KR101219518B1

KR101219518B1 - 내열성，광범위 ｐＨ，고활성 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 ｓｐ．ＨＰＬ-００３ 균주，이로부터 분리한 신규 자일라나아제 효소 및 이의 형질전환체를 이용한 이의 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR101219518B1
Application number: KR1020100061341A
Authority: KR
Inventors: 황인택; 박노중; 임희경
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2010-06-28
Filing date: 2010-06-28
Publication date: 2013-01-11
Also published as: KR20120000856A

Abstract

본 발명은 신규 페니바실러스 속 균주, 이로부터 분리한 신규 단백질에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 속 균주, 이로부터 분리한 고온 및 광범위 pH에서 고활성을 가지는 신규 자일라나아제 및 이의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 페니바실러스 속 HPL-003(Paenibacillus sp. HPL-003, KCTC18179P) 균주 및 자일라나아제는 고온 또는 광범위 pH에서 높은 활성으로 다양한 섬유소 바이오매스의 주성분인 자일란을 분해함으로써 바이오 연료 및 대체원료, 특수기능물질, 바이오 폴리머, 식품 및 사료 등의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

내열성，광범위 ｐＨ，고활성 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 ｓｐ．ＨＰＬ-００３ 균주，이로부터 분리한 신규 자일라나아제 효소 및 이의 형질전환체를 이용한 이의 대량 생산 방법{A Paenibacillus sp．HPL-００３ strain for producing xylanase and an thermostable，wide pH spectrum，and highly active xylanase produced thereby and a transgenic mass-producing method thereof}

본 발명은 신규 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 속 균주에 관한 것이다.

이산화탄소 방출저감 등 국제 환경규제에 대응하기 위하여 21세기를 살아가는 인류는 화석연료 대체자원 개발이라는 숙제를 안고 있으며, 지구온난화 및 석유자원 고갈에 대비하여 태양에너지, 풍력과 수력, 원자력, 바이오매스 등을 주요 대상으로 연구하고 있다. 이들 중에서 목질계 섬유소 바이오매스 원료를 당화하여 바이오연료와 화학원료를 생산하는 바이오리파이너리 공정에서는 목질계 원료 속에 포함되어 있는 15-30%의 자일란이 부산물로 생성되는 것을 피할 수 없으며, 현재까지 직접적인 이용이 불가능하기 때문에 대부분이 폐자원으로 처리되고 있는 실정이다.

현재까지 자일란의 가수분해는 화학적 방법으로 주로 이루어지고 있는데 섬유소계 바이오매스에 황산을 첨가하고 130℃에서 스팀 가압하여 분해하는 방법으로 분해 산물인 자일로스와 자일로올리고당의 형태로 전환되지만 과반응에 의한 여러 가지 불순물들이 부가적으로 생성되기 때문에 이의 정제기술을 필요로 한다. 또한 많은 양의 에너지를 소모할 뿐만 아니라 산 및 고온에 견딜 수 있는 고가의 장치가 필요하고, 또한 이때 발생하는 폐기물의 처리비용 등으로 인하여 생산단가가 높아지게 된다. 이에 반하여 자일라나아제(헤미셀룰로오스의 주성분인 자일란을 자일로스로 분해하여 당화하는 효소를 일반적으로 자일라나아제 효소로 통칭하고 있음)를 이용하는 생물학적 방법에 의한 자일란의 분해방법은 화학적 분해방법과 비교할 때 에너지의 소모가 적고 발생하는 폐기물 역시 소량일 뿐만 아니라, 그 처리가 용이하기 때문에 경제적으로도 매우 유리하다.

이와 같이 자일라나아제(Xylanase)는 바이오리파이너리(바이오화학산업) 공정에서 절실하게 요구될 뿐만 아니라 제지의 표백공정, 사료효율 개선, 과일음료의 청정화, 제빵의 고품질화 또는 농산 부산물 이용 등 다양한 용도로 활용될 수 있다. 지금까지 여러 가지 미생물에 의해 생산되었는데, 특히 제지산업에서는 표백공정에 응용하기 위한 내알칼리성 또는 내열성 자일라나아제(xylanase)가 여러 세균으로부터 분리되었고(Tenkanen, M. et . al ., Enzyme. Microb. Technol, 14, 566-574, 1992), 셀룰라제(cellulase)의 활성이 없는 자일라나아제(xylanase) 생산균도 다수 보고되어 제지용 셀룰라제(cellulose)의 손실을 줄이고자 하는 연구결과가 보고되어 있다(Khashin, A. et . al ., Appl. Environ. Microbiol, 59, 1725-1730, 1993; Kosugi, A. et . al ., J. Bacteriol, 183, 7037-7043, 2001). 또한, 자일라나아제(xylanase)를 처리하여 빵의 품질을 개선하거나(Courtin, C. M. et. al ., J. Agric. Food. Chem, 47, 1870-1877, 1999), β-자일로시다제(β-xylosidase) 및 자일라나아제(xylanase)의 유전자가 도입된 효모로서 농임산 부산물을 미생물이 이용할 수 있도록 당화시키는 연구가 보고되었다(La Grange, D. C. et . al ., Appl. Environ. Microbiol, 67, 5512-5519, 2001). 현재 사료산업에서는 자일라나아제(xylanase)가 사료첨가용 효소로 시판되어 사용되고 있는데, 상기 효소는 곡물 사료 섭취시 헤미셀룰로즈(hemicellulose)로 인한 가축의 장내의 점질도를 낮추어주는 기능을 함으로써 가축의 소화기 질병을 예방하고 사료효율을 향상시키는 것으로 알려져 있다(McCracken, K. J. et . al ., Br. Poult. Sci, 42, 638-642, 2001).

지금까지 보고된 자일라나아제 생산 미생물 중 트리코더마(Trichoderma) 속 곰팡이 균주들이 주로 이용되었는데, 이들의 효소 생산성은 자일라나아제를 생산하는 세균에 비해 대체로 우세하지만 주로 산성조건에서 최대 활성을 나타낸다(Tenkanen et al ., Enzyme and Microbial Technology 14(7):566-574, 1992). 자일라나아제를 생산하는 세균으로는 애로모나스(Aeromonas) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 아스퍼질루스(Aspergillus) 속 등이 있으며, 세균에 따라 생산하는 자일라나아제의 특성도 다양하며, 이들 효소를 암호화하는 유전자들도 다양하게 보고되어있다.

자일라나아제 효소에 대한 국내외 기술현황으로는 경희대 정대균 박사 팀에서 섬유소 분해효소를 생산하는 Trichoderma sp. C-4 균주를 선별하였지만 산업화를 위해서는 더 높은 활성이 요구되고 있다(Sul et al ., Appl Microbiol Biotechnol. 66(1):63-70, 2004). 동해대 강명규 박사 팀에서 내알카리성 자일라나아제를 생산하는 Cephalosporium sp. RYM-202 균주를 선별하여 펄프공정에 이용가능성을 연구하고 있다(강명규 외, 한국환경생물학회지 17(2):191-198, 1999). KAIST의 김정회 교수 팀에서는 Bacillus 유래의 효소(Endoxylanase)를 세포외부로 생산하는 재조합 균주인 Bacillus subtilis DB104/pJHKJ4를 구축하였다(Kim JH et al ., J. Microbiol . Biotechnol ., 10(4):551-553, 2000). 국외의 경우 대만에서는 혐기성 곰팡이 Neocallimastix patriciarum으로부터 유전자 복제된 자일라나아제가 방향적 효소진화 방법을 통하여 내염기성이 증가한 사례가 있으며(Yew-Loom Chen et al ., Can . J. Microbiol . 47(12):10881094, 2001) 최근에는 펄프공정 후 발생하는 폐수로부터 내염기성 균주인 Bacillus firmus가 분리 동정되었다(Pochih Chang, Biochemical and Biophysical Research Communications 319:1017-1025, 2004). 이 자일라나아제는 pH 4부터 pH 11까지의 넓은 범위에서 높은 활성이 있으며, 62℃에서 16시간을 배양하여도 초기 활성의 70% 정도의 잔여활성을 보일 정도로 높은 내열성이 있다. 이와 같이 세계 여러 나라에서 다양한 균주를 발굴하고 방향진화적인 진화를 통하여 기능을 향상시키고 있다.

기존의 자일라나아제와 관련된 특허를 살펴보면 자일라나아제를 생산하는 균주를 동정한 후 이들 야생균주를 이용하거나 대장균 등을 이용한 재조합 균주를 만들어 자일라나아제를 생산하는 방법을 이용하고 있다(국제공개특허 제 93/08275호, 국제공개특허 제 92/01793호, 국제공개특허 제 92/17573호, 대한민국 공개특허 제10-0072225호, 대한민국 공개특허 제 10-02211204호, 대한민국 공개특허 제10-0411771호). 또한 사료첨가제로서의 자일라나아제 관련 특허로는 자일라나아제를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 ＷＬ-2 균주에 대한 특허(대한민국 공개특허 제2001-0111986호), 고초균 유래 엔도 자일라나아제의 신호서열 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 및 그를 이용한 외래단백질의 제조방법에 관한 특허(대한민국 공개특허 제2000-0034279호), 바실러스 속 AMX-4(Bacillus sp. AMX-4) 균주의 자일라나아제(xylanase)를 코드화하는 신규한 자일라나아제 유전자에 관한 특허(대한민국 공개특허 제 2003-0085679호) 등이 있다.

현재 알려진 국내의 자일라나아제 관련 특허로는 자일라나아제를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 ＷＬ-2 균주에 대한 특허(대한민국 공개특허 2001-0111986), 고초균 유래 엔도자일라나아제의 신호서열 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 및 그를 이용한 외래단백질의 제조방법에 관한 특허(대한민국 공개특허 2000-0034279), 바실러스속 AMX-4(Bacillus sp. AMX-4) 균주의 자일라나아제(xylanase)를 코드하는 신규한 자일라나아제 유전자(대한민국 공개특허 2003-0085679) 및 신규한 패니바실러스 sp. HY-8 균주의 자일라나아제(대한민국 공개특허 2007-0082329) 등이 있으나 명확한 효소활성에 대한 언급이 없거나 실제로 국내에서 여러 분야에 사용되지 못하고 있다. 그러나 앞으로 바이오매스 기반의 각종 부가가치 화합물 특히 고분자화합물(플라스틱 등)의 중합 및 생산기술이 개발되고 있기 때문에 새로운 특성을 가지는 자일라나아제의 개발이 어느 때보다 시급하게 요구되고 있다.

바이오매스의 효율적인 활용을 위해서는 셀룰라아제를 이용한 셀룰로오스의 당화공정 개발은 물론 자일라나아제를 이용한 헤미셀룰로오스의 당화공정 개발이 동시에 이루어져야 할 것이다. 자일라나아제를 이용하는 효소적 당화공정은 바이오매스의 전처리 방법에 따라 요구되는 효소의 특성이 구분되는데, 산을 이용한 바이오매스 전처리의 경우 내산성 당화효소가 요구되지만 현행 펄프 및 제지공정이나 알칼리를 이용한 바이오매스 전처리 후 당화공정에서는 내알칼리성 당화효소가 요구된다. 또한 당화 및 발효 동시공정을 위해서는 내열성이 요구되기도 한다. 그러나 상품화된 자일라나아제는 산성 조건에 알맞은 것들이 대부분이기 때문에 알칼리 조건에서 활성을 가지는 자일라나아제의 개발이 요구되고 있다. 더욱 좋기로는 산성 및 알칼리조건 모두에서 활성이 높은 자일라나아제의 개발이 요구되고 있다. 따라서 산업에 직접적인 이용을 위해서는 기존의 자일라나아제가 아닌 신규의 미생물 및 효소 시스템을 탐색하여 높은 온도 및 pH 조건하에서도 활성도를 유지하는 자일라나아제 유전자의 확보가 필요하며, 이를 통하여 기존의 특허 등으로 인해 발생하는 문제를 해결할 수 있을 것이다.

이에, 본 발명자들은 기존의 자일라나아제 및 이를 생산하는 균주들이 모두 선진 개발국들에 의해서 과점 되고 있는 지적재산권을 회피 또는 타파하기 위하여 국내에서 자체개발함은 물론 세계적으로 영역을 확대할 수 있게 하기 위하여, 신규한 자일라나아제를 개발하던 중, 신규 페니바실러스 속 HPL-003(Paenibacillus sp. HPL-003) 균주 및 이로부터 생산된 자일라나아제가 다른 자일라나아제와 비교하여 지금까지 보고된 활성단위(Unit = mM product/mg protein/min), 내열성, 최적 pH의 범위 모두에서 가장 우수한 것을 고체배양 측정방법 및/또는 액체배양 효소활성 측정방법으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 고온 및 광범위 pH에서 높은 활성을 가지는 자일라나아제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 자일라나아제를 생산하는 균주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 자일라나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 배지에 균주 또는 상기 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 자일라나아제, 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 포함하는 자일란 분해제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 자일라나아제를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 자일라나아제를 포함하는 사료첨가제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 자일라나아제를 포함하는 제지공정용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 섬유소계 바이오매스 또는 자일란 함유액에 상기 자일라나아제, 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 다른 목적은 동물의 사료 재료에 상기 자일라나아제, 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 (a) 내지 (d)의 특징을 가지는 자일라나아제를 제공한다:

(a) SDS-PAGE 상에서 분자량은 약 65 kDa;

(b) pH 5 내지 pH 11에서 최대 활성;

(c) 50 내지 60℃에서 최대 활성; 및,

(d) 50℃, pH 5 내지 pH 11의 조건에서 95 unit/min㎎, 60℃, pH 6 내지 pH 9의 조건에서 100 unit/min㎎ 이상 자일로스 생산.

또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 생산하는 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 자일라나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 배지에 균주 또는 상기 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 포함하는 자일란 분해제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 사료첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 제지공정용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 섬유소계 바이오매스 또는 자일란 함유액에 상기 자일라나아제, 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 동물의 사료 재료에 상기 자일라나아제, 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 신규 균주인 페니바실러스(Paenibacillus) sp. HPL-003 및 이로부터 분리한 자일라나아제는 60℃ 내열성 및 넓은 pH 조건(4-11)에서 우수한 자일란 분해활성을 나타내므로 사료 산업, 제지 및 세제 산업에서는 물론 섬유질계 바이오매스의 당화공정에 활용되어 석유 대체원료, 특수기능물질, 바이오 폴리머 등의 원료를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 선발균주의 전자현미경 사진이다.
도 2는 1,248개 gDNA 라이브러리로부터 활성클론 선별 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 ORF 분석 및 각 ORF 아미노산 상동성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 형질전환체로부터 자일라나아제를 분리정제 후 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 자일라나아제 활성의 최적 pH 그래프이다.
도 6은 자일라나아제 활성의 최적 온도 그래프이다.
도 7은 자일라나아제 분리정제 후 효소특성(kinetics)이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 (a) 내지 (d)의 특징을 가지는 자일라나아제를 제공한다:

(a) SDS-PAGE 상에서 분자량은 약 65 kDa;

(b) pH 5 내지 pH 11에서 최대 활성;

(c) 50 내지 60℃에서 최대 활성; 및,

본 발명의 자일라나아제의 아미노산 서열은 하기의 서열 중 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다:

a) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열;

b) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열;

c) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열;

d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열; 및,

e) 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열이며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열.

상기 엄격한 조건은 혼성화 후 세정 시에 결정된다. 엄격한 조건 중의 하나는 상온에서 6 ± SSC, 0.5% SDS로 15분 세정한 뒤 45℃에서 2 ± SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정하고, 50℃에서 0.2 ± SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정을 두 번 반복한다. 더 바람직한 엄격한 조건은 상기보다 더 높은 온도를 이용하는 것이다. 상기 엄격한 조건의 다른 부분은 동일하게 수행하되 마지막의 두 번의 30분은 60℃에서 0.2 ± SSC, 0.5% SDS로 세정한다. 또 다른 엄격한 조건은 상기 엄격한 조건에서 마지막 두 번을 65℃에서 0.1 ± SSC, 0.1% SDS로 세정하는 것이다. 당업자라면 필요한 엄격한 조건을 얻기 위하여 이러한 조건을 명백히 설정할 수 있다.

본 발명의 자일라나아제는 pH 5 내지 pH 11, 바람직하게는 pH 6 내지 pH 10, 더욱 바람직하게는 pH 6 내지 pH 9에서 최대 활성을 나타내고, 50℃ 내지 60℃에서 최대 활성을 나타내는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 경남 거제시 남부면 다대리에 위치한 가라산 중턱에서 채취한 버섯재배 후 폐목재 잔여물이 포함된 토양으로부터 자일란 분해능이 뛰어난 균주를 선별하였다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기 균주로부터 자일라나아제 활성을 가지는 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하기 위하여 gDNA 라이브러리를 제작한 후, 자일라나아제 활성을 시험하였다. 상기 실험을 통해 1개의 클론을 선별하였고(도 2 참조), 삽입된 절편 DNA의 염기서열을 분석하였다. 분석 결과 DNA 절편의 크기는 6,956 bp이었고(서열번호 2), 아미노산 100개 이상의 범위에 11개의 ORF를 포함하였다(도 3 참조). 본 발명자들은 상기 ORF중 유전자가 암호화하는 단백질의 상동성 검색결과 엔도-1,4-베타-자일라나아제[endo-1,4-beta-xylanase(GenBank 접근 번호: YP_001817989)와 48% 상동성을 가지는 ORF9(1620 bp,539 aa)를 대장균에 형질전환하여 자일라나아제 활성을 확인한 결과 자일라나아제 활성이 우수함을 확인하였다. 또한, 상기 형질전환체의 목적 DNA 절편의 염기서열을 확인하여 서열번호 3으로 기재된 염기서열의 신규 자일라나아제 유전자의 ORF를 재확인하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열의 신규 자일라나아제를 대량으로 생산하기 위하여 과발현하는 형질전환체를 제작하였다. 형질전환 대장균으로부터 생산, 분리정제한 약 65 kD의 신규 자일라나아제(도 4 참조)의 효소 활성을 조사한 결과 pH 4-11에서, 온도 50℃ 내지 60℃에서 최대 활성을 나타냄을 확인하였다(도 5 내지 도 6 참조). 또한 중금속 원으로 첨가한 여러 가지 원소들 중에서 1 mM의 Cu+2, Zn+2, Fe+2, EDTA 등에 의해서 74%, 28%, 12%, 46% 저해되었지만 100 μM 이하에서는 영향을 받지 않거나 효소활성을 다소 증가시키는 것으로 나타났다(표 1 참조). 아울러, 반응특성(Enzyme Kinetics)을 분석한 결과, 기질친화력을 나타내는 Km 값은 0.2이었고(도 7 참조), 가수분해 산물은 대부분이 자일로올리고머였다.

따라서 서열분석 및 활성분석 결과 본 발명에서 동정한 균주로부터 생산되는 자일라나아제는 기존의 자일라나아제와 다른 신규한 자일라나아제임을 확인하였다.

상기 균주는 대장균을 포함한 원핵세포 또는, 효모, 동물세포 및 곤충세포를 포함하는 진핵세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 자일라나아제를 생산하는 균주는 수탁번호 KCTC18179P로 기탁된 페니바실러스 속 HPL-003(Paenibacillus sp. HPL-003)인 것이 바람직하나, 본 발명의 자일라나아제를 생산하는 균주라면 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 경남 거제시 남부면 다대리에 위치한 가라산 중턱에서 채취한 버섯재배 후 폐목재 잔여물이 포함된 토양으로부터 자일란 분해능이 뛰어난 균주를 선별하였다. 상기 선별된 균주를 동정한 결과, 그람 양성 간균이며, 1.1 ㎛의 세포크기와 2.5 ㎛ 내지 4 ㎛의 세포길이를 갖는 막대형이며, 편모를 가지지 않은 운동성 없는 간균이었다(도 1 참조). 상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA를 가지며, rRNA에 대한 상동성 분석 결과, 페니바실러스 속 CSH12-5(Paenibacillus sp. CSH12-5(GenBank 등록번호 EF694701) 균주와 95.0%, 페니바실러스 대전엔시스(T)[Paenibacillus daejeonensis(T)(GenBank 등록번호 AM141; AF391124)]와 95.7% 상동성이 있음을 확인하였으나 그 이상 일치하는 상동성은 검색되지 않았기 때문에, 본 발명의 상기 균주를 페니바실러스 속 HPL-003(Paenibacillus sp. HPL-003)으로 명명하였고, 한국생명공학연구원에 2009년 9월 21일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC18179P이다.

본 발명의 자일라나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하기의 서열 중 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

a) 서열번호 3에 기재된 염기 서열;

b) 서열번호 3에 기재된 염기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 상동성을 가지는 염기 서열;

c) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열;

d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열; 및,

e) 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 DNA 염기 서열이며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 염기 서열.

본 발명은 페니바실러스 속 HPL-003 균주로부터 분리한 자일라나아제를 코딩하는 신규한 유전자의 염기서열을 밝혔으므로 당업계 공지된 통상의 방법을 이용하면 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작할 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 상용화된 벡터를 이용할 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자가 적합한 재조합 벡터를 제조하여 이용하는 것도 무방하다.

본 발명에서 사용할 수 있는 숙주세포는 한정된 것은 아니나, 대장균, 박테리아를 포함한 원핵세포, 효모, 동물세포, 곤충세포를 포함하는 원핵세포로 이루어진 군으로부터 선택하여 이용하는 것이 바람직하며, 대장균을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 생산 방법은 상기 수득된 조효소액에서 자일라나아제를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 배지는 본 발명의 페니바실러스 속 HPL-003 균주(KCTC18179P) 또는 본 발명의 형질전환체에 적합한 배지를 당업자에게 공지된 상용 배지 중에서 선별하여 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명자들은 정제과정을 단순화시키면서 정제효율을 높이기 위한 방법으로 형질전환체를 제작할 때 컬럼크로마토그래피를 위한 특정 레진 결합 벡터를 사용하고, 정제과정에서는 레진에 결합된 효소만을 선별분리를 하는 것이 바람직하다. 엄격한 조건으로는 글루타치온 결합벡터, 칼모듈린 결합벡터, 말토스 결합벡터 등을 사용할 수 있으며, 컬럼 충진용 레진은 사용 벡터에 따라 결정된다. 본 발명에서는 글루타치온 결합벡터와 레진을 사용한 결과만을 제시하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 자일란 분해제는 상기 균주 또는 상기 형질전환체에서 생산하는 자일라나아제뿐만 아니라 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 직접 자일란 분해제로 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 사료첨가제는 본 발명의 자일라나아제 외에 동일하거나 유사한 성분을 포함할 수 있으며, 본 발명의 자일라나아제를 전체 조성물 또는 사료첨가제 중 1 내지 90%로 함유하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 자일라나아제는 기존의 자일라나아제와 달리 넓은 범위의 조건(pH 5-11) 및 내열성 온도범위(50~60℃)에서 높은 활성을 나타내므로(도 5 내지 도 6 참조), 새로운 내열성, 광범위 pH 및 고활성 자일라나아제의 용도로 이용될 수 있다.

현재 자일라나아제 효소시장을 점유하고 있는 용도는 크게 식품, 사료 및 기술로 분류할 수 있다(Bedford and Morgana, World's Poultry Science Journal 52:61-68, 1996). 식품(과일 및 야채생산, 양조 및 주류생산, 제빵 및 제과)시장에서는 재료의 연화 및 정제효율 개선, 점도감소, 추출 및 여과 효율증대 등을 통한 품질향상에 활용되고 있다. 사료시장에서는 돼지, 가금류, 반추동물 등의 사료의 비전분 탄수화물의 감소, 장내 점도개선, 단백질 및 전분의 소화흡수율 증대 등에 이용되고 있다(Kuhad and Singh, Crit. Rev. Biotechnol. 13, 151-172, 1993). 아울러 기술적으로는 제지공정에서 생물학적 백화공정, 염소소비의 감소, 기계적인 제지공정 단축을 통한 에너지 감소, 탈묵효과, 전분과 글루텐의 분리, 재생가능 연료(바이오에탄올) 및 화학원료생산 등에 활용되고 있다.

그러므로 본 발명의 신규 자일라나아제는 용지 생산 및 폐지 재생, 사료 첨가 및 식품의 품질 향상 또는 산업상 사용하는 자일라나아제의 분해에 유용하게 이용될 수 있으며 이는 당업자에게 자명하다. 상기 조성물들은 당업자에게 공지된 방법으로 제형화 되고 제제화될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 상기 형질전환체가 생산하는 자일라나아제의 첨가량은 당업자에 의해 조정될 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 균주 분리 및 선별

<1-1> 균주 분리

본 발명의 균주는 경남 거제시 남부면 다대리에 위치한 가라산 중턱에서 채취한 버섯재배 후 폐목재잔여물이 포함된 토양으로부터 분리하였다. 상기 토양의 표층으로부터 2~5 ㎝ 층에서 토양시료를 채취, 풍건 후 2 ㎜ 채를 통과시켜 토양을 정선하였다. 정선된 토양 30 g을 270 ㎖의 멸균된 생리식염수(NaCl 8.0 g/ℓ)에 넣어서 진탕배양기(37℃, 200 rpm)로 약 20분간 진탕 후 상온에 30분 정도 방치하여 굵은 토양입자 및 불순물 등을 바닥으로 침전시킨 후 상청액을 멸균된 용기로 옮겨 1차 희석액으로 하였다. 이것을 잘 교반한 후 10 ㎖을 취하여 90 ㎖의 생리식염수에 넣어 2차 희석액 100 ㎖을 제조하고, 2차 희석액을 충분히 교반하면서 위와 같은 방법으로 10 ㎖을 취하여 90 ㎖의 생리식염수에 넣어 3차 희석액 100 ㎖을 제조하였다. 이후 동일한 방법으로 6차 희석액까지 제조하였다. 균주 분리용 TSA(Tryptic Soy Agar, Difco Co.) 배지에 3, 4, 5 및 6차 희석액을 0.25 ㎖씩 3회 반복으로 분주한 후, 균일하게 도말하여 37℃ 평상인큐베이터에서 2일간 배양 후 형성된 미생물의 콜로니를 선발하였다. 이때 콜로니의 모양, 크기, 색상 등 여러 가지 요인을 고려하여 분리하며, 분리된 콜로니는 다시 TSA 배지에서 계대 배양하여 순수한 균주를 분리하였고 이것을 모 균주로 사용하기 위하여 -70℃에 보관하였다.

<1-2> 균주 선별

순수하게 분리된 균주들 중에서 자일라나아제 활성을 가지는 활성 균주 선별은 TSA 배지에 자작나무 자일란(Fluka Bio Chemika. Co.)이 0.5~1.0% 함유된 소프트 아가 더블 배지를 만들고 균주를 접종하여 하룻밤 배양한 후 다음날 Congo-red 염색법(Theater RM, PJ . Wood . Appl Environ Microbiol 43, 777-780, 1982; Beguin P. Analytical Biochemistry , 131(2):333-336, 1983)을 통해 배양된 콜로니 주변에 투명환(Halo)을 형성하는 균주 및 활성클론을 선별하였다. 선별된 균주의 자일란 분해능을 다시 한 번 측정하여 재현성을 확인하였고, 그 중 자일란 분해 능력이 가장 우수한 균주를 선발하여 자일라나아제를 생산하는 미생물로 최종 선발하였다.

< 실시예 2> 균주 동정

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 가장 높은 활성을 지닌 자일라나아제를 생산하는 균주를 30℃에서 배양한 후 그람 염색(Gram Staining) 및 포자 염색(Spore Staining)을 실시한 결과, 포자를 생성하는 그람양성 간균으로 확인되었다. 전자현미경으로 그 형태를 관찰한 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이 1.1 ㎛의 세포크기와 2.5 ㎛ 내지 4 ㎛의 세포길이를 갖는 막대형(rod) 이었으며 편모를 가지지 않는 운동성이 없는 간균으로 나타났다. 또한, 균주의 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 서열번호 1로 기재되는 1,234 bp의 rDNA를 얻은 후 유전자은행 정보자료(GenBank database)를 검색한 결과, 판토애 아글로메란스 ZFJ-15(Pantoea agglomerans ZFJ-15; GenBank 등록번호 EU931554) 균주와 96.4%의 상동성이 있고 페니바실러스 속 WPCB158(Paenibacillus sp. WPCB158; GenBank 등록번호 FJ006910)과 96.3%가 일치함을 확인하였으나 그 이상 일치하는 상동성은 검색되지 않았기 때문에, 본 균주를 페니바실러스 속 HPL-003 균주로 명명하였고, 한국생명공학연구원에 2009년 9월 21일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC18179P이다.

< 실시예 3> 신규 자일라나아제 분리

<3-1> 페니바실러스 균주의 유전자 라이브러리제작 및 활성검정

본 발명자들은 상기 실시예 1과 실시예 2에서 분리 동정한 페니바실러스 속 HPL-003 균주로부터 자일라나아제 활성을 가지는 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하기 위하여 게놈 DNA를 추출 후 5 kb 이하 크기의 유전자 조각을 가지는 gDNA 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리의 제작은 균주로부터 추출한 DNA를 무작위 절단방법을 통하여 1~6 kb 크기의 DNA 조각들을 만들고, 아가로스 젤에서 전기영동으로 크기를 선발하여 원하는 5 kb 전후 크기의 DNA 조각을 확보하였다. 이를 pCB31 플라스미드 벡터에 삽입 후 E. coli DH10B 세포에 형질전환시켰다. 이렇게 제작된 라이브러리 1,248개의 클론을 고상 또는 액상 조건에서 자일라나아제 활성을 시험하였다.

<3-2> 자일라나아제 활성시험

분리된 균주, 활성클론, 형질전환체 및 분리 정제된 효소 등의 자일라나아제 활성(자일란 분해능력) 측정은 다음과 같은 2가지 방법 중 하나 또는 모두를 사용하였다. 첫 번째 방법은 고체배양 측정방법으로 LB 배지에 자작나무 자일란(Fluka Bio Chemika. Co.)이 0.5~1.0% 함유된 소프트 아가 더블 배지를 만들고 균주를 접종하여 하룻밤 배양한 후 다음날 콩고레드 염색법을 통해 배양된 콜로니 주변에 투명환(halo)을 형성하는 균주 및 활성클론을 선별하였다. 두 번째 방법은 액체배양 효소활성 측정방법으로 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) 정량법(Miller G.L. Anal Chem 31, 426-428, 1959)을 사용하였고, 구체적으로는 50 ㎕의 효소용액에 50 ㎕의 기질용액(2% 자작나무 자일란이 포함된 50 mM Tris-HCl, pH 7.0)을 넣고 50℃에서 20분간 반응시킨 후 200 ㎕의 DNS 용액을 첨가한 다음 90℃에 5분간 처리한 후 흡광도 540 ㎚에서 측정하였다. 효소의 1유니트(unit)는 1분 동안에 1 mg의 자일라나아제가 1 μ㏖의 환원당(자일로스)을 생산하는 효소활성으로 규정하였다. 액체배양 및 고체배양 활성시험을 통하여 상위 1개 클론 GM3-SLX1을 선발하였다(도 2).

<3-3> 자일라나아제 활성클론 선발 및 유전자 분석

실시예 3-2에서 선발된 클론에 삽입된 절편 DNA의 염기서열을 분석하였다. 염기서열을 분석한 결과 플라스미드에 삽입된 DNA 절편의 크기는 6,956 bp(서열번호 2)이었고, 이를 NCBI의 Blast P 또는 Blast N 프로그램(//www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 암호화되어 있는 전사 해독틀(ORF, Open Reading Frame)을 분석하였다. 분석된 ORF 중 아미노산 100개 이상의 크기를 갖는 ORF 11개를 SLX-O1, SLX-O2, SLX-O3, SLX-O4, SLX-O5, SLX-O6, SLX-O7, SLX-O8, SLX-O9, SLX-O10, SLX-O11이라 이름 붙였다. 상기 ORF 중 유전자가 암호화하는 단백질의 상동성 검색결과 엔도-1,4-베타-자일라나아제[endo-1,4-beta-xylanase(AJ006646)]와 48% 상동성을 가지는 SLX-O9(서열번호 3)를 표적으로 하여 그 염기서열을 바탕으로 XhoI과 BamHI 제한효소 인식부위를 첨가한 프라이머를 제작한 뒤 PCR 증폭 후 pGEM-T-Easy 벡터(Promega) 벡터에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제작하였다.

구체적으로, GM3-SLX1 플라스미드 주형 1 ng을 서열번호 5(5'-CTCGAGATGGATACATTGAAGTTGTATGTG-3')로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6(5'-GGATCCCTATTCGTTGCTCCCC-3')로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍(10 p㏖)과 혼합한 뒤, PCR 증폭 조건은 PCR Premix(GenetBio)를 사용하여 94℃에서 5분간의 변성(Denaturation)을 수행한 후 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 결합(Annealing), 72℃에서 1분의 연장(Extension)을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 연장으로 마무리하고 4℃에서 유지한 뒤 반응을 종결하였다. PCR을 통해 증폭된 산물을 GENCLEAN II Kit(Q-Biogene)을 사용하여 정제하였고, pGEM-T-Easy 벡터에 T4 리가아제(RBC)를 사용하여 재조합 DNA를 만들었다. 상기 재조합된 플라스미드를 E. coli JM109에 형질전환시켜 유전자 형질전환 대장균을 제작하였다. 상기 형질전환체를 LB 액체 배지에서 배양한 후 HiYield™ Plasmid Mini Kit(RBC)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하여 제한효소 XhoI(NEB)과 BamHI(NEB)로 절단하였고, 이를 전기영동하여 목적하는 DNA 절편이 삽입되어 있음을 확인하였다. 또한, 상기 형질전환체를 실시예 3-2에서와 같이 액상의 조건에서 자일라나아제 활성을 시험한 결과 자일라나아제 활성을 보임을 확인하였다.

상기 형질전환체의 목적 DNA 절편의 염기서열을 확인하여 서열번호 4로 기재된 염기서열의 신규 자일라나아제 유전자의 ORF를 재확인하였다.

<3-4> 자일라나아제 과발현체 제작( pIVEX - GST - PX3 )

상기 신규 자일라나아제를 과발현하는 형질전환체를 제작하기 위하여, GM3-SLX1 플라스미드를 주형으로 하여 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액과 반응조건은 상기 실시예 3-2와 동일하였다. 증폭된 산물을 정제하여 XhoI(NEB)과 BamHI(NEB)으로 절단한 뒤, 단백질 과발현벡터 pIVEX-GST(Roche)에 삽입시켜 재조합 과발현 플라스미드를 제작하였고, 이를 E. coli BL21(RBC)에 형질전환하여 자일라나아제 과발현 형질전환 대장균을 제작하였다. 제작된 과발현 형질전환 대장균을 배양하여 플라스미드 DNA 추출 후 상기 제한효소를 이용하여 절단한 뒤 전기영동을 통해 벡터와 목적 DNA가 성공적으로 재조합되었는지 확인하였고, 확인된 균체를 LB 액체 배지에서(100 앰피실린/㎖ 첨가) 18시간 배양시킨(37℃, 250 rpm, A600=1.0) 후 새로운 LB 액체 배지에 재접종하여 A600 흡광도 값이 0.4~0.6일 때 1 mM의 IPTG를 처리하고 3시간 더 배양 후 균체를 수확하였다. 수확된 균체를 현탁시켜 초음파 분쇄 후 10,000 g에서 원심분리하여 상청액과 침전물로 분리하였고, SDS PAGE를 통하여 목적한 단백질이 상청액에 과발현됨과 분자량이 약 65 kD임을 확인하였다(도 4).

<3-5> 자일라나아제 활성발현 조건 분석

실시예 3-4에서 제작한 신규 자일라나아제 과발현 형질전환 대장균으로부터 과발현 및 분리된 자일라나아제의 활성을 pH, 온도 및 금속이온별로 실시예 3-2의 방법으로 조사하였다. 반응용액의 pH 조절은 시트릭산(Citric acid) 완충용액으로 pH 4-5, 인산(Phosphate) 완충용액으로 pH 6~8, 트리스/염산(Tris/HCl) 완충용액으로 pH 7~9 , 글라이신/수산화나트륨(Glycine/NaOH) 완충용액으로 pH 9~11로 수행하였다. 금속이온으로는 1 mM의 CaCl₂, MgCl2, MgCl₂, CuCl₂, ZnCl₂, FeCl₃ 등을 첨가하여 자일라나아제 활성에 미치는 영향을 조사하였고, 기타 NaCl, LiCl, KCl, NH₄Cl, EDTA, CsCl₂, 2-ME(2-Mercaptoethanol), DTT(Dithiothreitol), PMSF(Penylmethylsulfonyl fluoride), 아세트산염, 푸르푸랄(furfural) 등의 염을 첨가하여 자일라나아제 활성발현에 미치는 영향을 조사하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 신규 자일라나아제는 pH 4~11에서, 도 6에서 나타난 바와 같이 50℃ 내지 60℃에서 최대 활성을 나타내었다. 또한, 표 1에 나타난 바와 같이 1 mM의 Cu⁺², Zn⁺², Fe⁺², EDTA 등의 중금속 또는 첨가물에 의해서 자일라나아제 활성이 각각 74, 28, 12, 46%로 저해되었다.

첨가제	첨가제 농도에 따른 상대적 활성(%)
첨가제	1 mM
음성 대조군	100
NaCl	105
LiCl	101
KCl	101
NH4Cl	99
CaCl₂	102
MgCl₂	93
MnCl₂	98
CsCl₂	97
CuSO₄	26
ZnSO₄	72
FeCl₃	88
EDTA	54
2-ME	89
DTT	95
PMSF	95
Acetate	101
Furfural	98

< 실시예 4> 신규 자일라나아제의 대량 생산

서열번호 4로 기재되는 신규 자일라나아제를 암호화하는 유전자(서열번호 3)를 포함하는 pIVEX GST-xylanase 재조합 벡터(Bioprogen Co., Ltd., Korea)를 대장균 BL21-Gold(DE)(Stratagene, USA)에 형질전환 시킨 후 ampicillin이 첨가(50 ㎍/㎖)된 액체배지(LB 25 g/L)에 접종하여 O.D.₆₀₀ 값이 0.4~0.6이 될 때까지 37℃에서 150 rpm으로 교반 배양하였다. 목표 단백질의 대장균 세포내 발현을 유도하기 위하여, 상기 현탁액에 IPTG(isopropyl-D-thiogalactoside)를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가한 후에 3시간 더 배양하였다. 배양액을 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 회수한 침전물을 PBS로 2회 세척하였다. 세척된 침전물을 다시 PBS에 재현탁 후 초음파 파쇄기(Cosmo Bio Co., LTD)를 이용하여 균체를 파쇄한 후, 원심분리(12,000 rpm, 10분)하여 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액 속의 자일라나아제를 순수분리하기 위해 글루타치온에스-트렌스퍼레이즈 컬럼(GST binding resin column, Novagen)을 사용하였다. 이때 자일나아제 순수분리는 준비된 상청액을 완충용액(Washing buffer solution ; 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl; pH 7.0)으로 평형화된 글루타치온에스-트렌스퍼레이즈 컬럼(GST binding resin column, Novagen)에 부착 시킨 후, factor Xa protease(NEB)를 처리하고, 완충용액(Washing buffer solution; 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl; pH 7.0)을 이용하여 순수분리하였다. 정제 단계에서 회수한 각각의 시료로부터 자일라나아제 효소 활성을 측정 하였으며, 효소 활성 분획의 정제여부를 SDS-PAGE로 확인하였다. 단백질 함량은 브래드포드 방법(Bradford, Sigma Aldrich)을 이용하여 측정하였고, 표준 단백질로는 BSA(bovine serum albumin)를 사용하였다.

그 결과, 글루타치온 레진 컬럼크로마토그래피 법으로 간편하게 다량의 자일라나아제를 생산할 수 있었다. 또한 레진에 결합된 자일라나아제 상태로도 자일라나아제 활성이 변화되지 않는 특성을 보여주었기 때문에 효소고정화 방법을 통한 고효율 전환공정에 적용할 수 있음을 알 수 있다. 상기 방법에 의해 정제된 효소는 정제하기 전의 효소보다 5배 이상의 활성을 나타내었다. 효소활성은 50℃에서 pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0, pH 9.0, pH 10.0, 및 pH 11.0에서 각각 97.37, 124.19, 122.21, 124.61, 122.95, 103.27, 및 96.08 unit으로 나타나 매우 넓은 pH 적용성을 나타내었다. 또한 60℃에서도 pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0, pH 9.0, pH 10.0, 및 pH 11.0에서 각각 26.93, 105.19, 123.56, 120.95, 112.25, 29.89, 및 22.76 unit(1분당 1 mg의 효소가 생산하는 자일로스 μM 량)의 내열성과 고활성을 모두 나타내었다.

< 실시예 5> 대량생산된 신규 자일라나아제의 효소 특성

효소의 특성을 알아보기 위하여 정제된 자일라나아제를 시험관에 넣고 다양한 양의 자작나무 자일란을 포함하는 50 mM Tris-Hcl(pH 7.0) 완충용액을 넣었다. 반응 혼합물을 50℃에서 20분간 반응시켜서 효소반응 속도(Lineweaver-Burk)를 알아보았다.

그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 자일란 기질에 대한 친화도 K_m 값은 0.2이었고, 가수분해 산물은 대부분이 자일로스 및 자일로올리고머 이었다. 자작나무 자일란 이외의 자일란(너도밤나무, 귀리 등)에 대한 자일라나아제 활성도 유사하였다.

한국생명공학연구원

KCTC18179

20090921

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 자일라나아제.
제 1항에 있어서, 상기 자일라나아제는 하기 (a) 내지 (d)의 특징을 가지는 것을 특징으로 하는 자일라나아제:
(a) SDS-PAGE 상에서 분자량은 약 65 kDa;
(b) pH 5 내지 pH 11에서 최대 활성;
(c) 50 내지 60℃에서 최대 활성; 및,
(d) 50℃, pH 5 내지 pH 11의 조건에서 95 unit/min㎎, 60℃, pH 6 내지 pH 9의 조건에서 100 unit/min㎎ 이상 자일로스 생산하고,
여기서, unit/min㎎는 1분당 1mg의 자일라나아제가 생산하는 자일로스의 양 (μM)을 말한다.
제 1항의 자일라나아제를 생산하는 균주.
제 3항에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KCTC18179P로 기탁된 페니바실러스 속 HPL-003(Paenibacillus sp. HPL-003)인 것을 특징으로 하는 균주.
제 1항의 자일라나아제를 암호화하는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드.
삭제
제 5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 7항의 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체.
제 8항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균을 포함한 원핵세포 또는, 효모, 동물세포 및 곤충세포를 포함하는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
배지에 제 3항의 균주 또는 제 8항의 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법.
제 10항에 있어서, 상기 수득된 조효소액에서 자일라나아제를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
제 1항의 자일라나아제, 제 3항의 균주 또는 제 8항의 형질전환체를 포함하는 자일란 분해제.
제 1항의 자일라나아제를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물.
제 1항의 자일라나아제를 포함하는 사료첨가제.
제 1항의 자일라나아제를 포함하는 제지공정용 조성물.
섬유소계 바이오매스 또는 자일란 함유액에 제 1항의 자일라나아제, 제 3항의 균주 또는 제 8항의 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법.
삭제
동물의 사료 재료에 제 1항의 자일라나아제, 제 3항의 균주 또는 제 8항의 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법.