APMV-9 HN 단백질 항원은 닭 적혈구에 대한 혈구 응집능과 열 안정성이 있고, APMV-9 면역혈청에 의해 HI 반응이 특이적으로 나타났을 뿐만 아니라, 종래의 항원 (APMV-9 바이러스 항원)과 HI반응법 검사결과와 비교하였을 때 동일한 검사결과를 나타내는 효과가 있다. 따라서, 감염성 APMV-9 바이러스를 확보하고 있지 않아도 종래의 APMV-9 바이러스 항원 진단액을 본 발명에 의해 제조한 APMV-9 HN 단백질 항원으로 대체하여 사용할 수 있다.

Description

베큘러바이러스에 의하여 발현된 조류파라믹소바이러스-9 재조합 HN 단백질 및 이를 이용한 조류파라믹소바이러스-9의 진단 방법{Avian paramyxovirus type 9 recombinant hemagglutinin-neuraminidase protein expressed by baculovirus and diagnostic method for Avian paramyxovirus type 9 using the same}
본 발명은 베큘러바이러스에 의하여 발현된 조류파라믹소바이러스-9 재조합 HN 단백질 및 이를 이용한 조류파라믹소바이러스-9의 진단 방법에 관한 것이다.
조류파라믹소바이러스(Avian paramyxovirus; APMV)는 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)과, 아뷸라바이러스(Avulavirus)속으로 분류되는 RNA 바이러스이다. APMV는 APMV-1에서 APMV-11까지 현재까지 총 11개의 혈청형(serotype)이 존재하고 있는 것으로 밝혀져 있다. 이 중 APMV-1에 속하는 뉴캣슬병바이러스 (Newcastle disease virus; NDV)가 가금류에서 가장 중요한 병원체로 알려져 있으나 APMV-2, APMV-3, APMV-7 및 APMV-9 등도 각종 가금류에 감염하여 경제적 손실을 유발하는 것으로 알려져 있다. APMV-9는 1978년 미국 뉴욕에서 오리류에서 처음 분리 보고되었으며, 야생조류 특히 야생 오리류가 자연 숙주인 것으로 알려져 있다.
APMV 게놈은 음성-센스-단일 가닥 RNA(negative-sense single-stranded RNA)형태로 되어 있으며, N(nucleocapsid protein), 인산단백질(phosphoprotien; P), 기질 단백질(matrix protein; M), 융합 단백질(fusion protein; F), HN(hemagglutinin-neuraminidase) 및 중합효소 단백질(polymerase protein;L)을 발현하는 최소 6개 이상의 ORF(open reading frames)를 가지고 있다.
APMV 구조단백질 중 N, P, L 단백질은 전사복합체 (transcription complex)를 형성하여 RNA 복제과정에 관여한다. 바이러스 외피막을 구성하는 주요 당단백질로는 F와 HN 당단백질 (glycoprotein)이 있다. 이들 당 단백질은 방어면역에 관여하는 중요한 바이러스 구조단백질이다. F 당단백질은 감염세포간의 융합을 유발하고 병원성과도 관련이 있는 것으로 알려져 있다. HN 당단백질은 감염성 바이러스가 세포 표면에 달라붙거나 세포내에서 증식된 후대바이러스(progeny virus)가 세포막 외부로 유리하는 과정에 관여한다. 특히 HN 당단백질은 닭 적혈구를 응집시키거나 혈구응집 후 해리시키는 생물학적 기능을 가지고 있다.
APMV-9의 진단은 닭 부화란(종란)을 이용하여 검체 시료로부터 바이러스를 분리한 다음 분리 바이러스를 동정(identification) 하거나, 검체 시료(혈청)로부터 APMV 특이 항체를 검출하여 이루어진다. 이를 위하여 APMV 진단 항원과 면역혈청은 필수적이며, 진단방법으로 닭 적혈구를 이용한 혈구응집 (hemagglutination; HA) 반응법, 또는 혈구응집억제 (hemagglutination inhibition; HI) 반응법을 이용한다. 그러나 현재 APMV-9 진단을 위하여 사용하고 있는 진단 항원은 감염성 바이러스 입자를 닭 부화란에서 증식하여 제조한다. 따라서 APMV-9 바이러스는 일부 연구기관에서 제한적으로만 보유하고 있어서 APMV-9 진단에 어려움이 있었다.
이에, 본 발명자들은 미국 국립보건원의 유전자은행(Genbank)에 기 공지된 APMV-9/duck/New York/22/78 균주의 HN 유전자 서열정보를 바탕으로 인의적으로 HN 전체 유전자를 합성하여, 발현 벡터에서 클로닝하여 재조합 베큘로바이러스를 제작한 다음, 곤충세포에 감염시켰을 때 생산된 발현 단백질이 A닭 적혈구 응집능 등 HN 단백질의 고유한 생물학적 기능을 가지고 있으면서 APMV-9 면역혈청에 의해 혈구응집반응이 억제된다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 조류파라믹소바이러스-9(Avian paramyxovirus-9)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 발현벡터를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터가 형질도입된 세포를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터 또는 상기 발현벡터가 형질도입된 세포가 발현하는 HN 단백질을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 HN 단백질을 이용한 조류파리믹소바이러스-9 진단 키트를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 HN 단백질을 이용한 조류파리믹소바이러스-9의 진단방법을 제공함에 있다.
따라서, 본 발명은 조류파라믹소바이러스-9(Avian paramyxovirus-9)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터가 형질도입된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터 또는 상기 발현벡터가 형질도입된 세포가 발현하는 HN 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 HN 단백질을 이용한 조류파리믹소바이러스-9 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 HN 단백질을 이용한 조류파리믹소바이러스-9의 진단방법을 제공한다.
본 발명의 APMV-9 HN 단백질을 발현하는 베큘러바이러스 또는 이에 의하여 형질감염된 곤충세포는 APMV-9 HN 단백질을 고농도로 생산하며, 이를 이용하여 세포배양이 가능한 일반실험실에서도 손쉽게 대량의 항원을 제조할 수 있고, 곤충세포배양법으로 일주일 이내에 항원진단액 제조가 가능하므로 항원진단액 제조기간을 최소 일주일 이상 단축할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 의해 제조한 APMV-9 HN 단백질 항원은 닭 적혈구에 대한 혈구 응집능과 열 안정성이 있고, APMV-9 면역혈청에 의해 HI 반응이 특이적으로 나타났을 뿐만 아니라, 종래의 항원 (APMV-9 바이러스 항원)과 HI반응법 검사결과와 비교하였을 때 동일한 검사결과를 나타내는 효과가 있다. 따라서, 감염성 APMV-9 바이러스를 확보하고 있지 않아도 종래의 APMV-9 바이러스 항원 진단액을 본 발명에 의해 제조한 APMV-9 HN 단백질 항원으로 대체하여 사용할 수 있다.
도 1은 재조합 pGEM-T 벡터 내 삽입된 APMV-9 HN 유전자 절편을 EcoRI 및 XhoI 제한효소로 처리하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 재조합 pFastBacTM 전이벡터 내 삽입된 APMV-9 HN 유전자 절편을 BamHI 및 XhoI 제한효소로 처리하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 APMV-9 HN 유전자를 포함하는 재조합 bacmid를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 형광항체법에 의한 재조합 베큘로바이러스 감염 Sf9 곤충세포에서의 APMV-9 HN 단백질 발현을 나타낸 도이다(좌측: 정상 Sf9 곤충세포; 우측: 재조합 베큘러바이러스 감염 Sf9 곤충세포).
도 5는 PCR로 재조합 베큘로바이러스 내 APMV-9 HN 유전자 삽입을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 재조합 APMV-9 HN 단백질(rAPMV-9 HN)의 웨스턴 블랏 분석결과를 나타낸 도이다.
도 7은 APMV-9 HN 단백질 진단항원의 HN 단백질을 HA법으로 정량한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 조류파라믹소바이러스-9(Avian paramyxovirus-9)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터가 형질도입된 세포를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 APMV-9 HN 유전자 DNA 절편은 국제유전자은행에 공지된 (duck/New York/22/78스트레인) HN유전자 서열정보(accession no. EU910942.1)를 합성하여 pGEM-T 벡터 (Promega)와 같은 클로닝용 플라스미드에 이용하여 클로닝한다. DNA 절편의 합성은 HT-oligoTM 합성기(주식회사 바이오니아)등에 의하여 합성하고, 합성된 DNA절편의 클로닝을 원활히 하기 위하여, DNA절편의 5`말단에는 BamHI, 3`말단에는 XhoI 제한효소 인식부위를 추가한다. 클로닝한 APMV-9 HN DNA 절편은 제한효소 (BamHI 및 XhoI)를 처리하여 클로닝 벡터에서 추출한 다음 pFastBacTM와 같은 전이 벡터에 삽입한 후, Bacmid와의 전위(transposition)로 재조합 Bacmid를 제작한다. 이 후, 재조합 Bacmid를 곤충세포에 형질전환시켜 재조합 베큘로바이러스(baculovirus)를 제작한다. 이 후, 재조합 베큘러바이러스에 의해서 생산된 APMV-9 HN 발현 단백질은 닭 적혈구 응집능을 가지고 있음을 확인하였고, 열적 안정성이 있는지 확인하였고, 혈구응집억제반응법을 사용하여 APMV-9 특이항체를 검출하거나 정량화하였다.
본 발명의 APMV-9 HN 단백질을 발현하는 베큘러바이러스 또는 이에 의하여 형질감염된 곤충세포는 APMV-9 HN 단백질을 고농도로 생산하며, 이를 이용하여 세포배양이 가능한 일반실험실에서도 손쉽게 대량의 항원을 제조할 수 있고, 곤충세포배양법으로 일주일 이내에 항원진단액 제조가 가능하므로 항원진단액 제조기간을 최소 일주일 이상 단축할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 의해 제조한 APMV-9 HN 단백질 항원은 닭 적혈구에 대한 혈구 응집능과 열 안정성이 있고, APMV-9 면역혈청에 의해 HI 반응이 특이적으로 나타났을 뿐만 아니라, 종래의 항원 (APMV-9 바이러스 항원)과 HI반응법 검사결과와 비교하였을 때 동일한 검사결과를 나타내는 효과가 있다. 따라서, 종래의 APMV-9 바이러스 항원 진단액의 대체 항원으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 조류파라믹소바이러스-9(Avian paramyxovirus-9)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 코딩하는 서열은 서열번호 1의 염기서열인 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터(vector)"는 외부의 유전 물질을 다른 세포로 옮기는데 사용되는 전달 수단인 DNA 분자이다. 대표적으로 플라스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 코스미드 벡터, 인공 염색체를 이용한 벡터(예컨대, YAC, BAC) 등이 존재한다. 벡터를 이용하여 원하는 유전 물질을 대량 발현하는데 있으므로 벡터로서의 기능을 하기 위해 필요한 공통 요소가 존재하는데, 복제 원점(Replication Origin), 여러 제한효소 자리(Multicloning site), 선택표지(selective marker)가 반드시 존재하여야 한다. 벡터 그 자체는 DNA 염기 서열로 이식할 유전자(transgene)와 벡터 백본(backbone)을 포함한다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 진핵세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 진핵세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL프로모터, pR프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 [Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)], 그리고 파아지의 좌향 프로모터 [pL프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980)]가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET, pEGFP, pCR 등), 파지 (예: gt4B, -Charon, z1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 벡터는 발현 벡터이고, 바람직하게는 베큘러바이러스이다.
상기 발현벡터를 숙주에 형질 감염 또는 형질도입할 수 있으며, 숙주세포를 이용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 조류파라믹소바이러스-9(Avian paramyxovirus-9)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 발현벡터 또는 발현벡터가 형질도입된 세포가 발현하는 HN 재조합 단백질 및 이를 이용한 조류파리믹소바이러스-9 진단 키트를 제공한다.
본 발명에서의 용어 재조합 단백질이란 두 개 혹은 그 이상의 DNA를 유전자 재조합 기술로 이어 붙여 만든 재조합 DNA에서 만들어지는 단백질이다.
상기 재조합 DNA 기술을 통해 과거 자연 상태부터 미량으로밖에 얻을 수 없던 의료용 단백질 또는 산업용 효소 등을 박테리아(예컨대 E. coli)와 동물세포 등을 이용하여 합성할 수 있다. 박테리아(예컨대 E. coli)를 비롯한 효모(Yeast)와 동물 세포(Mammalian cell)의 발효 및 배양, 의약품 원료 수준의 정제 과정을 통하여 합성 가능하다. 재조합 단백질로 합성된 예로, hGH (Human growth hormone), INS (Insulin), 인터루킨 등이 있다.
상기 진단 키트는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 진단 키트는 재조합 HN 단백질을 발현하는 재조합 세포에서 발현된 재조합 HN 단백질 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
또한, 본 발명은 조류파라믹소바이러스-9(Avian paramyxovirus-9)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 발현벡터 또는 상기 발현벡터가 형질도입된 세포가 발현하는 재조합 HN 단백질을 이용하여 항원-항체반응을 통해 시료 내에서 조류파리믹소바이러스를 검출하는 것을 특징으로 하는, 조류파리믹소바이러스-9의 검출방법을 제공한다.
상기 항원-항체 반응은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용할 수 있다.
상기 시료는 조류파라믹소바이러스-7로 감염된 것으로 예상되거나 감염된 세포, 혈액, 소변, 타액, 조직 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. APMV -9 HN 전체 유전자의 인공합성
APMV-9 HN 전체 유전자의 DNA 절편을 인공합성하기 위하여 국제유전자은행유전자은행(accession no. EU910942.1)로 공지된 APMV-9/duck/New York/22/1978 균주의 HN 유전자 염기서열 정보를 사용하였다. DNA 절편 합성에 사용된 HN 유전자 염기서열은 총 1,740개의 핵산으로 구성되어 있고, 클로닝의 효율성을 위하여 인공합성 DNA절편의 5`말단에는 BamHI, 3`말단에는 XhoI 제한효소 인식부위를 추가하였다. 보다 구체적으로, HN 유전자 염기서열 정보를 (주)바이오니아에 제공하여 주문 제작을 실시하였으며, 이의 서열을 서열번호 1로 나타내었다. 유전자 절편 합성은 주식회사 바이오니아의 HT-oligoTM 384 합성기로 사용하여 실시하였다.
실시예 2. APMV -9 HN 유전자의 벡터 클로닝
상기 실시예 1에서 합성한 APMV-9 HN 유전자 DNA 절편은 중합효소연쇄반응법(PCR)을 통해 증폭하였다. 상기의 PCR을 위하여, APMV-9 HN 유전자의 ORF 전체를 구성하는 1,740개의 핵산 전체가 포함되도록 1,752개의 핵산이 증폭되도록 하기 표 1 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 합성 DNA 절편, 서열번호 2의 정방향 프라이머(forward primer), 서열번호 3의 역방향 프라이머(reverse primer) 및 PCR premix kit (주식회사 바이오니아)로 제조사의 권장방법에 따라 실시하였다. PCR 반응은 98℃에서 10초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초를 1 사이클로 하여 PCR 증폭기 (PE 9600;Perkin Elmer)에서 35 사이클 반복하여 PCR 증폭을 실시하였고, 마지막으로 72℃에서 5분간 DNA 합성을 실시하였다.
염기서열 서열번호
APMV-9 HN 정방향 프라이머 5`-GAA TCC ATG GAA TCA GGA ATC-3' 2
APMV-9 HN 역방향 프리이머 5`-CTC GAG TCA GTT ACG CGT GTA-3` 3
상기에서 증폭된 DNA 절편은 아가로오스 겔 (agarose gel)에서 전기영동을 실시한 후, 증폭된 약 1.7kb에 해당하는 유전자 증폭 산물을 겔로부터 추출하여 pGEM-T 벡터에 삽입하였다. 삽입된 APMV-9 HN 유전자 절편은 자동염기서열분석기(ABI 377, USA)를 사용하여 염기서열 분석을 실시하여 유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 제 EU910942.1로 공개되어 있는 염기서열과 비교 분석함으로서 HN 유전자 DNA의 올바른 삽입여부를 확인하였다. 증폭된 DNA 절편의 전기영동 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 증폭된 HN 유전자가 pGEM-T 벡터에 삽입됨을 확인하였다.
실시예 3. APMV -9 HN 유전자 전이벡터의 제작
APMV-9 HN 유전자 전이벡터를 제작하기 위하여, 상기 실시예 2의 pGEM-T 재조합 벡터를 BamHI 및 XhoI 제한효소로 처리하여, APMV-9 HN 유전자 절편을 추출한 후, T4 리가아제(ligase; Promega)를 이용하여 같은 제한 효소로 처리한 pFastBacTM 전이 벡터(transfer vector)에 삽입하였다. 그 후 재조합 전이벡터는 TOP10 완전 세포(compentent cell; Invitogen)에 형질전환 시킨 후, 생성된 흰색 콜로니를 선택하여 LB broth에서 배양하였다. 이 후, 증식된 대장균을 수거하여 재조합 pFastBacTM 전이벡터 플라스미드를 추출하였다. 그 후 재조합 전이벡터는 BamHI 및 XhoI 제한효소로 처리하여 APMV-9 HN 유전자 삽입여부를 확인하였으며, 이를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 전이벡터에 APMV-9 HN 유전자가 잘 삽입되었음을 확인하였다.
실시예 4. APMV -9 HN 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 셔틀벡터 제작
APMV-9 HN 유전자 절편이 삽입된 재조합 pFastBacTM 전이 벡터를 DH10BacTM 완전 세포(invitrogen)에 형질전환시켜 베큘러바이러스 셔틀 벡터(Baculovirus shuttle vector)인 bacmid에 폴리헤드린 프로모터(polyhedrin promoter) 및 HN 유전자 절편을 포함하는 부위를 전위(transposition)시켰다. X-gal이 처리된 LB 아가에서 2~3일 배양한 후, 흰색 콜로니를 선택하여 LB broth에 배양한 다음 mini prep으로 재조합 Bacmid를 추출하였다. 추출된 Bacmid 벡터는 상기 실시예 1의 PCR을 통해 APMV-9 HN 유전자가 전위(transposition)된 재조합 Bacmid를 선발하였고, 이를 도 3에 나타내었다.
실시예 5. APMV -9 HN 유전자를 발현하는 재조합 베큘로바이러스의 제조
APMV-9 HN 단백질을 생산하는 재조합 베큘로바이러스(baculovirus)를 제조하기 위하여, APMV-9 HN 유전자를 함유하는 재조합 Bacmid와 베큘로바이러스 (Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus; AcMNPV) DNA를 이용하여 Sf9(Spodoptera frugiperda ) 세포에 형질감염(transfection)시켰다. 그 후 Sf9 세포를 28℃에서 5일 동안 배양한 다음 세포와 배양액을 수거하여 70% 단층을 형성한 Sf9 세포에 다시 접종하여 28℃에서 5일 배양하는 방법으로 3대 계대 배양하였다. Sf9 세포에서 재조합바이러스의 특징적인 세포변성효과를 확인하고 세포변성효과가 있을 경우 세포를 수거하여 삽입된 실시예 1의 PCR로 재조합 베큘로바이러스 작성여부를 확인하였다. 재조합 베큘로바이러스는 플라크 시험법(Plaque Assay)을 실시하여 APMV-9 HN 단백질을 발현하는 재조합 베큘로바이러스를 순수 분리하여 rBac/APMV-9HN라고 명명하였다. 도 4는 재조합 베큘로바이러스에 의해 곤충세포에서 APMV-9 HN 단백질을 감염시킨 Sf9 곤충세포의 형태학적 소견을 나타낸 도이고, 도 5는 제작한 재조합 베큘로바이러스내 APMV-9 HN 유전자 삽입 여부를 PCR로 확인한 도이다. 도 6은 rBac/APMV-9HN 감염 곤충세포에서 발현한 재조합 APMV-9 HN 단백질(rAPMV-9 HN)을 APMV-9 닭 면역혈청을 이용하여 웨스턴 블랏(Western blot)으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 상기 재조합 베큘로바이러스에서, APMV-7 HN 단백질이 발현됨을 확인하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 재조합 베큘로바이러스 내에 APMV-9 HN 유전자가 삽입되었음을 확인하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 재조합 베큘로바이러스 감염세포에서 APMV-9 HN 단백질이 발현됨을 확인하였다.
실시예 6. 재조합 APMV -9 HN 단백질의 생산
상기 실시예 5의 재조합 베큘로바이러스(rAPMV-9 HN)를 감염시킨 Sf9 곤충세포에서 재조합 APMV-9 HN (rAPMV-9HN) 단백질을 생산 추출한 다음 진단 항원으로 제조하는 과정은 하기와 같다.
재조합 APMV-9 HN 단백질을 함유한 진단 항원은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 즉, 조직배양 플라스크 내 배양된 Sf9 곤충세포에 0.1 M 농도의 재조합 베큘로바이러스 rBac/APMV-9HN를 감염시켜 27℃에서 4일간 배양하였다. 그 후, 세포변성효과가 관찰되면 감염 곤충세포를 수확하여 50 ml 코니칼 원심튜브에 첨가하였다. 그 후 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 침전시키고 배양 배지의 1/100 농도의 PBS를 첨가하여 회수한 다음 초음파기로 200V에서 2분간 분쇄하였다. 분쇄후 8,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 세포추출액으로 회수하여 진단 항원으로 사용하였다. 이 같은 방법으로 50ml 곤충세포배양액으로 약 10ml의 항원을 제조하였다. 이때 제조한 항원은 0.5ml씩 분병하여 실험에 사용하기 전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다. 신규 뉴캐슬병 항원진단액의 항원 정량은 V-bottom 96 well microplate에서 혈구응집반응(HA)법을 사용하여 HN 단백질량을 측정하였고, 이의 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 곤충세포추출액에서 HA가 높게 나타남을 확인하여 상기 곤충세포가 단백질을 생산한다는 것을 확인하였다.
실시예 7. 재조합 APMV -9 HN 단백질에 대한 면역혈청 제조
재조합 APMV-9 HN 단백질(rAPMV-9 HN) 제조항원으로 APMV-9 면역혈청을 제조하였다. 우선 rAPMV-9 HN 단백질 항원을 211~12 HAU로 조정하여 ISA70(SEPPIC, France)과 3:7 비율로 혼합하여 백신을 제조하였다. 그후 제조한 백신을 4주령 SPF 닭 9수에 3주 간격으로 마리당 0.5ml씩 2회 근육으로 접종한 뒤 2차 접종 3주 후에 전 채혈하여 혈청을 분리하여 면역혈청을 생산하였다. 제조한 면역혈청은 rAPMV-9 HN HI 단백질 항원을 사용하여 HI반응법으로 항체를 정량하여 27이상의 HI 역가를 보이는 혈청을 선발하여 면역혈청으로 사용하였다. rAPMV-9 HN 단백질 항원으로 면역한 닭의 개체별 HI 항체 역가를 측정한 결과를 표 2에 나타내었다.
개체별 HI 항체 역가(log2)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
7 4 5 3 6 5 6 5 6
(검사항원은 모두 4 HA unit 항원을 사용하였음)
시험예 1. rAPMV -9 HN 단백질 항원에 특성 조사
1. rAPMV -9 HN 단백질의 열에 대한 안정성
재조합 베큘러바이러스 감염 곤충세포에서 발현된 HN 단백질의 열에 대한 안정성을 조사하였다. 발현된 단백질을 각각 56℃에서 5분, 10분, 20분 및 30분 처리한 후 혈구 응집능을 처리 전과 비교하여 30분 후에도 혈구응집능이 유지되면 열안정성(heat stable), 그렇치 않을 경우 열 불안정성(heat-labile)로 분류하였다. 뉴캣슬병바이러스(APMV-1) 라소타 균주를 대조바이러스로 하였다. 이의 결과를 표 3에 나타내었다.
항원
 56℃ 열처리 시간대별 HA 역가 결과
0분 5분 10분 20분 30분
rAPMV-9HN 256 128 32 32 32 안정(stable)
APMV-1(LaSota) 512 0 0 0 0 불안정(labile)
표 3에서 나타난 바와 같이, rAPMV-9HN 단백질 항원은 열안정성(heat stable)이 있는 것으로 분류되었다.
2. rAPMV -9 HN 단백질의 적혈구 해리 양상
rAPMV-9HN 단백질의 적혈구응집 해리 양상을 조사하였다. 혈구응집 해리 양상은 혈구응집 반응 1시간 후의 HA 역가와 24시간 후의 HA 역가를 비교하여 24시간 이후에 완전히 해리가 일어났을 경우, 빠른 용출(rapid elution), 그렇치 않을 경우 느린 용출(slow elution)로 분류하였다. 뉴캣슬병바이러스(APMV-1) 라소타 균주를 대조바이러스로 하였다. 이의 결과를 표 4에 나타내었다.
구분 HA역가 판정
1기간 후 24시간 후
rAPMV-9 256 256 느림
NDV(LaSota) 512 256 느림
표 4에서 나타난 바와 같이, rAPMV-9 HN 단백질 항원은 느린 용출 양상을 보임을 확인하였다.
시험예 2. rAPMV -9 HN 단백질 항원의 특이성 조사
rAPMV-9 HN 단백질의 APMV-9 면역혈청에 대한 특이성을 조사하였다. 이를 위하여 미국 국립수의검사소(National Veterinary Service Laboratories; NVSL)로부터 구입한 APMV 혈청형별 표준면역혈청을 사용하였다. 대조 APMV-9 항원으로 미국 NVSL에서 구입한 APMV-9 바이러스 항원을 사용하였다. rAPMV-9 HN 단백질의 APMV-9 면역혈청에 대한 특이성 확인 결과를 표 5에 나타내었다.
사용 항원* APMV 혈청형 면역혈청에 대한 HI 역가 (log2)
APMV-1 APMV-2 APMV-3 APMV-4 APMV-6 APMV-7 APMV-8 APMV-9
rAPMV-9HN 5 0 3 0 0 2 0 8
APMV-9항원 3 0 3 0 0 1 0 8
* 사용항원은 4 HA unit로 조정하여 HI 반응용 항원으로 사용하였음
표 5에 나타난 바와 같이, rAPMV-9HN 단백질 항원은 종래의 APMV-9 항원과 마찬가지로 APMV-9 면역혈청과 가장 높은 항체역가를 보였다. 그러나, rAPMV-9 HN 단백질 항원은 종래의 APMV-9 항원과 마찬가지로 APMV-1, APMV-3, APMV-7 표준면역혈청에 대한 낮은 수준의 교차반응을 나타내었다. 이 결과는 APMV-9 표준항원의 검사 성적과 차이를 보이지 않아 APMV-9 진단항원으로 사용할 수 있다는 것을 나타낸다.
시험예 3. rAPMV -9 HN 단백질 항원으로 제조한 면역혈청의 특이성 조사
1. 면역혈청이 APMV -9 항원에 대한 특이성 확인
상기 rAPMV-9 HN(베큘러 바이러스 유래의 APMV-9 HN) 단백질 항원을 닭에 면역시켜 생산한 면역혈청(상기 실시예 7)이 APMV-9 항원에 대한 특이성을 가지고 있는지 조사하였다. 상기 실시예 7에서 생산한 면역혈청 9점의 HI역가를 종래의 APMV-9 항원과 베큘러바이러스 유래의 APMV-9 HN 단백질 항원을 가지고 각각 측정하였다.
검사항원* 개체별 HI 항체 역가(log2)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
rAPMV-9 HN 7 4 5 3 6 5 6 5 6
APMV-9 항원 7 4 5 3 6 5 7 6 7
(검사항원은 모두 4 HA unit 항원을 사용하였음)
표 6에서 나타난 바와 같이, 두 항원간의 면역혈청별 HI 역가는 0.94의 높은 상관계수(r)를 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과는 rAPMV-9HN 단백질 항원으로 제조한 면역혈청도 종래의 APMV-9 바이러스항원으로 제조한 면역혈청을 대체하여 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.
2. 면역혈청이 조류유래 다른 병원체와 교차 반응 확인
rAPMV-9 HN 단백질 항원으로 제조한 면역혈청이 조류 유래 다른 병원체와 교차 반응이 나타나는 지를 조사하였다. 이의 결과를 표 7에 나타내었다.
생산
혈청		 검사
질병		 검사
방법		 개체별 항혈청의 검사결과
1 2 3 4 5 6 7 8 9
rAPMV-9 HN 혈청 IB HI 0 0 0 0 0 0 0 0 0
EDS HI 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AI ELISA 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성
MG ELISA 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성
MS ELISA 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성
aMPV ELISA 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성
IBD ELISA 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성
SP SPA 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성 음성
표 7에서 나타난 바와 같이, 닭전염성기관지염(Infectious bronchitis; IB), 닭 산란저하증(egg drop syndrome; EDS), 조류인플루엔자 (avian influenza; AI), 마이코플라즈마 갈리나룸(Mycoplasma gallicepticum; MG), 마이코플라즈마 시노비애(Mycoplasma synoviae; MS), 조류메타뉴모바이러스(avian metapneumovirus; aPMV), 닭전염성F낭병(infectious bursal disease; IBD), 추백리(Salmonella Pullroum; 추백리) 등 8종의 다른 조류질병 병원체에 대하여 모두 음성반응을 보임을 확인하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA (Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries.Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency (QIA) ) <120> Avian paramyxovirus type 9 recombinant hemagglutinin-neuraminidase protein expressed by baculovirus and diagnostic method for Avian paramyxovirus type 9 using the same <130> p-144 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1752 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> it is DNA sequence coding Avian paramyxovirus type 9 hemagglutinin-neuraminidase protein <400> 1 ggatccatgg aatcaggaat cagccaggca tctcttgtca atgacaacat agaattaagg 60 aatacgtggc gcacggcctt ccgtgtggtc tccttattac tcggcttcac cagcttggtg 120 ctcactgctt gcgctttaca cttcgctttg aatgccgcta cccctgcgga tctctctagt 180 atcccagtcg ctgttgacca aagtcatcat gaaattctac aaaccttgag tctgatgagc 240 gacattggca ataagattta caagcaggta gcactagata gtccagtggc gctgctcaac 300 actgaatcaa ccttaatgag cgcaattaca tcactatctt atcagattaa caatgcagcg 360 aataactcag gttgtggcgc ccctgtgcat gataaggatt ttatcaatgg agtggcaaag 420 gaattatttg tagggtctca atacaatgcc tcgaactatc gaccctccag gttccttgag 480 catctaaatt tcatccccgc ccctactacg ggaaaaggtt gcaccagaat tccgtccttt 540 gatctagctg caacacattg gtgttatact cacaatgtga ttcttaatgg ttgtaatgat 600 catgctcaat cttatcaata catatccctc gggatactca aggtgtcagc cacgggaaac 660 gtgttcttat ctactctcag atctatcaac ctggatgatg atgaaaaccg gaaatcatgt 720 agcatatcag caacgccact agggtgtgac ttactttgtg ctaaagtcac tgagagagaa 780 gaggcagatt acaattcaga tgcagcgacg agattagttc atggcaggtt aggttttgat 840 ggggtatacc atgagcaggc cctgcctgta gaatcattgt tcagtgactg ggttgcaaac 900 tatccgtcag tcggcggagg cagttacttt gataataggg tatggtttgg cgtgtatggg 960 gggatcagac ctggctctca gactgatctg ctccagtctg agaagtacgc gatatatcgt 1020 aggtacaata atacctgccc tgataataat cccacccaga ttgagcgggc caaatcatct 1080 tatcgtccgc agcggtttgg ccagcggctt gtacaacaag caattctatc aattagagtg 1140 gagccatctt tgggtaatga tcctaaacta tctgtgttag ataatacagt cgtgttgatg 1200 ggggcggaag caaggataat gacatttggc cacgtggcat taatgtatca aagagggtca 1260 tcatattttc cttctgcact attataccct ctcagtttaa caaatggtag tgcagcagca 1320 tccaagcctt tcatattcga gcaatataca aggccaggta gcccaccttg tcaggccact 1380 gcaagatgtc caaattcatg tgttactggt gtctacacag acgcataccc gttattttgg 1440 tctgaagatc ataaagtgaa tggtgtatat ggtatgatgt tagatgacat cacatcacgg 1500 ttaaacccgg tagcagctat atttgatagg tatggtagga gtagagtgac tagggttagc 1560 agtagcagca cgaaggcagc ttacactaca aatacatgct ttaaggttgt caaaacaaag 1620 agagtatact gcttgagcat tgccgagata gagaatacac tgtttggaga attcagaata 1680 acccctttac tctccgagat aatatttgac ccaaaccttg aaccctcaga cacgagccgt 1740 aactgactcg ag 1752 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> it is forward primer for APMV-9 HN <400> 2 ggatccatgg aatcaggaat c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> it is reverse primer for APMV-9 HN <400> 3 ctcgagtcag ttacgcgtgt a 21

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  7. 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 조류파라믹소바이러스-9(Avian paramyxovirus-9)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 포함하는, 베큘러바이러스 발현벡터가 형질도입된 곤충 세포가 발현하는 재조합 HN 단백질;을 포함하는, 조류파라믹소바이러스-9 진단용 조성물.
  8. 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 조류파라믹소바이러스-9의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 포함하는, 베큘러바이러스 발현벡터가 형질도입된 곤충 세포가 발현하는 재조합 HN 단백질;을 포함하는, 조류파라믹소바이러스-9 진단 키트.
  9. 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 조류파라믹소바이러스-9의 HN 유전자를 포함하는, 베큘러바이러스 발현벡터가 형질도입된 곤충 세포가 발현하는 재조합 HN 단백질;을 이용한 항원-항체반응을 통해 시료 내에서 조류파라믹소바이러스-9을 검출하는 것을 특징으로 하는, 조류파라믹소바이러스-9의 검출방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 항원-항체 반응은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 조류파라믹소바이러스-9의 검출방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 시료는 조류파라믹소바이러스-9로 감염된 것으로 예상되거나 감염된 세포, 혈액, 소변, 타액 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조류파라믹소바이러스-9의 검출방법.



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Silvina Chimeno Zoth 등. CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY. Vol. 16, No. 5, 페이지 775-778 (2009) *
Silvina Chimeno Zoth 등. CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY. Vol. 16, No. 5, 페이지 775-778 (2009)*

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