RU2439152C1

RU2439152C1 - Strain "stavropol 01/08" of african swine plague virus for virological, molecular-genetic and monitoring research

Info

Publication number: RU2439152C1
Application number: RU2010126641/10A
Authority: RU
Inventors: Владимир Михайлович Балышев (RU); Владимир Михайлович Балышев; Денис Владимирович Колбасов (RU); Денис Владимирович Колбасов; Виктор Васильевич Куриннов (RU); Виктор Васильевич Куриннов; Юрий Федорович Калантаенко (RU); Юрий Федорович Калантаенко; Содном Жемьянович Цыбанов (RU); Содном Жемьянович Цыбанов; Анатолий Николаевич Жуков (RU); Анатолий Николаевич Жуков; Александр Павлович Васильев (RU); Александр Павлович Васильев
Priority date: 2010-06-30
Filing date: 2010-06-30
Publication date: 2012-01-10

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: strain was isolated from the pig which died in LLP "Gorkaya Balka" in Soviet district of Stavropol region during disease epizootic in 2008. Strain is new, earlier unknown, isolated on the territory of RF and is designated as strain "Stavropol 01/08". It possesses high infectious activity, accumulates in cultures of bone marrow cells of pigs and pigs' leukocytes in titre 6.0-7.0 lg HAU_{50 cm3}. Virus titre on pigs constitutes 7.0-7.5 lg LD_{50 cm3}. Death of infected pigs occurs with symptoms characteristic of acute form of ASP 3-6 days after manifestation of clinical symptoms of disease. Invention can be used in research institutions and diagnostic centres as reference-strain in carrying out virological, molecular-genetic and monitoring research.

EFFECT: high infectious activity of strain.

3 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к штаммам вируса африканской чумы свиней (АЧС), и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и диагностических центрах в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований.The invention relates to the field of veterinary virology, in particular to strains of the African swine fever virus (ASF), and can be used in research institutes and diagnostic centers as a reference strain during virological, molecular genetic and monitoring studies.

В странах Африканского, Американского и Европейского континентов выделено более 400 штаммов и изолятов вируса АЧС, обладающих различными биологическими свойствами. Рядом авторов проводились исследования по классификации имеющихся изолятов вируса АЧС. С этой целью они использовали перекрестное заражение свиней, реакцию задержки гемадсорбции (РЗГАд) в культуре клеток костного мозга свиней (КМС) или лейкоцитов свиней (ЛС), рестрикционный анализ ДНК, генотипирование вируса и др. [1, 3, 4, 5].In countries of the African, American and European continents, more than 400 strains and isolates of ASF virus with various biological properties have been isolated. Several authors conducted studies to classify existing ASF virus isolates. To this end, they used cross-infection of pigs, the reaction of delayed hemi-adsorption (RHCA) in a culture of pig bone marrow cells (PMS) or pig leukocytes (PM), restriction analysis of DNA, genotyping of the virus, etc. [1, 3, 4, 5].

Согласно разработанной в ГНУ ВНИИВВиМ классификации, в основу которой положены результаты РЗГАд типоспецифическими сыворотками и иммунобиологической пробы на свиньях, имеющиеся в коллекции института изоляты вируса АЧС разделены на 8 серотипов [2]. Наиболее изученными являются штаммы вируса, отнесенные к I-IV серотипам; Референс-штаммом I-го серотипа определен штамм «Лиссабон 57», II-го - «Конго 49», III-го - «Мозамбик 78», IV-го «Франция 32» [1].According to the classification developed at the GNU VNIIVViM, which is based on the results of RZHAD with type-specific sera and an immunobiological test in pigs, ASF virus isolates available in the Institute’s collection are divided into 8 serotypes [2]. The most studied are the virus strains assigned to I-IV serotypes; The reference strain of the first serotype is the strain Lisbon 57, the second one is Congo 49, the third is Mozambique 78, and the fourth is France 32 [1].

Целью данного изобретения является получение нового вирулентного штамма вируса африканской чумы свиней, обладающего стабильными культуральными и вирулентными свойствами для свиней различных возрастных групп для использования в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований.The aim of this invention is to obtain a new virulent strain of the virus of African swine fever, with stable cultural and virulent properties for pigs of different age groups for use as a reference strain in virological, molecular genetic and monitoring studies.

Поставленная цель достигается путем выделения вируса АЧС от свиньи, павшей в ТОО «Горькая Балка» Советского района Ставропольского края во время эпизоотии болезни в 2008 г., который является новым, ранее неизвестным штаммом этого возбудителя, выделенным на территории РФ. Полученный вирулентный штамм обозначен как штамм «Ставрополь 01/08» и депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН под №278.The goal is achieved by isolating the ASF virus from a pig that died in Gorkaya Balka LLP in the Sovetsky district of the Stavropol Territory during an epizootic of the disease in 2008, which is a new, previously unknown strain of this pathogen isolated on the territory of the Russian Federation. The resulting virulent strain is designated as the strain "Stavropol 01/08" and deposited in the Collection of microorganisms of the GNU Research Institute of Veterinary Virology and Microbiology of RAAS under No. 278.

Новый вирулентный штамм обладает следующими свойствами.The new virulent strain has the following properties.

Морфологические и молекулярно-генетичесие свойства. При электронно-микроскопическом исследовании в вируссодержащем материале обнаруживают округлые частицы диаметром 175-215 нм, состоящие из плотного нуклеотида, 2-слойного икосаэдрического капсида и наружной оболочки. Плавучая плотность вириона в CsCl составляет 1.19-1.24 г/см³, коэффициент седиментации 1800-8000 S. Нуклеотид содержит ДНК, белок и окружен электронно-прозрачным слоем. Геном вируса представлен неинфекционной, двуспиральной, линейной молекулой ДНК, состоящей из 170-190 тыс. пар нуклеотидов. На основании результатов секвенирования фрагментов гена, кодирующего структурный белок Р 72, штамм отнесен к 2-му генотипу вируса АЧС.Morphological and molecular genetic properties. When electron microscopic examination in a virus-containing material detect rounded particles with a diameter of 175-215 nm, consisting of a dense nucleotide, a 2-layer icosahedral capsid and the outer shell. The floating density of the virion in CsCl is 1.19-1.24 g / cm ³ , the sedimentation coefficient is 1800-8000 S. The nucleotide contains DNA, protein and is surrounded by an electronically transparent layer. The virus genome is represented by a non-infectious, double-stranded, linear DNA molecule, consisting of 170-190 thousand pairs of nucleotides. Based on the results of sequencing of fragments of the gene encoding the structural protein P 72, the strain is assigned to the 2nd genotype of the ASF virus.

Антигенные свойства. Антигенные свойства штамма типичны для вируса АЧС. В вирионах идентифицированы 54 полипептида. Вирусспецифические антигены выявляются в реакциях преципитации, связывании комплемента, иммуноферментном анализе, иммунофлуоресценции, задержки гемадсорбции и др.Antigenic properties. The antigenic properties of the strain are typical of ASFV virus. 54 polypeptides were identified in virions. Virus-specific antigens are detected in precipitation reactions, complement binding, enzyme-linked immunosorbent assay, immunofluorescence, delayed hemodisorption, etc.

Типовая принадлежность. По результатам РЗГАд с использованием полученных в ГНУ ВНИИВВиМ референс-сывороток штамм «Ставрополь 01/08» отнесен к вирусу АЧС VIII-го серотипа.Type accessory. According to the results of RZHAD using the reference serums obtained in GNU VNIIVViM, the strain "Stavropol 01/08" was assigned to ASF virus of the VIII serotype.

Культуральные свойства. Штамм размножается в первичных культурах клеток КМС и ЛС. Репродукция вируса сопровождается адсорбцией эритроцитов свиней на инфицированных клетках (феномен гемадсорбции) на 3-5 сутки культивирования и их лизисом через 120-144 часов. Накопление вируса в эти сроки составляет 6,0-7,0 lg ГАЕ_50/cм3. В течение 20 серийных пассажей (срок наблюдения) штамм сохраняет эти свойства. Штамм не размножается в перевиваемых культурах клеток почки поросенка, тестикул поросенка, почки сибирского горного козерога, почки зеленой мартышки.Cultural properties. The strain propagates in primary cell cultures of CMC and drugs. Reproduction of the virus is accompanied by adsorption of pig red blood cells on infected cells (the phenomenon of hemadsorption) on 3-5 days of cultivation and their lysis after 120-144 hours. The accumulation of the virus during these periods is 6.0-7.0 lg GAE _{50 / cm3} . For 20 serial passages (observation period), the strain retains these properties. The strain does not propagate in transplanted cultures of cells of the kidney of a pig, testicles of a pig, kidney of a Siberian mountain ibex, kidney of a green monkey.

Инфекционная активность. Инфекционная активность штамма в культуре клеток КМС и на свиньях составляетInfectious activity. The infectious activity of the strain in the cell culture of the CCM and in pigs is

соответственно.respectively.

Патогенные свойства. Штамм патогенен только для свиней всех пород и возрастных групп. При внутримышечном заражении вирус вызывает их гибель с признаками острой формы болезни с характерными клиническими симптомами АЧС. У заболевших свиней на 3-5 сутки после заражения отмечают повышение температуры тела до 41,5-42,0°С, цианоз кожи, угнетение, отказ от корма, нарушение координации движений, учащенное дыхание, у отдельных животных парез задних конечностей. Длительность болезни у животных составляет от 3 до 6 суток. В ряде случаев животные погибают без проявления характерных клинических признаков АЧС на 3-4 сутки после внутримышечного заражения (сверхострая форма).Pathogenic properties. The strain is pathogenic only for pigs of all breeds and age groups. With intramuscular infection, the virus causes their death with signs of an acute form of the disease with characteristic clinical symptoms of ASF. In diseased pigs, an increase in body temperature up to 41.5-42.0 ° C, skin cyanosis, depression, refusal to feed, impaired coordination of movements, rapid breathing, in some animals paresis of the hind limbs are noted 3-5 days after infection. The duration of the disease in animals is from 3 to 6 days. In some cases, animals die without the manifestation of characteristic clinical signs of ASF 3-4 days after intramuscular infection (super-acute form).

Патологоанатомические изменения. Патоморфологические изменения у взрослых свиней характерны для острой формы АЧС. На серозных оболочках внутренних органов наблюдаются кровоизлияния, в грудной и брюшной полостях скопление серозно-геморрагического экссудата, междольковая ткань легких отечна, у отдельных животных с признаками серозно-геморрагической пневмонии. Лимфоузлы увеличены, темно-красного цвета, на разрезе геморрагически воспалены. Селезенка увеличена, кровенаполнена, черного цвета. Печень кровенаполнена, дряблой консистенции, темно-коричневого цвета.Pathological changes. Pathomorphological changes in adult pigs are characteristic of acute ASF. On the serous membranes of the internal organs, hemorrhages are observed, in the chest and abdominal cavities there is an accumulation of serous-hemorrhagic exudate, the interlobular tissue of the lungs is swollen, in some animals with signs of serous-hemorrhagic pneumonia. Lymph nodes are enlarged, dark red in color, hemorrhagically inflamed at the incision. The spleen is enlarged, blood-filled, black. The liver is blood-filled, flabby consistency, dark brown.

Контагиозность. Штамм контагиозен для свиней. Интактные свиньи заболевают АЧС при совместном содержании с инфицироваными штаммом «Ставрополь 01/08» животными.Contagiousness. The strain is contagious to pigs. Intact pigs develop ASF when kept together with infected animals of the Stavropol 01/08 strain.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.Contamination with bacteria, fungi, mycoplasmas and extraneous viruses. The strain is not contaminated by bacteria, fungi, mycoplasmas and extraneous viruses.

Способ получения и условия хранения. Штамм хранят при минус 40°С в виде лиофилизированной вируссодержащей крови, которую получают от внутримышечно зараженных свиней, находящихся в агональном состоянии. Периодичность освежения штамма один раз в 10 лет.The method of preparation and storage conditions. The strain is stored at minus 40 ° C in the form of lyophilized virus-containing blood, which is obtained from intramuscularly infected pigs in an agonal state. The frequency of refreshment of the strain once every 10 years.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1.Example 1

Накопление вируса в культуре клеток КМСThe accumulation of virus in cell culture

В табл.1 приведены сведения по культивированию штамма «Ставрополь 01/08»» вируса АЧС в монослое культуры клеток КМС, в течение 20 последовательных пассажей.Table 1 shows the information on the cultivation of the strain "Stavropol 01/08" "ASF virus in the monolayer of the cell culture of the CCM, for 20 consecutive passages.

Таблица 1Table 1 Накопление вируса АЧС в процессе пассированияThe accumulation of ASF virus during the passage Характеристика штаммаStrain characteristics * Доза заражения* Dose of infection Накопление вируса (lg ГАЕ_50/см3)The accumulation of the virus (lg GAE _{50 / cm3} ) 1 пас.1 pass 5 пас.5 pass 10 пас10 pass 20 пас.20 pass Лиофилизиро-ванная вирус-кровь (2 пассаж)Freeze-dried virus-blood (passage 2) 1,01,0 6,06.0 6,25-6,56.25-6.5 6,5-6,756.5-6.75 6,25-7,06.25-7.0 0,10.1 6,0-6,256.0-6.25 6,56.5 6,5-7,06.5-7.0 6,5-6,756.5-6.75 0,0010.001 6,0-6,256.0-6.25 6,25-7,06.25-7.0 6,5-6,756.5-6.75 6,25-7,06.25-7.0 Примечание: * - Доза заражения приведена в lg ГАЕ_{50/клетка.} Note: * - The dose of infection is given in lg GAE _{50 / cell.}

Как видно из табл.1, в течение 20 последовательных пассажей штамм «Ставрополь 01/08» вируса АЧС стабильно размножается в монослое культуры клеток КМС. Через 96-120 часов культивирования при температуре 37,0-37,5°С накопление вируса составляло 6,0-7,0 lg ГАЕ_50/см3. Размножение вируса сопровождалось феноменом гемадсорбции с последующим цитолизом инфицированных клеток. Заражающая доза 1,0-0,01 ГАЕ_{50/клетка} не влияла на накопление вируса. В более ранние сроки (48-72 час) цитолиз клеток наступает при инфицирующей дозе 1 ГАЕ_{50/клетка.} As can be seen from table 1, for 20 consecutive passages, the strain "Stavropol 01/08" ASF virus stably propagated in a monolayer of cell culture of the KMS. After 96-120 hours of cultivation at a temperature of 37.0-37.5 ° C, virus accumulation was 6.0-7.0 lg GAE _{50 / cm3.} The reproduction of the virus was accompanied by the phenomenon of haemadsorption followed by cytolysis of infected cells. The infectious dose of 1.0-0.01 GAU _{50 / cell} did not affect the accumulation of the virus. At an earlier date (48-72 hours), cell cytolysis occurs at an infectious dose of 1 GAE _{50 / cell.}

Полученный вируссодержащий материал обладает высокой инфекционной активностью и может быть использован при проведении фундаментальных и прикладных НИОКР.The resulting virus-containing material has a high infectious activity and can be used in basic and applied research and development.

Пример 2.Example 2

Определение типовой принадлежности штамма «Ставрополь 01/08»Determination of the type of strain "Stavropol 01/08"

Типовая принадлежность штамма определена в РЗГАд со специфическими референс-сыворотками I-VIII серотипов по разработанной в ГНУ ВНИИВВиМ методике. Установлено, что только специфическая референс-сыворотка, полученная на штамм Родезия вируса АЧС, вызывает задержку гемадсорбции штамма «Ставрополь 01/08». На основании этих исследований штамм «Ставрополь 01/08» отнесен к вирусу АЧС VIII-го серотипа и принят в качестве референс-штамма.Type affiliation of the strain was determined in RZHAD with specific reference serum I-VIII serotypes according to the method developed in GNU VNIIVViM. It has been established that only a specific reference serum obtained for the ASFV virus rhodesia strain causes a delay in the hemodisorption of the Stavropol 01/08 strain. Based on these studies, the Stavropol 01/08 strain is classified as ASF virus of the VIII serotype and adopted as a reference strain.

Результаты типирования штамма приведены в табл.2.The results of the typing of the strain are shown in table.2.

Таблица 2table 2 Результаты типизации штамма «Ставрополь 01/08» вируса АЧС в РЗГАдThe results of the typification of the strain "Stavropol 01/08" virus ASF in Rzgad Штаммы вируса АЧСASF Virus Strains Типовые референс-сыворотки (серотип)Typical reference serums (serotype) Серотип вирусаVirus serotype II IIII IIIIII IVIV VV VIVI VIIVII VIIIVIII Референс-штаммыReference strains Лиссабон - 57Lisbon - 57 -- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ II Конго - 49Congo - 49 ++ -- ++ ++ ++ ++ ++ ++ IIII Мозамбик - 78Mozambique - 78 ++ ++ -- ++ ++ ++ ++ ++ IIIIII Франция - 32France - 32 ++ ++ ++ -- ++ ++ ++ ++ IVIV ТСП - 80TSP - 80 ++ ++ ++ ++ -- ++ ++ ++ VV ТС/7TS / 7 ++ ++ ++ ++ ++ -- ++ ++ VIVI УгандаUganda ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- ++ VIIVII РодезияRhodesia ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- VIIIVIII Испытуемый вирусTest virus Ставрополь 01/08Stavropol 01/08 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- VIIIVIII Примечание: (-) - отсутствие (задержка) ГАдNote: (-) - absence (delay) (+) - специфическая ГАд(+) - specific GAD

Пример 3Example 3

Изучение биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ.The study of the biological properties of ASF virus isolates isolated in the Russian Federation.

При изучении биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных при мониторинговых исследованиях в РФ, в качестве референс-штамма использовали штамм «Ставрополь 01/08». Результаты этих исследований приведены в табл.3.When studying the biological properties of ASF virus isolates isolated during monitoring studies in the Russian Federation, the Stavropol 01/08 strain was used as the reference strain. The results of these studies are given in table.3.

Таблица 3Table 3 Результаты изучения вируса АЧС, выделенного в РФResults of a study of ASF virus isolated in the Russian Federation Наименование штаммов и изолятовThe name of the strains and isolates Биологические свойстваBiological properties Наличие ГАдThe presence of GAD * Титр вируса в культуре КМС* The title of the virus in the culture of the CCM Форма болезниForm of the disease ГенотипGenotype СеротипSerotype Референс-штаммReference strain Ставрополь 01/08Stavropol 01/08 ++ 6.0-7.06.0-7.0 ОстраяSharp 22 VIIIVIII Изучаемые изолятыStudy Isolates Краснодар 01/09Krasnodar 01/09 ++ 6.0-6,56.0-6.5 ОстраяSharp 22 VIIIVIII Северная ОсетияNorth Ossetia ++ 6.0-6,56.0-6.5 ОстраяSharp 22 VIIIVIII Ростов 01/09Rostov 01/09 ++ 6.25-,706.25-, 70 ОстраяSharp 22 VIIIVIII Чечня 04/09Chechnya 04/09 ++ 6.0-,756.0-, 75 ОстраяSharp 22 VIIIVIII Примечание: (+) - признак положительныйNote: (+) - positive sign * - титр вируса выражен в lg ГАЕ_50/см3 * - virus titer expressed in lg GAE _{50 / cm3}

Как видно из табл.3, изоляты вируса АЧС «Краснодар 01/09», «Северная Осетия», «Ростов 01/09», «Чечня 04/09» имели сравнимые характеристики с референс-штаммом «Ставрополь 01/08». Это указывает на общность происхождения и идентичность возбудителя АЧС, циркулирующего на территории РФ.As can be seen from table 3, isolates of ASF virus Krasnodar 01/09, North Ossetia, Rostov 01/09, Chechnya 04/09 had comparable characteristics with the reference strain Stavropol 01/08. This indicates a common origin and identity of the ASF pathogen circulating in the Russian Federation.

Источники информацииInformation sources

1.Диагностика африканской чумы свиней. И.Ф.Вишняков, Н.И.Митин, А.Н.Курносов, В.М.Колосов, Ф.А.Бадаев, И.В.Федорищев, В.А.Бурлаков // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1992. - С.57-70.1. Diagnosis of African swine fever. I.F. Vishnyakov, N.I. Mitin, A.N. Kurnosov, V.M. Kolosov, F.A. Badaev, I.V. Fedorishchev, V.A. Burlakov // Materials of the scientific conference VNIIVViM. - Pokrov, 1992. - P.57-70.

2. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней. И.Ф.Вишняков, Н.И. Митин, Ю.И. Петров и др. // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: Материалы научно-практич. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1995. - С.141-143.2. Seroimmunological classification of natural isolates of the virus of African swine fever. I.F. Vishnyakov, N.I. Mitin, Yu.I. Petrov et al. // Actual issues of veterinary virology: Materials of scientific and practical. conf. VNIIVViM. - Pokrov, 1995 .-- S. 141-143.

3. Селянинов Ю.О. Вирус африканской чумы свиней: физическое картирование генома штаммов / Ю.О.Селянинов, В.М.Балышев, С.Ж.Цыбанов / Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2000. - №5. - С.75-76.3. Selyaninov Yu.O. African swine fever virus: physical mapping of the genome of strains / Yu.O. Selyaninov, V.M. Balyshev, S.Zh. Tsybanov / Bulletin of the Russian Academy of Agricultural Sciences. - 2000. - No. 5. - S. 75-76.

4. Genotyping fielstraing of African swine fever by partial p72 gene characterization. A.D.S. Bastos [et al.] // Arch. Virol - 2003, vol.148, - P.693-706.4. Genotyping fielstraing of African swine fever by partial p72 gene characterization. A.D.S. Bastos [et al.] // Arch. Virol - 2003, vol. 148, - P.693-706.

5. Malmguist W.A. Serologic and immunologic studies with African swine fever virus / W.A. Malmguist // Amer. J. Vet. Res. 1963. - P.24.5. Malmguist W.A. Serologic and immunologic studies with African swine fever virus / W.A. Malmguist // Amer. J. Vet. Res. 1963. - P.24.

Claims

Штамм «Ставрополь 01/08» вируса АЧС семейства Asfarviridae рода Asfivirus, инв. №2783, депонированный в Коллекции микроорганизмов ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН, предложен в качестве вирулентного референс-штамма 8-го серотипа для проведения вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований. The strain "Stavropol 01/08" ASF virus of the family Asfarviridae of the genus Asfivirus, inv. No. 2783, deposited in the Collection of microorganisms of the GNU of the All-Russian Research Institute of Veterinary Virology and Microbiology of the Russian Academy of Agricultural Sciences, was proposed as a virulent reference strain of the 8th serotype for virological, molecular genetic and monitoring studies.