KR101455720B1 - 다효소기능을 가지는 신규 자일로시다아제 ｋｒｉｃｔ ｐｘｄ２ - Google Patents
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-
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Abstract
본 발명은 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열을 가지는 자일로시다아제(xylosidase)를 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 자일로시다아제는 다효소기능을 갖는다. 기존의 화학적 방법을 대체함으로써 폐기물 및 고가의 정제비용을 절감할 수 있으며, 우수한 자일란 분해활성을 나타내므로 사료 산업, 제지 및 세제 산업에서는 물론 섬유질계 바이오매스의 당화공정에 활용되어 석유 대체원료, 특수기능물질, 바이오 폴리머 등의 원료를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 다효소기능을 가지는 신규 자일로시다아제 KRICT PXD2에 관한 것이다.
21세기를 살아가는 인류는 화석연료 대체자원 개발이라는 커다란 숙제를 해결하기 위하여 8개 분야의 재생에너지(태양열, 태양광발전, 바이오매스, 풍력, 소수력, 지열, 해양에너지 및 폐기물에너지)와 3개 분야의 신에너지(연료전지, 석탄액화가스화 및 수소에너지)로 지정하였다. 이들 중에서 바이오매스만이 유일한 탄소자원이기 때문에 바이오매스 원료를 이용하여 바이오연료와 화학원료를 생산하는 바이오리파이너리 공정을 개발하여야 한다.
자연계에 존재하는 자일란(xylan)은 바이오매스 건조 중량의 10-30%를 차지하는 매우 중요한 탄소원임에도 불구하고 현재까지 직접적인 이용이 불가능하였기 때문에 대부분이 폐자원으로 처리되는 실정이다. 자일란의 가수분해는 현재까지 화학적 방법으로 주로 이루어지고 있다. 화학적 방법에 의한 자일란의 분해방법은 섬유소계 바이오매스에 황산을 첨가하고 130℃에서 스팀으로 가압하여 분해하므로 많은 양의 에너지를 소모할 뿐만 아니라, 산 및 고온에 견딜 수 있는 고가의 생산장비가 필요하다. 또한, 이때 발생하는 과반응 산물 및 폐기물은 환경오염을 유발하거나 분리, 정제비용 등으로 인하여 전체 생산단가가 높아지게 된다. 이에 반하여 엔도자일라나아제(endoxylanase)와 베타-자일로시다아제(ß-xylosidase)는 자일란을 분해하는 효소시스템으로써 엔도자일라나아제는 자일란의 내부 골격을 끊어 자일로올리고당을 만들며 베타자이로시다아제는 자일로올리고당의 말단을 공격하여 자일로스를 생산한다. 이와 같은 생물학적 방법에 의한 자일란의 분해방법은 화학적 분해방법과 비교할 때 에너지의 소모가 적고 발생하는 폐기물 역시 소량일 뿐만 아니라 그 처리가 용이하기 때문에 경제적으로도 매우 유리하다. 그러나 이러한 자일라나아제 효소시스템의 문제점은 엔도자일라나아제 및 자일로시다아제의 효소 역가가 낮아 반응속도 및 분해율이 낮고, 기존에 알려진 효소들의 특성이 산업적으로 이용하기에 적합한 내열성, 내알카리성을 충분히 가지지 못하고 있고, 또한 우리나라의 경우에는 이들 효소를 전적으로 수입에 의존하고 있다는 점이다. 따라서 자일라나아제 시스템의 이용을 위해서는 이러한 문제점들의 해결이 필요하다.
이러한 문제점을 해결하기 위해서는 기본적으로 내알칼리성 및 내열성을 갖는 국산효소의 개발이 우선적으로 선행되어야 하며, 경제적인 자일로시다아제 생산을 위해서는 대량생산 시스템이 갖추어져야 할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 자연계에 존재하는 바이오매스 건조 중량의 10-30%를 차지하는 자일란(xylan)을 산업적으로 이용하기 위해 자일란의 분해방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 기존의 많은 에너지를 소모하는 화학적 방법을 대체할 수 있는 내열성 및 내알칼리성의 신규한 자일로시다아제(xylosidase)를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 자일로시다아제를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 자일로시다아제를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 형질전환된 세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 올리고사카라이드 또는 폴라사카라이드의 분해 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 식품 내 자일란 가공용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 사료 첨가제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 제지공정용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열을 가지는 자일로시다아제(xylosidase)를 제공한다.
본 발명자들은 자연계에 존재하는 바이오매스 건조 중량의 10-30%를 차지하는 자일란(xylan)을 산업적으로 이용하기 위해 자일란의 분해방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 기존의 많은 에너지를 소모하는 화학적 방법을 대체할 수 있는 내열성 및 내알칼리성의 신규한 자일로시다아제(xylosidase)를 개발하였다.
본 발명의 자일로시다아제는 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 자일로시다아제는 35-45℃에서 최대 효소활성을 나타내고, 보다 바람직하게는 최적 온도는 37-43℃이며, 보다 더 바람직하게는 38-42℃이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 자일로시다아제는 pH 3.5-10.5에서 최대 효소활성을 나타내고, 보다 바람직하게는 최적 pH 4.0-9.0이고, 보다 더 바람직하게는 pH 4.0-7.0, 보다 더욱 더 바람직하게는 pH 4.0-5.0이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 자일로시다아제는 3-5의 미카엘리스-멘텐 상수(MichaelisMenten constant, Km) 값, 보다 바람직하게는 3.8-4.3 값을 갖는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열을 가지는 자일로시다아제를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 자일로시다아제 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 자일로시다아제의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 자일로시다아제와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.
본 발명의 자일로시다아제에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 자일로시다아제와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 자일로시다아제 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 예컨대 최소 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
바람직하게는, 핵산 분자는 서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 분자이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, T7 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL λ프로모터, pR λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터 및 trp 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pL λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann . Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pIVEX, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac. Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.
숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 자일로시다아제를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용한 숙주 세포는 E. coli (BL21)이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면. 본 발명의 자일로시다아제, 형질전환된 세포 또는 HPL-1 균주(KCTC11356BP)를 자일로오즈(xylose)-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드, 아라비노오즈(arabinose)-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드, 또는 글루코오즈(glucose)-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드에 접촉시키는 단계를 포함하는 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드의 분해 방법을 제공한다.
본 명세서에서, 상기 ‘자일로오즈(xylose)-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드’은 당업계에 공지된 다양한 자일로오스-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 자일로오스를 포함하는 다양한 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드는 자일란, 아라비노자일란(arabinoxylan), 헤미셀룰로오스(hemicellulose) 및 자일로피라노사이드(xylopyranoside)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 상기 ‘아라비노오즈(arabinose)-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드’은 당업계에 공지된 다양한 아라비노오즈-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 아라비노오즈-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드는 헤미셀룰로오즈, 펙틴, 아라비난(arabinan), 아라비노자일란(arabinoxylan), 아라비노갈락탄(arabinogalactan) 및 아라비노퓨라노사이드(arabinofuranoside)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 상기 ‘글루코오즈(glucose)-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드’은 당업계에 공지된 다양한 글루코오즈-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 글루코오즈-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드는 전분(starch), 셀룰로오즈, 수크로오즈(sucrose), 락토오스(lactose) 및 글루코피라노사이드(glucopyranoside)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 단계는 금속이온을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, Ca+2, Mn+2, Cu+2 또는 Zn+2를 추가적으로 포함하는 경우, 상기 자일로시다아제의 활성이 140-180% 증가한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 자일로시다아제, 형질전환된 세포 또는 HPL-1 균주(KCTC11356BP)를 포함하는 식품 내 자일란 가공용 조성물을 포함한다.
바람직하게는, 식품 재료의 연화 및 정제 효율개선, 점도감소 추출 및 여과 효율증대를 통한 품질향상에 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 자일로시다아제, 형질전환된 세포 또는 HPL-1 균주(KCTC11356BP)를 포함하는 사료 첨가제용 조성물을 포함한다.
바람직하게는, 가축의 사료 비전분 탄수화물의 감소, 장내 점도개선, 단백질 및 전분의 소화흡수율 증대를 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 자일로시다아제, 형질전환된 세포 또는 HPL-1 균주(KCTC11356BP)를 포함하는 제지공정용 조성물을 포함한다.
바람직하게는, 제지공정의 생물학적 백화공정, 공정의 단축, 탈묵효과, 전분과 글루텐의 분리 및 화학연료생산에 사용할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 다효소기능을 가지는 신규한 자일로시다아제를 제공한다.
(b) 본 발명의 자일로시다아제는 기존의 화학적 방법을 대체함으로써 폐기물 및 고가의 정제비용을 절감할 수 있다.
(c) 본 발명은 우수한 자일란 분해활성을 나타내므로 사료 산업, 제지 및 세제 산업에서는 물론 섬유질계 바이오매스의 당화공정에 활용되어 석유 대체원료, 특수기능물질, 바이오 폴리머 등의 원료를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 페니바실러스(Paenibacillus) 속 HPL-1의 전자현미경 사진으로 1.1 ㎛의 세포 크기와 2.5 내지 4.0 ㎛의 세포길이를 갖는 막대형(rod)의 그람양성 간균을 나타낸다.
도 2는 1,248개 gDNA 라이브러리로부터 활성클론 선별 결과를 나타낸다.
도 3은 형질전환체로부터 자일로시다아제를 분리정제 후 활성을 나타낸다.
도 4는 온도에 따른 자일로시다아제 활성을 나타낸다.
도 6은 자일로시다아제 분리정제 후 효소반응속도(kinetics)를 나타낸다.
도 2는 1,248개 gDNA 라이브러리로부터 활성클론 선별 결과를 나타낸다.
도 3은 형질전환체로부터 자일로시다아제를 분리정제 후 활성을 나타낸다.
도 4는 온도에 따른 자일로시다아제 활성을 나타낸다.
도 6은 자일로시다아제 분리정제 후 효소반응속도(kinetics)를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예
1: 균주 분리 및 균주 선별
균주 분리
본 발명의 균주는 충북 옥천군 군서면에 위치한 장수풍뎅이 사육농장에서 채취한 토양시료로부터 본원발명의 균주를 분리하였다. 상기 토양의 표층으로부터 2-5 ㎝ 층에서 토양시료를 채취, 풍건 후 2 ㎜ 채를 통과시켜 토양을 정선하였다. 30 g 정선된 토양을 270 ㎖의 멸균된 생리식염수(NaCl 8.0 g/ℓ)에 현탁하여 진탕배양기(37℃, 200 rpm)로 약 20분 동안 진탕한 후 상온에 30분 정도 방치하여 굵은 토양입자 및 불순물 등을 바닥으로 침전되게 하였다. 상청액을 멸균된 용기로 옮겨 1차 희석액으로 하였다. 이것을 잘 교반한 후 10 ㎖을 취하고 이에 90 ㎖ 생리식염수를 첨가하여 2차 희석액 100 ㎖을 제조하고, 2차 희석액을 충분히 교반하면서 같은 방법으로 10 ㎖을 취하여 90 ㎖ 생리식염수를 첨가하고 3차 희석액 100 ㎖을 제조하였다. 이후 동일한 방법으로 6차 희석액까지 제조하였다. 균주 분리용 TSA(Tryptic Soy Agar, Difco Co.) 배지에 3, 4, 5 및 6차 희석액을 0.25 ㎖씩 3회 반복으로 분주한 후, 균일하게 도말하여 37℃ 평상 인큐베이터에서 2일 동안 배양 후 형성된 미생물의 콜로니를 선별하였다. 이때 콜로니의 모양, 크기, 색상 등의 여러 가지 요인을 고려하여 분리하고, 분리된 콜로니는 다시 TSA 배지에서 계대 배양하여 순수한 균주를 분리하였고 이것을 모균주로 사용하기 위해 -70℃에 보관하였다.
균주 선별
순수하게 분리된 균주들 중에서 자일로시다아제 활성을 갖는 활성 균주 선별은 TSA 배지에 자작나무 자일란(Fluka Bio Chemika. Co.)이 0.5-1.0% 함유된 소프트 아가 더블 배지를 만들고 균주를 접종하여 하룻밤 배양한 후 다음날 Congo-red 염색법(Theater RM, PJ. Wood. Appl Environ Microbiol 43, 777-780, 1982; Beguin P. Analytical Biochemistry, 131(2):333-336, 1983)을 통해 배양된 콜로니 주변에 투명환(Halo)을 형성하는 균주 및 활성클론을 선별하였다. 선별된 균주의 자일란 분해능을 다시 한 번 측정하여 재현성을 확인하였고, 그 중 자일란 분해 능력이 가장 우수한 균주를 선발하여 자일로시다아제를 생산하는 미생물로 최종 선발하였다.
실시예 2: 균주 동정
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 가장 높은 활성을 지닌 자일로시다아제를 생산하는 균주를 30℃에서 배양한 후 그람 염색(Gram Staining) 및 포자 염색(Spore Staining)을 실시한 결과, 포자를 생성하는 그람양성 간균으로 확인되었다. 전자현미경으로 그 형태를 관찰한 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이 1.1 ㎛의 세포크기와 2.5 ㎛ 내지 4 ㎛의 세포길이를 갖는 막대형(rod)이었으며 편모를 가지지 않는 운동성이 없는 간균으로 나타났다. 또한, 상기 균주는 서열목록 제3서열로 기재되는 16S rRNA를 가지며, rRNA에 대한 상동성 분석 결과, 페니바실러스 속 페니바실러스 파비스포러스[Paenibacillus favisporus(GenBank 등록번호 AY308758)] 균주와 97.7%, 페니바실러스 파비스포러스[Paenibacillus favisporus(GenBank 등록번호 AY208751)]와 97.2%, 페니바실러스 파비스포러스 [Paenibacillus favisporus (GenBank 등록번호 EU798300)]와 97.1% 상동성이 있음을 확인하였기 때문에, 본 균주를 페니바실러스 속 HPL-1로 명명하였고, 한국생명공학연구원의 생명자원센터에 2008년 7월 17일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC11365BP이다.
실시예 3: 신규 자일로시다아제 분리
페니바실러스 균주의 유전자 라이브러리제작 및 활성검정
본 발명자들은 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 분리 동정한 페니바실러스 속 HPL-1 균주로부터 자일로시다아제 활성을 가지는 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하기 위하여 게놈 DNA를 추출 후 5 kb 이하 크기의 유전자 조각을 가지는 gDNA 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리의 제작은 균주로부터 추출한 DNA를 무작위 절단방법을 통하여 1-6 kb 크기의 DNA 조각으로 제조하고, 아가로스 젤에서 전기영동으로 크기를 선발하여 원하는 5 kb 전후 크기의 DNA 조각을 수득하였다. 이를 pCB31 플라스미드 벡터에 삽입 후 E. coli DH10B 세포에 형질전환하였다. 이렇게 제작된 라이브러리 1,248개의 클론을 고상 또는 액상 조건에서 자일로시다아제 활성을 시험하였다.
자일로시다아제
활성시험
분리된 균주, 활성클론, 형질전환체 및 분리 정제된 효소 등의 자일로시다아제 활성(자일란 분해능력) 측정은 다음과 같은 2가지 방법 중 하나 또는 모두를 사용하였다. 첫 번째 방법은 고체배양 측정방법으로 LB 배지에 자작나무 자일란(Fluka Bio Chemika. Co.)이 0.5-1.0% 함유된 소프트 아가 더블 배지를 만들고 균주를 접종하여 하룻밤 배양한 후 다음날 콩고레드 염색법을 통해 배양된 콜로니 주변에 투명환(halo)을 형성하는 균주 및 활성클론을 선별하였다. 두 번째 방법은 액체배양 효소활성 측정방법으로 자일로시다아제 분석법을 사용하였고, 구체적으로는 10 ㎕ p-니트로페닐(Nitrophenyl) β-D-자일로피라노사이드(Xylopyranoside,100 mM) 및 90 ㎕ 인산칼륨버퍼(100 mM, pH 7.0)에 피니파실러스 종(Peanibacillus sp.) 라이브러리를 37℃, 2일 동안 배양한 후 초음파 분해한 100 ㎕ 효소용액을 혼합하였다. 40℃에 10분 동안 반응한 후 흡광도(400nm)를 측정하였다. 효소의 1 유니트(unit)는 1분 동안에 1 g의 자일로시다아제가 1 m㏖의 환원당(자일로스)을 생산하는 효소활성으로 정의하였다. 액체배양 및 고체배양 활성시험을 통하여 상위 1개 클론 Peani-PXD2를 선발하였다(도 2).
자일로시다아제
활성클론 선발 및 유전자 분석
실시예 3의 ‘자일로시다아제 활성시험’에서 선발된 클론에 삽입된 절편 DNA의 염기서열을 분석하였다. 염기서열을 분석한 결과 플라스미드에 삽입된 DNA 절편의 크기는 4,795 bp(서열목록 제4서열)이었고, 이를 NCBI의 Blast P 및 Blast N 프로그램(//www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 암호화되어 있는 전사 해독틀(ORF, Open Reading Frame)을 분석하였다. 분석된 ORF 중 아미노산 100개 이상의 크기를 갖는 ORF 4개를 PXD2-O1, PXD2-O2, PXD2-O3 및 PXD2-O4 이라 명명하였다. 상기 ORF 중 유전자가 암호화하는 단백질의 상동성 검색결과 XylC와 86% 상동성을 가지는 PXD2-O1(서열목록 제2서열)을 표적으로 하여 그 염기서열을 바탕으로 NdeI(NEB)과 BamHI(NEB) 제한효소 인식부위를 첨가한 프라이머를 제작한 뒤 PCR 증폭 후 pGEM-T-Easy 벡터(Promega, 미국) 벡터에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로, 상기 재조합 플라스미드 주형 1 ng을 서열목록 제5서열(5'-ACATGCCATATGATGAAAAAACAAGGG-3')의 정방향 프라이머 및 서열목록 제6서열(5'-ACATGCGGATCCCTTACTCTAAAATAAACGAAG-3')의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍(10 p㏖)과 혼합한 뒤, PCR 증폭 조건은 PCR 프리믹스(GenetBio, 대한민국)를 사용하여 94℃에서 5분 동안의 변성(Denaturation)을 수행한 후 94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 결합(Annealing) 및 72℃에서 2분 동안 연장(Extension)을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 7분 동안 연장으로 마무리하고 4℃에서 유지한 뒤 반응을 종결하였다. PCR을 통해 증폭된 산물을 GENCLEAN II 키트(Q-Biogene, 미국)를 사용하여 정제하였고, pGEM-T-Easy 벡터에 T4 리가아제(RBC, 대만)를 사용하여 재조합 DNA를 제조하였다. 상기 재조합 플라스미드를 E. coli JM109에 형질전환 시켜 유전자 형질전환 대장균을 제조하였다. 상기 형질전환 대장균을 LB 액체 배지에서 배양한 후 HiYield™ 플라스미드 미니 키트(RBC, 대만)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하여 제한효소 NdeI(NEB, 영국) 및 BamHI(NEB, 영국)로 절단하였고, 이를 전기영동 하여 목적하는 DNA 절편이 삽입되어 있음을 확인하였다. 또한, 상기 형질전환 대장균을 실시예 3의 ‘자일로시다아제 활성시험’에서와 같이 액상의 조건에서 자일로시다아제 활성을 시험한 결과 자일로시다아제 활성을 보임을 확인하였다.
상기 형질전환 대장균의 목적 DNA 절편의 염기서열을 확인하여 서열목록 제1서열로 기재된 염기서열의 신규 자일로시다아제 유전자의 ORF를 재확인하였다(표 1).
자일로시다아제
과발현체
제작(
pIVEX
-
GST
-
PXD2
)
상기 신규 자일로시다아제를 과발현하는 형질전환 대장균을 제작하기 위해, Peani-PXD2 플라스미드를 주형으로 하여 서열목록 제5서열 및 서열목록 제6서열을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액 및 반응조건은 상기 실시예 3의 ‘자일로시다아제 활성시험’과 동일하게 실시하였다. 증폭된 산물을 정제하여 NdeI(NEB) 및 BamHI(NEB)으로 절단한 후, 단백질 과발현벡터 pIVEX-GST(Roche, 스위스)에 삽입시켜 재조합 과발현 플라스미드를 제작하였고, 이를 E. coli BL21(RBC, 대만)에 형질전환하여 자일로시다아제 과발현 형질전환 대장균을 제작하였다. 제작된 형질전환 대장균을 배양하여 플라스미드 DNA 추출 후 상기 제한효소를 이용하여 절단한 뒤 전기영동을 통해 벡터와 목적 DNA가 성공적으로 재조합되었는지 확인하였고, 확인된 균체를 LB 액체 배지에서(암피실린 100mg/L 첨가) 18시간 동안 배양(37℃, 250 rpm, A600=1.0)한 후 새로운 LB 액체 배지에 재접종하여 A595 흡광도 값이 0.4-0.6일 때 1 mM IPTG를 처리하고 18℃에서 18시간 더 배양한 후 균체를 수확하였다. 수확한 균체를 현탁하여 초음파 분쇄한 후 10,000 g에서 원심분리를 실시하여 상청액과 침전물로 분리하였고, SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 통하여 목적한 단백질이 상청액에 과발현됨과 분자량이 약 52 kD임을 확인하였다(도 3).
자일로시다아제
활성발현 조건 분석
실시예 3의 ‘자일로시다아제 과발현체 제작’에서 제작한 신규 자일로시다아제 과발현 형질전환 대장균으로부터 과발현 및 분리된 자일로시다아제의 활성을 pH, 온도 및 금속이온별로 실시예 3의 ‘자일로시다아제 활성시험’의 방법으로 조사하였다. 반응용액의 pH 조절은 구연산(Citric acid) 완충용액으로 pH 3-7을, 인산(Phosphate) 완충용액으로 pH 6-8을, 글라이신/수산화나트륨(Glycine/NaOH) 완충용액으로 pH 8-11으로 수행하였다. 금속이온으로는 1 mM의 CaCl2, MgCl2, MgCl2, CuCl2, ZnCl2 또는 FeCl3 등을 첨가하여 자일로시다아제 활성에 미치는 영향을 조사하였고, 기타 NaCl, LiCl, KCl, NH4Cl, EDTA, 2-ME(2-Mercaptoethanol), DTT(Dithiothreitol) 또는 PMSF(Penylmethylsulfonyl fluoride) 등의 염을 첨가하여 자일로시다아제 활성발현에 미치는 영향을 조사하였다.
그 결과, 신규 자일로시다아제는 pH 4에서, 도 4에서 나타난 바와 같이 40℃에서 최대 활성을 나타내었다. 또한, 표 2에 나타난 바와 같이 1 mM의 Ca+2, Mn+2, Cu+2 또는 Zn+2 등의 중금속 또는 첨가물에 의해서 p-니트로페닐 β-D-자일로피라노사이드에 대한 자일로시다아제 활성이 각각 156, 178, 156 및 144%로 증가되었다.
| 첨가제 | 첨가제 농도에 따른 상대적 활성(%) |
| 1 mM | |
| 음성 대조군 | 100 |
| NaCl | 112 |
| LiCl | 97 |
| KCl | 98 |
| NH4Cl | 101 |
| CaCl2 | 156 |
| MgCl2 | 125 |
| MnCl2 | 178 |
| CuSO4 | 156 |
| ZnSO4 | 144 |
| FeCl3 | 108 |
| EDTA | 115 |
| 2-ME | 117 |
| DTT | 106 |
| PMSF | 97 |
실시예
4: 신규
자일로시다아제의
대량 생산
서열목록 제2서열의 신규 자일로시다아제를 암호화하는 유전자(서열목록 제1서열)를 포함하는 pIVEX GST-xylosidase 재조합 벡터(Bioprogen Co., Ltd., 대한민국)를 대장균 BL21-Gold(DE)(Stratagene, 미국)에 형질전환 시킨 후 암피실린이 첨가(50 ㎍/㎖)된 액체배지(LB 25 g/L)에 접종하여 O.D.595 값이 0.4-0.6이 될 때까지 37℃에서 150 rpm의 조건으로 교반 배양하였다. 목표 단백질의 대장균 세포내 발현을 유도하기 위하여, 상기 현탁액에 IPTG(isopropyl-D-thiogalactoside)를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가한 후에 18℃에서 18시간 더 배양하였다. 배양액을 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 실시하여 회수한 침전물을 PBS로 2회 세척하였다. 세척된 침전물을 다시 PBS에 재현탁 후 초음파 파쇄기(Cosmo Bio Co., LTD)를 이용하여 균체를 파쇄한 후, 원심분리(12,000 rpm, 10분)하여 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액 속의 자일로시다아제를 순수분리하기 위해 글루타치온에스-트렌스퍼레이즈 컬럼(GST binding resin column, Novagen)을 사용하였다. 이때 자일로시나아제의 순수분리는 준비된 상청액을 완충용액(Washing buffer solution ; 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl; pH 7.0)으로 평형화된 글루타치온에스-트렌스퍼레이즈 컬럼(GST binding resin column, Novagen)에 부착 시킨 후, factor Xa 프로테아제(NEB, 영국)를 처리하고, 완충용액(50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl; pH 7.0)을 이용하여 순수분리하였다. 정제 단계에서 회수한 각각의 시료로부터 자일로시다아제 효소 활성을 측정 하였으며, 효소 활성 분획의 정제여부를 SDS-PAGE로 확인하였다. 단백질 함량은 브래드포드 방법(Bradford, Sigma Aldrich)을 이용하여 측정하였고, 표준 단백질로는 BSA(bovine serum albumin)를 사용하였다.
그 결과, 글루타치온 레진 컬럼크로마토그래피 법으로 간편하게 다량의 자일로시다아제를 생산할 수 있었다. 또한 레진에 결합된 자일로시다아제 상태로도 자일로시다아제 활성이 변화되지 않는 특성을 보여주었기 때문에 효소고정화 방법을 통한 고효율 전환공정에 적용할 수 있음을 알 수 있다. 상기 방법에 의해 정제된 효소는 정제하기 전의 효소보다 5배 이상의 활성을 나타내었다. 효소활성은 40℃에서 pH 3.0, pH 4.0, pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0, pH 9.0, pH 10.0, 및 pH 11.0에서 각각 0.10, 15.15, 2.97, 3.79, 4.57, 2.44, 2.64, 1.48 및 0.19 units(1분당 1g의 효소가 생산하는 자일로스 mM 량)으로 나타내었다.
특징적인 내용은 pH 4.0 및 40℃에서 p-니코페닐-β-D-자일로피라노사이드(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside), p-니트로페닐(N)-α-L-아라비노퓨라노사이드(p-nitrophenyl(N)-α-L-arabinofuranoside), p-N-β-D-글루코피라노사이드(p-N-β-D-glucopyranoside) 및 p-N-β-D-셀로비오사이드(p-N-β-D-cellobioside) 등의 기질을 사용할 경우에도 당화활성을 나타내어 비활성 5, 12, 4 및 3 유닛을 나타내었다. 즉, 다기능효소로서의 활용을 기대할 수 있었다. 그러나 p-N-α-D-글루코피라노사이드(p-N-α-D-glucopyranoside), p-N-α-L-아라비노피라노사이드(p-N-α-L-arabinopyranoside), p-N-β-L-아라비노피라노사이드(p-N-β-L-arabinopyranoside), p-N-β-D-만노피라노사이드(p-N-β-D-mannopyranoside) 및 p-N-β-D-갈락토피라노사이드(p-N-β-D-galactopyranoside) 등에 대해서는 활성을 나타내지 않았다.
실시예
5: 대량생산된 신규
자일로시다아제의
효소 특성
효소의 특성을 알아보기 위하여 정제된 자일로시다아제를 시험관에 넣고 다양한 양의 p-니트로페닐-β-D-자일로피라노사이드를 포함하는 50 mM 인산칼륨 버퍼(Potassium phosphate buffer, pH 7.0)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 10분 동안 반응시켜서 효소반응 속도(Hanes-woolf)를 조사하였다.
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 자일란 기질에 대한 친화도 Km 값은 4.091이었고, 가수분해 산물은 대부분이 자일로스였다. 자작나무 자일란 이외의 자일란(너도밤나무, 귀리 등)에 대한 자일로시다아제 활성도 유사하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY
<120> Novel Enzyme PXD2-01 Having Xylase Activity
<130> PN120303
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1425
<212> DNA
<213> PXD2-01
<400> 1
atgatgaaaa aacaagggct aaacccctat ctcccatcgt gggaatacat acctgacgga 60
gaaccgtacg tttttaacga cagagtttat gtatatggct cgcatgaccg ctttaacgga 120
catgtgtttt gtttaaacga ctacgcttgc tggtcggcac ccgttaatga tctaggcgac 180
tggcggtatg agggcgtgat ctacaccaaa acggatgacc cgctaaatcc tgatggcagg 240
atgtgtcttt atgcgccgga cgtcaccgtc ggaccggatg gtcgttatta cctttactat 300
gtcctggata aggttccggt tgtttcggtt gccgtctgcg atacacctgc tggaaagtat 360
gaattttacg gatacgtaaa atacgcggac ggtacacgct tgggcgaaag agaaggagat 420
gagccccagt ttgatccggg tgtattgaca gaagggaaga agacctactt atataccggc 480
ttctgtgcac ccaaggataa atccagacat ggcgcaatgg ccacggtgct tggtgaagat 540
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tattatcttg tctattcatc gattgtaatg catgaattat gttatgcgac cagtaaattt 720
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tcctacaaac cggcggacaa gccgatgtat tatggcggta ataaccatgg cagcattgtg 840
gaaatgaacg atagatggtt cattttttat catcgccata ccaacggtac ggcttttagc 900
cggcagggct gcatcgaacc gatcgtcatt cgggaggatg gaacgattcc tcaagtggaa 960
atgacctctt gcggtcccaa tgacggcccg cttgtgggtc gcggtgaata ccacgcctat 1020
ttggcatgta atctgttctg taaagacgaa gaattgtata caggcggctt cggctcaggg 1080
gtatggatgg acagccgttt tccgaagatc acgcaggagg gaagagacgg ggacgaagag 1140
atcggataca tcgcaaacat gacagactcc gctactgccg gtttcaagta tttcgactgc 1200
caaggaatac gtaaggtgaa aatcaaagtg cgtggttatt gccagggcaa ctttgaaatt 1260
aaaacggctt gggacggccc ggctctcgga aaaataaccg ttaactttac aaatatatgg 1320
acggaatatt caacggatct cgtcattccg gatggcatac aggctctata ttttacgtac 1380
acaggcagag gaagtgcgga tctggcttcg tttattttag agtaa 1425
<210> 2
<211> 474
<212> PRT
<213> PXD2-01
<400> 2
Met Met Lys Lys Gln Gly Leu Asn Pro Tyr Leu Pro Ser Trp Glu Tyr
1 5 10 15
Ile Pro Asp Gly Glu Pro Tyr Val Phe Asn Asp Arg Val Tyr Val Tyr
20 25 30
Gly Ser His Asp Arg Phe Asn Gly His Val Phe Cys Leu Asn Asp Tyr
35 40 45
Ala Cys Trp Ser Ala Pro Val Asn Asp Leu Gly Asp Trp Arg Tyr Glu
50 55 60
Gly Val Ile Tyr Thr Lys Thr Asp Asp Pro Leu Asn Pro Asp Gly Arg
65 70 75 80
Met Cys Leu Tyr Ala Pro Asp Val Thr Val Gly Pro Asp Gly Arg Tyr
85 90 95
Tyr Leu Tyr Tyr Val Leu Asp Lys Val Pro Val Val Ser Val Ala Val
100 105 110
Cys Asp Thr Pro Ala Gly Lys Tyr Glu Phe Tyr Gly Tyr Val Lys Tyr
115 120 125
Ala Asp Gly Thr Arg Leu Gly Glu Arg Glu Gly Asp Glu Pro Gln Phe
130 135 140
Asp Pro Gly Val Leu Thr Glu Gly Lys Lys Thr Tyr Leu Tyr Thr Gly
145 150 155 160
Phe Cys Ala Pro Lys Asp Lys Ser Arg His Gly Ala Met Ala Thr Val
165 170 175
Leu Gly Glu Asp Met Leu Thr Ile Met Glu Glu Pro Val Phe Val Ala
180 185 190
Pro Ser Glu Pro Tyr Ser Ala Gly Ser Gly Phe Glu Gly His Glu Phe
195 200 205
Phe Glu Ala Pro Ser Ile Arg Lys Lys Gly Asp Ile Tyr Tyr Leu Val
210 215 220
Tyr Ser Ser Ile Val Met His Glu Leu Cys Tyr Ala Thr Ser Lys Phe
225 230 235 240
Pro Thr Lys Gly Phe Ile Tyr Gln Gly Val Ile Ile Ser Asn Asn Asp
245 250 255
Leu His Ile Asp Ser Tyr Lys Pro Ala Asp Lys Pro Met Tyr Tyr Gly
260 265 270
Gly Asn Asn His Gly Ser Ile Val Glu Met Asn Asp Arg Trp Phe Ile
275 280 285
Phe Tyr His Arg His Thr Asn Gly Thr Ala Phe Ser Arg Gln Gly Cys
290 295 300
Ile Glu Pro Ile Val Ile Arg Glu Asp Gly Thr Ile Pro Gln Val Glu
305 310 315 320
Met Thr Ser Cys Gly Pro Asn Asp Gly Pro Leu Val Gly Arg Gly Glu
325 330 335
Tyr His Ala Tyr Leu Ala Cys Asn Leu Phe Cys Lys Asp Glu Glu Leu
340 345 350
Tyr Thr Gly Gly Phe Gly Ser Gly Val Trp Met Asp Ser Arg Phe Pro
355 360 365
Lys Ile Thr Gln Glu Gly Arg Asp Gly Asp Glu Glu Ile Gly Tyr Ile
370 375 380
Ala Asn Met Thr Asp Ser Ala Thr Ala Gly Phe Lys Tyr Phe Asp Cys
385 390 395 400
Gln Gly Ile Arg Lys Val Lys Ile Lys Val Arg Gly Tyr Cys Gln Gly
405 410 415
Asn Phe Glu Ile Lys Thr Ala Trp Asp Gly Pro Ala Leu Gly Lys Ile
420 425 430
Thr Val Asn Phe Thr Asn Ile Trp Thr Glu Tyr Ser Thr Asp Leu Val
435 440 445
Ile Pro Asp Gly Ile Gln Ala Leu Tyr Phe Thr Tyr Thr Gly Arg Gly
450 455 460
Ser Ala Asp Leu Ala Ser Phe Ile Leu Glu
465 470
<210> 3
<211> 1404
<212> RNA
<213> HPL-1 16S rRNA
<400> 3
tagagtttga tcatggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag 60
cggacttgat ggagagcttg ctctcctgat ggttagcggc ggacgggtga gtaacacgta 120
ggcaacctgc ctgcaagacc gggataaccc acggaaacgt gagctaatac cggatatctc 180
atttcctctc ctgagggaat gatgaaagac ggagcaatct gtcacttgcg gatgggcctg 240
cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct 300
gagagggtga acggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 360
gtagggaatc ttccgcaatg ggcgaaagcc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag 420
gttttcggat cgtaaagctc tgttgccagg gaagaacgtc cggtagagta actgctatcg 480
gagtgacggt acgtgagaag aaagccccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 540
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aagcgaagcc gcgaggtgga gccaatccta tcaaagctgg tctcagttcg gattgcaggc 1320
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<210> 4
<211> 4795
<212> DNA
<213> Peani-PXD2
<400> 4
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gcaagtcgtc ctgagcggat tgcagaagac aaagctgcat tgaacacagt cattccggca 120
gctttctggg aagaaatgcg cgaacaaaaa ctggtagcac cccatgcacc gctgcctatc 180
gacatgaaat caatagggga gtaatgaaca tggcacatac ggctgtctgg cagttttacc 240
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gaggaacctg tatttgtcgc cccaagtgaa ccttacagtg cgggaagcgg gtttgaaggg 1740
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atttatcagg gcgtcatcat aagcaacaat gatcttcaca tcgattccta caaaccggcg 1920
gacaagccga tgtattatgg cggtaataac catggcagca ttgtggaaat gaacgataga 1980
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cccaatgacg gcccgcttgt gggtcgcggt gaataccacg cctatttggc atgtaatctg 2160
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catgattatc agtttgccac gattgtacgc aacacgcttg tcctgagctt attgaaggtc 3060
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gggcttgccg tcggcagtgc aatttggaag gaaatgggct ggtggacgat catcttcctg 3360
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ttcaaggttg gtctgagtga cgggcgattc tcctacgcgg cagcaatcga tctcattcag 3660
tccgtcatct ccgtcatttt gatattttcc agtaacttca ttgccaagcg ggtgtcaggg 3720
tcaagcttat tctaaaaagg agggctggtg gtgcttaaga gccaaagaca gaaggatgtt 3780
atttttgaca gctttattta catcatgttg tttatattga tgctcatcat gctgtatcca 3840
ttctattatg tattcatcgc ctcgtttaac aaaggctccg atacgctcct gggaggcatt 3900
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tattttacgg tcatcatttt cgcgatgtac ttttccggcg gattgattcc ttattatgtt 4140
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gtctcgacgc cggtactcgc cacgatggcg ttatttatgg gcgtcggcca atggaattca 4380
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atggaagtga tcaacaagag caacacgccg ctggattcca ttgccgtagc aaacagtgcc 4500
tcggcttcgg ccggagtgac gagcttctcg ctgcaggtga cggcgatggt catctccatc 4560
gtgccgatca tatgcgtata cccgtttttg caaaaatatt ttgtgcatgg aattatgtta 4620
ggatctgtga aagggtaaat cgttgtttct atatttaacc gcttacatta aaataccagt 4680
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ctgtctgcga tcgaattcct gcagcccggg ggatccacta gttctagagc ggccg 4795
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<211> 27
<212> DNA
<213> foward primer
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<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> reverse primer
<400> 6
acatgcggat cccttactct aaaataaacg aag 33
Claims (8)
- 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 자일로시다아제(xylosidase).
- 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 자일로시다아제(xylosidase)를 코딩하는 핵산 분자.
- 상기 제 2 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
- 상기 제 3 항의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포.
- 상기 제 1 항의 자일로시다아제(xylosidase) 또는 상기 제 4 항의 형질전환된 세포를 자일로오즈(xylose)-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드, 아라비노오즈(arabinose)-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드, 또는 글루코오즈(glucose)-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드에 접촉시키는 단계를 포함하는 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드의 분해 방법.
- 상기 제 1 항의 자일로시다아제(xylosidase) 또는 상기 제 4 항의 형질전환된 세포를 포함하는 식품 내 자일란 가공용 조성물.
- 상기 제 1 항의 자일로시다아제(xylosidase) 또는 상기 제 4 항의 형질전환된 세포를 포함하는 사료첨가제용 조성물.
- 상기 제 1 항의 자일로시다아제(xylosidase) 또는 상기 제 4 항의 형질전환된 세포를 포함하는 제지공정용 조성물.
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120071675A KR101455720B1 (ko) | 2012-07-02 | 2012-07-02 | 다효소기능을 가지는 신규 자일로시다아제 ｋｒｉｃｔ ｐｘｄ２ |
Publications (2)
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|---|---|
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ID=50140344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020120071675A KR101455720B1 (ko) | 2012-07-02 | 2012-07-02 | 다효소기능을 가지는 신규 자일로시다아제 ｋｒｉｃｔ ｐｘｄ２ |
Country Status (1)
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|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012030845A2 (en) * | 2010-08-30 | 2012-03-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same |
-
2012
- 2012-07-02 KR KR1020120071675A patent/KR101455720B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012030845A2 (en) * | 2010-08-30 | 2012-03-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Biochem J., Vol. 321, Pages 375-381 (1997.01.15.) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20140004340A (ko) | 2014-01-13 |
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