KR101446295B1 - 사가섬 에조엔스 추출물을 포함하는 항노화용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연 추출물을 포함하는 항노화용 또는 보습용 조성물에 관한 것이다.

Description

사가섬 에조엔스 추출물을 포함하는 항노화용 조성물{COMPOSITION FOR ANTI-AGING CONTAINING SARGASSUM YEZOENSE EXTRACT}

본 발명은 천연 추출물을 포함하는 항노화용 또는 보습용 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부는 시간이 지남에 따라 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되며, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양 광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하게 되고 환경 오염이 더욱 심화됨에 따라, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가되고, 탄력이 감소될 뿐 아니라, 기미, 주근깨 및 검버섯 또한 증가하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다. 피부노화 과정은 일반적으로 내인성 노화(intrinsic aging)와 광노화(photoaging)에 의해 일어난다(Gilchrest, 1989; Ma etal.,2001;Jenkins,2002).

피부의 구성층 중 표피는 인체 내부의 수분 증발을 방지하는 중요한 역할을 한다. 표피는 외부로부터 순서대로 각질층, 과립층, 유극층, 기저층으로 구분되며, 각질층의 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하고 각질세포 사이의 세포간 지질들은 모르타르와 같은 역할로 작용하여 피부 장벽을 구성한다(J. Invest. Dermatol. 80 (Suppl.), 44-49. 1983). 또한, 건강한 사람의 각질세포에는 고농도의 자연보습인자(Natural Moisturing Factor, NMF)가 존재하여 피부의 수분 보유를 돕는데, 예를 들면 아미노산과 같은 물질은 수용성이기 때문에 효과적으로 수분과 결합하여 피부에서 수분이 건조되는 것을 억제한다(J. Invest. Dermatol. 54, 24-31, 1970).

그러나, 요즘과 같이 환경의 변화나 생활 패턴의 변화에 따른 냉/난방의 인위적인 온도 조절, 사회 생활에서 발생되는 각종 스트레스와 환경 오염으로 인한 피부 스트레스, 화장 습관에 따른 잦은 세안 및 연령 증가에 따른 자연적인 피부 노화 등의 여러 가지 원인으로 인하여 각질층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠게 되며 피부가 푸석거리고 촉촉함을 잃어 생기가 없어 보이는 등의 현상이 발생하기 때문에 피부 보습제의 필요가 증가하고 있다. 또한 외부로부터 받는 과도한 물리적, 화학적 자극, 자외선, 스트레스 및 영양결핍 등은 피부의 정상기능을 저하시키고 탄력손실, 각질화, 주름생성 등의 피부노화현상을 촉진시키게 되는데, 특히 자외선에 의해 표피 진피 경계부는 심하게 손상을 받는다.

본 발명자들은 사가섬 에조엔스 (Sargassum yezoense) 추출물을 포함하는 조성물이 피부노화, 피부주름 또는 피부보습, 또한 피부의 탄력 상실을 예방할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

Gilchrest, 1989; Ma etal.,2001;Jenkins,2002

본 발명의 목적은 천연 유래의 항산화 또는 보습용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 사가섬 에조엔스 (Sargassum yezoense) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 또는 보습용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 자연으로부터 얻어진 천연물을 유효성분으로 포함하여 인체에 적용시 부작용이 적을 뿐 아니라, 장기간 사용으로 인한 내성이 생길 가능성이 낮다. 특히, 본 발명의 조성물은 우수한 항노화 및 보습능을 가지므로, 유용하게 사용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 조성물은 젤라티네이즈, 전염증성 사이토카인, 매트릭스 메탈로프로테아제 및 엘라스타제로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 사이토카인 또는 효소의 생합성을 억제 또는 활성을 감소시킴에 따라 항노화용으로 사용될 수 있고, 필라그린 및 인볼루크린으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 생합성을 증가 또는 활성을 증가시켜서 보습용으로 사용 가능하다.

도 1은 상기 사가섬 에조엔스 추출물이 필라그린, 인볼루크린의 발현에 미치는 영향을 그림이다.
도 2는 상기 사가섬 에조엔스 추출물이 젤라티네이즈에 대한 활성저해 효과를 자이모그래피로 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 상기 사가섬 에조엔스 추출물이 MMP-1 에 대한 생합성 저해 효과를 웨스턴블랏으로 나타낸 그림이다.

본 발명은 일 관점에서 사가섬 에조엔스 (Sargassum yezoense) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 또는 보습용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 사가섬 에조엔스 (Sargassum yezoense)는 모자반목(Fucales), 모자반과(Sargasaceae), 모자반속 (Sargassum)에 속한다. 사가섬 에조엔스는 우리나라의 동해안과 남해안, 제주도의 조간대 하부에 분포하고 있고, 파도의 영향을 받는 암반에 군락을 이룬다. 일본에서는 홋카이도의 해안, 고토섬과 홋카이도 사이의 연안에 분포하고 있으며, 태평양 토호쿠 해안의 0-2m 깊이의 조하대에 우점하고 있다. 9월에 작고 어린 개체들이 자라기 시작하여 수온이 상승하기 시작하는 2월부터 매우 빠른 생장을 보이며 6월에 최대로 생장한다.

본 명세서에서 사용되는 사가섬 에조엔스는 추출물의 형태로 포함되거나, 생약 자체의 분쇄물, 또는 생약의 건조 분쇄물로서 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 아울러 본 명세서에서 사용되는 사가섬 에조엔스는 그 입수 방법에 제한이 없으며, 재배하여 사용하거나 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있으며, 일부 또는 전부를 사용할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 사가섬 에조엔스 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물은 하기의 단계들을 포함하는 분리정제 방법에 의해 제조될 수 있다.

1) 사가섬 에조엔스를 추출용매로 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 사가섬 에조엔스 추출물을 여과 및 농축하는 단계;

3) 단계 2)의 농축물을 추가적으로 유기용매로 추출하는 단계;

4) 단계 3)의 분획물을 praparative 크로마토그래피 방법을 통해 활성 분획물을 수득하는 단계; 및

5) 단계 4)의 활성 분획물을 HPLC 방법을 통해 활성 화합물을 수득하는 단계.

상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 한다. 상기 알코올로는 C₁ 내지 C₄ 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출시 용매를 사가섬 에조엔스 분량의 5 내지 15배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 10배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 용매를 가한 후 초음파 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 추출시 용매의 온도는 40 ~ 100℃인 것이 바람직하며, 80℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 2 ~ 4 시간이 바람직하며, 3 시간이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 방법에 의하여 사가섬 에조엔스를 추출, 여과한 뒤 여과액을 농축 및 동결건조하여 추출물을 수득하였다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 3)의 유기용매는 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄, 아세톤 또는 아세토니트릴 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 4)의 praparative 크로마토그래피는 YMC pack 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 충진제를 이용한 preparative 크로마토그래피를 수행하여 분리 및 정제할 수 있다. preparative 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있다.

본 명세서에서 사가섬 에조엔스 추출물은 상기와 같이 사가섬 에조엔스의 조추출물을 포함할 수 있고, 상기 조추출물을 극성이 낮은 유기 용매로 더욱 추출하여 얻어진 유기 용매의 가용성 분획물로서 포함할 수도 있다. 상기 유기 용매로는 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸 아세테이트, n-부탄올 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 방법으로 추출한 추출물 또는 그 추출물의 가용성 분획물은 그대로 사용할 수도 있으나, 여과 후 농축하여 엑기스 형태로 사용할 수 있으며, 농축 후 동결 건조하여 동결건조물의 형태로서 사용할 수 있다.

본 명세서에서 "유효성분"은 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미하는 것이다.

본 발명의 일 관점인 항노화용 또는 보습용 조성물에 있어서, 상기 추출물은 하기 화합물 1 및 화합물 2로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능"이란 통상의 의약적 복용량(medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기구의 승인을 받을 수 있거나 승인 받거나, 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전으로 인지되는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능한 염"은 유리산(free acid)에 의해 형성된 부가염이 유용하다. 적합한 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산 및 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartariac acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 사가섬 에조엔스 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산은 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 조제될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 항노화용 또는 보습용 조성물에 있어서, 상기 사가섬 에조엔스 추출물은 조성물 전체 중량에 대하여 0.001 내지 10중량%로 함유될 수 있다. 사가섬 에조엔스 추출물이 조성물 전체 중량에 대하여 0.001중량%미만으로 함유되면, 피부탄력개선, 주름 완화 등의 항노화 효능이 미미하고 피부가 건조하여 당기는 현상이 나타나며, 10중량%를 초과하여 함유되면, 약제 상의 다른 구성 성분의 함량을 제한하게 된다. 상기와 같은 관점에 있어서, 사가섬 에조엔스 추출물은 조성물 전체 중량에 대하여, 0.0011 내지 9중량%, 0.0012 내지 8중량%, 0.0013 내지 7중량%, 0.0014 내지 6중량%, 0.0015 내지 5중량%, 0.0016 내지 4중량%, 0.0017 내지 3중량%, 0.0018 내지 2중량% 또는 0.0019 내지 1중량%으로 함유될 수 있으며, 구체적으로 0.002중량%로 함유될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점인 항노화용 또는 보습용 조성물에 있어서, 상기 항노화용 조성물은 젤라티네이즈(gelatinase), 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine), 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP, Matrix metalloproteinase)및 엘라스타제(elastase)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 사이토카인 또는 효소의 생합성을 억제하거나 또는 활성을 감소시킬 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 관점인 항노화용 또는 보습용 조성물에 있어서, 상기 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)은 종양괴사인자(tumor necrosis factor)일 수 있고, 더 구체적으로 종양괴사인자 알파(TNF-α)일 수 있다. 본 발명의 항노화용 조성물은 상기 사이토카인 또는 효소의 생성을 억제하거나 감소시킬 수 있고, 생성되더라도 활성을 감소시켜서 그 기능을 억제 또는 저하시킬 수 있어서, 노화방지에 유용하다.

본 발명의 일 관점인 항노화용 또는 보습용 조성물에 있어서, 상기 추출물은 사가섬 에조엔스-C₁~C₆ 알코올 추출물일 수 있으며, 구체적으로 사가섬 에조엔스-메탄올 추출물 또는 사가섬 에조엔스-에탄올 추출물일 수 있다.

본 발명의 일 관점인 항노화용 또는 보습용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 필라그린 (filaggrin) 및 인볼루크린 (involucrin)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 생합성을 증가시키거나 또는 활성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 보습용 조성물은 상기 단백질의 생성을 억제하거나 감소시킬 수 있고, 생성되더라도 활성을 감소시켜서 그 기능을 억제 또는 저하시킬 수 있어서, 피부 보습에 유용하다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 건강식품 조성물일 수 있다.

상기 조성물은 이를 포함하는 드링크제, 발효유, 치즈, 요구르트, 주스, 생균제제 및 건강보조식품 등으로 가공될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가제의 형태로 사용될 수 있다.

일실시예에서 상기 조성물은, 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 제형은 용액, 유화물, 점성형 혼합물, 타블렛, 분말 등의 다양한 형태일 수 있으며, 이는 단순 음용, 주사 투여, 스프레이 방식 또는 스퀴즈 방식 등의 다양한 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물일 수 있다.

일실시예에서, 상기 약학 조성물은 피부 보습 또는 노화 방지에 효과적인 약학 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 의약품에 적용할 경우에는, 상기 조성물을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구 투여제 혹은 비경구 투여제로 제제화 할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 제재로서는 정제, 환제, 과립제, 연경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제 , 시럽제, 펠렛제 등을 들 수 있다. 또한, 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 등을 들 수 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 유효 성분의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적인 투여량은 0.001 mg/kg/일 내지 2000 mg/kg/일, 보다 구체적으로는 0.5 mg/kg/일 내지 1500 mg/kg/일이다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 화장료의 형태로 제형화할 경우, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 에센스 또는 팩 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 그 제형이 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 의한 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다. 또한, 본 발명의 조성물은 피부 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있고, 보다 구체적으로는 항염증용 및/또는 보습용 피부 외용제 조성물로 사용될 수 있다.

상기 피부외용제에는 상기 필수성분 이외에 통상 화장품이나 의약품등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예컨대 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다.

그밖에, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.

상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화액, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대일 수 있다.

상기 피부외용제는 임상 투여시에 약제학적으로 허용가능한 통상의 담체, 부형제, 결합제, 붕해제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다. 상기 피부외용제에서, 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.01 내지 300 mg/cm²이고, 바람직하게는 10 내지 50 mg/cm²이며, 하루 1 ~ 4 회 투여될 수 있다. 단, 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

사가섬 에조엔스 ( Sargassum yezoense ) 추출물의 제조

본 발명에서 사용된 사가섬 에조엔스는 강원도 동해안에서 자생하고 있는 것을 사용하였으며, 전초를 건조하여 사용하였다.

[ 실시예 1-1] 사가섬 에조엔스 -메탄올 추출물의 제조

건조시킨 사가섬 에조엔스 200 g을 100 % 메탄올 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 24.6 g을 얻었다.

[ 실시예 1-2] 사가섬 에조엔스 -물 추출물의 제조

건조시킨 사가섬 에조엔스 200 g을 물 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 18.4 g을 얻었다.

[ 실시예 1-3] 사가섬 에조엔스 -에탄올 추출물의 제조

건조시킨 사가섬 에조엔스 200 g을 95% 에탄올 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 22.8 g을 얻었다.

사가섬 에조엔스 추출물로부터 분획물의 제조

상기 실시예<1-1>의 추출물 2 g을 증류수에 현탁하여 에틸아세테이트 (Ethyl Acetate)로 3회 분획하여 얻은 분획물을 감압건조하여 농축하여 분획물 1.26 g을 수득하였다.

사가섬 에조엔스 분획물로부터 활성 분획물의 제조

상기 <실시예 2>의 분획물 중 1 g을 가지고 preparative ODS column (YMC-Pack ODS-AQ, 250 X 10mm, YMC Co., Japan) 크로마토그래피를 수행하였다. 용매는 0.05% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)을 함유한 80% 메탄올을 사용하였으며, 유속을 분당 3 ml로 흘려주었을 때, 30분 내지 35분이 경과한 시점에서 얻어진 분획물의 활성이 가장 우수하였다. 분획물을 모아 감압건조하여 농축하여 분획물 201 mg을 수득하였다.

화학식 1의 화합물의 분리

상기 <실시예 3>에서 얻어진 활성분획물을 고성능 액체크로마토그래피, 즉 HPLC (TSK gel silica-60 column, 4.6 X 250 mm, Tosoh, Japan)로 분석하였다. 클로로포름(chloroform) : 헥산(hexame) : 아세톤(acetone) : 메탄올(methanol)이 72 : 18 : 9: 1의 비율로 혼합된 용매를 제조하여 평균유속 분당 1 ml로 하여 흘려주었을 때 5분 경과 시점에 분리되어 나오는 화합물 23 mg을 수득하였다. 상기 화합물을 NMR(¹H 및 ¹³C-NMR, Varian 500MHz spectrometer, Varian USA)로 그 구조를 확인한 결과 5분대에 분리되어 나오는 화합물은 화학식 1의 구조를 가짐을 확인하였다.

화학식 2의 화합물의 분리

상기 <실시예 3>에서 얻어진 활성분획물을 고성능 액체크로마코그래피, 즉 HPLC (TSK gel silica-60 column, 4.6 X 250 mm, Tosoh, Japan)로 분석하였다. 클로로포름(chloroform) : 헥산(hexame) : 아세톤(acetone) : 메탄올(methanol)이 72 : 18 : 9: 1의 비율로 혼합된 용매를 제조하여 평균유속 분당 1 ml로 하여 흘려주었을 때 10분 경과 시점에 분리되어 나오는 화합물 135 mg을 수득하였다. 상기 화합물을 NMR(¹H 및 ¹³C-NMR, Varian 500MHz spectrometer, Varian USA)로 그 구조를 확인한 결과 10분대에 분리되어 나오는 화합물은 화학식 2의 구조를 가짐을 확인하였다.

[ 실험예 1] 피부 보습 및 수화에 관련된 필라그린 ( filaggrin ) 및 인볼루크린 (involucrin) 의 발현 측정

신생아 표피에서 직접 분리한 인체 각질형성세포 (Lonza, switzerland)를 10⁶개의 농도로 100 파이 디쉬(dish)에 배양하고, 각 시험물질을 10 uM, 추출물의 경우는 10 ug/ml 포함한 배지로 교체하였다. 배양 24 시간 후 세포를 수확(harvest)해서 단백질을 얻었으며 단백질량은 BCA 키트(Pierce Biotechnology, USA)를 사용하여 정량하였다. 웨스턴블랏(Western Blot) 방법을 사용하여 생성된 필라그린(filaggrin)과 인볼루크린(Involucrin)의 양을 정량하였다. 상기 웨스턴블랏은 레인(lane) 당 30 ug의 단백질을 SDS-PAGE 겔에 적재(loading)하여 전기영동한 후 단백질 이동키트(transfer kit)(Invitrogen, USA)을 사용하여 PVDF 막(membrane)(Amersham, USA)으로 단백질을 이동시켰다. 이동 후 1차 항체로 각각 PPARα, 필라크린과 인볼루크린에 대한 항체(Santacruz Biotechnology, USA)를 37℃에서 1시간 정도 붙여주고, PBS로 3회 세척한 후 HRP가 붙은 2차 항체를 37℃에서 1시간 정도 붙여주고, PBS로 3회 세척 후 ECL 키트을 사용하여 그 발광정도를 필름에 노출시키고, 밴드의 강도를 덴시토미터(densitometer)를 사용하여 정량하였다. 그 값은 자외선 대조군을 100으로 하여 비교치를 나타내었다.

사가섬 에조엔스 추출물, 이의 분획물 , 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물의 보습인자 생합성 효과

시료	농도	필라그린	인볼루크린
무처리군		100	100
WY14643	10 uM	120.1	101.4
실시예<1-1>	10 ug/ml	128.3	107.6
실시예 2	10 ug/ml	138.8	106.7
실시예 3	10 ug/ml	141.3	109.4
실시예 4	10 uM	128.4	108.2
실시예 5	10 uM	130.5	110.5

그 결과, 표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, 사가섬 에조엔스 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 각질형성세포에서 천연보습인자인 필라그린 및 인볼루크린의 생합성량을 증가시킴으로서 피부보습을 증진할 수 있음을 알 수 있었다.

[ 실험예 2] 자외선에 의한 젤라티네이즈 A( MMP -9)와 젤라티네이즈 B( MMP -2)의 생합성 억제 효능 및 활성억제 효능 측정

인체각질형성세포 (Lonza, switzerland)를 1 X 10⁴ 개의 농도로 24공 평판배양기에 배양하고, 24시간 후에 자외선 B를 30 mJ/cm²로 조사한 후, 각 시험물질을 10 uM, 추출물 및 분획물의 경우는 10 ug/ml 포함한 배지로 교체하였다. 배양 48 시간 후 상등액을 수확해서 세포를 수확(harvest)해서 젤라틴젤을 이용한 자이모그래피(Zymography)를 한 후 생성된 MMP-2와 MMP-9의 양을 덴시토미터로 측정하여 정량하였다.

또한 그 활성에 대한 영향을 측정하기 위하여, 인체각질형성세포에 자외선 B를 30 mJ/cm²로 조사한 상등액을 일정량 젤라틴젤에 내린 후 30분 동안 buffer A 에 담가 renaturation 시킨 후, bufferB와 시료를 동시에 처리하여 develop 한 후 활성이 억제된 정도를 MMP-2와 MMP-9의 밴트 크기를 덴시토미터로 측정하여 정량하였다. 그 값은 자외선 대조군을 100으로 하여 비교치를 표 2에 나타내었다.

사가섬 에조엔스 추출물, 이의 분획물 , 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물의 MMP-2 및 MMP -9에 대한 발현 및 활성 억제 정도

시료	농도	발현 억제 정도		활성 억제 정도
		MMP -2 (%)	MMP -9 (%)	MMP -2 (%)	MMP -9 (%)
대조군		100	100	100	100
실시예<1-1>	10 ug/ml	51.2	55.4	56.3	54.8
실시예 2	10 ug/ml	52.7	56.8	49.8	47.7
실시예 3	10 ug/ml	53.2	57.8	50.7	48.6
실시예 4	10 uM	45.2	47.3	53.1	52.8
실시예 5	10 uM	58.9	57.8	60.4	64.1

그 결과, 표 2 및 도 2에 나타난 바와 같이, 사가섬 에조엔스 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 MMP-2 와 MMP-9의 생합성 또는 활성을 저해하여 표피 진피 경계부를 보호 또는 분해를 방지하여 피부주름감소, 탄력증진, 피부 밀착력 강화를 시킬 수 있음을 알 수 있었다.

[ 실험예 3] 자외선에 의한 종양괴사인자 알파( TNF -α)의 생합성 억제 효능 측정

신생아 포피에서 직접 분리한 인체 각질형성세포 (Lonza, switzerland)를 10⁵ 개의 농도로 12공 평판배양기에 배양하고, 자외선 B를 30 mJ/cm²로 조사한 후, 각 시험물질을 10 uM, 추출물 및 분획물의 경우는 10 ug/ml 포함한 배지로 교체하였다. 배양 6 ~ 24 시간 후 세포를 수확(harvest)해서 ELISA(Pharmingen 555212) 방법을 사용하여 생성된 종양괴사인자 알파(TNF-α)의 양을 정량하였다. 그 값은 자외선 대조군을 100으로 하여 비교치를 표 3에 나타내었다.

사가섬 에조엔스의 자외선에 의한 TNF -α의 생합성 억제 효과

시료	농도	TNF -a 생합성(%)
무처리군		100
Wy-14,643	10 uM	40
실시예<1-1>	10 ug/ml	35
실시예 2	10 ug/ml	32
실시예 3	10 ug/ml	31
실시예 4	10 uM	42
실시예 5	10 uM	28

그 결과, 표 3에 나타나는 바와 같이 사가섬 에조엔스 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 자외선에 의한 종양괴사인자 알파의 생합성을 감소시켰음을 알 수 있다.

[ 실험예 4] 자외선에 의한 타입 I 콜라게나제인 메탈로프로테아즈 -1(Metalloelastase-1, MMP -1)의 생합성 억제 효능 및 콜라겐 분해 억제 측정

신생아 포피에서 직접 분리한 1차세포(primary cell)인 인체 섬유아세포 (Lonza, switzerland)를 10⁴개의 농도로 48공 평판배양기에 배양하고, 24시간 후에 자외선 A를 15 J/cm²로 조사한 후, 각각의 시험물질 10 uM 또는 10 ug/ml씩을 함유한 배지로 갈아주었다. 배양 2일째 상등액을 수확(harvest)해서 ELISA(AP biotech RPN2610) 방법을 사용하여 생성된 타입 I 콜라게나제의 양을 정량하였다. 또한 동일한 상등액을 이용하여 분해되지 않고 남아 있는 프로콜라겐의 양을 ELISA(Takara MK101)방법을 사용하여 정량하였다. 그 값들은 자외선 조사군을 100으로 한 비교치를 나타내었다.

사가섬 에조엔스 추출물 및 성분의 자외선에 의한 MMP -1의 생합성 억제 효과

시료	타입I 콜라게나제 생합성(%)	남은 프로콜라겐 (procollagen) 양 (%)
자외선 A 조사군	100	100
실시예 <1-1> (10 ug/ml)	30	200
실시예 2 (10 ug/ml)	25	205
실시예 3 (10 ug/ml)	22	208
실시예 4 (10 uM)	35	180
실시예 5 (10 uM)	20	220

그 결과, 표 4 및 도 3에 나타난 바와 같이, 사가섬 에조엔스 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물은 자외선에 의한 타입 I 콜라게나제의 생합성을 감소시키고, 염증 매개 인자 (TNF-α)의 생합성 감소에 기인함을 알 수 있었다. 또한 MMP-1의 생합성을 저해함에 따라 프로콜라겐의 분해도 막아줌을 알 수 있었다.

[ 실험예 5] 피부 탄력에 영향을 주는 엘라스타제 ( Elastase ) 활성에 미치는 영향 측정

사람 백혈구 엘라스타제 (HNE, sigma, E8140 (1 U))는 1 vial에 0.2M Tris-Cl(pH8.0)를 1ml 첨가하여 1U/ml로 만들고, 기질 (N-(Methoxysuccinyl)-Ala-Ala-Pro-Val 4-nitroanilide (M4765) MW 590.6) 은 DMSO에 120 mM로 만들어 놓은 후, 사용 직전에 0.2 M Tris-Cl (pH8.0)로 1:20으로 희석하여 6 mM로 만들어 final 2 mM로 첨가한다. 96 wellplate에 0.2 M Tris-Cl, 시험물과 효소를 넣고 10분간 두고 기질을 넣은 후 실온에서 30분간 두어 반응시킨 후 분해되어 나온 p-nitroanilide의 양을 405 nm에서 흡광도 측정하였다.

돼지 췌장 엘라스타제 (PPE, sigma (E1250 (19mg/ml))는 0.2M Tris-Cl(pH8.0)에 3X로 만든다(10ug/ml). 기질 (N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (S4760) MW;451.4)은 0.2 M Tris-Cl(pH8.0)에 6mM로 만들어 놓은 후, final 2mM로 첨가한다. 96 wellplate에 0.2 M Tris-Cl, 시험물과 효소를 넣고 10분간 둔 후 기질을 넣은 후 실온에서 30분간 두어 반응시킨 후 분해되어 나온 p-나이트로아닐라이드 (p-nitroanilide)의 양을 405nm에서 흡광도 측정하였다.

각 효소의 저해 정도는 아래 공식으로 구하였다.

Blank ; 총 반응액 중 효소만이 제외된 것.

대조군 ; 엘라스타제와 기질만(실험하고자 하는 샘플이 없는)이 포함된 것.

Inhibition (%) = (1-B/A) X 100

(A ; 대조군의 활성도, B ; 추출물이 들어간 샘플의 활성도)

사가섬 에조엔스 추출물 및 성분의 엘라스타제 활성 저해 효과

시료	사람 백혈구 엘라스타제	돼지 췌장 엘라스타제
대조군	100	100
실시예 <1-1> (10 ug/ml)	80	30
실시예 2 (10 ug/ml)	81	38
실시예 3 (10 ug/ml)	83	40
실시예 4 (10 uM)	78	25
실시예 5 (10 uM)	90	45

그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 사가섬 에조엔스 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 엘라스타제 활성을 저해하여 탄력섬유의 붕괴를 막아 피부탄력의 저하를 예방할 수 있음을 알 수 있었다.

[ 실험예 6] 사가섬 에조엔스 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물의 경구투여 급성 독성실험

본 발명자들은 사가섬 에조엔스 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성 독성실험을 실시하였다. 사가섬 에조엔스의 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물을 각각 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 5 g/kg/10 ㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 실험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상 증상, 체중 변화를 관찰하여 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하였다.

실험 결과, 실험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학검사, 부검소견 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다.

그 결과, 랫트에서 5 g/kg까지 독성 변화를 나타내지 않으며, 경구 투여 최소 치사량 (LD₅₀)은 5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.

본 발명에 의한 사가섬 에조엔스 추출물 함유 조성물은 하기와 같이 여러 가지 제형으로 응용 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

[제제예 1] 정제

사가섬 에조엔스 추출물 150 mg, 포도당 100 mg, 홍삼추출물 50 mg, 전분 96 mg 및 마그네슘 스테아레이트 4 mg을 혼합하고 30% 에탄올을 40 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하고 타정기를 이용하여 정제로 타정하였다.

[제제예 2] 과립제

사가섬 에조엔스 추출물 150 mg, 포도당 100 mg, 홍삼추출물 50 mg 및 전분 600 mg을 혼합하고 30% 에탄올을 100 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 다음 포에 충진하였다. 내용물의 최종 중량은 1 g으로 하였다.

[제형예 1] 로션

배합성분	중량%
사가섬 에조엔스 추출물	3.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
수용성 콜라겐 (1% 수용액)	1.00
시트르산나트륨	0.10
시트르산	0.05
1,3-부틸렌글리콜	3.00
정제수	to 100

[제형예 2] 팩

배합성분	중량%
사가섬 에조엔스 추출물	5.00
폴리비닐알코올	13.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
라우로일히드록시프롤린	1.00
수용성 콜라겐 (1% 수용액)	2.00
1,3-부틸렌글리콜	3.00
에탄올	5.00
정제수	to 100

[제형예 3] 미용액

배합성분	중량%
사가섬 에조엔스 추출물	2.00
히드록시에틸렌셀룰로오스 (2% 수용액)	12.00
크산탄검 (2% 수용액)	2.00
1,3-부틸렌글리콜	6.00
진한 글리세린	4.00
히알루론산나트륨 (1% 수용액)	5.00
정제수	to 100

[제형예 4] 연고

배합 성분	함량(중량%)
사가섬 에조엔스 추출물	0.1
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
밀납	4.0
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

1. 사가섬 에조엔스 (Sargassum yezoense) 추출물을 유효성분으로 포함하는 보습용 화장료 조성물.
2. 사가섬 에조엔스 (Sargassum yezoense) 추출물을 유효성분으로 포함하는 보습용 건강식품 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 추출물은 하기 화합물 1 및 화합물 2로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
   [화학식 2]
   

   
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 조성물은 상기 사가섬 에조엔스 (Sargassum yezoense) 추출물을 조성물 전체 중량에 대하여 0.001 내지 10중량%로 포함하는, 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 추출물은 사가섬 에조엔스-C₁~C₆ 알코올 추출물인, 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 조성물은 필라그린 (filaggrin) 및 인볼루크린 (involucrin)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 생합성을 증가 또는 이의 활성을 증가시키는, 조성물.
   
7. 삭제
8. 삭제
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