KR101463001B1 - Avian paramyxovirus type 7 recombinant hemagglutinin-neuraminidase protein expressed by baculovirus and diagnostic method for Avian paramyxovirus type 7 using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 베큘러바이러스에 의하여 발현된 조류파라믹소바이러스-7 재조합 HN 단백질 및 이를 이용한 조류파라믹소바이러스-7 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 APMV-7 HN 단백질을 발현하는 베큘러바이러스 또는 이에 의하여 형질감염된 곤충세포는 APMV-7 HN 단백질을 고농도로 생산하며, 이를 이용하여 세포배양이 가능한 일반실험실에서도 손쉽게 대량의 항원을 제조할 수 있고, 곤충세포배양법으로 일주일 이내에 항원진단액 제조가 가능하므로 항원진단액 제조기간을 최소 일주일 이상 단축할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 의해 제조한 APMV-7 HN 단백질 항원은 닭 적혈구에 대한 혈구 응집능과 열 안정성이 있고, APMV-7 면역혈청에 의해 HI 반응이 특이적으로 나타났을 뿐만 아니라, 종래의 항원 (APMV-7 바이러스 항원)과 HI반응법 검사결과와 비교하였을 때 동일한 검사결과를 나타내는 효과가 있다. 따라서, 감염성 APMV-7 바이러스를 확보하고 있지 않아도 종래의 APMV-7 바이러스 항원 진단액을 본 발명에 의해 제조한 APMV-7 HN 단백질 항원으로 대체하여 사용할 수 있다.The present invention relates to a bird paramiemovirus-7 recombinant HN protein expressed by the Bacillus virus and to a method for diagnosing avian paroxysin virus-7 using the same. The APMV-7 HN protein expressing APMV-7 HN protein according to the present invention produces APMV-7 HN protein at a high concentration and can easily produce a large amount of antigen even in a general laboratory capable of cell culture using the APMV- And it is possible to manufacture an antigen diagnostic solution within one week by the insect cell culture method, so that the period of manufacturing the antigen diagnostic solution can be shortened by at least one week. In addition, the APMV-7 HN protein antigen produced by the present invention has hemagglutination ability and thermal stability against chicken erythrocytes, and not only the HI response is specifically detected by the APMV-7 immunized serum, APMV-7 viral antigen) and HI reaction test results. Therefore, even if the infectious APMV-7 virus is not secured, the conventional APMV-7 viral antigen diagnostic solution can be used instead of the APMV-7 HN protein antigen prepared by the present invention.

Description

베큘러바이러스에 의하여 발현된 조류파라믹소바이러스-7 재조합 HN 단백질 및 이를 이용한 조류파라믹소바이러스-7의 진단 방법{Avian paramyxovirus type 7 recombinant hemagglutinin-neuraminidase protein expressed by baculovirus and diagnostic method for Avian paramyxovirus type 7 using the same} 7 recombinant HN protein and avian paramyxovirus type 7 expression using avian paramyxovirus type 7 recombinant hemagglutinin-neuraminidase protein expressed by baculovirus and avian paramyxovirus type 7 using the same}

본 발명은 베큘러바이러스에 의하여 발현된 조류파라믹소바이러스-7 재조합 HN 단백질 및 이를 이용한 조류파라믹소바이러스-7의 진단 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a bird paramiemovirus-7 recombinant HN protein expressed by a Bacillus virus and a diagnostic method of avian paroxysin virus-7 using the recombinant HN protein.

조류파라믹소바이러스(Avian paramyxovirus; APMV)는 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)과, 아뷸라바이러스(Avulavirus)속으로 분류되는 RNA 바이러스이다. APMV는 APMV-1에서 APMV-11까지 현재까지 총 11개의 혈청형(serotype)이 존재하고 있는 것으로 밝혀져 있다. 이 중 APMV-1에 속하는 뉴캣슬병바이러스 (Newcastle disease virus; NDV)가 가금류에서 가장 중요한 병원체로 알려져 있으나 APMV-2, APMV-3, APMV-7 및 APMV-9 등도 각종 가금류에 감염하여 경제적 손실을 유발하는 것으로 알려져 있다. APMV-7은 1975년 미국 테네시주 비둘기에서 처음 분리 보고되었다. Avian paramyxovirus (APMV) is an RNA virus classified into Paramyxoviridae and Avulavirus genus. APMV has 11 serotypes from APMV-1 to APMV-11 to date. Newcastle disease virus (NDV) belonging to APMV-1 is known to be the most important pathogen in poultry, but APMV-2, APMV-3, APMV-7 and APMV-9 also infect various poultry . APMV-7 was first reported in 1975 in Tennessee, USA.

APMV 게놈은 음성-센스-단일 가닥 RNA(negative-sense single-stranded RNA)형태로 되어 있으며, N(nucleocapsid protein), 인산단백질(phosphoprotien; P), 기질 단백질(matrix protein; M), 융합 단백질(fusion protein; F), HN(hemagglutinin-neuraminidase) 및 중합효소 단백질(polymerase protein;L)을 발현하는 최소 6개 이상의 ORF(open reading frames)를 가지고 있다. The APMV genome is in the form of negative-sense single-stranded RNA, and contains nucleoprotein (N), phosphoprotien (P), matrix protein (M) at least six ORFs (open reading frames) that express fusion protein (F), hemagglutinin-neuraminidase (HN) and polymerase protein (L)

APMV 구조단백질 중 N, P, L 단백질은 전사복합체 (transcription complex)를 형성하여 RNA 복제과정에 관여한다. 바이러스 외피막을 구성하는 주요 당단백질로는 F와 HN 당단백질 (glycoprotein)이 있다. 이들 당 단백질은 방어면역에 관여하는 중요한 바이러스 구조단백질이다. F 당단백질은 감염세포간의 융합을 유발하고 병원성과도 관련이 있는 것으로 알려져 있다. HN 당단백질은 감염성 바이러스가 세포 표면에 달라붙거나 세포내에서 증식된 후대바이러스(progeny virus)가 세포막 외부로 유리하는 과정에 관여한다. 특히 HN 당단백질은 닭 적혈구를 응집시키거나 혈구응집 후 해리시키는 생물학적 기능을 가지고 있다. Among the APMV structural proteins, the N, P, and L proteins form transcription complexes that are involved in the RNA replication process. The major glycoproteins constituting the viral envelope membrane are F and HN glycoproteins. These glycoproteins are important viral structural proteins involved in defense immunity. F glycoprotein has been known to induce fusion between infected cells and to correlate with hospital performance. The HN glycoprotein is involved in the process of infecting the infectious virus to the cell surface or progeny virus propagation outside the cell membrane. In particular, HN glycoprotein has a biological function of aggregating chicken erythrocytes or dissociating after hemocyte aggregation.

APMV-7의 진단은 닭 부화란(종란)을 이용하여 검체 시료로부터 바이러스를 분리한 다음 분리 바이러스를 동정(identification) 하거나, 검체 시료(혈청)로부터 APMV 특이 항체를 검출하여 이루어진다. 이를 위하여 APMV 진단 항원과 면역혈청은 필수적이며, 진단방법으로 닭 적혈구를 이용한 혈구응집 (hemagglutination; HA) 반응법, 또는 혈구응집억제 (hemagglutination inhibition; HI) 반응법을 이용한다. 그러나 현재 APMV-7 진단을 위하여 사용하고 있는 진단 항원은 감염성 바이러스 입자를 닭 부화란에서 증식하여 제조한다. 따라서 APMV-7 바이러스는 일부 연구기관에서 제한적으로만 보유하고 있어서 APMV-7 진단에 어려움이 있었다. The diagnosis of APMV-7 is made by isolating the virus from the specimen using chicken egg hatching (egg yolk) and then identifying the isolated virus or detecting the APMV specific antibody from the specimen (serum). For this purpose, APMV diagnostic antigen and immunized serum are essential, and hemagglutination (HA) reaction or hemagglutination inhibition (HI) reaction method using chicken erythrocytes is used as a diagnostic method. However, the diagnostic antigen currently used for the diagnosis of APMV-7 is produced by propagating infectious virus particles in the chicken embryo. Therefore, the APMV-7 virus was limited to a limited number of research institutes, which made it difficult to diagnose APMV-7.

이에, 본 발명자들은 미국 국립보건원의 유전자은행(Genbank)에 기 공지된 APMV-7/dove/Tennessee/4/75 균주의 HN 유전자 서열정보를 바탕으로 인의적으로 HN 전체 유전자를 합성하여, 발현 벡터에서 클로닝하여 재조합 베큘로바이러스를 제작한 다음, 곤충세포에 감염시켰을 때 생산된 발현 단백질이 A닭 적혈구 응집능 등 HN 단백질의 고유한 생물학적 기능을 가지고 있으면서 APMV-7 면역혈청에 의해 혈구응집반응이 억제된다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.Therefore, the present inventors synthesized the entire HN gene as a human gene based on the HN gene sequence information of the APMV-7 / dove / Tennessee / 4/75 strain known in the Genbank of the National Institutes of Health, And then the recombinant baculovirus was produced. Then, the expression protein produced when the insect cells were infected had a biological function of the HN protein such as the hemagglutinating ability of A chicken, and the hemagglutination reaction was carried out by the APMV-7 immunity serum The present invention has been completed.

본 발명의 목적은 조류파라믹소바이러스-7(Avian paramyxovirus-7)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 발현벡터를 제공함에 있다.It is an object of the present invention to provide an expression vector containing a sequence encoding the HN (hemagglutinin-neuraminidase) gene of avian paramyxovirus-7.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터가 형질도입된 세포를 제공함에 있다.Another object of the present invention is to provide a cell into which the above expression vector has been transduced.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터 또는 상기 발현벡터가 형질도입된 세포가 발현하는 HN 단백질을 제공함에 있다.It is still another object of the present invention to provide an HN protein expressed by the above-described expression vector or a cell transfected with the expression vector.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 HN 단백질을 이용한 조류파리믹소바이러스-7 진단 키트를 제공함에 있다.It is still another object of the present invention to provide a bird parmyxovirus-7 diagnostic kit using the HN protein.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 HN 단백질을 이용한 조류파리믹소바이러스-7의 진단방법을 제공함에 있다. It is another object of the present invention to provide a method for diagnosing avian paroxysin virus-7 using the HN protein.

따라서, 본 발명은 조류파라믹소바이러스-7(Avian paramyxovirus-7)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 발현벡터를 제공한다.Thus, the present invention provides an expression vector comprising a sequence encoding the HN (hemagglutinin-neuraminidase) gene of Avian paramyxovirus-7.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터가 형질도입된 세포를 제공함에 있다.The present invention also provides a cell into which the expression vector is transduced.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터 또는 상기 발현벡터가 형질도입된 세포가 발현하는 HN 단백질을 제공한다.The present invention also provides an HN protein expressed by the expression vector or the cell into which the expression vector is transduced.

또한, 본 발명은 상기 HN 단백질을 이용한 조류파리믹소바이러스-7 진단 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a bird parmyxovirus-7 diagnostic kit using the HN protein.

또한, 본 발명은 상기 HN 단백질을 이용한 조류파리믹소바이러스-7의 진단방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for diagnosing avian paroxysin virus-7 using the HN protein.

본 발명의 APMV-7 HN 단백질을 발현하는 베큘러바이러스 또는 이에 의하여 형질감염된 곤충세포는 APMV-7 HN 단백질을 고농도로 생산하며, 이를 이용하여 세포배양이 가능한 일반실험실에서도 손쉽게 대량의 항원을 제조할 수 있고, 곤충세포배양법으로 일주일 이내에 항원진단액 제조가 가능하므로 항원진단액 제조기간을 최소 일주일 이상 단축할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 의해 제조한 APMV-7 HN 단백질 항원은 닭 적혈구에 대한 혈구 응집능과 열 안정성이 있고, APMV-7 면역혈청에 의해 HI 반응이 특이적으로 나타났을 뿐만 아니라, 종래의 항원 (APMV-7 바이러스 항원)과 HI반응법 검사결과와 비교하였을 때 동일한 검사결과를 나타내는 효과가 있다. 따라서, 감염성 APMV-7 바이러스를 확보하고 있지 않아도 종래의 APMV-7 바이러스 항원 진단액을 본 발명에 의해 제조한 APMV-7 HN 단백질 항원으로 대체하여 사용할 수 있다.The APMV-7 HN protein expressing APMV-7 HN protein expressing APMV-7 HN protein is produced at a high concentration, and a large amount of antigen can be easily prepared in a general laboratory capable of cell culture using the APMV-7 HN protein And it is possible to manufacture an antigen diagnostic solution within one week by the insect cell culture method, so that the period of manufacturing the antigen diagnostic solution can be shortened by at least one week. In addition, the APMV-7 HN protein antigen produced by the present invention has hemagglutination ability and thermal stability against chicken erythrocytes, and not only the HI response is specifically detected by the APMV-7 immunized serum, APMV-7 viral antigen) and HI reaction test results. Therefore, even if the infectious APMV-7 virus is not secured, the conventional APMV-7 viral antigen diagnostic solution can be used instead of the APMV-7 HN protein antigen prepared by the present invention.

도 1은 재조합 pGEM-T 벡터내 삽입된 APMV-7 HN 유전자 절편을 EcoRI 및 XhoI 제한효소로 처리하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 재조합 pFastBacTM 전이벡터 내 삽입된 APMV-7 HN 유전자 절편을 BamHI 및 XhoI 제한효소로 처리하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 APMV-7 HN 유전자를 포함하는 재조합 bacmid를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 형광항체법에 의한 재조합 베큘로바이러스 감염 Sf9 곤충세포에서의 APMV-7 HN 단백질 발현을 나타낸 도이다(좌측: 정상 Sf9 곤충세포; 우측: 재조합 베큘러바이러스 감염 Sf9 곤충세포).
도 5는 PCR로 재조합 베큘로바이러스 내 APMV-7 HN 유전자 삽입을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 재조합 APMV-7 HN 발현 단백질의 전자현미경으로 관찰한 도이다.
도 7은 APMV-7 HN 단백질 항원과 다른 APMV-7 항원을 이용한 야외 농장 시료 HI 항체 검사결과를 나타낸 도이다.FIG. 1 shows the result of checking the inserted APMV-7 HN gene fragment in a recombinant pGEM-T vector with EcoR I and Xho I restriction enzymes.
Figure 2 is a APMV-7 HN gene fragment The recombinant pFastBac TM transfer vector insertion BamH I and Xho I restriction enzyme. Fig.
FIG. 3 shows the results of PCR of the recombinant bacmid containing the APMV-7 HN gene. FIG.
FIG. 4 is a graph showing APMV-7 HN protein expression in recombinant baculovirus-infected Sf9 insect cells by fluorescent antibody method (left: normal Sf9 insect cells; right: recombinant Baculovirus-infected Sf9 insect cells).
FIG. 5 is a diagram showing the results of confirming insertion of the APMV-7 HN gene in the recombinant beculovirus by PCR.
6 is an electron microscopic observation of the recombinant APMV-7 HN-expressing protein.
FIG. 7 shows results of HI antibody test on an outdoor farm sample using APMV-7 HN protein antigen and another APMV-7 antigen.

본 발명은 조류파라믹소바이러스-7(Avian paramyxovirus-7)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터가 형질도입된 세포를 제공한다.The present invention provides an expression vector comprising a sequence encoding the HN (hemagglutinin-neuraminidase) gene of Avian paramyxovirus-7 and a cell transduced with the expression vector.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에서 APMV-7 HN 유전자 DNA 절편은 국제유전자은행에 공지된 APMV-7(APMV-7/dove/Tennessee/4/75 균주) HN유전자 서열정보(등록번호:FJ231524.1)를 합성하여 pGEM-T 벡터 (Promega)와 같은 클로닝용 플라스미드에 이용하여 클로닝한다. DNA 절편의 합성은 HT-oligoTM 합성기(주식회사 바이오니아)등에 의하여 합성하고, 합성된 DNA절편의 클로닝을 원활히 하기 위하여, DNA절편의 5`말단에는 EcoRI, 3`말단에는 XhoI 제한효소 인식부위를 추가한다. 클로닝한 APMV-7 HN DNA 절편은 제한효소 (EcoRI 및 XhoI)를 처리하여 클로닝 벡터에서 추출한 다음 pFastBacTM와 같은 전이 벡터에 삽입한 후, Bacmid와의 전위(transposition)로 재조합 Bacmid를 제작한다. 이 후, 재조합 Bacmid를 곤충세포에 형질전환시켜 재조합 베큘로바이러스(baculovirus)를 제작한다. 이 후, 재조합 베큘러바이러스에 의해서 생산된 APMV-7 HN 발현 단백질은 닭 적혈구 응집능을 가지고 있음을 확인하였고, 열적 안정성이 있는지 확인하였고, 혈구응집억제반응법을 사용하여 APMV-7 특이항체를 검출하거나 정량화하였다.(APMV-7 / dove / Tennessee / 4/75 strain) HN gene sequence information (registration number: FJ231524.1) known in the International Gene Bank was synthesized and inserted into pGEM -T vector (Promega) for cloning. The DNA fragment was synthesized by HT-oligoTM synthesizer (Bioneer Co., Ltd.), and EcoR I was added at the 5 'end of the DNA fragment and Xho I restriction enzyme recognition site at the 3' end to facilitate cloning of the synthesized DNA fragment Add. The cloned APMV-7 HN DNA fragment is treated with restriction enzymes ( EcoR I and Xho I), extracted from the cloning vector, inserted into a transfection vector such as pFastBac ™, and then a recombinant Bacmid is prepared by transposition with Bacmid. Subsequently, recombinant Bacmid is transformed into insect cells to produce recombinant baculovirus. Thereafter, the APMV-7 HN-expressing protein produced by the recombinant v.clear virus was confirmed to have chicken erythrocyte aggregation ability, and it was confirmed that the protein had thermal stability and APMV-7 specific antibody was detected using the hemagglutination inhibition method Were detected or quantified.

본 발명의 APMV-7 HN 단백질을 발현하는 베큘러바이러스 또는 이에 의하여 형질감염된 곤충세포는 APMV-7 HN 단백질을 고농도로 생산하며, 이를 이용하여 세포배양이 가능한 일반실험실에서도 손쉽게 대량의 항원을 제조할 수 있고, 곤충세포배양법으로 일주일 이내에 항원진단액 제조가 가능하므로 항원진단액 제조기간을 최소 일주일 이상 단축할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 의해 제조한 APMV-7 HN 단백질 항원은 닭 적혈구에 대한 혈구 응집능과 열 안정성이 있고, APMV-7 면역혈청에 의해 HI 반응이 특이적으로 나타났을 뿐만 아니라, 종래의 항원 (APMV-7 바이러스 항원)과 HI반응법 검사결과와 비교하였을 때 동일한 검사결과를 나타내는 효과가 있다. 따라서, 종래의 APMV-7 바이러스 항원 진단액의 대체 항원으로 유용하게 사용할 수 있다.The APMV-7 HN protein expressing APMV-7 HN protein expressing APMV-7 HN protein is produced at a high concentration, and a large amount of antigen can be easily prepared in a general laboratory capable of cell culture using the APMV-7 HN protein And it is possible to manufacture an antigen diagnostic solution within one week by the insect cell culture method, so that the period of manufacturing the antigen diagnostic solution can be shortened by at least one week. In addition, the APMV-7 HN protein antigen produced by the present invention has hemagglutination ability and thermal stability against chicken erythrocytes, and not only the HI response is specifically detected by the APMV-7 immunized serum, APMV-7 viral antigen) and HI reaction test results. Therefore, it can be usefully used as an alternative antigen for the conventional APMV-7 viral antigen diagnostic fluid.

본 발명의 조류파라믹소바이러스-7(Avian paramyxovirus-7)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 코딩하는 서열은 서열번호 1의 염기서열인 것을 특징으로 한다.The sequence encoding the HN (hemagglutinin-neuraminidase) gene of avian paramyxovirus-7 of the present invention is characterized by being a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터(vector)"는 외부의 유전 물질을 다른 세포로 옮기는데 사용되는 전달 수단인 DNA 분자이다. 대표적으로 플라스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 코스미드 벡터, 인공 염색체를 이용한 벡터(예컨대, YAC, BAC) 등이 존재한다. 벡터를 이용하여 원하는 유전 물질을 대량 발현하는데 있으므로 벡터로서의 기능을 하기 위해 필요한 공통 요소가 존재하는데, 복제 원점(Replication Origin), 여러 제한효소 자리(Multicloning site), 선택표지(selective marker)가 반드시 존재하여야 한다. 벡터 그 자체는 DNA 염기 서열로 이식할 유전자(transgene)와 벡터 백본(backbone)을 포함한다.As used herein, the term "vector" is a DNA molecule that is a means of delivery used to transfer an outer genetic material to another cell. Typically, plasmid vectors, bacteriophage vectors, cosmid vectors, vectors using artificial chromosomes (e.g., YAC, BAC) and the like are present. Since a large amount of a desired genetic material is expressed using a vector, there is a common element necessary for functioning as a vector. Replication origin, a plurality of restriction sites, and a selective marker are necessarily present shall. The vector itself contains the transgene and vector backbone to be transplanted into the DNA sequence.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 진핵세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 진핵세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.The vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed by using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts. It is preferable that the polynucleotide of the present invention is derived from eukaryotic cells and that eukaryotic cells are used as a host in consideration of the convenience of culture. The vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL프로모터, pR프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 [Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)], 그리고 파아지의 좌향 프로모터 [pL프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980)]가 조절 부위로서 이용될 수 있다.For example, when the vector of the present invention is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (such as a tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL promoter, pR promoter , rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.), a ribosome binding site for initiation of translation and a transcription / translation termination sequence. When E. coli is used as a host cell, the promoter and operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158: 1018-1024 (1984)) and the phage left promoter [pL Promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14: 399-445 (1980)] can be used as a regulatory region.

본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET, pEGFP, pCR 등), 파지 (예: gt4B, -Charon, z1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 벡터는 발현 벡터이고, 바람직하게는 베큘러바이러스이다.Vectors that can be used in the present invention include plasmids such as pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, pEGFP, pCR etc., phage such as gt4B, -Charon, z1 and M13) or a virus (e.g., SV40 or the like). Preferably, the vector of the present invention is an expression vector, preferably a Baculovirus.

상기 발현벡터를 숙주에 형질 감염 또는 형질도입할 수 있으며, 숙주세포를 이용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. The expression vector can be transfected or transfected into a host, and the recombinant protein can be expressed using the host cell. When a eukaryotic cell is used as a host, a promoter derived from a genome of a mammalian cell (for example, a metallothionine promoter) or a mammalian virus (for example, a late adenovirus promoter, a vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, and tk promoter of HSV) can be used, and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
The vector of the present invention is a selection marker and includes an antibiotic resistance gene commonly used in the art and includes, for example, ampicillin, gentamycin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, There is a resistance gene for cyclin.

본 발명은 조류파라믹소바이러스-7(Avian paramyxovirus-7)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 발현벡터 또는 발현벡터가 형질도입된 세포가 발현하는 HN 재조합 단백질 및 이를 이용한 조류파리믹소바이러스-7 진단 키트를 제공한다.The present invention relates to an HN recombinant protein expressed by an expression vector comprising a sequence encoding a hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene of Avian paramyxovirus-7 or a cell transfected with an expression vector, Provides the ParisMixo virus-7 diagnostic kit.

본 발명에서의 용어 재조합 단백질이란 두 개 혹은 그 이상의 DNA를 유전자 재조합 기술로 이어 붙여 만든 재조합 DNA에서 만들어지는 단백질이다.The term recombinant protein in the present invention is a protein produced from recombinant DNA made by joining two or more DNAs with recombinant DNA technology.

상기 재조합 DNA 기술을 통해 과거 자연 상태부터 미량으로밖에 얻을 수 없던 의료용 단백질 또는 산업용 효소 등을 박테리아(예컨대 E. coli)와 동물세포 등을 이용하여 합성할 수 있다. 박테리아(예컨대 E. coli)를 비롯한 효모(Yeast)와 동물 세포(Mammalian cell)의 발효 및 배양, 의약품 원료 수준의 정제 과정을 통하여 합성 가능하다. 재조합 단백질로 합성된 예로, hGH (Human growth hormone), INS (Insulin), 인터루킨 등이 있다.The recombinant DNA technology can be used to synthesize a medical protein or an industrial enzyme that can only be obtained in a trace amount from the natural state, using bacteria such as E. coli and animal cells. It can be synthesized by fermentation and culture of yeast and mammalian cells including bacteria (for example, E. coli ), and purification processes at the drug substance level. Examples of recombinant proteins include hGH (human growth hormone), INS (insulin), and interleukin.

상기 진단 키트는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 진단 키트는 재조합 HN 단백질을 발현하는 재조합 세포에서 발현된 재조합 HN 단백질 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
The diagnostic kit may be prepared using a method commonly used in the art. These diagnostic kits include recombinant HN proteins expressed in recombinant cells expressing the recombinant HN protein as well as tools, reagents and the like commonly used in the art used for immunological analysis. Such tools / reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling agents capable of producing a detectable signal, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like. When the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator. Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers, e. G., Physiologically acceptable buffers such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, Polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, polymer such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose and combinations thereof.

또한, 본 발명은 조류파라믹소바이러스-7(Avian paramyxovirus-7)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 발현벡터 또는 상기 발현벡터가 형질도입된 세포가 발현하는 재조합 HN 단백질을 이용하여 항원-항체반응을 통해 시료 내에서 조류파리믹소바이러스를 검출하는 것을 특징으로 하는, 조류파리믹소바이러스-7의 검출방법을 제공한다. The present invention also relates to an expression vector comprising a sequence encoding a HN (hemagglutinin-neuraminidase) gene of Avian paramyxovirus-7 or a recombinant HN protein expressing the gene transduced with the expression vector And detecting the avian parmyxovirus in the sample through an antigen-antibody reaction using the avian parmyx virus-7.

상기 항원-항체 반응은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용할 수 있다.The antigen-antibody reaction can be assayed by immunohistochemical staining, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), Western blotting, immunoprecipitation assays, immunodiffusion assays, (Complement Fixation Assay), Fluorescence-activated cell sorter (FACS) and protein chip analysis.

상기 시료는 조류파라믹소바이러스-7로 감염된 것으로 예상되거나 감염된 세포, 혈액, 소변, 타액, 조직 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
The sample includes, but is not limited to, cells, blood, urine, saliva, tissue, etc. that are expected or infected with avian paramyxovirus-7.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It will be apparent to those skilled in the art that the following examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예Example 1.  One. APMVAPMV -7 -7 HNHN 전체 유전자의 인공합성 Artificial synthesis of whole genes

APMV-7 HN 전체 유전자의 DNA 절편을 인공합성하기 위하여 국제유전자은행(등록번호 FJ231524.1)에 공지된 APMV-7/dove/Tennessee/4/75 균주의 HN 유전자 염기서열 정보를 사용하였다. DNA 절편 합성에 사용된 HN 유전자 염기서열은 총 1,710개의 핵산으로 구성되어 있고, 클로닝의 효율성을 위하여 인공합성 DNA 절편의 5`말단에는 EcoRI, 3`말단에는 XhoI 제한효소 인식부위를 추가하였다. 보다 구체적으로, HN 유전자 염기서열 정보를 (주)바이오니아에 제공하여 주문 제작을 실시하였으며, 이의 서열을 서열번호 1로 나타내었다. 유전자 절편 합성은 주식회사 바이오니아의 HT-oligoTM 384 합성기로 사용하여 실시하였다.
HN gene sequence information of the APMV-7 / dove / Tennessee / 4/75 strain known in the International Gene Bank (registration number FJ231524.1) was used for artificial synthesis of the DNA fragment of APMV-7 HN whole gene. For the cloning efficiency, EcoR I was added at the 5 'end and Xho I restriction site was added at the 3' end of the synthetic DNA fragment for the cloning efficiency . More specifically, the HN gene sequence information was provided to Bioneer Co., Ltd., and the sequence thereof was shown in SEQ ID NO: 1. Genetic fragmentation synthesis was performed using HT-oligo (TM) 384 synthesizer of BIONIA Co., Ltd.

실시예Example 2.  2. APMVAPMV -7 -7 HNHN 유전자의 벡터  Vector of gene 클로닝Cloning

상기 실시예 1에서 합성한 APMV-7 HN 유전자 DNA 절편은 중합효소연쇄반응법(PCR)을 통해 증폭하였다. 상기의 PCR을 위하여 국제유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 제 FJ231524.1호로 등록된 APMV-7 HN 유전자의 ORF 전체를 구성하는 1,710개의 핵산 전체가 포함되도록 1,722개의 핵산이 증폭되도록 하기 표 1 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 합성 DNA 절편, 서열번호 2의 정방향 프라이머(forward primer), 서열번호 3의 역방향 프라이머(reverse primer) 및 PCR premix kit (주식회사 바이오니아)로 제조사의 권장방법에 따라 실시하였다. PCR 반응은 98℃에서 10초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초를 1 사이클로 하여 PCR 증폭기 (PE 9600;Perkin Elmer)에서 35 사이클 반복하여 PCR 증폭을 실시하였고, 마지막으로 72℃에서 5분간 DNA 합성을 실시하였다. The DNA fragment of APMV-7 HN gene synthesized in Example 1 was amplified by polymerase chain reaction (PCR). For the above PCR, 1,722 nucleic acids were amplified so that the entire 1,710 nucleic acids constituting the entire ORF of the APMV-7 HN gene registered with the NCBI (Genbank) registration number FJ231524.1 were included. Table 1 Primer Were used for PCR. PCR was carried out according to the manufacturer's recommendation using a synthetic DNA fragment, a forward primer of SEQ ID NO: 2, a reverse primer of SEQ ID NO: 3, and a PCR premix kit (Biona Co., Ltd.). PCR was performed by repeating 35 cycles of PCR amplification (PE 9600; Perkin Elmer) with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute and 30 seconds. Finally, 72 ° C For 5 minutes.

염기서열            Base sequence 서열번호   SEQ ID NO: APMV-7 HN 정방향 프라이머 APMV-7 HN forward primer 5`-GAA TTC ATG GAG TCA ATC GGG-3' 5`-GAA TTC ATG GAG TCA ATC GGG-3 ' 22 APMV-7 HN 역방향 프리이머 APMV-7 HN Reverse Preamer 5`-CTC GAG CTA GCT CAT AAT ACT-3`5'-CTC GAG CTA GCT CAT AAT ACT-3` 33

상기에서 증폭된 DNA 절편은 아가로오스 겔 (agarose gel)에서 전기영동을 실시한 후, 증폭된 약 1.7kb에 해당하는 유전자 증폭 산물을 겔로부터 추출하여 pGEM-T 벡터에 삽입하였다. 삽입된 APMV-7 HN 유전자 절편은 자동염기서열분석기(ABI 377, USA)를 사용하여 염기서열 분석을 실시하여 유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 제 FJ231524.1로 공개되어 있는 염기서열과 비교 분석함으로서 HN 유전자 DNA의 올바른 삽입여부를 확인하였다. 증폭된 DNA 절편의 전기영동 결과를 도 1에 나타내었다.The DNA fragment thus amplified was subjected to electrophoresis on agarose gel, and the gene amplification product corresponding to about 1.7 kb amplified was extracted from the gel and inserted into pGEM-T vector. The inserted APMV-7 HN gene fragment was sequenced using an automatic nucleotide sequencer (ABI 377, USA) and compared with the nucleotide sequence disclosed in NCBI, Genbank Registration No. FJ231524.1 And confirmed the correct insertion of HN gene DNA. The electrophoresis results of the amplified DNA fragments are shown in Fig.

도 1에 나타난 바와 같이, 증폭된 HN 유전자가 pGEM-T 벡터에 삽입됨을 확인하였다.
As shown in FIG. 1, it was confirmed that the amplified HN gene was inserted into the pGEM-T vector.

실시예Example 3.  3. APMVAPMV -7 -7 HNHN 유전자 전이벡터의 제작 Production of gene transfer vector

APMV-7 HN 유전자 전이벡터를 제작하기 위하여, 상기 실시예 2의 pGEM-T 재조합 벡터를 EcoRI 및 XhoI 제한효소로 처리하여, APMV-7 HN 유전자 절편을 추출한 후, T4 리가아제(ligase; Promega)를 이용하여 같은 제한 효소로 처리한 pFastBacTM 전이 벡터(transfer vector)에 삽입하였다. 그 후 재조합 전이벡터는 TOP10 완전 세포(compentent cell; Invitogen)에 형질전환 시킨 후, 생성된 흰색 콜로니를 선택하여 LB broth에서 배양하였다. 이 후, 증식된 대장균을 수거하여 재조합 pFastBacTM 전이벡터 플라스미드를 추출하였다. 그 후 재조합 전이벡터는 EcoRI 및 XhoI 제한효소로 처리하여 APMV-7 HN 유전자 삽입여부를 확인하였으며, 이를 도 2에 나타내었다.To prepare the APMV-7 HN gene transfer vector, the pGEM-T recombinant vector of Example 2 was treated with EcoR I and Xho I restriction enzymes, and the APMV-7 HN gene fragment was extracted and ligated with T4 ligase. Promega) was inserted into the transfer vector, pFastBac TM (transfer vector) was treated with the same restriction enzymes using a. The recombinant transfer vector was then transformed into TOP10 complete cells (Invitogen), and the resulting white colonies were selected and cultured in LB broth. Thereafter, the collected E. coli proliferation was extracted recombinant plasmid transfer vector pFastBac TM. Thereafter, the recombinant transfer vector was treated with restriction enzymes EcoR I and Xho I to confirm the insertion of the APMV-7 HN gene, which is shown in FIG.

도 2에 나타난 바와 같이, 전이벡터에 APMV-7 HN 유전자가 잘 삽입되었음을 확인하였다.
As shown in FIG. 2, it was confirmed that the APMV-7 HN gene was inserted well into the transfer vector.

실시예Example 4.  4. APMVAPMV -7 -7 HNHN 유전자를 포함하는 재조합  Recombination involving genes 베큘로바이러스Baculovirus 셔틀벡터 제작 Shuttle vector production

APMV-7 HN 유전자 절편이 삽입된 재조합 pFastBacTM 전이 벡터를 DH10BacTM 완전 세포(invitrogen)에 형질전환시켜 베큘러바이러스 셔틀 벡터(Baculovirus shuttle vector)인 bacmid에 폴리헤드린 프로모터(polyhedrin promoter) 및 HN 유전자 절편을 포함하는 부위를 전위(transposition)시켰다. X-gal이 처리된 LB 아가에서 2~3일 배양한 후, 흰색 콜로니를 선택하여 LB broth에 배양한 다음 mini prep으로 재조합 Bacmid를 추출하였다. 추출된 Bacmid 벡터는 상기 실시예 1의 PCR을 통해 APMV-7 HN 유전자가 전위(transposition)된 재조합 Bacmid를 선발하였고, 이를 도 3에 나타내었다.
APMV-7 HN polyhedrin promoters (polyhedrin promoter) and the HN gene fragment for insertion of the recombinant pFastBac TM transfer vector gene segments in the DH10Bac TM full cell was transformed to (invitrogen) chopping ocular viral shuttle vector (Baculovirus shuttle vector) bacmid Was transposed. After culturing in LB agar treated with X-gal for 2-3 days, white colonies were selected and cultured in LB broth, and then recombinant Bacmid was extracted with mini-prep. The extracted Bacmid vector was selected from the recombinant Bacmid transposing the APMV-7 HN gene through the PCR of Example 1, which is shown in FIG.

실시예Example 5.  5. APMVAPMV -7 -7 HNHN 유전자를 발현하는 재조합  Recombination expressing the gene 베큘로바이러스의Baculovirus 제조 Produce

APMV-7 HN 단백질을 생산하는 재조합 베큘로바이러스(baculovirus)를 제조하기 위하여, APMV-7 HN 유전자를 함유하는 재조합 Bacmid와 베큘로바이러스 (Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus; AcMNPV) DNA를 이용하여 Sf9(Spodoptera frugiperda ) 세포에 형질감염(transfection)시켰다. 그 후 Sf9 세포를 28℃에서 5일 동안 배양한 다음 세포와 배양액을 수거하여 70% 단층을 형성한 Sf9 세포에 다시 접종하여 28℃에서 5일 배양하는 방법으로 3대 계대 배양하였다. Sf9 세포에서 재조합바이러스의 특징적인 세포변성효과를 확인하고 세포변성효과가 있을 경우 세포를 수거하여 삽입된 실시예 1의 PCR로 재조합 베큘로바이러스 작성여부를 확인하였다. 재조합 베큘로바이러스는 플라크 시험법(Plaque Assay)을 실시하여 APMV-7 HN 단백질을 발현하는 재조합 베큘로바이러스를 순수 분리하여 rBac/APMV-7HN라고 명명하였다. 도 4는 재조합 베큘로바이러스에 의해 곤충세포에서 APMV-7 HN 단백질이 발현됨을 APMV-7 표준면역혈청을 사용하여 형광항체법으로 확인한 도이며, 도 5는 제작한 재조합 베큘로바이러스내 APMV-7 HN 유전자 삽입 여부를 PCR로 확인한 도이다.To prepare recombinant baculovirus producing APMV-7 HN protein, recombinant Bacmid containing APMV-7 HN gene and Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) Spodoptera frugiperda) were infected (transfection) traits in cells. Then, Sf9 cells were cultured at 28 ° C for 5 days, and the cells and the culture solution were collected and re-seeded into Sf9 cells formed with 70% monolayer, followed by incubation at 28 ° C for 5 days. The characteristic cytopathic effect of the recombinant virus was confirmed in Sf9 cells. When the cell degeneration effect was observed, cells were harvested and confirmed by the PCR of the inserted Example 1 to prepare recombinant baculovirus. Recombinant baculovirus was subjected to a plaque assay and the recombinant baculovirus expressing the APMV-7 HN protein was purified and named rBac / APMV-7HN. FIG. 4 is a graph showing the expression of APMV-7 HN protein in insect cells by recombinant baculovirus using the APMV-7 standard immunized serum by fluorescent antibody method, and FIG. 5 shows the results of the APMV- HN gene insertion by PCR.

도 4에 나타난 바와 같이, 상기 재조합 베큘로바이러스에서, APMV-7 HN 단백질이 발현됨을 확인하였다.As shown in FIG. 4, it was confirmed that APMV-7 HN protein was expressed in the recombinant baculovirus.

도 5에 나타난 바와 같이, 재조합 베큘로바이러스 내에 APMV-7 HN 유전자가 삽입되었음을 확인하였다.As shown in FIG. 5, it was confirmed that the APMV-7 HN gene was inserted into the recombinant baculovirus.

실시예Example 6. 재조합  6. Recombination APMVAPMV -7 -7 HNHN 단백질의 생산 Production of protein

상기 실시예 5의 재조합 베큘로바이러스(rAPMV-7 HN)를 감염시킨 Sf9 곤충세포에서 재조합 APMV-7 HN (rAPMV-7HN) 단백질을 생산 추출한 다음 진단 항원으로 제조하는 과정은 하기와 같다. The recombinant APMV-7 HN (rAPMV-7HN) protein was produced and extracted from Sf9 insect cells infected with the recombinant baculovirus (rAPMV-7 HN) of Example 5, and then prepared as a diagnostic antigen.

재조합 APMV-7 HN 단백질을 함유한 진단 항원은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 즉, 조직배양 플라스크 내 배양된 Sf9 곤충세포에 0.1 MOI 농도의 재조합 베큘로바이러스 rBac/APMV-7HN를 감염시켜 27℃에서 4일간 배양하였다. 그 후, 세포변성효과가 관찰되면 감염 곤충세포를 수확하여 50 ml 코니칼 원심튜브에 첨가하였다. 그 후 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 침전시키고 배양 배지의 1/100 농도의 PBS를 첨가하여 회수한 다음 초음파기로 200V에서 2분간 분쇄하였다. 분쇄후 8,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 세포추출액으로 회수하여 진단 항원으로 사용하였다. 이 같은 방법으로 50ml 곤충세포배양액으로 약 10ml의 항원을 제조하였다. 이때 제조한 항원은 0.5ml씩 분병하여 실험에 사용하기 전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다. 신규 뉴캐슬병 항원진단액의 항원 정량은 V-bottom 96 well microplate에서 혈구응집반응(HA)법을 사용하여 HN 단백질량을 측정하였다.
The diagnostic antigen containing the recombinant APMV-7 HN protein was prepared by the following method. Namely, Sf9 insect cells cultured in a tissue culture flask were infected with recombinant baculovirus rBac / APMV-7HN at a concentration of 0.1 MOI and cultured at 27 ° C for 4 days. Thereafter, when the cytopathic effect was observed, the infected insect cells were harvested and added to a 50 ml conical centrifuge tube. The cells were then centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to precipitate the cells. The cells were recovered by adding PBS at a concentration of 1/100 of the culture medium and then pulverized at 200 V for 2 minutes using an ultrasonic machine. After pulverization, the supernatant was centrifuged at 8,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was recovered as a cell extract and used as a diagnostic antigen. In this way, about 10 ml of antigen was prepared with 50 ml insect cell culture. At that time, the prepared antigen was dispensed in 0.5 ml portions and stored in a -70 ° C freezer until used in the experiment. Antigen quantification of new Newcastle Disease antigen was performed by using hemagglutination (HA) method on the V-bottom 96-well microplate.

실시예Example 7. 재조합  7. Recombination APMVAPMV -7 -7 HNHN 단백질에 대한 면역혈청 제조 Preparation of Immune Serum for Protein

재조합 APMV-7 HN 단백질(rAPMV-7HN) 제조항원으로 APMV-7 면역혈청을 제조하였다. 우선 rAPMV-7HN 단백질 항원을 211~12 HAU로 조정하여 ISA70(SEPPIC, France)과 3:7 비율로 혼합하여 백신을 제조하였다. 그후 제조한 백신을 4주령 SPF 닭 9수에 3주 간격으로 마리당 0.5ml씩 2회 근육으로 접종한 뒤 2차 접종 3주 후에 전 채혈하여 혈청을 분리하여 면역혈청을 생산하였다. 제조한 면역혈청은 rAPMV-7HN HI 단백질 항원을 사용하여 HI반응법으로 항체를 정량하여 27이상의 HI 역가를 보이는 혈청을 선발하여 면역혈청으로 사용하였다. rAPMV-7HN 단백질 항원으로 면역한 닭의 개체별 HI 항체 역가를 측정한 결과를 표 2에 나타내었다.
APMV-7 immunized serum was prepared as a recombinant APMV-7 HN protein (rAPMV-7HN) preparation antigen. First, the rAPMV-7HN protein antigen was adjusted to 2 11 to 12 HAU and mixed with ISA70 (SEPPIC, France) at a ratio of 3: 7 to prepare a vaccine. Subsequently, the vaccine was inoculated into 9-week-old SPF chickens at intervals of 3 weeks with 0.5 ml / mouse twice a day. After 3 weeks of the second inoculation, whole blood was collected and serum was separated to produce immunized serum. Antibodies were quantitated by the HI method using rAPMV-7HN HI protein antigen, and the sera showing HI titer of 2 7 or more were selected and used as immunity sera. Table 2 shows the result of measurement of the individual HI antibody titer of chicken immunized with rAPMV-7HN protein antigen.

개체별 HI 항체 역가(log2)HI antibody titer by individual (log2) 1One 22 33 44 55 66 77 88 99 77 88 77 88 88 88 77 88 44

(검사항원은 모두 4 HA unit 항원을 사용하였음)
(All 4 HA unit antigens were used as test antigens)

시험예Test Example 1.  One. rAPMVrAPMV -7-7 HNHN 단백질 항원에 특성 조사 Characterization of protein antigens

1. One. rAPMVrAPMV -7-7 HNHN 단백질의 열에 대한 안정성 Stability of proteins against heat

재조합 베큘러바이러스 감염 곤충세포에서 발현된 HN 단백질의 열에 대한 안정성을 조사하였다. 발현된 단백질을 각각 56℃에서 5분, 10분, 20분 및 30분 처리한 후 혈구 응집능을 처리 전과 비교하여 30분 후에도 혈구응집능이 유지되면 열안정성(heat stable), 그렇치 않을 경우 열 불안정성(heat-labile)로 분류하였다. 뉴캣슬병바이러스(APMV-1) 라소타 균주를 대조바이러스로 하였다. 이의 결과를 표 3에 나타내었다.The stability of HN protein expressed in recombinant Bacillus virus-infected insect cells was examined. After the expressed proteins were treated at 56 ° C for 5 minutes, 10 minutes, 20 minutes and 30 minutes, the hemagglutinating ability was compared with that before the treatment, and if the hemagglutinating ability was maintained after 30 minutes, the heat stable, (heat-labile). Newcastle disease virus (APMV-1) lasota strain was used as a control virus. The results are shown in Table 3.

항원
antigen
56℃ 열처리 시간대별 HA 역가56 ℃ Heat treatment time 결과
result
0분0 minutes 5분5 minutes 10분10 minutes 20분20 minutes 30분30 minutes rAPMV-7HNrAPMV-7HN 256256 128128 6464 6464 6464 안정(stable)Stable APMV-1(LaSota)APMV-1 (LaSota) 512512 00 00 00 00 불안정(labile)Unstable (labile)

표 3에서 나타난 바와 같이, rAPMV-7HN 단백질 항원은 열안정성(heat stable)이 있는 것으로 분류되었다. As shown in Table 3, the rAPMV-7HN protein antigen was classified as having heat stability.

2.2. rAPMVrAPMV -7-7 HNHN 단백질의 적혈구 해리 양상 Red blood cell dissociation pattern of protein

rAPMV-7HN 단백질의 적혈구응집 해리 양상을 조사하였다. 혈구응집 해리 양상은 혈구응집 반응 1시간 후의 HA 역가와 24시간 후의 HA 역가를 비교하여 24시간 이후에 완전히 해리가 일어났을 경우, 빠른 용출(rapid elution), 그렇치 않을 경우 느린 용출(slow elution)로 분류하였다. 뉴캣슬병바이러스(APMV-1) 라소타 균주를 대조바이러스로 하였다. 이의 결과를 표 4에 나타내었다.
The erythrocyte aggregation dissociation pattern of rAPMV-7HN protein was investigated. The hemagglutination dissociation pattern was compared with the HA activity after 1 hour of hemagglutination reaction and 24 hours after the hemagglutination reaction. When complete dissociation occurred after 24 hours, rapid elution or slow elution Respectively. Newcastle disease virus (APMV-1) lasota strain was used as a control virus. The results are shown in Table 4.

구분division HA역가HA station 판정Judgment 1기간 후After 1 period 24시간 후After 24 hours rAPMV-7rAPMV-7 256256 256256 느림Slow NDV(LaSota)NDV (LaSota) 512512 256256 느림Slow

표 4에서 나타난 바와 같이, rAPMV-7HN 단백질 항원은 느린 용출 양상을 보임을 확인하였다.
As shown in Table 4, the rAPMV-7HN protein antigen was found to exhibit a slow dissolution profile.

3. 재조합 3. Recombination APMVAPMV -7 -7 HNHN 발현단백질의Of expression protein 전자현미경 관찰 Electron microscope observation

재조합 베큘로바이러스를 감염시킨 Sf9 곤충세포로부터 추출하여 rAPMV-7HN 단백질의 입자를 전자현미경으로 관찰하였다. 즉 재조합 베큘로바이러스 감염 Sf9 세포를 3일 내지 5일 동안 배양한 다음 세포를 수거하여 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 침전시키고 배양 배지의 1/100 농도의 PBS를 첨가하여 회수한 다음 초음파기로 200V에서 2분간 분쇄한 후 8,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 그 후, 4% 인텅스텐 산(phosphotungstic acid)으로 음성 염색(negative staining)하여 전자현미경(LEO 912 AB OMEGA, Carl Zeiss)으로 120 kV로 50,000배 확대하여 관찰하였다. 이의 결과를 도 6에 나타내었다.The particles of rAPMV-7HN protein were observed by electron microscopy after extraction from Sf9 insect cells infected with recombinant baculovirus. That is, the recombinant baculovirus-infected Sf9 cells were cultured for 3 to 5 days, and then the cells were harvested and centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to precipitate the cells. The cells were collected by adding 1/100 concentration of PBS to the culture medium, For 2 minutes at 200 V and then centrifuged at 8,000 rpm for 10 minutes to collect the supernatant. After that, negative staining was performed with 4% phosphotungstic acid and observed with an electron microscope (LEO 912 AB OMEGA, Carl Zeiss) at 50,000 magnification at 120 kV. The results are shown in Fig.

도 6에서 보는 바와 같이, 재조합 베큘로바이러스 감염 Sf9 세포에서는 직경이 약 50~100 nm 구형의 바이러스 유사 입자가 다수 관찰됨을 확인하였고, 이들 입자의 외피막에는 바늘모양의 돌출 구조를 가지고 있다. APMV 유사 바이러스 입자 이외에도 폭이 약 60 nm와 길이가 약 375 nm인 직사각형 모양의 베큘로바이러스 입자도 관찰됨을 확인하였다.
As shown in FIG. 6, it was confirmed that virus-like particles having a diameter of about 50 to 100 nm were observed in the recombinant baculovirus-infected Sf9 cells, and the outer coating of these particles has a needle-like protruding structure. In addition to APMV-like viral particles, it was also confirmed that rectangular-shaped baculovirus particles having a width of about 60 nm and a length of about 375 nm were observed.

시험예Test Example 2.  2. rAPMVrAPMV -7-7 HNHN 단백질 항원의 특이성 조사 Investigation of protein antigen specificity

rAPMV-7HN 단백질의 APMV-7 면역혈청에 대한 특이성을 조사하였다. 이를 위하여 미국 국립수의검사소(National Veterinary Service Laboratories; NVSL)로부터 구입한 APMV 혈청형별 표준면역혈청을 사용하였다. 대조 APMV-7 항원으로 미국 NVSL에서 구입한 APMV-7 바이러스 항원을 사용하였다. rAPMV-7HN 단백질의 APMV-7 면역혈청에 대한 특이성 확인 결과를 표 5에 나타내었다.The specificity of rAPMV-7HN protein for APMV-7 immunity sera was examined. For this purpose, a standard immunized serum according to APMV serotype purchased from National Veterinary Service Laboratories (NVSL) was used. As the control APMV-7 antigen, APMV-7 virus antigen purchased from NVSL of USA was used. The specificity of the rAPMV-7HN protein for the APMV-7 immunity sera is shown in Table 5.

사용 항원* Used antigen * APMV 혈청형 면역혈청에 대한 HI 역가 (log2)HI titer (log 2) for APMV serotype immunity sera APMV-1APMV-1 APMV-2APMV-2 APMV-3APMV-3 APMV-4APMV-4 APMV-6APMV-6 APMV-7APMV-7 APMV-8APMV-8 APMV-9APMV-9 rAPMV-7HN rAPMV-7HN 22 33 22 1One 22 77 00 22 APMV-7항원APMV-7 antigen 1One 33 33 00 22 66 00 44

* 사용항원은 4 HA unit로 조정하여 HI 반응용 항원으로 사용하였음* Used antigen was adjusted to 4 HA unit and used as antigen for HI reaction

표 5에 나타난 바와 같이, rAPMV-7HN 단백질 항원은 종래의 APMV-7항원과 마찬가지로 APMV-7 면역혈청과 가장 높은 항체역가를 보였다. 그러나, rAPMV-7HN 단백질 항원은 종래의 APMV-7항원과 마찬가지로 APMV-1, APMV-3, APMV-7 표준면역혈청에 대한 낮은 수준의 교차반응을 나타내었다. 이 결과는 APMV-7 표준항원의 검사 성적과 차이를 보이지 않아 APMV-7 진단항원으로 사용할 수 있다는 것을 나타낸다.
As shown in Table 5, the rAPMV-7HN protein antigen showed the highest antibody titer with the APMV-7 immunity serum as in the case of the conventional APMV-7 antigen. However, the rAPMV-7HN protein antigen showed a low level of cross-reactivity to the APMV-1, APMV-3 and APMV-7 standard immunized sera as in the case of the conventional APMV-7 antigen. These results show that the test results do not differ from those of the APMV-7 standard antigen and thus can be used as the APMV-7 diagnostic antigen.

시험예Test Example 3.  3. rAPMVrAPMV -7-7 HNHN 단백질 항원으로 제조한 면역혈청의 특이성 조사 Investigation of the specificity of immunological sera prepared with protein antigen

1. 면역혈청이 1. Immune serum APMVAPMV -7 항원에 대한 특이성 확인-7 Identification of specificity for antigen

상기 rAPMV-7 HN(베큘러 바이러스 유래의 APMV-7 HN) 단백질 항원을 닭에 면역시켜 생산한 면역혈청(상기 실시예 7)이 APMV-7 항원에 대한 특이성을 가지고 있는지 조사하였다. 상기 실시예 7에서 생산한 면역혈청 9점의 HI역가를 종래의 APMV-7 항원과 베큘러바이러스 유래의 APMV-7 HN 단백질 항원을 가지고 각각 측정하였다. The immunological sera (Example 7) produced by immunizing chickens with the rAPMV-7 HN (APMV-7 HN) protein antigen derived from pemetrexed virus were examined for specificity to the APMV-7 antigen. The HI titer of 9 immunoserum samples produced in Example 7 was measured with conventional APMV-7 antigen and APMV-7 HN protein antigen derived from Becker virus.

검사항원* Test antigen * 개체별 HI 항체 역가(log2)HI antibody titer by individual (log2) 1One 22 33 44 55 66 77 88 99 rAPMV-7HNrAPMV-7HN 77 88 77 88 88 88 77 88 44 APMV-7항원APMV-7 antigen 77 88 77 88 77 88 77 88 33

(검사항원은 모두 4 HA unit 항원을 사용하였음)
(All 4 HA unit antigens were used as test antigens)

표 6에서 나타난 바와 같이, 두 항원간의 면역혈청별 HI 역가는 0.97의 높은 상관계수(r)를 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과는 rAPMV-7HN 단백질 항원으로 제조한 면역혈청도 종래의 APMV-7 바이러스항원으로 제조한 면역혈청을 대체하여 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.
As shown in Table 6, it was confirmed that the HI level of the immunity sera between the two antigens showed a high correlation coefficient (r) of 0.97. These results confirm that the immunized sera prepared with the rAPMV-7HN protein antigen can be used as an alternative to the immunity sera prepared with the conventional APMV-7 viral antigen.

2. 면역혈청이 2. Immune serum 조류유래Algae origin 다른 병원체와 교차 반응 확인 Identify cross-reactivity with other pathogens

rAPMV-7HN 단백질 항원으로 제조한 면역혈청이 조류 유래 다른 병원체와 교차 반응이 나타나는 지를 조사하였다. 이의 결과를 표 7에 나타내었다.
We investigated whether the immunological sera prepared with rAPMV-7HN protein antigen cross react with other pathogenic agents from algae. The results are shown in Table 7.

생산
혈청production
serum 검사
질병inspection
disease 검사
방법inspection
Way 개체별 항혈청의 검사결과Test results of antiserum by individual 1One 22 33 44 55 66 77 88 99 rAPMV-7 HN 혈청rAPMV-7 HN serum IBIB HIHI 00 00 00 00 00 00 00 00 00 EDSEDS HIHI 00 00 00 00 00 00 00 00 00 AIAI ELISAELISA 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice MGMG ELISAELISA 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice MSMS ELISAELISA 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice aMPVaMPV ELISAELISA 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice IBDIBD ELISAELISA 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice SPSP SPASPA 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice 음성voice

표 7에서 나타난 바와 같이, 닭전염성기관지염(Infectious bronchitis; IB), 닭 산란저하증(egg drop syndrome; EDS), 조류인플루엔자 (avian influenza; AI), 마이코플라즈마 갈리나룸(Mycoplasma gallicepticum; MG), 마이코플라즈마 시노비애(Mycoplasma synoviae; MS), 조류메타뉴모바이러스(avian metapneumovirus; aPMV), 닭전염성F낭병(infectious bursal disease; IBD), 추백리(Salmonella Pullroum; 추백리) 등 8종의 다른 조류질병 병원체에 대하여 모두 음성반응을 보임을 확인하였다.
Infectious bronchitis (IB), egg drop syndrome (EDS), avian influenza (AI), Mycoplasma gallicepticum (MG), mycoplasma All eight other avian pathogens, including Mycoplasma synoviae (MS), avian metapneumovirus (aPMV), infectious bursal disease (IBD), and Salmonella pullroum Negative reaction was observed.

시험예Test Example 4.  4. rAPMVrAPMV -7 -7 HNHN 단백질 항원의 야외적용 시험 Field application test of protein antigen

국내 5개 가금(닭) 농장유래 혈청 49점을 대상으로 rAPMV-7HN 단백질 항원으로 HI 항체검사를 실시하였다. 검사결과는 종래의 APMV-7 바이러스항원(미국 NVSL 제공)으로 검사한 결과와 비교하였다. 이의 결과를 도 7에 나타내었다A total of 49 sera from 5 domestic poultry farms were tested for HI antibody as rAPMV-7HN protein antigen. The test results were compared with those of conventional APMV-7 viral antigens (US NVSL provided). The results are shown in Figure 7

도 7에서 나타낸 바와 같이, 두 항원간의 면역혈청별 HI 역가는 거의 유사한 양상을 보였으며, 높은 상관계수(r=0.80)를 나타냄을 확인하였다.
As shown in FIG. 7, the HI level of the immunized sera between the two antigens was almost similar, and it was confirmed that the correlation coefficient (r = 0.80) was high.

<110> REPUBLIC OF KOREA (Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries.Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency (QIA) ) <120> Avian paramyxovirus type 7 recombinant hemagglutinin-neuraminidase protein expressed by baculovirus and diagnostic method for Avian paramyxovirus type 7 using the same <130> 1-42P <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1722 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> it is DNA sequence coding hemagglutinin-neuraminidase protein of Avian paramyxovirus type 7 <400> 1 gaattcatgg agtcaatcgg gaaaggaacc tggagaactg tgtatagagt ccttacgatt 60 ctattagatg tagtgatcat tattctctct gtgattgctc tgatttcatt gggtctgaag 120 ccaggtgaga ggatcatcaa tgaagtcaat ggatctatcc ataatcaact tgttccctta 180 tcggggatta cttccgatat tcaggcaaaa gtcagcagca tatatcggag caacttgcta 240 agtatcccac tacaacttga tcaaatcaac caggcaatat catcatctgc taggcaaatt 300 gctgatacaa tcaactcgtt tctcgctctg aatggcagtg gaacttttat ttatacaaat 360 tcacctgagt ttgcaaatgg tttcaataga gcaatgttcc caaccctaaa tcaaagctta 420 aatatgctaa cacctggtaa tctaattgaa tttactaatt ttattccaac tccaacaaca 480 aaatcaggat gtatcagaat accatcattt tcaatgtcat caagtcactg gtgttatacc 540 cataatatca ttgctagtgg atgtcaggat cattcaacca gtagtgaata catatcgatg 600 ggggttgttg aagtgactga tcaggcttac ccgaactttc ggacaactct ttctattaca 660 ttagctgata atctaaacag aaagtcatgt agcattgcag caactgggtt cgggtgtgat 720 atattatgta gtgttgtcac tgagacagaa aatgatgatt atcaatcacc agaaccgact 780 cagatgatct atggaagatt attttttaat ggcacatatt cagagatgtc attgaatgtg 840 aaccaaatgt tcgcagattg ggttgcaaat tatccagcag ttggatcagg agtagagtta 900 gcagattttg tcattttccc actctatgga ggtgttaaaa tcacttcaac cctaggagca 960 tctttaagcc agtattacta tattcccaag gtgcccacag tcaattgctc tgagacagat 1020 gcacaacaaa tagagaaggc aaaagcatcc tattcaccac ctaaagtggc tccaaatatc 1080 tgggctcagg cagtcgttag gtgcaataaa tctgttaatc ttgcaaattc atgtgaaatt 1140 ctgacattta acactagcac tatgatgatg ggtgctgagg gaagactctt gatgatagga 1200 aagaatgtat acttttatca acgatctagt tcgtattggc cagtgggaat tatatataaa 1260 ttagatctac aagaattgac aacattttca tcaaatcaat tgctgtcaac aataccaatt 1320 ccatttgaga aattccctag acctgcatct actgctggtg tatgttcaaa accaaatgtg 1380 tgtcctgcag tatgccagac tggtgtttat caagatctct gggtactata tgatcttggc 1440 aaattagaaa ataccacagc agtaggattg tatctaaact cagcagtagg ccgaatgaac 1500 ccttttattg ggattgcaaa tacgctatct tggtataata caactagatt attcgcacag 1560 ggtactccag catcatattc aacaacgacc tgcttcaaaa atactaagat tgacacggca 1620 tactgcttat caatattaga attaagtgat tctttgttag gatcatggag aattacacca 1680 ttattgtaca atatcacttt aagtattatg agctagctcg ag 1722 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> it is forward primer for APMV-7 HN gene <400> 2 gaattcatgg agtcaatcgg g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> it is reverse primer for APMV-7 HN gene <400> 3 ctcgagctag ctcataatac t 21 <110> REPUBLIC OF KOREA (Management: Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries.Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency (QIA)) <120> Avian paramyxovirus type 7 recombinant          hemagglutinin-neuraminidase protein expressed by baculovirus and          diagnostic method for Avian paramyxovirus type 7 using the same <130> 1-42P <160> 3 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 1722 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> it is DNA sequence coding hemagglutinin-neuraminidase protein of          Avian paramyxovirus type 7 <400> 1 gaattcatgg agtcaatcgg gaaaggaacc tggagaactg tgtatagagt ccttacgatt 60 ctattagatg tagtgatcat tattctctct gtgattgctc tgatttcatt gggtctgaag 120 ccaggtgaga ggatcatcaa tgaagtcaat ggatctatcc ataatcaact tgttccctta 180 tcggggatta cttccgatat tcaggcaaaa gtcagcagca tatatcggag caacttgcta 240 agtatcccac tacaacttga tcaaatcaac caggcaatat catcatctgc taggcaaatt 300 gctgatacaa tcaactcgtt tctcgctctg aatggcagtg gaacttttat ttatacaaat 360 tcacctgagt ttgcaaatgg tttcaataga gcaatgttcc caaccctaaa tcaaagctta 420 aatatgctaa cacctggtaa tctaattgaa tttactaatt ttattccaac tccaacaaca 480 aaatcaggat gtatcagaat accatcattt tcaatgtcat caagtcactg gtgttatacc 540 cataatatca ttgctagtgg atgtcaggat cattcaacca gtagtgaata catatcgatg 600 ggggttgttg aagtgactga tcaggcttac ccgaactttc ggacaactct ttctattaca 660 ttagctgata atctaaacag aaagtcatgt agcattgcag caactgggtt cgggtgtgat 720 atattatgta gtgttgtcac tgagacagaa aatgatgatt atcaatcacc agaaccgact 780 cagatgatct atggaagatt attttttaat ggcacatatt cagagatgtc attgaatgtg 840 aaccaaatgt tcgcagattg ggttgcaaat tatccagcag ttggatcagg agtagagtta 900 gcagattttg tcattttccc actctatgga ggtgttaaaa tcacttcaac cctaggagca 960 tctttaagcc agtattacta tattcccaag gtgcccacag tcaattgctc tgagacagat 1020 gcacaacaaa tagagaaggc aaaagcatcc tattcaccac ctaaagtggc tccaaatatc 1080 tgggctcagg cagtcgttag gtgcaataaa tctgttaatc ttgcaaattc atgtgaaatt 1140 ctgacattta acactagcac tatgatgatg ggtgctgagg gaagactctt gatgatagga 1200 aagaatgtat acttttatca acgatctagt tcgtattggc cagtgggaat tatatataaa 1260 ttagatctac aagaattgac aacattttca tcaaatcaat tgctgtcaac aataccaatt 1320 ccatttgaga aattccctag acctgcatct actgctggtg tatgttcaaa accaaatgtg 1380 tgtcctgcag tatgccagac tggtgtttat caagatctct gggtactata tgatcttggc 1440 aaattagaaa ataccacagc agtaggattg tatctaaact cagcagtagg ccgaatgaac 1500 ccttttattg ggattgcaaa tacgctatct tggtataata caactagatt attcgcacag 1560 ggtactccag catcatattc aacaacgacc tgcttcaaaa atactaagat tgacacggca 1620 tactgcttat caatattaga attaagtgat tctttgttag gatcatggag aattacacca 1680 ttattgtaca atatcacttt aagtattatg agctagctcg ag 1722 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> it is forward primer for APMV-7 HN gene <400> 2 gaattcatgg agtcaatcgg g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> it is reverse primer for APMV-7 HN gene <400> 3 ctcgagctag ctcataatac t 21

Claims (11)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 조류파라믹소바이러스-7(Avian paramyxovirus-7)의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 유전자를 포함하는, 베큘러바이러스 발현벡터가 형질도입된 곤충 세포가 발현하는 재조합 HN 단백질;을 포함하는, 조류파라믹소바이러스-7 진단용 조성물.A HN (hemagglutinin-neuraminidase) gene of avian paramyxovirus-7 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a recombinant HN Protein, &lt; / RTI &gt; 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 조류파라믹소바이러스-7의 HN 유전자를 포함하는, 베큘러바이러스 발현벡터가 형질도입된 곤충 세포가 발현하는 재조합 HN 단백질;을 포함하는, 조류파라믹소바이러스-7 진단 키트.A recombinant HN protein expressing an insect cell transfected with a Baculovirus expression vector comprising the HN gene of a bird parmyx virus-7 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 7 Diagnostic Kit. 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 조류파라믹소바이러스-7의 HN 유전자를 포함하는, 베큘러바이러스 발현벡터가 형질도입된 곤충 세포가 발현하는 재조합 HN 단백질;을 이용한 항원-항체반응을 통해 시료 내에서 조류파라믹소바이러스-7을 검출하는 것을 특징으로 하는, 조류파라믹소바이러스-7의 검출방법.A recombinant HN protein expressing an insect cell transfected with a Baculovirus expression vector containing the HN gene of a bird paramiemovirus-7 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 7. A method for the detection of avian paramyxovirus-7. 제 9항에 있어서, 상기 항원-항체 반응은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로 부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 조류파라믹소바이러스-7의 검출방법.
The method of claim 9, wherein the antigen-antibody reaction is selected from the group consisting of tissue immunostaining, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), Western blotting, immunoprecipitation assay, immunodiffusion assay Characterized in that the method is carried out using at least one method selected from the group consisting of Assay, Complement Fixation Assay, Fluorescence-activated cell sorter (FACS) and protein chip analysis. Method for detecting Myxovirus-7.
제 9항에 있어서, 상기 시료는 조류파라믹소바이러스-7로 감염된 것으로 예상되거나 감염된 세포, 혈액, 소변, 타액 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조류파라믹소바이러스-7의 검출방법.









10. The method according to claim 9, wherein the sample is at least one selected from the group consisting of cells, blood, urine, saliva and tissues expected to be infected with or infected with avian paramyxovirus-7. Detection method.









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Silvina Chimeno Zoth 등. CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY. Vol. 16, No. 5, 페이지 775-778 (2009) *
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