CN102746403A - 用于elisa检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物、其制备方法及黄曲霉毒素elisa检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物、其制备方法及黄曲霉毒素ELISA检测方法。用于ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物，其特征在于：它为可识别各鼠源抗黄曲霉毒素单克隆抗体的兔抗鼠抗体。它是以鼠源抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体和抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体作为混合抗原，经免疫新西兰长耳大白兔，颈动脉取血，血清亲和纯化后获得。该标准品通用替代物无毒无害，可分别通过替代黄曲霉毒素ELISA检测方法中各相应黄曲霉毒素标准品来定量检测样品中的各相应黄曲霉毒素浓度。

Description

用于 ELISA 检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物、其制备方法及黄曲霉毒素 ELISA 检测方法

技术领域

本发明属黄曲霉毒素检测领域，具体涉及用于ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物、其制备方法及黄曲霉毒素ELISA检测方法。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉菌（Aspergillus flavs）、寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）和集蜂曲霉菌（Aspergillus nonius）产生的一组高毒和强致癌的次生代谢产物，主要有黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B₁，AFB₁），黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M₁，AFM₁），黄曲霉毒素G1（Aflatoxin G₁，AFG₁）。其广泛存在于各种农产品、食品和饲料中，严重污染花生、稻米、玉米、小麦等粮油产品，极大威胁人民的身体健康和生命安全。由于黄曲霉毒素对人类的潜在威胁日趋严重，世界上已有100多个国家对农产品食品中黄曲霉毒素的含量进行了严格的限量要求。因此迫切需要操作简单、快速、高通量的检测技术对污染物进行监控、检测。免疫学检测技术具有灵敏度高、样品前处理简单、操作方便的特点。其中酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）具有检测通量高、样品需要量少的优点，已广泛应用于食品及农产品中黄曲霉毒素的检测。由于ELISA法定量时需要竞争反应和标准曲线，检测过程中需应用大量黄曲霉毒素标准品进行质控，且检测不同的黄曲霉毒素需要不同的黄曲霉毒素标准品。并且，这些高毒强致癌物质的使用会对操作人员和环境带来极大的危害，且因价格昂贵、供应紧张，经常影响检测过程的进行。因此急需一种安全、低成本的ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物会大大降低检测过程的风险，简化检测步骤。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供用于ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物、其制备方法及黄曲霉毒素ELISA检测方法。该标准品通用替代物无毒无害，可分别通过替代黄曲霉毒素ELISA检测方法中的各相应黄曲霉毒素标准品来定量检测样品中各相应黄曲霉毒素浓度。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

用于ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物，其特征在于：它为可识别各鼠源抗黄曲霉毒素单克隆抗体的兔抗鼠抗体。

按上述方案，所述抗黄曲霉毒素单克隆抗体优选为抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体和抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体。

用于ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物的制备方法，其特征在于：它是以鼠源抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体和抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体作为混合抗原，经免疫新西兰长耳大白兔，颈动脉取血，血清亲和纯化后获得的。

按上述方案，所述的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO. C201014 的杂交瘤细胞株3G1分泌产生的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体3G1；所述的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体2C9，所述的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体1C8为由保藏编号为CCTCC NO. C201017的杂交瘤细胞株1C8分泌产生的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体1C8；所述抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体3G1，抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体2C9和抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体1C8为等摩尔量配比作混合抗原。

用于ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物在黄曲霉毒素ELISA检测中的应用。

黄曲霉毒素ELISA检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：

（1）采用常规间接竞争ELISA方法，将标准品通用替代物取代各黄曲霉毒素标准品，分别建立各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程a（x₁，y₁），

——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，y₁为抑制率；

（2）采用常规间接竞争ELISA方法，测定待测样品的抑制率；

（3）将步骤（2）得到的待测样品抑制率相应代入步骤（1）的曲线方程中，然后将计算得到的各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度结果代入各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度——，计算得到待测样品中各相应黄曲霉毒素的浓度。

按上述方案，所述步骤（3）为：相应结合各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA分析曲线方程a（x₁，y₁），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，y₁为抑制率——，和各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度——，得到：在标准品通用替代物做ELISA标准分析曲线下抑制率与各相应黄曲霉毒素浓度的曲线方程e（y₁，x₂），——y₁为抑制率，x₂为各相应黄曲霉毒素浓度；

将步骤（2）得到的待测样品抑制率代入上述曲线方程e（y₁，x₂），计算得到待测样品中各相应黄曲霉毒素的浓度。

按上述方案，所述步骤（3）中的各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度——，是采用以下方法得到的：

①采用常规间接竞争ELISA方法分别建立各相应黄曲霉毒素标准品的ELISA标准分析曲线方程c（x₂，y₂），——x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度，y₂为抑制率；

②采用常规间接竞争ELISA方法，将标准品通用替代物替代各相应黄曲霉毒素标准品，分别建立各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程d（x₁，y₁），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，y₁为抑制率；

③相应结合各相应黄曲霉毒素标准品分析曲线方程c（x₂，y₂）和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA分析曲线方程d（x₁，y₁），得到各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度。

所述各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂）是恒定不变的，在后续检测实验中无需重新建立。

按上述方案，所述步骤③为：相应结合各相应黄曲霉毒素标准品分析曲线方程c（x₂，y₂），——x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度，y₂为抑制率——，和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA分析曲线方程d（x₁，y₁），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，y₁为抑制率——，计算20%～80%的抑制率范围内同一抑制率所对应的各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度，然后以各相应黄曲霉毒素标准品浓度x₂为横坐标，各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度x₁为纵坐标，分别作图拟合而得到各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度。

按上述方案，所述的常规间接竞争ELISA法中抑制率的测定方法如下：取包被各黄曲霉毒素相应的黄曲霉毒素完全抗原的微孔包被板，加入各黄曲霉毒素相应的抗黄曲霉毒素单克隆抗体，然后加入待测样品或各相应黄曲霉毒素标准品或标准品通用替代物，反应后，洗涤液洗涤，加酶标记羊抗鼠二抗，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤后，加显色液，暗处静置后加终止液，在450 nm下测定光吸收值，根据待测孔光吸收值为B，对照孔的光吸收值为B₀，计算抑制率为B/B₀。

按上述方案，所述各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程d（x₁，y₁），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，y₁为抑制率——的建立中，各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度布设范围为0.4-100 μg/mL。

以待测样品中黄曲霉毒素B1测量为例，黄曲霉毒素B1的ELISA典型检测方法为：

（1）黄曲霉毒素B1标准品浓度和标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂）的建立，x₁为标准品通用替代物的浓度，x₂为黄曲霉毒素B1标准品的浓度；

（1.1）采用常规间接竞争ELISA方法建立黄曲霉毒素B1标准品的ELISA标准分析曲线方程c（x₂，y₂），——x₂为黄曲霉毒素B1标准品的浓度，y₂为抑制率；

（1.2）采用常规间接竞争ELISA方法，将标准品通用替代物取代黄曲霉毒素B1标准品，建立黄曲霉毒素B1相应的标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程d（x₁，y₁），——x₁为标准品通用替代物的浓度，y₁为抑制率；

（1.3）结合黄曲霉毒素B1标准品分析曲线方程c（x₂，y₂）和其相应的标准品通用替代物ELISA分析曲线方程d（x₁，y₁），计算20%～80%的抑制率范围内同一抑制率所对应的黄曲霉毒素B1标准品浓度和标准品通用替代物浓度，然后以黄曲霉毒素B1标准品浓度x₂为横坐标，标准品通用替代物浓度x₁为纵坐标，作图拟合而得相应的黄曲霉毒素B1标准品浓度和标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂），——x₁为标准品通用替代物的浓度，x₂为黄曲霉毒素B1标准品；

（2）采用常规间接竞争ELISA方法，将标准品通用替代物取代黄曲霉毒素B1标准品，建立黄曲霉毒素B1相应的标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程a（x₁，y₁），——x₁为标准品通用替代物的浓度，y₁为抑制率；

（3）结合标准品通用替代物ELISA分析曲线方程a（x₁，y₁），——x₁为标准品通用替代物的浓度，y₁为抑制率——，和黄曲霉毒素B1标准品浓度和标准品通用替代物浓度的换算方程b（x₁，x₂），——x₁为标准品通用替代物的浓度，x₂为黄曲霉毒素B1标准品的浓度——，得到在标准品通用替代物做ELISA标准分析曲线下抑制率与黄曲霉毒素B1浓度的曲线方程e（y₁，x₂），——y₁为抑制率，x₂为黄曲霉毒素B1浓度；

（4）采用常规间接竞争ELISA法，测定待测样品的抑制率；

（5）将步骤（4）得到的待测样品抑制率代入上述曲线方程e（y₁，x₂），计算得到待测样品中黄曲霉毒素B1的浓度。

在待测样品中黄曲霉毒素B1的首次检测中，步骤（2）中的标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程a（x₁，y₁）可直接采取步骤（1.2）得到的标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程d（x₁，y₁），无需重复。在后续检测分析中，因黄曲霉毒素B1标准品浓度和标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程是恒定不变的，可直接采用预先建立的黄曲霉毒素B1标准品浓度和标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂），而无需为获得黄曲霉毒素B1标准品浓度和标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程重新建立黄曲霉毒素B1标准品的ELISA标准分析曲线方程c（x₂，y₂），减少了黄曲霉毒素B1标准品使用环节，降低黄曲霉毒素B1标准品的使用对环境造成的危害，降低检测成本，简化操作步骤。其它黄曲霉毒素的分析检测亦如此。

传统的竞争性ELISA定量模式是基于样品中游离黄曲霉毒素与包被于酶标板上的固定黄曲霉毒素抗原竞争结合抗黄曲霉毒素单克隆抗体，样品中的游离黄曲霉毒素越多，与黄曲霉毒素单克隆抗体竞争结合越多，留在酶标板上与固定抗原结合的抗黄曲霉毒素单克隆抗体越少，则可结合在抗黄曲霉毒素单克隆抗体上的酶标二抗也越少，最终显色程度越弱。

本发明基于的工作模式为标准品通用替代物与酶标二抗竞争结合抗黄曲霉毒素单克隆抗体，标准品通用替代物越多，最终结合到抗黄曲霉毒素单克隆抗体上的酶标二抗就越少，显色反应时酶越少，显色程度越弱。由此可知，标准品通用替代物与黄曲霉毒素标准品之间存在着正相关的关系，只要探明二者之间量的对应关系，即可将标准品通用替代物替代黄曲霉毒素标准品进行ELISA分析曲线的校准，检测黄曲霉毒素含量。由于标准品通用替代物为黄曲霉毒素单克隆抗体的非标记二抗，其可识别各抗黄曲霉毒素单克隆抗体包括抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体和抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，因此该标准品通用替代物能够应用于基于各黄曲霉毒素的ELISA检测方法中包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1和抗黄曲霉毒素G1，具有通用性。

本发明的有益效果在于：

（1）该黄曲霉毒素的标准品通用替代物的本质是一种抗体，无毒，对人体无害，成本低；

（2）在黄曲霉毒素检测中，应用该标准品通用替代物进行ELISA分析曲线校准，减少了剧毒强致癌的各相应黄曲霉毒素标准品使用环节，有利于保护操作人员身体不受黄曲霉毒素标准品的侵害；降低各相应黄曲霉毒素标准品的使用对环境造成的危害；降低检测成本；

（3）基于该标准品通用替代物的ELISA检测方法具有通用性，可用于检测各种黄曲霉毒素，如黄曲霉毒素B1、G1和M1。

附图说明

图1 各相应黄曲霉毒素标准品ELISA标准分析曲线，图中：-■- AFB1；-▼-AFG1；-●- AFM1；

图2 各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA标准分析曲线，图中：-■- mab: 3G1；-▼-mab: 2C9；-●- mab: 1C8；

图3 黄曲霉毒素B1标准品浓度与标准品通用替代物浓度间的对应关系曲线；

图4 黄曲霉毒素G1标准品浓度与标准品通用替代物浓度间的对应关系曲线；

图5 黄曲霉毒素M1标准品浓度与标准品通用替代物浓度间的对应关系曲线。

具体实施方式

实施例1 标准品通用替代物的制备

1. 杂交瘤细胞株3G1，该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C201014。其筛选方法，抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备及其亚型特性如下：

（1）杂交瘤细胞株3G1的筛选

①抗原合成及动物免疫

购买市售黄曲霉毒素B1标准品进行完全抗原合成，具体合成步骤如下：将4 mg AFB1溶于2 mL丙酮，加入40 μL 10% H₂SO₄，混合物在56 ℃ 搅拌反应4 h；产物蒸干后，加入5 mL的H₂O，用25 mL氯仿提取两次，然后用20 mL H₂O洗涤有机层，保留有机层；蒸去有机溶剂，得黄色固体产物。取1.0 mg产物，向其中加入2 mL 0.5% BSA溶液（4 mL PBS（磷酸盐缓冲液，pH7.4）溶解20 mg BSA）37 ℃反应30 min；加入100 μL 6.5 mM NaBH₄，4℃反应30 min；加入50 μL 0.1M HCl，除去过量的NaBH₄。在4℃ 条件下，PBS溶液（磷酸盐缓冲液，pH7.4）透析3d，除去AFB1及AFB_2a，最后进行常规紫外扫描法鉴定，鉴定结果表明制备得到了黄曲霉毒素B1完全抗原AFB_2a-BSA。

购买6周龄雌性BALB/c小鼠6只，免疫自行合成的黄曲霉毒素B1完全抗原AFB_2a-BSA。第一次免疫将完全抗原AFB_2a-BSA与等量福氏完全佐剂混合乳化，然后小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于首免4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等体积完全抗原AFB_2a-BSA乳化，小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔时间4周，免疫方式及剂量与第二次相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式及免疫剂量与第二次免疫相同，每次免疫剂量为每鼠50μg。前3次每次免疫后一周，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价。第4次免疫后一周，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前的2倍。AFB1购于Sigma-Aldrich公司。

②细胞融合

最后一次加强免疫3天后，采用50%（重量百分数）的聚乙二醇即PEG（分子量为1450）作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤如下：

颈椎脱臼法处死免疫小鼠，在无菌条件下取脾脏，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5∶1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，然后用50%PEG融合，融合时间1分钟，然后加满RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用72mL RPMI-1640基础培养液重悬，将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置37℃二氧化碳培养箱培养，所述的RPMI-1640基础培养液为含有20%（体积百分数）胎牛血清，2%（重量百分数）生长因子和1%（重量百分数）次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷。上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有限公司；RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司；1%次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷（HAT）购于Sigma-Aldrich公司。

③细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后第12天左右，细胞集落长到占孔底1/2面积大小，培养液变黄，即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素B1而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用黄曲霉毒素B1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔（吸光值较高指竞争原为0的孔即阴性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC₅₀值较小），采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步法进行检测，如此重复克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株3G1。

（2）抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株系3G1抗体可变区序列测定

①提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株系3G1的总RNA；

②合成cDNA：以步骤1获得的总RNA 为模板，oligo (dT) ₁₅为引物，按照SuperScript^TM-2 Ⅱ反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo (dT) ₁₅ 由Invitrogen购得；

③PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃ 30s、55℃ 1min、72℃ 1min ，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％（重量百分数）的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5^，-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3^，（22mer）和5^，-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3^，（32mer）其中S、M、R和W为兼并碱基，M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，轻链可变区引物为5^，-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC -3^，（24mer）和5^，-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3^，（24mer）。

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长347bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由115个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长338bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由110个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:4所示。

（3）抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备、亚型及特性鉴定：

将抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株系3G1注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4 ℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株3G1分泌的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的亚型为IgG_2a。

用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得3G1的鼠腹水抗体的效价可达6.4×10⁶，即鼠腹水抗体稀释6.4×10⁶倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对黄曲霉毒素B1的灵敏度为1.6ng/mL，与黄曲霉毒素B2交叉反应率为6.4%，黄曲霉毒素G1与G2的交叉反应率均小于1%。

2. 杂交瘤细胞株1C8，该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C201017。其筛选方法，抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备及其亚型特性如下：

（1）杂交瘤细胞株1C8的制备

①抗原合成及动物免疫

购买市售黄曲霉毒素G1标准品，根据CN101270146.X中的具体实施方式的实施例1中公开的AFG1-BSA的合成方法进行AFG1-BSA完全抗原的合成；

购买6周龄雌性BALB/c小鼠6只，免疫自行合成的黄曲霉毒素G1完全抗原AFG1-BSA。第一次免疫将完全抗原AFG1-BSA与等量福氏完全佐剂混合乳化，然后小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于首免4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等体积完全抗原AFG1-BSA乳化，小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔时间4周，免疫方式及剂量与第二次相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式及免疫剂量与第二次免疫相同，每次免疫剂量为每鼠50μg。前3次每次免疫后一周，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价。第4次免疫后一周，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前的2倍。

②细胞融合

于最后一次加强免疫3天后，采用50%（重量百分数）的聚乙二醇即PEG（分子量为1450）作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5∶1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50%PEG融合，融合1分钟，然后加满RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用72mLRPMI-1640基础培养液重悬，将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置37℃二氧化碳培养箱培养，所述的RPMI-1640基础培养液为含有20%（体积百分数）胎牛血清，2%（重量百分数）生长因子和1%（重量百分数）次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT。上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有限公司；RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司；1%次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT购于Sigma-Aldrich公司。

③细胞株的筛选及克隆待细胞融合后第12天左右，细胞集落长到占孔底1/2大小，培养液变黄，即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素G1而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用黄曲霉毒素G1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔（吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC₅₀值较小），采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步法进行检测，如此重复克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株1C8。

（2）抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体杂交瘤细胞株系1C8抗体可变区序列测定

①提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株系1C8的总RNA；

②合成cDNA：以步骤1获得的总RNA 为模板，oligo (dT) ₁₅为引物，按照SuperScript^TM-2 Ⅱ反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo (dT) ₁₅ 由Invitrogen购得；

③PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃ 30s、55℃ 1min、72℃ 1min ，扩增 30 个循环，最后 72℃延伸 10min。PCR 产物经过1％（重量百分数）的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5^，-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3^，（22mer）和5^，-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3^，（32mer）其中S、M、R和W为兼并碱基，M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，轻链可变区引物为5^，-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC -3^，（24mer）和5^，-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3^，（24mer）。

得到的基因序列结果：轻链可变区编码基因序列长332bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由110个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。重链可变区编码基因序列长362bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由120个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:4所示。

（3）抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定

将实施例2获得的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体杂交瘤细胞株系1C8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株1C8分泌的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体的亚型为IgG_2a。

用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得1C8的鼠腹水抗体的效价可达8.19×10⁵，即鼠腹水抗体稀释8.19×10⁵倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对黄曲霉毒素G1的灵敏度（IC₅₀）为13.92ng/mL，与黄曲霉毒素B1，B2及M1没有交叉反应。

3. 标准品通用替代物的制备：

将鼠源抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体3G1、抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体2C9和抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体1C8等摩尔量混合，并用作混合抗原，采用常规方法免疫新西兰长耳大白兔，颈动脉取血，血清亲和纯化，所纯化的血清即为标准品通用替代物；

所述的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体3G1由保藏编号为CCTCC NO. C201014的杂交瘤细胞株3G1分泌产生，所述的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体2C9由保藏编号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生，所述的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体是由保藏编号为CCTCC NO. C201017的杂交瘤细胞株1C8分泌产生。

下述实施例2-4中：

所述包被缓冲液为：Na₂CO₃ 1.59 g，NaHCO₃ 2.93 g，加纯水定容至1 L。

所述OVA为卵清白蛋白。

所述PBST溶液为：KH₂PO₄ 0.2 g，KCl 0.2 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g，NaCl 8.0 g，0.5mL Tween-20，加纯水定容至1 L。

所述显色液为9.5 mL底物缓冲液 + 0.5 mL 底物使用液 + 32 μL 浓度为3%的双氧水

组成。

底物缓冲液为：Na₂HPO₄·12H₂O 1.841 g，C₆H₇O₈·H₂O 0.933 g溶于100 mL超纯水中。

底物使用液为：2 mg TMB溶解在100 mL无水乙醇中。

实施例2 花生样品中黄曲霉毒素B1的测定

（1）标准品通用替代物浓度和黄曲霉毒素B1标准品浓度的对应关系换算方程的建立

①黄曲霉毒素B1标准品ELISA标准分析曲线方程

首先用包被缓冲液稀释黄曲霉毒素B1完全抗原（AFB₁-OVA，2 μg/mL），加入酶标板中，每孔100 μL，4 °C过夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 μL 1.5% OVA水溶液作为封闭液，37 °C反应1 h。PBST洗板三次，每孔加入50 μL 抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液，再加入黄曲霉毒素B1标准品（2.4到600 pg/mL）。37 °C反应1 h后，PBST洗板三次，每孔加入100 μL商品化羊抗鼠酶标二抗，37°C反应1 h。PBST洗板六次，加入显色液反应15 min。加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应。在450 nm下测定光吸收值，待测孔光吸收值为B，无黄曲霉毒素B1标准品孔的光吸收值为B₀，抑制率为B/B₀。黄曲霉毒素B1标准品ELISA分析曲线见图1“-■-”部分，经非线性逻辑斯蒂回归拟合得黄曲霉毒素B1标准品ELISA标准分析曲线方程为：

y₂ = 75.78/[1 + (x_2/25.25)^2.37] + 15.89 方程（1）

其中y₂表示抑制率，x₂表示黄曲霉毒素B1浓度。

②标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程

用包被缓冲液稀释黄曲霉毒素B1完全抗原（AFB₁-OVA，2 μg/mL），加入酶标板中，每孔100 μL，4°C过夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 μL 1.5% OVA水溶液作为封闭液，37 °C反应1h。PBST洗板三次，每孔加入50 μL 抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液，再加入50 μL标准品通用替代物（0.4到100 μg/mL）。37 °C反应1 h后，PBST洗板三次，每孔加入100 μL商品化羊抗鼠酶标二抗，37° C反应1 h。PBST洗板六次，加入显色液反应15 min。加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应。在450 nm下测定光吸收值，待测孔光吸收值为B，无标准品通用替代物孔的光吸收值为B₀，抑制率为B/B₀。用标准品通用替代物替代黄曲霉毒素B1标准品，得到的标准品通用替代物ELISA标准分析曲线见图2中“-■-”部分，经非线性逻辑斯蒂回归拟合得标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程为：

y₁= 86.22 / [1 + (x₁/5.26)^1.23] + 12.92 方程（2）

其中y₁表示抑制率，x₁表示标准品通用替代物浓度。

③标准品通用替代物浓度和黄曲霉毒素B1标准品浓度的对应关系换算方程

根据方程（1）和方程（2），计算出20%～80%抑制率范围内同一抑制率所对应的黄曲霉毒素B1标准品浓度和标准品通用替代物浓度，间隔为5%抑制率。然后以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标，标准品通用替代物浓度为纵坐标作图，得到同一抑制率下黄曲霉毒素B1浓度和标准品通用替代物浓度的对应关系曲线，见图3，并经非线性逻辑斯蒂回归分析拟合得到标准品通用替代物浓度和黄曲霉毒素B1标准品浓度的对应关系方程：

x₁ = 98.26 / [1 + (x₂/115.97) ^−1.89] + 0.54 方程（3）

其中x₁表示标准品通用替代物浓度，x₂表示黄曲霉毒素B1浓度。

（2）花生样品中AFB₁浓度的测定

①在标准品通用替代物做标准曲线下，抑制率与黄曲霉毒素B1浓度曲线方程

根据方程（2）和（3）求出在标准品通用替代物做标准曲线下，抑制率与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线方程为：

y₁ = 86.22 / (1 + ((98.26 / (1 + (x₂/115.97) ^−1.89) + 0.54)/ 5.26) ^1.23) + 12.92 方程（4）

其中y₁表示抑制率，x₂表示黄曲霉毒素B1浓度。

②花生样品中AFB₁浓度的测定

称取5 g花生样品（记为1#）溶于15 mL 80%甲醇水溶液（含4% NaCl），漩涡30 s混匀，放于超声波振荡器中，50 °C水浴振荡15 min。取上清过0.45 μm有机滤膜。滤液用PBS稀释10倍，取50 μL上样作检测样品液。

用包被缓冲液稀释黄曲霉毒素B1完全抗原（AFB₁-OVA，2 μg/mL），加入酶标板中，每孔100 μL，4°C过夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 μL 1.5% OVA水溶液作为封闭液，37 °C反应1h。PBST洗板三次，每孔加入50 μL 抗AFB₁单克隆抗体溶液，再加入50 μL花生样品液。37 °C反应1 h后，PBST洗板三次，每孔加入100 μL商品化羊抗鼠酶标二抗，37° C反应1 h。PBST洗板六次，加入显色液反应15 min。加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应。在450 nm下测定光吸收值，待测孔光吸收值为B，无待测样品孔的光吸收值为B₀，计算出样品的抑制率。

将花生样品1#的抑制率值代入方程（4）中，求得花生样品1#中黄曲霉毒素B1浓度为15.6 µg/kg；采用农业部公布的标准方法NY/T 1286-2007检测所得花生样品1#中黄曲霉毒素B1浓度为14.3 µg/kg，两个结果的相对偏差符合标准规定的误差范围。

称取5 g花生样品2（记为2#）溶于15 mL 80%甲醇水溶液（含4% NaCl），漩涡30 s混匀，放于超声波振荡器中，50 °C水浴振荡15 min。取上清过0.45 μm有机滤膜。滤液用PBS稀释10倍，取50 μL上样作检测样品液。

根据如上花生样品1#的检测方法测得花生样品2#的抑制率并代入方程（4）中求得该花生样品2#中黄曲霉毒素B1的浓度为9.6 µg/kg；采用农业部公布的标准方法NY/T 1286-2007检测所得花生样品2#中黄曲霉毒素B1浓度为8.7 µg/kg，两个结果的相对偏差符合标准规定的误差范围。

实施例3 花生样品中黄曲霉毒素G1浓度的测定

（1）标准品通用替代物浓度和黄曲霉毒素G1标准品浓度的对应关系换算方程的建立

①黄曲霉毒素G1标准品ELISA分析曲线方程

首先用包被缓冲液稀释黄曲霉毒素G1完全抗原（AFG₁-OVA，2 μg/mL），加入酶标板中，每孔100 μL，4 °C过夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 μL 1.5% OVA水溶液作为封闭液，37 °C反应1 h。PBST洗板三次，每孔加入50 μL 抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶液，再加入黄曲霉毒素G1标准品（82.3到20000pg/mL）。37 °C反应1 h后，PBST洗板三次，每孔加入100 μL商品化羊抗鼠酶标二抗，37°C反应1 h。PBST洗板六次，加入显色液反应15 min。加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应。在450 nm下测定光吸收值，待测孔光吸收值为B，无黄曲霉毒素G1标准品孔的光吸收值为B₀，抑制率为B/B₀。黄曲霉毒素G1标准品ELISA标准分析曲线见图1“-▼-”部分，经非线性逻辑斯蒂回归拟合得黄曲霉毒素G1标准品ELISA标准分析曲线方程为：

y₂ = 79.52/[1 + (x₂/3150.46)^1.03] + 18.59 方程（5）

其中y₂表示抑制率，x₂表示黄曲霉毒素G1。

②标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程

用包被缓冲液稀释黄曲霉毒素G1完全抗原（AFG₁-OVA，2 μg/mL），加入酶标板中，每孔100 μL，4°C过夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 μL 1.5% OVA水溶液作为封闭液，37 °C反应1h。PBST洗板三次，每孔加入50 μL 抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶液，再加入50 μL标准品通用替代物（（0.4到100 μg/mL）。37 °C反应1 h后，PBST洗板三次，每孔加入100 μL商品化羊抗鼠酶标二抗，37° C反应1 h。PBST洗板六次，加入显色液反应15 min。加入50 μL 2 M硫酸终止反应。在450 nm下测定光吸收值，待测孔光吸收值为B，无标准品通用替代物孔的光吸收值为B₀，抑制率为B/B₀。用标准品通用替代物替代黄曲霉毒素G1标准品得到的标准品通用替代物ELISA标准分析曲线见图2“-▼-”部分，经非线性逻辑斯蒂回归拟合得标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程为：

y₁= 261.72 / [1 + (x₁/471.09)^0.37] − 149.45 方程（6）

其中y₁表示抑制率，x₁表示标准品通用替代物浓度。

③标准品通用替代物浓度和黄曲霉毒素G1标准品浓度的对应关系换算方程

再根据方程（5）和方程（6），将20%～80%抑制率范围内同一抑制率所对应的黄曲霉毒素G1浓度和标准品通用替代物浓度算出，间隔为5%抑制率。然后以黄曲霉毒素G1浓度为横坐标，标准品通用替代物浓度为纵坐标作图，得到同一抑制率下所对应的黄曲霉毒素G1浓度和标准品通用替代物浓度的对应关系曲线，见图4，并经非线性逻辑斯蒂回归分析拟合得到标准品通用替代物浓度和黄曲霉毒素G1标准品浓度的对应关系换算方程：

x₁ = 86.11 / [1 + (x₂/11200.22) ^−1.39] − 0.43 方程（7）

其中x₁表示标准品通用替代物浓度，x₂表示黄曲霉毒素G1浓度。

（2）花生样品中AFG1浓度的测定

①在标准品通用替代物做标准曲线下，抑制率与黄曲霉毒素G1浓度曲线方程

根据方程（6）和（7）求出在标准品通用替代物做标准曲线下，抑制率与黄曲霉毒素G1浓度的关系曲线方程为：

y₁ = 261.72/(1 + ((86.11/(1 + (x₂/11200.22) ^−1.39) − 0.43)/471.09) ^0.37) − 149.45 方程（8）

其中y₁表示抑制率，x₂表示黄曲霉毒素G1浓度。

②花生样品中AFG₁浓度的测定

称取5 g花生样品(记作1#)溶于15 mL 80%甲醇水溶液（含4% NaCl），漩涡30 s混匀，放于超声波振荡器中，50 °C水浴振荡15 min。取上清过0.45 μm有机滤膜。滤液用PBS稀释10倍，取50 μL上样作检测液。

用包被缓冲液稀释黄曲霉毒素G1完全抗原（AFG₁-OVA，2 μg/mL），加入酶标板中，每孔100 μL，4 °C过夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 μL 1.5% OVA水溶液作为封闭液，37 °C反应1h。PBST洗板三次，每孔加入50 μL抗 黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶液，再加入50 μL花生样品液。37 °C反应1 h后，PBST洗板三次，每孔加入100 μL商品化羊抗鼠酶标二抗，37° C反应1 h。PBST洗板六次，加入显色液反应15 min。加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应。在450 nm下测定光吸收值，待测孔光吸收值为B，无待测样品孔的光吸收值为B₀，抑制率为B/B₀，计算出样品的抑制率。

将花生样品1#的抑制率值代入方程（8）中，求出花生样品1#中黄曲霉毒素G1的浓度为4.2 µg/kg；采用国家质检总局公布的标准方法SN 0637-1997测定花生样品1#中黄曲霉毒素G1的浓度为3.9 µg/kg，两个结果的相对偏差符合标准规定的误差范围。

称取5 g花生样品（记作2#）溶于15 mL 80%甲醇水溶液（含4% NaCl），漩涡30 s混匀，放于超声波振荡器中，50 °C水浴振荡15 min。取上清过0.45 μm有机滤膜。滤液用PBS稀释10倍，取50 μL上样作检测液。

根据如上花生样品1#的检测方法测得花生样品2#的抑制率并代入方程（8）中计算，最终求得该花生样品2#中的黄曲霉毒素G1浓度为1.2µg/kg，采用国家质检总局公布的标准方法SN 0637-1997测定花生样品2#中黄曲霉毒素G1的浓度为1.1 µg/kg，两个结果的相对偏差符合标准规定的误差范围。

实施例4 牛奶样品中黄曲霉毒素M1浓度的测定

（1）标准品通用替代物浓度和黄曲霉毒素M1标准品浓度的对应关系换算方程的建立

①黄曲霉毒素M1标准品ELISA标准分析曲线方程

首先用包被缓冲液稀释黄曲霉毒素M1完全抗原（AFM₁-OVA，0.06 μg/mL），加入酶标板中，每孔100 μL，4 °C过夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 μL 1.5% OVA水溶液作为封闭液，37 °C反应1 h。PBST洗板三次，每孔加入50 μL 抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液，再加入黄曲霉毒素M1标准品（4.1到1000 pg/mL）。37 °C反应1 h后，PBST洗板三次，每孔加入100 μL商品化羊抗鼠酶标二抗，37 °C反应1 h。PBST洗板六次，加入显色液反应15 min。加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应。在450 nm下测定光吸收值, 待测孔光吸收值为B，无黄曲霉毒素M1标准品孔的光吸收值为B₀，抑制率为B/B₀。黄曲霉毒素M1标准品ELISA标准分析曲线见图1“-●-”部分，经非线性逻辑斯蒂回归拟合得黄曲霉毒素M1标准品ELISA标准分析曲线方程为：

y₂= 78.84/[1 + (x₂/121.97)^1.19] + 12.27 方程（9）

其中y₂表示抑制率，x₂表示黄曲霉毒素M1浓度。

②标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程

用包被缓冲液稀释黄曲霉毒素M1完全抗原（AFM₁-OVA，0.06 μg/mL），加入酶标板中，每孔100 μL，4 °C过夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 μL 1.5% OVA水溶液作为封闭液，37 °C反应1 h。PBST洗板三次，每孔加入50 μl 抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液，再加入50 μL标准品通用替代物（（0.4到100 μg/mL）。37 °C反应1 h后，PBST洗板三次，每孔加入100 μL商品化羊抗鼠酶标二抗，37 °C反应1 h。PBST洗板六次，加入显色液反应15 min。加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应。在450 nm下测定光吸收值, 待测孔光吸收值为B，无标准品通用替代物孔的光吸收值为B₀，抑制率为B/B₀。用标准品通用替代物替代黄曲霉毒素M1标准品的ELISA分析曲线见图2“-●-”部分，经非线性逻辑斯蒂回归拟合得标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程为：

y₁ = 133.42 / [1 + (x₁/61.81)^0.80] − 30.98 方程（10）

其中y₁表示抑制率，x₁表示标准品通用替代物浓度。

③标准品通用替代物浓度和黄曲霉毒素M1标准品浓度的对应关系换算方程的建立

根据方程（9）和方程（10），将20%～80%抑制率范围内同一抑制率所对应的黄曲霉毒素M1浓度和标准品通用替代物浓度计算出，间隔为5%抑制率。以黄曲霉毒素M1浓度为横坐标，标准品通用替代物浓度为纵坐标作图，得到同一抑制率下所对应的黄曲霉毒素M1浓度和标准品通用替代物浓度的对应关系曲线，见图4，并经非线性逻辑斯蒂回归拟合得到标准品通用替代物浓度和黄曲霉毒素M1标准品浓度的对应关系换算方程：

x₁ = 146.41 / [1 + (x₂/340.89) ^−1.30] + 3.22 方程（11）

其中x₁表示标准品通用替代物浓度，x₂表示AFM₁浓度。

（2）牛奶样品中AFM₁浓度的测定

①在标准品通用替代物做标准曲线下，抑制率与黄曲霉毒素M1浓度曲线方程

根据方程（10）和（11）求出在标准品通用替代物做标准曲线下，抑制率与黄曲霉毒素M1浓度的关系曲线方程为：

y₁ = 133.42/(1 + ((146.41/(1 + (x₂/340.89) ^−1.30) + 3.22)/61.81) ^0.80) − 30.98 方程（12）

其中y₁表示抑制率，x₂表示AFM₁浓度。

②牛奶样品中AFM₁浓度的测定

取20 mL牛奶样品(记作1#)加入50 mL离心管中，在3500 g下离心15 min，去掉上层油脂层，舍去下层沉淀物，取中间层，取50 μL上样检测。

用包被缓冲液稀释黄曲霉毒素M₁完全抗原（AFM₁-OVA，2 μg/mL），加入酶标板中，每孔100 μL，4 °C过夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 μL 1.5% OVA水溶液作为封闭液，37 °C反应1 h。PBST洗板三次，每孔加入50 μL抗黄曲霉毒素M₁单克隆抗体溶液，再加入50 μL牛奶样品液。37 °C反应1 h后，PBST洗板三次，每孔加入100 μL商品化羊抗鼠酶标二抗，37 °C反应1 h。PBST洗板六次，加入显色液反应15 min。加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应。在450 nm下测定光吸收值，待测孔光吸收值为B，无待测样品孔的光吸收值为B₀，抑制率为B/B₀，算出样品的抑制率。

将牛奶样品1#的抑制率值代入方程（12）中，求出牛奶样品1#中黄曲霉毒素M1的浓度为0.92 µg/kg；采用国家标准GB/T 23212-2008测得牛奶样品1#中黄曲霉毒素M1的浓度为0.95µg/kg，两个结果的相对偏差符合标准规定的误差范围。

取20 mL牛奶样品（记作2#）加入50 mL离心管中，在3500 g下离心15 min，去掉上层油脂层，舍去下层沉淀物，取中间层，取50 μL上样检测。

根据如上牛奶样品1#的检测方法测得牛奶样品2#的抑制率并代入方程（12）中计算，最终求得该牛奶样品中的黄曲霉毒素M1浓度为0.37 µg/kg；采用国家标准GB/T 23212-2008测得牛奶样品2#中黄曲霉毒素M1的浓度为0.34µg/kg，两个结果的相对偏差符合标准规定的误差范围。

上述实施例2-4皆是相应测定待测样品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素M1的首次实验。在后续检测中包括放置长时间后，因各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程恒定不变，无需重新建立。故具体步骤可直接简化为：建立各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程，然后相应结合各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程（如以样品中黄曲霉毒素B1测量为例，则该黄曲霉毒素B1标准品浓度和标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程见方程（3）），得到：在标准品通用替代物做ELISA标准分析曲线下，抑制率与各相应黄曲霉毒素浓度的曲线方程e（y₁，x₂），然后测定待测样品的抑制率值，相应代入上述方程计算即可得。

序列表

＜110＞ 中国农业科学院油料作物研究所

＜120＞ 用于ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物、其制备方法及黄曲霉毒素ELISA检测方法

＜160＞ 8

＜210＞ 1

＜211＞ 347bp

＜212＞ DNA

＜213＞ 小鼠

＜400＞ 1

tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccagtagtcc atagcccagt 50

aggccgatct tgcacagtaa tatgtggctg tgtcctcagt agtcacagaa 100

tttaactgca ggtagtactg gttcttggat gtgtctcgag tgatggagat 150

tcgactcttg agagatggat tgtagtaagg gttaccactg tagctcatga 200

accccatgta ctcaagttta ttcccaggga atttccggat ccagtgccag 250

taatcactgg tgatggagtc gccagtgaca gaacaggtga gggacagagt 300

ctgagaaggt ttcacgaggc taggtcctga ctcctgcagc tgcacct 347

＜210＞ 2

＜211＞ 338bp

＜212＞ DNA

＜213＞ 小鼠

＜400＞ 2

gacattgagc tcacccagtc tccaaaattc atgtccacat cagtaggaga 50

cagggtcagc atctcctgca aggccagtca ggatgtgggt actgatgtag 100

cctggtacgg agtccctgat cgcctcacag gcagtggatc tgggacagat 150

ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct gaagacttgg cagattattt 200

ctgtcaacaa tatagcagct atattcacgt tcggctcggg gacaaagttg 250

gaaataaaac gtttttgtgg agaggggcat gtcatagtcc tcactgtgtc 300

tcacgttcgg tgctgggacc aagctggagc tgaaacgg 338

＜210＞ 3

＜211＞ 115

＜212＞ PRT

＜213＞ 小鼠

＜400＞ 3

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr

1 5 10 15 20

Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Trp His Trp Ile Arg Lys Phe Pro

25 30 35 40

Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met Gly Phe Met Ser Tyr Ser Gly Asn Pro Tyr Tyr Asn Pro

45 50 55 60

Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Trp

85 90 95 100

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

105 110 115

＜210＞ 4

＜211＞ 110

＜212＞ PRT

＜213＞ 小鼠

＜400＞ 4

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser

1 5 10 15 20

Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Asp Val Ala Trp Tyr Gly Val Pro Asp

25 30 35 40

Arg Leu Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

45 50 55 60

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ile His Val Arg Leu Gly

65 70 75 80

Asp Lys Val Gly Asn Lys Thr Phe Leu Trp Arg Gly Ala Cys His Ser Pro His Cys Val

85 90 95 100

Ser Arg Ser Val Leu Gly Pro Ser Trp Ser

105 110

＜210＞ 5

＜211＞ 332bp

＜212＞ DNA

＜213＞ 小鼠

＜400＞ 5

ccgttttatt tccagcttgg tcccccctcc gaacgtgtaa gctccctaat 50

gtgctgacag taataggttg cagcatcctc ctcctccaca ggatggatgt 100

tgagggtgaa gtctgtccca gacccactgc cactgaacct ggcagggacc 150

ccagattcta ggttggatac aagatagatg aggagtctgg gtggctgtcc 200

tggtttctgt tggttccagt gcatataact atagccagat gtactgacac 250

ttttgctggc cctgtatgag atggcggccc tctgccccag agatacagct 300

aaggaagctg gagactgggt gagctcaatg tc 332

＜210＞ 6

＜211＞ 362bp

＜212＞ DNA

＜213＞ 小鼠

＜400＞ 6

aggtgcagct gcagcagtca ggacctgagc tggtgaggcc tgggacttca 50

gtgaagatat cctacaaggc ttctggctgt accttcctca cctactggat 100

gagctgggtg aagttgaggc ctgcacaggg ccttgagtgg attggacaga 150

tttttcctgc aggtggtagt gctaacttca atgagatttt cagggtcaag 200

gccacattga ctgtaggcac atcctccagt tcagcctaca tgcagctaat 250

cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcaa tttctgtgca agagaggagg 300

gcctattact atcttatggt agggacttct ggggccaagg gaccacggtc 350

accgtctcct ca 362

＜210＞ 7

＜211＞ 110

＜212＞ PRT

＜213＞ 小鼠

＜400＞ 7

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Ala

1 5 10 15 20

Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Thr Ser Tyr Met His Trp Asn

25 30 35 40

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser

45 50 55 60

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ale Ale Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg

85 90 95 100

Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Leu Asn

105 110

＜210＞ 8

＜211＞ 120

＜212＞ PRT

＜213＞ 小鼠

＜400＞ 8

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser

1 5 10 15 20

Tyr Lys Ala Ser Gly Cys Thr Phe Leu Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Lys Leu Arg Pro

25 30 35 40

Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ala Asn Phe Asn

45 50 55 60

Glu Ile Phe Arg Val Lys Ala Thr Leu Thr Val Gly Thr Ser Ser Ser Ser Ala Tyr Met

65 70 75 80

Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Asn Phe Cys Ala Arg Glu Glu Gly

85 90 95 100

Leu Leu Leu Ser Tyr Gly Arg Asp Phe Asn Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

105 110 115 120

Claims (11)

1.用于ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物，其特征在于：它为可识别各鼠源抗黄曲霉毒素单克隆抗体的兔抗鼠抗体。

2.根据权利要求1所述的用于ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物，其特征在于：所述抗黄曲霉毒素单克隆抗体为抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体和抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体。

3.根据权利要求1或2所述的用于ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物的制备方法，其特征在于：它是以鼠源抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体和抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体作为混合抗原，经免疫新西兰长耳大白兔，颈动脉取血，血清亲和纯化后获得的。

4.根据权利要求3所述的用于ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物的制备方法，其特征在于：所述的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO. C201014的杂交瘤细胞株3G1分泌产生的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体3G1；所述的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体2C9，所述的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体1C8为由保藏编号为CCTCC NO. C201017的杂交瘤细胞株1C8分泌产生的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体1C8；所述抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体3G1，抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体2C9和抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体1C8为等摩尔量配比作混合抗原。

5.用于ELISA检测黄曲霉毒素的标准品通用替代物在黄曲霉毒素ELISA检测中的应用。

6.黄曲霉毒素ELISA检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：

（1）采用常规间接竞争ELISA方法，将标准品通用替代物取代各黄曲霉毒素标准品，分别建立各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程a（x₁，y₁），

——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，y₁为抑制率；

（2）采用常规间接竞争ELISA方法，测定待测样品的抑制率；

（3）将步骤（2）得到的待测样品抑制率相应代入步骤（1）的曲线方程中，然后将计算得到的各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度结果代入各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度——，计算得到待测样品中各相应黄曲霉毒素的浓度。

7.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（3）为：相应结合各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA分析曲线方程a（x₁，y₁），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，y₁为抑制率——，和各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度——，得到：在标准品通用替代物做ELISA标准分析曲线下抑制率与各相应黄曲霉毒素浓度的曲线方程e（y₁，x₂），——y₁为抑制率，x₂为各相应黄曲霉毒素浓度；

将步骤（2）得到的待测样品抑制率代入上述曲线方程e（y₁，x₂），计算得到待测样品中各相应黄曲霉毒素的浓度。

8.根据权利要求6或7所述的黄曲霉毒素ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中的各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度——，是采用以下方法得到的：

①采用常规间接竞争ELISA方法分别建立各相应黄曲霉毒素标准品的ELISA标准分析曲线方程c（x₂，y₂），——x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度，y₂为抑制率；

②采用常规间接竞争ELISA方法，将标准品通用替代物替代各相应黄曲霉毒素标准品，分别建立各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程d（x₁，y₁），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，y₁为抑制率；

③相应结合各相应黄曲霉毒素标准品分析曲线方程c（x₂，y₂）和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA分析曲线方程d（x₁，y₁），得到各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度。

9.根据权利要求8所述的黄曲霉毒素ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤③为：相应结合各相应黄曲霉毒素标准品分析曲线方程c（x₂，y₂），——x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度，y₂为抑制率——，和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA分析曲线方程d（x₁，y₁），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，y₁为抑制率——，计算20%～80%的抑制率范围内同一抑制率所对应的各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度，然后以各相应黄曲霉毒素标准品浓度x₂为横坐标，各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度x₁为纵坐标，分别作图拟合而得到各相应黄曲霉毒素标准品浓度和各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物浓度的对应关系换算方程b（x₁，x₂），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，x₂为各相应黄曲霉毒素标准品的浓度。

10.根据权利要求6或7所述的黄曲霉毒素ELISA检测方法，其特征在于：所述的常规间接竞争ELISA法中抑制率的测定方法如下：取包被各黄曲霉毒素相应的黄曲霉毒素完全抗原的微孔包被板，加入各黄曲霉毒素相应的抗黄曲霉毒素单克隆抗体，然后加入待测样品或各相应黄曲霉毒素标准品或标准品通用替代物，反应后，洗涤液洗涤，加酶标记羊抗鼠二抗，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤后，加显色液，暗处静置后加终止液，在450 nm下测定光吸收值，根据待测孔光吸收值为B，对照孔的光吸收值为B₀，计算抑制率为B/B₀。

11.根据权利要求6或7所述的黄曲霉毒素ELISA检测方法，其特征在于：所述各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物ELISA标准分析曲线方程d（x₁，y₁），——x₁为各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度，y₁为抑制率——的建立中，各相应黄曲霉毒素标准品通用替代物的浓度布设范围为0.4-100 μg/mL。

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