KR101458578B1 - 표층 키메라 형질 전환 식물의 작출 방법 - Google Patents

Abstract

도입 유전자가 일부의 세포, 예컨대 꽃잎의 L1층의 세포 등에 존재하고, 다른 세포, 예컨대 화분 세포나 배주 세포 등의 생식 세포에는 존재하지 않는 장미를 작출한다. 이 장미는 다른 장미와 교잡하더라도 도입 유전자가 다른 장미에 전파되지 않기 때문에 도입 유전자의 확산 가능성을 완전히 부정할 수 있다.

외래 유전자, 화훼 식물

Description

표층 키메라 형질 전환 식물의 작출 방법 {METHOD FOR PRODUCING TRANSGENIC SURFACE CHIMERIC PLANT}

본 발명은 일부의 세포에만 도입 유전자를 가진 키메라의 유전자 재조합 식물을 작출하는 방법을 제공하는 것이다.

복수의 유전적으로 다른 세포군으로 이루어진 개체는 키메라라고 불린다. 식물의 키메라는 그 구조를 기준으로 주연 키메라 (periclinal chimera), 부분 키메라 및 구분 키메라 (sectorial chimera)로 나누어지는데, 예컨대 접목 외에 우발적 또는 방사선 조사에 의한 체세포 변이나 약제 처리에 의한 염색체 배가에 의하여 제작될 수 있다.

구분 키메라는 식물의 적층 구조에 기인하는 비구조적 키메라이며, 성장점에 비구조적으로 혼재하는 변이 세포의 증식에 의하여 생긴다. 즉, 하나의 조직층 자체가 키메라인 것을 가리키고, 꽃·잎·줄기 등의 기관에 이색 (異色)의 스트라이프로서 나타나는 경우가 많다. 구분 키메라는 통상 불안정하고 소실되는 것이 많지만, 드물게 주연 키메라로 발전하기도 한다.

주연 키메라는 식물의 조직층 구조에 기인하는 구조적 키메라로, 구분 키메라가 발전하여 하나의 세포층이 변이 세포로 완전하게 치환된 상태의 것을 말한다. 주연 키메라의 경우, 하나의 조직층 자체는 균일하여, 키메라는 아니다. 주연 키메라는 안정적이고, 소실되는 빈도는 작은 것으로 알려져 있다. 식물의 세포 조직은 기본적으로 3개의 세포층으로 구성되어 있고, 외측으로부터 제1층 (L1), 제2층 (L2), 제3층 (L3)의 조직층 구조로 되어 있다.

성장점의 2층의 외피 (tunica)로부터 생기는 것이 L1와 L2이며, 내체 (corpus)로부터 생기는 것이 L3이다. 대부분의 식물종에 있어서, 표피는 모두 L1층으로부터 생성되고, L2층은 생식 세포계에 관계한다. 이들 세포층마다 다른 성질을 가진 주연 키메라는 원예적으로 중요한 것이 많아서 산업적 가치는 높지만, 우발적으로, 또는 방사선 조사나 약제 처리와 같은 인위적으로 변이를 유발하는 수단에 의하여도 주연 키메라를 얻을 수 있는 확률은 극히 낮다.

외래 유전자를 식물체에 도입할 때에 인위적으로 일부의 세포만 도입 유전자를 가진 키메라 식물을 작출하는 것은 용이하지 않다. 지금까지는 파티클 건을 사용한 방법에 의하여 옥수수의 미성숙 배에 유전자를 도입하고, 생식 세포 또는 L2 세포층에만 도입 유전자를 가진 키메라 식물을 작출한 예가 있다 (특표평10-503374호 공보). 그러나, 아그로박테리움을 매개하여 유전자를 도입하는 경우에는 키메라 식물을 작출하는 것은 한층 어렵다. 아그로박테리움을 매개하여 유전자를 도입하는 방법에 있어서는 마커 유전자의 발현에 의한 약제 내성 등의 형질을 지표로 하여, 유전자가 도입된 단일 세포를 선별하고, 당해 단일 유전자 도입 세포로부터 하나의 개체의 형질 전환체 식물을 얻는다.

따라서, 통상 얻을 수 있는 유전자 재조합 식물은 유전적으로 단일의 세포로 이루어지고, 모든 세포에 있어서 도입 유전자를 가진 것이다. 만일, 일부의 세포에만 외래 유전자를 갖지 않은 식물 (키메라 식물)을 얻었다고 하더라도, 그것은 우연한 결과이며, 현재의 기술로 식물체의 특정 부분의 세포에만 유전자가 도입되도록 제어하는 것은 매우 곤란하다. 또한, 우연히 얻었다고 하더라도, 전술한 바와 같이 일부의 세포층에만 유전자를 가진 주연 키메라가 될 확률은 극히 낮을 것으로 생각된다.

유전자 도입 세포를 선발하는 과정에 있어서, 그 일부에만 외래 유전자가 도입된 키메라 세포 덩어리 또는 키메라 식물체가 출현하는 경우는 있으나, 이 경우, 전체 세포층을 통하여 키메라, 또는 하나의 조직층 자체가 키메라로 되어 있기 때문에, 완전한 주연 키메라 (특정의 세포층에만 외래 유전자가 도입되고, 그 세포층 자체는 균일한 것)는 아니다. 지금까지 완전한 주연 키메라 형질 전환 식물을 작출하고, 그것을 분자 생물학적 수법으로 증명한 예는 극히 적다. 지금까지는 rol 유전자와 탈리 인자를 포함하는 벡터를 사용함으로써, 주연 키메라체가 작출될 수 있는 것을 밝힌 예가 보고되어 있는데 (일본 공개 특허 공보 2002-315460호), 이 경우는 L3층의 주연 키메라이다.

유전자 재조합 식물에 있어서는 염색체에 도입된 도입 유전자는 멘델의 법칙에 따라 그 자손에게까지 안정적으로 전달된다. 이들 유전자 재조합 식물을 교배 부모로서 사용함으로써, 도입 유전자에 유래하는 형질을 이용하여 한층 더 새로운 품종을 만들어 낼 수 있다.

또한, 유전자 재조합 식물에 관하여는 생태계 (환경)에 대한 영향 (자연계에 의 도입 유전자의 확산 등)이 염려되고 있다. 유전자 재조합 식물로부터 비형질 전환체나 야생 식물에의 유전자 확산을 막는 기술로서는, (1) 모성 유전의 이용, (2) 웅성 불임의 이용, (3) 불임 종자의 이용 등이 알려져 있다. 모성 유전의 이용이라 함은, 화분 세포에는 전해지지 않는 엽록체의 게놈에 외래 유전자를 도입함으로써 화분에 의한 유전자 확산을 막는 방법이다.

웅성 불임의 이용이라 함은, 화분 형성을 저해하거나 화분에 생식능을 갖게 하지 않는 방법을 말하는데, 이것에 의하여 유전적 격리를 실시할 수 있다. 예를 들면, 웅성 생식 기관 특이적으로 발현하는 프로모터를 사용하여 유해한 유전자 산물을 조직 특이적으로 만들고, 화분 형성을 저해하는 방법 등이 있다. 불임 종자의 이용이라 함은 유전자 재조합 식물의 종자 형성을 직접 저해함으로써, 교잡 또는 종자의 확산을 모두 막는 방법으로서, 자가 채종을 불가능하게 하는 「터미네이터 테크놀로지」등이 이것에 해당한다.

만일, 생식 세포에 도입 유전자를 갖지 않은 유전자 재조합 식물을 작출할 수 있으면, 그 재조합 식물을 화분 부모로 한 경우 또는 종자 부모로 한 경우의 어느 경우에 있어서도, 교잡에 의한 도입 유전자 확산의 가능성을 완전히 배제할 수 있게 된다. 이것은 유전자 재조합 식물을 야외에서 재배하거나, 산업상 이용하는 사람에게 있어서는 유전자 재조합 식물의 재배를 위한 절차에 관한 부담을 경감하는 것이기도 하다. 이와 같은 절차로는 일본 국내에 있어서는 「유전자 재조합 생물 등의 사용 등의 규제에 의한 생물의 다양성의 확보에 관한 법률 (카르타헤나법)」에 의거한 생물 다양성 영향 평가 등이 있고, 다른 나라에서는 유사한 법률에 따 른 평가가 있다.

특허 문헌 1 특표평10-503374호 공보

특허 문헌 2 일본 공개 특허 공보 2002-315460호

특허 문헌 3 USP 5480789

특허 문헌 4 W0 2005/017147

특허 문헌 5 PCT/JP96/00348

비특허 문헌 1 Firoozababy et al. Bio/Technology 12: 883-888 1994

비특허 문헌 2 Lazo et al. Bio/Techno1ogy 9: 963-967, 1991

비특허 문헌 3 Fujiwara et al. Plant J. 16 421-431, 1998

비특허 문헌 4 Mitsuhara et al. Plant Vell Physiol. 37, 45-59 1996

따라서, 본 발명은 도입 유전자가 식물체의 일부분의 세포에만 존재하고, 예를 들면 생식 세포에는 존재하지 않는 유전자 도입의 장미 등의 화훼 식물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 여러 가지 검토한 결과, 외래 유전자를 아그로박테리움 투메파키엔스를 매개하여 화훼 식물에 도입하고, 재생한 화훼 식물이 키메라 식물이 되는 경우가 있는 것을 밝혀내었다. 또한, 그 중에서 주연 키메라의 식물을 선택함으로써, 목적으로 하는 유전자 재조합 화훼 식물을 얻을 수 있는 것을 밝혀내고, 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명은 외래 유전자가 일부의 세포에 존재하고, 다른 세포에는 존재하지 않는 장미 등의 화훼 식물을 제공한다.

좋기로는 상기 일부의 세포는 일부의 세포층을 구성하고 있다. 예를 들면, 상기 다른 세포는 예컨대 화분 또는 배주이다. 더 구체적인 예로서, 상기 일부의 세포층이 L1층이거나, 또는 L1층과 L3층이다. 외래 유전자로서는, 플라보노이드의 합성과 관련되는 유전자, 그 중에서도 안토시아닌의 합성에 관련된 유전자 등의 꽃의 색깔에 관한 유전자를 들 수 있다.

화훼 식물이 장미인 경우에 있어서는 외래 유전자는, 예를 들면 제비꽃과식물 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자, 현삼과 식물 유래의 방향족 아실기 전이 효소 유전자가 중요하다. 상기 제비꽃과 식물은 예컨대 제비꽃과 팬지이고, 상기 현삼과 식물은 예컨대 현삼과 토레니아이다. 상기 장미는, 예를 들면 장미 품종 WKS82 등의 하이브리드 티, 플로리분다, 미니 장미이다. 본 발명의 장미는 도입 유전자의 효과에 의하여, 예를 들면 유전자 도입 전의 장미에 비하여 꽃의 색깔이 청색 방향으로 변화하고 있다.

화훼 식물이 카네이션인 경우에 있어서는 외래 유전자는 예를 들면 상기 외래 유전자가 금어초 유래의 칼콘 합성 효소 유전자의 프로모터 제어하에 있는 사르비아 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자 cDNA, 페튜니아의 디히드로플라보놀4-환원 효소의 염색 유전자, 카네이션 유래의 안토시아니딘 합성 효소 유전자 중 하나 내지 복수의 유전자이다. 상기 카네이션은 스탠더드 타입 또는 스프레이 타입의 것이다. 본 발명의 카네이션은 도입 유전자의 효과에 의하여, 예컨대 유전자 도입 전의 카네이션과 비교하여 꽃의 색깔이 청색 방향으로 변화하고 있다.

그러나, 외래 유전자는 전술한 바와 같은 유전자에 한정되는 것이 아니며, 널리 색소 합성계에서 기능하는 유전자, 예를 들면 플라보노이드 합성계에서 기능하는 유전자이어도 좋다. 또한 외래 유전자는 GFP 유전자나 NPTII 유전자, GUS 유전자, SURB 유전자와 같은 선택 마커의 유전자이어도 좋다. 또한, 외래 유전자는 전사 인자를 코드하는 유전자이어도 좋고, 예를 들면 myb 형태의 전사 인자를 코드하는 유전자, 구체적으로는, PHR1 유전자나 Psr1 유전자이어도 좋다.

본 발명은 또한 상기 장미 등의 화훼 식물과 동일한 성질을 가진 그들의 조직 및 이들의 영양 증식체를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 장미 등의 화훼 식물의 제조 방법에 있어서, 외래 유전자를 아그로박테리움을 매개하여 장미에 도입하고, 또한 당해 외래 유전자가 일부의 세포에만 존재하는 장미를 선택하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 청구항 3 내지 27의 어느 하나의 항에 기재된, 생식 세포에 외래 유전자가 없는 화훼 식물을 작출함으로써 자연계에 도입 유전자가 확산되는 것을 방지하는 방법을 제공한다.

도 1은 장미의 각 기관에 있어서의 도입된 유전자의 존재의 유무를 나타내는 도면이다.

도 2는 도입된 외래 유전자가 L1층의 세포에 있어서만 발현하고 있고, L2층 및 L3층에는 발현하고 있지 않은 것을 나타낸다.

도 3은 실시예 2에서 사용하는 바이너리 벡터 pSPB130의 구조를 나타내는 도 면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 상태

본 발명에서 사용하는 화훼 식물은 아그로박테리움을 매개하여 외래 유전자를 도입할 수 있는 화훼 식물이면 특히 한정되지 않는다. 예를 들면, 장미, 카네이션, 페튜니아, 토레니아, 담배, 바베나 (verbena), 니렘베르기아, 국화, 백합, 나팔꽃, 금어초, 시클라멘, 난, 리시언더스, 프리지어, 거베라, 글라디올러스, 안개꽃, 카랑코에, 페랄고늄, 제라늄, 튤립, 유채씨, 포테이토, 토마토, 포플러, 바나나, 유칼립투스, 고구마, 대두, 알파파, 루핀, 콜리플라워 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 장미, 카네이션, 페튜니아, 토레니아, 담배, 바베나, 니렘베르기아가 좋다. 그 중에서도, 장미와 카네이션은 특히 매우 적합하게 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 외래 유전자로서는, 도입 후에 L1층의 세포에서 기능하는 효소의 유전자인 것이 좋다. 예를 들면, 꽃의 색깔에 관한 유전자나 선택 마커의 유전자, 또는 전사 인자를 코드하는 유전자가 좋다. 꽃의 색깔에 관한 유전자로서는, 플라보노이드의 합성과 관련된 효소의 유전자, 예컨대 안토시아닌 합성에 관한 유전자나 올론 합성에 관한 단백질을 코드하는 유전자, 액포의 pH를 제어하는 단백질을 코드하는 유전자, 지방족 아실기 전이 효소를 코드하는 유전자, 플라본 합성 효소를 코드하는 유전자 등을 들 수 있다. 선택 마커 유전자로서는, GFP 유전자나 NPTII 유전자, GUS 유전자, SURB 유전자 등을 들 수 있다. 전사 인자를 코드하는 유전자로서는, 예컨대 MYB 형태의 전사 인자를 코드하는 유전자, 구체적으로는, PHR1 유전자나 Psr1 유전자를 들 수 있다. 그러나, 이들 구체적으로 열거한 유 전자에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용하는 장미는 원예종 또는 야생종의 어느 것이라도 좋다. 그 중에서도, 상업적으로 유용한 하이브리드 티, 플로리분다, 그랑데 플로라 또는 미니 장미 등의 원예종 (Rosa hybrida)이 좋다. 이들 품종은 특히 한정되지 않는다.

장미의 캘러스에 일정한 조건하에서, 아그로박테리움을 매개하여 팬지 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자의 발현 카세트 및 토레니아 유래의 방향족 아실기 전이 효소 유전자 NPTII 유전자의 발현 카세트로 이루어진 T-DNA를 도입하였다. 얻은 형질 전환은 도입 유전자의 작용에 의하여 꽃의 색깔이 변화한 것을 볼 때, 도입 유전자가 꽃잎의 세포, 특히 색소 합성을 실시하고 있는 꽃잎의 L1층의 세포에는 존재하는 것이 시사되었다. 장미의 각각의 기관을 나누어 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR에 의하여, 화분 세포에는 도입 유전자가 존재하지 않는 것이 시사되었다.

또한, 당해 재조합 식물로부터 얻은 화분을 사용하여 다른 원예종 및 야생종의 장미와 교잡 시험을 한 경우에 있어서, 얻은 종자에는 도입 유전자가 전혀 검출되지 않았다. 이것으로부터도, 도입 유전자가 화분 세포에는 포함되지 않은 것이 시사되었다. 또한, 인 시투 (in situ) 하이브리디제이션에 의하여, 도입 유전자가 L1 세포층에만 존재하는 것이 밝혀졌다. 이것은 L2 세포층을 기원으로 하여 형성되는 화분 등의 생식 세포에는 도입 유전자가 존재하지 않는다는 것을 뒷받침하는 것이다. 따라서, 상기와 같이 장미 캘러스에 외래 유전자를 도입함으로써, 일부의 세포에만 도입 유전자를 가진 키메라 식물을 작출할 수 있다.

이 중, 플라보노이드류의 합성에 관련된 효소의 유전자로서는, 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자나 방향족 아실기 전이 효소 유전자를 들 수 있다. 이들의 유래는 특히 한정되지 않지만, 장미에서 기능하는 것이 확인된 팬지 등 제비꽃과 식물 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자, 또는 토레니아 등 현삼과 식물 유래의 방향족 아실기 전이 효소 유전자가 좋다.

본 발명에서 사용하는 카네이션은 상업적으로 유용한 스탠더드 타입 또는 스프레이 타입이 좋다. 이들의 품종은 특히 한정되지 않는다. 필링 화이트, 프리크로스 두지 (Precross Doozy), 스타잘 (Starzarl), 콜티나 샤넬 (Kortina Chanel) 등 어느 품종이라도 좋다.

카네이션에 대하여, 일정한 조건하에서, 아그로박테리움을 매개하여 금어초 유래의 칼콘 합성 효소 유전자의 프로모터 제어하에 있는 사르비아 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자 cDNA, 페튜니아의 디히드로플라보놀4-환원 효소의 염색 유전자, 카네이션 유래의 안토시아니딘 합성 효소 유전자 SURB 유전자를 도입하였다. 얻은 형질 전환은 도입 유전자의 작용에 의하여 꽃의 색깔이 변화한 것을 볼 때, 도입 유전자가 꽃잎의 세포, 특히 색소 합성을 하고 있는 꽃잎의 L1층의 세포에는 존재하는 것이 시사되었다. 카네이션의 각각의 기관에 나누어 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR에 의하여, 도입 유전자가 L1층에만 존재하는 키메라 식물인 것이 판단되었다.

다음으로, 본 발명을 실시예에 의하여, 더 구체적으로 설명한다.

실시예 1 장미에의 유전자 도입 방법

장미의 형질 전환에 관하여는 이미 많은 방법이 보고되어 있는데 (예를 들어, Firoozababy et al. Bio/Technology 12: 883-888 1994, US 5480789, WO 2005/017I47), 이들 방법에 따라서 장미에 외래 유전자를 도입할 수 있다.

구체적으로는, 아그로박테리움 투메파키엔스 (Agrobacterium tumefaciens) Ag 1O주 (Lazo et al. Bio/Technology 9: 963-967, 1991)의 균액 중에, 무균묘 (無菌苗)의 잎으로부터 유도한 장미의 캘러스를 5 분간 담그고, 멸균 여과지로 여분의 균액을 닦아낸 후, 계대용 배지에 이식하고, 2 일간 어두운 곳에서 공존 배양하였다.

그 후, 카르베니실린을 400 ㎎/ℓ를 가한 액체 배지로 세정하고, 계대용 배지에 카나마이신 50 ㎎/ℓ와 카르베니실린 200 ㎎/ℓ를 가한 선발·제균용 배지에 이식하였다. 선발 배지 상에서 생육 저해를 받지 않고, 정상적으로 증식하는 부분의 이식과 배양을 반복하여, 카나마이신 내성 캘러스를 선발하였다.

카나마이신 내성을 나타낸 형질 전환 캘러스를, 카나마이신 50 ㎎/ℓ, 카르베니실린 200 ㎎/ℓ를 첨가한 재분화용 배지에서 배양하여 카나마이신 내성 슈트를 얻었다. 얻은 슈트는 1/2 MS 배지 (카나마이신을 첨가하고 있지 않음)에서 발근 (發根)시킨 후, 순화 (馴化)를 하였다. 순화 개체는 분에 옮겨심은 후, 폐쇄계 온실에서 재배하여 개화시켰다. 그 후, 통상의 영양 증식 (꺾꽂이)으로 유지·증식을 실시하였다.

실시예 2 바이너리 백터 pSPB130 의 구축

안토시아닌을 방향족 아실기로 수식함으로써 안토시아닌을 안정화시키고, 또한 그 색을 파랗게 할 수 있다 (예컨대, PCT/JP96/00348). 아실화한 델피니딘형 안토시아닌의 생산을 목표로 하여, 이하의 실험을 실시하였다.

토레니아 (상품명: 서머 웨이브 (상표))의 꽃잎으로부터 total RNA를 얻고, 또한 이것으로부터 polyA+RNA를 조제하였다. 이 polyA+RNA로부터 λZAPII (Stratagene사)를 벡터로 하는 cDNA 라이브러리를 directional cDNA 라이브러리 제작 키트 (Stratagene사)를 사용하여 제조자가 권장하는 방법으로 작제하였다.

토레니아의 주요 안토시아닌은 그 5위의 글루코오스가 방향족 아실기에 의하여 수식되어 있기 (Suzuki et al. Molecular Breeding 6, 239-246, 2000) 때문에, 토레니아 꽃잎에 있어서는 안토시아닌 아실기 전이 효소가 발현하고 있다. 안토시아닌 아실기 전이 효소는 Asp-Phe-Gly-Trp-Gly-Lys라는 아미노산 배열이 보존되고 있고, 이것에 대응하는 합성 DNA를 프라이머로서 사용함으로써 안토시아닌 아실기 전이 효소 유전자를 취득할 수 있다 (PCT/JP96/00348).

구체적으로는, 토레니아 cDNA 라이브러리 작제시에 합성한 단일 가닥 cDNA 10 ng를 주형으로 하고, 100 ng의 ATC 프라이머 (5'-GA(TC)TT(TC)GGITGGGGIAA-3', I는 이노신, (TC)는 그 중 하나를 의미한다) (배열 번호: 1), 100 ng의 올리고 dT 프라이머 (5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTCTCGAG-3') (배열 번호: 2)를 프라이머로 하고, Taq 포리메라제 (다카라, 일본)를 사용하여 제조자가 권장하는 조건으로 PCR를 실시하였다. PCR는 95℃ 1 분, 55℃ 1 분, 72℃ 1 분를 1 사이클로 하는 반응을 25 사이클 실시하였다. 얻은 약 400 bp의 DNA 단편을 Gene Clean II (BIO, 101. Inc.) 에 의하여 제조자가 권장하는 방법으로 회수하고, pCR-TOPO에 서브 클로닝하였다.

그 염기 배열을 결정한 바, 용담의 아실기 전이 효소 유전자 (Fujiwara et al. Plant J. 16 421-431, 1998)와 상동인 배열을 볼 수 있었다. 또한, 염기 배열은 다이프라이머법 (어플라이드 바이오시스템즈사)을 이용하여 시퀀서 310 또는 377 (모두 어플라이드 바이오시스템즈사)을 사용하여 결정하였다.

이 DNA 단편을 DIG 표지 검출 키트 (니폰 로슈)를 사용하여 DIG에 의하여 표지하고, 제조자가 권장하는 방법으로 토레니아의 cDNA 라이브러리를 플라크 하이브리디제이션법에 의하여 스크리닝하였다. 얻은 포지티브 시그널을 나타낸 클론을 무작위로 12개 선택하고, 그것으로부터 플라스미드를 회수하여 염기 배열을 결정하였다. 이들은 안토시아닌 아실기 전이 효소에 좋은 상동성을 나타내었다. 이들 클론 중 pTAT7로 한 클론에 포함되는 cDNA의 전체 염기 배열을 결정하였다 (배열 번호: 3).

pBE2113-GUS (Mitsuhara et al: Plant Vell Physiol. 37, 45-59 1996)을 SacI로 소화한 후, 평활 말단화하여 8 bp의 XhoI 링커 (TaKaRa)를 삽입하였다. 이 플라스미드의 BamHI와 XhoI 부위에 pTAT7를 BamHI와 XhoI로 소화하여 얻은 약 1.7 kb의 DNA를 삽입하고, pSPB120를 얻었다. pSPB120를 SnaBI와 BamHI로 소화한 후 평활 말단화하여 라이게이션함으로써 pSPB120'을 얻었다. 한편, 팬지 유래의 F3',5'H#40 cDNA를 함유하는 플라스미드 pCGP1961을 BamHI로 완전 소화하고, 또한 XhoI로 부분 소화하여 얻은 약 1.8 kb의 DNA 단편을 회수하고, 이것과 BamHI와 XhoI로 소화한 pUE5H와 라이게이션하여 얻은 플라스미드를 pUEBP40로 하였다.

pUEBP40를 SnaBI와 BamHI로 소화한 후, 평활 말단화하여 라이게이션함으로써 pUEBP40'를 얻었다. pUEBP40를 HindIII로 부분 소화하여 얻은 약 2.7 kb의 DNA 단편을 회수하고, HindIII로 부분 소화한 DNA 단편과 연결하였다. 얻은 플라스미드 중에서, 바이너리 벡터 상에서 라이트 보더측으로부터, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 팬지 F3'5'H#40, 토레니아 5 AT 유전자의 순으로 각각 동일한 방향으로 연결된 바이너리 벡터를 pSPB130으로 하였다 (도 3). 본 플라스미드는 식물에 있어서는 팬지 F3'5'H#40 유전자와 5AT 유전자 구성적으로 발현하고, 유전자를 꽃잎 특이적으로 전사하도록 되어 있다. 이 플라스미드를 아그로박테리움 투메파키엔스 (Agrobacterium tumefaciens) Ag 10주에 도입하였다.

실시예 3. WKS82에의 팬지 F3'5'H#40 유전자와 토레니아 안토시아닌 5-아실기 전이 효소 유전자의 도입

갈색계 장미「WKS82」에 pSPB130를 도입하고, 89 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 해석을 실시한 44 개체 전체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다. 델피니딘 함유율은 최고 91% (평균 49%)이었다. 꽃의 색깔은 RHS 컬러챠트 186d (GREYED-PURPLE GROUP)에서 80c (PURPLE-VIOLET GROUP)로 변화하였다. 대표적인 형질 전환체의 해석값을 아래 표에 나타낸다.

Del: 델피니딘, Cya: 시아니딘, Pel: 펠라고니딘, M: 미리세틴, Q: 케르세틴, K: 켄페롤, Del (%): 총 안토시아니딘 중의 델피니딘의 비율, Acyl (%): 총 안토시아닌 중의 아실화한 색소의 비율, na: 해석 미실시

Del: 델피니딘, Cya: 시아니딘, Pel: 펠라고니딘, M: 미리세틴, Q: 케르세틴, K: 켄페롤, Del (%): 총 안토시아니딘 중의 델피니딘의 비율, Acyl (%): 총 안토시아닌 중의 아실화한 색소의 비율, na: 해석 미실시

실시예 4 각 기관에 있어서의 도입 유전자의 존재의 유무 확인

「WKS82」 (이하, 숙주라 한다) 및 실시예 3에서 작출한 재조합체 No. 5 및 No. 24 (WKS82/130-4-1 및 WKS82/130-9-1; 이하, 재조합체라 한다)의 꽃잎, 잎, 줄기, 뿌리 및 화분으로부터 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)를 사용하여 제조업자가 권장하는 방법에 따라서 게놈 DNA를 추출하였다. 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 TaKaRa Ex Taq (TaKaRa)에 의하여 PCR법으로 도입 유전자 (팬지 F3'5'H 유전자 (배열 번호 4), 토레니아 5AT 유전자 (배열 번호 3), 대장균 NPTII 유전자)의 증폭을 실시하였다.

또한, 내재성 콘트롤로서 장미의 안토시아니딘 합성 효소 (ANS) 유전자의 증폭을 실시하였다. PCR의 반응 조건은 열변성이 94℃에서 5 분간, 이어서 94℃에서 30 초, 55℃에서 30 초, 72℃에서 1 분의 사이클을 25 회 반복하고, 그 후, 신장 반응이 72℃에서 7 분간 이어졌다. 얻은 증폭산물을 아가로스 겔 전기 영동을 실시하여, 에티디움 브로마이드 염색에 의하여 증폭 단편의 검출을 실시하였다.

또한, 팬지 F3'5'H 유전자의 증폭에는 BP40-F2와 BP40-R3를, 토레니아 5AT 유전자의 증폭에는 TAT7-50F와 TAT7-R1을, NPTII 유전자의 증폭에는 NPTII-F와 NPTII-R을, ANS 유전자의 증폭에는 RhANS69-r1과 RhANS69-ml을 프라이머로서 사용하였다.

팬지 F3'5'H특이적 프라이머

BP40-F2:5'-GAG CTA GGC CAC ATG CTT A-3' (배열 번호: 5)

BP40-R3:5'-CTT TGC GCT CAT GAC TCG T-3' (배열 번호: 6)

토레니아 5AT 유전자 특이적 프라이머

TAT7-50F: 5'-AAC AAT ATG TGC AGT CCT CGA A-3' (배열 번호: 7)

TAT7-R1: 5'-AAC TCG CAT CGC CAA CTA C-3' (배열 번호: 8)

NPTII 유전자 특이적 프라이머

NPTII-F: 5'-GAT TGA ACA AGA TGG ATT GCA CGC-3' (배열 번호 9)

NPTII-R: 5'-CGA AGA ACT CCA GCA TGA GAT CCC-3' (배열 번호 10)

ANS 특이적 프라이머

Rh ANS 69-rl: 5'-TTT GAT CTT CCC ATT GAG C-3' (배열 번호 11)

Rh ANS 69-m1: 5'-TCC GCG GTG GGA AGA TCC CC-3' (배열 번호 12)

PCR에 의한 해석 결과, 이 유전자 재조합체의 꽃잎, 잎, 줄기의 게놈 중에서는 도입 유전자가 검출되었지만, 뿌리, 화분의 게놈에 있어서는 이들 도입 유전자는 검출되지 않았다. 표 3 및 도 1에 결과를 나타내었다.

또한, 꽃잎, 잎이나 줄기의 표피계, 꽃받침 조각, 수술, 암술은 L1층 및 L2층, 화분과 난세포는 L2층, 잎이나 줄기의 내부 조직, 뿌리는 L3층에 유래하는 것이 알려져 있다. 뿌리 및 화분의 게놈에 있어서 도입 유전자가 검출되지 않은 것으로 볼 때, 본 재조합체는 도입 유전자가 L1층에만 존재하는 키메라 식물인 것이 시사되었다.

실시예 5. 원예종과의 인공 교배 (온실 내)

통상의 방법에 따라, 원예종의 개화 직전에 제웅, 봉투 씌우기를 한 후, 암술이 충분히 성숙한 시점에서 맑은 날의 오전 중에 온실 내에서 재배한 숙주 또는 실시예 3에서 작출한 재조합체 No. 24 (WKS82/130-9-1; 이하, 재조합체라 한다)의 화분을 부착시켰다. 그 후, 다른 화분이 부착하지 않도록 다시 봉투 씌우기를 실시하고, 종자 형성의 유무를 조사하였다. 또한, 화분은 개열 전의 꽃밥 [약(葯)]을 회수한 후, 실리카겔을 넣은 데시케이터 내에서 1 일간 실온 방치하고, 다음날 개열한 꽃밥으로부터 회수한 신선한 화분을 사용하였다. 교잡 모본으로서 그랑데 플로라계 사철 개화성 장미 품종「퀸 엘리자베스」와, 플로리분다계 사철 개화성 장미 품종 「골드바니」를 사용하였다.

교배 후 1개월 이상 경과한 시점에서, 생리 낙과하지 않고, 결실이 인정된 과실에 대하여 종자 형성의 유무를 확인하였다. 또한, 재조합체와의 교배에 의하여 얻은 종자에 대하여는 후대에 있어서의 도입 유전자의 전달성을 확인하기 위하여, 얻은 종자로부터 Nucleon PHYTOPURE for PLANT DNA EXTRACTION KIT (Amersham Biosciences)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하고, 또한 REPLI-g Kit (QIAGEN)로 이것을 증폭한 후, PCR법으로 도입 유전자 (팬지 F3'5'H 유전자)를 검출하였다.

결과를 표 4에 나타내었다. 결실율은 숙주 및 재조합체간에 거의 차이는 인정되지 않았다. 또한, 재조합체와의 교배에 의하여 얻은 종자를 해석한 결과, 이들 종자에서는 도입 유전자는 전혀 검출되지 않았다. 이것으로부터, 화분의 수정 능력에 대하여는 숙주과 재조합체 사이에 차이는 없기는 하지만, 재조합체의 화분 세포중에는 도입 유전자가 포함되지 않은 등의 이유에 의하여, 도입 유전자는 후대에 전달되지 않는 것이 시사되었다.

실시예 6. 원예종과의 인공 교배 (야외)

통상의 방법에 따라서, 원예종의 개화 직전에 제웅, 봉투 씌우기를 한 후, 암술이 충분히 성숙한 시점에서 맑은 날의 오전 중에 야외에서 재배한 숙주 또는 실시예 3에서 작출한 재조합체 No. 24 (WKS82/130-9-1; 이하, 재조합체라 한다)의 화분을 부착시켰다. 그 후, 다른 화분이 부착하지 않도록 재차 봉투 씌우기를 실시하고, 종자 형성의 유무를 조사하였다. 또한, 화분은 개열 전의 꽃밥을 회수후, 실리카겔을 넣은 데시케이터 내에서 1 일간 실온 방치하고, 다음날 개열한 꽃밥으로부터 회수한 신선한 화분을 사용하였다.

교잡 모본으로서 그랑데 플로라계 사철 개화성 장미 품종「퀸 엘리자베스」와 플로리분다계 사철 개화성 장미 품종「골드바니」를 사용하였다.

교배 후 3개월 이상 경과한 시점에서, 생리 낙과하지 않고, 결실이 인정된 과실에 대하여 종자 형성의 유무를 확인하였다. 또한, 재조합체와의 교배에 의하여 얻은 종자를 회수하고, 4℃에서 3 개월간 저온 처리한 후, 파종하였다. 이들에 있어서의 도입 유전자의 전달의 유무를 확인하기 위하여, 얻은 실생의 잎으로부터 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하고, PCR법으로 도입 유전자 (팬지 F3'5'H 유전자)의 검출을 실시하였다. 또한, 내재성 컨트롤 유전자로서 장미의 글리세르알데하이드3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH) 유전자의 검출을 실시하였다.

또한, 종자를 저온 처리한 경우, 통상은 약 1 개월이면 발아가 관찰되지만, 3개월이 경과한 후에도 그 일부에서만 발아가 관찰되었다. 이에 발아하지 않은 파종 종자의 일부를 재회수하여, 종자를 이용하여 동일한 해석을 실시하였다. 재회수한 종자로부터, Nucleon PHYTOPURE for PLANT DNA EXTRACTION KIT (Amersham Biosciences)를 사용하여, 게놈 DNA를 추출하고, 또한 REPLI-g Kit (QIAGEN)로 이것을 증폭한 후, PCR법으로 도입 유전자 (팬지 F3'5'H유전자)의 검출을 실시하였다.

결과를 표 5 및 표 6에 나타낸다. 결실율은 숙주 및 재조합체 사이에 차이는 인정되지 않았다. 또한 재조합체와의 교배에 의하여 얻은 실생을 PCR법으로 해석하였지만, 이들 실생으로부터는 재조합체 유래의 도입 유전자는 검출되지 않았다. 또한, 어느 종자에 있어서도 재조합체 유래의 도입 유전자는 검출되지 않았다. 이것으로부터 화분의 수정 능력에 대하여는 숙주와 조합체 간의 차이는 없었으며, 조합체의 화분 세포 중에는 도입 유전자가 포함되어 있지 않은 등의 이유에 의하여 도입 유전자는 후대에 전달되지 않은 것이 시사되었다.

*1), 2): 회수 종자수와 해석 종자수의 차이는 종자의 속이 여물지 않은 것(종자의 속이 빈 것), DNA 추출이 불가능한 것, PCR 해석으로 대조군 유전자의 폭이 인정되지 않은 것은 이 해석의 대상으로부터 제외하였기 때문에 발생하였다.

실시예 7. 야생종과의 인공 교배(야외)

통상의 방법에 따라서 원예종의 개화 직전에 제웅, 봉투 씌우기를 한 후, 암술이 충분히 성숙된 시점에서 맑은 날 오전 중에 야외에서 재배한 숙주 또는 실시예 3에서 작출한 재조합체 No. 24 (WKS82/130-9-1; 이하, 재조합체라 한다)의 화분을 부착시켰다.

그 후, 다른 화분이 부착하지 않도록 재차 봉투 씌우기를 실시하고, 종자 형성의 유무를 조사하였다. 또한, 화분은 개열 전의 꽃밥을 회수한 후, 실리카겔을 넣은 데시케이터 내에서 1 일간 실온 방치하고, 다음날 개열한 꽃밥으로부터 회수한 신선한 화분을 사용하였다.

교잡 모본으로서 야생종은 찔레꽃 (R. multiflora Thunb . ex Murray), 돌가시나무 (R. wichuraiana Crep .), 해당화 (R. rugosa Thunb . ex Murray)를 사용하였다.

교배 후 2개월 이상 경과한 시점에서, 생리 낙과하지 않고, 결실이 인정된 과실에 대하여 종자 형성의 유무를 확인하였다. 또한 얻은 종자를 회수하여, 4 ℃에서 3개월간 저온 처리한 후 파종하였다. 이들에 있어서의 숙주 또는 재조합체와의 교잡의 유무, 도입 유전자의 전달의 유무를 확인하기 위하여, 얻은 실생의 잎으로부터 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)을 사용하여 게놈 DNA를 추출하고, PCR법으로 해석을 실시하였다. 숙주 또는 재조합체와의 교잡의 유무에 대하여는 사철 개화성에 관여하는 유전자 (KSN 유전자)를 지표로 하고, 도입 유전자의 전달의 유무에 대하여는 재조합체 유래의 도입 유전자인 팬지 F3'5'H 유전자를 지표로 하였다. 또한, 내재성 컨트롤 유전자로서 장미의 GAPDH 유전자를 사용하였다.

KSN 유전자는 한철 개화성 장미의 ksn 유전자 (경정 (莖頂)을 유지하는 기능이 있음)에 약 9 kb의 트랜스포존이 삽입되어 생긴 것으로, 이것에 의하여 당해 유전자의 발현이 억제되고, 경정에 있어서의 꽃눈의 형성 억제가 해제되기 때문에, 꽃눈 형성이 촉진되어 사철 개화성이 되는 것이 보고되어 있다^{1 )}. 원예종은 KSN 유전자를 호모로 가지고 있다. 한편, 한철 개화성의 야생종은 ksn 유전자를 호모로 가지고 있다. 따라서, 야생종 (한철 개화성)에 있어서는 KSN 유전자는 원예종과 교잡하였을 경우에만 검출될 것으로 생각된다.

또한, 종자를 저온 처리한 경우, 통상은 약 1 개월 내에 발아가 관찰되지만, 3 개월이 경과한 후에도 그 일부에서만 발아가 관찰되었다. 이에 발아하지 않은 파종 종자의 일부를 재회수하여, 종자를 사용하여 동일한 해석을 실시하였다. 재회수한 종자로부터, Nucleon PHYTOPURE for PLANT DNA EXTRACTION KIT (Amersham Biosciences)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하고, 또한 REPLI-g Kit (QIAGEN)로 이것을 증폭한 후, PCR법으로 숙주 또는 재조합체와의 교잡의 유무, 도입 유전자의 전달의 유무에 대하여 해석을 하였다.

결과를 표 7 및 표 8에 나타낸다. 결실율은 숙주, 재조합체 중 어느 것을 화분 부모로 한 경우에도 극히 낮았다. 얻은 실생을 PCR법으로 해석한 바, 숙주 또는 재조합체와 야생종과의 교잡은 인정되었지만, 재조합체 유래의 도입 유전자는 검출되지 않았다. 또한 발아하지 않은 파종 종자를 재회수하고, 종자의 충실에 대하고 관찰을 하였더니, 그 대부분이「속이 여물지 않은 것 (종자의 속이 빈 것)」이었고, 정상적인 배를 확인할 수 있는 개체는 극히 적었다. 이들에 대하여도 마찬가지로 PCR법으로 해석을 실시한 바, 숙주 또는 재조합체와 야생종과의 교잡은 인정되었지만, 재조합체 유래의 도입 유전자는 검출되지 않았다. 이것으로부터, 재조합체의 화분 세포 중에 도입 유전자가 포함되지 않은 등의 이유에 의하여, 도입 유전자가 후대에 전달되지 않은 것이라고 생각된다.

따라서, 상기 재조합체와 야생종 (찔레꽃, 돌가시나무, 해당화)이 교잡하였다고 하더라도, 재조합체의 화분 세포 중에 도입 유전자가 포함되지 않은 등의 이유로 도입 유전자가 후대에 전달될 가능성은 없는 것이 시사되었다.

또한, 돌가시나무에서는 어느 종자도 정상적인 배 (胚)를 확인할 수 없었다.

실시예 8 인 시투 (in situ) 하이브리디제이션

도입 유전자의 국재성을 더 상세하게 조사하기 위하여, 인 시투 (in situ) 하이브리디제이션을 실시하였다. 5 mm 정도의 크기의 눈 (bus)을 수직 방향으로 반으로 절단한 후, 포름알데히드 고정액에 침지하여 고정하였다. 다음으로, 탈수를 실시하기 위하여, 고정액을 50% 에탄올로부터 100% 에탄올로 차례로 치환하고, 또한 25% 레모졸로 치환 (투철)하였다. 그 후, 파라핀을 서서히 침윤시켜, 포매 (包埋)하였다. 포매 샘플을 마이크로톰으로 얇게 잘라서 슬라이드 글라스에 접착시켰다. 슬라이드 글라스를 수화하고, 프로테네스 K 처리, 아세틸화 등의 전처리를 한 후, 탈수, 건조시켰다. DIG 라벨한 프로브 (BP40, TAT, NPTII, 각 유전자의 안티센스 및 센스 프로브)를 하이브리디제이션 용액에 용해하고, 건조시킨 슬라이드 글라스에 놓고 반응시켰다. 하이브리디제이션 후, 슬라이드 글라스를 세정하고, DIG를 검출하였다.

도 2의 사진에 나타내는 바와 같이, 도입 유전자는 L1층의 세포에서만 발현하고 있고, L2층, L3층의 세포에서는 발현을 볼 수 없다. 이것으로부터, 도입 유전자는 L1층에만 존재하고 L2층, L3층에는 존재하지 않는 것, 그러므로 L2층으로부터 발현하는 생식 세포 (화분 세포나 배주 세포)에는 도입 유전자가 존재하지 않는 것이 증명되었다.

실시예 9: 재조합 카네이션의 작제와 해석

도입 유전자가 L1층에만 존재하는 카네이션을 작성하였다.

재조합 카네이션은 아그로박테리움을 사용하는 유전자 도입에 의하여, 이하와 같이 작제하였다. 플라스미드 pCGP2442 (Application No. US60/988, 293 출원일 2007년 11월 15일에 기재)는 그 T-DNA 영역에, 금어초 유래의 칼콘 합성 효소 유전자의 프로모터 제어하에 있는 사르비아 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자 cDNA, 페튜니아의 디히드로플라보놀 4-환원 효소의 염색 유전자, 카네이션 유래의 안토시아니딘 합성 효소 유전자, 그리고 형질 전환의 선발 마커로서 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 제어하에 있는 담배의 아세토락테이트 합성 유전자 SURBc DNA가 포함되어 있다. 이것을 특허 출원 특표평11-505116에 기재되어 있는 방법으로 아그로박테리움에 도입하고, 또한 카네이션 품종 콜티나 샤넬에 도입하였다. 얻은 재조합 카네이션의 꽃잎에는 천연 카네이션에는 포함되지 않는 델피니딘이 검출되었다. 이것은 도입 유전자가 적어도 꽃잎의 상피 세포에서 기능하고 있는 것을 나타낸다. 이 중 1 계통 (계통 19907)에 대하여 상세하게 해석하였다. 또한, 계통 19907로부터 염색체 DNA를 추출하고, 전술한 pCGP2442의 T-DNA 상의 유전자를 프로브로서 사용하여 서던 하이브리디제이션법 (Southern hybridization method)에 의하여 해석하였더니, 도입 유전자가 염색체에 삽입되어 있는 것이 확인하였다.

5 ㎍/L Glean을 함유한 호르몬 프리 MS 고형 배지에 계통 19907과 계통 26898의 슈트를 심음으로써 조직 배양물을 작제하였다. 4 내지 5 주 사이에 발근의 유무를 관찰한 바, 계통 26898은 발근하였지만, 계통 19907은 발근하지 않았다.

다음으로 계통 19907과 계통 26898 및 품종 콜티나 샤넬로부터 얻은 잎의 절편을 5 ㎍/L Glean을 함유하는 half-strength MS 고형 medium with 0.5 ㎎/ℓIAA와, Glean를 함유하지 않는 half-strength MS 고형 medium with 0.5 ㎎/ℓIAA상에서 5 주간 배양하였다. 5 ㎍/L Glean를 함유하는 배지에서 배양한 계통 19907과 품종 콜티나 샤넬의 잎편은 모두 갈변하였다. 계통 26898의 얻은 잎편은 녹색으로 발근을 볼 수 있었다.

계통 19907의 잎과 뿌리로부터 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN사)를 사용하여 염색체 DNA를 추출하였다. 이 DNA 100ng를 주형으로 하고, SuRB 유전자를 증폭하기 위한 합성 프라이머 (#960 5'-ATT TCC GCC TCA TTA GAA GG-3', #1468 5'-GCC TCA TGT TTC CAT TTG TGC-3')를 사용하여 PCR를 실시하였다. 반응은 Hot Star Taq를 사용하고, 25 ㎕의 반응 체적으로, 95℃의 반응을 15분 실시한 후, 96℃의 반응을 1분, 52℃의 반응 30초, 72℃의 반응을 2분 실시하는 1 사이클을 35 사이클 실시하고, 또한 72℃의 반응을 7분 실시하였다. 이 반응물을 아가로스 겔 전기 영동으로 해석하였더니, 잎 유래의 DNA를 주형으로 하였을 경우에는 SURB의 밴드가 관찰되었지만, 뿌리 유래의 DNA를 주형으로 하였을 경우에는 SURB의 밴드가 관찰되지 않았다.

잎은 L1, L2, L3 세포로 이루어지고, 뿌리는 L2, L3 세포로 이루어지는 것이 알려져 있다. 이상의 결과로부터, 계통 19907은 L1 세포에는 도입 유전자가 들어 있지만 L2, L3 세포에는 도입 유전자가 들어 있지 않은 것, 즉 계통 19907은 도입 유전자가 L1층에만 존재하는 키메라 식물인 것이 판단되었다.

실시예 10 각종 식물에 대하여, 본 발명 기술의 응용 가능성을 검토하였다.

(1) 페튜니아에의 감염예

화훼 식물로서 페튜니아를 사용하고, 외래 유전자로서 플라보노이드의 합성과 관련된 유전자를 도입하였다.

콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터 상류에 인핸서 배열을 2회 반복하여 가진 E1₂35S 프로모터 배열 (Plant Cell Physiol 37, 49-59 (1996))과, 안창 (Butterfly pea)의 F3'5'H cDNA 배열 (특허 출원 번호 WO 2004/020637에 기재), 노파린 합성 효소 (nos)의 터미네이터 배열을 바이너리 벡터 pBinP1us (Trangenic Research, 4, 288-290 (1995))에 도입되어 있는 pSPB748 (PlantCell Physio1. 43, s227 (2002))에 의하여, 안창 F3'5'H cDNA와 nos 터미네이터를 연결한 DNA 단편 (약 2.0 kb)을 BamHI 소화와 EcoRI의 부분 소화에 의하여 회수하고, pBluescriptII (sk-) (Stratagene사)의 BamHI/EcoRI 사이트에 도입함으로써, 플라스미드 pB-Bn으로 하였다. 마우스의 이물 응답 배열 (XRE)을 6회 반복하여 가진 6 xXRE 프로모터 배열과, GUS 유전자, nos 터미네이터를 pBluescriptII (ks+)(Stratagene)에 도입한 pBlueSXXREGUS (Kodama (2003) Molecular mechanisms of chemical-inducible gene expression in higher plants for monitoring and remediation of environmental contaminants, Diss.)로부터 GUS 유전자와 nos 터미네이터의 유전자 카세트를 XbaI와 KpnI로 뽑아내고, 동일 사이트에 pB-Bn로부터 XbaI와 KpnI 소화로 잘라낸 안창 F3'5'H와 nos 터미네이터의 연결한 DNA 단편 (약 2.0 kb)을 삽입하고, pB-X6Bn를 얻었다. 바이너리 벡터 pBin19 상에, CaMV35S 프로모터와 nos 터미네이터로 이루어지는 발현 유닛 2조에 알파파 모자이크 바이러스의 5' 비번역 (UTR) 배열을 각각 부가한 AhRV 및 Arnt를 순방향으로 삽입한 벡터 pSKAVAt (Kodama (2003))의 SalI 사이트에, pB-X6Bn를 XhoI 소화하여 잘라낸 6xXRE 프로모터 배열과 안창 F3'5'H cDNA, nos 터미네이터 배열의 유전자 카세트 (2.2kb)를 도입함으로써, pSPB1459를 구축하였다.

pSPB1459를 아그로박테리움 투메파키엔스 Ag 10주 (BioTechnology 9, 963-967 (1991))에 도입하고, 페튜니아 (품종 PL, Skr4 xSw63 (Nature, 366, 276-27과 동일))를 리프 디스크를 사용하는 아그로박테리움법으로 형질 전환하였다. 아그로박테리움에의 플라스미드의 도입, 형질 전환의 방법은 공지의 방법 (Plant J. 5, p81-92 (1994))에 의하였다. 품종 PL는 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자, 플라보노이드 3'-수산화 효소 유전자를 결손하고 있기 때문에 꽃의 색깔은 흰색 내지 옅은 분홍색이지만, 이 실험의 목적에는 사용하는 페튜니아 품종은 PL에 한정되는 것은 아니다. 독립된 형질 전환 페튜니아 PAB를 38 계통 취득하였다.

(2): 토레니아에의 감염예-1

화훼 식물로서 토레니아를 사용하고, 외래 유전자로서 선택 마커의 유전자인 GFP 유전자를 도입하였다.

CaMV35S-sGFP(S65T)-NOS3' (Curr. Bio1. 6, 325-330 (1996))을 BamHI와 EcoRI로 소화하고, sGFP 유전자와 nos 터미네이터 유전자의 연결 DNA (1.Okb)를 pBluescriptII (sk-)의 BamHI/EcoRI 사이트에 도입함으로써, 플라스미드 pB-Gn를 구축하였다. pBlueSXXREGUS-last로부터 GUS 유전자와 nos 터미네이터의 유전자 카세트를 XbaI와 KpnI로 뽑아내고, 동일 사이트에 pB-Gn으로부터 XbaI와 KpnI 소화하여 잘라낸 sGFP와 nos 터미네이터의 유전자 카세트 (1.0kb)를 삽입하여, pB-X6Gn을 구축하였다. pSKAVAt의 SalI 사이트에, pB-X6Gn를 XhoI 소화하여 잘라낸 6xXRE 프로모터와 sGFP, nos 터미네이터의 유전자 카세트 (1.2kb)를 도입하여, pSPB1458를 구축하였다.

pSPB1458를 아그로박테리움 투메파키엔스 Ag 10주에 도입하고, 리프 디스크를 사용하는 아그로박테리움법으로 토레니아 (품종 서머 웨이브 블루: SWB (선토리 플라워즈 가부시키가이샤)) 리프 디스크로 형질 전환을 실시하였다. 토레니아의 형질 전환은 공지의 방법 (Mol. Breeding 6, 239-246 (2000))에 의하였다. SWB의 꽃의 색깔은 파란 색이지만, 본 실험의 목적으로 사용하는 토레니아 품종은 SWB에 한정되는 것은 아니다. 독립된 형질 전환 토레니아 계통 TAG를 40 계통 취득하였다.

(3) 토레니아에의 감염예-2

화훼 식물로서 토레니아를 사용하여, 외래 유전자로서 플라보노이드의 합성과 관련된 유전자를 도입하였다.

WO 2005-059141에 개시되어 있는 방법에 준하여, 토레니아 품종 서머 웨이브 블루를 숙주 식물로 하여, 상기와 같은 아그로박테리움을 사용하는 방법에 의하여, 올론 합성에 관한 유전자의 발현 카세트와 안토시아닌 합성계 유전자의 발현을 RNAi에 의하여 억제하기 위한 카세트를 가진 컨스트럭트 (pSFL307 또는 pSFL308)를 도입하였다. 얻은 토레니아에서는 꽃의 색깔이 파란색으로부터 노란색으로 변화하였다.

(4) 담배, 바베나, 니렘베르기아에의 감염예

화훼 식물로서 담배, 바베나 또는 니렘베르기아를 사용하고, 외래 유전자로서 전사 인자 유전자를 도입하였다.

인산이 결핍된 조건하에서 발현하는 애기장대의 PHRI 유전자 (Genes & Development 15: 2122-2133 (2001))를 TOPO-TACloning Kit (인비트로젠가부시키가이샤)를 사용하여 해설서에 따라 pCR2. 1 벡터로 서브클로닝하였다. 프라이머 PHRf (5'-ATGGAGGCTCGTCCAGTTCAT-3')와 PHRr (5'-TCAATTATCGATTTTGGGACGC-3')를 사용한 PCR 반응으로 증폭한 산물을 서브 클로닝하여, pSPB1892로 하였다. 35S 프로모터의 인핸서 배열과 마노핀신타제 프로모터를 연결한 (Mac) 프로모터와 마노핀신타제 (mas) 터미네이터를 가진 바이너리 벡터 pSPB2311를 SmaI로 절단하여, pSPB2311A를 얻었다. pSPB1892를 EcoRI로 절단하고 평활화한 단편을 pSPB2311A에 삽입하여 pSPB2314를 얻었다.

이어서, 공지의 방법 (Plant J. 5, 81, 1994)에 기초하여 pSPB1898를 사용하여 아그로박테리움 (균주: Ag 10)를 형질 전환하고, 이 pSPB1898를 가진 형질 전환체 아그로박테리움을 사용하여, 담배, 바베나, 니렘베르기아의 형질 전환을 실시하였다. 담배, 바베나, 니렘베르기아의 형질 전환은 각각 공지의 방법 (Science 227, 1229, 1985; PlantCell Rep. 21, 459, 2003; Plant Biotech. 23, 19, 2006)에 기초하여 실시하였다. 얻은 식물체의 유전자 도입에 대하여는 각 식물체의 잎으로부터 DNA를 추출하고, PHR1 유전자를 템플레이트로 한 PCR에 의하여 확인하였다. 담배에서 11 개체, 바베나에서 16 개체, 니렘베르기아에서 1 개체의 PHRI 형질 전환 식물을 취득하였다.

(5) 아프리카 봉선화, 베르기아에의 감염예

화훼 식물로서 아프리카 봉선화 또는 베고니아를 사용하여 외래 유전자로서 전사 인자 유전자를 도입하였다.

아프리카봉선화 (Impatiens walleriana)의 형질 전환은 기본적으로 미국 특허 제6,121,511호에 따라서, 품종 글리터 레드 (사카다 시드)와 템포 핑크 (다키이 앤드 코포레이션)을 사용하여 실시하였다. Vitro 묘로부터 절출한 경정, 마디, 잎줄기, 잎편을 전배양 액체 배지 (1 ㎎/ℓ TDZ 첨가 MS 배지)로 5 일간 전배양한 후, 전배양 고형 배지 (0.05 ㎎/ℓ NAA, 6 ㎎/ℓ Zeatin, 0.3% 겔란 첨가 MS 배지)에 48 시간 정치하였다. 그 후 pSPB2314를 도입한 아그로박테리움 (균주 Ag 10)을 감염시키고, 선택 배지상 (0.05 ㎎/ℓ NAA, 6 ㎎/ℓ Zeatin, 100 ㎎/ℓKanamycin, 500 ㎎/ℓ Carbenicillin, 100 ㎎/ℓ Cefotaxime, 0.3% 겔란검 첨가 MS 배지)로 4 내지 8 주간 배양하여 슈트를 얻었다 (표 9). 잎편은 쉽게 갈변하여 슈트를 얻을 수 없었다. 경정 및 마디에서는 하나의 외식편으로부터 많은 슈트를 얻을 수 있지만, 위양성도 다수 포함되어 있는 것으로 생각된다. 잎줄기로부터의 슈트는 출현에 시간이 걸렸고, 수도 적었지만 가장 확실하였다.

베고니아 (Begonia Semperflorens)의 형질 전환은 품종 앰베서더 화이트와 앰베서더 스칼릿(사카다 시드)을 사용하여 실시하였다. Vitro 묘로부터 잎편과 잎줄기를 잘라내고, pSPB2314를 도입한 아그로박테리움 (균주 Ag 10)을 감염시키고, 공존 배양 배지 (0.5 ㎎/ℓ IAA, 0.1 ㎎/ℓ TDZ, 0.5% PVP, 2 ㎎/ℓAgNO3, 200μM Acetosyringone, 0.3% 겔란검 첨가 MS 배지) 상에서 암흑하에 3 일간 배양하였다. 그 후, 전선택 배지(1 ㎎/ℓBAP, 1 ㎎/ℓ Zeatin, 0.1 ㎎/ℓ IAA, 500 Timentin, 50 μM Acetosyringone, 0.3% 겔란검 첨가 MS 배지)에서 3 내지 5 일간, 선택 배지 1 (2 ㎎/ℓ TDZ, 0.1 mg/L NAA, 100 ㎎/ℓ Kanamycin, 500 ㎎/ℓ Timentin, 0.4)에서 2 주간, 선택 배지 2 (0.2 ㎎/ℓ BAP, 0.1 ㎎/ℓNAA, 100 ㎎/ℓKanamycin, 500 ㎎/ℓ Timentin. 0.4% 한천 첨가 MS 배지)에서 2 주간, 선택 배지 3 (100 ㎎/ℓ Kanamycin, 500 ㎎/ℓ Timentin, 0.4% 한천 첨가 MS 배지)에서 3 주간 연속하여 배양하였다. 그 사이에 형성된 슈트는 직경 5 mm 이상으로 성장하였을 때, 주위의 조직을 잘라내고, 선택 배지 4 (150 ㎎/ℓ Kanamycin, 500 ㎎/ℓ Timentin, 0.4% 한천 첨가 MS 배지)로 옮겨서 2 내지 3 주간 더 배양 후, 발근 배지 (10O ㎎/ℓKanamycin, 500 ㎎/ℓ Timentin, 0.4% 한천 첨가 MS 배지)로 옮겨 발근 슈트를 얻었다 (표 10).

이상과 같이, 장미나 카네이션 이외의 화훼 식물, 예를 들면 페튜니아, 토레니아, 담배, 바베나, 니렌, 아프리카봉선화, 베고니아 등에도 아그로박테리움을 사용하여 외래 유전자를 도입할 수 있는 것을 알 수 있었다. 도입하는 외래 유전자로서는, 여기서 예를 든 구체적인 유전자에 한정하지 않고, 도입 후에 L1세포에서 기능하는 유전자이면, 어떠한 유전자이든 동일한 방법으로 이들 화훼 식물에 도입할 수 있다고 생각한다. 본 발명의 기술은 아그로박테리움을 사용하여 외래 유전자를 도입할 수 있는 화훼 식물에 적응 가능하기 때문에, 이들 식물에 대하여도, 본 발명의 화훼 식물, 즉, 도입 유전자가 형질 전환체 식물의 일부의 세포에만 존재하고, 다른 세포에는 존재하지 않는 화훼 식물을 작출하는 것이 가능하다.

본 발명에 의하여 개시된 방법에 의하여 작출되는 형질 전환체 식물은 생식 세포 등을 포함하는 L2 세포층에는 도입 유전자가 없고, L1층의 세포에만 도입 유전자를 가진 키메라 식물이다. 이와 같은 형질 전환체는 생식 세포에 도입 유전자를 갖지 않기 때문에, 권한 없는 제3자에 의하여, 당해 유전자 재조합 식물이 자유롭게 교배 부모로서 이용될 가능성을 저지할 수 있다.

또한, 유전자 재조합 식물에 관하여는 자연계에의 도입 유전자의 확산이 염려되나, 이와 같은 생식 세포에 도입 유전자가 없는 유전자 재조합 식물을 작출함으로써, 도입 유전자 확산의 가능성이 완전히 부정된다. 따라서, 유전자 재조합 식물을 산업상 이용하고자 하는 사람에게 있어서는 유전자 재조합 식물의 상업 이용을 위한 승인 신청 (일본 국내에서는「유전자 재조합 생물 등의 사용 등의 규제에 의한 생물의 다양성의 확보에 관한 법률 (카르타헤나법)」에 의거한 생물 다양성 영향 평가 등)과 관련된 부담을 경감하게 된다.

<110> INTERNATIONAL FLOWER DEVELOPMENTS PROPRIETARY LIMITED <120> METHOD FOR PRODUCING PERICLINAL CHIMERA TRANSGENIC ROSE <130> 090909-ROSE <150> JP 2007-089259 <151> 2007-03-29 <150> JP 2007-202291 <151> 2007-08-02 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATC primer <220> <221> modified_base <222> (9) <223> i <220> <221> modified_base <222> (15) <223> i <400> 1 gayttyggnt ggggnaa 17 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo dT primer <400> 2 tttttttttt tttttttctc gag 23 <210> 3 <211> 1808 <212> DNA <213> Torenia <400> 3 cttcaaagcc aaaaagaaac aattaatcaa tggctgttga agcccccaaa acaatatgtg 60 cagtcctcga aaactctctt attacaccac aaagtaccga tacagaacaa actctttcac 120 tcacattctt tgacatcaaa tgggttcatt ttcatccaat gcaatgcctt gtgttgtaca 180 acttcccatg ttctaagtca cattttctcg aagccacagt tccgagcttc aaatcatcac 240 tctccaaaac tctcagacac tatcttccat tatcaggaaa cttatactat ccaaacccga 300 cccatgacat ggatgatgat gaatcgaaca 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cgcactagcc 180 aaactcgcta agaagtatgg tccgatcatg cacctaaaaa tgggcacgtg cgacatggtg 240 gtcgcgtcca cccccgagtc ggctcgagcc ttcctcaaaa cgctagacct caacttctcc 300 aaccgcccac ccaacgcggg cgcatcccac ctagcgtacg gcgcgcagga cttagtcttc 360 gccaagtacg gtccgaggtg gaagacttta agaaaattga gcaacctcca catgctaggc 420 gggaaggcgt tggatgattg ggcaaatgtg agggtcaccg agctaggcca catgcttaaa 480 gccatgtgcg aggcgagccg gtgcggggag cccgtggtgc tggccgagat gctcacgtac 540 gccatggcga acatgatcgg tcaagtgata ctcagccggc gcgtgttcgt gaccaaaggg 600 accgagtcta acgagttcaa agacatggtg gtcgagttga tgacgtccgc cgggtacttc 660 aacatcggtg acttcatacc ctcgatcgct tggatggatt tgcaagggat cgagcgaggg 720 atgaagaagc tgcacacgaa gtttgatgtg ttattgacga agatggtgaa ggagcataga 780 gcgacgagtc atgagcgcaa agggaaggca gatttcctcg acgttctctt ggaagaatgc 840 gacaatacaa atggggagaa gcttagtatt accaatatca aagctgtcct tttgaatcta 900 ttcacggcgg gcacggacac atcttcgagc ataatcgaat gggcgttaac ggagatgatc 960 aagaatccga cgatcttaaa aaaggcgcaa gaggagatgg atcgagtcat cggtcgtgat 1020 cggaggctgc tcgaatcgga catatcgagc ctcccgtacc tacaagccat tgctaaagaa 1080 acgtatcgca aacacccgtc gacgcctctc aacttgccga ggattgcgat ccaagcatgt 1140 gaagttgatg gctactacat ccctaaggac gcgaggctta gcgtgaacat ttgggcgatc 1200 ggtcgggacc cgaatgtttg ggagaatccg ttggagttct tgccggaaag attcttgtct 1260 gaagagaatg ggaagatcaa tcccggtggg aatgattttg agctgattcc gtttggagcc 1320 gggaggagaa tttgtgcggg gacaaggatg ggaatggtcc ttgtaagtta tattttgggc 1380 actttggtcc attcttttga ttggaaatta ccaaatggtg tcgctgagct taatatggat 1440 gaaagttttg ggcttgcatt gcaaaaggcc gtgccgctct cggccttggt cagcccacgg 1500 ttggcctcaa acgcgtacgc aacctgagct aatgggctgg gcctagtttt gtgggcctta 1560 atttagagac ttttgtgttt taaggtgtgt actttattaa ttgggtgctt aaatgtgtgt 1620 tttaatttgt atttatggtt aattatgact ttattgtata attatttatt tttcccttct 1680 gggtatttta tccatttaat ttttcttcag aattatgatc atagttatca gaataaaatt 1740 gaaaataatg aatcggaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1781 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BP40-F2 primer <400> 5 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Claims (36)

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26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 다음의 단계를 포함하는 외래 유전자가 L1층 내 세포에 포함되지만 화분의 세포 또는 배주의 세포에는 포함되지 않는 장미 식물을 제조하는 방법:

    외래 유전자를 아그로박테리움 투메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 매개시켜 장미 식물에 도입하는 단계; 및

    상기 외래 유전자가 L1층 내 세포에 포함되지만 화분의 세포 또는 배주의 세포에는 포함되지 않는 장미 식물을 선택하는 단계,

    상기 외래 유전자는 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자 및 방향족 아실기 전이 효소 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
30. 삭제
31. 제29항에 있어서, 상기 외래 유전자는 제비꽃과 식물 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자 및 현삼과 식물 유래의 방향족 아실기 전이 효소 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 제비꽃과 식물은 제비꽃과 팬지인 것인 방법.
33. 제31항에 있어서, 상기 현삼과 식물은 현삼과 토레니아인 것인 방법.
34. 제29항 및 제31항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 장미는 로사 하이브리다(Rosa hybrida)인 것인 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 장미는 하이브리드 티 장미, 플로리분다 장미 또는 미니 장미인 것인 방법.
36. 제34항의 방법에 의해 제조된 장미 식물, 또는 이의 영양증식체, 조직 또는 일부(part).

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