CN113897376B

CN113897376B - 一种hn蛋白突变的基因vii型新城疫病毒重组疫苗株

Info

Publication number: CN113897376B
Application number: CN202111173227.2A
Authority: CN
Inventors: 于晓慧; 王静静; 刘华雷; 李峥; 舒波; 李阳; 蒋文明
Original assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Current assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority date: 2021-10-08
Filing date: 2021-10-08
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2041-10-08
Also published as: CN113897376A

Abstract

本发明提供一种HN蛋白突变的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株，其中用于构建基因VII型新城疫病毒重组疫苗株的过程中使用的基因片段包含了毒性致弱的基因VII.2亚型新城疫病毒的囊膜糖蛋白F蛋白基因和HN蛋白基因。本发明提供的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株在鸡胚中具有高生长滴度和低致病力的生物学特性，遗传稳定，对新城病毒具有良好的免疫保护效果，并能有效抑制排毒，能够用于防控目前流行的基因VII型新城疫病毒，具有广阔的应用前景。

Description

一种HN蛋白突变的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种HN蛋白突变的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株及其构建方法和应用。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)强毒株感染禽类引起的一种急性、高度接触性传染病。NDV强毒株可导致感染禽类出现呼吸困难、下痢、神经机能紊乱及粘膜、浆膜出血和坏死等典型特征，病死率可达100％，给养禽业造成严重经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将新城疫列为法定通报动物疫病，我国农业农村部将其列为一类动物疫病，并在《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》中，将其列为优先防治的重大动物疫病。

NDV为单股、负链、不分节段的RNA病毒，宿主范围广泛，其中以鸡只最易感。NDV具有遗传多样性。根据病毒F基因进行遗传进化分析，NDV可分为I类(class I)和II类(classII)两种类型，其中I类只有1个基因型，II类至少有21个基因型(I—XXI)。1984年，我国台湾地区首次发现基因VII型NDV。随后，该基因型毒株在我国家禽中广泛流行，主要为基因VII.1.1亚型。2011年，我国在广西野鸟中首次分离到基因VII.2亚型NDV。国家新城疫参考实验室监测数据显示，2012—2018年我国陆续在家禽中也分离到VII.2亚型毒株，并可能成为优势基因型。

疫苗免疫是预防新城疫的重要手段，目前广泛使用的新城疫疫苗主要有II系苗B1、IV系苗LaSota、clone30、V4活疫苗以及A-VII油乳剂灭活苗和LaSota油乳剂灭活苗等，这些疫苗虽然可以提供一定的免疫保护，但是不能完全阻止新城疫病毒的扩散、传播，特别是基因VII型新城疫病毒在我国的流行给养殖业造成巨大损失。目前养殖场免疫的基因VII型新城疫疫苗是针对基因VII.1.1亚型研制的，其对现流行的基因VII.2亚型毒株存在免疫失败的风险。鉴于此，为促进我国养禽业健康发展，最终达到新城疫净化的目标，研制基因VII.2亚型NDV疫苗具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HN蛋白突变的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株及其构建方法和应用，所构建的疫苗株的毒力高度减弱，在鸡胚上具有较高繁殖能力，免疫原性好，能够用于防控目前流行的基因VII.2亚型NDV。

本发明首先提供一种用于构建基因VII型新城疫病毒重组疫苗株的基因片段，是用包含了毒性致弱的基因VII.2亚型NDV的囊膜糖蛋白F蛋白基因片段和HN蛋白基因片段替换LaSota株基因组的对应部分的基因片段；

所述的毒性致弱的基因VII.2亚型NDV的囊膜糖蛋白F蛋白基因，是将氨基酸序列为SEQ ID NO:1(一种具体的编码基因的序列为SEQ ID NO:5)的F基因的位点112R-R-R-K-R-F117突变为112G-R-Q-G-R-L117；

所述的HN蛋白基因，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2(一种具体的编码基因的序列为SEQ ID NO:6)；

更进一步的，是将HN蛋白的长度从571aa延长至577aa，其氨基酸序列为SEQ IDNO:3(一种具体的编码基因的序列为SEQ ID NO:7)；

作为实施例的具体记载，所述的含了毒性致弱的基因VII.2亚型NDV的囊膜糖蛋白F蛋白基因和HN蛋白基因的，用于构建基因VII型新城疫病毒重组疫苗株的基因片段的一种具体核苷酸序列为SEQ ID NO:4；

本发明还提供了一种基因VII型新城疫病毒重组疫苗株，是使用上述的基因片段构建的，其构建方法包括以下步骤：

1)构建包含基因II型新城疫病毒LaSota株基因组全长cDNA质粒；

2)在1)中构建的LaSota株基因组全长cDNA质粒上，用进行了毒性致弱的基因VII.2亚型NDV的囊膜糖蛋白F蛋白基因和HN蛋白基因片段替换LaSota株基因组的对应部分片段获得全长重组质粒；

3)将2)中构建的全长重组质粒与表达新城疫病毒LaSota毒株NP、P和L基因的真核表达质粒共转染表达T7聚合酶的细胞，获得表达基因VII型F和HN蛋白的重组新城疫病毒弱毒疫苗株；

所述的细胞为BSR-T7/5细胞。

本发明的再一个目的是提供所述的HN蛋白突变的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株在制备疫苗中的应用；

所述的疫苗为灭活疫苗，是通过甲醛对弱毒株进行灭活。

本发明提供的HN蛋白突变的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株是将进行了致弱突变的基因VII型新城疫病毒的囊膜糖蛋白F蛋白基因和HN蛋白基因片段与LaSota株基因组的对应部分基因进行替换，拯救获得了基因VII型新城疫病毒重组致弱疫苗株。该重组弱毒株遗传稳定，并具有高生长滴度和低致病力的生物学特性。该重组弱毒株制备的疫苗能诱导产生较高的中和抗体，并能有效抑制排毒，能够用于防控强毒力基因VII型以及新流行的基因VII.2亚型NDV的侵害，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为pOK-rLaSota全长质粒构建示意图，图中倒三角形状所示为有别于野生型毒株序列而引入的分子标记(突变的单一酶切位点)；

图2为拯救病毒rLaSota株全长cDNA的突变位置的测序结果图；

图3为全长基因组质粒pOK-rLa-VII-YN17和pOK-rLa-VII-571-YN17构建示意图；

图4为基因VII型NDV重组疫苗候选株rLa-VII-YN17和rLa-VII-571-YN17第1代、第5代、第10代、第15代与NDV YN1106/2017株F基因裂解位点测序比对结果。

具体实施方式

本发明设计了一种表达基因VII型NDV F和HN基因重组弱毒疫苗rLa-VII-YN17的构建方法，在建立基因II型新城疫病毒LaSota株的反向遗传操作平台基础上，将中国主要流行的新城疫病毒基因VII.2亚型分离株YN1106/2017的囊膜糖蛋白F蛋白基因和HN蛋白基因片段与LaSota株基因组的对应部分基因进行替换，同时将F蛋白的强毒裂解位点(112R-R-R-K-R-F117)突变为弱毒株LaSota的F蛋白裂解位点(112G-R-Q-G-R-L117)，并将HN蛋白的长度从571aa延长至577aa，构建出致弱的表达NDV基因VII.2亚型F和HN基因的全长cDNA克隆质粒pOK-rLa-VII-YN17，与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后拯救出重组NDV弱毒疫苗株rLa-VII-YN17。

本发明还提供了一种所述的HN蛋白突变的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株rLa-VII-YN17的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建基因II型新城疫病毒LaSota株基因组全长cDNA质粒pOK-rLaSota；

(2)构建重组质粒pOK-rLa-VII-YN17，在pOK-rLaSota基础上，用Bgl II和HindIII限制性内切酶切割B片段与C片段，结合同源重组的方法，将基因VII.2亚型新城疫病毒YN1106/2017株的F基因和HN基因片段与LaSota株基因组的对应部分基因进行替换，同时将F蛋白的强毒裂解位点(112R-R-R-K-R-F117)突变为弱毒株LaSota的F蛋白裂解位点(112G-R-Q-G-R-L117)，并将HN蛋白的长度从571aa延长至577aa，获得重组质粒pOK-rLa-VII-YN17；

(3)重组致弱毒株rLa-VII-YN17的拯救，将全长质粒pOK-rLa-VII-YN17与表达NDVLaSota毒株NP、P和L基因的pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒共转染表达T7聚合酶的BSR-T7/5细胞，转染6h后添加TPCK胰酶，孵育72h，将转染样品反复冻融后接种9～11日龄SPF鸡胚，即获得表达基因VII型F和HN蛋白的重组新城疫病毒弱毒疫苗株rLa-VII-YN17。

上述方法中，步骤(1)的pOK-rLaSota通过以下方法构建得到：根据LaSota株的全长cDNA序列特点，将全长基因组分为a、b、c、d、e共5个片段。根据克隆需要设计引物对部分片段进行相应的突变修饰，以保证克隆所使用的酶切位点的单一性，突变的碱基序列可以作为拯救病毒的分子标签，并在a片段的5’上游引入T7启动子序列，在T7启动子的后面引入三个连续的G碱基来加强其转录活性，在e片段的3’端引入丁肝核酶(HdvRz)序列和T7终止子序列。随后将各个片段依次克隆到pOK12载体中。在实施例中构建完成基因组全长质粒命名为pOK-rLaSota。

本发明的再一个目的是提供所述的新城疫病毒重组疫苗株rLa-VII-YN17的应用。

含有上述表达基因VII型新城疫病毒F和延长的HN蛋白基因重组弱毒疫苗株rLa-VII-YN17的生物制品属于本发明的保护范围。

对重组疫苗株rLa-VII-YN17遗传稳定性进行分析，结果表明rrLa-VII-YN17株在9～11日龄SPF鸡胚中连续传代至第15代，其第1代(F1)、第5代(F5)和第10代(F10)和第15代(F15)病毒经序列测定均含有基因VII型新城疫病毒的F(突变裂解位点)和HN序列，并含有构建时引入的分子标签，病毒遗传稳定性好。

本发明设计的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株rLa-VII-YN17，是将基因VII.2亚型新城疫病毒F蛋白的强毒裂解位点112R-R-R-K-R-F117突变为弱毒株LaSota的F蛋白裂解位点112G-R-Q-G-R-L117，并将HN蛋白的长度从571aa延长至577aa，该突变后序列能够使其毒力降低，毒株的安全性更好。

本发明设计的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株rLa-VII-YN17使用新城疫病毒基因II型经典疫苗株LaSota株的NP、P、M和L基因作为骨架，其保留了LaSota毒株高繁殖滴度的特性，该重组疫苗株在鸡胚上表现出了优异的生长特性。

所述的疫苗为灭活疫苗，是通过甲醛对弱毒株进行灭活。

免疫保护实验结果表明，重组疫苗株rLa-VII-YN17制备的灭活疫苗对鸡只安全且无副反应；免疫28日龄SPF鸡2周后可产生较高水平抗体，3周后抗体水平更高；免疫3周后用基因VII型新城疫病毒强毒野毒株YN1106/2017进行攻毒，免疫组鸡只未出现任何发病症状或者死亡，免疫保护率达到100％，并可有效抑制排毒，而对照组的死亡率以及拭子病毒排毒检出率均为100％。

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例中的实验方法，若未特别指明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。

实施例1：LaSota株的拯救

1、病毒纯化

病毒的纯化是为了获得单一的病毒克隆，采用有限稀释法对LaSota株进行了纯化，详细步骤如下：对病毒液进行10倍倍比稀释，稀释后分别取各滴度病毒液接种9～11日龄SPF鸡胚(100μL/枚)，每个稀释度接种5枚。4d后收获鸡胚尿囊液测定HA活性。选取具有HA活性的最高稀释倍数的尿囊液作为下一代纯化的病毒液。用同样的方法进行倍比稀释和鸡胚接种，对病毒连续纯化5代，分装保存第5代病毒液，将其作为原始种毒用于下一步试验。

2、病毒序列测定

以纯化后的病毒反转录基因组cDNA为模板，利用设计的扩增LaSota株全长序列的13对引物(表1)，对LaSota基因组进行PCR扩增，同时使用3′-RACE和5′-RACE试剂盒测定了病毒基因组两个末端序列。通过DNA Star生物学软件对所测得的序列进行拼接。结果表明，NDV LaSota株基因组全长为15186bp。

表1：LaSota株NDV全基因组测序用引物表

3、LaSota全长cDNA克隆质粒的构建

根据LaSota基因组的序列特点，通过酶切位点的筛选，将全长基因组分为5个片段(片段a-e)。设计引物扩增这5个片段(表2)，并对P基因、M基因和L基因上的三个酶切位点进行突变，以保证Bgl II和Hind III酶切位点的单一性，突变的碱基序列可以作为拯救病毒的分子标签。在a片段的5’上游引入T7启动子序列，在T7启动子的后面引入三个连续的G碱基来加强其转录活性，在e片段的3’端引入丁肝核酶(HdvRz)序列和T7终止子序列。随后将各个片段依次连接到pOK12克隆载体中，构建策略如图1。在完成全长基因组克隆后进行序列测定，将构建完成且测序正确的病毒基因组质粒命名为pOK-rLaSota。

表2：LaSota毒株基因组全长cDNA克隆构建所用引物表

4、辅助质粒的构建

根据测定的LaSota株基因组序列，设计引物分别扩增其编码核衣壳蛋白NP、磷蛋白P和聚合酶蛋白L的开放阅读框(表3)，并将3个ORF分别克隆至真核表达载体pCI-neo的CMA启动子下游，构建3个辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L，经测序验证无基因突变产生。

表3：LaSota辅助质粒构建所用引物表

5、病毒的拯救

将已构建好的全长质粒(pOK-rLaSota)和3个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P和pCI-L)共同转染BSR-T7/5细胞。转染6h后，更换成含2％血清、1％抗生素、5μg/mL的TPCK-Trypsin的DMEM培养基。转染72h后收获培养液及细胞，接种9～11日龄SPF鸡胚(200μL/枚)，37℃孵育，3～4d后收获鸡胚尿囊液，并进行血凝(HA)试验。结果显示为HA阳性，初步表明病毒拯救成功。

6、拯救病毒rLaSota的鉴定及生物学特性分析

提取HA阳性的病毒液RNA，对拯救病毒进行全基因组序列测定。序列比对结果显示拯救病毒基因组中含有构建时引入的分子标签(突变的酶切位点，图2)，表明LaSota株基因组cDNA克隆成功拯救，将拯救的病毒命名为rLaSota。将其继续在9～11日龄SPF鸡胚中连续传至5代。检测每代的血凝效价其可达2¹⁰～2¹¹之间。对F5代病毒液进行序列测定，结果显示，分子标签未发生回复突变，表明拯救的rLaSota具有较好的稳定性。测定拯救病毒与亲本毒的鸡胚半数感染量(EID₅₀)、鸡胚平均致死时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)，表4显示了拯救病毒与亲本病毒具有相同的生物学特性和致病性。

表4：拯救病毒与亲本毒株的生物学特性表

综上所述，本发明的新城疫病毒LaSota株的反向遗传操作平台构建成功，其可作为良好的疫苗载体使用。

实施例2：重组新城疫疫苗候选种毒的拯救

1、病毒的筛选及纯化

选取实验室分离保存的当前中国主要流行的基因VII.2亚型鸡源新城疫病毒进行繁殖复壮，进而采用有限稀释法对5株毒株进行纯化，各毒株不同代次的血凝效价见表5。最终选取纯化5代后的YN1106/2017毒株，作为原始种毒用于全长cDNA克隆的构建。

表5：基因VII型新城疫病毒不同毒株各代次血凝效价表

2、YN1106/2017株全长基因组序列的测定和分析

以纯化后的YN1106/2017病毒反转录基因组cDNA为模板，利用设计的扩增VII型NDV全长序列的12对引物(表6)，对YN1106/2017基因组进行PCR扩增，同时使用3’RACE和5’RACE试剂盒测定了病毒基因组两个末端序列。通过DNA Star生物学软件对所测得的序列进行拼接。结果表明，YN1106/2017株基因组全长为15192bp。

表6：VII型NDV全基因组测序用引物表

3、疫苗候选株基因组全长cDNA构建

以pOK-LaSota全长质粒为平台，设计合成该全长序列中从Bgl II酶切位点到HindIII酶切位点中间的新基因序列YN17-571HN-bc，共6539bp，其包含将基因VII型新城疫病毒YN1106/2017株的囊膜糖蛋白F蛋白基因和HN蛋白基因片段与LaSota株基因组的对应部分基因进行替换，同时将F蛋白(SEQ ID NO:1)的强毒裂解位点(112R-R-R-K-R-F117)突变为弱毒株LaSota的F蛋白裂解位(112G-R-Q-G-R-L117)，其他序列保持不变，设计重组病毒rLa-VII-571-YN17株。

在上述突变基础上，并同时设计合成包含将HN蛋白的长度从571aa(SEQ ID NO:2)延长至577aa(SEQ ID NO:3)的另一个新基因序列YN17-577HN-bc(SEQ ID NO:4)，共6539bp，设计重组病毒rLa-VII-YN17株。

使用Bgl II和Hind III两个限制性内切酶对pOK-rLaSota全长质粒进行双酶切，剪切掉原来的b、c两个片段。设计引物扩增合成的目的基因YN17-571HN-bc和YN17-577HN-bc片段(表7)，将胶回收的目的片段YN17-571HN-bc和YN17-577HN-bc片段分别与酶切后的载体进行连接，构建策略如图3。在完成全长基因组克隆后进行序列测定，将构建完成且测序正确的病毒基因组质粒分别命名为pOK-rLa-VII-571-YN17和pOK-rLa-VII-YN17。

表7:用于扩增YN17-571HN-bc和YN17-577HN-bc片段的引物表

4、疫苗候选株的拯救

将已构建好的两个全长重组质粒(pOK-rLa-VII-571-YN17和pOK-rLa-VII-YN17)分别和LaSota病毒的3个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P和pCI-L)共同转染BSR-T7/5细胞。转染6h后，更换成含2％血清、1％抗生素、5μg/mL的TPCK-Trypsin的DMEM培养基。转染后72h收获培养液及细胞，接种9～11日龄SPF鸡胚(200μL/枚)，37℃孵育，3～4d后收获鸡胚尿囊液，并进行血凝(HA)试验。结果都显示为HA阳性，初步表明病毒拯救成功。

5、疫苗候选株的序列鉴定和遗传稳定性

选取HA阳性的病毒液提取RNA并进行反转录后，进行全基因组序列测定。序列比对结果显示拯救病毒rLa-VII-571-YN17基因组为以LaSota株为骨架，嵌合YN1106/2017株的F和HN基因，并且F基因裂解位点已突变；拯救病毒rLa-VII-YN17基因组为以LaSota株为骨架，嵌合YN1106/2017株的F和HN基因，并且F基因裂解位点已突变，HN蛋白的长度从571aa延长至577aa，表明两株病毒均获得成功拯救。

将拯救病毒继续在9～11日龄SPF鸡胚中连续传代15次。每代病毒的血凝效价均在2¹⁰～2¹¹之间。选取第1代、第5代、第10代和第15代重组病毒的F和HN基因进行序列测定。测序结果表明，第1代、第5代、第10代和第15代重组病毒的F和HN基因均与***的序列一致，F蛋白裂解位点也未发生回复突变(图4)，表明两株重组病毒传代过程中遗传稳定。

6、疫苗候选株的生物学特性

选取第15代rLa-VII-YN17和rLa-VII-571-YN17疫苗候选株测定其EID₅₀、MDT和ICPI，并以病毒Lasota株和YN1106/2017株作为对照，比较病毒的毒力变化情况。表8的试验数据表明，本发明拯救的rLa-VII-YN17和rLa-VII-571-YN17疫苗候选株毒力都明显降低，而具有HN蛋白长度延长的rLa-VII-YN17疫苗候选株相较于rLa-VII-571-YN17疫苗候选株在鸡胚中具有更高生长滴度以及对1日龄雏鸡有更低致病力的生物学特性。因此，本发明构建的rLa-VII-YN17疫苗候选株可作为优选疫苗株用于疫苗生产。

表8：拯救病毒与亲本毒株的生物学特性表

实施例3 rLa-VII-YN17疫苗株对SPF鸡安全性试验和免疫效果试验

1、灭活疫苗的制备

rLa-VII-YN17疫苗株用灭菌生理盐水稀释10 000倍，接种9～11日龄SPF鸡胚，每胚接0.1mL，置37℃继续孵育。将接种后24h内死胚弃去，24h～120h死胚及时放4℃，收混合样，测定制苗毒的HA为2⁸，病毒滴度为10^9.65EID₅₀/0.1mL。将测定好效价的新城疫病毒液导入灭活罐内，加入终浓度为0.1％的甲醛溶液使其充分混合，4℃灭活48h，期间每隔2h摇晃一次。灭活后的病毒原液按常规方法制备油佐剂灭活疫苗。

2、灭活疫苗的超剂量接种安全性试验

为测定本发明实施例2拯救的rLa-VII-YN17疫苗株对SPF鸡的安全性，将制备的rLa-VII-YN17灭活疫苗免疫7日龄SPF鸡16只，每只肌肉注射疫苗1.0mL，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡只采食、饮水及临床情况。免疫后3天和7天每组剖检3只鸡，观察肝脏、脾脏、胰腺、十二指肠、腺胃、气管、盲肠扁桃体、法氏囊、心脏、脑、肺脏、肾脏和胸腺等组织脏器是否出现病变。结果显示，鸡只免疫后疫苗吸收效果良好，饮食、饮水、排便正常，均未表现出任何局部和全身的不良反应，剖检鸡只各脏器均无病变。

3、灭活疫苗的免疫效果评价

为测定本发明实施例2拯救的rLa-VII-YN17疫苗株对SPF鸡的免疫保护效果，将饲养于隔离器内的28日龄的SPF鸡20只，随机分成两组，每组10只，一组为实施例3步骤1所制备的rLa-VII-YN17灭活疫苗免疫组，一组为阴性对照组。免疫组每只鸡肌肉注射疫苗20μL，对照组注射相同剂量的PBS。分别于免疫后7天、14天和21天采血，分离血清，测定抗体。21天采血后，用临床分离的基因VII型野毒株强毒YN1106/2017株攻毒，每只鸡以10⁶EID₅₀剂量经肌肉注射途径进行攻毒，隔离器饲养，观察14天，每天记录鸡只发病和死亡情况；攻毒后3天、5天、7天和10天采集两组鸡口咽拭子和泄殖腔拭子口咽拭子和泄殖腔拭子接种鸡胚进行病毒分离，检测排毒情况。

结果显示，免疫组免疫14天后可产生较高水平抗体，21天抗体水平更高，结果见表9。攻毒后，在14天的观察期内，免疫组未出现任何发病或死亡，免疫保护率达到100％；而对照组鸡只则在攻毒3～4后全部死亡，结果见表10。表11的排毒结果显示，rLa-VII-YN17灭活疫苗免疫组仅在攻毒后第5天有一只鸡排毒，阴性对照组排毒率为100％。

表9：免疫后抗体效价测定表

表10：免疫效力试验结果表

表11：攻毒后试验鸡排毒检测结果表

综上所述，本发明所制备的灭活的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株rLa-VII-YN17，对免疫鸡只具有较好的安全性和保护效果，具有广阔的应用前景。

上述内容仅为本发明创造的优选实施例，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是未脱离本发明技术方案的内容，依本发明创造权利要求及发明创造说明内容对以上实施例所做出的简单变化、等效变化与修饰，均仍属于本发明技术方案涵盖的范围。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种HN蛋白突变的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 553

<212> PRT

<213> 新城疫病毒(Newcastle disease virus)

<400> 1

Met Gly Ser Asn Ser Ser Thr Arg Thr Pro Thr Pro Pro Met Leu Val

1 5 10 15

Thr Leu Ile Ile Leu Ile Leu Ser Phe Ile Cys Leu Ala Ser Ser Leu

20 25 30

Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys

35 40 45

Ala Val Asn Ile Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys

50 55 60

Leu Leu Pro Asn Met Pro Lys Asp Lys Glu Ala Cys Ala Arg Ala Pro

65 70 75 80

Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly

85 90 95

Asp Ser Ile Arg Lys Ile Gln Gly Ser Ala Ser Thr Ser Gly Gly Arg

100 105 110

Arg Arg Lys Arg Phe Ile Gly Ala Ile Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly

115 120 125

Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala

130 135 140

Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala

145 150 155 160

Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asn Gly Leu Ser Gln Leu Ser

165 170 175

Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Asn

180 185 190

Thr Ala Arg Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val

195 200 205

Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln

210 215 220

Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn

225 230 235 240

Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Val Gly

245 250 255

Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Tyr

260 265 270

Pro Ile Leu Tyr Asp Ser Gln Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Asn

275 280 285

Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu

290 295 300

Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Phe Ala Ser Ala Leu Val Pro

305 310 315 320

Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser

325 330 335

Tyr Cys Ile Glu Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr

340 345 350

Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser

355 360 365

Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met

370 375 380

Thr Leu Lys Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Ile Thr Thr Cys Arg

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Cys Ala Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val

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Ser Leu Ile Asp Arg Arg Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile

420 425 430

Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile

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Ser Ile Leu Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser

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Leu Ala Glu Ser Asn Ser Lys Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu Thr

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Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Val Ile Ser Leu

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<210> 2

<211> 571

<212> PRT

<213> 新城疫病毒(Newcastle disease virus)

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<212> PRT

<213> 新城疫病毒(Newcastle disease virus)

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Gly

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<212> DNA

<213> 新城疫病毒(Newcastle disease virus)

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gaaaacatct gttgcagtca tggaagccaa cttgggaatg atgaagattc tggatcccgg 120

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agtttcaggc cctggagacc cctctcccta tgtgacacaa ggaggcgaaa tggcacttaa 240

taaactttcg caaccagtgc cacatccatc tgaattgatt aaacccgcca ctgcatgcgg 300

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cccgagttct tcagccaagc tcctaagcaa gttagatgca gccgggtcga tcgaggaaat 420

caggaaaatc aagcgccttg ctctaaatgg ttaattacta ctgccacacg tagcgggtcc 480

ctgtccactc ggcatcacac ggaatctgca ccgagttccc ccccgcagac ccaaggtcca 540

actctccaag cggcaatcct ctctcgcttc ctcagcccca ctgaatgatc gcgtaaccgt 600

aattaatcta gctacattta agattaagaa aaaatacggg tagaattgga gtgccccaat 660

tgtgccaaga tggactcatc taggacaatt gggctgtact ttgattctgc ccattcttct 720

agcaacctgt tagcatttcc gatcgtccta caagacacag gagatgggaa gaagcaaatc 780

gccccgcaat ataggatcca gcgccttgac ttgtggactg atagtaagga ggactcagta 840

ttcatcacca cctatggatt catctttcaa gctgggaatg aagaagccac tgtcggcatg 900

atcgatgata aacccaagcg cgagttactt tccgctgcga tgctctgcct aggaagcgtc 960

ccaaataccg gagaccttat tgagctggca agggcctgtc tcactatgat agtcacatgc 1020

aagaagagtg caactaatac tgagagaatg gttttctcag tagtgcaggc accccaagtg 1080

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aaagcgccag agaagattcc cgggagtgga accctagaat acaaggtgaa ctttgtctcc 1200

ttgactgtgg taccgaagaa ggatgtctac aagatcccag ctgcagtatt gaaggtttct 1260

ggctcgagtc tgtacaatct tgcgctcaat gtcactatta atgtggaggt agacccgagg 1320

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catattggac ttatgaccac cgtagatagg aaggggaaga aagtgacatt tgacaagctg 1440

gaaaagaaaa taaggagcct tgatctatct gtcgggctca gtgatgtgct cgggccttcc 1500

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caaaccgcgt gcctgcggag cgttaaaatc attatccaag caggtaccca acgcgctatc 1680

gcagtgaccg ccgaccacga ggttacctct actaagctgg agaaggggca cacccttgcc 1740

aaatacaatc cttttaagaa ataagctgcg tctctgagat tgcgctccgc ccactcaccc 1800

agatcatcat gacacaaaaa actaatctgt cttgattatt tacagttagt ttacctgtct 1860

atcaagttag aaaaaacacg ggtagaagat tctggatccc ggttggcgcc ctccaggtgc 1920

aagatgggtt ccaactcttc taccaggacc ccaacacccc cgatgctggt cactctgatc 1980

atactgatat taagcttcat ctgcctggca agctctctcg atggcaggcc tcttgcggct 2040

gcagggattg tggtaacagg agacaaggca gtcaatatct acacctcgtc tcaaacaggg 2100

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ccattagaag catataatag aacattgact acattgctca ctccccttgg cgattccatc 2220

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ataaaaatta cacaacaggt tggtgtagaa ctcaacctat acctgactga attgactaca 2580

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gagtctgatc tggatttata ttgcacaaga atagtgacat tccccatgtc cccaggcatt 3000

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actacgccat atatgaccct taaaggctca gttattgcca attgtaagat aacaacatgt 3120

agatgtgcag atcctcctgg tatcatatcg caaaattacg gagaagctgt gtctctgata 3180

gacagacgtt cgtgcaatgt cctatcatta gacgggataa ctctgaggct cagtggggag 3240

tttgatgcaa cttatcaaaa gaatatctca atactagatt ctcaagttat cgtgacaggc 3300

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gctctcatta cttatatcgt tttaacagtc atttctcttg tttctggtgc acttagtttg 3480

attttaacat gttacttgat gtacaagcag aaggcacaac agaagacctt actatggctt 3540

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agtcctcaat catggaccgt gtggtcaata gggtcgtgct ggagaatgag agaagagaag 3840

caaagaatac atggcgcttg gtcttccgta tcacagtctt acttttattg gcaatgactc 3900

tagccatctc tgcagccgcc ctggcgcata gcatgagggc ctgtacgctg cgtgacctcg 3960

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taaatactga atctataatt atgaatgcaa taacctctct ttcctatcaa atcaacggag 4140

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catttgacat gagcaccact cattattgtt atactcacaa tgtgatattt tctggttgca 4380

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ttgatggtca ataccatgag aaggacttag ataccacagt cttatttaaa gattgggtgg 4680

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cttcatataa gccccagcga tttggtggga agcgcgtaca gcaagccatc ttatctattg 4920

aggtgtcaac atctttgggt aaggatccgg tgctgactat tccacctaat acaattacac 4980

tcatgggggc cgaaggcaga attctcacgg tagggacatc tcacttcctg tatcaacgag 5040

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ccaataaaac ttattgtctt agtattgcag aaatatccaa caccctattc ggggaattta 5460

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cctgatgaat gtgacttcga ccacctcatt ctcagccgac aatggaaaaa aatacttgaa 5940

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cagatccaga ggcatctgat ggtggcagct aggacaaggt ctgcggccaa caaattggtg 6360

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 新城疫病毒(Newcastle disease virus)

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atgggttcca actcttctac caggacccca acacccccga tgctggtcac tctgatcata 60

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tgtgcagatc ctcctggtat catatcgcaa aattacggag aagctgtgtc tctgatagac 1260

agacgttcgt gcaatgtcct atcattagac gggataactc tgaggctcag tggggagttt 1320

gatgcaactt atcaaaagaa tatctcaata ctagattctc aagttatcgt gacaggcaat 1380

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agcaccactc attattgtta tactcacaat gtgatatttt ctggttgcag agaccactca 600

cactcacacc aatacctagc acttggcgtg ctccggacat ctgcaacagg gaggatattc 660

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gattacaggt cagttacccc cacatcaatg gtgcacggaa ggctagggtt tgatggtcaa 840

taccatgaga aggacttaga taccacagtc ttatttaaag attgggtggc aaattaccct 900

ggggtgggag gtgggtcttt tattaacgac cgtgtatggt tcccagttta tggagggctc 960

aaacccaatt cacctagtga caccgcacaa gaagggaaat atgtaatata caagcgctat 1020

aatgacacat gccccgatga acaagattac caaatccgga tggctaaatc ttcatataag 1080

ccccagcgat ttggtgggaa gcgcgtacag caagccatct tatctattga ggtgtcaaca 1140

tctttgggta aggatccggt gctgactatt ccacctaata caattacact catgggggcc 1200

gaaggcagaa ttctcacggt agggacatct cacttcctgt atcaacgagg atcttcatat 1260

ttctcccccg ctttattata ccccatgatt gtgcataaca aaacggctac tctccataat 1320

ccttatacat ttaatgcctt cactcggccg ggtagcgtcc cttgccaggc atcagcaaga 1380

tgccccaact catgcatcac cggggtttat actgatccat acccattaat cttccatagg 1440

aatcatactt tacgaggggt cttcgggacg atgcttgatg atggacaagc aagacttaat 1500

cccacatctg cagtatttga caacatatcc cgcagtcgtg taactcgggt gagttcaagc 1560

agcaccaagg cagcatacac aacatcaaca tgttttaaag ttgtcaagac caataaaact 1620

tattgtctta gtattgcaga aatatccaac accctattcg gggaatttag gattgttccc 1680

ttactgattg agatcctcaa ggatgataga gtctga 1716

<210> 7

<211> 1734

<212> DNA

<213> 新城疫病毒(Newcastle disease virus)

<400> 7

atggaccgtg tggtcaatag ggtcgtgctg gagaatgaga gaagagaagc aaagaataca 60

tggcgcttgg tcttccgtat cacagtctta cttttattgg caatgactct agccatctct 120

gcagccgccc tggcgcatag catgagggcc tgtacgctgc gtgacctcgc aggcatatcg 180

acagggatct ccaagacaga agatagaatt acgtctttac tcagtttaag tcaagatgtg 240

atagatagga tatataagca ggtggctctt gaatctccgc tggcgttact aaatactgaa 300

tctataatta tgaatgcaat aacctctctt tcctatcaaa tcaacggagc tgcgaatagt 360

agcggatgtg gggcgcctgt tcatgaccca gattatatcg gggggatagg caaagaactc 420

atagtagacg atactagtga cgtcacttcg ttttatcctt ctgcgtatca agaacacttg 480

aatttcattc cagcacccac gacaggatcc ggttgcactc ggataccctc atttgacatg 540

agcaccactc attattgtta tactcacaat gtgatatttt ctggttgcag agaccactca 600

cactcacacc aatacctagc acttggcgtg ctccggacat ctgcaacagg gaggatattc 660

ttctctactc tgcgttccat caatttagat gacacccaaa atcggaagtc ctgcagtgtg 720

agtgcaactc ctttaggttg tgatatgcta tgctctaaag tcacagagac tgaggaagaa 780

gattacaggt cagttacccc cacatcaatg gtgcacggaa ggctagggtt tgatggtcaa 840

taccatgaga aggacttaga taccacagtc ttatttaaag attgggtggc aaattaccct 900

ggggtgggag gtgggtcttt tattaacgac cgtgtatggt tcccagttta tggagggctc 960

aaacccaatt cacctagtga caccgcacaa gaagggaaat atgtaatata caagcgctat 1020

aatgacacat gccccgatga acaagattac caaatccgga tggctaaatc ttcatataag 1080

ccccagcgat ttggtgggaa gcgcgtacag caagccatct tatctattga ggtgtcaaca 1140

tctttgggta aggatccggt gctgactatt ccacctaata caattacact catgggggcc 1200

gaaggcagaa ttctcacggt agggacatct cacttcctgt atcaacgagg atcttcatat 1260

ttctcccccg ctttattata ccccatgatt gtgcataaca aaacggctac tctccataat 1320

ccttatacat ttaatgcctt cactcggccg ggtagcgtcc cttgccaggc atcagcaaga 1380

tgccccaact catgcatcac cggggtttat actgatccat acccattaat cttccatagg 1440

aatcatactt tacgaggggt cttcgggacg atgcttgatg atggacaagc aagacttaat 1500

cccacatctg cagtatttga caacatatcc cgcagtcgtg taactcgggt gagttcaagc 1560

agcaccaagg cagcatacac aacatcaaca tgttttaaag ttgtcaagac caataaaact 1620

tattgtctta gtattgcaga aatatccaac accctattcg gggaatttag gattgttccc 1680

ttactgattg agatcctcaa ggatgataga gtcagagaag ccaggtctgg ctag 1734

Claims

1.一种用于构建基因VII型新城疫病毒重组疫苗株的基因片段，其特征在于，所述的基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

2.权利要求1所述的用于构建基因VII型新城疫病毒重组疫苗株的基因片段在构建基因VII型新城疫病毒重组疫苗株中的应用。

3.一种基因VII型新城疫病毒重组疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是使用权利要求1所述的用于构建基因VII型新城疫病毒重组疫苗株的基因片段，与辅助质粒共转染细胞后遗传拯救的。

4.如权利要求3所述的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株，其特征在于，所述的细胞为BSR-T7/5细胞。

5.权利要求3或4所述的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株在制备疫苗中的应用。

6.一种灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗，其中抗原包含有灭活的如权利要求3或4所述的基因VII型新城疫病毒重组疫苗株。