KR101462985B1 - Recombinant antigenic protein of hemagglutinin-neuraminidase of avian paramyxovirus-3 and composition for diagnosis using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제3형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-3, APMV-3)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 재조합 곤충 세포, 상기 재조합 곤충세포가 발현하는 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 재조합 항원 단백질을 포함하는 제3형 조류파라믹소바이러스 진단용 조성물, 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 진단용 조성물은 살아있는 바이러스 취급에 따른 오염 가능성 없이 안전하고, 신속하게 대량의 샘플로부터 제3형 조류파라믹소바이러스의 감염 여부를 정확하게 진단할 수 있는 우수한 효과를 가지고 있다.   The present invention relates to a recombinant virus expression vector comprising a gene encoding a hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein of avian paramyxovirus-3 (APMV-3) A recombinant insect cell expressing the hemagglutinin-neuraminidase protein of the third type avian paramyxovirus transformed with said vector, a hemagglutinin of the type 3 avian paramyxovirus expressing said recombinant insect cell, To a diagnostic kit for diagnosis of type 3 avian paramyxovirus comprising nin-laminaminase recombinant antigen protein, a diagnostic kit and a diagnostic method using the same. The diagnostic composition according to the present invention has an excellent effect of accurately and accurately diagnosing the infection of the third type avian paramyxovirus from a large amount of samples safely and rapidly without the possibility of contamination due to the handling of living viruses.

Description

제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제의 재조합 항원 단백질 및 이용한 진단용 조성물 {Recombinant antigenic protein of hemagglutinin-neuraminidase of avian paramyxovirus-3 and composition for diagnosis using the same}Recombinant antigenic proteins of hemagglutinin-neuraminidase and avian paramyxovirus-3 and composition for diagnosis using the same are provided. The recombinant antigenic proteins of hemagglutinin-

본 발명은 제3형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-3, APMV-3)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 재조합 곤충 세포, 상기 재조합 곤충세포가 발현하는 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 재조합 항원 단백질을 포함하는 제3형 조류파라믹소바이러스 진단용 조성물, 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a recombinant virus expression vector comprising a gene encoding a hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein of avian paramyxovirus-3 (APMV-3) A recombinant insect cell expressing the hemagglutinin-neuraminidase protein of the third type avian paramyxovirus transformed with said vector, a hemagglutinin of the type 3 avian paramyxovirus expressing said recombinant insect cell, To a diagnostic kit for diagnosis of type 3 avian paramyxovirus comprising nin-laminaminase recombinant antigen protein, a diagnostic kit and a diagnostic method using the same.

조류파라믹소바이러스 (Avian paramyxovirus; APMV)는 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)과, 아뷸라바이러스(Avulavirus)속으로 분류되는 RNA바이러스이다. APMV는 APMV-1에서 APMV-11까지 현재까지 총 11개의 혈청형(serotype)이 존재하고 있는 것으로 밝혀져 있다. 이 중 APMV-1에 속하는 뉴캣슬병바이러스 (Newcastle disease virus; NDV)가 가금류에서 가장 중요한 병원체로 알려져 있으나 APMV-3, APMV-3, APMV-7 및 APMV-9 또한 각종 가금류에 감염하여 경제적 손실을 유발하는 것으로 알려져있으며, APMV-3은 1968년 미국 위스콘신주 칠면조에서 처음 분리 보고되었다. Avian paramyxovirus (APMV) is an RNA virus classified into Paramyxoviridae and Avulavirus genus. APMV has 11 serotypes from APMV-1 to APMV-11 to date. APMV-3, APMV-7 and APMV-9 also infect various poultry species and cause economic losses. APMV-1 is the most important pathogenic organism in poultry. Newcastle disease virus (NDV) APMV-3 was first reported in 1968 in Wisconsin, United States.

APMV 게놈은 음성 극성 단일 가닥 (negative-sense single-stranded) RNA 형태로 되어 있으며, 뉴클레오캡시드 단백질 (nucleocapsid protein, N), 인단백질 (phosphoprotien, P), 매트릭스 단백질 (matrix protein, M), 융합 단백질 (fusion protein, F), 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 및 폴리머라아제 단백질 (polymerase protein, L)을 발현하는 최소 6개 이상의 전사 해독틀 (open reading frames, ORF)을 가지고 있다. The APMV genome is in the form of negative-sense single-stranded RNA and contains nucleocapsid protein (N), phosphoprotien (P), matrix protein (M) At least six open reading frames, which express a fusion protein (F), hemagglutinin-neuraminidase (HN) and a polymerase protein (L) ORF).

APMV 구조단백질 중 N, P, L 단백질은 전사복합체 (transcription complex)를 형성하여 RNA 복제과정에 관여한다. 바이러스 외피막을 구성하는 주요 당단백질로는 F와 HN 당단백질 (glycoprotein)이 있다. 이들 당 단백질은 방어면역에 관여하는 중요한 바이러스 구조단백질이다. F 당단백질은 감염세포간의 융합을 유발하고 병원성과도 관련이 있는 것으로 알려져 있다. HN 당단백질은 감염성 바이러스가 세포 표면에 달라붙거나 세포 내에서 증식된 후대바이러스(progeny virus)가 세포막 외부로 유리하는 과정에 관여한다. 특히 HN 당단백질은 닭 적혈구를 응집시키거나 적혈구 응집 후 해리시키는 생물학적 기능을 가지고 있다. Among the APMV structural proteins, the N, P, and L proteins form transcription complexes that are involved in the RNA replication process. The major glycoproteins constituting the viral envelope membrane are F and HN glycoproteins. These glycoproteins are important viral structural proteins involved in defense immunity. F glycoprotein has been known to induce fusion between infected cells and to correlate with hospital performance. The HN glycoprotein is involved in the process of infecting the infectious virus to the cell surface or progeny virus propagation outside the cell membrane. In particular, HN glycoprotein has a biological function of aggregating chicken erythrocytes or dissociating after erythrocyte aggregation.

APMV-3의 진단은 닭 부화란(종란)을 이용하여 검체 시료로부터 바이러스를 분리한 다음 분리 바이러스를 동정(identification) 하거나, 검체 시료(혈청)로부터 APMV 특이 항체를 검출하여 이루어진다. 이를 위하여 APMV 진단 항원과 면역혈청은 필수적이며, 진단방법으로 닭 적혈구를 이용한 혈구응집 (hemagglutination; HA) 반응법, 또는 혈구응집억제 (hemagglutination inhibition; HI) 반응법을 이용한다. 그러나 현재 APMV-3 진단을 위하여 사용하고 있는 진단항원은 감염성 바이러스 입자를 닭 부화란에서 증식하여 제조하며, APMV-3 바이러스는 일부 연구기관에서 제한적으로만 보유하고 있기 때문에, APMV-3 진단에 많은 어려움이 있었다. The diagnosis of APMV-3 is made by isolating the virus from the specimen using chicken egg hatching (egg yolk) and then identifying the isolated virus or detecting the APMV specific antibody from the specimen (serum). For this purpose, APMV diagnostic antigen and immunized serum are essential, and hemagglutination (HA) reaction or hemagglutination inhibition (HI) reaction method using chicken erythrocytes is used as a diagnostic method. However, the diagnostic antigen currently used for the diagnosis of APMV-3 is produced by proliferating infectious viral particles in the chicken hatching column, and since the APMV-3 virus is limited only to a limited number of research institutes, There was difficulty.

이에, 본 발명자들은 신규한 제3형 조류파라믹소바이러스를 진단할 수 있는 조성물을 개발하고자 노력한 결과, 제3형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-3, APMV-3)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터를 제조하고, 상기 발현 벡터를 곤충 세포에 형질감염 시킨 후 생산된 재조합 항원 단백질이 닭 적혈구 응집능을 가지고 있어 제3형 조류파라믹소바이러스를 빠르고 정확하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have made efforts to develop a composition capable of diagnosing the novel type 3 avian paramyxovirus. As a result, the present inventors have found that the avian paramyxovirus-3 (APMV-3) hemagglutinin- A recombinant virus expression vector containing a gene encoding a hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein is prepared, and the recombinant antigen protein produced after transfecting the expression vector into insect cells has chicken erythrocyte aggregation ability The present inventors completed the present invention by confirming that the type 3 avian Paramyxovirus can be diagnosed quickly and accurately.

본 발명의 목적은 제3형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-3, APMV-3)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터를 제공하는 것이다. An object of the present invention is to provide a recombinant virus expression vector comprising a gene encoding a hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein of avian paramyxovirus-3 (APMV-3) Vector.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 바이러스 발현 벡터에 의해 형질전환된 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 재조합 곤충 세포를 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a recombinant insect cell expressing the hemagglutinin-neuraminidase protein of the type 3 avian paramyxovirus transformed with the recombinant virus expression vector.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 곤충세포가 발현하는 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 항원 단백질을 포함하는 제3형 조류파라믹소바이러스 진단용 조성물, 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a composition for diagnosing type III avian paramyxovirus comprising a hemagglutinin-neuraminidase antigen protein of a type III avian paramyxovirus expressing the recombinant insect cell, a diagnostic kit, And to provide a diagnostic method using the same.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 제3형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-3, APMV-3)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터를 제공한다. In order to solve the above problems, the present invention provides a gene encoding a hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein of avian paramyxovirus-3 (APMV-3) Lt; RTI ID = 0.0 > expression vector. ≪ / RTI >

또한, 본 발명은 상기 재조합 바이러스 발현 벡터에 의해 형질전환된 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 재조합 곤충 세포를 제공한다. The present invention also provides a recombinant insect cell expressing a hemagglutinin-neuraminidase protein of a type III avian paroxysmal virus transformed by the recombinant virus expression vector.

또한, 본 발명은 상기 재조합 곤충세포가 발현하는 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 항원 단백질을 포함하는 제3형 조류파라믹소바이러스 진단용 조성물, 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법을 제공한다.
The present invention also relates to a composition for diagnosing type 3 avian paramyxovirus comprising a hemagglutinin-neuraminidase antigen protein of a type 3 avian paramyxovirus expressing the recombinant insect cell, a diagnostic kit, and a diagnosis using the composition ≪ / RTI >

본 발명에 따른 진단용 조성물은 살아있는 바이러스 취급에 따른 오염 가능성 없이 안전하고, 신속하게 대량의 샘플로부터 제3형 조류파라믹소바이러스의 감염 여부를 정확하게 진단할 수 있는 우수한 효과를 가지고 있다.
The diagnostic composition according to the present invention has an excellent effect of accurately and accurately diagnosing the infection of the third type avian paramyxovirus from a large amount of samples safely and rapidly without the possibility of contamination due to handling of live viruses.

도 1은 재조합 pGEM-T 벡터 내 삽입된 APMV-3 HN 유전자 절편을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 재조합 pFastBacTM 전이벡터 내 삽입된 APMV-3 HN 유전자 절편을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 APMV-3 HN 유전자를 포함하는 재조합 bacmid를 PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 재조합 베큘로바이러스 내 APMV-3 HN 유전자 삽입을 PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 재조합 베큘로바이러스 감염 곤충세포에서 적혈구 흡착을 나타낸 도이다.
도 6은 재조합 APMV-3 HN 발현 단백질을 전자 현미경을 통해 관찰한 도이다.
도 7은 APMV-3 HN 단백질 항원과 APMV-3 바이러스 항원을 이용한 야외 농장 시료 HI 항체 검사 결과를 나타낸 도이다. FIG. 1 shows the results of identifying the inserted APMV-3 HN gene fragment in the recombinant pGEM-T vector.
2 is a diagram showing a result of confirming the APMV-3 HN gene fragment The recombinant pFastBac TM transfer vector insertion.
FIG. 3 is a diagram showing the result of confirming recombinant bacmid containing APMV-3 HN gene by PCR.
FIG. 4 is a graph showing the results of PCR for inserting the APMV-3 HN gene in the recombinant baculovirus.
5 is a graph showing erythrocyte adsorption in recombinant baculovirus-infected insect cells.
6 is an electron microscopic observation of the recombinant APMV-3 HN expressed protein.
FIG. 7 shows results of HI antibody test on an outdoor farm sample using APMV-3 HN protein antigen and APMV-3 virus antigen.

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 제3형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-3, APMV-3)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터를 제공한다. The present invention relates to a recombinant virus expression vector comprising a gene coding for hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein of avian paramyxovirus-3 (APMV-3) to provide.

상기 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것 또는 이와 기능적으로 동등한 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다. The gene coding for the hemagglutinin-neuraminidase protein of the type III avian paramyxovirus is characterized by having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence having functionally equivalent thereto.

상기 “기능적으로 동등한”이란 염기의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열에 의해 코딩된 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 코딩할 수 있는 염기서열을 의미한다. 예를 들어, 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다.As used herein, the term " functionally equivalent " means that at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 70% Means a nucleotide sequence capable of encoding a protein having substantially the same physiological activity as a protein encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a sequence homology of 95% or more. For example, a nucleic acid molecule encoding a hemagglutinin-neuraminidase protein of type 3 avian paramyxovirus, although some base sequences have been modified by deletion, substitution or insertion, And variants that can function in the same way as the other.

본 발명에 따른 재조합 바이러스 발현 벡터의 수득 과정은 하기와 같다. The process for obtaining the recombinant virus expression vector according to the present invention is as follows.

먼저, 제3형 조류파라믹소바이러스로부터 게놈 DNA를 분리하거나, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 게놈 DNA를 합성한다. 상기 게놈 DNA로부터 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 유전자 부분을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분리하고, 유전자를 대량으로 생산할 수 있도록 클로닝 벡터 (예를 들어, pGEM-T 벡터, pCR-2.1-TOPO 벡터 등)에 삽입한다. 상기 재조합 벡터 내의 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 유전자 부분을 다시 분리하여, 베큘로바이러스 폴리헤드린프로모터 (PPH)를 가진 발현 벡터 (예를 들어, pFastBacTM1 벡터 등)에 삽입하여 최종적으로 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터를 제조한다.
First, genomic DNA is isolated from type 3 avian paramyxovirus, or genomic DNA is synthesized using methods known in the art. From the genomic DNA, the gene portion coding for the hemagglutinin-neuraminidase protein of the third type avian paramyxovirus is isolated using a method known in the art, and a cloning vector For example, pGEM-T vector, pCR-2.1-TOPO vector, etc.). The gene portion encoding the hemagglutinin-neuraminidase protein of the type-III aldicarum paramyxovirus in the recombinant vector is separated again, and an expression vector having a beculovirus polyhedrin promoter (P PH ) , pFastBac TM 1 vector, etc.) to prepare a recombinant virus expression vector containing a gene encoding a hemagglutinin-neuraminidase protein of a type-III algae paramyxovirus.

또한, 본 발명은 상기 재조합 바이러스 발현 벡터에 의해 형질전환된 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 재조합 곤충 세포를 제공한다. The present invention also provides a recombinant insect cell expressing a hemagglutinin-neuraminidase protein of a type III avian paroxysmal virus transformed by the recombinant virus expression vector.

상기 곤충 세포는 담배거세미나방종의 도둑나방 (Spodoptera frugiperda)에서 유래한 Sf9 세포일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
The insect cells may be, but are not limited to, Sf9 cells derived from Tobacco rubrum or Spiroglyceridae (Spodoptera frugiperda).

본 발명에 따른 제3형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-3, APMV-3)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터에 의해 형질전환된 재조합 곤충세포는, 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 발현할 수 있다. 상기 시스템을 이용할 경우, 세포 배양이 가능한 일반 실험실에서 손쉽게 대량의 단백질을 제조할 수 있으며, 수득된 제3형 조류파라믹소바이러스 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질은 닭 적혈구에 대한 혈구 응집능과 같은 HN 단백질 고유의 생물학적 기능을 가지고 있으며, 감염성을 지니고 있는 살아있는 바이러스 취급에 따른 오염 가능성 없이 안전하고, 종래 고가의 무균닭 부화란을 사용하는 항원 제조 과정에 비하여 매우 신속하고 정확하게 대량생산이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 항원 단백질은 제3형 조류파라믹소바이러스를 진단하는데 유용하게 이용될 수 있다.
A recombinant virus expression vector comprising a gene encoding a hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein of avian paramyxovirus-3 (APMV-3) according to the present invention , Can express the hemagglutinin-neuraminidase protein of type 3 avian paroxysmal virus. When the above system is used, it is possible to easily produce a large amount of protein in a general laboratory capable of cell culture, and the obtained type 3 avian paramyxovirus hemagglutinin-neuraminidase protein has a hemagglutination ability against chicken erythrocytes , And it is safe without contamination due to the handling of live viruses with infectivity and can be mass produced very quickly and accurately compared with the conventional production process of antigen using sterile chicken broth. Do. Therefore, the hemagglutinin-neuraminidase antigen protein of the type 3 avian paramyxovirus according to the present invention can be usefully used for diagnosing type 3 avian paramyxovirus.

또한, 본 발명은 상기 재조합 곤충세포가 발현하는 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 항원 단백질을 포함하는 제3형 조류파라믹소바이러스 진단용 조성물 및 진단 키트를 제공한다. The present invention also provides a composition for diagnosing type 3 avian paroxysmnia virus and a diagnostic kit comprising the hemagglutinin-neuraminidase antigen protein of the type 3 avian paramyxovirus expressing the recombinant insect cells.

본 발명에서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 제3형 조류파라믹소바이러스의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 확인하는 것이다. In the present invention, "diagnosis" means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to confirm the incidence or likelihood of developing type 3 avian paramyxovirus.

상기 진단 키트는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 진단 키트는 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 항원 단백질뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
The diagnostic kit may be prepared using a method commonly used in the art. These diagnostic kits include the hemagglutinin-neuraminidase antigen protein of the type-III avian paramyxovirus, as well as tools, reagents and the like commonly used in the art used for immunological analysis. Such tools / reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling agents capable of producing a detectable signal, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like. When the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator. Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers, e. G., Physiologically acceptable buffers such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, Polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, polymer such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose and combinations thereof.

또한 본 발명은 상기 재조합 동물 세포가 발현하는 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 항원으로 이용하여, 시료 내에서 항원-항체 반응을 통해 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 검출하는 것을 특징으로 하는, 제3형 조류파라믹소바이러스의 진단 방법을 제공한다. The present invention also relates to a method for producing a recombinant animal parasite including the use of a hemagglutinin-neuraminidase protein of a type III avian paramyxovirus expressed by the recombinant animal cell as an antigen, The present invention provides a method of diagnosing type 3 avian paramyxovirus characterized by detecting the hemagglutinin-neuraminidase protein of the virus.

상기 항원-항체 반응은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 모두 이용할 수 있으며, 예를 들어 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용할 수 있다. The antigen-antibody reaction can be performed by any of the methods commonly used in the art, for example, tissue immunostaining, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), Western blotting, immunoprecipitation One or more methods selected from the group consisting of immunoprecipitation assays, immunodiffusion assays, complement fixation assays, fluorescence-activated cell sorters (FACS) and protein chip assays .

상기 시료는 제3형 조류파라믹소바이러스로 감염된 것으로 예상되거나 감염된 세포, 혈액, 소변, 타액, 조직 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
The sample includes, but is not limited to, cells, blood, urine, saliva, tissues, etc. that are expected or infected with the type III avian paramyxovirus.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. It will be apparent to those skilled in the art that the embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention.

실시예Example 1.  One. APMVAPMV -3 -3 HNHN 전체 유전자의 인공합성 Artificial synthesis of whole genes

APMV-3 HN (제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제) 전체 유전자의 DNA 절편을 인공합성하기 위하여, 국제유전자은행(accession no. EU403085.1)에 공지된 APMV-3/PKT/Netherland/449/75 균주의 HN 유전자 염기서열 정보를 사용하였다. 본 실험의 DNA 절편 합성에 사용된 HN 유전자 염기서열은 총 1,734개의 핵산으로 구성되어 있다. 클로닝의 효율성을 위하여 인공합성 DNA 절편의 5`말단에는 EcoRI, 3`말단에는 XhoI제한효소 인식부위를 추가하였다. 서열번호 1 및 제한 효소 인식 부위를 포함하는 염기서열을 (주)바이오니아에 제공하여 HT-oligoTM 384 합성기로 사용하여 유전자 인공 합성을 수행하였다.
APMV-3 HN (hemagglutinin-neuraminidase of type 3 avian paramyxovirus) In order to synthesize the DNA fragment of the entire gene, APMV-3 HN 3 / PKT / Netherland / 449/75 strains were used. The HN gene sequence used in the DNA fragment synthesis of this experiment is composed of 1,734 nucleotides in total. For cloning efficiency, EcoRI was added to the 5 'end of the artificial synthetic DNA fragment and XhoI restriction enzyme recognition site was added to the 3' end. A nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 1 and a restriction enzyme recognition site was provided to Bioneer Co., Ltd. and used as an HT-oligo (TM) 384 synthesizer to carry out gene synthesis.

실시예Example 2.  2. APMVAPMV -3 -3 HNHN 유전자의 벡터  Vector of gene 클로닝Cloning

상기 실시예 1에서 합성한 APMV-3 HN 유전자 DNA 절편을 중합효소연쇄반응법(PCR)을 통해 증폭하였다. 이를 위한 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었다. PCR 반응은 98℃ 10초, 55℃ 1분, 72℃에서 1분 30초를 1 사이클로 하여 PCR 증폭기 (PE 9600;Perkin Elmer)에서 35사이클 반복하여 PCR 증폭을 실시하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 DNA합성을 실시하였다.
The DNA fragment of APMV-3 HN gene synthesized in Example 1 was amplified by polymerase chain reaction (PCR). Primer sequences for this are shown in Table 1 below. The PCR reaction was carried out by repeating 35 cycles in a PCR amplifier (PE 9600; Perkin Elmer) with a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute and 30 seconds, Minute DNA synthesis was carried out.

정방향 프라이머Forward primer 5’-GAA TTC ATG GAA TCC CCT CCT-3’5'-GAA TTC ATG GAA TCC CCT CCT-3 ' 역방향 프라이머Reverse primer 5’-CTC GAG TTA CCG GCT TGT CAC-3’5'-CTC GAG TTA CCG GCT TGT CAC-3 '

PCR을 통해 증폭된 DNA 절편은 아가로오스 겔 (agarose gel)에서 전기영동을 실시하여 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. The DNA fragment amplified by PCR was confirmed by electrophoresis on an agarose gel. The results are shown in Fig.

도 1에 나타낸 바와 같이, 약 1.75kb의 크기에 해당하는 유전자 증폭 산물을 겔로부터 추출하여 pGEM-T 벡터에 삽입하였다. 삽입된 APMV-3 HN 유전자 절편은 자동염기서열분석기(ABI 377, USA)를 사용하여 공개되어 있는 염기서열과 비교 분석함으로써 HN 유전자 DNA의 올바른 삽입 여부를 확인하였다.
As shown in Fig. 1, a gene amplification product corresponding to a size of about 1.75 kb was extracted from the gel and inserted into a pGEM-T vector. The insertion of the APMV-3 HN gene fragment was confirmed by correcting the DNA insert of the HN gene by comparing with the published nucleotide sequence using an automatic sequencer (ABI 377, USA).

실시예Example 3.  3. APMVAPMV -3 -3 HNHN 유전자 전이벡터의 제작 Production of gene transfer vector

APMV-3 HN 유전자 전이벡터를 제작하기 위하여, 상기 실시예 2의 pGEM-T 재조합 벡터를 EcoRI 및 XhoI 제한효소로 처리하여 APMV-3 HN 유전자 절편을 추출한 다음, T4 리가아제(Promega)를 이용하여 같은 제한 효소로 처리한 pFastBacTM 전이벡터(transfer vector)에 삽입하였다. 상기 재조합 전이벡터를 TOP10 competent cell (Invitogen)에 형질전환 시킨 후, 생성된 흰색 콜로니를 선택하여 LB배지에서 배양하였다. 그 후 증식시킨 대장균을 수거하여 재조합 pFastBacTM 전이벡터 플라스미드를 추출하였다. 최종적으로 수득한 재조합 전이벡터를 SphI 및 KpnI 제한효소로 처리하여 APMV-3 HN 유전자 삽입 여부를 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. In order to prepare the APMV-3 HN gene transfer vector, the pMEM-T recombinant vector of Example 2 was treated with EcoRI and XhoI restriction enzymes to extract the APMV-3 HN gene fragment, and then, using T4 ligase (Promega) pFastBac TM transition treated with the same restriction enzymes was inserted into a vector (transfer vector). The recombinant transfer vector was transformed into TOP10 competent cells (Invitogen), and the resulting white colonies were selected and cultured in LB medium. Then, to extract the collected E. coli proliferation was the recombinant transfer vector, pFastBac TM plasmids. The finally obtained recombinant transfer vector was treated with SphI and Kpn I restriction enzymes to confirm the insertion of the APMV-3 HN gene by electrophoresis. The results are shown in Fig.

도 2에 나타낸 바와 같이, 재조합 전이벡터에 APMV-3 유전자가 정상적으로 삽입되어 있는 것을 확인하였다.
As shown in Fig. 2, it was confirmed that the APMV-3 gene was normally inserted into the recombination transfer vector.

실시예Example 4.  4. APMVAPMV -3 -3 HNHN 유전자를 포함하는 재조합  Recombination involving genes 베큘로바이러스의Baculovirus 셔틀벡터 제작 Shuttle vector production

상기 실시예 3의 APMV-3 HN 유전자 절편이 삽입된 재조합 pFastBacTM 전이벡터를 DH10BacTM competent cell (invitrogen)에 형질전환시켜, 베큘로바이러스 셔틀벡터 bacmid에 폴리헤드린 프로모터 및 HN 유전자 절편을 포함하는 부위를 전위(transposition)시켰다. 이를 X-gal이 처리된 LB 아가 배지에서 2~3일 배양한 후 흰색 콜로니를 선택하여 LB 배지에서 배양한 다음, 재조합 Bacmid를 추출하였다. 상기 실시예 1의 프라이머를 이용하여, PCR을 통해 APMV-3 HN 유전자가 전위된 재조합 Bacmid를 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
By transforming the above Example 3 APMV-3 HN gene fragment The recombinant pFastBac TM transition insert of the vector in DH10Bac TM competent cell (invitrogen), region containing the polyhedrin promoter and HN gene segments to virus shuttle vector bacmid with bekyul Was transposed. After culturing in LB agar medium treated with X-gal for 2-3 days, white colonies were selected and cultured in LB medium, and then recombinant Bacmid was extracted. Using the primer of Example 1, a recombinant Bacmid transcribed with the APMV-3 HN gene was confirmed by PCR. The results are shown in Fig.

실시예Example 5.  5. APMVAPMV -3 -3 HNHN 유전자를 발현하는 재조합  Recombination expressing the gene 베큘로바이러스의Baculovirus 제작 making

상기 실시예 4의 APMV-3 HN 유전자를 함유하는 재조합 Bacmid와 베큘로바이러스(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus; AcMNPV) DNA를 이용하여 Sf9(Spodoptera frugiperda) 세포에 트랜스팩션(transfection)시켰다. 상기 Sf9 세포를 28℃에서 5일 동안 배양한 다음, 세포와 배양액을 수거하여 70% 단층을 형성한 Sf9세포에 다시 접종하여 28℃에서 5일 배양하는 방법으로 3대 계대 배양하였다. 재조합 베큘로바이러스는 플라크 시험법(Plaque Assay)을 실시하여 APMV-3 HN 단백질을 발현하는 재조합 베큘로바이러스를 순수 분리하였으며, 상기 실시예 1의 프라이머를 이용하여 APMV-3 유전자의 삽입 여부를 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. Recombinant Bacmid containing the APMV-3 HN gene of Example 4 and Baculovirus ( Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus; AcMNPV) DNA using Sf9 ( Spodoptera frugiperda cells. < / RTI > The Sf9 cells were cultured at 28 DEG C for 5 days, and the cells and the culture medium were collected and re-seeded into Sf9 cells having a 70% monolayer, and cultured at 28 DEG C for 5 days. Recombinant baculovirus was subjected to a plaque assay to purify recombinant baculovirus expressing the APMV-3 HN protein. The primer of Example 1 was used to confirm whether or not the APMV-3 gene was inserted Respectively. The results are shown in Fig.

도 4에 나타낸 바와 같이, 재조합 베큘로바이러스에 APMV-3 HN 유전자가 정상적으로 삽입된 것을 확인하였으며, 상기 APMV-3 HN 단백질을 발현하는 재조합 베큘로바이러스를 rBac/APMV-3HN라고 명명하였다. As shown in FIG. 4, it was confirmed that the APMV-3 HN gene was inserted into the recombinant baculovirus, and the recombinant baculovirus expressing the APMV-3 HN protein was named rBac / APMV-3HN.

또한, 재조합 베큘로바이러스 감염 곤충 세포가 적혈구를 흡착시키는 것을 확인하였으며, 이를 도 5에 나타내었다.
In addition, it was confirmed that the recombinant baculovirus-infected insect cells adsorbed red blood cells, which is shown in Fig.

실시예Example 6. 재조합  6. Recombination APMVAPMV -3 -3 HNHN 단백질의 생산 Production of protein

상기 실시예 5의 재조합 베큘로바이러스(rAPMV-3 HN)를 감염시킨 Sf9 곤충세포에서 재조합 APMV-3 HN (rAPMV-3HN) 단백질을 생산 추출한 다음, 진단 항원으로 이용하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다. The recombinant APMV-3 HN (rAPMV-3HN) protein was produced and extracted from the Sf9 insect cells infected with the recombinant beculovirus (rAPMV-3 HN) of Example 5, and then the following experiment was conducted to use it as a diagnostic antigen Respectively.

먼저, 조직배양 플라스크 내 배양된 Sf9 곤충세포에 0.1 MOI 농도의 재조합 베큘로바이러스 (rBac/APMV-3HN)를 감염시킨 후, 27℃에서 4일간 배양하였다. 그 후, 세포변성효과가 관찰되면 감염 곤충세포를 수확하여 50 ml 원심튜브에 첨가하였다. 그 후 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 침전시키고 배양 배지의 1/100 농도의 PBS를 첨가하여 회수한 다음 초음파기로 200V에서 2분간 분쇄하였다. 분쇄 후 8,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 세포추출액으로 회수하여 진단 항원으로 사용하였다. 생산된 진단 항원은 25 ul당 212의 고농도의 HA 단백질이 함유되어 있었으며, 이때 제조한 항원은 0.5ml씩 분병하여 실험에 사용하기 전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다.
First, Sf9 insect cells cultured in a tissue culture flask were infected with recombinant beculovirus (rBac / APMV-3HN) at a concentration of 0.1 MOI, and then cultured at 27 ° C for 4 days. Then, when the cytopathic effect was observed, the infected insect cells were harvested and added to a 50 ml centrifuge tube. The cells were then centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to precipitate the cells. The cells were recovered by adding PBS at a concentration of 1/100 of the culture medium and then pulverized at 200 V for 2 minutes using an ultrasonic machine. After pulverization, the supernatant was centrifuged at 8,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was recovered as a cell extract and used as a diagnostic antigen. The produced diagnostic antigen contained 2 12 high HA proteins per 25 μl. The prepared antigen was dispensed in 0.5 ml and stored in a -70 ° C freezer until used in the experiment.

실시예Example 7. 재조합  7. Recombination APMVAPMV -3 -3 HNHN 단백질에 대한 면역혈청의 제조 Preparation of Immune Serum for Protein

재조합 APMV-3 HN 단백질 (rAPMV-3HN) 항원을 이용하여, APMV-3 면역혈청을 제조하였다. 우선 rAPMV-3HN 단백질 항원을 212 HAU로 조정하여 ISA70(SEPPIC, France)과 3:7 비율로 혼합하여 백신을 제조하였다. 그 후 제조한 백신을 4주령 SPF 닭 9수에 3주 간격으로 마리당 0.5ml씩 2회 근육으로 접종한 뒤, 2차 접종 3주 후에 전 채혈하여 혈청을 분리하여 면역혈청을 생산하였다. 제조한 면역혈청은 rAPMV-3HN 단백질 항원을 사용하여 HI반응법으로 항체를 정량하였으며, 27이상의 HI 역가를 보이는 혈청을 선발하여 면역혈청으로 사용하였다. rAPMV-3HN 단백질 항원으로 면역한 닭의 개체별 HI 항체 역가를 측정한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
The recombinant APMV-3 HN protein (rAPMV-3HN) antigen was used to prepare APMV-3 immunized sera. First, rAPMV-3HN protein antigen was adjusted to 2 12 HAU and mixed with ISA70 (SEPPIC, France) at a ratio of 3: 7 to prepare a vaccine. After that, the vaccine was inoculated into 9 - week - old SPF chickens three times at 3 - week intervals with 0.5 ml per each muscle. Three weeks after the second inoculation, whole blood was collected and serum was separated to produce immunized serum. Antibodies were quantitated by the HI method using rAPMV-3HN protein antigen and sera with HI titer of 2 7 or more were selected and used as immunity sera. The results of measurement of the individual HI antibody titer of chicken immunized with rAPMV-3HN protein antigen are shown in Table 2 below.

개체별 HI 항체 역가(log2)HI antibody titer by individual (log2) 1One 22 33 44 55 66 77 88 99 77 88 77 88 88 88 77 88 44

* 검사항원은 모두 4 HA unit 항원을 사용하였음
 * All 4 HA unit antigens were used as test antigens

실시예Example 8.  8. rAPMVrAPMV -3-3 HNHN 단백질 항원의 특성 조사 Characterization of protein antigen

1) rAPMV-3HN 단백질의 열에 대한 안정성1) Thermal stability of rAPMV-3HN protein

재조합 베큘로바이러스 감염 곤충세포에서 발현된 HN 단백질의 열에 대한 안정성을 조사하였다. 발현된 단백질을 각각 56℃에서 5분, 10분, 20분 및 30분 처리한 후 혈구 응집능을 처리 전과 비교하여 30분 후에도 혈구응집능이 유지되면 열 안정성(heat stable), 그렇지 않을 경우 열 불안정성(heat labile)으로 분류하였다. 뉴캣슬병바이러스(APMV-1) 라소타 균주를 대조바이러스로 두었다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
The heat stability of HN protein expressed in recombinant baculovirus-infected insect cells was examined. After the expressed proteins were treated at 56 ° C for 5 minutes, 10 minutes, 20 minutes, and 30 minutes, the hemagglutinating ability was compared with that before the treatment, and if the hemagglutinating ability remained after 30 minutes, the heat stable, (heat labile). The Newcastle Disease Virus (APMV-1) lasota strain was used as a control virus. The results are shown in Table 3 below.

항원antigen 56℃ 열처리 시간대별 HA 역가56 ℃ Heat treatment time 결과result 0분0 minutes 5분5 minutes 10분10 minutes 20분20 minutes 30분30 minutes rAPMV-3HNrAPMV-3HN 128128 1616 88 22 00 불안정성instability APMV-1
(LaSota)APMV-1
(LaSota) 512512 00 00 00 00 불안정성instability

표 3에 나타낸 바와 같이, rAPMV-3HN 단백질 항원은 열 민감성을 가진 것을 확인되었다.
As shown in Table 3, it was confirmed that the rAPMV-3HN protein antigen has heat sensitivity.

2) rAPMV-3HN 단백질의 적혈구 해리 양상2) Red blood cell dissociation pattern of rAPMV-3HN protein

재조합 베큘로바이러스 감염 곤충세포에서 발현된 HN 단백질의 적혈구응집 해리 양상을 조사하였다. 혈구응집 해리 양상은 혈구응집 반응 1시간 후의 HA 역가와 24시간 후의 HA역가를 비교하여 24시간 이후에 완전히 해리가 일어났을 경우 빠른 용출(rapid elution), 그렇지 않을 경우 느린 용출(slow elution)로 분류하였다. 뉴캣슬병 바이러스(APMV-1) 라소타 균주를 대조바이러스로 두었다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
The red cell aggregation dissociation pattern of HN protein expressed in recombinant baculovirus - infected insect cells was investigated. The hemagglutination dissociation pattern was classified as rapid elution when complete dissociation occurred after 24 hours and slow elution if it was not. Respectively. The Newcastle Disease Virus (APMV-1) lasota strain was used as a control virus. The results are shown in Table 4 below.

구분division HA역가HA station 판정Judgment 1시간 후After 1 hour 24시간 후After 24 hours rAPMV-3rAPMV-3 128128 128128 느린 용출Slow release NDV(LaSota)NDV (LaSota) 512512 256256 느린 용출Slow release

표 4에 나타낸 바와 같이, rAPMV-3HN 단백질 항원은 적혈구 해리 양상이 느린 것을 확인하였다.
As shown in Table 4, the rAPMV-3HN protein antigen was found to be slow in erythrocyte dissociation.

3) rAPMV-3HN 단백질의 전자현미경 관찰3) Electron microscopic observation of rAPMV-3HN protein

재조합 베큘로바이러스 감염 곤충세포에서 발현된 HN 단백질의 입자를 전자현미경으로 관찰하였다. 보다 구체적으로, 재조합 베큘로바이러스 감염 Sf9 세포를 3일 내지 5일 동안 배양한 다음, 세포를 수거하여 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 침전시키고 배양 배지의 1/100 농도의 PBS를 첨가하여 회수한 다음 초음파기로 200V에서 2분간 분쇄한 후 8,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 그 후 4% 포스포텅스텐산 (phosphotungstic acid)으로 음성 염색하여 전자현미경(LEO 912 AB OMEGA, Carl Zeiss)으로 120 kV로 50,000배 확대하여 관찰하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. Particles of HN protein expressed in recombinant baculovirus-infected insect cells were observed with an electron microscope. More specifically, the recombinant baculovirus-infected Sf9 cells were cultured for 3 to 5 days, and then the cells were harvested and centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to precipitate the cells. PBS at a concentration of 1/100 of the culture medium was added The supernatant was recovered by centrifugation at 8,000 rpm for 10 minutes. The cells were then stained negative with 4% phosphotungstic acid and observed with an electron microscope (LEO 912 AB OMEGA, Carl Zeiss) at a magnification of 50,000x at 120 kV. The results are shown in Fig.

도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 재조합 베큘로바이러스 감염 Sf9 세포에서는 직경이 약 50～150 nm 구형의 바이러스 유사 입자가 다수 관찰되었으며 이들 입자의 외피막에는 바늘모양의 돌출 구조를 가지고 있음을 확인하였다. 또한, APMV 유사 바이러스 입자 이외에도 폭이 약 60 nm, 길이가 약 375 nm인 직사각형 모양의 베큘로바이러스 입자도 관찰하였다.
As shown in FIG. 6, in the recombinant baculovirus-infected Sf9 cells of the present invention, many virus-like particles having a diameter of about 50 to 150 nm were observed, and it was confirmed that the outer coat of these particles had a needle- Respectively. In addition to the APMV-like viral particles, rectangular-shaped baculovirus particles having a width of about 60 nm and a length of about 375 nm were also observed.

실시예Example 9.  9. rAPMVrAPMV -3-3 HNHN 단백질 항원의  Protein antigen APMVAPMV -3 면역 혈청에 대한 특이성 조사-3 Investigation of specificity for immunity sera

미국 국립수의검사소(National Veterinary Service Laboratories; NVSL)로부터 구입한 APMV 혈청형별 표준면역혈청을 대조군으로 사용하여 실험을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
Experiments were performed using a standard immunized serum according to APMV serotype purchased from National Veterinary Service Laboratories (NVSL) as a control group. The results are shown in Table 5 below.

사용 항원* Used antigen * APMV 혈청형 면역혈청에 대한 HI 역가 (log2)HI titer (log 2) for APMV serotype immunity sera APMV-1APMV-1 APMV-2APMV-2 APMV-3APMV-3 APMV-4APMV-4 APMV-6APMV-6 APMV-3APMV-3 APMV-8APMV-8 APMV-3APMV-3 rAPMV-3HN rAPMV-3HN 55 33 77 33 22 33 00 33 APMV-3항원APMV-3 antigen 44 33 77 00 00 33 22 44

* 사용항원은 4 HA unit로 조정하여 HI 반응용 항원으로 사용하였음
* Used antigen was adjusted to 4 HA unit and used as antigen for HI reaction

표 5에 나타낸 바와 같이, rAPMV-3HN 단백질 항원은 종래의 APMV-3항원과 마찬가지로 APMV-3 면역혈청과 가장 높은 항체 역가를 보였으며, 기존의 APMV-3 표준항원 결과와 큰 차이를 보이지 않아, 본 발명의 rAPMV-3HN 항원단백질을 APMV-3 진단항원으로 사용할 수 있음을 확인하였다.
As shown in Table 5, the rAPMV-3HN protein antigen showed the highest antibody titer to APMV-3 immunity sera as in the case of the conventional APMV-3 antigen, and showed no significant difference from the conventional APMV-3 standard antigen result, It was confirmed that the rAPMV-3HN antigen protein of the present invention can be used as the APMV-3 diagnostic antigen.

실시예Example 10.  10. rAPMVrAPMV -3-3 HNHN 단백질 항원으로 제조한 면역혈청의 특이성 조사 Investigation of the specificity of immunological sera prepared with protein antigen

상기 rAPMV-3HN 단백질 항원을 닭에 면역시켜 생산한 면역혈청이 APMV-3 항원에 대한 특이성을 가지고 있는 지 조사하였다. 상기 실시예 7에서 생산한 면역혈청 9점의 HI역가를 종래의 APMV-3항원과 rAPMV-3HN 단백질 항원을 가지고 각각 측정하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
The rAPMV-3HN protein antigen was immunized with chicken to investigate whether the immunized sera produced in this experiment had specificity for the APMV-3 antigen. The HI titer of 9 immunoserum produced in Example 7 was measured with conventional APMV-3 antigen and rAPMV-3HN protein antigen. The results are shown in Table 6 below.

검사항원* Test antigen * 개체별 HI 항체 역가(log2)HI antibody titer by individual (log2) 1One 22 33 44 55 66 77 88 99 rAPMV-3HNrAPMV-3HN 66 66 66 66 77 77 66 66 66 APMV-3항원APMV-3 antigen 55 55 55 55 55 66 55 55 55

* 검사항원은 모두 4 HA unit 항원을 사용하였음
 * All 4 HA unit antigens were used as test antigens

표 6에 나타낸 바와 같이, 두 항원 간의 면역 혈청 별 HI 역가간 차이는 전반적으로 큰 차이가 없었으며, 이를 통해 본 발명의 rAPMV-3HN 단백질 항원으로 제조한 면역혈청을 APMV-3 진단에 이용할 수 있음을 확인하였다.
As shown in Table 6, there was no significant difference in the HI titer between the two immunized sera between the two antigens. As a result, immunity sera prepared with the rAPMV-3HN protein antigen of the present invention can be used for the diagnosis of APMV-3 Respectively.

또한 본 발명의 rAPMV-3HN 단백질 항원으로 제조한 면역혈청이 조류 유래 다른 병원체와 교차 반응이 나타나는 지를 조사하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
In addition, we investigated whether the immunological sera prepared with rAPMV-3HN protein antigen of the present invention cross-react with other pathogenic agents from algae. The results are shown in Table 7 below.

검사
질병inspection
disease 검사
방법inspection
Way 개체 별 항혈청의 검사결과Test results of antiserum by individual 1One 22 33 44 55 66 77 88 99 IBIB HIHI 00 00 00 00 00 00 00 00 00 EDSEDS HIHI 00 00 00 00 00 00 00 00 00 AIAI ELISAELISA 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice MGMG ELISAELISA 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice MSMS ELISAELISA 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice aMPVaMPV ELISAELISA 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice IBDIBD ELISAELISA 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice SPSP SPASPA 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice

표 7에 나타낸 바와 같이, 닭전염성기관지염(Infectious bronchitis; IB), 닭 산란저하증(egg drop syndrome; EDS), 조류인플루엔자 (avian influenza; AI), 마이코플라즈마 갈리나룸(Mycoplasma gallicepticum; MG), 마이코플라즈마 시노비애(Mycoplasma synoviae; MS), 조류메타뉴모바이러스(avian metapneumovirus; aPMV), 닭전염성F낭병(infectious bursal disease; IBD), 추백리(Salmonella Pullroum; 추백리) 등 8종의 다른 조류질병 병원체에 대하여 모두 음성반응을 보임을 확인하였다.
Infectious bronchitis (IB), egg drop syndrome (EDS), avian influenza (AI), Mycoplasma gallicepticum (MG), mycoplasma All eight other avian pathogens, including Mycoplasma synoviae (MS), avian metapneumovirus (aPMV), infectious bursal disease (IBD), and Salmonella pullroum Negative reaction was observed.

실시예Example 11.  11. rAPMVrAPMV -3-3 HNHN 단백질 항원의 야외적용 시험 Field application test of protein antigen

국내 5개 가금(닭) 농장유래 혈청 49점을 대상으로 rAPMV-3HN 단백질 항원으로 HI 항체검사를 실시하였다. 검사 결과는 종래의 APMV-3 바이러스항원(미국 NVSL 제공)으로 검사한 결과와 비교하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.   A total of 49 sera from 5 domestic poultry farms were tested for HI antibody as rAPMV-3HN protein antigen. The test results were compared with those of conventional APMV-3 viral antigens (US NVSL provided). The results are shown in Fig.

도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 rAPMV-3HN 단백질 항원은 기존의 APMV-3 바이러스 항원과 유사한 수준으로, 야외 적용시 APMV-3를 진단하는데 이용할 수 있음을 확인하였다.   As shown in Fig. 7, the rAPMV-3HN protein antigen of the present invention was found to be similar in level to the existing APMV-3 viral antigen and could be used to diagnose APMV-3 in outdoor application.

<110> REPUBLIC OF KOREA (Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries.Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency (QIA) ) <120> Recombinant antigenic protein of hemagglutinin-neuraminidase of avian paramyxovirus-3 and composition for diagnosis using the same <130> 40 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1734 <212> DNA <213> Avian paramyxovirus-3 <400> 1 atggaatccc ctccttctgg caaggatgcg ccagccttcc gcgagcctaa gcgaacttgc 60 agactctgtt acagggcgac gactctctcc cttaatctca ccatcgttgt attatcaatt 120 ataagcattt atgtatcaac tcaaactggg gcaaacaact cttgtgtcaa tcccacaatc 180 gtaactcctg attatttaac tggcagcacg acaggctcag ttgaagatct tgctgactta 240 gagagtcaac tccgggagat acgtagagac acagggatta atctcccagt tcagatcgat 300 aatacagaaa atctaatact gacaactctg gcgagtatca actcgaattt acgctttctg 360 caaaatgcaa caactgagag ccagacctgc ctatctcctg tcaatgaccc tcgctttgta 420 gctggcataa ataggatccc agcagggtcg atggcatata atgacttcag caacctcatt 480 gagcacgtaa atttcatacc gtcgccgaca acgttgtcag gctgcaccag gataccatca 540 ttttcactct ctaagacgca ctggtgttat acccacaatg ttatatcaaa cgggtgcctt 600 gaccatgctg caagttcaca atacatctca atagggatcg ttgataccgg cctaaataat 660 gagccctatt ttagaacaat gtcttcaaag tcactgaatg acggattaaa tagaaagagt 720 tgctctgtga ccgcagccgc taatgcatgt tggttactct gtagcgtagt aacagaatac 780 gaagctgcgg actatcgatc acgaactcct actgctatgg ttctggggcg attcgatttt 840 aatggtgaat acacagaaat agctgtcccc tcctcactat tcgatggccg gtttgcatct 900 aactatccag gtgtgggatc gggaactcaa gtcaatggaa cattatattt ccctttatat 960 ggaggggtcc ttaatgggtc agatatagaa acggcaaaca aggggaaatc cttcaggcct 1020 cagaatccta agaataggtg tccagactcg gaggcgatcc aaagctttag agcgcaagat 1080 agctattacc cgacgagatt tgggaaggtg ctgatccaac aggcaatcat tgcatgtagg 1140 atcagtaaca aaagttgtac tgatttctat ctcctgtact tcgacaacaa cagagtgatg 1200 atgggtgcag aggcacggct atattatctt aataaccaat tatatctata tcaacgctcg 1260 tcgagctggt ggccgcatcc tttgttctat agcatctcat taccgtcatg tcaagccctt 1320 gctgtctgtc aaattacaga ggcccatctg acactgactt acgccacgtc gaggccagga 1380 atgtctatct gtacaggagc atcaaggtgt ccaaataatt gcgtagacgg tgtatatact 1440 gatgtatggc cattgacaaa gaacgatgct caggacccca atctcttcta cactgtatac 1500 ttaaataatt caactcggcg gattagccca accataagtc tatacactta tgaccgcagg 1560 atcaaatcta agctggcagt gggtagtgat ataggagcag cttataccac gagtacctgt 1620 ttcggccgat cagatacagg ggcggtttat tgcttaacta taatggagac cgttaacaca 1680 atatttggtc agtaccggat cgtgccaata ttacttagag tgacaagccg gtaa 1734 <110> REPUBLIC OF KOREA (Management: Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries.Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency (QIA)) <120> Recombinant antigenic protein of hemagglutinin-neuraminidase of          avian paramyxovirus-3 and composition for diagnosis using the          same <130> 40 <160> 1 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 1734 <212> DNA <213> Avian paramyxovirus-3 <400> 1 atggaatccc ctccttctgg caaggatgcg ccagccttcc gcgagcctaa gcgaacttgc 60 agactctgtt acagggcgac gactctctcc cttaatctca ccatcgttgt attatcaatt 120 ataagcattt atgtatcaac tcaaactggg gcaaacaact cttgtgtcaa tcccacaatc 180 gtaactcctg attatttaac tggcagcacg acaggctcag ttgaagatct tgctgactta 240 gagagtcaac tccgggagat acgtagagac acagggatta atctcccagt tcagatcgat 300 aatacagaaa atctaatact gacaactctg gcgagtatca actcgaattt acgctttctg 360 caaaatgcaa caactgagag ccagacctgc ctatctcctg tcaatgaccc tcgctttgta 420 gctggcataa ataggatccc agcagggtcg atggcatata atgacttcag caacctcatt 480 gagcacgtaa atttcatacc gtcgccgaca acgttgtcag gctgcaccag gataccatca 540 ttttcactct ctaagacgca ctggtgttat acccacaatg ttatatcaaa cgggtgcctt 600 gaccatgctg caagttcaca atacatctca atagggatcg ttgataccgg cctaaataat 660 gagccctatt ttagaacaat gtcttcaaag tcactgaatg acggattaaa tagaaagagt 720 tgctctgtga ccgcagccgc taatgcatgt tggttactct gtagcgtagt aacagaatac 780 gaagctgcgg actatcgatc acgaactcct actgctatgg ttctggggcg attcgatttt 840 aatggtgaat acacagaaat agctgtcccc tcctcactat tcgatggccg gtttgcatct 900 aactatccag gtgtgggatc gggaactcaa gtcaatggaa cattatattt ccctttatat 960 ggaggggtcc ttaatgggtc agatatagaa acggcaaaca aggggaaatc cttcaggcct 1020 cagaatccta agaataggtg tccagactcg gaggcgatcc aaagctttag agcgcaagat 1080 agctattacc cgacgagatt tgggaaggtg ctgatccaac aggcaatcat tgcatgtagg 1140 atcagtaaca aaagttgtac tgatttctat ctcctgtact tcgacaacaa cagagtgatg 1200 atgggtgcag aggcacggct atattatctt aataaccaat tatatctata tcaacgctcg 1260 tcgagctggt ggccgcatcc tttgttctat agcatctcat taccgtcatg tcaagccctt 1320 gctgtctgtc aaattacaga ggcccatctg acactgactt acgccacgtc gaggccagga 1380 atgtctatct gtacaggagc atcaaggtgt ccaaataatt gcgtagacgg tgtatatact 1440 gatgtatggc cattgacaaa gaacgatgct caggacccca atctcttcta cactgtatac 1500 ttaaataatt caactcggcg gattagccca accataagtc tatacactta tgaccgcagg 1560 atcaaatcta agctggcagt gggtagtgat ataggagcag cttataccac gagtacctgt 1620 ttcggccgat cagatacagg ggcggtttat tgcttaacta taatggagac cgttaacaca 1680 atatttggtc agtaccggat cgtgccaata ttacttagag tgacaagccg gtaa 1734

Claims (10)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 제3형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-3, APMV-3)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 베큘러바이러스 발현벡터가 형질도입된 재조합 곤충 세포가 발현하는, 재조합 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 포함하는, 제3형 조류파라믹소바이러스 진단용 조성물.
A gene encoding a hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein of avian paramyxovirus-3 (APMV-3), which is composed of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: ; And a third type avian paramyxin protein comprising recombinant type avian paramyxovirus hemagglutinin-neuraminidase protein expressed by recombinant insect cells transfected with a recombinant baculovirus expression vector comprising A composition for diagnosing a virus.
서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 제3형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-3, APMV-3)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 베큘러바이러스 발현벡터가 형질도입된 재조합 곤충 세포가 발현하는, 재조합 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 포함하는, 제3형 조류파라믹소바이러스 진단 키트.
A gene encoding a hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein of avian paramyxovirus-3 (APMV-3), which is composed of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: ; And a third type avian paramyxin protein comprising recombinant type avian paramyxovirus hemagglutinin-neuraminidase protein expressed by recombinant insect cells transfected with a recombinant baculovirus expression vector comprising Virus Diagnostic Kit.
서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 제3형 조류파라믹소바이러스 (avian paramyxovirus-3, APMV-3)의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 (hemagglutinin-neuraminidase, HN) 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 베큘러바이러스 발현벡터가 형질도입된 재조합 곤충 세포가 발현하는, 재조합 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 항원으로 이용하여, 시료 내에서 항원-항체 반응을 통해 제3형 조류파라믹소바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 단백질을 검출하는 것을 특징으로 하는, 제3형 조류파라믹소바이러스의 진단 방법.
A gene encoding a hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein of avian paramyxovirus-3 (APMV-3), which is composed of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: ; And using hemagglutinin-neuraminidase protein of a recombinant type 3 avian paramyxovirus expressing a recombinant insect cell transfected with a recombinant Baculovirus expression vector containing the antigen as an antigen, - detecting the hemagglutinin-neuraminidase protein of the type 3 avian paramyxovirus through an antibody reaction.
제 8항에 있어서, 상기 항원-항체 반응은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질 칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 제3형 조류파라믹소바이러스의 진단 방법.
The method of claim 8, wherein the antigen-antibody reaction is selected from the group consisting of tissue immunostaining, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), Western blotting, immunoprecipitation assay, immunodiffusion assay Characterized in that the method is carried out by using at least one method selected from the group consisting of Assay, Complement Fixation Assay, Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) and protein chip analysis. Diagnostic method of avian paroxysmal virus.
제 8항에 있어서, 상기 시료는 제3형 조류파라믹소바이러스로 감염된 것으로 예상되거나 감염된 세포, 혈액, 소변, 타액 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 제3형 조류파라믹소바이러스의 진단 방법.9. The method according to claim 8, wherein the sample is at least one species selected from the group consisting of cells, blood, urine, saliva, and tissues expected to be infected with the third type avian paramyxovirus or infected. Method of diagnosis of virus.
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Silvina Chimeno Zoth 등. CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY. Vol. 16, No. 5, 페이지 775-778 (2009) *
Silvina Chimeno Zoth 등. CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY. Vol. 16, No. 5, 페이지 775-778 (2009)*

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