KR101414413B1 - Marker for predicting survival in patients with early stage lung cancer and method for predicting survival using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후 예측과 유의적 상관관계를 갖는 특정 단일염기다형성(SNP)의 염기를 확인하여 폐암 생존 예후를 예측하는 방법, 상기 SNP를 확인할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후 예측용 조성물, 그리고 이를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a method for predicting survival prognosis of lung cancer by identifying a specific single nucleotide polymorphism (SNP) base having a significant correlation with the survival prognosis prediction of a patient who has undergone surgical resection of lung cancer, a polynucleotide capable of identifying the SNP, A composition for predicting the survival prognosis of a patient who has undergone surgical excision of lung cancer including a polypeptide or a cDNA thereof, and a microarray and a kit comprising the same.
Description
본 발명은 폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후 예측과 유의적 상관관계를 갖는 특정 단일염기다형성(SNP)의 염기를 확인하여 폐암 생존 예후를 예측하는 방법, 상기 SNP를 확인할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후 예측용 조성물, 그리고 이를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a method for predicting survival prognosis of lung cancer by identifying a specific single nucleotide polymorphism (SNP) base having a significant correlation with the survival prognosis prediction of a patient who has undergone surgical resection of lung cancer, a polynucleotide capable of identifying the SNP, A composition for predicting the survival prognosis of a patient who has undergone surgical excision of lung cancer including a polypeptide or a cDNA thereof, and a microarray and a kit comprising the same.
폐암은 전세계적으로 암으로 인한 사망의 주요 원인 중의 하나이다. 특히, 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)은 폐암의 약 85%를 차지하고 있으며, 지난 수십 년 동안 비소세포폐암의 진단 및 치료의 발전에도 불구하고, 여전히 폐암 진단 환자의 평균 5년 생존율이 15%에도 미치지 못한다. 또한, 절제 가능한 병기 비소세포폐암 환자 중에서도 상당수가 암의 재발로 인하여 사망하고 있다. 현재 종양 병기 분류법은 비소세포폐암의 예후를 예측할 수 있는 가장 좋은 지표로 여겨지고 있으나, 같은 병기의 환자라 할지라도 환자의 생존에 상당한 차이를 보이기 때문에 이러한 예후의 상이성을 설명하기에는 종양병기분류법이 적합하지 않다. 따라서 환자의 임상적 결과를 보다 잘 예측하고 특정 치료법에 효과적인 환자군을 선별할 수 있는 분자 바이오 마커를 찾으려는 연구가 수없이 행해지고 있으나, 아직까지 뚜렷한 연구 결과가 없는 실정이다.Lung cancer is one of the leading causes of cancer-related deaths worldwide. In particular, non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for approximately 85% of lung cancers, and despite the development of diagnosis and treatment of non-small cell lung cancer for decades, Survival rate is less than 15%. In addition, a large number of resectable stage non-small cell lung cancer patients die due to cancer recurrence. The current tumor stage is considered to be the best predictor of prognosis of non-small cell lung cancer, but even in patients with the same stage, there is a significant difference in the survival of patients. I do not. Therefore, there have been numerous studies to find molecular biomarkers that better predict the clinical outcome of a patient and select patients that are effective in a particular treatment regimen, but no studies have yet been conducted.
한편, 최근 완성된 인간 유전자 지도를 바탕으로 유전자의 다형성이 개개인의 외모, 지능, 성격 등을 결정할 뿐만 아니라 질병에 대한 감수성과 질병이 발생한 후 중증도와 진행속도 등을 결정할 것으로 예상되고 있으며, 인간 개개인의 특성이 다양한 만큼 그 특성을 결정하는 유전인자 또한 매우 다양할 것으로 예상되고 있다. 일반적으로 개체간의 유전적 차이는 개체간의 DNA 염기서열의 차이에 의해 초래되고 이러한 염기서열의 차이는 변이(mutation)와 다형성(polymorphism)으로 구분되는데, 다형성은 미세한 표현형의 차이(phenotypic change)를 초래하며 그 빈도가 인구의 1% 이상인 경우 다형성 유전형으로 정의된다.On the other hand, based on the recently completed human gene map, it is expected that the polymorphism of the gene not only determines the individual appearance, intelligence, personality, etc., but also determines the sensitivity and the speed of the disease after the susceptibility to the disease and the disease, It is expected that the genetic factors that determine its characteristics will vary widely as well. In general, genetic differences between individuals are caused by differences in DNA sequences between individuals, and differences in these sequences are classified into mutation and polymorphism. Polymorphism results in a minor phenotypic change And if the frequency is more than 1% of the population, it is defined as a polymorphic genotype.
단일염기다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)은 유전체(genome) 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 말한다. 이러한 SNP의 2/3는 염기서열 중 C와 T간의 변이인 것으로 알려져 있고, SNP 변이는 보통 유전체상의 염기서열에서 1000개당 한번 꼴로 나타난다고 알려져 있다. 또한 SNP은 인간의 유전체에서 발생하는 변이의 약 90%를 차지하고 있고, 비슷한 형질이나 같은 가계도를 가지고 있는 사람들은 동일하거나 또는 비슷한 SNP 패턴을 보이기 때문에 임상에서 개체의 질병에 대한 감수성(susceptibility)을 예측하는 지표로 사용될 수 있고, 약물에 대한 효과 및 부작용을 예측할 수 있는 지표로 사용될 수 있을 것이다. 나아가 개체의 유전적 특성에 적합한 진단 및 치료전략을 구사하는 맞춤의학(personalized medicine)에 이용될 수 있고, SNP의 패턴과 질병기록을 잘 통합할 수 있다면 여러 가지 질병의 치료를 위한 의료 통계를 구축할 수 있을 것이다.Single nucleotide polymorphism (SNP) refers to a change in one of the nucleotide sequences of A, T, C, and G in the genome to a different nucleotide sequence. Two-thirds of these SNPs are known to be mutations in the nucleotide sequence between C and T, and it is known that SNP mutations usually occur once per 1000 nucleotides in the genomic sequence. In addition, SNPs account for about 90% of mutations in human genomes, and people with similar traits or families have the same or similar SNP patterns, so clinical susceptibility to disease And can be used as an indicator for predicting the effects and side effects of drugs. In addition, it can be used for personalized medicine that provides diagnostic and therapeutic strategies suited to the genetic characteristics of an individual. If SNP patterns and disease records can be well integrated, medical statistics for treatment of various diseases can be constructed. You can do it.
따라서 최근 들어 이러한 유전자의 다형성을 이용한 질병들에 대한 감수성을 예측하고 진단하는 방법들이 개발되고 있으며, 특히 암과 관련된 유전자의 다형성과 암과의 연관성에 대한 연구들이 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 아폽토시스의 조절과 발생에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려진 카스파제(caspase, CASP) 유전자와 관련하여 CASP8 프로모터의 -652 6-뉴클레오티드(CTTACT) 결실 변이체(rs3834129, -652 6N del)는 CASP8 유전자의 발현을 감소시키고 다발성 암 위험과 관련이 있는 것으로 보고되었고 (Sun T, et al. Nat Genetic 39:605-13, 2007), CASP8 D302H (rs1045485G>C)와 IVS12-19G>A (rs3769818) 다형성에 관한 기능이 알려지지 않았지만 다양한 유형의 암 위험과 관련된 것으로 보고되었다(Macpherson G, et al. J Natl Cancer Inst 96:1866-9, 2004). 또한, 염색체 19q13.3 부위는 DNA 복구, 세포사멸, 세포분열 등과 관련된 유전자가 많이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 여기에 위치하는 rs1970764T>C (PPP1R13L IVS8-1435), rs11615G>A (ERCC1 N118N)) 등의 haplotype은 기저세포암, 유방암, 폐암의 위험도와 연관성이 있는 것으로 보고된 바 있다 (Yin J, Rockenbauer E, Hedayati M, et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 11:1449-1453, 2002; Nexo BA, Vogel U, Olsen A, et al. Carcinogenesis 24:899-904, 2003; Vogel U, Laros I, Jacobsen NR, et al. Mutat Res 546:65-74, 2004). In recent years, methods for predicting and diagnosing susceptibility to diseases using such polymorphisms have been developed. In particular, studies on the relationship between cancer-related polymorphisms and cancer have been actively conducted. For example, the -652 6-nucleotide (CTTACT) deletion mutant (rs3834129, -652 6N del) of the CASP8 promoter in association with the caspase (CASP) gene, which is known to play a crucial role in the regulation and development of apoptosis, (Rs1045485G> C) and IVS12-19G> A (rs3769818) were reported to be related to the risk of multiple cancers (Sun T et al. Nat Genetic 39: 605-13, 2007) Although the function of polymorphism is unknown, it has been reported to be associated with various types of cancer risk (Macpherson G, et al. J Natl Cancer Inst 96: 1866-9, 2004). In addition, the chromosome 19q13.3 region is known to contain a large number of genes related to DNA repair, apoptosis, and cell division, and rs1970764T> C (PPP1R13L IVS8-1435) and rs11615G> A (ERCC1 N118N) (Yin J, Rockenbauer E, Hedayati M, et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 11: 1449-1453, 2002; Nexo BA, Vogel et al. U, Olsena, et al., Carcinogenesis 24: 899-904, 2003; Vogeli, Laros I, Jacobsen NR, et al., Mutat Res 546: 65-74, 2004).
그러나 종래의 유전자의 SNP 다형성들은 주로 암에 대한 감수성을 진단하기 위한 용도로 연구되어 왔을 뿐, 유전자의 다형성이 암 환자의 생존 결과와 관련되는지에 대하여는 연구되지 않았다. 이에 본 발명자들은 유전자의 다형성이 수술로 폐암을 절제한 환자의 임상적 예후에 영향을 미칠 것이라는 가설을 세우고, 폐암을 수술로 절제한 초기 비소세포암 환자들을 대상으로 SNP 들과 환자 생존률과의 연관성을 분석한 결과, 환자 생존을 예측할 수 있는 바이오 마커를 찾아내어 본 발명을 완성하게 되었다.However, SNP polymorphisms of conventional genes have been studied mainly for the purpose of diagnosing susceptibility to cancer, and no study has examined whether the polymorphisms of the genes are related to the survival outcome of cancer patients. The present inventors hypothesized that the polymorphism of the gene would affect the clinical prognosis of patients who underwent surgical resection of lung cancer and the relationship between SNPs and patient survival in patients with early stage non-small cell carcinoma who underwent surgical resection of lung cancer As a result of the analysis, a biomarker capable of predicting patient survival was found and the present invention was completed.
본 발명의 하나의 목적은 폐암을 수술로 절제한 환자로부터 채취한 유전자 시료에 대하여 생존 예후와 유의적 상관관계를 갖는 특정의 SNP의 염기를 확인함으로써, 폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후를 예측하는 방법을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to identify the specific SNP bases that have a significant correlation with the survival prognosis of genetic samples collected from patients who have undergone surgical resection of lung cancer to determine the survival prognosis And to provide a method of predicting.
본 발명의 다른 하나의 목적은 특정의 SNP 마커를 확인할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는, 폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for predicting the survival prognosis of a patient who has undergone surgical resection of lung cancer, which comprises a polynucleotide, a polypeptide or cDNA thereof capable of identifying a specific SNP marker.
본 발명의 다른 하나의 목적은 특정의 SNP 마커를 확인할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는, 폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a microarray for predicting the survival prognosis of a patient who has undergone surgical resection of lung cancer, including a polynucleotide, a polypeptide or cDNA thereof capable of identifying a specific SNP marker.
본 발명의 다른 하나의 목적은 특정의 SNP 마커를 확인할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는, 폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for predicting survival prognosis of a patient who has undergone surgical resection of lung cancer, which comprises a polynucleotide, a polypeptide or cDNA thereof capable of identifying a specific SNP marker.
본 발명은 환자로부터 얻은 유전자 시료에 대하여, 염색체 19q13.3 중의 서열번호 1(NCBI refSNP ID: rs967591)로 표시되는 서열의 27번째 염기의 다형성을 확인하는 단계를 포함하는, 폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후의 예측 방법을 제공한다. The present invention relates to a method for screening a gene sample obtained from a patient, which comprises identifying a polymorphism of the 27th base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 (NCBI refSNP ID: rs967591) in chromosome 19q13.3 A method for predicting the survival prognosis of a patient is provided.
본 발명에서 제공하는 SNP 마커인 rs967591G>A 는, CD3EAP와 PPP1R13L 유전자의 프로모터 부위에 위치해 있으며, 그 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 표 1에서 SNP에 대한 NCBI의 refSNP ID는 해당 SNP의 서열 및 그 위치를 나타내는 것이다. 당업자라면 상기 번호를 이용하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있다. NCBI에 등록되어 있는 SNP의 refSNP ID에 해당하는 구체적인 서열은 계속되는 유전자에 대한 연구 결과에 따라 약간씩 변경될 수 있으며, 이러한 변경된 서열 또한 본 발명의 범위 내에 포함됨은 당업자에게 자명할 것이다.The SNP marker rs967591G> A provided in the present invention is located at the promoter region of the CD3EAP and PPP1R13L genes, and its sequence is shown in Table 1 below. In Table 1, the refSNP ID of the NCBI for the SNP indicates the sequence of the corresponding SNP and its position. Those skilled in the art can easily identify the position and sequence of the SNP using the above numbers. It will be apparent to those skilled in the art that the specific sequence corresponding to the refSNP ID of the SNPs registered in the NCBI may be varied slightly depending on the results of the study of the succeeding genes and such altered sequences are also included within the scope of the present invention.
gtgcgagcagcccgggctacagggtt [a / g] cctgaggtgtgggtcccaggatgga
본 발명에서, rs967591 AA 유전자형은 GG 또는 GA인 경우보다 나쁜 생존 결과와 관련이 있기 때문에, 환자의 시료에서 rs967591 AA 유전자형이 검출될 경우 생존 예후가 낮다고 예측될 수 있다.In the present invention, since the rs967591 AA genotype is associated with a worse survival outcome than that of GG or GA, the survival prognosis may be predicted when the rs967591 AA genotype is detected in the patient's sample.
본 발명자들은 폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후를 예측하기 위하여 염색체 19q13.3에 위치한 SNP와 초기 비소세포폐암 환자의 전체 생존 (OS; overall survival)과의 상관관계를 분석하고 SNP의 기능적 원인을 분석하였다.The present inventors analyzed the correlation between the SNP located on the chromosome 19q13.3 and the overall survival (OS) of patients with early stage non-small cell lung cancer in order to predict the survival prognosis of patients who underwent surgical resection of lung cancer, Respectively.
우선, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 유전자 연관성 연구에서 흔히 발생하기 쉬운 위양성 결과를 배제하기 위해 두 개의 독립적인 코호트를 발굴과 검증 단계로 분류해 분석을 진행하였다. 구체적으로, 환자 328명을 대상으로 생존율과 관련된 SNP를 발굴하였으며, 565명의 다른 환자군을 대상으로 검증하는 두 단계로 진행하였다. 또한 Liciferase 분석과 real-time PCR로 SNP의 기능성을 분석하였다. First, in a specific example of the present invention, two independent cohorts were classified into an excavation and verification step in order to exclude the false positive results that are often found in gene association studies. Specifically, SNPs related to the survival rate were extracted from 328 patients, and the two steps were performed to examine 565 different patient groups. In addition, SNP function was analyzed by liciferase analysis and real-time PCR.
1단계 연구 결과 3개의 SNP (rs105165C>T, rs967591G>A and rs735482A>C)가 수술을 실시한 비소세포폐암 환자의 OS와 강한 상관관계를 나타내었다. 이 중에서, rs967591A 대립유전자는 CD3EAP 유전자 프로모터의 활성을 높여 발현량을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, CD3EAP mRNA 발현량이 비악성 폐 조직에 비해 종양 조직이 현격히 높다는 것과, CD3EAP 발현량이 증가되는 유전형을 가진 환자의 OS가 좋지 않음을 확인하였다. In the first phase of the study, three SNPs (rs105165C> T, rs967591G> A and rs735482A> C) showed a strong correlation with the OS of patients with non-small cell lung cancer undergoing surgery. Among them, the rs967591A allele increased the activity of the CD3EAP gene promoter and increased the expression level. In addition, the CD3EAP mRNA expression level was significantly higher than that of the non-malignant lung tissue, and the OS of patients with the genotype with increased expression of CD3EAP was poor.
rs967591G>A는 2단계 연구에서도 연관성을 보여 주었는데, rs967591 AA 유전형은 OS가 나쁜 것으로 나타났으며 (adjusted hazard ratio = 1.69, 95% confidence interval = 1.29-2.20, P = 0.0001), rs967591G>A는 CD3EAP의 발현량을 변화시켜 초기 NSCLC의 OS에 영향을 주는 것으로 분석되었다. 이와 같이, rs967591G>A는 두 개의 코호트에서 모두 OS와 연관성이 있는 것으로 분석되었으며 관찰된 P-value도 통계적으로 신뢰할 만한 수준 (10-4)이었으므로, 이 SNP가 초기 비소세포폐암 환자의 생존과 관련되었다는 결과가 신뢰할 만한 것임을 알 수 있다. 또한, 이러한 결과는 rs967591G>A 유전형을 분석하면 예후가 좋지 않은 그룹을 분류해 치료 방법을 보다 세밀하게 조정하도록 도와줄 수 있다는 것을 의미한다.rs967591G> A showed a correlation in the second stage study. rs967591G> A showed poor OS (adjusted hazard ratio = 1.69, 95% confidence interval = 1.29-2.20, P = 0.0001) And the initial NSCLC was affected by the change of the expression level of NSCLC. Thus, rs967591G> A was associated with OS in both cohorts, and the observed P-value was also statistically reliable (10 -4 ), suggesting that this SNP is associated with survival of patients with early stage non-small cell lung cancer The results are reliable. These results also suggest that analysis of the rs967591G> A genotype may help to classify poor prognosis groups and to fine tune the treatment method.
따라서, 본 발명에서 확인된 SNP 마커 rs967591G>A는 폐암 환자의 생존율(OS)을 예측할 수 있는 조직학적 특이성을 가진 바이오 마커로 적용이 가능하다. 특히, 본 발명의 SNP 는 폐암 절제술을 받은 환자에 대한 생존을 예측하는 생체지표로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 SNP의 분석은 폐암 절제술에 효과가 있는 소그룹의 선별에 도움이 될 것이며, 초기 비소세포폐암 환자의 치료요법을 결정하는 데에도 도움이 될 수 있다.Therefore, the SNP marker rs967591G> A identified in the present invention can be applied as a biomarker having histological specificity for predicting the survival rate (OS) of lung cancer patients. In particular, the SNP of the present invention can be used as a biomarker for predicting the survival of patients undergoing lung cancer resection. Thus, the analysis of the SNPs of the present invention will be helpful in screening small groups that are effective in lung cancer resection and may also be helpful in determining treatment regimens for patients with early non-small cell lung cancer.
본 발명에서, 환자는 폐암이 발병한 환자를 의미한다. 상기 폐암은 바람직하게는 비소세포폐암이며, 선암 또는 편평세포암일 수 있다. 이들 폐암 환자로부터 획득한 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등으로부터 유전자 시료를 얻는데, 그 유전자 시료는 DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA를 포함한다.In the present invention, the patient refers to a patient suffering from lung cancer. The lung cancer is preferably non-small cell lung cancer and can be adenocarcinoma or squamous cell carcinoma. A gene sample is obtained from tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine obtained from these lung cancer patients. The gene sample includes cDNA synthesized from DNA, mRNA or mRNA.
본 발명에서 용어, "예후"는 폐암과 같은 신생물 질환의 예를 들어 발병, 재발, 전이성 확산, 및 약물 내성을 비롯한 폐암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 예후는 폐암 절제술에 따른 생존 예후를 의미하며, 바람직하게는 폐암 절제술로 1차 치료한 비소세포폐암 환자의 예후를 의미한다. 일반적으로 폐암 초기로 진단된 경우 광범위한 절제를 통한 완치를 치료의 목적으로 하나, 절제 가능한 병기 비소세포폐암 환자 중에서도 상당수가 암의 재발로 인하여 사망하고 있으며, 같은 병기의 환자라 할지라도 환자의 생존에 상당한 차이를 보이고 있다. 본 발명의 상기 방법을 이용하면 폐암 절제술에 대한 생존 예후를 손쉽게 예측할 수 있어, 추가 필요한 치료 방법의 사용 여부를 손쉽게 결정할 수 있다. 이로써 폐암 발병 후의 생존율을 현저히 높일 수 있다.The term "prognosis" in the present invention refers to the progression and cure of a disease, such as an onset, recurrence, metastatic spread, and the likelihood of lung cancer-induced death or progression, including drug resistance, . For the purpose of the present invention, the prognosis means the survival prognosis according to the resection of lung cancer, preferably the prognosis of patients with non-small cell lung cancer treated first with lung cancer resection. In general, the diagnosis of early stage lung cancer is based on extensive resection of the cure. However, a large number of resectable stage non-small-cell lung cancer patients die due to recurrence of cancer. There are significant differences. Using the method of the present invention, the survival prognosis for lung cancer resection can be easily predicted, and it is possible to easily determine whether or not to use additional necessary treatment methods. This can significantly increase the survival rate after the onset of lung cancer.
본 발명에서 용어, "예측"이란 환자가 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자의 치료 후 생존할 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 예측 방법은 폐암 발병 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 예측 방법은 환자가 예를 들어 소정 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정 치료 처방과 같은 치료 처방에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존이 가능한지 여부를 예측할 수 있다.As used herein, the term "prediction" relates to the likelihood and / or likelihood of a patient to survive after treatment, preferentially or non-preferentially, to a therapy. The predictive method of the present invention can be used clinically to make treatment decisions by selecting the most appropriate treatment regimen for patients with lung cancer. The predictive method of the present invention may also be used to confirm that a patient is preferentially responsive to treatment regimens, such as, for example, a prescribed treatment or combination, surgical intervention, chemotherapy, etc., Can be predicted as to whether or not long-term survival of the subject is possible.
본 발명은 또한 환자에 있어서의 폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후를 예측하기 위한 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for predicting the survival prognosis of a patient who has undergone surgical resection of lung cancer in a patient.
상기 조성물은 환자로부터 단리된 유전자 시료에 대하여, 염색체 19q13.3 중의 서열번호 1(NCBI refSNP ID: rs967591)로 표시되는 서열의 27번째 염기를 확인하기 위한 시약을 함유하는 것을 특징으로 한다.Characterized in that the composition contains a reagent for identifying the 27th base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 (NCBI refSNP ID: rs967591) in chromosome 19q13.3, with respect to the isolated gene sample from the patient.
본 발명의 조성물에 함유되는 시약은, 바람직하게는 염색체 19q13.3 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 27번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드이다.The reagent contained in the composition of the present invention is preferably a polynucleotide consisting of 10 or more consecutive bases comprising 27th base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 in chromosome 19q13.3 or a complementary polynucleotide thereof.
따라서, 본 발명은 일 양태로서 상기 폴리뉴클레오티드를 제공한다.Accordingly, the present invention provides the above polynucleotide as an embodiment.
본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 10개 이상, 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 20 내지 60개, 보다 더 바람직하게는 40 내지 60개의 연속 염기로 구성될 수 있다. The polynucleotide or its complementary polynucleotide according to the present invention may comprise more than 10, preferably 10 to 100, more preferably 20 to 60, even more preferably 40 to 60 contiguous bases have.
본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열(polymorphic sequenc)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위(polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다. 본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.The polynucleotide or its complementary polynucleotide according to the present invention is a polymorphic sequence. A polymorphic sequence refers to a sequence comprising a polymorphic site representing a single base polymorphism in the nucleotide sequence. A polymorphic site is a site in a polymorphic sequence where a single base polymorphism occurs. In the present invention, the polynucleotide may be DNA or RNA.
본 발명의 조성물에 함유되는 시약은, 바람직하게는 염색체 19q13.3 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 27번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이다.The reagent contained in the composition of the present invention is preferably selected from the group consisting of a polynucleotide consisting of 10 or more consecutive bases comprising the 27th base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 in chromosome 19q13.3 or a complementary polynucleotide thereof, And is a polynucleotide that hybridizes with a target.
따라서 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 일 양태로서 제공한다.Accordingly, the present invention provides, as an aspect, a polynucleotide that specifically hybridizes with the polynucleotide or a complementary polynucleotide thereof.
본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 대립형질 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드이다.In the present invention, a polynucleotide that specifically hybridizes with the polynucleotide or a complementary polynucleotide thereof is an allele-specific polynucleotide.
대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행된다. 예를 들어, 5xSSPE (750mM NaCl, 50mM Na Phosphate, 5mM EDTA, pH 7.4) 및 25 ~ 30℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다. Allele-specific polynucleotides are meant to specifically hybridize to each allele. That is, hybridization refers to hybridization so that the base of the polymorphic site present in the polymorphic sequence can be specifically discriminated. Here, hybridization is usually carried out under stringent conditions, for example, a salt concentration of 1 M or less and a temperature of 25 ° C or higher. For example, conditions of 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) and 25-30 [deg.] C may be suitable for allele-specific probe hybridization.
본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 대립 유전자 특이적 프로브일 수 있다. 즉, 본 발명에 있어서, 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 대립형질 특이적 프로브는 같은 종의 두 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에서 다형성 부위가 존재하여, 한 개체로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화 하나, 다른 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 프로브는 대립형질을 검출하여 폐암 생존 예후를 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 진단 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.In the present invention, the allele-specific polynucleotide may be an allele-specific probe. That is, in the present invention, a probe means a hybridization probe, and means an oligonucleotide capable of binding sequence-specifically to a complementary strand of a nucleic acid. The allele-specific probe of the present invention has a polymorphic site among nucleic acid fragments derived from two individuals of the same species, and hybridizes to a DNA fragment derived from one individual, but not to a fragment derived from another individual. In this case, the hybridization conditions show a significant difference in the hybridization intensity between the alleles, and should be sufficiently strict so that only one of the alleles hybridizes. Preferably, the probe of the present invention aligns with the polymorphic site of the polymorphic sequence. This can lead to good hybridization differences between different allelic forms. The probe of the present invention can be used for a diagnostic kit such as a microarray for predicting the survival prognosis of lung cancer by detecting alleles, a prediction method and the like.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 대립 유전자 특이적 프라이머일 수 있다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 폐암 생존 예후를 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 진단 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.In the present invention, the allele-specific polynucleotide may be an allele-specific primer. The appropriate length of the primer may vary depending on the purpose of use, but is generally comprised of 15 to 30 bases. The primer sequence need not be completely complementary to the template, but should be sufficiently complementary to hybridize with the template. The primer hybridizes to a DNA sequence containing a polymorphic site to amplify a DNA fragment containing the polymorphic site. The primer of the present invention can be used for a diagnostic kit such as a microarray for predicting the survival prognosis of lung cancer by detecting alleles, a prediction method and the like.
본 발명의 조성물에 함유되는 시약은, 바람직하게는 염색체 19q13.3 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 27번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이다.The reagent contained in the composition of the present invention is preferably a polynucleotide consisting of 10 or more consecutive bases comprising the 27th base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 in chromosome 19q13.3 or a complementary polynucleotide thereof Lt; / RTI >
따라서 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리펩티드를 일 양태로서 제공한다. 이러한 폴리펩티드는 폐암 생존 예후의 예측용 조성물, 폐암 생존 예후의 예측용 마이크로어레이 또는 키트 등에서 사용될 수 있다. 다르게는 상기 폴리펩티드를 대신하여 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 사용할 수 있다. 상기 항체로는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.Accordingly, the present invention provides, as an embodiment, a polypeptide encoding the polynucleotide. Such polypeptides may be used in compositions for predicting survival prognosis of lung cancer, microarrays or kits for predicting survival prognosis of lung cancer, and the like. Alternatively, an antibody to the polypeptide may be used in place of the polypeptide. The antibody is preferably a monoclonal antibody.
본 발명의 조성물에 포함되는 상기의 폴리뉴클레오티드, 이와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그에 의해 특이적으로 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA는 또한, 폐암 생존 예후의 예측용 마이크로어레이 또는 키트의 제조를 위한 용도로써 제공된다. 상기 마이크로어레이 또는 키트는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제작될 수 있다.The polynucleotide, the polynucleotide that specifically hybridizes with the polynucleotide, or the polypeptide specifically encoded by the polynucleotide or cDNA thereof contained in the composition of the present invention may also be used for the preparation of a microarray or kit for the prediction of the survival prognosis of lung cancer It is provided as an application. The microarray or kit may be prepared by conventional methods known to those skilled in the art.
본 발명에서 상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, cDNA 등을 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.In the present invention, the microarray may be a conventional microarray, except for including polynucleotides, polypeptides, cDNA, etc. of the present invention. The hybridization of nucleic acids on a microarray and the detection of hybridization results are well known in the art. The detection may be performed, for example, by labeling the nucleic acid sample with a labeling substance capable of generating a detectable signal including a fluorescent substance, such as Cy3 and Cy5, and then hybridizing on the microarray, The hybridization result can be detected.
본 발명에서 상기 키트는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, cDNA 등 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 일 양태로서, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 추가로 포함할 수 있다. 다른 일 양태로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 폐암 생존 예후 예측용 키트일 수 있으며, DNA 칩 키트는 상기 SNP 에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.In the present invention, the kit may include one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the analysis method as well as polynucleotides, polypeptides, cDNAs, etc. of the present invention. In one embodiment, the kit of the present invention may be a kit containing the necessary elements necessary to perform PCR, and may be a test tube or other suitable container, a reaction buffer (pH and magnesium concentrations vary), deoxynucleotides (dNTPs) Enzymes such as Taq polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitor, DEPC-water and sterile water. In another embodiment, the kit of the present invention may be a kit for predicting the survival prognosis of a lung cancer, which contains essential elements necessary for carrying out a DNA chip, and the DNA chip kit may include a polynucleotide, a primer or a probe specific for the SNP And the substrate may comprise a nucleic acid corresponding to a quantitation control gene or a fragment thereof.
본 발명의 SNP 의 유전자형의 확인은 시퀀싱 분석, 자동염기서열분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱 (pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법 (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법 (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법 (specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO (allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법 (rolling circle amplification), HRM (high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법에 의하여 수행될 수 있다. 나아가, 상기 SNP 다형성의 결과들은 당업계에서 일반적으로 사용되는 통계학적 분석 방법을 이용하여 통계처리 할 수 있으며, 예를 들면, 스튜던트 t-검정(Student's t-test), 카이-스퀘어 테스트 (Chi-square test), 선형 회귀선 분석(linear regression line analysis), 다변량 로지스틱 회귀분석 (multiple logistic regression analysis) 등을 통해 얻은 연속 변수 (continuous variables), 절대 변수 (categorical variables), 대응비 (odds ratio) 및 95% 신뢰구간 (confidence interval) 등의 변수를 이용하여 분석할 수 있다.The genotyping of the SNP of the present invention can be confirmed by sequencing analysis, sequencing analysis using an automatic sequencer, pyrosequencing, hybridization with a microarray, PCR-RELP (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP single strand conformation polymorphism (PCR), SSO (specific sequence oligonucleotide), ASO (allele specific oligonucleotide) hybridization method using PCR-SSO method and dot hybridization method, TaqMan-PCR method, MALDI-TOF / MS method, RCA method rolling circle amplification, HRM (high resolution melting), primer extension, Southern blot hybridization, dot hybridization, and the like. Further, the results of the SNP polymorphism can be statistically processed using statistical analysis methods commonly used in the art, such as Student's t-test, Chi- continuous variables, categorical variables, odds ratios, and 95% confidence intervals, obtained through linear regression analysis, linear regression line analysis, and multiple logistic regression analysis, % Confidence interval, and so on.
본 발명에서 확인된 SNP는 폐암 생존 예후를 예측할 수 있는 조직학적 특이성을 가진 바이오 마커로 적용이 가능하므로, 본 발명의 SNP를 분석함으로써 폐암이 발병한 환자에 대하여 손쉽게 환자의 예후를 평가하고, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화함으로써 폐암 발병 환자의 생존율을 높일 수 있다.Since the SNP identified in the present invention can be applied as a biomarker having histologic specificity for predicting the survival prognosis of lung cancer, the SNP of the present invention can be analyzed to easily evaluate the prognosis of patients with lung cancer, The targeting and evaluation of lung cancer can be increased and the survival rate of lung cancer patients can be increased.
도 1은 328명의 폐암 환자가 포함된 1단계 연구에서 사용된 염색체 19q13.3 부위에 있는 SNP들의 연관비평형(LD) 블록을 나타낸다. LD블록은 Gabriel 등 (Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, et al. Science 296:2225-2229, 2002)이 제안하는 방법을 사용하는 Haploview 프로그램으로 작성하였다. 삼각형은 haplotype 블록을 의미한다. 숫자의 자승은 |D'| (x 100)값이다.
도 2는 1단계 연구의 rs1005165C>T (A), rs967591G>A (B) rs735482A>C (C), rs3212986G>T (D) 와 rs11615G>A (E) 유전자형에 따른 전체 생존(OS)의 카프란-마이어 plot과 2단계 검증연구의 rs967591G>A (F) 유전자형에 따른 OS의 카프란-마이어 plot을 나타낸다. P-값, Log-Rank 테스트 (P-값은 A, B, C와 F: 변이형 대립유전자 열성 모델)
도 3은 rs967591G>A 가 CD3EAP 와 ERCC1의 mRNA 발현과 CD3EAP와 PPP1R13L의 전사 활성도에 미치는 효과를 나타낸다. (A)는 pGL3-CD3EAP와 pGL3-PPP1R13L을 집어넣은 H1299 세포를 Dual Luciferase Reporter Assay System을 이용해 전사 활성도를 측정한 것으로, rs967591A 유전형이 포함된 경우 rs967591G 유전형이 포함된 경우에 비해 CD3EAP의 전사 활성도가 크게 높아졌다 (P=0.002). 그러나, PPP1R13L의 전사 활성도는 rs967591G>A에 의해 바뀌진 않았다. 4회 반복 실험을 독립적으로 2회 실시한 후 얻어진 결과의 표준오차를 데이터로 제시하였다. (B) 내지 (D)는 CD3EAP와 ERCC1의 mRNA 발현량과 rs967591G>A 유전형 (27 GG, 51 GA, and 40 AA)과의 연관성을 118례의 종양과 비악성 폐조직 쌍에서 분석한 것으로, CD3EAP와 ERCC1 mRNA 발현 수준은 β-actin 유전자로 보정하였다. 박스 내 수평선은 평균값을 나타낸다; 박스 내 위쪽과 아래쪽의 경계는 각각 제1사분위수와 제3사분위수를 나타낸다; 위쪽과 아래쪽 바는 관찰된 가장 큰 값과 가장 작은 값을 각각 나타낸다. (B) CD3EAP와 ERCC1 발현 정도는 비악성 폐조직 보다 종양에 상당히 높아졌다 (P < 0.001 와 P=0.03, 각각). (C) 비악성 폐조직에서의 CD3EAP mRNA 발현정도는 rs967591 GG 또는 GA 유전자형보다 rs967591 AA 유전자형이 현격히 높았다. (D) 그러나 종양과 비악성 폐조직의 rs967591G>A 유전자형에 따른 ERCC1 mRNA 발현은 큰 차이가 없었다. (E)는 H1299의 CD3EAP 과발현에 따른 ERCC1 발현 변화를 분석한 것이다. 정상 CD3EAP와 변형 벡터를 H1299 세포에 집어 넣었다. ERCC1 mRNA 발현은 real-time RT-PCR로 분석하였으며 β-actin gene으로 보정하였다. CD3EAP 과발현은 FLAG 항체를 써서 Western blotting으로 확인했다. β-actin 항체는 내부보정물질로 사용했다.
도 4는 rs967591G>A유전자형에 따른 OS의 Kaplan-Meier plot을 나타낸다. (A)는 참조 모델이며, (B) 변이형 대립유전자 열성 모델을 나타낸다. P-값, Log-Rank 테스트.Figure 1 shows the association non-equilibrium (LD) block of SNPs at the chromosome 19q13.3 site used in Phase I studies involving 328 lung cancer patients. The LD block was constructed using the Haploview program using the method proposed by Gabriel et al. (Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, et al. Science 296: 2225-2229, 2002). A triangle represents a haplotype block. The square of a number is | D '| (x 100).
FIG. 2 is a graph showing the overall survival (OS) kappans according to rs1005165C> T (A), rs967591G> A (B) rs735482A> C (C), rs3212986G> T (D) and rs11615G> A - The Kaplan-Meier plot of the OS according to rs967591G> A (F) genotype in the Meyer plot and the two-step verification study. P-value, Log-Rank test (P-values are A, B, C and F: mutant allele thermolabile model)
Figure 3 shows the effect of rs967591G > A on mRNA expression of CD3EAP and ERCC1 and transcriptional activity of CD3EAP and PPP1R13L. (A) shows the transcriptional activity of H1299 cells harboring pGL3-CD3EAP and pGL3-PPP1R13L in the Dual Luciferase Reporter Assay System. Compared with the rs967591A genotype, (P = 0.002), respectively. However, the transcriptional activity of PPP1R13L was not altered by rs967591G> A. The data were presented as standard error of the results obtained after four independent experiments twice. (B) to (D) show the relationship between mRNA expression levels of CD3EAP and ERCC1 and rs967591G> A genotype (27 GG, 51 GA, and 40 AA) in 118 tumors and non-malignant lung tissue pairs. CD3EAP And ERCC1 mRNA expression levels were corrected with the β-actin gene. The horizon in the box represents the average value; The upper and lower bounds in the box represent the first quartile and the third quartile, respectively; The top and bottom bars represent the largest and smallest observed values, respectively. (B) The degree of expression of CD3EAP and ERCC1 was significantly higher in tumors than in non-malignant lung tissues (P <0.001 and P = 0.03, respectively). (C) CD3EAP mRNA expression level in non - malignant lung tissue was significantly higher than rs967591 GG or GA genotype in rs967591 AA genotype. (D) However, ERCC1 mRNA expression was not significantly different according to rs967591G> A genotype of tumor and non-malignant lung tissue. (E) is the analysis of ERCC1 expression change by CD3EAP overexpression of H1299. Normal CD3EAP and strain vectors were put into H1299 cells. ERCC1 mRNA expression was analyzed by real-time RT-PCR and corrected for β-actin gene. CD3EAP overexpression was confirmed by Western blotting using FLAG antibody. β-actin antibody was used as an internal calibrator.
Figure 4 shows a Kaplan-Meier plot of the OS according to rs967591G > A genotype. (A) is a reference model, and (B) represents a variant allele-recessive model. P-value, Log-Rank test.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
실시예Example 1. 환자 1. Patient
염색체 19q13.3 부위의 SNP와 NSCLC의 예후와의 상관관계를 분석하기 위해 2단계 연구를 진행하였다. 1단계 연구는 1998년 9월부터 2006년 12월 사이에 경북대학교병원 (대한민국, 대구)에서 절제술을 받은 NSCLC 환자 중 병리학적 병기가 I, II, IIIA (micro-invasive N2)인 328명을 대상으로 하였다. 이 연구에 포함된 대상환자에 대한 자세한 기록은 참고문헌 (Park JY, Lee WK. Jung DK, et al. Clin Cancer Res 15:1794-1800, 2009)에 개시되어 있다. 2단계 연구는 1997년 12월부터 2008년 10월 사이에 서울대학교병원 (대한민국, 서울)에서 절제술을 받은 NSCLC 환자 중 병리학적 병기가 I, II, IIIA (micro-invasive N2)인 565명을 대상으로 하였다. 본 연구는 경북대학교병원과 서울대학교병원의 기관심의위원회의 허가를 얻어 진행되었다.
Two-step study was conducted to analyze the correlation between the SNP of chromosome 19q13.3 and the prognosis of NSCLC. Among the NSCLC patients who underwent resection at Kyungpook National University Hospital (Daegu, Republic of Korea) between September 1998 and December 2006, 328 patients with pathologic stage I, II, IIIA (micro-invasive N2) Respectively. A detailed record of the patients involved in this study is provided in the reference (Park JY, Lee WK, Jung DK, et al. Clin Cancer Res 15: 1794-1800, 2009). The second-stage study included 565 patients with pathologic stage I, II, IIIA (micro-invasive N2) who underwent resection at Seoul National University Hospital between December 1997 and October 2008 Respectively. This study was conducted with the permission of Kyungpook National University Hospital and Seoul National University Hospital Institutional Review Board.
실시예Example 2. 유전자 다형성 선별 및 유전자형 분석 2. Genetic polymorphism screening and genotyping
PPP1R13L, CD3EAP, ERCC1 유전자에 포함된 기능적 변이를 모두 선별하기 위해 공공 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)를 이용하였고, 프로모터 부위, 인트론과 엑손의 경계를 포함한 모든 엑손, 3'-UTR 등을 그 대상으로 하였다. 5 SNP (rs1005165C>T [-7474 from PPP1R13L; or -905 from CD3EAP], rs967591G>A, rs735482A>C, rs3212986G>T [ERCC1 *197; or CD3EAP Q504K], and rs11615G>A)를 선택하여 1단계 연구를 진행하였다. 뉴클레오티드 치환과 SNP 고유번호는 도 1에 나타내었다. 선별한 SNP는 PCR-RFLP로 분석하였다.
A public database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP) was used to screen all functional mutations contained in the PPP1R13L, CD3EAP, and ERCC1 genes and all promoter regions, including the borders of introns and exons Exon, 3'-UTR, and the like. 5 SNPs (rs1005165C> T [-7474 from PPP1R13L; or -905 from CD3EAP], rs967591G> A, rs735482A> C, rs3212986G> T [ERCC1 * 197; CD3EAP Q504K], and rs11615G> A) The research was conducted. Nucleotide substitutions and SNP numbers are shown in FIG. The selected SNPs were analyzed by PCR-RFLP.
실시예Example 3. 프로모터- 3. Promoter - 루시퍼라제Luciferase 컨스트럭트Construct 및 And 루시퍼라제Luciferase 분석 analysis
rs967591가 CD3EAP 또는 PPP1R13L 유전자의 프로모터 활성도에 영향을 주는지 알아보기 위해 luciferase 분석법을 실시하였다. rs967591를 포함하는 CD3EAP 또는 PPP1R13L의 프로모터 부위를 PCR로 표 2에 나타난 프라이머를 사용해 증폭하였다. PCR 산물은 pGL3-basic 플라스미드 (Promega, Madison, WI, USA)의 NheI/BglII 부위에 삽입해 클로닝하였고, 염기서열 분석법으로 확인하였다. Effectene transfection reagent (Qiagen, Hiden, Germany)를 사용해 pRL-SV40 vector와 재조합 플라스미드를 H1299 세포 속으로 넣었다. 48시간 후 세포를 수집하였고 Promega의 방법에 따라 세포의 용해물을 준비하였다. Lumat LB953 luminometer (EG & G Berthhold, Bad Wildbad, Germany)로 luciferase 활성도를 측정하였으며, 측정결과는 Renilla luciferase의 활성도를 기준으로 보정하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.luciferase assay was performed to investigate whether rs967591 affects the promoter activity of CD3EAP or PPP1R13L gene. The promoter region of CD3EAP or PPP1R13L containing rs967591 was amplified by PCR using the primers shown in Table 2. < tb > < TABLE > The PCR product was inserted into the NheI / BglII site of the pGL3-basic plasmid (Promega, Madison, WI, USA) and cloned and sequenced. PRL-SV40 vector and recombinant plasmid were introduced into H1299 cells using Effectene transfection reagent (Qiagen, Hiden, Germany). After 48 hours, cells were collected and cell lysates were prepared according to the method of Promega. The luciferase activity was measured with a Lumat LB953 luminometer (EG & G Berthhold, Bad Wildbad, Germany) and the results were corrected based on the activity of Renilla luciferase. All experiments were repeated 3 times.
Promoter assay
Promoter assay
RT-PCR
RT-PCR
CD3EAP cloning
실시예Example 4. 4. RNARNA 제조 및 정량적 Manufacturing and Quantitative 역전사Reverse transcription -- PCRPCR ( ( qRTqRT -- PCRPCR ))
CD3EAP와 ERCC1 mRNA의 발현량은 qRT-PCR로 측정하였다. Trizol (Invitrogen, Carlsbad, USA)를 이용해 종양과 비악성 폐조직 (118례)으로부터 총 RNA를 추출하였다. QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen)을 이용한 real-time PCR은 LightCycler 480 (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)에서 수행하였다. Real-time PCR에 사용된 CD3EAP, ERCC1, β-actin 유전자의 프라이머는 표 2에 나타내었다. CD3EAP와 ERCC1 mRNA의 상대적 발현량은 β-actin mRNA의 발현량으로 보정하였으며 2ΔΔ Ct방법으로 계산하였다 (Livak KJ, Schmittgen TD. Methods 25:402-408, 2001).
Expression levels of CD3EAP and ERCC1 mRNA were measured by qRT-PCR. Trizol (Invitrogen, Carlsbad, USA) was used to extract total RNA from tumors and non-malignant lung tissue (118 cases). Real-time PCR using QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen) was performed on a LightCycler 480 (Roche Applied Science, Mannheim, Germany). Primers of CD3EAP, ERCC1, and β-actin genes used in real-time PCR are shown in Table 2. Relative expression level of CD3EAP and ERCC1 mRNA was corrected by the expression level of β-actin mRNA was calculated as 2 ΔΔ Ct method (Livak KJ, Schmittgen TD Methods 25 :. 402-408, 2001).
실시예Example 5. 5. CD3EAPCD3EAP 과발현 Overexpression
CD3EAP 전체 유전자를 표 2에 나타낸 프라이머를 사용해 증폭하였으며, p3XFlag-pCMV10 벡터 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)에 삽입하였다. CD3EAP가 ERCC1 발현을 억제하는지 확인하기 위해, CD3EAP 유전자를 포함한 p3XFlag-pCMV10를 H1299 세포에 집어 넣었다. 48시간 경과 후, ERCC1과 CD3EAP의 발현량을 real-time PCR과 Western blotting으로 측정하였다.
The entire CD3EAP gene was amplified using the primers shown in Table 2 and inserted into p3XFlag-pCMV10 vector (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). To confirm whether CD3EAP inhibits ERCC1 expression, p3XFlag-pCMV10 containing the CD3EAP gene was inserted into H1299 cells. After 48 hours, expression levels of ERCC1 and CD3EAP were measured by real-time PCR and Western blotting.
실시예Example 6. 통계 분석 6. Statistical Analysis
임상병리학적 요소들에 따른 유전형의 분포도 차이는 χ2 테스트로 비교하였다. SNP 간의 연관불균형 (linkage disequilibrium, LD)은 HaploView를 사용하여 측정하였다. Haplotype의 빈도는 Phase 프로그램을 이용해 베이지안 알고리즘을 기초로 분석하였다 (Stephens M, Smith MJ, Donnelly P. Am J Hum Genet 68:978-989, 2001). LD 블록은 Gabriel 등이 제안한 정의에 따라 해석하였다 (Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, et al. Science 296:2225-2229, 2002). 전체 생존 (overall survival, OS)은 수술을 한 날부터 사망일 혹은 최종 확인일로 정의하였다. OS와 유전형의 연관성은 Kaplan-Meier 방법으로 분석하였으며 log-rank 테스트로 평가하였다. 위험비 (Hazard ratios, HRs)와 95% 신뢰구간 (confidence intervals, CIs)은 나이, 성별, 흡연력, 병리학적 병기, 수술 후 치료 등으로 보정한 다변량 Cox 비례위험모형으로 측정하였다. 모든 통계분석은 SPSS, version 15.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)를 사용하였다.
Differences in the distribution of genotypes according to clinicopathological factors were compared by the χ 2 test. Linkage disequilibrium (LD) between SNPs was measured using HaploView. The frequency of haplotypes was analyzed based on Bayesian algorithm using Phase program (Stephens M, Smith MJ, Donnelly P. Am J Hum Genet 68: 978-989, 2001). LD block was interpreted according to the definition proposed by Gabriel et al. (Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, et al. Science 296: 2225-2229, 2002). The overall survival (OS) was defined as the day of death or the date of the last visit from the day of surgery. The relationship between OS and genotype was analyzed by Kaplan-Meier method and evaluated by log-rank test. Hazard ratios (HRs) and 95% confidence intervals (CIs) were measured using a multivariate Cox proportional hazards model adjusted for age, sex, smoking history, pathologic stage, and postoperative care. All statistical analyzes were done using SPSS, version 15.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).
실험결과Experiment result
1. 환자 특성 및 임상적 예측 변수1. Patient characteristics and clinical predictors
1단계와 2단계 연구에 사용된 환자의 임상적, 병리학적 특징과 OS의 연관성은 표 3에 나타내었다. 병리학적 병기와 OS와의 밀접한 연관성 (log-rank P [PL -R] < 0.001)은 1단계와 2단계 연구에서 모두 관찰되었다. 나이, 성과 OS와의 연관성 (PL-R for OS = 0.001 and 0.01; respectively)은 2단계 연구에서만 관찰되었다.Table 3 shows the relationship between the clinical and pathological characteristics of the patients used in the first and second stage studies and OS. The close association between pathologic stage and OS (log-rank P [P L -R ] <0.001) was observed in both the first and second studies. Age, and performance OS (P LR for OS = 0.001 and 0.01; respectively) were observed only in the second stage study.
2. 유전자형 빈도 및 전체 생존(2. Genotype frequency and overall survival OSOS )에 미치는 영향)
5 SNP의 유전형 분포도는 Hardy-Weinberg equilibrium으로 평가하였다. 5 SNP 모두 환자 관련 또는 암 관련된 요소들 (나이, 성별, 흡연력, 조직학적 분류, 병리학적 병기, 수술후 치료)과의 연관성을 보이지는 않았다. 5 genotype distribution of SNP was evaluated by Hardy-Weinberg equilibrium. 5 SNPs did not correlate with patient-related or cancer-related factors (age, sex, smoking history, histologic classification, pathologic stage, postoperative course).
변이형 대립유전자의 열성모델에 따라 분석 했을 때, 5 SNP 중 3 SNP (rs1005165C>T, rs967591G>A and rs735482A>C)는 OS와 밀접한 연관성 (log-rank P [PL-R] for OS = 0.005, 0.003, and 0.01, respectively)을 가지는 것으로 분석이 되었지만 2 SNP (rs3212986G>T and rs11615G>A) 는 OS와 연관성이 없는 것으로 밝혀졌다 (표 4 및 도 2). (Log-rank P [PL-R] for OS = 0.005) was found to be closely related to the OS when analyzed according to the recessive model of the mutant allele, 3 SNPs (rs1005165C> T, rs967591G> A and rs735482A> C) , 0.003, and 0.01, respectively), but 2 SNPs (rs3212986G> T and rs11615G> A) were found to be unrelated to the OS (Table 4 and Figure 2).
다섯 개의 SNP 중 rs1005165C>T, rs967591G>A 및 rs735482A>C, 및 rs3212986G>T 및 rs11615G>A는 강한 LD를 보였다 (도 1). 그래서 rs1005165C>T, rs967591G>A, rs735482A>C의 haplotype과 rs3212986G>T, rs11615G>A의 haplotype의 OS에 대한 연관성을 분석하였다. 추정된 haplotype과 OS와의 연관성은 표 5에 나타내었다. 각 유전형을 따로 분석한 결과처럼, 변이 유전형을 모두 포함한 rs1005165T-rs967591A-rs735482C haplotype의 경우 표준 유전형을 모두 포함한 rs1005165C-rs967591G-rs735482A haplotype의 경우보다 OS가 현격히 나빴다 (adjusted HR [aHR] for OS = 1.32, 95% CI = 1.03-1.70, P = 0.03). 뿐만 아니라, rs1005165T-rs967591A-rs735482C haplotype을 동형 (homozygous)으로 가진 환자의 경우 rs1005165T-rs967591A-rs735482C haplotype을 하나를 가지거나 하나도 가지지 않은 환자에 비해 현격히 나쁜 OS를 보였다 (aHR for OS = 1.91, 95% CI = 1.29-2.83, P = 0.001).Among the five SNPs, rs1005165C> T, rs967591G> A and rs735482A> C, and rs3212986G> T and rs11615G> A showed strong LD (Fig. 1). Thus, we analyzed the haplotype of rs1005165C> T, rs967591G> A, rs735482A> C and the haplotype of rs3212986G> T and rs11615G> A to OS. The relationship between the estimated haplotype and OS is shown in Table 5. As a result of analysis of each genotype separately, the rs1005165T-rs967591A-rs735482C haplotype including all variant genotypes was OS harder than the rs1005165C-rs967591G-rs735482A haplotype including all the standard genotypes (adjusted HR [aHR] for OS = 1.32 , 95% CI = 1.03-1.70, P = 0.03). In addition, patients with homozygous rs1005165T-rs967591A-rs735482C haplotype showed significantly poor OS (aHR for OS = 1.91, 95%) than patients with one or none of rs1005165T-rs967591A-rs735482C haplotype CI = 1.29-2.83, P = 0.001).
3. 3. rs967591Grs967591G >A 이 > A CD3EAPCD3EAP 및 And PPP1R13LPPP1R13L 프로모터 활성에 미치는 영향 Effect on promoter activity
rs1005165C>T, rs967591G>A, rs735482A>C가 매우 강력한 LD이기 때문에 어느 SNP가 질병과 관련된 기능적 역할을 하는 것인지 알아내기가 매우 어렵다. 이 문제를 해결하기 위해 Alibaba2와 PolyPhen을 이용해 3 SNP의 기능적 중요성을 예측해 보았다. Alibaba2를 이용해 전사인자의 결합부위를 분석하였을 때, rs967591G가 A로 바뀌면 ER 결합부위가 생성된다는 것을 알았다. 뿐만 아니라, PolyPhen을 이용한 분석에서는 rs735482A>C (CD3EAP Q504K)로 인해 기능적 변화가 발생할 것으로 예측하였다. PolyPhen 분석에서는 Q에서 K로 변화하는 것은 큰 영향을 주지 않을 수도 있는 것으로 분석하였다. 이러한 결과는 rs967591G>A가 기능적 변화를 일으키는 요인일 수 있다는 것을 의미한다. 그래서 rs967591G>A가 CD3EAP와 PPP1R13L 유전자의 프로모터 활성도에 미치는 영향을 luciferase 에세이로 분석하였다. rs967591A 대립유전형이 rs967591G 대립유전형에 비해 CD3EAP 유전자의 프로모터 활성도를 크게 증가시켰다 (P=0.002). 하지만 rs967591G>A에 따른 PPP1R13L 유전자의 프로모터 활성도는 크게 변하지 않았다 (도 3A).
Because rs1005165C> T, rs967591G> A, rs735482A> C is a very powerful LD, it is very difficult to determine which SNPs play a functional role in disease. To solve this problem, we used Alibaba2 and PolyPhen to predict the functional significance of three SNPs. When the binding site of transcription factor was analyzed using Alibaba2, it was found that when rs967591G was changed to A, an ER binding site was generated. In addition, the analysis using PolyPhen predicted that functional changes would occur due to rs735482A> C (CD3EAP Q504K). In the PolyPhen analysis, it was analyzed that the change from Q to K may not have a large effect. These results indicate that rs967591G> A may be a factor in causing functional changes. Thus, the effect of rs967591G> A on the promoter activity of CD3EAP and PPP1R13L genes was analyzed by luciferase assay. The rs967591A allele genotype significantly increased the promoter activity of the CD3EAP gene compared to the rs967591G allele genotype (P = 0.002). However, the promoter activity of PPP1R13L gene according to rs967591G > A did not change much (Fig. 3A).
4. 4. rs967591Grs967591G >A 이 > A CD3EAPCD3EAP mRNAmRNA 발현에 미치는 영향 Effect on expression
rs976591G>A 유전형이 CD3EAP 유전자의 발현과 관련이 있는지 살펴 보기 위해, 118례 (유전형 분포도: 27 GG, 51 GA, and 40 AA)에서 mRNA를 정량 분석하였다. 도 3B에 게시된 것처럼, CD3EAP mRNA 발현량은 비악성 조직보다 종양 조직에서 현격히 높았다 (P<0.001). 프로모터 활성도 분석 결과처럼, CD3EAP mRNA 발현량은 rs967591 GG 또는 GA 유전형보다 rs967591 AA 유전형에서 현격히 높게 관찰되었다 (P = 0.01, 도 3C). 그러나, 유사한 경향을 보이기는 했지만 mRNA 발현량과 유전형이 반드시 일치하지는 않았다 (P=0.31). 이러한 불일치는 분석에 사용된 암 조직내의 종양세포 분포도 차이에서 기인하는 것으로 추정된다.
mRNA was quantitatively analyzed in 118 cases (genotype distribution: 27 GG, 51 GA, and 40 AA) in order to examine whether the rs976591G> A genotype was associated with the expression of the CD3EAP gene. As shown in FIG. 3B, the expression of CD3EAP mRNA was significantly higher in tumor tissues than in non-malignant tissues (P <0.001). As a result of the promoter activity analysis, CD3EAP mRNA expression level was significantly higher in rs967591 AA genotype than in rs967591 GG or GA genotype (P = 0.01, Fig. 3C). However, mRNA expression and genotype did not necessarily agree with each other (P = 0.31). These discrepancies are presumed to be due to differences in the distribution of tumor cells within cancer tissues used for analysis.
5. 5. rs967591Grs967591G >A 이 > A ERCC1ERCC1 mRNAmRNA 발현에 미치는 영향 Effect on expression
CD3EAP 유전자는 ERCC1 유전자의 반대방향으로 위치하기 때문에, CD3EAP mRNA가 ERCC1의 발현을 저해하는 것으로 보인다. 그래서 CD3EAP와 ERCC1 mRNA 발현의 상관관계 뿐 아니라 rs967591G>A 유전형과 ERCC1 mRNA 발현량과의 상관관계를 분석하였다. 도 3B에 게시된 것처럼, ERCC1 mRNA 발현량은 비악성 폐 조직에 비해 현격히 높은 것으로 확인되었다 (P = 0.03). 그러나, ERCC1 mRNA 발현량과 rs967591G>A의 상관관계는 발견되지 않았다 (도 3D). 이러한 결과를 검증하기 위해 CD3EAP 유전자를 과발현시켜 ERCC1 발현량 변화를 관찰하였다. ERCC1 발현량은 CD3EAP 과발현에 큰 영향을 받지 않았으며 (도 3E), 이러한 결과는 rs967591G>A가 CD3EAP 발현량에는 영향을 주지만 ERCC1 발현에는 영향을 주지 않는다는 것을 의미한다.
Because the CD3EAP gene is located in the opposite direction of the ERCC1 gene, CD3EAP mRNA appears to inhibit ERCC1 expression. Therefore, we analyzed the correlation between CD3EAP and ERCC1 mRNA expression as well as the relationship between rs967591G> A genotype and ERCC1 mRNA expression level. As shown in FIG. 3B, the amount of ERCC1 mRNA expression was significantly higher than that of non-malignant lung tissue (P = 0.03). However, there was no correlation between ERCC1 mRNA expression level and rs967591G> A (FIG. 3D). In order to verify these results, the expression of ERCC1 was observed by overexpressing the CD3EAP gene. ERCC1 expression was not significantly influenced by CD3EAP overexpression (Fig. 3E), indicating that rs967591G > A affects CD3EAP expression but not ERCC1 expression.
6. 6. rs967591Grs967591G >A 과 생존 예후 간의 연관성에 대한 유효성 연구> Effectiveness of the association between A and survival prognosis
rs967591G>A와 생존과의 연관성을 검증하기 위해, 독립적인 샘플로 분석을 실시하였다. 1단계 연구의 결과처럼, rs967591G>A는 OS와 밀접한 연관성을 보였다 (도 2F). 변이형 대립유전자의 열성모델에서 두 단계 연구에서 HRs의 상이점을 발견할 수 없었다 (P-value of test for heterogeneity = 1.00; 표 6). 두 단계 연구를 종합 분석했을 때, rs967591 AA 유전형은 rs967591 GG 또는 GA 유전형에 비해 현격히 나쁜 OS를 보였다 (aHR for OS = 1.69, 95% CI = 1.29-2.20, P = 0.0001; 표 5와 도 4).rs967591G> In order to verify the relationship between A and survival, an independent sample was analyzed. As a result of Phase I study, rs967591G> A showed a close association with OS (Fig. 2F). No difference in HRs was found in the two-step study in the recessive model of variant alleles (P-value of test for heterogeneity = 1.00; Table 6). Compared to rs967591 GG or GA genotypes, the rs967591 AA genotype showed a significantly worse OS (aHR for OS = 1.69, 95% CI = 1.29-2.20, P = 0.0001; Table 5 and Figure 4) .
서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list
Claims (10)
염색체 19q13.3 중의 서열번호 1(NCBI refSNP ID: rs967591)로 표시되는 서열의 27번째 염기의 다형성을 확인하는 단계를 포함하는,
비소세포폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.For gene samples from patients,
Confirming the polymorphism of the 27th base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 (NCBI refSNP ID: rs967591) in chromosome 19q13.3.
Methods for providing information for predicting the survival prognosis of patients who underwent surgical resection of non - small cell lung cancer.
비소세포폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후 예측용 조성물.A polynucleotide consisting of 10 or more consecutive bases comprising the 27th base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 (NCBI refSNP ID: rs967591) in chromosome 19q13.3, or a complementary polynucleotide thereof.
A composition for predicting the survival prognosis of patients who underwent surgical resection of non - small cell lung cancer.
비소세포폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후 예측용 조성물. A polynucleotide comprising a probe or primer that specifically binds to the polynucleotide of claim 5,
A composition for predicting the survival prognosis of patients who underwent surgical resection of non - small cell lung cancer.
비소세포폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후 예측용 조성물. A polynucleotide comprising a polypeptide encoded by the polynucleotide of claim 5,
A composition for predicting the survival prognosis of patients who underwent surgical resection of non - small cell lung cancer.
비소세포폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이.A polynucleotide of claim 5, a probe or primer specifically binding thereto, or a polypeptide specifically encoded by the polynucleotide,
Microarray for predicting the survival prognosis of patients who underwent surgical resection of non - small cell lung cancer.
비소세포폐암을 수술로 절제한 환자의 생존 예후 예측용 키트.
12. A microarray comprising the microarray of claim 9,
A kit for predicting the survival prognosis of patients who underwent surgical resection of non - small cell lung cancer.
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| Lung Cancer. 2012.06., Vol. 76, No. 3, pp. 286-291. * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11756207B2 (en) | 2020-09-01 | 2023-09-12 | Research & Business Foundation Sungkyunkwan University | Apparatus and method for lesion analysis based on marginal feature |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20140058162A (en) | 2014-05-14 |
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