KR101440818B1 - 효모 세포벽 성분들 및 이의 검출 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물 사료 첨가물들과 사료 생산물들내에 이의 탐지에 관계한다. 추가적으로, 본 발명은 효모 세포벽 성분들, 이들의 단리 방법들, 그리고 이의 면역학적 이의 탐지를 위한 조성물들 및 방법들에 관한 것이다.

Description

효모 세포벽 성분들 및 이의 검출{YEAST CELL WALL COMPONENTS AND DETECTION THEREOF}

본 발명은 동물 사료 첨가물들 및 사료 생산물들에서 이의 검출에 관한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 효모 세포벽 성분들, 이의 분리 방법, 그리고 면역학적으로 이를 검출하기 위한 조성물들 및 방법들에 관한 것이다.

본 출원은 2010년 5월 14일자로 제출된 미국 임시 특허 출원 번호 제61/334,995호를 우선권으로 수반하는 출원이며, 이는 여기에 참고로 포함된다.

동물 영양 보급(nutrition) 분야에서, 다양한 첨가물들 및 보충제들이 가축 능력을 개선시키기 위하여 이용되어 왔다. 일부 경우들에서, 동물 사료 첨가물들의 용도로 효모 세포벽 성분들을 찾는다. 한 가지 예는 사료 첨가물 MYCOSORB(ALLTECH, Inc에서 제조)이다. MYCOSORB는 음식 및 사료 안에 진균독 오염물질들에 결합하고, 이로 인하여 진균독들을 소화하기 어려운 상태로 격리시킨다. 이러한 진균독 오염 물질들은 공급 원료 성분들로 이용되는 들에 있는 그리고 수확후 곡물, 곡물의 부산물, 그리고 옥수수 목초에서 곰팡이의 성장으로 인하여 공통적으로 발생한다. 시판되는 가공되지 않은 그리고 완성된 사료 성분들에 대해서 진균독에 대한 필수 모니터링을 하지만, 100% 효과적인 모니터링 시스템은 없다. 전세계적으로, 모든 곡물의 대략 25%는 진균독 오염에 영향을 받고(Council for Agricultural Science and Technology(1989) Mycotoxins: Economics and Health Risks, Task Force Report No. 116, Ames, IA), 따라서 오염된 원료들이 가축 및 반려 동물 사료 공급망으로 유입되는 경우들이 불가피하다. 진균독-오염된 사료를 가축들이 섭취한 결과는 식욕 감퇴, 감소된 성장 감소, 감소된 번식 기능 및 우유 산출량, 억제된 면역계, 손상된 소화력을 포함하며, 그리고 심각한 경우들에서는 사망의 원인이 된다. 따라서, 진균독 제거(sequestration)는 동물 및 인간의 건강에 불리하게 영향을 주는 자연 발생 독소의 유해성을 감소시키는 유용한 전략으로 확인되었다.

동물 소비용으로 준비된 사료 안에 사용된 상대적으로 낮은 농도의 사료 첨가물과 많은 간섭 화합물들의 존재로 인하여, 사료 첨가물들의 정량적 그리고 정성적 탐지를 위한 확고하고, 특이적인 분석 방법들 및 키트들의 개발은 어렵다.

본 발명은 동물 사료 첨가물들 및 사료 생산물들 안에서 이의 검출에 관한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 효모 세포벽 성분들, 이들을 분리시키는 방법들, 그리고 면역학적으로 이를 검출하기 위한 조성물들 및 방법들에 관한 것이다.

일부 실시예들에서, 시료(가령, 사료 시료들, 음식 시료들, 또는 이의 추출물들) 안에 효모 세포벽 성분 및/또는 이의 단편을 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 사료 생산물들(가령, 가축 사료, 반려 동물 사료, 또는 이의 제조 중간 물질들) 내에서, 예를 들면, 효모 세포 벽 성분들(가령, 효모 글루칸, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, MYCOSORB 사료 첨가물, BIOMOSS 사료 첨가물, ACTIGEN 사료 첨가물 및 이와 유사한 것들)로 구성된 음식 및 사료 첨가물들의 존재를 판단하는데 용도를 찾는다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 사료 생산물들(가령, 가축 사료, 반려 동물 사료, 또는 이의 제조 중간물질들)로부터 효모 세포벽 성분들(가령, 효모 글루칸, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, MYCOSORB 사료 첨가물 및 이와 유사한 것들)을 추출하는 방법들에 관한 것이다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 특이적 효모 세포 벽 성분들(가령, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸 및/또는 이의 콘쥬게이트들)에 대한 항체들을 만드는데 있어서 용도를 찾는 항원들을 제공한다. 바람직한 실시예들에서, 이러한 항원들은 운반체, 가령, 단백질 운반체(가령, 소 혈청 알부민(BSA))에 콘쥬게이트된다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 C6-OH 위치(들)에서 탄수화물들(가령, 글루코피라노즈 고리들, 글루칸들, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸을 포함하는 탄수화물들)을 활성화시키는 방법들을 제공한다. 일부 실시예들에서, 이러한 활성화는 약한 산화(가령, 디메틸술폭시드/무수 아세트산을 이용)를 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 효모 세포벽 항원들(가령, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, 또는 이의 콘쥬게이트들을 인지할 수 있는 단클론 또는 다클론 항체들 효모 (1→4)-α-글루칸/(1→6)-β-D-글루칸/BSA 항원에 대항하여 생성된 단클론 항체들 513A161.1 또는 513A431.1 원문 화살표 누락 (1→4)-α-글루칸/(1→6)-β-D-글루칸/BSA 항원에 대항하여 생성된 다클론 항체들 또는 정제된, 희석된, 콘쥬게이트된 및/또는 이의 단일 특이적 형들)을 인지할 수 있는 항체들을 제공한다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 시료들(가령, 사료 시료들, 음식 시료들, 또는 이의 추출물들) 안에서 효모 세포 벽 성분들(가령, 효모 글루칸, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, MYCOSORB 사료 첨가물 및 이와 유사한 것들)을 검출하기 위한 시약들을 포함하는 키트들을 제공한다.

본 발명은 분석용으로 이용되는 시료의 유형 또는 성질에 제한되지 않는다. 일부 바람직한 실시예들에서, 이 시료는 음식 또는 사료 생산물이거나 또는 이로부터 유래된다. 음식 또는 사료 생산물은 규정식의 에너지 및/또는 영양소로 기여하는(가령, 동물에 의해) 소비되는 임의의 원료(들)를 포함한다. 사료 재료들의 예로는 완전 혼합 사료(TMR), 먹이(들), 펠렛(들), 농축물(들), 프레믹스(들) 공동 생산물(들), 낟알(들), 증류 낟알(들), 당밀(molasses), 화이버(들), 꼴(fodder)(들), 목초(들), 건초, 인(kernel)(들), 잎, 체질하지 않은 굵은 가루(meal), 가용성(들), 그리고 보충제(들)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 사료 및 음식 재료들은 이들의 물리적 형태로 제한되지 않는다. 사료 및 음식 재료들은 더 작은 입자 크기로 가공될 수 있고(가령, 가늘고 길게 자르거나(chipped), 잘게 다지거나(chopped), 갈거나(ground), 제분하거나(milled) 또는 이와 유사하게); 액체 형으로 만들거나(가령, 추출하거나, 끓이거나, 농축하거나, 시럽 또는 다른 점성 형태로 전환시키거나); 또는 더 큰 크기(가령, 꾸러미로 만들거나(baled), 통합하거나(consolidated), 압착하거나(compressed), 또는 합성 모양 가령, 펠렛, 블록, 스퀘어, 플레이크 및 이와 유사한 것들로 모양을 만들거나)로 가공할 수 있다.

본 발명은 분석용 시료를 수득하는데 이용되는 추출 방법의 유형 또는 성질에 의해 제한되지 않는다. 일부 실시예들에서, 분석될 원 재료(가령, 음식 또는 사료 생산물 가축 사료)는 분석용 시료를 얻기 위한 추출 기술을 거친다. 추출 기술은 산 추출, 알칼리 추출, 유기 용매로 추출, 완충액으로 추출, 염으로 추출, 세제로 추출, 물리적 추출(가령, 가열, 스팀 추출, 저온 추출, 빻기 및 이와 유사한 것들), 또는 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시예들에서, 분석될 원료(가령, 음식 또는 사료 생산물 가축 사료)는 유기 용매 및 산 용액의 조합을 이용하여 추출한다. 일부 실시예들에서, 분석될 원료(가령, 음식 또는 사료 생산물 가축 사료)는 디메틸술폭시드(DMSO) 및 염산(HCl) 용액을 이용하여 추출한다.

본 발명은 원 시료 내에 있는 분석물(가령, 항원, 효모 세포 벽 성분, 효모 글루칸, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, MYCOSORB 사료 첨가물 및 이와 유사한 것들)의 양에 제한되지 않는다. 분석물의 양은 톤당 0.005㎎ 미만, 0.005-0.05㎎, 0.05-0.5㎎, 0.5-1㎎, 1-5㎎, 5-10㎎, 10-25㎎, 25㎎ 또는 그 초과일 수 있다. 본 발명은 테스트될 원료 안에 존재하는 분석물(가령, 항원, 효모 세포 벽 성분, 효모 글루칸, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, MYCOSORB 사료 첨가물 및 이와 유사한 것들)의 양에 제한되지 않는다. 탐지되는 분석물의 양은 톤당 0.05㎏ 미만, 0.05-0.5㎏, 0.5-1㎏, 1.0-2.0㎏, 2.0-3.0㎏, 3.0-4.0㎏, 4.0-5.0㎏, 5.0-6.0㎏, 6.0-10.0㎏, 10㎏ 또는 그 초과일 수 있다.

본 발명은 분석물(가령, 항원, 효모 세포벽 성분, 효모 글루칸, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, MYCOSORB 사료 첨가물 및 이와 유사한 것들)을 탐지하는데 이용되는 항체들의 작업 농도에 제한되지 않는다. 이 항체들(가령, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, 또는 이의 콘쥬게이트들 (1→4)-α-D-글루칸/(1→6)-β-D-글루칸/BSA 항원에 대항하여 생성된 단클론 항체들 513A161.1 또는 513A431.1; (1→4)-α-D-글루칸/(1→6)-β-D-글루칸/BSA 항원에 대항하여 생성된 다클론 항체들 또는 정제된, 희석된, 콘쥬게이트된 및/또는 이의 단일 특이적 형태들을 인지할 수 있는 단클론 또는 다클론 항체들)의 작용 희석은 1:100,000 초과 1:50,000 내지 1:100,000; 1:20,000 내지 1:50,000; 1:10,000 내지 1:20,000; 1:5,000 내지 1:10,000; 1:1,000 내지 1:5,000; 1:500 내지 1:1,000; 1:100 내지 1:500; 1:50 내지 1:100; 1:10-1:50; 1:1 내지 1:10; 2:1 내지 1:1로 희석되거나 또는 2:1 이상으로 농축될 수 있다.

일부 실시예들에서, 본 발명은 효모 세포벽 성분들을 포함하는 면역 조성물을 제공한다. 일부 실시예들에서, 효모 세포벽 성분은 효모 글루칸을 포함한다. 일부 실시예들에서, 이 글루칸은 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, 또는 콘쥬게이트들 또는 이의 유도 물질들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 운반체(가령, 단백질 운반체)에 콘쥬게이트된 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸을 제공한다. 운반체들은 숙주 동물에서 면역성 및/또는 안정성을 도울 수 있다. 운반체들의 예로는 소 혈청 알부민(BSA), 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH), 오브알부민(OVA), 소의 티로글로불린(THY), 그리고 오리 B형 간염 코어 항원(DHBcAg)(Gathuru et al. (2005) Vaccine 23:4727-4733)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명은 항원과 운반체 사이에 연쇄(linkage)의 위치에 제한되지 않는다. 일부 바람직한 실시예들에서, 이 항원(가령, 탄수화물 항원, 글루칸, 글루코피라노즈 링(들)을 포함하는 탄수화물, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸)은 항원에 대해 하나 이상의 O-6 위치에서 운반체에 콘쥬게이트된다. 일부 실시예들에서, 이 항원은 C6 위치에서 BSA에 콘쥬게이트된 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸이다.

본 발명의 항체들은 이들이 생성된 숙주 종에 제한되지 않는다. 숙주 종들은 쥐, 마우스, 기니아 피그, 헴스터, 토끼, 염소, 양, 닭, 당나귀, 말, 소, 개과 동물, 고양이과, 돼지, 유인원, 인간, 또는 임의의 기타 종일 수 있다. 본 발명의 항체들은 이 항체들을 야기하기 위하여 이용되는 접종 섭생, 항원 준비 방법, 또는 항원 전달 방법에 제한되지 않는다. 항원은 면역-자극 물질들(가령, 어쥬번트들), 완충액들, 염들, 용매들, 용해도-강화 화합물들, 또는 이와 유사한 것들의 존재 또는 부재 하에 제시될 수 있다. 이 숙주 종들은 이 항원으로 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 5-10회, 10-20회 또는 20회 초과로 면역화될 수 있다. 본 발명의 항체들은 클론성(가령, 단클론, 다클론)에 제한되지 않는다. 항체들은 미정제 또는 정제된 형으로 이용될 수 있다. 항체들은 다중 특이적 또는 단일 특이적일 수 있다. 바람직한 실시예들에서, 항체들은 이들을 일으키는데 이용된 항원을 특이적으로 인지할 수 있다. 일부 바람직한 실시예들에서, 본 발명의 항체들은 효모(가령, 사카로미세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae)) 세포벽으로부터 추출된 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸을 특이적으로 인지할 수 있다. 일부 바람직한 실시예들, 본 발명의 항체들은 다클론 항체들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, 또는 이의 단편들, 이의 변이체들 또는 이의 콘쥬게이트들을 인지할 수 있는 단클론 또는 다클론 항체들을 제공한다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 항체 조성물들은 효모 세포벽 (1→4)-α-D-글루칸에 결합하지만, 효모 세포벽 효모 (1→4)-α-D-글루칸-함유하는 폴리머들(가령, 효모 세포벽 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 세포 벽 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, 또는 이의 단편들, 이의 변이체들, 또는 이의 콘쥬게이트들)이외의 물질들에 존재하는 (1→4)-α-D-글루칸-함유하는 모이어티들에는 결합하지 않는다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 항체 조성물들은 효모 세포벽 (1→6)-β-D-글루칸에 결합하지만, 효모 세포벽 (1→6)-β-D-글루칸-함유하는 폴리머들(가령, 효모 세포벽 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 세포 벽 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, 이의 단편들, 이의 변이체들, 또는 이의 콘쥬게이트들)이외의 물질들에 존재하는 효모 세포벽 (1→6)-β-D-글루칸-함유하는 모이어티들에는 결합하지 않는다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 항체 조성물들은 효모 세포벽 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸에 결합하지만, 효모 세포벽(가령, 효모 세포벽 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, 이의 단편들, 이의 변이체들, 또는 이의 콘쥬게이트들)이외에 물질들에 존재하는 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸-함유하는 모이어티들에는 결합하지 않는다.

본 발명의 일부 항원 탐지 방법들은 면역탐지 방법들을 포함한다. 일부 바람직한 실시예들에서, 면역 탐지 방법들은 ELISA를 포함한다. 일부 실시예들에서, ELISA는 원래 분석될 원료(가령, 음식 또는 사료 생산물 가축 사료 이의 추출물)로부터 유도된 시료와 1차 항체(가령, 효모 세포 벽 성분을 인지할 수 있는 항체 효모 글루칸을 인지할 수 있는 항체 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸 및/또는 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸을 인지할 수 있는 항체)를 이용하여 실행한다. 일부 실시예들에서, 이 항체는 검출 가능한 신호(가령, 색원성 물질, 형광 발생성 물질, 방사능 동위 원소 등)를 생성할 수 있는 물질에 직접적으로 연결된다. 일부 실시예들에서, 이 항체는 검출 가능한 신호(가령, 색원성 물질, 형광 발생성 물질, 방사능 라벨, 동위 원소 등)를 생성할 수 있는 또 다른 물질에 직접적으로 또는 간접적으로 연합된다.

일부 실시예들에서, 본 발명은 시료(가령, 음식 또는 사료 생산물, 가축 사료, 이의 추출물) 안에 분석물(가령, 항원, 효모 세포 벽 성분, 효모 글루칸, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸 및/또는 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸)의 탐지를 위한 키트들을 제공한다. 키트 성분들은 시약들, 추출 완충액들, 용매들, 세제들, 차단 물질들, 튜브들, 항체들, 표준들, 지침들 및 임의의 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

일부 실시예들에서, 본 발명은 원래 분석될 원료(가령, 음식 또는 사료 생산물, 가축 사료, 이의 추출물)를 위하여 분석물(가령, 항원, 효모 세포 벽 성분, 효모 글루칸, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸 및/또는 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸)의 농도에 대한 정보를 얻는 서비스를 제공한다. 일부 실시예들에서, 이 분석은 최종 소비자(가령, 농부, 가축 소유주, 가축 취급자, 가축 종축자, 반려 동물 소유주, 반려 동물 취급자, 반려 동물 종축자, 수의사, 사료 또는 음식 생산물 제조업자, 사료 또는 음식 생산물 도매업자, 관리 공무원)에 의해 실시된다. 일부 실시예들에서, 시료 또는 최초 원료는 최종 소비자(가령, 농부, 가축 소유주, 가축 취급자, 가축 종축자, 반려 동물 소유주, 반려 동물 취급자, 반려 동물 종축자, 수의사, 사료 또는 음식 생산물 제조업자, 사료 또는 음식 생산물 도매업자, 관리 공무원)에 의해 제3 자에게 제공되고, 이 제3 자가 이 분석을 실시한다. 일부 실시예들에서, 이 제3 자는 분석 결과들에 대한 정보를 최종 소비자(가령, 농부, 가축 소유주, 가축 취급자, 가축 종축자, 반려 동물 소유주, 반려 동물 취급자, 반려 동물 종축자, 수의사, 사료 또는 음식 생산물 제조업자, 사료 또는 음식 생산물 도매업자, 관리 공무원)에게 통지한다. 일부 실시예들에서, 이 제3 자는 이 분석 결과를 제4 자에게 전달한다.

추가적인 실시예들은 여기에 포함된 내용에 근거하여 관련 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다.

도 1은 이 글루칸 분획물 P1, P2, P3 및 S1, S2, 및 S3(가령, 실시예 1 참고)의 생산의 개요도를 보여준다.
도 2는 토끼의 최초 항혈청과 친화력-정제된 항혈청의 4가지 상청액의 반응을 보여준다. BSA로 피복된 마이크로-웰 플레이트에 β-(1,6)-글루칸 특이적(Gab 1-Gab4) 항체들의 분리로부터 친화력-정제된 항혈청을 수득하였다(가령, 실시예 3 참고).
도 3은 여기에서 설명된 방법들을 이용하여 생성된 정제된 항-(1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸 BSA 다클론 토끼 항체들을 이용하여 만든 검량선(calibration curve)을 보여준다(가령, 실시예 2 및 3 참고).
도 4는 낙농(dairy) 사료 원료 안에 MYCOSORB의 6가지 함유 수준으로 실행한 5개 분석으로부터 평균 표준 곡선을 보여준다. 2차 y축은 표준 곡선을 위한 작업일내(Within-day)(% CVintra) 및 작업일간(Between-day)(%CVinter) 재현 정밀도(반복성 정밀성)를 강조하고 있다.
도 5는 닭 사료 원료 안에 MYCOSORB의 6가지 함유 수준으로 실행한 5개 분석으로부터 평균 표준 곡선을 보여준다. 2차 y축은 표준 곡선을 위한 작업일내(Within-day)(% CVintra) 및 작업일간(Between-day)(%CVinter) 재현 정밀도(반복성 정밀성)를 강조하고 있다.
도 6은 돼지 사료 원료 안에 MYCOSORB의 6가지 함유 수준으로 실행한 5개 분석으로부터 평균 표준 곡선을 보여준다. 2차 y축은 표준 곡선을 위한 작업일내(Within-day)(% CVintra) 및 작업일간(Between-day)(%CVinter) 재현 정밀도(반복성 정밀성)를 강조하고 있다.
도 7은 다중 미량적정 플레이트 분포를 위하여 닭 시료에서 수득한 MYCOSORB 생산물 신호로부터 공제한 간섭 생산물의 평균 광학 밀도 판독 차이(ΔOD450)를 보여준다(실시예 7). MYCOSORB 생산물(100%, 1.0㎏/T)에 추가하여, 간섭(interferential) 생산물들은 50%, 100%, 200%(w/w)로 추가하였다.
도 8은 단일 미량적정 플레이트 분포를 위하여 닭 시료에서 수득한 MYCOSORB 생산물 신호로부터 공제한 간섭 생산물의 평균 광학 밀도 판독 차이(ΔOD450)를 보여준다(실시예 7). MYCOSORB 생산물(100%, 1.0㎏/T)에 추가하여, 간섭(interferential) 생산물들은 50%, 100%, 200%(w/w)로 추가하였다.
도 9는 1:100 (위) 또는 1:200 (아래) 농도에서 단클론 항체 513A161.1의 교차-반응성을 나타내는 ELISA 분석 결과를 보여준다.
도 10은 1:500 (위) 또는 1:1000 (아래) 농도에서 단클론 항체 513A161.1의 교차-반응성을 나타내는 ELISA 분석 결과를 보여준다.
도 11은 1:1500 (위) 또는 1:2000 (아래) 농도에서 단클론 항체 513A161.1의 교차-반응성을 나타내는 ELISA 분석 결과를 보여준다.
도 12는 1:100 (위) 또는 1:200 (아래) 농도에서 단클론 항체 513A431.1의 교차-반응성을 나타내는 ELISA 분석 결과를 보여준다.
도 13은 1:500 (위) 또는 1:1000 (아래) 농도에서 단클론 항체 513A431.1의 교차-반응성을 나타내는 ELISA 분석 결과를 보여준다.
도 14는 1:1500 (위) 또는 1:2000 (아래) 농도에서 단클론 항체 513A431.1의 교차-반응성을 나타내는 ELISA 분석 결과를 보여준다.
도 15는 희석안된 또는PBS 또는 PBS + 3% 탈지 분유에서 1:1로 희석된 플레이트된 3가지 효모 세포벽 추출물 표준들의 ELISA 분석 흡수도 판독 및 표준 편차를 보여준다(실시예 6).
도 16은 실시예 6에서 설명된 ELISA 마이크로플레이트 피복 시간 및 온도 항온처리에 대한 사료 추출물 표준 곡선 그래프를 보여준다.

용어의 정의

본 발명의 이해를 돕기 위하여 몇 가지 용어 및 문구를 아래와 같이 정의한다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 그리고 "단백질"은 모두 공유 "펩티드 연쇄"에 의해 이어진 1차 서열의 아미노산을 지칭한다. 일반적으로, 펩티드는 소수의 아미노산, 일반적으로 2-50개 아미노산으로 구성되며, 단백질보다 짧다. 용어 "폴리펩티드"는 펩티드들 및 단백질들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 합성된 것이며, 다른 실시예들에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 또는 자연적으로 생성된 것이다. 합성 펩티드는 시험관에서 인공적인 수단에 의해 만들어진 펩티드이다(가령, 생체 내에서는 생성되지 않는다).

용어 "당단백질(들)" 또는 "당펩티드(들)"은 폴리펩티드 쇄에 공유적으로 부착된 하나 이상의 탄수화물 잔기들을 함유하는 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 용어 "셀레노단백질(들)" 또는 "셀레노펩티드(들)"는 하나 이상의 셀렌 원자를 함유하는 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 대체로, 셀렌 원자들은 셀레노시스테인 및 셀레노메티오닌을 포함하는, 셀렌-함유 아미노산 내 단백질에 통합된다.

용어 "셀레노당단백질(들)", "셀레노당펩티드(들)" 또는 "SGP(들)"은 하나 이상의 셀렌 원자들이 섞여 있는 당단백질 또는 당펩티드를 지칭한다. 대체로, 셀레노당단백질들은 하나 이상의 셀렌-함유하는 아미노산들을 포함한다. 셀레노당단백질들은 임의의 수의 상이한 형태의 다수의 탄수화물을 포함할 수 있다.

용어 "시료" 및 "표본"은 최대로 광범위한 관념에서 이용되며, 임의의 원천으로부터 수득한 시료들 또는 표본들을 포함한다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "시료"는 동물들(인간을 포함)로부터 수득한 생물학적 시료들을 지칭하는데 이용되며, 그리고 유체, 고체, 조직 및 기체들을 포함한다. 본 발명의 일부 실시예들에서, 시료들은 시료들을 함유하는 식물-유도된 물질(제조의 중간 단계들에서 저장목초, 낟알, 가공된 가축 사료, 사료 생산물들)을 포함한다. 그러나, 이들 예들은 본 발명으로 용도를 발견한 시료들의 유형을 제한하는 것으로 간주되어서는 않는다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "효모 및 효모 세포들"은 세포 벽, 세포 막 및 세포내 성분들을 보유하는, 균(Fungi) 계에서 분류되는 진핵 미생물을 지칭한다. 효모들은 특이적 분류법적(taxonomic) 또는 계통발생학적(phylogenetic) 집단화를 형성하지는 않는다. 현재 약 1,500 종이 공지되어 있으며 모든 효모 종의 단지 1%만 설명된 것으로 추정한다. 용어 "효모"는 S. cerevisiae의 동의어로 흔히 간주되지만, 그러나 효모의 계통 발생학적 다양성은 Ascomycota 및 Basidiomycota의 두 분할 모두에 있다. 용어 효모는 양조용 효모, 증류용 효모 및 제빵용 효모를 포함한다. 버딩(budding) 효모 ("참(true) 효모")는 Saccharomycetales 목(order)으로 분류된다. 대부분 효모 종은 버딩에 의해 무성색식으로 번식하지만, 일부는 2분열(binary fission)에 의해 번식한다. 효모는 단세포이지만, 일부 종은 pseudohyphae, 또는 false hyphae으로 알려진 버딩 세포들이 연결되어 형성된 스트링을 형성하여 다세포가 된다. 효모 크기는 종에 따라 매우 다양할 수 있지만, 대체로 직경이 3-4㎛으로 측정되지만, 일부 효모는 40㎛ 이상에 이를 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "효모 세포 벽"은 YCW라고 부르기도 하는데, 이 효모의 혈장 막과 세포내 성분들을 에워싸는 효모 유기체의 세포벽을 지칭한다. 효모 세포벽은 이 효모 세포벽의 바깥 층(주로 만난(mannan))과 안쪽 층(주로 글루칸 및 치틴) 모두 포함한다. 세포벽의 기능은 효모 내부를 구성하고 보호한다(이의 대사 활성 중심). 신호생성 및 인지 경로들은 효모 세포벽에서 일어난다. 효모 세포벽의 조성물은 균주마다 가변적이고, 효모의 성장 조건들에 따라 가변적이다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "효모 세포벽 추출물"은 파열된 또는 용해된(가령, 파열 및 용해 단계 동안) 그리고 효모 세포의 가용성 세포내 성분으로부터 분리된 효모의 세포벽을 지칭한다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 w/w(중량/중량)는 중량 기반으로 조성물 안에서 주어진 물질의 양을 지칭한다. 예를 들면, 0.02%w/w의 본 발명의 규정식(dietary) 사료 보충제를 포함하는 동물 사료는 규정식 사료 보충제의 양은 총 동물 사료의 0.02%(가령, 907,200g 의 동물 사료에서 본 발명의 규정식 사료 보충제 조성물은 200g임)임을 의미한다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "정제된" 또는 "정제하기 위하여"는 시료로부터 성분들을 제거하는 것을 지칭한다. 예를 들면, 효모 세포 벽 또는 효모 세포 벽 추출물들은 비-효모 세포벽 성분들(가령, 혈장 막 및/또는 효모 세포내 성분들)의 제거에 의해 정제되고 이들은 오염 물질들 또는 효모 세포벽 이외의 물질들을 제거함으로써 또한 정제된다. 비-효모 세포 벽 성분들 및/또는 비-효모 세포 벽 오염 물질들을 제거하면 시료 안에 효모 세포 벽 또는 이의 성분들의 비율이 증가된다. 분자 수준에서, 용어 "정제된"이란 이들의 천연 환경으로부터 제거된, 단리된 또는 분리된 분자(가령, 탄수화물들, 당단백질들)를 지칭한다. "단리된(isolated) 탄수화물"은 따라서 정제된 탄수화물일 수 있다. "실질적으로 정제된" 분자들은 이 분자들이 자연적으로 연합된 기타 성분들이 최소한 60% 없는, 바람직하게는 최소한 75% 없는, 그리고 더욱 바람직하게는 최소한 90% 없다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "정제된" 또는 "정제하기 위하여"는 시료로부터 오염 물질들의 제거를 지칭한다. 오염 단백질들의 제거로 이 시료 안에 관심 대상의 폴리펩티드의 비율을 증가된다. 더욱이, 재조합 폴리펩티드(가령, 당단백질들)는 식물, 박테리아, 효모, 또는 포유동물 숙주 세포들에서 발현되거나 또는 이로부터 정제되고, 그리고 이 폴리펩티드들은 숙주 세포 단백질들의 제거에 의해 정제된다. 따라서 이 시료 안에 재조합 폴리펩티드의 비율은 증가된다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "동물"은 동물계(kingdom)를 지칭한다. 동물계는 가축, 농장 동물, 가정의 동물들, 반려 또는 애완동물들, 해양 및 담수 동물들, 그리고 야생 동물들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "가축"은 "가축 종(species)"으로 지칭되기도 하고, 그리고 "가정용 가축"으로 지칭되기도 하고, 그리고 또한 "상업적으로 사육되는 동물들"로 지칭되기도 하는데, 이는 음식 또는 화이버(fiber)를 생산하기 위한 농업 또는 양식 환경에서 의도적으로 길들여진 동물들 또는 동물들의 노동력 또는 친교를 위하여 길들여진 동물들을 말한다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어들 "음식 보충제", "규정식 보충제", "규정식 보충제 조성물" 및 이와 유사한 것들은 규정식으로 조성된 음식 생산물 또는 규정식의 일부, 가령, 동물 사료에 추가하기 위하여 이용되는 영양 보급물 보충제를 지칭한다. 예시적인 규정식 보충제 조성물들은 여기에서 설명된다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "키트"는 시약들과 기타 원료들의 조합과 관련하여 이용된다. 이 키트는 추출 용액들, 항체들, 그리고 탐지 시약들과 같은 시약들을 포함할 수 있다. 용어 "키트"는 시약들 및/또는 기타 원료들의 특정 조합으로 국한시키는 것을 의미하지 않는다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "독성"은 독성물의 투여 전, 동일한 세포 또는 조직과 비교하였을 때, 피험자, 세포, 또는 조직에 임의의 해로운 또는 유해한 효과를 말한다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "냉동-건조" 및 용어 "동결 건조" 및 용어 "냉동 건조(cryodesiccation)"는 승화(sublimation)에 의해 냉동 상태의 물질로부터 용액을 제거하는 것을 말한다. 이는 건조시킬 원료를 공융점(eutectic point) 아래로 냉동시키고, 그리고 그 다음 승화 잠열(latent heat)을 제공하여 실시한다. 입열(heat input)의 정확한 제어로 생산물의 번복 용해(melt-back) 없이 냉동 상태로부터 건조시킬 수 있다. 실질적인 적용 시에, 이 공정은 감압 조건하에서 가속화되고, 정확하게 제어된다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "건조 자유 유동성 분말(dry free flowing powder)"은 자유 유동성 건조 분말, 가령, 큰 덩어리의 방해 없이 용기, 백, 관으로부터 따라낼 수 있는 분말을 말한다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "빻기(grinding)"는 충돌, 전단(shearing), 또는 마찰(attrition)에 의해 입자 크기를 감소시키는 것을 말한다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "세척"은 조제물(preparation)에서 불순물 또는 가용성의 바람직하지 않은 성분의 제거 또는 정화(가령, 임의의 유형의 용질(가령 증류수, 완충액, 또는 용매)를 이용하여)를 말한다(가령, 시료로부터 비-효모 세포 벽 성분들을 제거하기 위하여 효모 세포 벽 추출물을 세척할 수 있고 미량적정 플레이트의 웰은 비-결합 또는 비-특이적으로 결합 성분들을 제거하기 위하여 세척할 수 있다).

용어 "항체" 또는 "면역 글로블린"은 특이적 항원에 결합하는 단백질들을 말한다. 면역 글로블린은 다클론, 단클론, 키메라, 그리고 인간화(humanized) 항체들, Fab 단편들, F(ab)2 단편들을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 그리고 다음의 부류의 면역 글로블린을 포함한다: IgG, IgA, IgM, IgD, IbE, 그리고 분비된 면역글로블린(sIg). 면역 글로블린은 일반적으로 두 개의 동일한 중쇄 및 두 개의 경쇄를 포함한다. 그러나, 용어 "항체" 및 "면역 글로블린"은 단일 쇄 항체들과 두 개의 쇄 항체들을 또한 포함한다. 항체들은 임의의 공지의 방법으로 생산될 수 있다(가령, Current Protocols in Immunology (1998) John Wiley and Sons, Inc., N.Y.).

용어 "항원"은 탄수화물, 단백질, 당단백질, 지단백질, 지질 또는 이 분자의 일부에 특이적인 항체와 반응성이 있는 기타 물질을 지칭한다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "분석물"은 원자, 분자, 원자들 및/또는 분자들의 집단, 물질, 또는 화학적 구성 성분을 지칭한다. 분석물 그 자체는 측정할 수 없고, 그 반대로, 이 분석물의 측면들 또는 성질들(물리적, 화학적, 생물학적, 등)은 분석 과정, 가령, HPLC 또는 NMR과 같은 분석 과정을 이용하여 결정할 수 있다. 예를 들면, "의자"(분석물-성분) 자체는 측정할 수 없지만, 의자의 높이, 폭 등은 측정할 수 있다. 유사하게, 진균독을 측정할 수는 없지만, 이 농도와 관련된 이 진균독 신호(가령, 색원성 신호, 형광 신호)는 측정할 수 있다.

용어 "면역 침전시키다," 면역 정화하다 및 "친화력 정화하다" 그리고 이러한 동사 및 부사의 문법적 변이들은 기타 분자들의 혼합물로부터 항체의 항원 또는 이의 일부를 분리시키는데 항체를 이용하는 것을 말한다.

용어 "면역 탐지" 그리고 문법적 변이들은 기타 분자들의 혼합물로부터 항원의 존재를 확인하는데 항체를 이용하는 것을 말한다.

용어 "착색"은 원료(가령, 시료, 사료 시료, 사료 시료의 추출물, 세포, 세포들)의 특이적 성분(들) 및/또는 특징(들)을 더 잘 보이게 하거나, 구별하거나 또는 확인하는데 이용되는 이 분야에 공지된 임의의 많은 공정을 말한다.

용어 "면역 형광"은 당분야에 숙련자들에게 공지된 과정에 의해 확인하고, 표시하고, 라벨하고, 가시화하고 또는 더 분명하게 하는데 이용되는 착색 기술을 말하며, 여기에서 리간드(보통, 항체)는 수용체(보통 항원)에 결합되어 있고, 이러한 리간드, 만일 항체가 콘쥬게이트된 형광 분자에 콘쥬게이트되거나, 또는 이 리간드가 그 다음 리간드에 특이적인 항체에 결합되고, 그리고 상기 항체는 형광 분자에 콘쥬게이트되어, 이때 상기 형광 분자는 적절한 기구(가령, 형광 현미경)로 볼 수 있을 것이다.

용어 "항원 결정 부위"는 특정 항체와 접촉하는 항원의 부분(가령, 에피토프)을 말한다. 단백질 또는 단백질의 단편을 이용하여 숙주 동물을 면역화시킬 때, 이 단백질의 수많은 영역들은 이 단백질에 있는 주어진 부분 또는 3차 구조에 특이적으로 결합하는 항체 생산을 유도할 수 있고 이 영역들 또는 구조들을 항원성 결정부위라고 한다. 항원성 결정 부위는 항체에 결합하는 것에 대해 고유 항원(면역 반응을 유도하는데 이용되는 "면역원")과 경쟁할 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "면역 분석"은 시료 안에서 항원의 탐지를 허용하기 위하여 의도된 정량적 또는 정성적 테스트를 말한다. 면역 분석은 대체로 항원-인지 항체들을 이용한다. 이 항원-인지 항체는 색원성 또는 형광 발생성 표지(marker) 또는 효소와 같은 가시화 단계에 직간접적으로 연결될 수 있다. 면역 분석의 예로는 효소 연결된 면역 흡착 분석(ELISA), 측면 유동 테스트, 웨스턴 블랏, 미립자-기반 분석(가령, Luminex^® 분석), 자석 면역 분석, 도트 블랏, 효소 면역분석(EIA), 방사능 면역 분석(RIA), 화학 발광 면역 분석(CLIA), 카운팅 면역 분석(CIA) 및 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 면역 분석은 경쟁적이거나 또는 비-경쟁적일 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "효소 연결된 면역 흡착 분석" 또는 "ELISA", 일부 경우 "샌드위치 분석"이라고도 하는 것은 특이적 유형의 면역 분석을 말한다. 대체로, 양을 모르는 항원은 고형 표면에 흡착되거나 또는 고정되고, 이를 인지하는 항체에 노출시킨다. 결합된 항체의 양은 일반적으로 형광 발생성 또는 색원성 효소에 직접적 또는 간접적 연쇄(linkage)를 통하여 측정한다. ELISA의 유형은 직접 ELISA, 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA, 경쟁적 ELISA, 그리고 역 ELISA를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "ELISA"는 효소 연결된 면역흡착 분석(또는 EIA)을 말한다. 많은 ELISA 방법들과 응용법들이 당업계에 공지되어 있으며, 많은 참고 자료에서 설명하고 있다(가령, Crowther, "효소 연결된 면역 흡착 분석(ELISA)," in Molecular Biomethods Handbook, Rapley et al. (eds.), pp. 595-617, Humana Press, Inc., Totowa, N.J. (1998); Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 11, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994)). 또한, 시판되는 많은 이용 가능한 ELISA 테스트 시스템이 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어들 "음식", "음식 재료들", "사료", "사료 생산물", "사료 재료들" 및 이와 유사한 것들은 (가령, 동물에 의해)소비되고, 규정식에 에너지 및/또는 영양분으로 기여되는 임의의 원료(들)를 말한다. 예를 들면, 완전 혼합 사료(Total Mixed Ration, TMR), 먹이(들), 펠렛(들), 농축물(들), 프레믹스(들), 공동 생산물(들), 낟알(들), 증류 낟알(들), 당밀, 화이버(들), 꼴(들), 목초(들), 건초, 인(들), 잎, 체질하지 않은 굵은 가루, 가용성(들), 그리고 보충제(들)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 음식 재료들은 이들의 물리적 형태에 의해 제한되지 않는다. 사료 및 음식 재료들은 더 작은 입자 크기로 가공될 수 있고(가령, 가늘고 길게 자르거나, 잘게 다지거나, 갈거나(ground), 제분하거나, 또는 이와 유사하게); 액체 형으로 만들거나(가령, 추출하거나, 끓이거나, 농축하거나, 시럽 또는 다른 점성 형태로 전환시키거나); 또는 더 큰 크기(가령, 꾸러미로 만들거나, 통합하거나, 압착하거나, 또는 합성 모양 가령, 펠렛, 블록, 스퀘어, 플레이크, 및 이와 유사한 것들로 모양을 만들거나)로 가공할 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, 명사로 이용되었을 때, "첨가물" 또는 "보충제물"은 추가되는 물질 또는 물건을 말하거나 또는 다른 방법으로 또 다른 물질 또는 물건에 포함된 물질을 말한다. 더욱이, 여기에서 사용된 것과 같이, 명사로 이용될 때, 단어들 첨가물 또는 보충제는 동물에 공급되기 전 동물 사료에 혼합되는 첨가물들 또는 보충제들을 언급할 때 서로 호환사용가능하다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "글루칸"은 임의의 글루코오즈를 함유하는 탄수화물 폴리머를 지칭한다. 일부 실시예들에서, 글루칸은 폴리머화 정도, 다른 폴리머들과의 공유 또는 비공유적 연합, 또는 정확한 탄수화물 조성물에 제약 없이 D-글루코오즈 폴리머이다. 글루칸 폴리머의 길이를 통하여, D-글루코오즈 단위는 α-연쇄, β-연쇄, 또는 α- 및 β-연쇄 모두에 관여할 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "탄수화물"은 일반식 Cm(H2O)n의 유기 화합물을 언급할 때 이용한다. 탄수화물은 탄소, 수소 및 산소 원자 만으로 구성되며, 이로 인하여 수소와 산소 원자들은 2:1의 원자 비율에 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "신호"는 반응, 예를 들면, 항원에 항체의 결합이 일어났음을 알리는 임의의 검출 가능한 공정을 언급할 때 일반적으로 이용된다. 방사능 활성, 형광 또는 발색 생산물들/시약들의 형태의 신호 모두 본 발명에서 이용할 있다고 본다. 본 발명의 다양한 실시예들에서, 이 신호는 정량적으로 평가되며, 선택적인 실시예들에서, 이 신호는 정성적으로 평가된다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "고형 지지대"는 항체들, 항원들, 그리고 기타 테스트 성분들과 같은 시약들이 부착되는 임의의 고형 또는 정지된 원료를 언급할 때 이용한다. 예를 들면, ELISA 방법에서, 미량적정 플레이트들의 웰들은 고형 지지대를 제공한다. 기타 고형 지지대들의 예로는 현미경 슬라이드들, 커버슬립, 비드들, 입자들, 세포 배양 플라스크들, 뿐만 아니라 많은 기타 적합한 물품들을 포함한다.

용어 "특이적 결합" 및 "특이적으로 결합"은 항체와 항원 간의 상호작용을 언급할 때 이용되는 경우, 이 항원에서 특정 구조(가령, 항원성 결정 부위 또는 에피토프)의 존재에 따라 달라지는 상호 작용을 설명한다. 환언하면, 이 항체는 일반적으로 모든 단백질에 결합하는 것이 아니라(가령, 비-특이적 결합), 이 항원에 독특한 단백질 구조를 인지하고 결합한다.

효모 세포 벽(YCW)은 두 개의 주요 폴리사카라이드 성분들: (1→2)(1→3)(1→6)-α-D-만난 및 (1→3)(1→6)-β-D-글루칸을 포함하는 복합 구조를 포함한다. 이들 폴리사카라이드는 O- 및 N-글루코시딜 결합들을 통하여 YCW 단백질들에 연결되며, 이는 최근에 공개된 문헌에서 논의된 바 있다(Lesage etal. (2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70:317-343). 이는 전문이 여기에 참고 자료로 통합된다). 산업 규모에서, YCW는 용해된 효모 유기체로부터 원심분리와 세척에 의해 대체로 분리되거나 또는 추출된다(D.A.Howes and K.E.Newman)(가령, 미국 특허 제6,045,834호, 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다). 이 단계에서, YCW는 물에 가용성이 아니다. 후속적으로 1차 YWC의 효소적 처리 및 화학적 처리로 폴리사카라이드들과 단백질들의 구조를 변형시키고, 이로 인하여, YCW의 이들 성분들은 최소한 물 및 디메틸 술폭시드 "DMSO"에 부분적으로 가용성이 된다. 이 생산물의 가용성 부분과 불용성 부분들의 조성물은 이 공정의 조건들에 따라 달라진다.

면역 분석은 이러한 복합적인 비-동질성 혼합물들의 용도를 찾는 감응성 분석 기술을 포함한다. 본 발명의 일부 방법 실시예들에서, 세포벽의 주요 구조적 성분들 모두를 서로 연결시키는 효모 (1→6)-β-D-글루칸을 함유하는 항원으로 면역화시킨 동물로부터 얻은 항체(Kollr et al.(1997) J. Biol. Chem. 272:17762-17775, 이는 전문이 여기에 참고 자료로 통합된다)는 이 폴리사카라이드를 인지함으로써, 확고하고 감응적인 면역분석의 확립한다. 본 발명의 일부 실시예들에서, 정성적 면역 분석(ELISA)은 동물 사료 시료들 안에 YCW 유도된 영양 보급물 첨가물, MYCOSORB(ALLTECH, Inc.)의 분석을 허용한다. YCW로부터 (1→6)-β-D-글루칸의 분석은 YCW의 정량분석에서 매우 특이적인데, 그 이유는 (1→6)-β-D-글루칸은 식물 탄수화물들 중에서 매우 희귀하기 때문이다. 따라서, 이 YCW 폴리사카라이드에 대항하는 항체들은 동물 사료에 존재하는 식물 폴리사카라이드들과 유의적으로 상호 작용하지 않고, 낮은 분석 배경이 된다.

추가적으로, 본 발명의 일부 실시예들은 다음에 대한 방법들을 또한 제공한다: 1) 효모 세포벽으로부터 가용성 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸의 분리 (Kwiatkowski et al.(2009) J. Instit. Brew. 115:1031, and Arvindekar et al. (2002) Yeast 19:131-139 참고. 이는 전문이 여기에 참고 자료로 통합된다), 가령, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸을 인지하는 항체들의 조제물에 대한 항원으로써 알데히드기로 전환시키기 위하여(Zekovic et al.(2006) Chem. Papers 60:243-248 참고. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다), 글루코피라노즈 고리들의 C-6 위치에서 폴리사카라이드 하이드록실기를 Pfizner-Moffat 시약으로 산화(Pfizner et al.(1963) J. Am. Chem. S. 85:3027 참고. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다); 그리고 폴리사카라이드-단백질 콘쥬게이트를 만들기 위하여 소 혈청 알부민(BSA)의 리신 잔기와 함께 그리고 환원성-아민화 반응에서 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸의 산화된 형태의 용도(Abdel-Magid et al.(1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862 참고. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다). 일부 실시예들에서, 본 발명은 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸 BSA 콘쥬게이트의 분리 및 정제 방법(가령, 이온 교환, DEAE 셀룰로오즈 및 상이한 이온 강도의 Na₂HPO₄ 완충액들을 이용)들을 제공하는데, 이 콘쥬게이트는 동물(가령, 토끼) 면역화에서 가용성 면역원으로 이용된다(Howard et al.(2001) Basic Methods in Antibody Production and Characterization, CRC Press, pp. 11-18 and 31-50 참고). 일부 실시예들에서, 본 발명은 BSA-피복된 친화력 상 수지를 준비하는 방법들(Matejtschuk(1997) Affinity Separations: a Practical Approach, Oxford University Press 참고)과 BSA-특이적 그리고 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸-특이적 항체들을 함유하는 토끼 혈청으로부터 BSA-특이적 항체들의 흡착에 이를 이용하는 방법들을 제공한다. 본 발명의 일부 실시예들에서, 폴리사카라이드들을 단백질들에 콘쥬게이트시키는 방법들은 간 및 동물 백신 생산에 용도를 찾는데, 이러한 방법들은 이 폴리사카라이드의 최초 구조를 보존하고 그리고 전형적인 콘쥬게이트 방법이 하는 것처럼 이의 환원 말단을 변형시키지 않는다(미국 특허 제6,596,861호 참고 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다).

사카로미세스 세르비시에( Saccharomyces cerevisae ) 세포벽 글루칸들

글루칸들은 사카로미세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae) 세포벽 폴리사카라이드들에서 만연하다(Kwiatkowski et al.(2009) J. Instit. Brew. 115:151-158). 효모 세포벽의 모양 및 견고성의 유지에서 (1→3)-β-D-글루칸의 역할(Klis et al.(2006) Yeast 23:185-202; Lesage et al.(2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70:317-343 참고. 각각 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)과 이 세포벽 폴리사카라이드들을 모두 서로 연결시키는 폴리사카라이드로써 (1→6)-β-D-글루칸의 역할은 입증되어 있다(Aimaniada et al.(2009) J. Biol. Chem. 284:13401-13412; Kollr et al.(1997) J. Biol. Chem. 272:17762-1777; Klis et al.(2002) FEMS Microbiology Rev. 26:239-256 참고. 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다). 호기적으로 성장한 S. cerevisiae의 세포들 안에 가용성 및 불용성 글리코겐-유사 (1→4)-α-D-글루칸의 존재는 초기 효모 문헌들에서 자주 언급되었고(Gunja-Smith et al.(1974) Bihem. Biophys. Res. Com. 56:588-592; Grba et al.(1975) Appl. Microbiol. Biotechnol. 2:29-37 참고. 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다), 그리고 두 개의 형태의 글리코겐 합성 효소가 확인되었다(Gunja-Smith et al.(1977) J. Bacteriol. 130:818-825; Rothman-Denes et al.(1970) PNAS 66:967-974 참고. 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다). 글리코겐은 S. cerevisiae에 의해 축적되는 에너지 비축 탄수화물이며, 효모 아사 상태(starvation) 동안 활용될 수 있다. 이는 α-D-글루코오즈의 폴리머로써, ~108의 분자량과 1→4 연쇄에 의해 결합된 10-14개의 α-D-글루코오즈 잔기로 된 분자 구조를 가진다(Aklujkar et al.(2008) J. Instit. Brew. 114:205-208; Boulton et al.(2001) The Bihemistry of Fermentation. In: Brewing Yeast and Fermentation, Blackwell Science, Iowa, pp. 89-92 참고. 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다).

효모 세포 벽에 (1→4)-α-D-글루칸 함량은 이 세포들의 영양 보급 상태, 단리 방법, 환경 조건, 세포들을 수확하는 환경 조건들 및 시간에 따라(Lille et al.(1980) J. Bacteriol. 143:1384-1394) 건중량의 1%와 같은 미량으로부터(Lille et al.(1980) J. Bacteriol. 143:1384-1394) 29% 정도의 많은 수준까지 다변할 수 있다(Sedmak et al., 미국 특허 출원 제2006/0263415호; 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다). 산업적으로 생산되는 양조용 효모 세포들(Sedmak et al., 미국 특허 출원 제2006/0263415호; 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)은 28.9% 건중량(d.w.) 농도의 글루칸들을 함유하였고, 여기에 (1→4)-α-D-글루칸의 12.4% d.w를 포함하였다. 이들 세포들은 알칼리 프로테아제로 처리하였고, 물-불용성 세포 벽 성분은 54.5% d.w.의 글루칸들을 함유하였으며, 중량의 절반 이상은 (1→4)-α-D-글루칸(29.2% d.w.)이다.

2002년, Arvindekar and Patil(Arvindekar et al.(2002) Yeast 19: 131-139. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)은 (1→4)-α-D-글루칸은 (1→6)-β-D-글루칸에 공유적으로 결합된다는 발견에 근거하여 효모 세포 벽 내부에 씻어 내기 어려운(다른 이들에 의해 정의된)(Fleet et al.(1976) J. Gen. Microbiol. 94: 180-192 참고. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다) 효모 글리코겐의 존재에 대한 설명을 제시하였다. 그러나, 이 사실은 효모 세포 벽 안에 (1→6)-β-D-글루칸의 역할 및 구조에 관한 Kollar 및 공동 작업자들(Kollr et al.(1997) J. Biol. Chem. 272: 17762-17775. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에 의해 공개된 1997년 논문과 Aimaniada 및 공동-작업자들(Aimaniada et al.(2009) J. Biol. Chem. 184:13401-13412. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에 의해 공개된 내용과 불일치한다. 특히, Arvindekar and Patil의 결론은 구조적 증명을 요구하였는데, 그 이유는 이들 저자들은 효모 세포벽의 효소적 가수분해로부터 미세한 분획물로 작업하였고, 그리고 분리된 생산물들에 대한 정량 분석 또는 구조적 지정을 위하여 NMR을 이용하지 않았기 때문이다. 본 발명의 실시예들을 만드는 과정 동안 실행된 실험들에서, S. cerevisiae 세포벽으로부터 혼합형 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸 폴리사카라이드의 분리를 위한 대규모 분리 방법들이 개발되었고, 그리고 NMR 분광학을 이용하여 이 생산물의 구조를 확립하였다.

동물 음식 및 사료

동물 사료는 길들인 가축(가령, 소, 염소, 양, 말, 가금류, 버팔로, 알파카, 라마, 당나귀, 노새, 토끼, 닭, 거위, 칠면조 그리고 돼지)에게 공급하기 위하여 특별히 이용된 임의의 식료품이다. 동물 사료들은 건초, 짚, 저장 목초, 압착된 그리고 펠렛화된 사료, 오일 및 혼합된 양식, 그리고 또한 싹이 튼 낟알 및 콩 꼬투리를 종종 포함한다. 전세계 동물 사료 산업에서 2006년에 6억 3천 5백만 톤이 소비되었고, 매년 약 2%의 속도로 성장한다. 인간의 음식보다 사료를 키우기 위하여 농지를 이용하는 것은 논쟁의 여지가 있을 수 있고 일부 유형의 사료들, 가령, 콘(옥수수)은 인간의 음식으로 또한 사용할 수 있지만, 목초와 같은 다른 것들은 그럴 수 없다. 동물들에게 에너지원으로 제공되는 것에 추가하여, 동물 사료들은 신체에서 이용되는 영양소(가령 셀렌)를 제공할 수 있다. 동물 사료들은 동물들에게 공급되기 전, 보충제들 및/또는 첨가물들(가령, MYCOSORB)과 흔히 혼합된다.

면역 탐지 방법들

본 발명은 시료들 안에 물질들을 탐지하는 방법들을 제공하는데, 이러한 방법들은 면역 탐지 분석 또는 면역 분석을 포함한다. 면역 분석(면역 탐지 분석, 면역 탐지 방법)은 이 항체가 결합하는 물질(가령, 항원)의 탐지(가시화, 정량적 확인, 정성적 탐지)를 위한 항체의 이용이 관련된다. 항체에 의해 인지되는 항원은 거대 분자 또는 이의 단편(가령, 폴리머, 탄수화물, 당단백질, 단백질, 이의 모이어티 또는 단량체)일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 일부 방법들은 효모 세포벽 글루칸들(가령, (1→4)-α-D-글루칸, (1→6)-β-D-글루칸 및/또는 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸)의 탐지에서 용도를 찾는다.

다수의 면역 분석은 물질(가령, 저농도에서 발견되는 물질들, 복합 혼합물들, 탄수화물 물질, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸)에 존재하는 물질들)의 정량적 또는 정성적 탐지에서 용도를 찾는다. 면역 분석의 유형은 효소 연결된 면역 흡착 분석(ELISA), 측면 유동 테스트, 웨스턴 블랏, 미립자-기반 분석(가령, Luminex^® 분석), 자석 면역 분석, 도트 블랏, 효소 면역 분석(EIA), 방사능 면역 분석(RIA), 화학 발광 면역 분석(CLIA), 카운팅 면역 분석(CIA) 및 이와 유사한 것들(가령, Wild et al.(2005) The Immunoassay Handbook, 3rd Ed., Elsevier Ltd., Oxford, UK)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 면역 분석은 경쟁적 또는 비경쟁적일 수 있다.

효소 연결된 면역 흡착 분석(ELISA)

효소 연결된 면역 흡착 분석, ELISA는 의학 및 식물 병리학에서 진단 도구로 이용되었으며, 뿐만 아니라 다양한 산업 분야에서 품질 관리 점검에 이용되어 왔었다. 전형적인 ELISA의 한 예에서, 폴리스티렌 마이크로플레이트 또는 기타 표면에 1차 고정된 프로브 분자를 포함한다. 그 다음, BSA와 같은 차단제를 제공하고, 항온 처리한다. 미지의 농도의 특이적 표적 분자(흔히, 단백질)를 함유하는 생물학적 또는 기타 시료는 고정된 프로브 분자와 접촉되도록 만든다. 표적 분자가 존재한다면, 이 표적 분자는 표적 분자의 농도에 비례하여 프로브에 의해 포획된다. 그 다음, 이 표면은 특이적으로 결합되지 않은 임의의 분자들을 제거하기 위하여 약한 세제 용액으로 일반적으로 세척한다. 그 다음, 추가 분자, 가령, 제2 항체를 제공하여 포획 프로브, 표적 분자, 그리고 라벨된 검출자 프로브와 함께 "샌드위치" 복합체를 형성한다. 이 제2 분자를 검출자 프로브 또는 검출자 항체라고 흔히 부르는데, 효소, 합텐, 또는 기타 라벨링 라벨링 분자에 공통적으로 공유 연결된다.

최종 세척 단계 후, 라벨된 검출자 항체에 결합하고, 그리고 효소적 기질, 형광으로 라벨된 탐지 시약, 또는 다양한 기타 리포터들을 함유하는 콘쥬게이트를 추가함으로써 이 플레이트를 발달시킨다. 이 리포터는 이 시료 안에 있는 표적 항원의 양에 비례하는 탐지 가능한 신호를 만든다. 대체로, ELISAs는 발색 또는 형광 플레이트 판독기를 이용하여 판독되며, 그리고 웰당 단일 표적 분석물 측정으로 나타난다. ELISA 분석의 기타 변이체들은 간접, 경쟁적, 또는 역 ELISA을 포함하나 이에 한정되지 않는다(가령, Crowther et al.(2008) "The ELISA Guidebook", 2nd Ed., Humana Press).

많은 경우들에서, ELISAs는 자동화된 기구를 통하여 프로세싱할 수 있는 표준화된 포맷에 적합하도록 만들어진 마이크로플레이트에서 실행한다. 이들 표준들은 Siety of Biomolecular Sciences(SBS)에 의해 확립되었고, 그리고 SBS 표준으로 알려져 있다. SBS 표준들에 따르면, 다중웰 플레이트의 "풋프린트(footprint)"는 전체 웰의 수에 따라 지정 위치 포맷에 있는 웰에서 대략적으로 85㎜×125㎜이다. American National Standards Institute(ANSI)는 마이크로플레이트용 SBS 표준들을 발표하였다: Footprint Dimensions(ANSI/SBS 1-2004), Height Dimensions(ANSI/SBS 2-2004), Bottom Outside Flange Dimensions(ANSI/SBS 3-2004) 및 Well Positions (ANSI/SBS 4-2004). 가장 흔하게, ELISA 사용자들은 단일 플레이트 내에 96-웰을 이용한다. 대안으로, 96-웰 미만이 분석에 표구될 경우, 한 번에 96-웰의 일부만 이용되도록 최대 8-웰 "스트립"을 이용하여 할 수 있다.

테스트 서비스

일부 실시예들에서, 컴퓨터-기반 분석 프로그램을 이용하여, 분석(가령, 면역 분석, ELISA)(가령, 항원의 존재, 부재 또는 이의 양)(가령, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸)에 의해 생성된 원시 데이터를 최종 소비자(가령, 가축 또는 반려 동물 종축자 또는 취급자, 수의사, 농부, 소비자)를 위한 예측 값의 데이터로 옮긴다. 이 최종 소비자는 임의의 적합한 수단들을 이용하여 예측 값에 접근할 수 있다. 따라서, 일부 실시예들에서, 본 발명은 면역 분석 분석에 대해 훈련을 받을 것 같지 않은 최종 소비자가 원시 데이터를 이해할 필요가 없도록 추가 잇점을 제공한다. 이 데이터들은 가장 유용한 영태로 최종 소비자에게 직접 제공된다. 그 다음 이 최종 소비자는 피험자(가령, 가축 또는 반려 동물)의 관리를 최적화하도록 하기 위하여 즉시 이 정보를 이용할 수 있다.

본 발명은 이러한 분석을 실행하는 실험실로부터 또는 실험실로 시료에 관련된 정보를 수용하고, 프로세싱하고, 전송할 수 있는 임의의 방법을 고려한다. 예를 들면, 본 발명의 일부 실시예들에서, 시료(가령, 사료 시료, 사료 시료의 추출물)는 세계의 임의의 위치(가령, 피험자가 거주하는 또는 이러한 정보가 궁극적으로 이용되는 지역에 적합한 영역 또는 이러한 지역과는 상이한 영역)에 있는 프로파일링 서비스(가령, 실험실 등)로부터 수득하고, 그리고 이러한 서비스에 전달되어, 원시 데이터를 생성한다. 최종 소비자는 제3 자로부터 수득한 시료(가령, 사료 추출물)를 프로파일링 센터로 보낼 수 있고, 또는 피험자들이 시료 자체를 채집하고, 이를 프로파일링 센터로 직접 보낼 수 있다. 이 시료가 기존의 확인된 정보를 포함하는 경우, 이 정보는 최종 소비자에 의해 프로파일링 서비스로 바로 보내질 수 있다(가령, 정보를 담고 있는 정보 카드를 컴퓨터로 스캔하고, 그리고 이 데이터는 전자 통신 시스템을 이용하여 프로파일링 센터의 컴퓨터로 전송된다). 프로파일링 서비스가 일단 정보를 수용한 후, 이 시료는 가공되고, 그리고 최종 소비자에게 바람직한 진단 또는 예후 정보에 특이적인 프로파일(가령, 항원 함량)이 만들어진다.

그 다음 프로파일 데이터는 최종 소비자가 이해하는데 적합한 포맷으로 준비된다. 예를 들면, 원시 데이터로 제공되기 보다는, 준비된 포맷은 특정 가축 관리 선택사항에 대한 추천과 함께 최종 소비자를 위한 위험 평가(가령, 항원 존재 가능성)을 제시할 수 있다. 이 데이터는 임의의 적합한 방법에 의해 최종 소비자들에게 표현될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시예들에서, 이 프로파일링 서비스는 최종 소비자를 위하여 인쇄될 수 있는 리포터(가령, 접촉 시점, 가축 관리 시점에서) 또는 컴퓨터 모니터 상에서 최종 소비자에게 나타낼 수 있는 리포터를 만든다.

일부 실시예들에서, 가축 관리 시점에서 또는 지역 설비에서 이 정보를 우선 분석한다. 그 다음 원시 데이터는 추가 분석을 위하여 및/또는 원시 데이터를 최종 소비자 또는 다른 관심 집단에 유용한 정보로 전환하기 위하여 중앙 처리 설비로 보내진다. 중앙 프로세싱 설비는 데이터 분석의 비밀(모든 데이터는 일정한 안전 프로토콜을 가진 중앙 설비에 보관되며), 속도 및 균일성의 장점을 제공한다. 그 다음 중앙 프로세싱 설비는 최종 소비자에게 통지 후 데이터의 운명을 관리할 수 있다. 예를 들면, 전자 통신 시스템을 이용하여, 중앙 설비는 최종 소비자에게 데이터를 제공할 수 있다.

일부 실시예들에서, 최종 소비자는 전자 통신 시스템을 이용하여 이 데이터에 직접적으로 접근할 수 있다. 최종 소비자는 결과에 근거하여 추가 정보를 찾을 수 있다. 일부 실시예들에서, 이 데이터를 연구 용도로 이용한다. 예를 들면, 이 데이터를 이용하여 가축 또는 반려 동물들을 위한 영양 보급물 체제를 더 최적화시킬 수 있다.

조성물들 및 키트들

본 발명의 일부 실시예들의 방법에 사용하기 위한(가령, 이들 방법에 충분한, 필수적인 또는 유용한) 조성물들은 특이적 항원들(가령, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸)의 존재 또는 부재를 탐지하는 시약들을 포함한다. 이들 임의의 조성물들 단독 또는 본 발명의 기타 조성물들과 조합하여 키트 형태에 제공될 수 있다. 키트들은 적절한 대조군 및/또는 탐지시약들을 추가로 포함할 수 있다.

항원-운반체 콘쥬게이션

일부 실시예들에서, 본 발명은 효모 세포 벽 물질들의 분석(가령, 면역학적 분석 항체 조제물용)에 용도를 찾아낸 조성물들(가령, 항원들)을 제공한다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 효모 세포벽으로부터 효모 (1→6)-β-D-글루칸에 대한 항원으로써, 가용성 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸의 분리하는 방법(Kwiatkowski et al.(2009) J. Instit. Brew. 115:1031; Arvindekar et al.(2002) Yeast 19:131-139. 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다); 알데히드기로 전환시키기 위하여(Zekovic et al .(2006) Chem . Papers 60:243-248 참고. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다), 글루코피라노즈 고리들의 C-6 위치에서 폴리사카라이드 하이드록실기를 Pfizner-Moffat 시약으로 산화시키는 방법(Pfizner et al.(1963) J. Am. Chem. S. 85:3027 참고. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다); 그리고 폴리사카라이드-단백질 콘쥬게이트를 만들기 위하여 운반체(가령, 운반체 단백질, 예를 들면, BSA)의 리신 잔기와 함께 환원성-아민화 반응에서 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸의 산화된 형태의 이용 방법(Abdel-Magid et al.(1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862 참고. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)을 제공한다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 순수 항원(가령, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸-BSA 콘쥬게이트)의 분리에서 분리 기술(가령, 이온 교환, DEAE 셀룰로오즈 및 상이한 이온 강도의 Na₂HPO₄ 완충액들)의 적용에 관계하는데, 이 항원은 동물(가령, 토끼)의 면역화를 위한 가용성 면역원으로 이용한다(Howard et al.(2001) Basic Methods in Antibody Production and Characterization, CRC Press, pp. 11-18 and 31-50). 일부 실시예들에서, 본 발명은 BSA 피복된 친화력 상의 준비물(Matejtschuk(1997) Affinity Separations: A Practical Approach, Oxford University Press)과 운반체(가령, BSA) 및 항원(가령, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸)에 대한 항체 모두를 함유하고, 따라서 생성된 항체 준비물의 특이성을 돕는, 항혈청(가령, 토끼 혈청)으로부터 운반체-특이적(가령, BSA-특이적) 항체들의 흡착에 이의 이용하는 것에 또한 관한 것이다. 본 발명의 일부 실시예들에서, 폴리사카라이드들을 운반체들(가령, 단백질 운반체들, 가령, BSA)에 콘쥬게이션시키는 방법들은 인간 및 동물 백신의 생산에 용도를 찾고, 이러한 방법들은 전형적인 콘쥬게이션 방법들이 하는 것과 같은 폴리사카라이드의 구조의 환원 및 변형을 야기하기 보다는 폴리사카라이드 구조를 보존한다(Moreau et al., 미국 특허 제6,596,861호; 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다).

폴리- 또는 올리고사카라이드의 약한 항원성은 항원들로 이들을 사용하기 전 변형을 흔히 요구한다. 본 발명의 일부 실시예들에서, 합성 방법들은 폴리사카라이드 항원들 ((1→6)-β-D-글루칸을 함유하는)이 면역화에 이용되는 종 이외의 상이한 동물 종으로부터 기원된 또는 유도된 운반체(가령, 단백질 운반체, 가령, BSA)에 콘쥬게이트되도록 개발되어 왔었다(Howard et al.(2001) Basic Methods in Antibody Production and Characterization, CRC Press, pp. 11-18 and 31-50; Matejtschuk(1997) Affinity Separations: A Practical Approach, Oxford University Press). 본 발명은 이용되는 운반체의 성질 또는 유형에 제한되지 않지만, BSA는 상업적으로 이용가능하며, 5개의 리신 잔기가 존재하고, 이들 각각은 다양한 화학적 방법들에 의해 폴리- 또는 올리고사카라이드에 콘쥬게이트할 수 있는 단일 아미노기를 가지고 있기 때문에 유리하다(Abdel-Magid et al.(1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862; Lees et al.(1996) Vaccine 14:190-198; Pawlowski et al. (1999) Vaccine 17:1474-1483. 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다). 일부 바람직한 실시예들에서, 이 항원의 탄수화물 모이어티와 콘쥬게이션에 이용된 운반체는 물에 가용성이다. 일부 실시예들에서, 이 항원의 탄수화물 모이어티(가령, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸 폴리사카라이드)의 말단 알데히드기의 환원은 운반체(가령, BSA)에 직접 콘쥬게이트시키는데 이용되지 않는데, 그 이유는 이렇게 하기 위해서는 폴리사카라이드 항원의 구조 및 결합 능력이 실질적으로 변화되어야 하기 때문이다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 C3 이외의 위치에서 산화를 위한 무수 아세트산/디메틸술폭시드(Ac2O/DMSO) 시스템의 응용을 통하여 탄수화물 모이어티의 구조의 최대 보존을 허용한다(Zekovic et al.(2006) Chem. Papers 60:243-248. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다).

일부 실시예들에서, 본 발명은 항체들 (가령, 다클론 항체들)의 생산에 이용되는 항원 (가령, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸-BSA(소 혈청 알부민)) 콘쥬게이트 합성에서 사카로미세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae) 세포벽)으로부터 효모 세포 벽 성분들(가령, 가용성 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸을 이용하는 방법들을 제공한다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸을 포함하는 면역 조성물 및/또는 동일한 것을 포함하는 콘쥬게이트(가령, 단백질 또는 슈가 콘쥬게이트)를 제공한다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 항체 조성물들은 관심 시료들(가령, 동물 사료 시료들 또는 이의 유도체들, 분획물, 또는 추출물들) 안에 효모 세포 벽 생산물들을 탐지하는데 용도를 찾는다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 조성물들은 글루칸-풍부한 원료 또는 글루칸-풍부한 생산물(GEM, ALLTECH, Inc., Nicholasville, KY, USA)로부터, 가령, 산 추출(Kwiatkowski et al.(2009) J. Instit. Brew. 115:1031. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에 의해 추출된다. 일부 실시예들에서, 디메틸술폭시드(DMSO)/무수 아세트산 (Ac2O) 혼합물(Pfizner et al.(1963) J. Am. Chem. S. 85:3027. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)을 이용하여 글루코피라노즈 고리들의 C-6 위치에서 폴리사카라이드(가령, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸)의 약한 산화는 C-6 하이드록시메틸렌(-CH₂OH)기들을 알데히드기(-CH=O) 기들로 전환시키고(Zekovic et al.(20060 Chem. Papers 60:243-248. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다), 그리고 운반체(가령, BSA)와 함께 환원성 아민화로 진입할 수 있는 항원(가령, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸의 산성화된 형을 만든다(Moreau et al., 미국 특허 제6,596,861호; Abdel-Magid et al.(1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다).

본 발명의 콘쥬게이션 방법들, 가령, C6-OH에서 폴리사카라이드 활성화를 포함하는 방법들은 폴리사카라이드 모이어티의 최초 구조를 온전하게 보전하며, 그리고 따라서 항원 준비물에 유익하다. 과요오드산염 산화(Hay et al.(1973) Methods Carb. Chem. 5:357-370. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다) 또는CDAP 활성화(Lees et al.(1996) Vaccine 14:190-198)를 포함하나 이에 한정되지 않는, 폴리- 또는 올리고사카라이드 활성화의 대안 방법들은 실질적으로 변형된 폴리사카라이드들을 만드는데, 이는 항원들로서의 이들의 유용성을 손상시킨다.

항체들

본 발명의 또 다른 측면은 효모 세포 벽 성분들 (가령, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸)을 탐지하기 위한 분석용으로 면역 글로블린을 준비하는 방법인데, 이 방법은 피험자를 효모 세포벽 성분(가령, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸-BSA, 또는 기타 단편들, 변이체들, 또는 이의 콘쥬게이트들)으로 면역화시키는 단계와 수취인으로부터 면역 글로블린을 단리시키는 단계를 포함한다. 이 방법에 의해 준비된 면역 글로블린은 본 발명의 추가 측면이다.

다클론 항체 생산을 위한 접종물은 수성 조성물을 만들기 위하여 염수 또는 기타 어쥬번트들과 같은 생리학적으로 용인되는 희석제 안에 항원성 조성물을 분산시켜 대체로 준비한다. 접종물의 면역촉진 양을 피험자에게 투여하고, 그리고 접종을 맞은 피험자는 보호성 항체들을 유도하기 위하여 항원 조성물에 대해 충분한 시간 동안 유지시킨다.

친화력 크로마토그래피와 같은 잘 알려진 기술을 이용하여 원하는 수준으로 항체들을 단리할 수 있다(가령, Harlow and Lane, Antibodies; a Laboratory Manual(1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press).

항체들은 다양한 흔히 이용되는 동물들(가령 염소, 영장류, 토끼, 당나귀, 돼지, 말, 기니아 피그, 쥐 또는 사람)로부터의 항혈청 준비물을 포함한다. 동물들에서 채혈하고, 혈청을 회수한다.

본 발명에 따라 만들어진 면역 글로블린은 전체 항체들, 항체 단편들 또는 하위 단편들을 포함할 수 있다. 항체들은 가령 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 임의 분류의 전체 면역 글로블린, 키메라 항체들 또는 본 발명의 두 개의 또는 그 초과 항원들에 대한 이중 특이성을 가진 하이브리드 항체들일 수 있다. 항체들은 또한 단편들 가령 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 및 하이브리드 단편들을 포함하는 이와 유사한 것들일 수도 있다.

대안으로, 단일 쇄 항체들을 생산하는데 설명되는 기술들은 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단일 쇄 항체들을 만들기 위하여 당업계 공지된 방법들을 이용하여 개조될 수 있다. 관련된 특이성을 가진, 그러나 별개의 이디오타입(idiotypic) 조성물을 가진 항체들은 무작위의 복합 면역글로빈 라이브러리로부터 쇄 셔플링(chain shuffling)(가령, Burton, Pr. Natl. Acad. Sci. 88, 11120 23, 1991)으로 만들어질 수 있다.

단일-쇄 항체들은 주형으로 하이브리도마 cDNA를 이용하여 PCR과 같은 DNA 증폭 방법에 의해 작제될 수도 있다(가령, Thirion et al., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11). 단일-쇄 항체들은 단일 또는 이중 특이적이며, 그리고 2가 또는 4가일 수 있다. 4가, 이중특이적 단일-쇄 항체들의 작제는 예를 들면, Coloma & Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159-63에서 교시된다. 2가, 이중 특이적 단일-쇄 항체들의 작제는 예를 들면, Mallender & Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199-206에서 교시된다.

단일-쇄 항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 하기에서 설명된 것과 같이, 수작업 또는 자동화된 뉴클레오티드 합성을 이용하여 작제할 수 있고, 표준 재조합 DNA 방법들을 이용하여 발현 구조물 안으로 클론시키고, 그리고 코딩 서열을 발현시키기 위하여 세포 안으로 도입시킬 수 있다. 대안으로, 예를 들면, 필라멘트성 파아지 기술을 이용하여 단일-쇄 항체들을 직접적으로 만들 수 있다(가령, Verhaar et al., 1995, Int. J. Cancer 61, 497-501; Nicholls et al., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91).

특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체들은 림프세포 집단 안에서 생체내 생산을 유도하거나 또는 문헌(가령, Orlandi et al., Pr. Natl. Acad. Sci. 86, 3833 3837, 1989; Winter et al., Nature 349, 293 299, 1991)에서 공개된 것과 같이 면역 글로블린 라이브러리 또는 매우 특이적 결합 시약들의 패널을 스크리닝함으로써 또한 만들 수 있다.

키메라 항체들은 WO 93/03151에서 공개한 것과 같이 작제할 수 있다. 면역 글로블린으로부터 유도된 그리고 WO 94/13804에서 설명된 디아바디와 같은 다가 및 다중특이적인 결합 단백질들을 또한 준비할 수 있다. 항체들은 당업계에 공지되어 있는 방법들에 의해 정제될 수 있다. 예를 들면, 항체들은 관련 항원이 결합된 컬럼을 통과함으로써 친화력 정제될 수 있다. 그 다음 이 결합된 항체들은 고농도 염을 가진 완충액을 이용하여 컬럼으로부터 용리시킬 수 있다.

본 발명의 면역 조성물은 피험자에게 투여되고, 그 다음 이 특이적 면역 조성물로부터 공격에 반응하여 생산된 면역 글로블린의 원천으로 작용한다. 따라서, 처리를 받은 피험자는 혈장을 공여할 것이고, 이로부터 전통적인 혈장 분획 방법을 통하여 고면역 글로블린을 수득할 것이다.

본 발명의 조성물들은 임의의 부류(가령, IgG, IgM, IgA, IgD 또는IgE, 키메라 항체들)의 전체 면역 글로블린 또는 본 발명의 두 개의 또는 그 초과 항원들에 대한 특이성을 가진 하이브리드일 수 있는 항체들(가령, 단클론 및/또는 다클론 항체들)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 항체들은 단편들 가령 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 및 하이브리드 단편들을 포함하는 이와 유사한 것들일 수도 있다.

단클론 항체들을 만드는 방법들은 당업계에 공지되어 있으며, 그리고 비장세포들과 골수종 세포들의 융합을 포함할 수 있다(가령, Kohler and Milstein 1975 Nature 256; 495; Harlow and Lane, Antibodies; a Laboratory Manual(1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press). 대안으로, 단클론 Fv 단편들은 적합한 파아지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다(가령, Vaughan TJ et al 1998 Nature Biotechnology 16; 535). 단클론 항체들은 공지의 방법들에 의해 인화되거나 또는 부분 인화될 수 있다.

본 발명의 일부 실시예들에서, 항체들 조성물들은 효모 세포 벽 항원들 (가령, 효모 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, 이의 단편들, 이의 변이체들, 또는 이의 콘쥬게이트들을 인지할 수 있는 단클론 또는 다클론 항체들)을 인지할 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 항체 조성물들은 효모 세포벽 (1→4)-α-D-글루칸에 결합하지만, 효모 세포 벽 (1→4)-α-D-글루칸-함유하는 폴리머들(가령, 효모 세포 벽 (1→4)-α-D-글루칸, 효모 세포벽 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, 이의 단편들, 이의 변이체들, 또는 이의 콘쥬게이트들) 이외의 물질들에 존재하는 (1→4)-α-D-글루칸-함유하는 모이어티들에는 결합하지 않는다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 항체 조성물들은 효모 세포벽 (1→6)-β-D-글루칸에 결합하지만, 효모 세포벽 (1→6)-β-D-글루칸-함유하는 폴리머들(가령, 효모 세포벽 (1→6)-β-D-글루칸, 효모 세포벽 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, 이의 단편들, 이의 변이체들, 또는 이의 콘쥬게이트들)이외의 물질들에 존재하는 (1→6)-β-D-글루칸-함유하는 모이어티들에는 결합하지 않는다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 항체 조성물들은 효모 세포벽 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸에 결합하지만, 효모 세포벽(가령, 효모 세포벽 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸, 이의 단편들, 이의 변이체들, 또는 이의 콘쥬게이트들)이외의 물질들에 존재하는 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸-함유하는 모이어티들에는 결합하지 않는다.

실시예들

다음의 실시예들은 본 발명의 특정 바람직한 실시예들과 본 발명의 측면들을 설명하기 위하여 제공되며, 그리고 이의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 아니 된다.

실시예 1

식품 등급의 사카로미세스 세르비시에( Saccharomyces cerevisiae ) 효모 세포벽 -글루칸으로부터 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸의 추출

효모 세포 벽 글루칸 조제물

효소적/알칼리/열 처리에 의해 S. cerevisiae로부터 만든 산업 등급의 효모 (1→6)-β-D-글루칸(ALL-BGY, ALLTECH, Inc., Nicholasville, KY, USA)은 임의의 가용성 잔유물을 제거하기 위하여 탈이온화된 물로 4회 세척하였다. 냉동-건조 후, 글루칸 풍부한 원료 (GEM)를 얻었다.

효모 세포 벽 글루칸의 산성 분해(digestion)

도 1은 다양한 분획물의 조제를 설명한다. 효모 세포벽 글루칸의 산성 분해(digestion)는 Kwiatkowski et al.(2009) J. Instit. Brew. 115:151-158에서 설명된 것과 같이 실행하였다. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. "글루칸 풍부한 원료"(GEM)(70g)는 700mL의 100mM HCl(pH 2.2)로 80℃에서 6시간 동안 가수 분해시켰다. 이 후, 이 혼합물은 13,500×g/10℃/10 간 원심 분리하였고, 상청액을 채집하였다. 펠렛은 150mL의 탈이온화된 물로 추출하였고, 동결 건조시켜, 57.9g의 백색 무정형 생산물(P1)을 얻었다.

2회 세척물은 최초 상청액과 복합하였고, 그리고 2N NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 중화시켰다. 원심 분리(동결 건조 후 1.82g)로부터 형성된 침전물을 채집하였고(펠렛 P1/7), 그리고 상청액은 37℃ 이하에서 Buchi 진공 회전 증발기를 이용하여 450mL의 용적으로 농축시켰다. 이 용액은 5kDa Amicon^® 15 한외-여과 원심분리 장치(Millipore Corporation, Delaware USA)를 이용하여 더 농축시켰다. 산 가수 분해로 초래된 염 및 저분자량 성분을 제거하기 위하여, 이 농축물(~150mL)은 동일한 한외-여과 장치를 이용하여 두 개의 동일 용적의 탈이온화된 물과 함께 2회의 원심 분리에 의해 세척시켰다. 세척된 농축물(S1)을 동결건조시켜, 7.5g의 백색 무정형 생산물을 얻었다. 이 펠렛 P1의 일부는 0.1N HCl 제1 추출에서 동일한 시약 비율 및 조건들을 이용하여 제2 추출을 거치게 하였다. 이들 생산물들을 동결 건조시켜, P2 및 S2를 얻었다. 0.1N HCl을 이용한 제2 추출은 침전물을 만들지 않았고, 그 다음 상청액은 중화시켰다. 이 펠렛 P2의 일부는 0.1N HCl 제1 추출에서 동일한 시약 비율 및 조건들을 이용하여 제3 추출을 거치게 하였고, 이들 생산물들을 동결 건조시켜, P3 및 S3을 얻었다. 0.1N HCl을 이용한 제3 추출은 침전물을 만들지 않았고, 그 다음 상청액은 중화시켰다. 0.1N HCl 추출로부터 가용성 및 비-가용성 분획물의 탄수화물 조성물 및 폴리사카라이드 구조는 1H NMR 분광학을 이용하여 확립하였다. 이 시료들 안에서 만노즈 및 글루코오즈의 함량은 H₂SO₄-HPLC 조성물 분석 (Dallies et al.(1998) Yeast 14:1297-1306. 이는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)을 이용하여 분석하였다. 단백질 함량의 예측량은 LECO 연소 분석을 이용하고, 그리고 질소 함량에 인자 6.25를 곱하여 계산하였다.

실시예 2

항원 조제물

(1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸 조제물의 Ac2O/DMSO 산화

580mg의 가용성 글루칸을 자석 교반 막대가 구비된 22ml 유리 바이알 안에 두고, 고무 중격으로 막아두었다. 이 바이알 안에 10ml의 무수 DMSO 및 110㎕의 무수 아세트산을 유리 주사기를 이용하여 실온에서 교반시키면서 추가하였다. 이 글루칸 현탁액은 20℃에서 교반하면서 4시간 안에 완전하게 용해되었다. 이 혼합물의 교반은 24시간 지속하였고, 그 다음 반응 혼합물은 40ml의 물로 희석하였다. 생성된 맑은 용액은 30kDa Amicon^®15 한외-여과 원심 분리 장치로 농축시켰고, 그리고 필터 상에 잔유물은 탈이온화된 물, 매회 12ml을 이용하여 5회 세척하여, 용매 및 반응물로부터 산화 생성물을 분리시키고, 정화시켰다. 모든 원심 분리는 4,750×g/30분/10℃에서 실시하였다. 필터상의 최종 잔유물을 채집하였고, 동결 건조시켜 백색 분말 형태의, 502㎎의 산화된 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸을 얻었다. 이 생산물은 물에 부분적으로 가용성이며, 그리고 DMSO에는 완전한 가용성이었다.

원소 분석

산화된 글루칸에 대한 실험치: C-40.05%; H-6.61%. C6H8O5×H2O에 대한 계산치: C-40.48%; H-5.66%

산화된 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸을 BSA으로 환원성 아민화 반응

412mg의 산화된 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸의 시료를 20ml의 탈이온화된 물에 용해시켰고, 그리고 자석 교반 하에 2ml의 탈이온화된 물에 256㎎의 BSA 용액과 복합시켰다. 그 다음 이 혼합물은 60㎎의 고체 시아노붕화수소 나트륨으로 처리하였다. 반응 바이알은 고무 격막으로 막고, 그리고 이 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반시켰다. 이 후, 100㎎의 붕화수소 나트륨을 추가하였고, 이 혼합물은 추가 22시간 동안 교반시켰다. 그 다음 맑은 용액은 30kDa Amicon^®15 한외-여과 원심분리 장치를 통하여 4,750×g/30min/10℃에서 여과시켰다. 잔유물은 필터 상에서 매회 12ml의 물로 4회 세척하였고, 최종 농축물은 동결 건조시켜, 573㎎의 백색 분말을 얻었다.

원소 분석

C 45.01%, H 6.40%, N 2.11%.

(1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸-BSA 콘쥬게이트의 DEAE 셀룰로오즈 이온 교환 크로마토그래피 분리

5ml의 5mM Na2HPO4 내 400㎎의 미정제 콘쥬게이트 용액은 50g의 DEAE 셀룰로오즈/5mM Na2HPO4을 함유하는 2×55㎝ 유리 크로마토그래피 컬럼의 상단에 도입시켰다. 다음의 용리에 다양한 농도의 Na2HPO4를 이용하였다: 40.1㎎의 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸(220ml, 5 mM); 132.3㎎의 순수 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸-BSA 콘쥬게이트(280ml, 55 mM); 그리고 96.7㎎의 BSA(80ml, 100 mM). 순수 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸-BSA 콘쥬게이트 용액은 30kDa Amicon^®15 한외-여과 원심분리 장치를 이용하여 2ml 용적으로 농축시켰고, 탈이온화된 물로 세척하였고, 동결 건조시켜, 132.3㎎(총 수율은 24.4%)의 백색 분말-유사 생산물을 얻었다. 겔 전기영동으로 넓은 밴드가 만들어졌으며, 이는 Comassie Blue 및 PAS 착색을 이용하여 드러나고, 중앙은 ~170kDa이다. 전기영동에서 자유 BSA 또는 임의의 다른 불순물은 탐지되지 않았다.

원소 분석

C 40.11%, H 6.23%, N 3.06%, (BSA의 20.44w%). β-글루칸: BSA의 계산비율은 4:1이다.

실시예 3

다클론 항체 조제물 및 정제

항원 조제물 및 토끼 면역화

실시예 2에서 설명된 것과 같이 준비된 10㎎의 BSA-콘쥬게이트된 항원을 동결 건조시키고, 4℃에 보관하고, 그리고 3마리의 토끼를 면역화시키는데 이용하였다(면역화 당 200㎍ 항원). 면역화 프로토콜은 표 1에 열거된 것과 같다.

[표 1]

토끼에서 항-(1→4)-α-/(1→6)-β-D- 글루칸 - BSA 다클론 항체들을 만들기 위한 면역화 프로토콜

다클론 항체의 친화력 단계 정제

1g의 에폭시-활성화된-아가로즈(Sigma E 6632)를 2.68g의 BSA(SIGMA A2153)/27ml의 10mM Na2HPO4 용액에서 현탁시키고, 이 혼합물은 4℃의 얼음-물 조 안에서 4시간 동안 교반시켰다. 이 시간 이후, 이 혼합물은 2500×g/5min/10℃에서 원심 분리시키고, 그리고 이 펠렛은 세척하였고, 매회30ml의 100mM Na2HPO4/0.05 w% NaN3로 4회 이상 원심 분리시켰다.

BSA 피복된 친화력 단계(상기에서 설명된)의 최종 원심 분리로부터 얻은 펠렛은 750㎕의 혈청(가용성 글루칸-BSA 콘쥬게이트로 면역화시킨 토끼로부터 채집한)/20ml의 10mM Na2HPO4/0.05w%NaN3 용액에 현탁시키고, 그리고 실온에서 2시간 동안 뒹굴리고, 그 다음 1500×g/5min/10℃에서 원심 분리시켰다. 이 상청액을 채집하고, 펠렛은 20ml의 동일한 완충액으로 3회 더 세척하여, 상청액을 세 개 더 채집하였다. 상청액들은 도 2에 나타낸 것과 같이, BSA 및 "가용성" 글루칸에 대한 특이성에 대하여 검사하였다. 제1 및 제2 상청액-상당량의 항체들을 함유하는-을 함께 모으고, 10kDa Amicon^® Ultra-15 Centrifugal Filter Device를 이용하여 5000×g/5min/10℃에서 원심 분리함으로써, 2.5ml의 용적으로 농축시켰다. 이 농축물은 10mM Na2HPO4/0.05w% NaN3 와 함께 필터 상에서 세척하였고, 그리고 동일한 완충액으로 6ml(6g)의 용적으로 희석시켰다. "친화력 정제된 항체들"의 1:800 희석의 이 용액은 동물 사료 안에서 MYCOSORB에 대한 ELISA 분석에 이용하였다. 수득된 검량선은 도 3에 제공한다.

실시예 4

ELISA에 의한 효모 세포 벽의 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸의 탐지

원료 및 방법들

시약들

다른 명시가 없는 한, 공인된 분석용 등급의 시약들만을 이용하였고, 그리고 탈이온화된 또는 탈광물화된 물 또는 등가의 물 순도(18,2 M Ω/cm, 25℃)을 이용하였다.

시약들 및 시약 용액들의 조제물은 다음과 같다.

● 염산, 12.1N; HCl

● 희석된 염산, 1N; HCl: 41.3ml HCl 121N을 400ml의 탈이온화된 물에 서서히 첨가시키고, 교반 막대로 교반 플레이트 상에서 냉각될 때까지 혼합시켰다. 이 용액을 500ml 용적의 플라스크로 옮기고, 탈이온화된 물을 이용하여 용적에 맞추고, 그 다음 실온에 보관하였다.

● 디메틸 술폭시드: 이용된 DMSO는 고 순도이며, 분광광도, 액체 크로마토그래피 및 기체 크로마토그래피에 적합하다.

● 추출 시약: 추출 시약을 준비하기 위하여, 900ml의 DMSO는 98.75ml의 탈이온화된 물과 1.25ml의 HCl 12,1N으로 혼합하였다. 이 용액은 실온에서 교반 플레이트 상에서 교반 막대로 중간 속도로 혼합하였고, 그 다음 20℃ 또는 그 초과의 온도에서 보관하였다.

● 염화나트륨(NaCl)

● 염화칼륨(KCl)

● 인산수소이나트륨(Na2HPO4)

● 인산이수소칼륨(KH2PO4)

● 인산염 완충액 염수(PBS) 10X: 10X PBS를 준비하기 위하여, 80.0g의 염화나트륨[NaCl], 2.0g의 염화칼륨[KCl], 14.2g의 인산수소이나트륨[Na2HPO4] 및 2.4g의 인산이수소칼륨[KH2PO4]은 대략적으로 800ml의 탈이온화된 물과 혼합하였다. 이 용액은 고체가 완전하게 용해될 때까지 교반 플레이트 상에서 교반 막대를 이용하여 교반하였다. 이 용액을 1000ml 용적 측정 플라스크로 옮기고, 탈이온화된 물로 용적을 맞춘 다음, 실온 또는 2 - 8℃에 보관하였다. 최대 보관 시간은 희석되지 않은 액체의 경우 2-8℃에서 6개월이었다. 이 용액을 사용하기 전 실온으로 데웠다.

희석된 PBS, 1X: 1X PBS를 준비하기 위하여, 1 용적의 PBS, 10X는 9 용적의 탈이온화된 물로 희석하였다. 희석물은 실온에서 교반 플레이트 상에서 교반 막대를 이용하여 중간 속도로 혼합하였다. 최대 보관 시간은 하루였다.

● 폴리소르베이트 20

● 인산염 완충된 염수, 0.01M, 0.05% 폴리소르베이트 20, pH 7.4: 이를 준비하기 위하여, 한 개 파우치의 내용물을 1000ml의 탈이온화된 물에 용해시켰다. 이 용액은 완전하게 용해될 때까지 교반 플레이트 상에서 교반시켰고, 실온 또는 2- 8℃온도에서 보관하였다. 최대 보관 시간은 희석안된 액체의 경우 2-8℃에서 6개월이었다. 이 용액을 사용하기 전 실온으로 데웠다.

● 건조 탈지 우유

● 건조 탈지 우유, 3%(w/v)/PBS, 1X 차단 시약: 1X 차단 시약을 준비하기 위하여, 분유는 사용전 1X PBS에 완벽하게 용해시켰다. 차단시키기 위하여 각 플레이트에는 10ml 용적이 필요하였다. 최대 보관 시간은 하루였다.

● 토끼 다클론 항체들 1차 항체(항체 용액 #1): 여기에서 설명된 것과 같이, 친화력-정제된 항체들을 준비하였다. 사용전 까지 -80℃에 보관하였다.

● 희석된 토끼 다클론 항체 용액: 1㎕의 항체 용액 #1을 Xi의 PBS, 1X에 추가하여 PBS에서 1:Xi로 희석하였다. 각 미량적정 플레이트에 10ml 용적의 용액이 필요하였다. 사용 전 희석된 항체 용액을 잘 혼합하였고, 그리고 과량의 희석된 항체는 버렸다. 최대 보관 시간은 하루였다

● 과산화효소-콘쥬게이트된 AffiniPure 염소 항-토끼 IgG (H+L); HRP 2차 항체, Ref.# 111-035-045(Jackson ImmunoResearch, PA, USA-항체 용액 #2): 1.5ml 탈이온화된 물로 재수화시키고, 완벽하게 맑은 용액을 얻을 때까지 원심 분리시켰다. 사용 전까지 -80℃에서 10㎕ 분획물에 보관하였다. 최대 보관 시간은 희석되지 않은 액체의 경우 2-8℃에서 6주였다.

● 희석된 염소 항-토끼 항체: 1㎕의 항체 용액 #2를 Yi의 PBS, 1X에 추가하여 PBS에서 1:Yi로 희석하였다. 사용 전 희석된 항체 용액을 잘 혼합하였고, 그리고 과량의 희석된 항체는 버렸다. 최대 보관 시간은 하루였다

● SureBlue Reserve TMB Microwell 과산화효소 기질: 필요한 용적은 Nalgene HDPE 및 LDPE 호박색 병에서만 재분배하였다. 이 기질은 사용 전 실온으로 데웠다. 뚜껑은 단단히 닫아 둔채로 유지되었고, 빛을 차단하였다. 과량의 기질은 버리고, 이 시약은 2-8℃에 보관하였다. 최대 보관 시간은 8℃에 보관하였을 때, 제조일로부터 24개월이었다.

● MYCOSORB 비축 시료 batch Ref.#285965(ALLTECH, Inc., KY, USA): MYCOSORB의 균질성 시료를 이용하였다.

● 사료 재료들에서 MYCOSORB의 희석: 표준 곡선을 만들기 위하여(3개의 복사본으로) 250ml 원심 분리 병 안에서 20g의 사료 원료는 MYCOSORB 생산물의 양을 증가시키면서(0.01; 0.02; 0.08; 0.10; 0.12g) 혼합하였다. 이 병은 400rpm에서 1시간 동안 오비탈 쉐이커 상에서 흔들었다. 사료 원료들에 대한 중량 측정의 정밀성은 ±0.025g이었고, 그리고 MYCOSORB 생산물에 대한 정밀성은 ±0.005g이었다.

● 사료 재료들에서 희석된 MYCOSORB의 큰 배취(batch): 사료에서 희석된 MYCOSORB 생산물의 거대 시료는 1000ml 용기 안에 1.2g의 생산물과 300g의 사료 원료를 이용하여 준비하였다. 이 병은 400rpm에서 1시간 동안 오비탈 쉐이커 상에서 흔들었다. 사료 원료 안에 MYCOSORB 생산물의 최종 농도는 4.0kg/T이었다. 균질화된 300.0g의 큰 배취 사료-생산물 혼합물 20.0g을 250ml 원심분리 병으로 옮겼다. 이러한 이동을 9회 더 반복하여 10개의 레플리케이트 시료들을 만들었다. 병의 바닥에 생산물이 가라앉는 것을 피하기 위하여 준비된 매 3 분획물 마다 간헐적으로 이 혼합물을 흔들었다. 사료 원료들에 대한 중량 측정의 정밀성은 ±0.025g이었고, 그리고 MYCOSORB 생산물에 대한 정밀성은 ±0.005g이었다.

● 사료 재료들 안에 미지의 양의MYCOSORB의 희석물: 미지의 양의 MYCOSORB 생산물과 20.0g (±0,025g)의 사료 원료를 5개의 각 250ml 원심분리 병으로 옮겨 미지의 시료를 준비하였다. 이 병은 400rpm에서 1시간 동안 오비탈 쉐이커 상에서 흔들었다. 이 시료(들)에 대한 표준 곡선의 시료 조제물을 동시에 완성하였다.

제형(formulation)

3가지 사료 원료들(표 4, 표 5 및 표 6)을 이용하여 이 분석을 실증하였다. 이 사료 원료 제제는 당분야에서 찾아볼 수 있는 조성물들에 따라 선택하였다. 이 시료 크기는 총 15㎏의 사료 원료이었고, 실험실로 보내지기 전에 신중하게 균질화하였다. 이 시료는 전체 연구 기간 동안 2-8℃에 보관하였다.

시료 균질성 확인

사료 원료 안에 MYCOSORB 생산물의 희석물의 균질성은 4.0kg/T의 사료에서 생산물의 중간 농도로 사료에서 희석된 MYCOSORB 생산물의 큰 배취를 준비함으로써 실증하였다. 이 시료는 10개의 하위-시료들로 분할하였고, 추출 과정에 따라 추가 추출하고, 그리고 10개의 각 시료들에 대하여 4회의 ELISA 분석을 이용하여 생산물의 탐지에 대한 변이 계수를 측정하였다.

시료 조제물(preparation)

표준 시료의 조제물은 여기에서 설명된 것과 같이 만들었고, 테스트될 MYCOSORB 생산물과 함께 표 2에 제시한다. 이 경우에서, 처음 비축 생산물은 여기에서 명시된 것과 같이 참고하였다. 미지의 시료들은 상기에서 설명된 것과 같이 준비하였다. 이 추출 과정을 실행하기 전 사료 시료는 빻을 필요는 없었다(이 사료 원료가 펠렛화된 형태로 제공되는 경우 이 또한 경우에 해당될 것이다). 사료 원료의 빻기는 이 분석의 최종 신뢰성에 영향을 줄 수 있음을 알았다.

[표 2]

표준 곡선을 위한 MYCOSORB 생산물의 희석 단계들

추출 과정

전체 병들은 400rpm에서 1시간 동안 오비탈 쉐이커 상에서 흔들었다. 한번에 3개 병을 빼내고, 80ml의 추출 시약을 병의 상부 용적 분배기를 이용하여 각 병에 추가하였다. 병들의 뚜껑을 닫았다. 모든 시료들은 추출 시약과 함께 완전하게 혼합될 수 있도록 손으로 흔들었다. 이 병들은 1시간 동안 자동으로 80℃로 조절 유지된 수조에 두어, 사료 용액이 완전하게 잠기도록 하였다. 항온처리 후, 병들을 수조로부터 빼내고, 병의 내용물은 실험실 고회전 교반기를 이용하여 막대(NALGENE 브랜드)로 혼합하였다. 이 혼합물은 완전하게 균질화되었다. 각 MYCOSORB 및 각 미지의 시료(들)에 함유 수준에 대해 투명한 막대를 이용하였다. 이 병들은 1시간 동안 자동으로 80℃로 조절 유지된 수조에 되돌려 두었다. 항온처리 후, 이 병들을 수조로부터 빼내고, 80ml의 탈이온화된 물을 병의 상부 용적 분배기를 이용하여 각 병에 추가하였고, 그 다음 병들의 뚜껑을 닫았다. 완전하게 혼합될 때까지 병들을 흔들었다 실험실 고회전 교반기와 NALGENE 브랜드 막대는 필요할 때 이용하였다. 이 병들은 8,000g에서 10분간 원심분리하였다. 유리 피펫을 이용하여, 대략적으로 10ml의 이 상청액을 15ml의 원심 분리 멸균 튜브로 옮겼다. 이 튜브들은 4,000g에서 10분간 원심 분리하였고, 그리고 가만히 따라내어 새로운 15ml의 원심분리 멸균 튜브들로 옮기고, 적합하게 라벨하였다. 이 튜브들은 ELISA 분석에 이용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

ELISA 과정

SureBlue Reserve TMB Microwell Peroidase Substrate(과산화효소 기질)을 이용하여 희석된 MYCOSORB 생산물로부터 추출된 관심 기질과 특이적으로 반응하는 희석된 1차 항체 자체와 더 반응하는, 미량적정 플레이트 상에 고정된, 희석된 HRP 2차 항체와의 반응을 통하여 발색 반응을 촉발시켰다. 이 발색 반응은 HCl, 1N을 이용하여 20분 후에 완전하게 중단되었고, 그리고 450㎚의 파장에서 플레이트 판독기로 흡수도 판독을 실행하였다. 따라서, 사료 원료만으로 만들어진 블랭크(blank)를 측정하여 분광광도계에서 배경 신호를 제공하는 사료 매트릭스로부터 발생될 수 있는 발색 변이를 설명하였다. 계산에서, 각 시료에 대해 수득한 흡수도 값으로부터 블랭크 값을 공제하였다.

하룻밤 동안 보관된 이미 추출된 시료들은 해동시키고, 실온으로 데웠다. 이 시료들을 볼텍스하여 미량적정 플레이트의 웰을 코팅하기 위하여 ELISA에 사용하기 전 동질성 시료를 확보하였다.

각 시료 레플리케이트를 위하여, 100㎕의 이 상청액은 표 3에 나타낸 것과 같이, 96-웰 미량적정 플레이트 상에 3개 웰 각각으로 옮겼다. 이 플레이트 상에서 이 시료들의 무작위화된 분포는 프로그램에 의해 자동화된 미량적정 웰 분배기가 갖추어진 실험실에서 실행시킬 수 있다. 표준 곡선 시료들 및 시료 레플리케이트는 하나의 독특한 플레이트 상에 모두 분포되었다(가령, 모든 0kg/T 시료 레플리케이트는 열/컬럼 E1 내지 F10을 통하여 플레이트되었다). 미지의 MYCOSORB 레플리케이트 시료들은 동일한 플레이트 상에 분포되었다(가령, 열/컬럼 A11 내지 C12를 통하여 플레이트되었다). 이 미량적정 플레이트들은 마이크로플레이트 접착성 필름으로 밀봉하였고, 그리고 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 항온 처리하는 동안, 미량적정 플레이트의 각 웰에 있는 이 용액을 빼내고, 단일 세척용 250㎕ PBS, 1X으로 대체하였다. 이 작업은 총 2회 이상 더 반복하였다. 이 미량적정 플레이트의 각 웰은 100㎕의 희석된 탈지 우유/PBS 용액으로 차단시켰고, 실온에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 항온 처리 후, 각 웰에서 이 용액을 빼내고, 단일 세척용 250㎕ PBS, 1X으로 대체하였고, 2회 세척용으로 250㎕의 PBS 함유하는 폴리소르베이트20, 0.05%로 대체하였다.

희석된 1차 항체 100㎕를 각 웰에 추가하였다. 이 미량적정 플레이트는 실온에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 항온 처리 후, 이 미량적정 플레이트의 각 웰에 있는 이 용액을 빼내고, 3회 세척용으로 250㎕의 PBS, 1X 함유하는 폴리소르베이트20, 0.05%로 대체하였다.

희석된 2차 항체 100㎕를 각 웰에 추가하였다. 이 미량적정 플레이트는 실온에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 항온 처리 후, 이 미량적정 플레이트의 각 웰에 있는 이 용액을 빼내고, 3회 세척용으로 250㎕의 PBS, 1X 함유하는 폴리소르베이트20, 0.05%로 대체하였다.

실온으로 미리-데워진 TMB 기질 100㎕를 각 웰에 추가하였고, 이 미량적정 플레이트는 실온에서 20분간 항온 처리하였다. TMB 기질과 함께 정확하게 20분 후, 100㎕의 HCl, 1N을 각 웰에 즉시 추가하여 발색 발생을 중단시켰다. 각 미량적정 플레이트는 미량적정 플레이트 판독기에서, 450㎚에서 판독되었다.

[표 3]

미량적정 플레이트 상에서 시료 집단 분포

레플리케이트로부터 데이터 배제

Dixons Q-Test를 통과하지 않았고, 따라서 결과적으로 다음의 정의에 따라 제외자(outlier)로 확인된 레플리케이트를 제외하고 모든 레플리케이트들이 유사하였다는 것을 확인하기 위하여 통계학적 데이터 분석이 필요하였다:

, 이 때, R은 모든 데이터 점들의 범위이며 xa는 의심이 되는 제외자이며 xb는 xa에 가장 근접한 데이터 점이다. Qcalculated > Qtable인 경우, 95% 신뢰 수준에서 의심 가는 점은 버린다.

표준 곡선 형성

정량 분석을 위하여 검량선을 이용하였다. Council Directive 96/23에서 명시된 것과 같이 생산물의 작업 범위 안에서 최소한 5개 수준(0을 포함)을 이용하여 각 사료 매트릭스에 대해 작제한다. 각 시료 집단에 대해 OD450에서 웰 흡수도의 3개 레플리케이트의 평균을 계산하였다. 블랭크 사료 시료의 경우 OD450에서 웰 흡수도의 10개 레플리케이트의 평균을 계산하였다. 그 다음, 세로 좌표 상에 수득된 차이 ΔOD450(OD450 시료 집단-OD450 블랭크 사료)과 가로 좌표 상에 상이한 MYCOSORB 생산물 농도 범위들, 0.5, 1.0, 4.0, 5.0, 6.0kg/T 로 표준 곡선 또는 검량선을 만들었다.

회귀 계수와 OD450 흡수도에 대한 플롯된 함유 수준의 방정식은 최적의 피팅 라인, ΔOD450=Ax(MYCOSORB)을 이용하여 선형 회귀에 따라 계산하고, 평균을 낸 블랭크 값으로 이 값을 보정하였다. 검량선의 수용 가능한 범위와 선형성(Linearity)은 0.95 이상의 상관 계수(r2) 값에 의해 실증되었다. 이 곡선의 대응하는 방정식을 이용하여, 대응하는 식을 풀어서 미지의 시료(들)안에 MYCOSORB 생산물의 함유 수준을 결정하였다.

내삽법(Interpolation)

위 상관 계수 r2>0.95가 표준 곡선에서 발견된다면, 보정된 곡선의 대응하는 방정식 F(x)=Ax, (배경 신호로부터 빼고, 0을 가르는)을 이용하여 미지의 시료(들) 안에 MYCOSORB 생산물의 함유 수준을 결정하였다. MYCOSORB 생산물의 미지의 함유 수준(C) 에 대해여 OD450에서 10개의 레플리케이트의 평균을 계산한다. 수득한 평균은 이미 계산된 블랭크 사료 시료에 대하여 10개의 레플리케이트의 OD450에서 웰 흡수도의 평균으로부터 뺀다. OD450 평균값을 이용하여 보정된 곡선 F-1(yC),을 풀고, 여기에서 yC=AxC이다:

, 여기에서 yC는 미지의 시료 (C)에 대해 OD450 수득된 평균 - 블랭크의 OD450이고, xC는 MYCOSORB 생산물의 대응하는 함유 수준이며, 그리고 A는 표준 곡선의 기울기, kg/T OD450이다.

탐지 및 정량 분석의 한계

탐지 한계(LD = 3σblank) 및 정량 분석 한계(LQ = 10σblank)는 IUPAC 체계에 따라 측정하였고, ΔOD450으로 제시된다.

탐지의 한계(LD) 및 정량 분석의 한계(LQ)는 매트릭스 블랭크 분석으로부터 측정하였고, 다음에 따라 풀이된 검량선 F(x)=Ax에 의해 평균 배경 OD450으로부터 교정된 선형 회귀로부터 농도로 계산되었다:

및

, 여기에서 LD는 생산물의 탐지 가능한 최저 농도 또는 탐지 한계이며 LQ는 생산물의 정량화 가능한 최저 농도 또는 정량분석의 한계이다.

균질성(Homogeneity)

균질성 (RSDH = CVH)의 변이 계수는 동일한 장비 및 방법으로, 동일한 작업자에 의해 동일한 날, 동일한 시료로부터 수득한 10개의 독립적인 레플리케이트로부터 평균 변이 계수로 정의하였다.

정밀성(Precision): 반복성(Repeatability)

작업내(within-run) 반복성 정밀성(RSDintra = CVintra)은 동일한 장비 및 방법으로, 동일한 작업자에 의해 같은 날짜에, 동일한 작업에 대해, 동일한 시료로부터 얻은 반복으로부터 평균 변이 계수로 정의하였다.

작업간(between-run) 반복성 정밀성(RSDInter = CVInter)은 동일한 장비 및 방법으로, 동일한 작업자에 의해 상이한 날짜에 상이한 작업 동안, 동일한 시료로부터 얻은 독립적인 결과들로부터 평균 변이 계수로 정의하였다.

정밀성: 종합적인 정밀성

정밀성은 동일한 양의 연속 측정 간에 일치 분포(또는 근접성)를 평가한다. 일련의 측정에서 이 분포는 보통 표준 편차로 나타낸다. 따라서, 정밀성은 동일한 장비 및 방법으로, 동일한 작업자에 의해 동일한 날짜에 동일한 시료로부터 수득한 단일 함유 수준에서 단일 개별 실험의 표준 편차로 계산되었고 다음의 식에 따라 동일한 장비 및 방법으로 동일한 작업자에 의해 각 개별 작업을 비교한 표준 편차로부터 계산되었다:

, 여기에서 σTotal은 전체 실험 세트의 표준 편차이며, σintra는 단일 개별 실험의 표준 편차이며, σInter는 다중 실험간에 표준 편차이며, 그리고 n은 레플리케이트의 수를 나타낸다.

표준 편차의 비교는 F-test (p-value ≤ 0.05)를 이용하여 집단 평균의 변이와 집단내 변이의 평균 사이에 변이 분석으로부터 얻었다(일원 ANOVA).

정확성(Accuracy)

정확성은 테스트 결과와 측정되는 생산물의 수용된 기준 값 사이에서 찾을 수 있는 일치도(closeness of agreement)이다. 따라서, 정확성은 백분수로 표현되는 회수 측정(measurement of the recovery)으로 평가하였다. 이때 회수는 추출되고, 측정에 이용되는 분석물에 존재하는 또는 혼합된 양의 비율로 나타낸다. 편차(bias)는 테스트 결과들과 수용된 기준 값(분석물의 고정된 농도) 간의 차이다. 다음의 식에 따라 계산을 실행하였다:

여기에서 Xc는 고정된(spiked) 시료에서 측정된 농도이며 Xb는 고정되지 않은(unspiked) 시료(blank)에서 측정된 농도이며 XTH는 이론적인 농도이다.

실증(validation) 테스트에 이용된 사료 원료

Center for Animal Nutrigenomics and Applied Animal Nutrition(ALLTECH, Inc., KY, USA)에서 MYCOSORB 생산물의 상이한 수준의 함유물과 혼합된 낙농 사료 제제, 닭 사료 제제 그리고 돼지 사료 제제의 사료 원료로 테스트를 실행하였다. 사료 제제에 대한 전체 설명은 아래에 포함되어 있다.

낙농 사료 원료

사료 원료는 제제명 "Spirit Lait 2L5"로Coralis Vern(Vern sur Seiche, France, Ref.#111605)에 의해 제형화되었다(표 4). 이 시료 크기는 실험실로 보내지기 전 신중하게 균질화시킨, 총 15㎏의 사료 원료이다. 이 시료는 전 연구 기간 동안 2-8℃에서 보관하였다. 낙농 사료 원료는 펠렛 형으로 제공되었다. 추출 과정을 실행하기 전, 사료 시료를 빻을 필요는 없었다.

[표 4]

방법의 실증에 이용된 낙농 사료 제제

닭 사료 원료

이 사료 원료는 University of Kentucky 및 ALLTECH, Inc., KY, USA의 연합 연구 집단, Coldstream University of Kentucky에서 제형화되었다(표 5). 이 조제물은 이 업계에서 볼 수 있는 조성물에 따라 만들어지고, European Union, North America, Latin America, 등에서 흔히 볼 수 있는 제제로 일반화시킬 수 있다. 이 시료 크기는 실험실로 보내지기 전 신중하게 균질화시킨, 총 15㎏의 사료 원료이다. 이 시료는 전 연구 기간 동안 2-8℃에서 보관하였다.

[표 5]

방법의 실증에 이용된 닭 사료 제제

돼지 사료 원료

이 사료 원료는 University of Kentucky 및 ALLTECH, Inc., KY, USA의 연합 연구 집단, Coldstream University of Kentucky에서 제형화되었다(표 6). 이 조제물은 이 업계에서 볼 수 있는 조성물에 따라 만들어지고, European Union, North America, Latin America, 등에서 흔히 볼 수 있는 제제로 일반화시킬 수 있다. 이 시료 크기는 실험실로 보내지기 전 신중하게 균질화시킨, 총 15㎏의 사료 원료이다. 이 시료는 전 연구 기간 동안 2-8℃에서 보관하였다.

[표 6]

방법의 실증에 이용된 돼지 사료 제제

낙농 사료 원료를 이용한 실증

Center for Animal Nutrigenomics and Applied Animal Nutrition(ALLTECH, Inc., KY, USA)에서 MYCOSORB 생산물의 상이한 5가지 농도와 혼합된 European 형 고체 낙농 사료로 테스트를 실행하였다.

0.0; 0.5; 1.0; 4.0; 5.0; 6.0kg/T의 MYCOSORB 생산물로 개별적으로 혼합된 낙농 사료 원료들을 분석하였고, 뿐만 아니라 동일한 미량적정 플레이트 상에서 분포하였을 때 미지의 수준의 MYCOSORB 생산물과 혼합된 동일한 낙농 사료 원료의 시료로 분석하였다.

적용가능성(Applicability)

복합 사료재료들 안에 생산물의 추적을 목적으로 추적가능성 종료점 과정으로 MYCOSORB 생산물과 대체물의 특이적 분석을 위하여 개발된 ELISA 분석의 특징을 결정하기 위한 실증을 실행하였다.

이 사료 시료에 혼합된 함유 작업 범위(0.0; 0.5; 1.0; 4.0; 5.0; 6.0㎏/T)에 대응하는 실증에 6가지 수준의 MYCORSORB 생산물을 이용하였다.

희석된 토끼 다클론 항체 용액: 배경 수준에 따라 1차 항체 희석을 변경하였다. 따라서, 이 항체들은 1㎕의 항체 용액#1을 1.2ml의 PBS, 1X에 추가함으로써 PBS에서 1:2,500으로 희석되었다. 각 미량적정 플레이트에 10ml의 용액이 필요하였다.

희석된 염소 항-토끼 항체: 배경 수준에 따라 2차 항체 희석을 변경하였다. 따라서, 이 항체들은 1㎕의 항체 용액#2를 20.0ml의 PBS, 1X에 추가함으로써 PBS에서 1:20,000으로 희석되었다.

균질성(Homogeneity)

실험 계획에서 중간 수준의 MYCOSORB 생산물(4.0㎏/T) 함유에 대해 이 시료의 균질성을 확인하였다. 이 특정 수준에 대한 분석은 각 4개 레플리케이트를 이용하여 10개의 개별 시료에서 5회 반복하였다.

표 7에서 상세하게 나타낸 발견된 계산치에 따르면, CVH는 4.53%이었다.

[표 7]

4개 레플리케이트에서 분석된 10가지 개별 시료 조제물에서 5회 작업에 대한 ELISA 과정을 통하여 평가된 낙농용 유럽형 규정식에 혼합된 단일 농도의 4.0㎏/T MYCOSORB 생산물에서 균질성 평가

검량(Calibration)

이 분석의 검량은 여기에서 설명된 표준 시료의 공지 농도와 0.0 내지 6.0㎏/T 범위의 MYCOSORB 생산물로 혼합된 사료에서 실행하였다. 선형 곡선 피트, y=Ax를 이용하여 농도와 반응 (OD450) 간의 상관관계를 정의하였다. 5회 작업의 평균 표준 곡선은 도 4에 나타낸다.

선형성(Linearity)

표준 곡선의 선형성은 블랭크를 공제한 후, 0에서 갈리는 최적의 피팅 선, ΔOD450=Ax(MYCOSORB)을 이용하여 OD450 흡수도에 대해서 플롯된 함유 수준의 식에 따라 회귀 계수 계산으로부터 평가하였다. 표준 곡선의 선형성은 r2>0.95에서 발견되는 상관계수 값으로 실증하였다.

[표 8]

표준 곡선의 선형성

반복성(Repeatability)

반복성은 반복성 표준 편차의 평가에 의해 내부 변이의 측도이다. 작업의 반복 내에 이 반복성의 평가는 동일한 장비 및 방법으로, 동일한 작업자에 의해 동일한 작업에 대해, 동일 날짜, 동일 시료로부터 수득하였으며, 작업내 탐지의 변이, CVintra로 나타낸다(표 9). 상이한 작업간의 반복성 평가는 동일한 장비 및 방법으로, 동일한 작업자에 의해 상이한 날짜에 상이한 작업 동안 동일한 시료로부터 얻고, 이는 작업간의 탐지 변이, CVinter로 나타낸다(표 10).

결과에서는 동일한 날짜에 그리고 상이한 날짜에 수득한 표준 곡선들은 거의 변이가 없었고, 0.0 내지 6.0㎏/T의 작업 범위의 표준 곡선에 적용시켰을 때, 동일한 날짜(within-day)에서의 평균 정밀성은 5.70%이며, 상이한 날짜 간(between-day)의 정밀성은 7.86%이었다. 전체 정밀성은 8.28%이었다(표 11).

[표 9]

표준 곡선 구축을 위한 작업내 ( Within - run ) 반복성 정밀성

[표 10]

표준 곡선 구축을 위한 작업간 ( Between - run ) 반복성 정밀성

[표 11]

표준 곡선 구축을 위한 전체 정밀성

LD 및 LQ (감응성)

LD 및 LQ 값은 표 12에서 보고한다. 발견된 LQ 값은 MYCOSORB 생산물에서 최저 권고 함유율 2㎏/T 아래에 있었고, 사료 원료 안에 이의 정량 분석을 가능하게 한다.

탐지 한계 LD = 0.501 ± 0.103㎏/T

정량분석 한계 LQ=1.800 ± 0.389㎏/T

[표 12]

LD 및 LQ 측정

정확성(Accuracy)

정확성은 10개의 독립 시료들을 각 포함하고, 사료 원료에 4.0㎏/T 농도의 MYCOSORB 생산물에 대해 각각 4개 레플리케이트에서 작업한 5개의 독립 실험으로부터 측정하였다. 각 시료의 최종 농도는 균질성 계산을 위하여 수득한 관찰된 값을 이용하여 상기에서 표현한 방정식에 따라 계산하였다(표 13). 그 다음 평균 정밀성은 모든 작업에 대해 수득한 평균을 낸 정확성으로부터 계산하였고, 그리고 사료 원료에 혼합된 고정된 농도 양 4.0㎏/T의 MYCOSORB 생산물과 비교하였다. 상기 제공된 방정식에 따라 계산하였다.

결과에서 회수 평가는 고정된 농도의 MYCOSORB 생산물에서 사료 원료의 실제 함량의 21%의 과대평가를 설명하였다는 것을 보여준다(표 14).

[표 13]

각 10개의 독립 시료들을 포함하고, 그리고 사료 원료에 혼합된 4.0㎏/T 농도의 MYCOSORB 생산물에 대해 각 4개의 레플리케이트에서 작업한, 5개 독립 실험으로부터 측정한 정확성 및 정밀성

[표 14]

각 10개의 독립 시료들을 포함하고, 그리고 사료 원료에 혼합된 4.0㎏/T 농도의 MYCOSORB 생산물에 대해 각 4개의 레플리케이트에서 작업한, 5개 독립 실험으로부터 측정한 전체 회수

닭 사료 원료를 이용한 실증

Center for Animal Nutrigenomics and Applied Animal Nutrition(ALLTECH, Inc., KY, USA)에서 MYCOSORB 생산물의 상이한 5가지 농도와 혼합된 고형 닭 사료 제형으로 테스트를 실행하였다.

0.0; 0.5; 1.0; 4.0; 5.0; 6.0㎏/T의 MYCOSORB 생산물로 개별적으로 혼합된 닭 사료 원료들을 분석하였고, 뿐만 아니라 동일한 미량적정 플레이트 상에서 분포하였을 때 미지의 수준의 MYCOSORB 생산물과 혼합된 동일한 닭 사료 원료의 시료로 분석하였다.

적용가능성(Applicability)

복합 사료재료들 안에 초기에 언급한 생산물의 추적을 목적으로 추적가능성 종료점 과정으로 MYCOSORB 생산물과 대체물의 특이적 분석을 위하여 개발된 ELISA 분석의 특징을 결정하기 위한 실증을 실행하였다.

이 사료 시료에 혼합된 함유 작업 범위(0.0; 0.5; 1.0; 4.0; 5.0; 6.0㎏/T)에 대응하는 실증에 6가지 수준의 MYCORSORB 생산물(Ref. #285965)을 이용하였다.

희석된 토끼 다클론 항체 용액: 배경 수준에 따라 1차 항체 희석을 변경하였다. 따라서, 이 항체들은 1㎕의 항체 용액#1(4.15)을 7.5ml의 PBS, 1X에 추가함으로써 PBS에서 1:7,500으로 희석되었다. 각 미량적정 플레이트에 10ml의 용액이 필요하였다.

희석된 염소 항-토끼 항체: 배경 수준에 따라 2차 항체 희석을 변경하였다. 따라서, 이 항체들은 1㎕의 항체 용액#2를 30.0ml의 PBS, 1X에 추가함으로써 PBS에서 1:30,000으로 희석되었다.

균질성(Homogeneity)

실험 계획에서 중간 수준의 MYCOSORB 생산물(4.0㎏/T) 함유에 대해 이 시료의 균질성을 확인하였다. 이 특정 수준에 대한 분석은 각 4개 레플리케이트를 이용하여 10개의 개별 시료에서 5회 반복하였다(표 15).

[표 15]

4개 레플리케이트에서 분석된 10가지 개별 시료 조제물에서 5회 작업에 대한 ELISA 과정을 통하여 평가된 닭 사료 물질에 혼합된 단일 농도의 4.0㎏/T MYCOSORB 생산물에서 균질성 평가

검량(Calibration)

이 분석의 검량은 여기에서 설명된 표준 시료의 공지 농도와 0.0 내지 6.0㎏/T 범위의 MYCOSORB 생산물로 혼합된 사료에서 실행하였다. 선형 곡선 피트, y=Ax를 이용하여 농도와 반응(OD450) 간의 상관관계를 정의하였다. 5회 작업의 평균 표준 곡선은 도 5에 나타낸다.

선형성(Linearity)

표준 곡선의 선형성은 블랭크를 공제한 후, 0에서 갈리는 최적의 피팅 선, ΔOD450=Ax(MYCOSORB)을 이용하여 OD450 흡수도에 대하여 플롯된 함유 수준의 식에 따라 회귀 계수 계산으로부터 평가하였다. 표준 곡선의 선형성은 상기 r2>0.95에서 발견되는 상관계수 값으로 실증하였다. 각 표준 작업 곡선 및 평균화된 표준 작업 곡선에 대한 회귀 계수는 표 16에 나타낸다.

[표 16]

닭 사료 원료에서 표준 곡선의 선형성

반복성(Repeatability)

반복성은 반복성 표준 편차의 평가에 의해 내부 변이의 측도이다. 작업의 반복 내에 이 반복성의 평가는 동일한 장비 및 방법으로, 동일한 작업자에 의해 동일한 작업에 대해, 동일 날짜에 동일 시료로부터 수득하였으며, 작업 내 탐지의 변이, CVintra로 나타낸다(표 17). 상이한 작업간의 반복성 평가는 동일한 장비 및 방법으로, 동일한 작업자에 의해 상이한 날짜에 상이한 작업 동안 동일한 시료로부터 얻고, 이는 작업간의 탐지 변이, CVinter로 나타낸다(표 18).

결과에서는 동일한 날짜에 그리고 상이한 날짜에 수득한 표준 곡선들은 거의 변이가 없었고, 동일한 날짜(within-day)에서의 평균 정밀성은 6.00%이었다. 그러나, 0.0 내지 6.0㎏/T의 작업 범위의 표준 곡선에 적용시켰을 때, 상이한 날짜간(between-day)의 정밀성은 21.52%이었다. 전체 정밀성은 21.75%이었다(표 19).

[표 17]

표준 곡선 구축을 위한 작업내(Within-run) 반복성 정밀성

[표 18]

표준 곡선 구축을 위한 작업간(Between-run) 반복성 정밀성

[표 19]

표준 곡선 구축을 위한 전체 정밀성

LD 및 LQ (감응성)

LD 및 LQ 값은 표 20에서 보고한다. 발견된 LQ 값은 MYCOSORB 생산물에서 최저 권고 함유율 아래에 있었고, 사료 원료 안에 이의 정량 분석을 가능하게 한다.

탐지 한계 LD = 0.547 ± 0.237㎏/T.

정량 분석 한계 LQ=1.864 ± 0.806㎏/T.

[표 20]

닭 사료 원료에서 LD 및 LQ 측정

정확성(Accuracy)

정확성은 10개의 독립 시료들을 각각 포함하고, 사료 원료에 4.0㎏/T 농도의 MYCOSORB 생산물에 대해 각각 4개 레플리케이트에서 작업한 5개의 독립 실험으로부터 측정하였다. 각 시료의 최종 농도는 균질성 계산을 위하여 수득한 관찰된 값을 이용하여 상기에서 표현한 방정식에 따라 계산하였다(표 21). 그 다음 평균 정밀성은 모든 작업에 대해 수득한 평균을 낸 정확성으로부터 계산하였고, 그리고 사료 원료에 혼합된 고정된 농도 양 4.0㎏/T의 MYCOSORB 생산물과 비교하였다. 상기 제공된 방정식에 따라 계산하였다.

결과에서 회수 평가는 고정된 농도의 MYCOSORB 생산물에서 사료 원료의 실제 함량의 18%의 과대 평가를 설명하였다는 것을 보여준다(표 22).

[표 21]

각 10개의 독립 시료들을 포함하고, 그리고 사료 원료에 혼합된 4.0㎏/T 농도의 MYCOSORB 생산물에 대해 각 4개의 레플리케이트에서 작업한, 5개 독립 실험으로부터 측정한 정확성 및 정밀성

[표 21]

각 10개의 독립 시료들을 포함하고, 그리고 사료 원료에 혼합된 4.0㎏/T 농도의 MYCOSORB 생산물에 대해 각 4개의 레플리케이트에서 작업한, 5개 독립 실험으로부터 측정한 전체 회수

돼지 사료 원료를 이용한 실증

Center for Animal Nutrigenomics and Applied Animal Nutrition(ALLTECH, Inc., KY, USA)에서 MYCOSORB 생산물의 상이한 5가지 농도와 혼합된 고형 돼지 사료 제형으로 테스트를 실행하였다.

0.0; 0.5; 1.0; 4.0; 5.0; 6.0kg/T의 MYCOSORB 생산물로 개별적으로 혼합된 돼지 사료 원료들을 분석하였고, 뿐만 아니라 동일한 미량적정 플레이트 상에서 분포하였을 때 미지의 수준의 MYCOSORB 생산물과 혼합된 동일한 돼지 사료 원료의 시료로 분석하였다.

적용 가능성(Applicability)

복합 사료재료들 안에 생산물의 추적을 목적으로 추적가능성 종료점 과정으로 MYCOSORB 생산물과 대체물의 특이적 분석을 위하여 개발된 ELISA 분석의 특징을 결정하기 위한 실증을 실행하였다.

이 사료 시료에 혼합된 함유 작업 범위(0.0; 0.5; 1.0; 4.0; 5.0; 6.0㎏/T)에 대응하는 실증에 6가지 수준의 MYCORSORB 생산물을 이용하였다.

희석된 토끼 다클론 항체 용액: 배경 수준에 따라 1차 항체 희석을 변경하였다. 따라서, 이 항체들은 1㎕의 항체 용액#1을 3.5ml의 PBS, 1X에 추가함으로써 PBS에서 1:3,500으로 희석되었다. 각 미량적정 플레이트에 10ml의 용액이 필요하였다.

희석된 염소 항-토끼 항체: 배경 수준에 따라 2차 항체 희석을 변경하였다. 따라서, 이 항체들은 1㎕의 항체 용액#2를 30.0ml의 PBS, 1X에 추가함으로써 PBS에서 1:30,000으로 희석되었다.

균질성(Homogeneity)

실험 계획에서 중간 수준의 MYCOSORB 생산물(4.0㎏/T) 함유에 대해 이 시료의 균질성을 확인하였다. 이 특정 수준에 대한 분석은 각 4개 레플리케이트를 이용하여 10개의 개별 시료에서 5회 반복하였다(표 23).

[표 23]

4개 레플리케이트에서 분석된 10가지 개별 시료 조제물에서 5회 작업에 대한 ELISA 과정을 통하여 평가된 돼지 사료 물질에 혼합된 단일 농도의 4.0㎏/T MYCOSORB 생산물에서 균질성 평가

검량(Calibration)

이 분석의 검량은 여기에서 설명된 표준 시료의 공지 농도와 0.0 내지 6.0㎏/T 범위의 MYCOSORB 생산물로 혼합된 사료에서 실행하였다. 0에서 갈리는, 선형 곡선 피트, y=Ax를 이용하여 농도와 반응 (OD450) 간의 상관관계를 정의하였다. 5회 작업의 평균 표준 곡선은 도 6에 나타낸다.

선형성(Linearity)

표준 곡선의 선형성은 블랭크를 공제한 후, 0에서 갈리는 최적의 피팅 선, ΔOD450=Ax(MYCOSORB)을 이용하여 OD450 흡수도에 대하여 플롯된 함유 수준의 식에 따라 회귀 계수 계산으로부터 평가하였다. 표준 곡선의 선형성은 상기 r2>0.95에서 발견되는 상관계수 값으로 실증하였다. 각 표준 작업 곡선 및 평균화된 표준 작업 곡선에 대한 회귀 계수는 표 24에 나타낸다.

[표 24]

돼지 사료 원료에서 표준 곡선의 선형성

반복성(Repeatability)

반복성은 반복성 표준 편차의 평가에 의해 내부 변이의 측도이다. 작업의 반복내에 이 반복성의 평가는 동일한 장비 및 방법으로, 동일한 작업자에 의해 동일한 시료의 동일한 작업에 대해, 동일 날짜에 동일 시료로부터 수득하였으며, 작업내 탐지의 변이, CVintra로 나타낸다(표 25). 상이한 작업간의 반복성 평가는 동일한 장비 및 방법으로, 동일한 작업자에 의해 상이한 날짜에 상이한 작업 동안 동일한 시료로부터 얻었고, 이는 작업간의 탐지 변이, CVinter로 나타낸다(표 26).

결과에서는 동일한 날짜에 그리고 상이한 날짜에 수득한 표준 곡선들은 거의 변이가 없었고, 0.0 내지 6.0㎏/T의 작업 범위의 표준 곡선에 적용시켰을 때, 동일한 날짜(within-day)에서의 평균 정밀성은 7%이었고, 상이한 날짜간(between-day)의 정밀성은 20%이었다.

[표 25]

표준 곡선 구축을 위한 작업내(Within-run) 반복성 정밀성

[표 26]

표준 곡선 구축을 위한 작업간(Between-run) 반복성 정밀성

[표 27]

표준 곡선 구축을 위한 전반적인 정밀성

LD 및 LQ (감응성)

LD 및 LQ 값은 표 28에서 보고한다. 발견된 LQ 값은 MYCOSORB 생산물에서 최저 권고 함유율 아래에 있었고, 사료 원료 안에 이의 정량 분석을 가능하게 한다.

탐지 한계 LD = 0.403 ± 0.150㎏/T

정량 분석 한계 LQ=1.363 ± 0.498㎏/T

[표 28]

돼지 사료 원료에서 LD 및 LQ 측정

정확성(Accuracy)

정확성은 10개의 독립 시료들을 각 포함하고, 사료 원료에 4.0㎏/T 농도의 MYCOSORB 생산물에 대해 각각 4개 레플리케이트에서 작업한 5개의 독립 실험으로부터 측정하였다. 각 시료의 최종 농도는 균질성 계산을 위하여 수득한 관찰된 값을 이용하여 상기에서 표현한 방정식에 따라 계산하였다(표 29). 그 다음 평균 정밀성은 모든 작업에 대해 수득한 평균을 낸 정확성으로부터 계산하였고, 그리고 사료 원료에 혼합된 고정된 농도 양 4.0㎏/T의 MYCOSORB 생산물과 비교하였다. 여기에서 설명된 방정식에 따라 계산하였다.

결과에서 회수 평가는 고정된 농도의 MYCOSORB 생산물에서 사료 원료의 실제 함량의 20%의 과대평가를 설명하였다는 것을 보여준다(표 30).

[표 29]

각 10개의 독립 시료들을 포함하고, 그리고 사료 원료에 혼합된 4.0㎏/T 농도의 MYCOSORB 생산물에 대해 각 4개의 레플리케이트에서 작업한, 5개 독립 실험으로부터 측정한 정확성 및 정밀성

[표 30]

각 10개의 독립 시료들을 포함하고, 그리고 사료 원료에 혼합된 4.0㎏/T 농도의 MYCOSORB 생산물에 대해 각 4개의 레플리케이트에서 작업한, 5개 독립 실험으로부터 측정한 전체 회수

닭과 돼지 사료 원료를 이용한 확인

닭 및 돼지 매트릭스에서 MYCOSORB 탐지를 위하여 사료 분석에서 ELISA를 실행하였고, 독립 실험실에서 실증하였으며, 실증 결과들을 비교하였다. 이 분석은 Alimetrics, Ltd., Koskelontie 19B, Espoo, Finland에서 실증되었다.

이 분석의 검량은 0.0 내지 6.0㎏/T의 MYCOSORB 생산물 범위 내에서 공지의 표준 시료 농도와 혼합된 사료에서 상이한 두 날짜에 실시하였다. 0에서 갈리는, 선형 곡선 피트, y=Ax를 이용하여 돼지 사료재료들과 닭 사료재료들에서 농도와 반응(OD450) 간의 상관관계를 정의하였다. 흡수도와 생성된 검량은 상이한 작업 간에 유의적인 차이가 있었다 그러나, 공지의 그리고 블라인드 시료들에 대한 절대 농도는 동일하게 유지된다.

선형성(Linearity)

표준 곡선의 선형성은 블랭크를 공제한 후, 0에서 갈리는 최적의 피팅 선, ΔOD450=Ax(MYCOSORB)을 이용하여 OD450 흡수도에 대하여 플롯된 함유 수준의 식에 따라 회귀 계수 계산으로부터 평가하였다. 표준 곡선의 선형성은 상기 r2>0.95에서 발견되는 상관계수 값으로 실증하였다. 이 상관 계수는 0.991 내지 0.994 범위에 있었다(표 31).

[표 31]

닭 및 돼지 사료 원료에서 표준 곡선의 선형성

평균 제곱 오차는 다음과 같이 선형 회귀 모델로 정의한다:

, 여기에서

yi - i 이며 yi는 실험적으로 측정된 y값이며 i는 예상된 xi 농도의 MYCOSORB 생산물에 대한 이론값이다.

LD 및 LQ (감응성)

LD 및 LQ 값은 40% 염산 매트릭스에서 측정하였다. 각 LD 및 LQ 값의 예측은 차례로 닭 사료재료들에 혼합된 0.35 및 1.20kg/T의 MYCOSORB와 그리고 돼지 사료재료들에 혼합된 0.27 및 0.91㎏/T의 MYCOSORB이었다(차례로 표 32와 표 33).

[표 32]

닭 사료 재료들의 확인 실험에 의해 실행하고, 하루 간격으로 실시된 두 개의 별도 작업에서 블랭크 시료들에 대해 얻은 결과들

[표 33]

돼지 사료재료들의 확인 실험에 의해 실행하고, 하루 간격으로 실시된 두 개의 별도 작업에서 블랭크 시료들에 대해 얻은 결과들

공지의 시료들에 대한 정확성 및 정밀성

사료 원료에 혼합된 4.0㎏/T 농도의 MYCOSORB 생산물의 6개 레플리케이트를 포함하는 두 가지 독립 실험에서 정확성을 측정하였다. 평균 정밀성은 모든 작업으로부터 얻은 평균을 낸 정확성으로부터 계산하였고, 그리고 사료 원료에 혼합된 고정된 농도 4.0㎏/T의 MYCOSORB 생산물과 비교하였다.

수득된 이 값들은 다음과 같이 정확성 및 정밀성 모두에 대한 기준에 부합하였다.

작업 반복내 반복성의 평가는 동일한 장비 및 방법으로, 동일한 작업자에 의해 동일한 날짜에 동일한 시료로 동일한 작업으로부터 수득하여, 작업내 탐지의 변이 CVintra를 나타낸다. 상이한 작업간의 반복성 평가는 동일한 장비 및 방법으로, 동일한 작업자에 의해 상이한 날짜에 상이한 작업 동안 동일한 시료로부터 얻었고, 이는 작업간의 탐지 변이, CVinter로 나타낸다.

수득된 이 값들은 닭 및 돼지 매트릭스에 대하여 정확성 및 정밀성 모두에 대한 기준에 부합하였다(표 34 및 표 35).

[표 34]

닭 사료 원료에 혼합된 MYCOSORB 생산물의 공지의 시료들(4.0㎏/T)을 이용하여 별도의 양일간 실행된 6개 레플리케이트 테스트로부터 측정된 정확성 및 정밀성

[표 35]

돼지 사료 원료에 혼합된 MYCOSORB 생산물의 공지의 시료들(4.0㎏/T)을 이용하여 별도의 양일간 실행된 6개 레플리케이트 테스트로부터 측정된 정확성 및 정밀성

"미지의" 시료들에 대한 정확성 및 정밀성

블라인드 테스트에서 사료 원료에 혼합된 4.0㎏/T 농도의 MYCOSORB 생산물의 3개 레플리케이트를 포함하는 두 가지 독립 실험에서 정확성을 측정하였다. 수득된 이 값들은 다음과 같이 정확성 및 정밀성 모두에 대한 기준에 부합하였다.(표 36 및 표 37).

[표 36]

닭 사료 원료에 혼합된 MYCOSORB 생산물의 미지의 시료들(4.0㎏/T)에서 실시한 3개 레플리케이트 테스트로부터 측정된 정확성 및 정밀성

[표 37]

돼지 사료 원료에 혼합된 MYCOSORB 생산물의 미지의 시료들(4.0㎏/T)에서 실시한 3개 레플리케이트 테스트로부터 측정된 정확성 및 정밀성

엄격성(Ruggedness)

엄격성 분석은 환경적 그리고 과정의 변이들에서 사소한 변화를 겪게 될 때, 결과에서 변화에 저항하는 측정 방법의 능력을 평가한다.

ELISA 분석의 안정성은 1차 및 2차 항체 희석, 1차 항체의 안정성의 변화, 미량적정 플레이트상에서 테스트되는 상이한 시료들의 분포의 변화(측정되는 모든 시료들을 함유하고, 표준 및 미지의 시료를 함유하는 단일 플레이트 대(對) 분석되는 시료당 더 많은 반복을 포함하나, 블랭크, 표준 및 미지의 시료는 상이한 미량적정 플레이트에 포함된 다중 미량적정 플레이트)에 의해 조사하였다. 표 38은 변이를 보고하는데, 변화가 있더라도 결과는 일관성이 있고, 특히 항체 희석에 대한 변이에 대해 테스트의 강력한 엄격성을 나타내는 것을 보여준다.

[표 38]

엄격성 테스트

표준 조건들은 굵은 글씨로 나타낸다. 변경이 발견된 경우, 10% 변경은 또한 눈에 띄게 강조한다.

실시예 5

단클론 항체 특이성 테스트

방법들

효모 (1→4)-α-D-글루칸/(1→6)-β-D-글루칸-BSA 콘쥬게이트에 대항하여 생성된 단클론 항체들에 의한 교차-반응성을 측정하기 위하여 PBS에서 50㎍/ml 농도로 17개 화합물들을 테스트하였다.

테스트된 화합물들은 다음과 같다: 가용성 전분-감자, 전분-쌀, 전분-밀, 전분-옥수수, BSA, 글리코겐(토끼로부터), 글리코겐(굴로부터), 글리코겐(소로부터), Mannan, Laminarin, Zymosin A, Maltrin QD, 글루칸(제빵 효모), (1→3)-β-D-글루칸(Eug. gracilis), Torula 효모, Ycw-02 비드 비터(bead beater)(효모 세포 벽 분획물-비드 비터 조제물), β-글루칸(보리).

효모 세포벽 추출물(MYCOSORB batch#08FS001) 및 단클론 항체를 생성하는데 이용된 (1→4)-α-D-글루칸/(1→6)-β-D-글루칸-BSA 항원은 1㎍/ml, 2㎍/ml 및 5㎍/ml의 농도에서 또한 테스트하였다. 두 가지 단클론 항체들(513A161.1 및513A431.1)은 모두 다음의 희석 범위에서 분석하였다: 1:100, 1:200, 1:500, 1:1000, 1:1500 및 1:2000. Lot#0702013와 96-웰 Nunc 미량적정 플레이트를 이용하였다. 플레이트들은 100㎕/well의 화합물로 피복하였고, 손가락 끝으로 8-10회 톡톡 두드려 흔들었다. 이 플레이트들은 실링 테이트로 덮고, 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 용액을 제거하였고, 플레이트들은 다중 채널 피펫을 이용하여 한번 세척 당 200㎕의 PBS로 3회 세척하였다. 플레이트들로부터 각 세척 용액을 제거하기 전, 손가락 끝으로 8-10회 톡톡 두드려 흔들었다. 세척과 세척 사이에 과량의 유체는 페이퍼 타올 위에 플레이트를 두드려 제거하였다. 차단을 위하여, 100㎕/well 3% 우유 (원심분리안함)를 추가하였다. 플레이트들은 실온에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 차단 용액을 제거하였고, 웰은 1×200㎕의 PBS, 2×200㎕ PBS + 0.05% 폴리소르베이트 20으로 세척하였다. 플레이트들로부터 각 세척 용액을 제거하기 전, 손가락 끝으로 플레이트를 8-10회 톡톡 두드려 흔들었다. 세척과 세척 사이에 과량의 유체는 페이퍼 타올 위에 플레이트를 두드려 제거하였다.

적절한 혈청의 각 희석물 100㎕를 웰에 추가하였다. 블랭크 웰에는 PBS(100㎕/well)를 이용하였다. 플레이트를 덮고, 실온에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 용액을 제거하였고, 플레이트들은 다중 채널 피펫을 이용하여 한번 세척 당 200㎕ PBS + 0.05% 폴리소르베이트 20으로 3회 세척하였다. 플레이트들로부터 각 세척 용액을 제거하기 전, 손가락 끝으로 플레이트를 8-10회 톡톡 두드려 흔들었다. 세척과 세척 사이에 과량의 유체는 페이퍼 타올 위에 플레이트를 두드려 제거하였다. 100㎕의 2차 항체(1:10,000 염소 항-마우스, IgG-과산화효소 콘쥬게이트된)를 각 웰에 추가하였다. 플레이트를 덮고, 실온에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 용액을 제거하였고, 플레이트들은 다중 채널 피펫을 이용하여 한번 세척 당 200㎕ PBS + 0.05% 폴리소르베이트 20으로 3회 세척하였다. 플레이트들로부터 각 세척 용액을 제거하기 전, 손가락 끝으로 플레이트를 8-10회 톡톡 두드려 흔들었다. 세척과 세척 사이에 과량의 유체는 페이퍼 타올 위에 플레이트를 두드려 제거하였다.

100㎕의 실온 TMB 기질을 웰에 추가하였다. 5분후, 100㎕의 1N HCl을 웰당 추가하여 반응을 중단시켰다. 플레이트 바닥은 손자국이 없도록 깨끗하게 닦아내었고, 10초간 흔든 후, 미량적정 플레이트 판독기를 이용하여 450㎚에서 흡수도를 측정하였다.

결과

도 9- 도 14는 ELISA 데이터의 막대 그래프들을 나타낸다. 513A161.1 및 513A431.1은 1㎍/ml와 같은 낮은 농도의 항원 499-73-3과 매우 강력하게 반응하였고, 2㎍/ml 농도에서 가장 강력한 흡수도를 나타내었다. 항체들은 또한 1㎍/ml 내지 5㎍/ml 범위의 농도에서 08FS001을 인지할 수 있었고, 5㎍/ml 농도에서 가장 강력한 흡수도를 나타내었다. 그러나, 흡수도는 항원 499-73-3보다는 08FS001에 대해 상당히 낮았다. 항체 513A161.1은 Laminarin을 인지하였고, 이와 유의미적으로 반응하였지만, 513A431.1은 그렇지 않았다. 두 항체들 모두 Zymosin A에 대해 매우 강력한 흡수도를 보유하였는데, 이는 항원 499-73-3에서 볼 수 있었던 것과 유사하고, 일부는 이보다 더 강력하였다. 놀라운 것은, 이 항체들은 Zymosin A, Maltrin QD, 글루칸(제빵 효모), (1→3)-β-D-글루칸(Eug. gracilis), Torula 효모 및 ycw-02 비드 비터 펠렛과 유의미적인 교차-반응을 나타내었고, 정성적 ELISA 분석에 대한 이들의 이용을 제한한다.

실시예 6

사료-추출된 항원을 탐지하기 위한 단클론 항체 ELISA 분석 조건을 최적화시키기 위한 시도들

PBS 대 PBS+3% 탈지 분유에서 희석

정성적 ELISA 분석에서 사료-추출된 항원을 탐지하기 위하여 단클론 항체 513A161.1(실시예 5)을 이용하기 위한 시도들은 낮은 흡수도를 초래하였다. PBS와는 반대로 3% 우유에 항체들을 희석하는 것이 흡수도에 영향을 주는지(가령, 사료 추출물 성분들과 복합되었을 때 과도한 차단을 야기함으로써) 판단하기 위하여, 다음의 프로토콜을 실행하였다.

효모 세포 벽 추출물(MYCOSORB batch#08FS001) 추출물들은 0.5% HCl를 함유하는 용액으로, 실시예 4에서 논의된 바와 같은 화학적 추출을 거치게 하였다. ELISA 분석은 1차 항체로 1:400 희석에서 단클론 항체 513A161과 2차 항체로 PBS 또는 3% 우유에 희석된 염소 항 마우스 IgG-HRP 항체 (1:10,000)를 이용하여 실시예 5에서 설명된 것과 같이 실시하였다. 미량적정 플레이트들은 100㎕/well의 효모 세포 벽 추출물 또는 200㎕/well의 PBS에서 1:1 희석된 추출물로 피복하였다.

도 15에 나타낸 결과들에서 항체 희석물의 약한 그러나 통계학적으로 의미없는 효과가 관찰되었음을 확인하였다. 추가적으로, 0.5% HCl으로 추출한 사료 표준들에서 항원을 탐지하기 위하여 단클론 항체를 이용하는 3중 시도들은 레플리케이트 간에 판독에서 큰 변이, 큰 표준 편차, 그리고 부풀려진 흡수도 판독을 초래하였다.

항원 피복 단계- 온도 및 시간

정성적 ELISA 분석에서 사료-추출된 항원을 탐지하기 위한 단클론 항체 513A161.1(실시예 5)을 이용하는 시도는 낮은 흡수도 판독을 초래하였다. 마우스 단클론 항체 513A161.1을 이용한 ELISA의 흡수도 판독을 증가시키기 위하여, 다음의 실험을 실행하여 항원 피복 항온처리 단계의 시간 및 온도의 변화가 배경/비-특이적 결합의 증가없이 사료-추출된 항원 탐지를 개선시킬 수 있는지를 판단하였다.

이 프로토콜은 분석 시료들을 만들기 위하여 상기에서 설명된 것과 같이 사료 추출을 실행하는 것으로 구성된다. 이 시료 분획물들은 플레이트에 바로 피복하거나 또는 -25℃에서 하룻밤 동안 보관된 플레이트에 피복시켰다. 시료 준비는 삼중 추출물을 만들기 위하여 3회 반복하였다. 6개-점 표준 곡선(0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.8, 2.4㎏/T)은 닭 사료 조제물에서 항원을 이용하여 준비하였다. 플레이트는 사료 추출물(표준 곡선)로 피복시키고, 그리고 4℃에서 하룻밤 동안(정지), 4℃에서 하룻밤 동안(흔듬), 또는 37℃에서 1시간 동안(정지) 항온 처리하였다. ELISA 분석은 1차 항체로 3% 우유에 1:400으로 희석된 단클론 항체 513A161.1과 2차 항체로 3% 우유에 희석된 염소 항 마우스 IgG-HRP 항체(1:10,000)를 이용하여 실시예 5에서 설명된 것과 같이 실시하였다. 기질 항온처리는 30분간 일어났고, 그리고 450㎚에서 흡수도를 측정하였다.

도 16에 나타낸 결과에서 이 항원이 플레이트에 피복되는 시간 및 온도의 변화는 흡수도를 최적의 범위로 증가시키지 못하였고, 표준 곡선의 선형성에 또한 영향을 주지 않은 것으로 나타났다. 또한, 배경은 항온처리 기간과는 독립적으로 증가하였다.

실시예 7

다클론 항체 선택성(간섭) 테스트

간섭 수준을 결정하기 위하여, MYCOSORB 생산물(Ref.#285965) 없이 그리고 1㎏/T의 MYCOSORB 생산물(Ref.#285965)과 함께 여기에서 설명된 닭 사료 원료를 이용한 일련의 분석을 실행하였고, 생산물을 포함하는 경우, 사료 제제에서 볼 수 있는 탄수화물들 또는 부산물들에 속하는 있을 수 있는 간섭 생산물들의 몇 가지 비율과 함께(MYCOSORB 생산물의 함유 수준과 비교하여 50%, 100%, 200%, w/w), 또는 이들 없이 진행되었다. 이 점에 있어서, 여기 추출 방법을 통하여 MYCOSORB 생산물의 탐지에 이들의 충돌을 평가하기 위하여 다음의 생산물들을 조사하였고, 그리고 테스트하였다.

● 아밀로즈(감자 전분): (1→4):(1→6)-β-D-글루칸들, 30:1의 비율.

● 말토덱스트린 및 옥수수 시럽 고체들: 천연 옥수수 전분, 덱스트로즈 폴리머로부터 만든 용이하게 소화 가능한 탄수화물들.

● 글리코겐(소의 간, 유형 IX): (1→4):(1→6)-β-D-글루칸들, 10:1의 비율.

● 라미나린(Laminarin)(Laminaria digitata): (1→3):β(1→6)-β-D-글루칸들, 3:1의 비율.

● 증류 건조 낟알(Distiller Dry Grains); 옥수수의 바이오에탄올 생산의 부산물들.

● Red Star^® Pasteur Champagne Active Dry Wine Yeast (Saccharomyces bayanus): 효모 및 효모 세포벽 ((1 →3):β(1→6)-β-D-글루칸들, 단백질에 연결된 (1→4):(1→6)-α-D-폴리만노즈, (1→2):(1→4)-β-N-아세틸글루코사민)으로 만들어진 복합 탄수화물들.

도 7 및 도 8에 나타낸 것과 같이, MYCOSORB 생산물과 50, 100, 200% (w/w)의 간섭물과 혼합된 MYCOSORB 생산물에서 얻어진 신호 간에 차이의 합은 대략적으로 OD450 값은 0이었다. 이 결과들은 간섭이 없음을 설명하고, 그리고 상이한 탄수화물들 간섭물로 구성된 복합 사료 매트릭스 안에서 MYCOSORB 생산물의 탐지를 위한 분석의 특이적 성질을 설명한다.

표 39 내지 표 44를 통하여 95% 신뢰 구간으로, 일원 ANOVA 테스트의 개별 간섭물 및 한계에 대한 상세한 결과를 나타내는데, 이들 표에서 시료들 간에 광학 밀도(450) 평균값과 차이를 계산하였고, 뿐만 아니라 표준 편차 및 변이계수를 계산하였다. 각 간섭물 이내에서 변이의 균질성은 Levene, O'Brien, 그리고 Brown 및 Forsythe 테스트들을 이용하여 평가하였다. 비-불변 변이(constant variance) 경우에서, 비모수(nonparametric) Kruskal-Willis 일원 ANOVA 방법을 이용하여 등급 변형(rank transformation)과 함께, 비-정상에 대해 더욱 확고한 테스트가 되고, 제외자(outliers)에 저항이 있었다. 테스트된 간섭물의 각 농도에 대해 별도 플레이트에서 또는 단일 개별 플레이트에서 분석을 실행하였다. 두 개의 플레이트 조제물에 대해 동일한 결과를 수득하였다.

[표 39]

닭 사료에서 0, 50, 100, 200% (w/w)의 아밀로즈를 혼합하였을 때, MYCOSORB 생산물에 대해 수득한 OD450 평균 값

값의 차이는 일원 ANOVA에 의해 분석하였고, 그리고 95%의 신뢰 구간의 비교 통계 테스트를 나타낸다.

[표 40]

닭 사료에서 0, 50, 100, 200% (w/w)의 말토덱스트린을 혼합하였을 때, MYCOSORB 생산물에 대해 수득한 OD450 평균 값

값의 차이는 일원 ANOVA에 의해 분석하였고, 그리고 95%의 신뢰 구간의 비교 통계 테스트를 나타낸다.

[표 41]

닭 사료에서 0, 50, 100, 200%(w/w)의 글리코겐을 혼합하였을 때, MYCOSORB 생산물에 대해 수득한 OD450 평균 값

값의 차이는 일원 ANOVA에 의해 분석하였고, 그리고 95%의 신뢰 구간의 비교 통계 테스트를 나타낸다.

[표 42]

닭 사료에서 0, 50, 100, 200%(w/w)의 라미나린을 혼합하였을 때, MYCOSORB 생산물에 대해 수득한 OD450 평균 값

값의 차이는 일원 ANOVA에 의해 분석하였다.

[표 43]

닭 사료에서 0, 50, 100, 200%(w/w)의 RED STAR 와인 효모를 혼합하였을 때, MYCOSORB 생산물에 대해 수득한 OD450 평균 값

값의 차이는 일원 ANOVA에 의해 분석하였고, 그리고 95%의 신뢰 구간의 비교 통계 테스트를 나타낸다.

[표 44]

닭 사료에서 0, 50, 100, 200%(w/w)의 증류된 건조 낟알들을 혼합하였을 때, MYCOSORB 생산물에 대해 수득한 OD450 평균 값

값의 차이는 일원 ANOVA에 의해 분석하였고, 그리고 95%의 신뢰 구간의 비교 통계 테스트를 나타낸다.

상술한 명세서에서 언급된 모든 공개물 및 특허는 참고자료에 통합된다. 본 발명의 설명된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변이는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 당업계 숙련자들에게 자명할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 실시예들과 연관하여 설명하고 있지만, 청구되는 본 발명은 이러한 특이적 구체예들에 대해 지나치게 제한되어서는 아니 된다는 것을 이해해야만 한다. 또한, 탄수화물 화학, 미생물학, 동물 사료 및 영양 보급물, 면역학 또는 관련된 분야에 숙련자들에게 자명한 발명을 실행하기 위하여 설명된 방식들의 다양한 변형 또한 다음의 청구 범위 내에 있다.

Claims (43)

1. 시료 안에 효모 세포 벽 성분을 탐지하는 방법에 있어서,
   상기 방법은,
   - 가축 사료, 반려 동물 사료, 완전 혼합 사료(TMR), 먹이, 사료 펠렛, 사료 농축물, 사료 프레믹스 공동 생산물, 낟알, 증류 낟알, 당밀, 화이버, 꼴, 목초, 건초, 인, 잎, 체질하지 않은 굵은 가루, 가용성 사료 및 이의 추출물들로 구성된 군으로부터 선택된 음식 또는 사료의 시료를 제공하고,
   - (1→4)-α-D-글루칸, (1→6)-β-D-글루칸 및 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸으로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 1차 항체를 상기 1차 항체가 존재하는 경우에 상기 항원과 복합체를 형성하는 조건들 하에서 상기 시료에 접촉시키는 것을 포함하는 분석을 실행하고,
   - 2차 항체를 이용하여 1차 항체-항원 복합체를 탐지하며, 상기 1차 항체-항원 복합체를 탐지하는 것은 상기 시료 내의 효모 세포 벽 성분의 존재의 표시를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 유기 용매 및 산을 이용하여 상기 시료로부터 상기 추출물을 얻는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 디메틸술폭시드 및 염산을 이용하여 상기 시료로부터 상기 추출물을 얻는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2 항에 있어서, 실온 이상의 온도에서 상기 유기 용매 및 산으로 상기 시료를 항온 처리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 항온 처리는 75℃ 내지 85℃ 사이의 온도에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 1차 항체는 상기 항원에 단일 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 1차 항체는 다클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 2차 항체는, 효소, 형광 발생성 원료, 색원성 원료 그리고 방사능 동위 원소로 구성된 군으로부터 선택된 물질에 콘쥬게이트되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 2차 항체는 상기 1차 항체와 함께 복합체를 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 시료는 딱딱한 지지대에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 딱딱한 지지대는 다중웰 플레이트의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 시료 내에 (1→4)-α-D-글루칸, (1→6)-β-D-글루칸 또는 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸 성분의 존재를 결정하는 공정에 있어서,
    상기 공정은,
    - 가축 사료, 반려 동물 사료, 완전 혼합 사료(TMR), 먹이, 사료 펠렛, 사료 농축물, 사료 프레믹스 공동 생산물, 낟알, 증류 낟알, 당밀, 화이버, 꼴, 목초, 건초, 인, 잎, 체질하지 않은 굵은 가루 및 가용성 사료로 구성된 군으로부터 선택된 물질을 얻고,
    - 상기 시료를 형성하도록 산 추출, 알칼리 추출, 유기 추출, 물리적 프로세싱 또는 이의 조합을 통해 상기 물질로부터 추출물을 생성하는 것을 포함하는 방법에 의해 상기 시료를 만들도록 상기 물질을 처리하며,
    - (1→4)-α-D-글루칸, (1→6)-β-D-글루칸 및 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸으로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 1차 항체를 상기 1차 항체가 존재하는 경우에 상기 항원과 복합체를 형성하는 조건들 하에서 상기 시료에 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 시료에 면역학적 분석을 실시하고, 1차 항체-항원 복합체를 탐지하는 것은 상기 시료 내의 (1→4)-α-D-글루칸, (1→6)-β-D-글루칸 또는 (1→4)-α-/(1→6)-β-D-글루칸의 존재의 표시를 제공하는 것을 특징으로 하는 공정.
13. 제 1 항에 있어서, 상기 분석은 아밀로즈, 말토텍스트린, 클리코겐, 라미라닌, Red Star 효모, 증류 건조 낟알 그리고 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 상기 1차 항체-항원 복합체의 형성을 간섭할 수 있는 간섭의 존재에서 상기 1차 항체-항원 복합체를 탐지하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 삭제
37. 삭제
38. 삭제
39. 삭제
40. 삭제
41. 삭제
42. 삭제
43. 삭제

Images