KR101462463B1 - 수련뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

수련뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수련뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물의 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 수련뿌리 추출물, 이의 분획물은 대사성 질환을 유발하는 글리세롤-3-포스페이트(glycerol-3-phosphate, GPAT)의 활성을 효과적으로 억제하고, 세포 내의 중성지방의 생합성 저해 활성, 골격근 세포에서의 인슐린 의존적 포도당 섭취(glucose uptake) 증대 활성을 나타내므로, 수련뿌리 추출물 및 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver) 등의 대사성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

수련뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition containing Nymphaea tetragona extract, fractions thereof or isolated polyphenolic compounds for prevention or treatment of metabolic disease}
본 발명은 수련뿌리 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver) 등의 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
중성지방의 생합성은 다단계 반응으로 그 첫 단계는 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)에 의해 촉매되며, 글리세롤-3-포스페이트(glycerol-3-phosphate)의 sn-1 위치에 아실-코엔자임 에이(acyl-coenzyme A)의 형태인 지방산(fatty acyl-CoA)를 전이하여 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid, LPA)를 생성하는 에스터(ester) 반응을 촉매하며 글리세롤-3-포스페이트 경로(glycerol-3-phosphate pathway)의 속도를 조절하는 율속단계(rate-limiting step)로 알려져 있다(Bell et al, Annu Rev Biochem 49:459-487, 1980). 마지막 단계는 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(diacylglycerol acyltransferase; 이하 "DGAT")에 의해 중성지방의 생합성이 이루어진다.
현재까지 GPAT는 포유동물 조직에 4 종류의 동족체(isoenzyme)가 존재하며, N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide, NEM)에 대한 감수성과 존재하는 위치에 따라 구분된다. 즉, 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에 존재하는 GPAT3와 GPAT4는 NEM을 포함하는 설프히드릴기 시약(sulfhydryl reagent)에 대해 높은 감수성을 나타내고, 미토콘드리아 외막(mitochondrial outer membrane, MOM)에 존재하는 mtGPAT1과 mtGPAT2는 NEM에 대해 저항성을 나타내며 기질로서 포화지방산(saturated fatty acyl-CoA)를 선호하는 특징을 가진다(Gonzanlez-Baro et al. Biochim. Biophys. acta, 1771: 830-838, 2007).
mtGPAT은 인체 대부분의 조직에 있어서 전체 GPAT 활성의 약 10% 정도를 차지하고 있지만, 간 조직에서는 전체 GPAT 활성에 대하여 최대 50%까지의 활성을 차지하며, 지방조직에서도 활성이 높은 것으로 알려져 있다(Bell et al, Annu Rev Biochem 49:459-487, 1980; Lewin et al. Arch. Biochem. Biophys. 396: 119-127, 2001). 이는 mtGPAT가 지방간의 형성과 비만, 인슐린저항성 치료의 유용한 표적이 될 수 있음을 시사하고 있다.
GPAT의 4 가지 이소폼(isoform) 가운데, mtGPAT만이 식이와 운동에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 연구에 따르면 고탄수화물식이를 섭취 통해 과도한 칼로리의 이용이 가능할 때, mtGPAT의 mRNA 발현이 증가되고 그 결과 mtGPAT의 활성이 증가된다는 보고가 있으며, 이와 유사하게 꾸준하게 운동을 시킨 후 10 시간 가량 움직임 없이 방치한 마이스(mice) 군에서는 운동을 전혀 하지 않은 군의 마이스에 비해 mtGPAT의 활성이 꾸준히 증가하고 그 결과 혈중 중성지방의 합성이 유의적으로 증가한다는 결과가 보고되었다(KuMp et al. 2006).
랫(Rat)에서 mtGPAT의 간에서의 선택적인 과발현은 대조군과 비교하여 간에서의 지질 생합성이 증가하는 반면 지방산의 산화는 크게 감소하였으며, 지방간과 이상지질혈증(dyslipidemia), 인슐린 저항성이 높아졌는데, 특히 간에서의 인슐린 저항성이 크게 증가하였다(Linden et al. FASEB J, 20:434-443, 2006; Linden et al. J. Lipid Res. 45:1279-1288, 2004). 이는 간에서의 지질 대사가 인슐린 저항성의 발달에 주요하게 관여되고 있음을 의미하고 있다. 특히, 비만환자에서 지방간(fatty liver)의 발병률이 현저히 높기 때문에 mtGPAT은 비알콜성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease)과 관련된 이상지질혈증, 인슐린저항성 치료제 개발의 매력적인 분자 타겟이 될 수 있음을 시사하고 있다(Linden et al ., FASEB J, 20:434-443, 2006).
이와 관련된 연구로서, mtGPAT-결핍(mtGPAT-/-)된 마우스에 비만유도를 위해 고지방, 고당분 식이를 섭취시키면 중성지방의 합성과는 동떨어져 CPT-1과 β-산화(β-oxidation)가 활성화되며, 또한, mtGPAT-결핍(mtGPAT-/-)된 마우스는 대조군에 비해 중성지방의 함량이 간에서 37% 감소, 혈중에서는 15% 감소하였으며, 초저비중지질단백(very low density lipoprotein, VLDL)의 분비는 30% 감소되었으며, 결과적으로 마우스에서 mtGPAT-/-는 체중과 지방량의 감소 이후 인슐린 감수성이 증가함이 관찰되었다(Hammond et al, Mol Cell Biol 22:8024-8214, 2002; Hammond et al, J Biol Chem 280: 25629-25636, 2005).
따라서, GPAT 저해는 중성지방의 세포 내 축적을 저해하는 작용점이 될 수 있으며, GPAT의 지방 축적과 에너지 대사 역할을 조절하는 저분자 저해제의 개발은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 치료제를 개발하는 전략이 될 수 있다.
기존에 mtGPAT 저해제 화합물로서는 싸이클로펜테닐 아세틱산(cyclopentenyl acetic acid) 유도체(Eydysh et al. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18: 6470-6479), 2-(nonylsulfonamido) 및 벤조산(benzoic acid) 유도체(Eydysh et al. J. Med. Chem. 2009, 52:3317-3327)가 알려져 있으나, IC50 값이 25 μM에서 350 μM 사이로 효소 저해제로서의 미약한 저해활성을 보였다. 이때 사용한 효소원이 랫의 미토콘드리아 분획으로 아직 초보적인 단계에 있는 결과로 해석된다. 특허로는 미국의 FASgen과 프린스턴대학과 공동으로 mtGPAT 및 지질대사 관련 효소들의 유전적 억제가 다양한 바이러스 감염의 억제 및 치료에 효과적임을 연구한 특허 1편이 알려져 있다(WO 2011/019498).
한편, 수련(Nymphaea tetragona)은 수련과에 속하는 식물로서 한국, 일본, 중국, 인도, 시베리아 동부 등에 분포되어 있고 여러 해살이 수중식물로 굵고 짧은 땅속줄기에서 많은 잎자루가 자라서 물 위에서 꽃이 핀다. 수련의 꽃은 한방에서 더위를 풀고 숙취를 풀어주며 소아의 급만성 경풍을 치료하는데 사용된다. 민간에서는 꽃을 지혈, 강장, 불면증 등의 약으로 사용된다.
수련뿌리 성분으로 폴리페놀계열인 제라닌(geraniin)과 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로이-베타-D-포도당(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose, PGG)이 알려져 있으며 방사선에 의해 유도된 세포사(apoptosis)를 억제하는 것으로 알려져 있다 (Kang et al. Cell Biol. Toxicol. 2011, 27:83-94; Biol. Pharm. Bull. 2010, 33:1122-1127).
본 발명자들은 천연물로부터 mtGPAT1을 억제하는 활성물질을 탐색하는 과정에서 수련뿌리 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리한 폴리페놀계 화합물들이 mtGPAT1의 효소활성을 효과적으로 억제하였고, 세포 내의 중성지방의 생합성을 저해하는 것을 확인함으로써, 골격근 세포에서의 포도당 섭취를 증대시켜 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 예방 및 치료 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 수련뿌리(Nymphaea tetragona) 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 수련뿌리 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
<화학식 1>
Figure 112012101754634-pat00001
;
<화학식 2>
Figure 112012101754634-pat00002
;
<화학식 3>
Figure 112012101754634-pat00003
; 및
<화학식 4>
Figure 112012101754634-pat00004
아울러, 본 발명의 다른 목적은 수련뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 수련뿌리(Nymphaea tetragona) 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 수련뿌리 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 수련뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 수련뿌리 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 수련뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 폴리페놀계 화합물들은 대사성 질환을 유발하는 mtGPAT1의 활성을 효과적으로 억제하고, 세포내 중성지방의 생합성 저해 및 골격근 세포에서의 인슐린 의존적 포도당 섭취 증대 활성을 나타내는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 폴리페놀계 화합물들을 비롯하여, 이들을 함유하는 수련뿌리 추출물 또는 이의 분획물은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 수련뿌리 메탄올 추출물, 부탄올 분획물 및 분획물에서 분리된 화합물의 hGPAT1의 저해 활성을 나타낸 도이다.
도 1a는 수련뿌리 메탄올 추출물과 용매 분획물의 hGPAT1의 저해 활성을 나타낸 도이다.
도 1b는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 또는 화학식 4의 hGPAT1 저해 활성을 나타낸 도이다.
도 2는 수련뿌리의 메탄올 추출물과 용매 분획물의 HepG2 세포(인간 유래 간세포) 내에서의 중성지방 생합성 저해효과를 나타낸 도이다.
도 3은 수련뿌리 메탄올 추출물과 분획물 및 분리된 화합물의 포도당 섭취 활성을 나타낸 도이다.
도 3a는 수련뿌리의 메탄올 추출물과 분획물의 쥐의 골격근세포인 L6 세포에서의 포도당 섭취 활성을 나타낸 도이다.
도 3b는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 또는 화학식 4의 쥐의 골격근세포인 L6 세포에서의 포도당 섭취 활성을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수련뿌리(Nymphaea tetragona) 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어, “수련(Nymphaea tetragona)”은 천연, 잡종 또는 변종 수련의 모든 기관, 예를 들어, 뿌리, 가지, 줄기, 잎, 꽃을 모두 포함하여 의미하나, 구체적으로는 수련의 지하부이다.
상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합물인 용매로 추출되는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 수련뿌리 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것 일 수 있으나 이에 한정하지 않는다:
1) 수련뿌리에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 수련뿌리는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한없이 사용할 수 있다. 상기 수련뿌리는 수련 지하부를 이용하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 수련뿌리 추출물의 추출 방법으로는 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류냉각 추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 열수 추출 방법으로 1회 내지 5회 추출하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 3회 반복 추출하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출용매는 건조된 수련뿌리에 0.1 내지 10배 첨가할 수 있으며, 0.3 내지 5배 첨가하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20 내지 40인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 12 내지 48시간인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 수련뿌리 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 유기용매는 헥산, 클로로포름 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 분획물은 수련뿌리 추출물을 헥산, 클로로포름, 부탄올 및 물 순으로 계통분획하여 얻은 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 헥산은 n-헥산인 것이 바람직하다.
상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
<화학식 1>
Figure 112012101754634-pat00005
또한, 본 발명은 하기 화학식 2의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
<화학식 2>
Figure 112012101754634-pat00006
또한, 본 발명은 하기 화학식 3의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
<화학식 3>
Figure 112012101754634-pat00007
또한, 본 발명은 하기 화학식 4의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
<화학식 4>
Figure 112012101754634-pat00008
상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 및 화학식 4의 화합물은 각각 수련뿌리 추출물로부터 분리한 것일 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 다른 물질로부터 유래한 것 또는 합성한 것 모두 사용가능하다.
상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명자들은 수련뿌리 추출물 및 분획물을 제조하기 위해 수련뿌리를 분쇄하여 메탄올에 침지하여 추출하였다. 추출액을 여과하고, 감압 농축하여 메탄올 추출물을 얻었으며, 활성물질을 분리하기 위해 상기 수련뿌리 메탄올 추출물을 헥산, 클로로포름, 부탄올, 물로 용매 분획하여 각각의 분획물들을 얻었으며, 상기 분획들의 인간 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(human glycerol-3-phosphate acyltransferase, hGPAT1) 저해 활성을 측정한 결과 부탄올 분획물에서 보다 우수한 저해활성을 확인하였다.
본 발명자들은 수련뿌리 추출물로부터 화합물을 분리하기 위하여, 상기 부탄올 분획물을 메탄올/물 혼합용매로 순차적으로 극성을 증가시키면서 역상 컬럼 크로마토그래피(reverse phase column chromatography)를 이용하여 총 8 개의 분획으로 분리하였다(분획물1 ~ 분획물8). 이들 중 저해활성이 가장 강한 분획물을 모아 세파덱스 LH-20(Sephadex LH20)을 사용하여 메탄올로 용출시켜 활성분획을 분리하였다. 이 중 저해활성이 강한 분획물을 모아 용출용매로 메탄올/물 혼합용매를 5 ml/분으로 흘려주면서 고속액체크로마토그래피(YMC J'sphere ODS H-80 column, 250×20 mm)를 실시하여 최종적으로 순수한 화합물 4종(화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 및 화학식 4)을 얻었다.
본 발명자들은 상기 4종의 화합물들의 구조를 규명하기 위해, 상기 화합물의 성상, 분자량, 분자식, 질량분석, 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과 발표된 문헌[Hideyuki Kurihara et al. Biosci . Biotech . Biochem ., 57(9):1570-1571,1993; Wen-Hua Zhao et al. J. Chromatogr . B., 850, 523-527, 2007; R. W. Owen et al. Food and Chemical Toxicology., 41, 1727-1738, 2003]의 데이터와 일치하였으며, 제라닌(geranin), 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로이-베타-D-글루코스(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose), 1,2,3,6-테트라-O-갈로이-베타-D-글루코스(1,2,3,6-tetra-O-galloyl-beta-D-glucose), 메틸갈레이트(methyl gallate)로 동정하였다. 수련뿌리로부터 분리된 화합물의 이화학적 특성과 화학 구조는 하기와 같다.
<화학식 1>
제라닌(geranin)
Figure 112012101754634-pat00009
<화학식 2>
1,2,3,4,6-펜타-O-갈로이-베타-D-글루코오스(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose)
Figure 112012101754634-pat00010
<화학식 3>
1,2,3,6-테트라-O-갈로이-베타-D-글루코오스(1,2,3,6-tetra-O-galloyl-beta-D-glucose)
Figure 112012101754634-pat00011
<화학식 4>
메틸갈레이트(methyl gallate)
Figure 112012101754634-pat00012
본 발명자들은 인체유래 hGPAT1 (human GPAT1)의 대량 발현 및 hGPAT1 효소원을 분리하고자, Human hGPAT1 cDNA(NCBI accesstion No. NM_020918)를 pFastBac1 벡터에 클로닝하고 이 후 얻어진 재조합 bacmid DNA를 Sf9 세포에 형질전환하여 human hGPAT1 cDNA를 포함하는 배큘로바이러스(baculovirus)를 조립·증폭하였다. 세포를 회수하였으며, 초음파세포파쇄기를 이용하여 균질화하였다. 상등액만을 취하고, 원심분리하였다. 얻어진 침전물을 수크로오스 완충액에 현탁하여 미토콘드리아 hGPAT1(mitochondrial hGPAT1)의 효소원으로 사용하였다. 또한, 침전물을 제거한 상등액을 원심분리하여 얻은 침전물을 수크로오스 완충액(sucrose buffer)에 현탁하여 마이크로솜 hGPAT1 효소원으로 사용하였다.
인체유래 hGPAT1의 활성 저해 효과를 측정하기 위해, 마이크로솜 hGPAT1 효소의 활성은 N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide, NEM)에 의해 그 활성이 소실되며, 미토콘드리아 hGPAT1 활성만을 측정할 때에는 실험 전에 N-에틸말레이미드를 전처리함으로써 마이크로솜 hGPAT1 활성을 소실시킨 후 실험을 진행하였다. 미토콘드리아 hGPAT1 효소의 활성은 생성된 반응물인 [14C]리소포스파티딕산([14C]Lysophosphatidic acid)의 방사선 양으로 측정하였다. 미토콘드리아 hGPAT1의 활성은 실험 전 미토콘드리아 hGPAT1 효소원에 2 mM N-에틸말레이미드를 15분 동안 얼음 욕조(ice bath)에서 전처리하여 마이크로솜 hGPAT1의 활성을 실활시킨 후 측정하였으며, 마이크로솜 hGPAT1의 활성은 N-에틸말레이미드(2 mM)를 마이크로솜 hGPAT1 효소원에 전처리하여 전체 hGPAT1 활성과 마이크로솜 hGPAT1의 효소 활성 비율을 측정하여 마이크로솜 hGPAT1 효소원의 활성 결과를 보정하여 효소 활성을 측정하였다.
효소 반응에 사용된 기질은 [14C]글리세롤-3-포스페이트(1.8 μM)와 팔미토일-코에이(palmitoyl-CoA)(100 μM)이며, 이들 기질은 반응액에서 반응 후, 수포화 부탄올과 물에 의해 반응이 정지되었다. 반응물은 원심분리를 통하여 물 층과 부탄올 층으로 분리되었고, 반응 생성물인 [14C]리소포스파티딕산(lysophosphatidic acid)이 포함된 상층액(부탄올 층)을 취하였다. 상층액은 동량의 물과 진탕하여 원심분리를 통해 물 층과 부탄올 층으로 다시 분리하였고 상층액 600 ㎕를 취하여 액체섬광계측기(liquid scintillation counter, LSC)로 방사능의 양(Disintegrations per minute, DPM)을 측정하였다. 상기 실시예 1 및 2에서 제조한 수련뿌리 추출물, 분획물 및 화학식 1, 화학식 2와 화학식 3의 화합물을 각각 처리하여 hGPAT1 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 수련뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 비환식 폴리페놀계 화합물은 hGPAT1 저해 활성이 우수하며, 농도의존적으로 hGPAT1 저해 활성을 나타내었다(표 1, 표 2, 도 1a 및 도 1b 참조).
본 발명의 화합물에 의한 세포 내에서의 중성지방 합성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 인간 유래 간세포인 HepG2 세포를 이용하여 2종의 기질에 대한 세포 내에서의 중성지방 생합성 저해 활성을 측정하였다. 그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 수련 추출물 및 분획물을 각각 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 [14C]글리세롤을 기질로 사용했을 때 각 분획물은 세포내의 중성지방 생성을 저해하였다(표 3 참조).
L6 세포(rat skeletal myoblast cell line)에서의 포도당 섭취 증가 효과 측정하기 위하여, 분화된 L6 세포에 인슐린을 비롯한 수련뿌리 추출물 또는 분획물 및 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4를 각각 처리한 후 크렙스-링거 완충액(Krebs-Ringer Buffer, KRB)에서 배양하였다. KRB에서 배양된 세포에 2-데옥시-2-글루코오스(2-deoxy-D-glucose)와 표지된 2-데옥시-2-글루코오스(2-deoxy-D-[14C]glucose, 0.2 μCi/ml)를 처리한 후 10분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 방사성 측정기(scintillation counter)로 측정하여 포도당 섭취 정도를 판단했다. 그 결과, 수련뿌리 추출물 또는 부탄올 분획물을 처리하였을 때 대조군(DMSO)에 비해 포도당 섭취를 크게 증가시켰다. 또한 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4를 처리하였을 때 대조군(DMSO)에 비해 포도당 섭취를 크게 증가시켰다.
수련뿌리 추출물 또는 부탄올 분획물의 L6 세포(rat skeletal myoblast cell line)에서의 포도당 섭취 증가 효과 측정하기 위하여, 분화된 L6 세포에 인슐린을 비롯한 수련뿌리 추출물과 부탄올 분획물을 처리한 후 크렙스-링거 완충액(Krebs-Ringer Buffer, KRB)에서 배양하였다. KRB에서 배양된 세포에 2-데옥시-2-글루코오스(2-deoxy-D-glucose)와 표지된 2-데옥시-2-글루코오스(2-deoxy-D-[14C]glucose, 0.2 μCi/ml)를 처리한 후 10분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 방사성 측정기(scintillation counter)로 측정하여 포도당 섭취 정도를 판단했다. 그 결과, 수련뿌리 추출물 또는 부탄올 분획물을 처리하였을때 대조군(DMSO)에 비해 포도당 섭취를 크게 증가시켰으며 인슐린에 의존적인 것으로 나타났다.
본 발명의 수련뿌리 추출물의 경구 급성 독성을 알아보기 위하여 마우스를 사용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 실험동물은 무특이병원체(specific pathogen free, SPF) 동물로서 7 주령의 수컷 ICR 마우스를 대조군 및 시험군으로 구분하여, 대조군에는 0.5% 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC) 용액만을 투여하였고, 시험군에는 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 수련뿌리 추출물을 각각 1,000 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여한 후 2 주간 독성 여부를 관찰하였다. 그 결과, 모든 군에서 사망한 동물은 없었으며, 특이한 행동이나 독성증상의 소견을 보이는 동물은 발견되지 않았다. 또한, 모든 군에서 체중이 증가하였으며 부검 시 관찰한 흉강 및 복강 내 모든 장기에서 특이한 병변이나 이상 소견은 발견되지 않았다.
따라서, 본 발명에 따른 수련뿌리 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물로부터 분리한 폴리페놀계 화합물들은 대사성 질환을 유발하는 mtGPAT1의 활성을 효과적으로 억제하고, 세포내 중성지방의 생합성 저해 및 골격근 세포에서의 인슐린 의존적 포도당 섭취 증대 활성을 나타내는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 폴리페놀계 화합물들을 비롯하여, 수련뿌리 추출물 또는 이의 분획물은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 수련뿌리 추출물 또는 이의 분획물을 0.1 내지 99.9 중량%를 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 피부외용으로 사용한다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 수련뿌리 추출물의 양을 기준으로 0.01 내지 1000 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 30 내지 500 ㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 300 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 본 발명에 따른 조성물을 대사성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 치료 방법을 제공한다.
상기 대사성 질환은 비만, 제 2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증 및 비알콜성 지방간으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 mg/kg이고, 0.001 내지 10 mg/kg이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 개체는 척추동물이고, 구체적으로는 포유동물이고, 더 구체적으로는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이며, 보다 구체적으로는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물일 수 있다.
본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서, "투여"는 본 발명의 조성물을 췌장암 세포로 "전신 전달" 또는 "국소 전달"하여 도입되는 것을 뜻한다. "전신 전달"은 유기체 내에 화합물의 광역 생체분포를 유발하는 전달을 지칭한다. 일부 투여 기술은 특정한 화합물의 전신 전달을 유발하고, 다른 것들에는 그렇지 않을 수 있다. 전신 전달은 유용한, 바람직하게는 치료적으로 유효한 양의 화합물이 신체의 대부분에 노출되는 것을 의미한다. 일반적으로, 광역 생분포를 얻기 위해, 화합물이 투여 부위와 멀리 떨어진 질환 부위에 도달하기 전에 빠르게 분해되거나 제거되지 않도록(예를 들면, 최초 통과 기관(간, 폐 등)에 의해 또는 빠른 비특이적 세포 결합에 의해) 하는 혈액내 수명이 요구된다. 본 명세서에 사용된 "국소 전달"은 유기체 내에서 표적 부위에 화합물을 직접 전달하는 것을 지칭한다. 예를 들면, 화합물은 질환 부위, 예를 들면 종양 또는 다른 표적 부위, 예를 들면 표적 기관, 예를 들면 췌장에 직접 주사함으로써 국소 전달될 수 있다.
또한, 본 발명은 수련뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 수련뿌리 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
상기 폴리페놀계 화합물은 상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 및 화학식 4로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에서는 수련뿌리 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물로부터 분리한 폴리페놀계 화합물들은 대사성 질환을 유발하는 mtGPAT1의 활성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 폴리페놀계 화합물들을 비롯하여, 수련뿌리 추출물 또는 이의 분획물은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 예방 및 개선용 건강식품용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01~0.04 중량부, 구체적으로는 약 0.02 ~ 0.03 중량부 범위에서 선택할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 실시예 및 제조예를 통해 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 수련뿌리 추출물 및 분획물의 제조
건조된 수련뿌리 5 kg을 분쇄하여 메탄올 25 ℓ에 침지하여 2회 추출하였다. 추출액을 여과하고, 감압 농축하여 메탄올 추출물 약 199 g을 얻었다. 활성물질을 분리하기 위해 상기 수련뿌리 메탄올 추출물 199 g을 증류수 1000 ㎖에 현탁시킨 후 헥산, 클로로포름, 부탄올, 물로 용매 분획하여 각각의 분획물들을 얻었다. 상기 분획들의 hGPAT1 효소 저해 활성 측정한 결과 부탄올 분획물에서 보다 우수한 저해활성을 보였다.
< 실시예 2> 수련뿌리 추출물로부터 화합물의 분리
상기 부탄올 분획 (약 25 g)을 20%, 30%, 40%, 50% 메탄올/물 혼합용매로 순차적으로 극성을 증가시키면서 역상 컬럼 크로마토그래피(reverse phase column chromatography)를 이용하여 총 8 개의 분획으로 분리하였다(분획물1 ~ 분획물8).
이들 중 저해활성이 가장 강한 분획물을 모아 세파덱스 LH-20(Sephadex LH20)을 사용하여 메탄올로 용출시켜 활성분획을 분리하였다. 이 중 저해활성이 강한 분획물을 모아 용출용매로 90% 메탄올/물 혼합용매를 5 ml/분으로 흘려주면서 고속액체크로마토그래피(YMC J'sphere ODS H-80 column, 250×20 mm)를 실시하여 최종적으로 순수한 화합물 4종(화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 및 화학식 4)을 얻었다.
< 실시예 3> 화합물의 구조 규명
상기 화합물은 물질의 성상, 분자량, 분자식, 질량분석, 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과 발표된 문헌[Hideyuki Kurihara et al. Biosci . Biotech. Biochem ., 57(9):1570-1571,1993; Wen-Hua Zhao et al. J. Chromatogr . B., 850, 523-527, 2007; R. W. Owen et al. Food and Chemical Toxicology., 41, 1727-1738, 2003]의 데이터와 일치하였으며, 제라닌(geranin)(화학식 1), 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로이-베타-D-글루코스(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose)(화학식 2), 1,2,3,6-테트라-O-갈로이-베타-D-글루코스 (1,2,3,6-tetra-O-galloyl-beta-D-glucose)(화학식 3) 및 메틸갈레이트(methyl gallate)(화학식 4)로 동정하였다. 수련뿌리로부터 분리된 화합물의 이화학적 특성과 화학 구조는 하기와 같다.
Figure 112012101754634-pat00013
1) 성상 : 연한 갈색 고체(pale brown solid)
2) 분자량 : 952
3) 분자식 : C41H28O27
4) ESI-질량분석 : m/z = [M+Na]+, 975.06
5) 1H-NMR(400MHz, CD3OD, δ(ppm)) : 5.21 (methine), 7.31-6.57 (aromatic), 6.29-4.35 (sugar)
6) 13C-NMR(100MHz, CD3OD, δ(ppm)) : 46.19, 51.97, 62.35, 63.25, 63.66, 63.79, 65.90, 66.86, 69.93, 70.51, 72.60, 73.07, 73.30, 90.70, 91.77, 92.38, 96.21, 107.88, 108.04, 110.22, 110.52, 110.66, 110.86, 113.36, 115.21, 115.77, 119.57, 120.26, 124.60, 124.78, 125.66, 128.58, 136.42, 137.67, 139.68, 143.42, 144.51, 144.90, 144.96, 145.13, 145.23, 145.39, 145.73, 145.92, 154.57, 164.70, 164.81, 165.36, 165.56, 166.11, 168.17, 168.31, 191.71, 194.43.
Figure 112012101754634-pat00014
1) 성상 : 연한 갈색 고체(pale brown solid)
2) 분자량 : 940
3) 분자식 : C41H32O36
4) ESI-질량분석 : m/z = [M+Na]+, 963
5) 1H-NMR(400MHz, CD3OD, δ(ppm)) : 7.10 (2H, s, 1-Gall-H-2, 6), 7.04 (2H, s, 2-Gall-H-2, 6), 6.97 (2H, s, 3-Gall-H-2, 6), 6.94 (2H, s, 4-Gall-H-2, 6), 6.89 (2H, s, 6-Gall-H-2, 6), 6.22 (1H, d, J=9.5 Hz, glu-H-1).
6) 13C-NMR(100MHz, CD3OD, δ(ppm)) : 167.9 (2-Gall-C-7), 167.3 (1-Gall-C-7), 167.0 (3-Gall-C-7), 166.9 (4-Gall-C-7), 166.2 (6-Gall-C-7), 146.5 (1-Gall-C-3,5), 146.4 (2-Gall-C-3,5), 146.4 (3-Gall-C-3,5), 146.3 (4-Gall-C-3,5), 146.3 (6-Gall-C-3,5), 140.8 (1-Gall-C-4), 140.4 (2-Gall-C-4), 140.3 (3-Gall-C-4), 140.1 (4-Gall-C-4), 140.0 (6-Gall-C-4), 121.1 (1-Gall-C-1), 120.4 (2-Gall-C-1), 120.3 (3-Gall-C-1), 120.2 (4-Gall-C-1), 119.7 (6-Gall-C-1), 110.6 (1-Gall-C-2,6), 110.4 (2-Gall-C-2,6, 3-Gall-C-2,6), 110.3 (4-Gall-C-2,6, 6-Gall-C-2,6), 93.8 (glu-C-1), 74.4 (glu-C-3), 74.1 (glu-C-5), 72.2 (glu-C-2), 69.8 (glu-C-4), 63.1 (glu-C-6).
Figure 112012101754634-pat00015
1) 성상 : 연한 갈색 고체(pale brown solid)
2) 분자량 : 788
3) 분자식 : C34H28O22
4) ESI-질량분석 : m/z = [M+Na]+, 811
5) 1H-NMR(400MHz, CD3OD, δ(ppm)) : 7.11 (2H, s, 6-Gall-H-2, 6), 7.01 (2H, s, 3-Gall-H-2, 6), 6.98 (2H, s, 1-Gall-H-2, 6), 6.90 (2H, s, 2-Gall-H-2, 6), 6.00 (1H, d, J=9.5 Hz, glu-H-1).
6) 13C-NMR(100MHz, CD3OD, δ(ppm)) : 168.1 (6-Gall-C-7), 167.7 (3-Gall-C-7), 167.5 (2-Gall-C-7), 167.1 (1-Gall-C-7), 146.5 (1-Gall-C-3,5), 146.4 (3-Gall-C-3,5), 146.3 (6-Gall-C-3,5), 146.2 (2-Gall-C-3,5), 121.2 (6-Gall-C-1), 120.8 (3-Gall-C-1), 120.5 (2-Gall-C-1), 120.4 (1-Gall-C-1), 110.4 (1-Gall-C-2,6, 2-Gall-C-2,6), 110.3 (3-Gall-C-2,6, 6-Gall-C-2,6), 91.5 (glu-C-1), 73.8 (glu-C-3), 73.4 (glu-C-5), 70.6 (glu-C-2), 68.7 (glu-C-4), 64.4 (glu-C-6).
Figure 112012101754634-pat00016
1) 성상 : 흰색 가루(white powder)
2) 분자량 : 184
3) 분자식 : C8H8O5
4) 1H-NMR(400MHz, CD3OD, δ(ppm)) : 7.41 (1H, s, H-2), 7.75 (1H, s, H-6), 3.87 (3H, s, methoxy methyl), 3.83 (1H, s, ester methyl)
5) 13C-NMR(100MHz, CD3OD, δ(ppm)) : 121.5 (C-1), 110.6 (C-2), 149.9 (C-3), 146.1 (C-4), 141.2 (C-5), 118.7 (C-6), 168.2 (C-7), 56.8 (methoxy methyl), 49.5 (ester methyl).
< 실시예 4> 인체유래 hGPAT1 ( human GPAT1 )의 대량 발현 및 효소원 분리
Human GPAT1(hGPAT1)을 과발현시킨 sf9 세포로부터 분리한 미토콘드리아 단백질(mitochondrial protein)을 효소원으로 사용하였다. hGPAT1 cDNA(NCBI accesstion No. NM_020918)를 pFastBac1 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하고 이 후 얻어진 재조합 bacmid DNA를 Sf9 세포에 형질전환하여 human hGPAT1 cDNA를 포함하는 배큘로바이러스(baculovirus)를 조립·증폭하였다. Sf9 세포 (1×106 세포/ml)에 10 MOI의 바이러스를 감염시키고 48 시간 후 원심분리를 통해 세포를 회수하였으며, 균질화 완충액(homogenize buffer)(250 mM 수크로오스(sucrose), 10 mM Tris (pH 7.4), 1 mM EDTA)을 넣고 초음파세포파쇄기를 이용하여 균질화하였다. 원심분리(600 g, 15분)하여 상등액만을 취하고, 이를 다시 8,000 g에서 15분 동안 원심분리 하여 얻어진 침전물인 미토콘드리아 단백질 분획을 수크로오스 완충액 (sucrose buffer: 250 mM sucrose, 10 mM Tris (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mM DTT)에 현탁하여 브래드포드 방법(Bradford Method)으로 단백질의 농도를 결정하였으며, 이를 -80℃에 보관한 후 실험에 사용하였다.
< 실시예 5> 인체유래 hGPAT1 의 활성 저해 효과 측정
hGPAT1 효소의 활성은 미토콘드리아 hGPAT1 효소원에 의해 생성된 반응물인 [14C]리소포스파티딕산([14C]Lysophosphatidic acid)의 방사선 양으로 측정하였다. 미토콘드리아 hGPAT1의 활성은 다른 동질효소에 비해 hGPAT1은 에틸말레이미드(N-ethylmaleimide, NEM)의 처리에 의해 활성을 유지한다는 이전 연구 결과에 따라 실험 전 hGPAT1 효소원에 2 mM N-에틸말레이미드를 15분 동안 얼음 욕조(ice bath)에서 전처리하여 hGPAT1 외의 동질효소의 활성을 실활시킨 후 측정하였다.
효소 반응에 사용된 기질은 [14C]글리세롤-3-포스페이트(1.8 μM)와 팔미토일-코에이(palmitoyl-CoA)(100 μM)이며, 이들 기질은 반응액(75 mM Tris (pH 7.5), 4 mM MgCl2, 8 mM NaF, 2 ㎎/㎖ BSA)과 함께 26℃에서 20분 동안 반응 후, 수포화 부탄올과 물에 의해 반응이 정지되었다. 반응물은 원심분리를 통하여 물 층과 부탄올 층으로 분리되었고, 반응 생성물인 [14C]리소포스파티딕산(lysophosphatidic acid)이 포함된 상층액(부탄올 층) 800 ㎕를 취하였다. 상층액은 동량의 물과 진탕하여 원심분리를 통해 물 층과 부탄올 층으로 다시 분리하였고 상층액 600 ㎕를 취하여 액체섬광계측기(liquid scintillation counter, LSC)로 방사능의 양(Disintegrations per minute, DPM)을 측정하였다. 상기 실시예 1 및 2에서 제조한 수련뿌리 추출물 및 분획물의 최종농도를 30,100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 상기 실시예 2에서 제조한 화학식 1, 화학식 2와 화학식 3의 화합물의 최종농도 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 hGPAT1 효소 활성을 측정하였다. 시료에 의한 hGPAT1 효소 활성의 저해율은 하기 수학식 1로 계산하였다.
Figure 112012101754634-pat00017
T : 효소 반응액에 시료를 넣은 시험 구의 DPM 값,
C : 효소 반응액에 시료를 넣지 않은 대조 구의 DPM 값,
B : 효소원을 넣지 않고 시료를 넣은 대조 구의 DPM 값.
그 결과, 표 1, 표 2, 도 1a 및 도 1b에 나타난 바와 같이, 수련뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 비환식 폴리페놀계 화합물은 hGPAT1 저해 활성이 우수하며, 농도의존적으로 hGPAT1 저해 활성을 나타내었다. 또한, 화학식 1, 화학식 2와 화학식 3의 화합물의 hGPAT1에 대한 50% 저해 활성을 나타내는 농도인 IC50 값은 각각 16.9 ㎍/㎖, 70.3 ㎍/㎖과 59.8 ㎍/㎖ 이었다.
최종농도(㎍/㎖) hGPAT1 저해율(%)
메탄올 추출물 30 77.1
100 91.4
헥산 분획 30 70.9
100 85.8
클로로포름 분획 30 78.0
100 91.9
부탄올 분획 30 82.0
100 94.4
물 분획 30 75.6
100 84.2
최종농도(㎍/㎖) hGPAT1 저해율(%) IC50(㎍/㎖)

화학식 1		 300 99.6 16.9
100 98.60
30 74.9
10 36.8
3 17.1
1 15.3

화학식 2		 300 98.8 70.3
100 81.5
30 32.2
10 12.2
3 10.9
1 9.3
화학식 3 300 96.4 59.8
100 74.5
30 31.8
10 9.4
3 8.6
1 7.5
< 실시예 6> HepG2 세포 내에서의 중성지방 생합성저해 효과 측정
본 발명의 화합물에 의한 세포 내에서의 중성지방 합성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 인간 유래 간세포인 HepG2 세포를 이용하여 2종의 기질에 대한 세포 내에서의 중성지방 생합성 저해 활성을 측정하였다. HepG2 세포는 ATCC에서 분양 받았으며, 최소필수배지(Minimum essential medium, MEM; 2 mM L-글루타민; 및 1.5 g/L 탄산수소 나트륨(sodium bicarbonate), 0.1 mM 불필수 아미노산(nonessential amino acids) 및 1 mM 피루브산 나트륨(sodium pyruvate)을 함유하도록 조제된 earle`s BSS) 배지에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)과 1% 항생제(100 U/ml penicillin 및 100 g/ml streptomycin)를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포 내에서의 hGPAT1 효소 활성은 배양된 HepG2 세포에서 생성된 중성지방의 양으로 측정하였으며 효소활성 저해 물질로 화학식 1과 화학식 2, 화학식 3의 화합물을 각각 첨가한 후 중성지방의 생성의 감소율에 따라 효소 저해제의 효과를 결정하였다. 24 웰(well) 배양접시에 웰 당 1×106 세포/ml의 세포수로 분주하여 24 시간 동안 배양한 후 FBS가 존재하지 않는 DMEM(Dulbecco`s modified Eagle`s medium) 배지로 교환하고 기질로서 0.2 mCi의 [14C]아세테이트([14C]acetate)(Amersham사)를 첨가시키고 6시간 동안 반응시켰다. 또 다른 기질로 사용된 [14C]글리세롤([14C]glycerol)의 경우 18시간 동안 반응시켰다. 시료는 디메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹여 사용하였으며, 중성지방 생성반응에서의 대조구는 시료를 넣지 않고 디메틸설폭시화물만으로 반응을 시켰으며, 이로써 생성된 중성지방의 생성율을 100으로 하였다.
반응이 끝난 세포 내에서 중성지방의 생성양을 측정하기 위해 세포로 흡수되지 않고 배지 중에 남아있는 기질인 [14C]아세테이트 또는 [14C]글리세롤을 제거하고 인산완충식염수(phosphate-buffer-saline, PBS)로 1회 제거한 후 추출용매(헥산(hexane) : 아이소프로판올(isopropanol) = 3:2, v:v) 0.5 ml을 첨가하여 중성지방을 포함한 전체 지방을 추출하였다. 0.5 ml 추출 용매로 30분씩 2회 추출 후 얻어진 추출액 1 ml은 질소가스를 통해 농축하였으며, 추출용매를 제거한 후 전체 지방을 유기용매(클로로포름:메탄올 = 2:1)에 녹여 박층 크로마토그래피(TLC: silica gel 60F254, thickness: 0.5mm, Merck)에 점적하여 전개용매(헥산:디에틸에테르:아세틱에시드 = 80:20:1, v:v:v)상에서 전개하였다. TLC 상에서 중성지방(Rf값: 0.4)을 분리한 후 TLC 판을 방사능 에너지를 감광할 수 있는 필름에 3시간 동안 감광한 후 이미지 분석(FLA-7000, Fuji, Japan)을 통해 중성지방의 [14C] 방사능 양을 측정하였다. 추출 후 남아 있는 세포는 0.1 N 수산화나트륨 0.3 ml에 녹여 반응에 이용된 세포의 단백질 농도 측정에 이용하였다. 중성지방의 방사능 양을 측정하여 단백질 농도로 나눈 값을 실험값으로 하여 각 시험군 사이의 실험 오차를 보정하여 본 발명의 수련 추출물 및 분획물에 의한 중성지방의 생성율을 산출하였다.
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 수련 추출물 및 분획물을 각각 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 [14C]글리세롤을 기질로 사용했을 때 세포내의 중성지방 생성을 메탄올 추출물은 15.9%, 헥산 분획물은 16.7%, 클로로포름 분획물은 27.3%, 부탄올 분획물은 27.4%, 물분획물은 35.6% 저해하였다.
화합물(㎍/㎖) 사용된 기질 중성지방 생성율(대조군의 백분율%)
대조군(DMSO) 30 ㎍/㎖ 50 ㎍/㎖
메탄올 추출물 [14C]글리세롤 100 ± 3.75 82.3 ± 5.1 84.1 ± 3.2
[14C]아세테이트 100 ± 0.8 89.14 ± 9.6 98.6 ± 12.8
헥산 분획물 [14C]글리세롤 100 ± 3.75 113.2 ± 6.1 83.3 ± 1.2
[14C]아세테이트 100 ± 0.8 126.04 ± 0.5 109.2 ± 10.6
클로로포름 분획물 [14C]글리세롤 100 ± 3.75 99.7 ± 2.0 72.7 ± 11.4
[14C]아세테이트 100 ± 0.8 80.19 ± 3.3 91.23 ± 13.5
부탄올 분획물 [14C]글리세롤 100 ± 3.75 72.5 ± 6.7 72.6 ± 3.3
[14C]아세테이트 100 ± 0.8 71.93 ± 5.2 66.12 ± 4.6
물 분획물 [14C]글리세롤 100 ± 3.75 67.5 ± 0.4 64.4 ± 2.7
[14C]아세테이트 100 ± 0.8 82.3 ± 1.4 75.65 ± 5.9
< 실시예 7> 수련뿌리 추출물 또는 부탄올 분획물의 L6 세포( rat skeletal myoblast cell line )에서의 포도당 섭취 증가 효과 측정
L6 근아세포(myoblasts)주는 FBS 10%를 포함하는 DMEM(4 mM L-글루타민, 1.5 g/L 탄산수소 나트륨, 4.5 g/L 포도당) 배지에 배양하였다. 24웰 플레이트에서 배양된 세포주는 80%가 배지 전면에 증식한 상태 상태에서 PBS로 세포를 두 번 세척한 후 0.2% FBS DMEM (4 mM L-글루타민, 1.5 g/L 탄산수소 나트륨, 1 g/L 포도당) 배지로 교환하여 24시간 배양하였다. 이 조건하에서 근아세포(myoblastes) 상태의 세포는 근관세포(myotubes)로 분화하게 된다. 분화된 L6 세포에 인슐린을 비롯한 수련뿌리 추출물과 분획물 30 ㎍/㎖와 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 및 화학식 4를 각각 30 uM의 농도로 각각 일정시간(1시간, 3시간, 6시간) 처리한 후 크렙스-링거 완충액(Krebs-Ringer Buffer, KRB)에서 30분간 배양했다. KRB에서 배양된 세포에 0.1 mM의 2-데옥시-2-글루코오스(2-deoxy-D-glucose)와 표지된 2-데옥시-2-글루코오스(2-deoxy-D-[14C]glucose, 0.2 μCi/ml)를 처리한 후 10분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 세포에서 KRB 완충액를 제거하고 KRB 완충액으로 3번 세척한 후 1 M수산화나트륨(NaOH)으로 세포를 용해시켰다. 1M 수산화나트륨에 용해된 세포는 방사성 측정기(scintillation counter)로 측정하여 포도당 섭취 정도를 판단했다.
그 결과, 수련뿌리 추출물 및 부탄올 분획물을 30 ㎍/㎖의 농도로 6시간 처리하였을 때 대조군(DMSO)에 비해 포도당 섭취를 크게 증가시켰다. 또한 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 및 화학식 4를 30 uM의 농도로 6시간 처리하였을 때 대조군(DMSO)에 비해 포도당 섭취를 크게 증가시켰다.
< 실시예 8> 수련뿌리 추출물의 급성 독성실험
본 발명의 수련뿌리 추출물의 경구 급성 독성을 알아보기 위하여 마우스를 사용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 실험동물은 무특이병원체(specific pathogen free, SPF) 동물로서 7 주령의 수컷 ICR 마우스(대한바이오링크, 충북 음성)를 도입하여 1 주일간 순화기간을 거쳐 8 주령이 되었을 때 각 군당 5마리씩 배정하여 실험에 사용하였다. 대조군에는 0.5% 카르복시메틸 셀룰로오스 (carboxymethyl cellulose, CMC) 용액만을 투여하였고, 시험군에는 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 수련뿌리 추출물을 각각 1,000 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여한 후 2 주간 독성 여부를 관찰하였다.
그 결과, 모든 군에서 사망한 동물은 없었으며, 특이한 행동이나 독성증상의 소견을 보이는 동물은 발견되지 않았다. 또한, 모든 군에서 체중이 증가하였으며 부검 시 관찰한 흉강 및 복강 내 모든 장기에서 특이한 병변이나 이상 소견은 발견되지 않았다. 따라서, 수련뿌리 추출물은 마우스에 대하여 각각 1,000 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏ 농도의 단회 경구투여에 따른 독성을 나타내지 않는 것을 알 수 있었다.
< 제조예 1> 산제의 제조
<실시예 1>의 수련뿌리 추출물 0.1 g
유당 1.5 g
탈크 0.5 g
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
< 제조예 2> 정제의 제조
<실시예 1>의 수련뿌리 분획물 0.1 g
락토오스 7.9 g
결정성 셀룰로오스 1.5 g
마그네슘 스테아레이트 0.5 g
상기의 성분들을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)으로 정제를 제조하였다.
< 제조예 3> 캡슐제의 제조
<실시예 2>의 화학식 1의 화합물 0.1 g
옥수수전분 5 g
카르복시 셀룰로오스 4.9 g
상기의 성분들을 혼합하여 분말을 제조한 후, 상기 분말을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
< 제조예 4> 주사제의 제조
<실시예 2>의 화학식 2의 화합물 0.1 g
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
< 제조예 5> 액제의 제조
<실시예 2>의 화학식 3의 화합물 0.1 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
< 제조예 6> 건강식품의 제조
<실시예 2>의 화학식 4의 화합물 100 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎎
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
< 제조예 6> 건강 음료의 제조
<실시예 1>의 수련뿌리 추출물 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (15)

  1. 수련뿌리(Nymphaea tetragona) 추출물의 헥산, 클로로포름 및 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합물인 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 비만, 간지방증 및 비알콜성 지방간으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 비만, 간지방증 및 비알콜성 지방간으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 분획물은 수련뿌리 추출물을 헥산, 클로로포름 및 부탄올 순으로 계통분획하여 얻은 헥산 분획물, 클로로포름 분획물 또는 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는 비만, 간지방증 및 비알콜성 지방간으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 수련뿌리 추출물의 헥산, 클로로포름 및 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만, 간지방증 및 비알콜성 지방간으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 개선용 건강식품용 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
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