KR101463000B1 - 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제의 재조합 항원 단백질 및 이용한 진단용 조성물 - Google Patents

제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제의 재조합 항원 단백질 및 이용한 진단용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101463000B1
KR101463000B1 KR1020120150987A KR20120150987A KR101463000B1 KR 101463000 B1 KR101463000 B1 KR 101463000B1 KR 1020120150987 A KR1020120150987 A KR 1020120150987A KR 20120150987 A KR20120150987 A KR 20120150987A KR 101463000 B1 KR101463000 B1 KR 101463000B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hemagglutinin
protein
recombinant
neuraminidase
avian paramyxovirus
Prior art date
Application number
KR1020120150987A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140081342A (ko
Inventor
최강석
계수정
김지예
권준헌
이희수
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020120150987A priority Critical patent/KR101463000B1/ko
Publication of KR20140081342A publication Critical patent/KR20140081342A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101463000B1 publication Critical patent/KR101463000B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 제6형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-6, APMV-6)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 재조합 곤충 세포, 상기 재조합 곤충세포가 발현하는 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 재조합 항원 단백질을 포함하는 제6형 조류파라믹소바이러스 진단용 조성물, 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 진단용 조성물은 살아있는 바이러스 취급에 따른 오염 가능성 없이 안전하고, 신속하게 대량의 샘플로부터 제6형 조류파라믹소바이러스의 감염 여부를 정확하게 진단할 수 있는 우수한 효과를 가지고 있다.

Description

제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제의 재조합 항원 단백질 및 이용한 진단용 조성물 {Recombinant antigenic protein of hemagglutinin-neuraminidase of avian paramyxovirus-6 and composition for diagnosis using the same}
본 발명은 제6형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-6, APMV-6)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 재조합 곤충 세포, 상기 재조합 곤충세포가 발현하는 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 재조합 항원 단백질을 포함하는 제6형 조류파라믹소바이러스 진단용 조성물, 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
조류파라믹소바이러스 (Avian paramyxovirus; APMV)는 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)과, 아뷸라바이러스(Avulavirus)속으로 분류되는 RNA바이러스이다. APMV는 APMV-1에서 APMV-11까지 현재까지 총 11개의 혈청형(serotype)이 존재하고 있는 것으로 밝혀져 있다. 이 중 APMV-1에 속하는 뉴캣슬병바이러스 (Newcastle disease virus; NDV)가 가금류에서 가장 중요한 병원체로 알려져 있으나 APMV-6, APMV-6, APMV-7 및 APMV-9 또한 각종 가금류에 감염하여 경제적 손실을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 이 중 APMV-6는 칠면조에서 약한 호흡기증상과 산란율 저하 등의 질병을 유발할 수 있다.
APMV 게놈은 음성 극성 단일 가닥 (negative-sense single-stranded) RNA형태로 되어 있으며, 뉴클레오캡시드 단백질 (nucleocapsid protein, N), 인단백질 (phosphoprotien, P), 매트릭스 단백질 (matrix protein, M), 융합 단백질 (fusion protein, F), 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 및 폴리머라아제 단백질 (polymerase protein, L)을 발현하는 최소 6개 이상의 전사 해독틀 (open reading frames, ORF)을 가지고 있다.
APMV 구조단백질 중 N, P, L 단백질은 전사복합체 (transcription complex)를 형성하여 RNA 복제과정에 관여한다. 바이러스 외피막을 구성하는 주요 당단백질로는 F와 HN 당단백질 (glycoprotein)이 있다. 이들 당 단백질은 방어면역에 관여하는 중요한 바이러스 구조단백질이다. F 당단백질은 감염세포간의 융합을 유발하고 병원성과도 관련이 있는 것으로 알려져 있다. HN 당단백질은 감염성 바이러스가 세포 표면에 달라붙거나 세포 내에서 증식된 후대바이러스(progeny virus)가 세포막 외부로 유리하는 과정에 관여한다. 특히 HN 당단백질은 닭 적혈구를 응집시키거나 적혈구 응집 후 해리시키는 생물학적 기능을 가지고 있다.
APMV-6의 진단은 닭 부화란(종란)을 이용하여 검체 시료로부터 바이러스를 분리한 다음 분리 바이러스를 동정(identification) 하거나, 검체 시료(혈청)로부터 APMV 특이 항체를 검출하여 이루어진다. 이를 위하여 APMV 진단 항원과 면역혈청은 필수적이며, 진단방법으로 닭 적혈구를 이용한 혈구응집 (hemagglutination; HA) 반응법, 또는 혈구응집억제 (hemagglutination inhibition; HI) 반응법을 이용한다. 그러나 현재 APMV-6 진단을 위하여 사용하고 있는 진단항원은 감염성 바이러스 입자를 닭 부화란에서 증식하여 제조하며, APMV-6 바이러스는 일부 연구기관에서 제한적으로만 보유하고 있기 때문에, APMV-6 진단에 많은 어려움이 있었다.
이에, 본 발명자들은 신규한 제6형 조류파라믹소바이러스를 진단할 수 있는 조성물을 개발하고자 노력한 결과, 제6형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-6, APMV-6)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터를 제조하고, 상기 발현 벡터를 곤충 세포에 형질감염 시킨 후 생산된 재조합 항원 단백질이 닭 적혈구 응집능을 가지고 있어 제6형 조류파라믹소바이러스를 빠르고 정확하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 제6형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-6, APMV-6)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 바이러스 발현 벡터에 의해 형질전환된 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 재조합 곤충 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 곤충세포가 발현하는 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 항원 단백질을 포함하는 제6형 조류파라믹소바이러스 진단용 조성물, 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 제6형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-6, APMV-6)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 바이러스 발현 벡터에 의해 형질전환된 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 재조합 곤충 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 곤충세포가 발현하는 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 항원 단백질을 포함하는 제6형 조류파라믹소바이러스 진단용 조성물, 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 진단용 조성물은 살아있는 바이러스 취급에 따른 오염 가능성 없이 안전하고, 신속하게 대량의 샘플로부터 제6형 조류파라믹소바이러스의 감염 여부를 정확하게 진단할 수 있는 우수한 효과를 가지고 있다.
도 1은 본 발명의 재조합 바이러스 발현 벡터의 제조 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 재조합 바이러스 발현 벡터에 의해 형질전환된 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 재조합 곤충 세포의 제조 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 재조합 베큘로 바이러스 내의 APMV-6 단백질의 발현을 나타낸 도이다.
이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 제6형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-6, APMV-6)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터를 제공한다.
상기 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것 또는 이와 기능적으로 동등한 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 “기능적으로 동등한”이란 염기의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열에 의해 코딩된 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 코딩할 수 있는 염기서열을 의미한다. 예를 들어, 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다.
본 발명에 따른 재조합 바이러스 발현 벡터의 수득 과정은 하기와 같다.
먼저, 제6형 조류파라믹소바이러스로부터 게놈 DNA를 분리하거나, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 게놈 DNA를 합성한다. 상기 게놈 DNA로부터 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 유전자 부분을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분리하고, 유전자를 대량으로 생산할 수 있도록 클로닝 벡터 (예를 들어, pGEM-T 벡터, pCR-2.1-TOPO 벡터 등)에 삽입한다. 상기 재조합 벡터 내의 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 유전자 부분을 다시 분리하여, 베큘로바이러스 폴리헤드린프로모터 (PPH)를 가진 발현 벡터 (예를 들어, pFastBacTM1 벡터 등)에 삽입하여 최종적으로 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터를 제조한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 바이러스 발현 벡터에 의해 형질전환된 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 재조합 곤충 세포를 제공한다.
상기 곤충 세포는 담배거세미나방종의 도둑나방 (Spodoptera frugiperda)에서 유래한 Sf9 세포일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 제6형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-6, APMV-6)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터에 의해 형질전환된 재조합 곤충세포는, 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 발현할 수 있다. 상기 시스템을 이용할 경우, 세포 배양이 가능한 일반 실험실에서 손쉽게 대량의 단백질을 제조할 수 있으며, 수득된 제6형 조류파라믹소바이러스 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질은 닭 적혈구에 대한 혈구 응집능과 같은 HN 단백질 고유의 생물학적 기능을 가지고 있으며, 감염성을 지니고 있는 살아있는 바이러스 취급에 따른 오염 가능성 없이 안전하고, 종래 고가의 무균닭 부화란을 사용하는 항원 제조 과정에 비하여 매우 신속하고 정확하게 대량생산이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 항원 단백질은 제6형 조류파라믹소바이러스를 진단하는데 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 곤충세포가 발현하는 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 항원 단백질을 포함하는 제6형 조류파라믹소바이러스 진단용 조성물 및 진단 키트를 제공한다.
본 발명에서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 제6형 조류파라믹소바이러스의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 확인하는 것이다.
상기 진단 키트는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 진단 키트는 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 항원 단백질뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 동물 세포가 발현하는 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 항원으로 이용하여, 시료 내에서 항원-항체 반응을 통해 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 검출하는 것을 특징으로 하는, 제6형 조류파라믹소바이러스의 진단 방법을 제공한다.
상기 항원-항체 반응은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 모두 이용할 수 있으며, 예를 들어 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용할 수 있다.
상기 시료는 제6형 조류파라믹소바이러스로 감염된 것으로 예상되거나 감염된 세포, 혈액, 소변, 타액, 조직 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. APMV -6 HN 유전자를 함유하는 발현벡터 제작
CSM04/05로 야생철새의 항문스왑에서 분리된 APMV-6 균주로부터 RNeasy RNA extraction kit(Qiagen)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 바이러스 게놈 RNA를 추출하였다. 상기 RNA를 기초로, 하기 표 1의 프라이머 및 SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 상기 첫 번째 가닥 cDNA 및 하기 표 1의 프라이머 및 Emeral PCR 키트(TaKaRa)를 이용하여, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다. PCR은 98℃ 10초, 55℃ 1분, 72℃에서 1분 30초를 1 사이클로 하여 PCR 증폭기 (PE 9600;Perkin Elmer)에서 35사이클 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 5분간 DNA합성을 실시하였다.
정방향 프라이머 5'-GAATTCACTCCCCAGCTGGTGGCAAT-3'
역방향 프라이머 5'-AAGCTTGCGGGCTATATGTCACCATCTA-3'
상기 프라이머는 국제유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 제AY029299호로 등록된 APMV-6 HN 유전자의 ORF(open reading frame) 전체를 구성하는 1,841개의 핵산전체가 포함되도록 디자인되었으며, 이 후 클로닝을 위해, 정방향 프라이머의 5’말단의 ATG 상류에 EcoR1 제한효소 작용부위 및 역방향 프라이머의 5’말단의 종료코돈 상류에 HindIII 제한효소 작용부위를 삽입하였다.
PCR을 통해 증폭된 HN 유전자 cDNA단편은 제한효소 처리하여, 바로 pCR®-2.1-TOPO®벡터 (Invitrogen, USA)에 삽입하여 "pCR/APMV6HN"을 클로닝하였다. 상기 pCR/AMPV6HN 벡터를 EcoR1 및 HindIII로 처리하여 1,975bp의 DNA 단편을 추출한 후, 추출한 APMV-6 HN DNA단편을 베큘로바이러스 폴리헤드린프로모터(PPH)를 가진 pFastBacTM1 발현벡터의 멀티클로닝 부위(multicloning site)내 삽입하여 재조합 베큘로바이러스 발현벡터 (이하 “pFB/APMV6HN”이라 함)를 제작하였다.
이상의 과정을 도 1에 모식도로 나타내었다.
실시예 2. APMV -6 HN 단백질을 발현하는 재조합 베큘로바이러스의 제작
APMV-6 HN 단백질을 발현하는 재조합 베큘로바이러스를 제조하기 위하여, Baculovirus espression system 키트(Life Science사)를 사용하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 1의 재조합 베큘로바이러스 발현벡터 pFB/APMV6HN를 Bacmid를 함유하고 있는 DH10BAC E. coli 세포에 형질전환시켜 Bacmid와의 재조합 과정을 거쳤다. 그 후 재조합 Bacimid를 추출하여 곤충세포(Spodoptera frugiperda 9 cells, Sf9 세포)에 형질감염(transfection) 시켜 재조합 베큘로바이러스를 만들었다. 그런 다음, 형질감염시킨 세포의 배양 상층액을 수확하여 플라크 시험법(Plaque Assay)을 실시하여 APMV-6 HN단백질을 발현하는 재조합 베큘로바이러스(rBac/APMV6HN)를 순수 분리하였다.
이상의 과정을 도 2에 모식도로 나타내었다.
또한, 재조합 베큘로바이러스 내의 APMV-6 단백질을 SDS-PAGE 후 APMV-6 닭 면역혈청을 이용하여 웨스턴 블랏(Western blot)을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
실시예 3. APMV -6 HN 단백질 항원을 이용한 APMV -6 특이항체 검출
상기 실시예 2에서 제조한 APMV-6 HN 단백질 항원으로 APMV-6 특이 항체를 검출할 수 있는지 여부를 조사하였다. 이를 위하여 APMV 혈청형별 면역혈청(미국 국립수의검사소 제공)을 사용하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
면역혈청 HI 항체역가 (log2)
APMV-1 2
APMV-2 2
APMV-3 3
APMV-4 3
APMV-6 8
APMV-7 2
APMV-8 2
APMV-9 2
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 APMV-6 HN 단백질 항원을 사용하여 HI법을 실시했을 때, APMV-6 면역혈청에 대해서 높은 수준의 양성반응을 나타내었으며, 다른 혈청형 면역혈청에 대해서는 미약한 수준의 양성반응이 나타남을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 APMV-6 HN 단백질 항원을 이용하여, APMV-6를 진단하는데 이용할 수 있음을 확인하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA (Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries.Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency (QIA) ) <120> Recombinant antigenic protein of hemagglutinin-neuraminidase of avian paramyxovirus-6 and composition for diagnosis using the same <130> 41 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1976 <212> DNA <213> Avian paramyxovirus-6 <400> 1 actccccagc tggtggcaat ggcttcctca agtgatatga gacagggtca ggcaactcta 60 tatgagggtg accctaacag caaaaggaca tggaggaccg tgtaccgggt tatcaccata 120 ttgttggata taaccgtcct ttgtgtcggc atagtggcag tagtcaggat gtcaaccatt 180 acgacaaagg atattgataa cagtatatca tcgtccatta cttccctgag tgccgattac 240 cagccaatat ggtcagatac ccatcagaaa gtcaacagta ttttcaagga agtcggaatc 300 actatccccg tcacactcga caagatgcaa gtggaaatgg gaacggcagt taacataatc 360 aatgatgccg taaggcaact gcaaggggtc aatgggtcag cgggatttag cattaccaat 420 tcaccagaat atagtggagg gatagacaca ctgatatacc ctcttaactc acttaatggg 480 aaggctttag ccgtatcgga cctactagaa catccgagct tcataccagc gcctaccacc 540 tctcatggtt gcacccgcat tcctacattc cacctaggat accgtcattg gtgttatagt 600 cacaacacaa tagaatctgg ttgtcacgat gcaggagaaa gcattatgta cgtatctatg 660 ggtgcggtag gggtcggcca tcgtgggaaa cccatgttta cgacaagcgc agcaacaatc 720 ctagatgatg gaaagaacag gaaaagttgt agcatcatag caaaccctaa tgggtgtgat 780 gtcttgtgca gcttggttaa gcaaacagag aatgaggact acgctgaccc tacaccgacc 840 caaatgatcc acggtaggct ccacttcaat ggcacgtaca cagagtctga actcgaccct 900 ggcctattta ataaccattg ggtcgctcaa tatccagcag ttggcagcgg tgtcgtcagc 960 cacgggaaac tattctttcc gctttacgga gggatatcac cacagtcaaa actgttcaac 1020 gagcttaagt catttgctta cttcacccac aatgccgaat tgaaatgtga gaacctgaca 1080 gagagacaaa aagaagatct atataacgca tataggcctg ggaaaatagc aggatctctc 1140 tgggctcaag gggttgtaac atgtaatctg accaatctag ctgattgtaa agttgcaatt 1200 gcgaacacga gcaccatgat gatggctgcc gaggggaggt tacagcttgt gcaagatagg 1260 attgtcttct accagagatc ctcatcatgg tggccagtcc taatatatta tgatatccct 1320 attagtgacc ttatcagtgc cgatcattta gggatagtaa actggactcc atatccacaa 1380 tctaaatttc cgaggcccac ttggacaaaa ggcgtatgcg agaaaccggc aatatgtccc 1440 gctgtgtgtg taacgggtgt ttaccaggat gtttgggtag tcagtatagg gtcccagagc 1500 aatgagactg ttgtggtagg cggatactta gatgctgcag cagcccgtca ggatccatgg 1560 attgcagcag ccaaccagta taactggttg gttaggcgtc gcctttttac atctcagact 1620 gaagcagcat actcatcaac cacttgcttc agaaacacga agcaggatag agtgttctgc 1680 ctgactataa tggaagttac agacaaccta ctaggagact ggagaatcgc cccgctgtta 1740 tatgaggtta ctgtggctga taagcaacag ggtaatcgca attacgcgcc aatgggaagg 1800 atggggacgg ataagttcca atattataca ccaggtggta aatacactcc tcagcattga 1860 tgactcactg cagcttgtac ataacaattc tcttacttcc tctatttaca gagtaaatca 1920 gaagaatgac ggtcggtgat tgaccgaact caattagatg gtgacatata gcccgc 1976

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 제6형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-6, APMV-6)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 베큘러바이러스 발현벡터가 형질도입된 재조합 곤충 세포가 발현하는, 재조합 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 포함하는, 제6형 조류파라믹소바이러스 진단용 조성물.
  7. 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 제6형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-6, APMV-6)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 베큘러바이러스 발현벡터가 형질도입된 재조합 곤충 세포가 발현하는, 재조합 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 포함하는, 제6형 조류파라믹소바이러스 진단 키트.
  8. 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 제6형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-6, APMV-6)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 베큘러바이러스 발현벡터가 형질도입된 재조합 곤충 세포가 발현하는, 재조합 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 항원으로 이용하여, 시료 내에서 항원-항체 반응을 통해 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 검출하는 것을 특징으로 하는, 제6형 조류파라믹소바이러스의 진단 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 항원-항체 반응은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질 칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 제6형 조류파라믹소바이러스의 진단 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 시료는 제6형 조류파라믹소바이러스로 감염된 것으로 예상되거나 감염된 세포, 혈액, 소변, 타액 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 제6형 조류파라믹소바이러스의 진단 방법.
KR1020120150987A 2012-12-21 2012-12-21 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제의 재조합 항원 단백질 및 이용한 진단용 조성물 KR101463000B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120150987A KR101463000B1 (ko) 2012-12-21 2012-12-21 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제의 재조합 항원 단백질 및 이용한 진단용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120150987A KR101463000B1 (ko) 2012-12-21 2012-12-21 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제의 재조합 항원 단백질 및 이용한 진단용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140081342A KR20140081342A (ko) 2014-07-01
KR101463000B1 true KR101463000B1 (ko) 2014-11-19

Family

ID=51732676

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120150987A KR101463000B1 (ko) 2012-12-21 2012-12-21 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제의 재조합 항원 단백질 및 이용한 진단용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101463000B1 (ko)

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank Accession Number JN571486 (2011.12.08.) *
GenBank Accession Number JN571486 (2011.12.08.)*
Silvina Chimeno Zoth 등. CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY. Vol. 16, No. 5, 페이지 775-778 (2009) *
Silvina Chimeno Zoth 등. CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY. Vol. 16, No. 5, 페이지 775-778 (2009)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140081342A (ko) 2014-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bonami et al. Viral diseases of the giant fresh water prawn Macrobrachium rosenbergii: a review
Damena et al. Characterization of Newcastle disease virus isolates obtained from outbreak cases in commercial chickens and wild pigeons in Ethiopia
Mao et al. Review detection of Newcastle disease virus
Patel et al. Complete genome sequence analysis of chicken astrovirus isolate from India
JP4953256B2 (ja) 鳥類免疫系によって認識されるｈｎ蛋白質のエピトープ及び前記エピトープ突然変異を含むニューカッスル病ウイルス
Alvarado et al. Detection of Massachusetts and Arkansas serotypes of infectious bronchitis virus in broilers
Panigrahi et al. Molecular characterization of chicken astroviruses in gout-affected commercial broiler chickens in Haryana, India
CN102803516A (zh) 病毒试验
CN102108414B (zh) 狗鱼幼鱼弹状病毒实时荧光rt-pcr检测法和试剂盒
EP3892729A1 (en) Recombinant porcine parvovirus antigenic protein and use thereof
KR101463000B1 (ko) 제6형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제의 재조합 항원 단백질 및 이용한 진단용 조성물
KR101491817B1 (ko) 제 8형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제의 재조합 항원 단백질 및 이용한 진단용 조성물
Villarreal Diagnosis of infectious bronchitis: an overview of concepts and tools
KR100504763B1 (ko) 전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자
KR101462985B1 (ko) 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제의 재조합 항원 단백질 및 이용한 진단용 조성물
KR101462998B1 (ko) 제2형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌―뉴라미니다아제의 재조합 항원 단백질 및 이용한 진단용 조성물
KR102154380B1 (ko) 고-적정 e형 간염 바이러스 스톡을 세대화시키는 방법과 e형 간염 바이러스의 적정 측정법
KR101463004B1 (ko) 베큘러바이러스에 의하여 발현된 조류파라믹소바이러스-9 재조합 hn 단백질 및 이를 이용한 조류파라믹소바이러스-9의 진단 방법
KR101463001B1 (ko) 베큘러바이러스에 의하여 발현된 조류파라믹소바이러스-7 재조합 hn 단백질 및 이를 이용한 조류파라믹소바이러스-7의 진단 방법
Raji et al. Molecular Detection, Characterisation and Serological Survey of Chicken Astrovirus from Broiler Flocks in Malaysia.
Zhang et al. Duck hepatitis virus
KR101395347B1 (ko) 뉴캐슬병바이러스 ｈｎ 단백질 및 이를 포함하는 ｈｉ법 검사용 항원진단액
KR101374192B1 (ko) 제4형 조류파라믹소바이러스 ｈｎ 단백질 및 이를 포함하는 ｈｉ법 검사용 항원진단액
KR20170101655A (ko) 효소면역기법을 이용한 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법
Saini et al. Diagnosis and molecular characterization of chicken anaemia virus

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant