KR101394348B1 - 대사질환 또는 염증질환 치료 및 예방 효과가 있는 락토바실러스 플란타륨 ｄｓｒ920 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대사질환 또는 염증질환 치료 및 예방에 효과가 있는 신규 유산균에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지방세포의 분화를 억제시켜 지방 조직의 비대화를 억제하는 동시에, 염증성 사이토카인을 억제시켜 지방 조직의 만성적인 염증 반응으로 초래되는 인슐린 저항성을 개선시켜 비만 치료와 예방에 도움을 주고 궁극적으로 대사 증후군 질환의 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있는 신규 락토바실러스 플란타륨 DSR920 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물, 식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다.

Description

대사질환 또는 염증질환 치료 및 예방 효과가 있는 락토바실러스 플란타륨 ＤＳＲ920 및 이의 용도 {Lactobacillus plantarum DSR920 having effect of treatment and prevention of metabolic or inflammatory diseases}

본 발명은 대사질환 또는 염증질환 치료 및 예방에 효과가 있는 신규 유산균에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지방세포의 분화를 억제시켜 지방 조직의 비대화를 억제하는 동시에, 염증성 사이토카인을 억제시켜 지방 조직의 만성적인 염증 반응으로 초래되는 인슐린 저항성을 개선시켜 비만 치료와 예방에 도움을 주고 궁극적으로 대사 증후군 질환의 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있는 신규 락토바실러스 플란타륨 DSR920 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물, 식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다.

현대 사회에서 비만은 암보다 완치율이 낮은 질병으로 이로 인한 각종 성인병은 물론 이로 인한 사망률이 증가하고 있다. 미국에서는 "비만과의 전쟁"을 선포할 정도의 심각한 문제를 야기하고 있다.

지방 세포가 비대하여 내장 지방이 지나치게 축적되면, 고혈압이나 고지혈증, 당뇨병 등의 병의 용태가 복합적으로 발증하는 계기가 된다. 이들 병의 용태는 종합하여 대사 증후군이라고 불리고, 최근, 국민의 건강에 있어서 큰 문제이며, 그 대책이 급무로 되어 있다.

비만이 유도되면 내장 지방 조직의 이상을 초래하고 지방 조직에서, 아디포넥틴, 플라스미노겐 활성 인자 억제제(plasminogen activator inhibitor), 단구 화학주성 단백질-1 (MCP-1), 종양 괴사 인자(TNF-α), 렙틴 등의 내분비 인자를 분비하게 된다. 특히 단구 화학주성 단백질-1 (MCP-1), 종양 괴사 인자(TNF-α) 가 과다 분비 되면 대식세포와 같은 면역 세포들이 지방 조직에 침윤되고 단구 화학주성 단백질-1 (MCP-1), 종양 괴사 인자(TNF-α)외 인터루킨-6 (IL-6)과 같은 염증성 사이토카인의 발현을 증가 시킨다. 그 결과 지방 조직의 만성적인 염증이 발생되고, 만성적인 염증 반응은 인슐린 민감도를 감소시키고 글루코오스 내성을 유발시켜 당뇨 질환까지 발병하게 된다. [Winer, S. et al. 2009 : Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotheraphy. Nat. Med. 15: 921-929, Hotamisligil, G.S., N.S. shargill & B.M. Spiegelman. 1993. : Adipose expression of tumor necrosis factor-α:direct role in obesity-linked insulin resistance. Science 259:87-91] 따라서 지방 조직의 비대화와 염증 반응을 억제 시킴으로써 항 비만 효과를 기대할 수 있고 그 결과 항 대사 증후군에도 도움을 줄 수 있을 것이라고 예상 된다.

국내외에서 판매되는 비만치료제로는 미 FDA에서 승인을 받은 orlistat을 주원료로 하는 ‘제니칼’(한국로슈), sibutramine을 원료로 하는 ‘리덕틸’(일성신약), 그리고 녹차 카테콜 성분을 원료로 하는 ‘엑소리제’(구주제약) 등이 있다. 리파아제 작용을 억제하는 제니칼의 경우 지방변, 가스생성, 지용성비타민 흡수저하 등의 위장계 부작용을, 그리고 리덕틸의 경우에는 교감신경계의 세로토닌과 노르아드레날린 농도를 증가시킴으로써 두통, 구갈, 식욕부진, 불면, 변비 등의 부작용을 나타낸다. 이외에도 그동안 항비만 약제로 개발된 제품 중에는 심각한 부작용으로 인해 판매가 금지된 것들도 상당수에 이른다. 예를 들어, 아미노필린은 탁월한 체지방 분해효과에도 불구하고 정신신경계, 순환기계, 소화기계에 걸쳐 폭넓은 부작용이 보고된 바 있고, 펜프루라민, 덱스펜플루라민, 토피라메이, 에페드린 등도 비만치료 부적합 약물로 판정되어 판매가 금지되었다. 이와 같이 합성의약품의 부작용과 만성질환의 극복에 서양의학이 한계를 보임에 따라 천연물 식의약품에 대한 가치가 새롭게 부각되고 있다. 또한 비만 인구가 급격하게 증가되는 현 상황에서 치료제의 수요가 감소되는 현상이 일어나고 있으며, 이는 기존 약물에 대한 부작용과 효능에 대한 불만임을 감안할 때 이를 극복할 수 있는 새로운 기전의 비만치료제 개발이 절실한 상황이다.

따라서 지방세포 분화를 억제하고 염증 반응을 억제하는 유산균을 개발한다면 신규한 비만, 비만 합병증 또는 대사증후군의 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있게 될 것이다.

한편, 김치 유산균은 김치 발효에 관여하는 유산균으로서 면역증강, 항 미생물, 항산화, 항암효과, 항비만예방, 고혈압예방 또는 변비예방효과 등이 있는 것으로 보고되고 있다[Hivak P, Odrska J, Ferencik M, Ebringer L, Jahnova E, Mikes Z. : One-year application of Probiotic strain Enterococcus facium M-74 decreases Serum cholesterol levels. : Bratisl lek Listy 2005; 106(2); 67-72; Agerholm-Larsen L. Bell ML. Grunwald GK. Astrup A. : The effect of a probiotic milk product on plasma cholesterol : a metaanalysis of short-term intervention studies ; Eur J Clin Nutr. 2000; 54(11) 856-860; Renato Sousa, Jaroslava Helper, Jian Zhang, Strephen J Lewis and Wani O Li ; Effect of Lactobacillus acidophilus supernants on body weight and leptin expression in rats ; BMC complementary and alternative medicine. 2008; 8(5)1-8].

한국공개특허 제2011-0095929호는 지질의 체내 흡수를 방해하는 락토바실러스 루테리 균주에 대해 개시하고 있고, 한국특허 제0996577호는 저밀도지단백 수용체 증가를 통해 콜레스테롤의 세포 내 유입을 증가시킴으로써 혈중 콜레스테롤 강하와 비만을 억제하는 락토바실러스 커베터스에 대해 개시하고 있으며, 한국공개특허 제20110-0010015호 역시 총콜레스테롤을 감소시키고 저밀도지단백 수치를 저하시킴으로써 혈중 콜레스테롤 강하와 동시에 비만을 억제하는 락토바실러스 존소니에 대하여 개시하고 있다.

그러나 상기 유산균들은 지질의 흡수를 방해하거나 콜레스테롤의 세포 유입을 증가시킴으로써 비만을 억제하는 것으로, 지방세포의 분화를 억제시켜 지방 조직의 비대화를 억제하는 동시에, 염증성 사이토카인을 억제시켜 지방 조직의 만성적인 염증 반응으로 초래되는 인슐린 저항성을 개선시켜 비만 치료와 예방에 도움을 주고 궁극적으로 대사 증후군 질환의 예방 및 치료에 도움을 주는 유산균, 특히 김치 유산균에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 발명의 목적은 지방세포의 분화를 억제시켜 지방 조직의 비대화를 억제하는 동시에, 염증성 사이토카인을 억제시켜 지방 조직의 만성적인 염증 반응으로 초래되는 인슐린 저항성을 개선시키는 락토바실러스 플란타륨을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 플란타륨을 유효성분으로 하는 대사질환 또는 염증질환 치료 및 예방용 약학 조성물, 식품 조성물 및 사료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantrum) DSR920 [기탁번호: KCCM11210P]을 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantrum) DSR920 [기탁번호: KCCM11210P] 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 대사질환 또는 염증질환 치료 및 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 대사질환 또는 염증질환 치료 및 예방용 약학 조성물에서 상기 대사질환은 비만인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 대사질환 또는 염증질환 치료 및 예방용 약학 조성물에서 상기 약학 조성물은 지방세포의 분화를 억제하면서 면역 반응에 의한 TNF-α, IL-6 및 MCP-1 중에서 어느 하나 이상의 사이토카인의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 대사질환 또는 염증질환 치료 및 예방용 약학 조성물에서 상기 염증질환은 관절염, 류머티즘성 관절염, 류마티스성 다발성 근육통, 염증성 내장 질병, 궤양성 대장염, 크론(Crohn) 병, 뇌척수염, 수막염, 췌장염, 복막염, 골수염, 뇌염, 뇌막염, 비염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 맥관염, 임파구 맥락수막염, 사구체신염, 포도막염, 회장염, 간 염증, 신장 염증, 천식, 통증, 패혈성 쇼크, 패혈증, 궤양, 화상, 감염, 박테리아성 감염, 비루스성 감염, 진균성 감염 및 기생성감염 중에서 선택되는 어느 하나의 질환인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantrum) DSR920 [기탁번호: KCCM11210P] 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 대사질환 또는 염증질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantrum) DSR920 [기탁번호: KCCM11210P] 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 가축의 대사질환 또는 염증질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 신규 김치 유산균인 락토바실러스 플란타륨 DSR920은 지방세포의 분화를 억제시켜 지방 조직의 비대화를 억제하는 동시에, 염증성 사이토카인을 억제시켜 지방 조직의 만성적인 염증 반응으로 초래되는 인슐린 저항성을 개선시켜 비만 치료와 예방에 도움을 주고 궁극적으로 대사 증후군 질환의 예방 및 치료에 도움을 주고, 염증질환의 예방 및 치료에 효과가 있으므로, 대사질환 또는 염증질환 치료 및 예방용 약학 조성물, 식품 조성물 및 사료 조성물로 다양하게 이용될 수 있다.

도 1은 실험예 1의 지방전구세포를 배양하여 지방세포로 분화되는 과정에서 본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR920의 지방 분화 억제를 확인하기 위하여 오일-레드 O로 지방세포 내의 지방을 염색한 사진이다.
도 2는 실험예 1의 오일-레드 O로 염색된 세포 내 지방의 양을 분광분석기에 의해 상대적으로 비교한 그래프이다..
도 3은 실험예 2의본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR920에 의한 염증성 인자 MCP-1, TNF-α, IL-6의 발현 억제율을 나타낸 그래프이다.

본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR920 은 김치에서 분리된 것으로, 지방세포의 분화를 억제시켜 지방 조직의 비대화를 억제하는 동시에, 염증성 사이토카인을 억제시켜 지방 조직의 만성적인 염증 반응으로 초래되는 인슐린 저항성을 개선시켜 비만 치료와 예방에 도움을 주고 궁극적으로 대사 증후군 질환의 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있고, 염증질환의 치료 및 예방에 효과적이므로, 이를 유효성분으로 하는 약학 조성물, 식품 조성물 조성물 및 사료 조성물을 제조할 수 있다.

상기 약학 조성물, 식품 조성물 및 사료 조성물에 유효성분으로는 본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR920의 생균, 건조균 또는 배양물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액)등을 포함한다. 조성물 내 락토바실러스 플란타륨의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에서 락토바실러스 플란타륨DSR920을 유효성분으로 약학 조성물을 제조할 경우 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다.

상기 약학 조성물은 예를 들어, 락토바실러스 플란타륨 또는 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 또는 첨가제와 혼합하여 정제(tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다.

상기 담체로는 희석제, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 방부제 등을 사용할 수 있다. 구체적으로 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 바람직하다.

또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 향료, 비타민류, 항산화제 등을 사용할 수 있다. 예를들어, 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다. 이러한 제제화 방법 및 제제화시 필요한 담체 및 첨가제에 대해서는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세하게 기재되어 있다.

또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR920의 생균을 기준으로 1일 1 X 10 ⁵ 내지 1 X 10 ¹⁰CFU를 투여하는 것이 바람직하다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는 경구 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 락토바실러스 플란타륨DSR920 또는 이의 배양액은 건강기능식품을 포함하는 식품 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다. 상기 식품 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있고, 인간이 널리 통상적으로 매일 섭취하는 일반적인 식품 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR920 또는 이의 배양액은 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 건조물 또는 고형인 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 음료인 경우 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

식품 조성물에 이용될 경우 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제와 함께 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형 또는 일반 식품 형태로 제제화될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR920 또는 이의 배양액을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 음료 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로 사용되는 본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR920 또는 이의 배양액 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 락토바실러스 플란타륨 DSR920 또는 이의 배양액 이외에 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에서 락토바실러스 플란타륨 DSR920 또는 이의 배양액은 사료첨가제 또는 사료와 같은 사료 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.

사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다. 상기 사료 첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다. 상기 사료는 동물의 식이 욕구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 포함할 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분, 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

또한 사료 첨가제 또는 사료와 같은 사료 조성물은 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다.

또한 사료 첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

이하 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시 예는 본 발명의 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.

실시예 1: 락토바실러스 플란타륨 DSR920 분리 및 동정

통상적인 김치 제조방법으로 제조된 김치에서 유산균을 분리하였다. 김치시료를 0.85 % 식염수로 10 배 희석하였고, 0.1 ㎖씩 MRS 아가 배지(MRS 아가, 디프코(Difco.); 박토 펩톤 10 g, 소고기추출물 10 g, 효모추출물 5 g, 글루코스 20 g, 트윈 801 g, 구연산 2 g, 제2 인산칼륨 2 g, 초산나트륨 5 g, 황산망간 0.1 g, 황산마그네슘 0.05 g, 아가 15 g/증류수 1 ℓ)플레이트에 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 이후, 플레이트를 37 ℃의 항온 배양기에서 1일 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 MRS 아가 플레이트에 획선 접종하였고, 37 ℃에서 1일 동안 배양하여 유산균 콜로니를 분리하였고, 본 발명의 균주는 상기 분리된 유산균 중에서 지방세포 분화억제능과 항염증 활성이 뛰어난 균주를 선정한 것이다.

본 발명의 유산균 균주의 동정 및 분류를 위한 16S rRNA유전자의 염기서열을 분석하였다. Genomic DNA를 분리하여 16S ribosomal DNA 부분을 증폭하여 증폭된 DNA단편을 전기영동으로 확인하였다. DNA 단편을 Qiagen PCR purification kit (Giagen,Hilden,Germany)으로 정제하여 d-Rhodamine dye-labeling dd-NTP를 포함하는 반응액과 혼합하여 sequencing PCR을 한 후 얻어진 DNA를 Ethanol/Sodium acetate 침전법을 이용하여 정제하였다. 정제한 DNA를 TSR(Template Suppression Reagent)에 녹여 ABI prism 310 Genetic Analyzer(PE AppliedBiosystems, U.S.A)로 분석하고 분석된 염기서열은 Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 이용하여 동정하였다.

본 발명의 유산균 균주의 16S rRNA 염기서열(서열번호 1)은 분석 결과 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum)과 가장 높은 상동성(99 %)을 나타내었다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 균주를 락토바실러스 플란타륨 DSR920으로 명명하고 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2011년 10월 6일자로 기탁하였다[기탁번호: KCCM11210P].

실험예 1: 마우스 지방세포주(3 T3 - L1 )를 이용한 지방세포 분화 억제 효과

락토바실러스 플란타륨 DSR920이 지방세포의 분화 및 성장에 미치는 영향을 평가하기 위해 마우스 지방 세포주(3T3-L1, ATCC, 미국)을 사용하였다. 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 6-웰 플레이트에 분주하고 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Gibco, 미국), 10% 우태아혈청(fatal bovine serum, Gibco, 미국)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 콘플루언트(confluent) 한 상태로 자랄 때까지 배양시켰다.

콘플루언트 한 상태로 자란 3T3-L1 세포를 MDI(0.5 mM 이소부틸-메틸잔틴(isobutyl-methylxanthine, 씨그마-알드리치, 미국), 1 μM 덱사메타손(dexamethason, 씨그마-알드리치, 미국), 그리고 1 ㎍/㎖ 인슐린, (Insulin씨그마-알드리치, 미국)이 첨가된 배양액 에서 이틀간 배양하여 분화된 지방세포(differentiation adipocyte)로 만든 후, 1 ㎍/㎖ 인슐린을 포함하는DMEM 배양액에서 이틀간 더 배양시키면서 성숙한 지방세포(mature adipocyte)로 분화시켰다.

그 후에는 이틀 간격으로 DMEM 배양액을 교체하면서 10일간 더 배양하여 완전히 분화된 지방세포(fully differentiatedadipocyte)를 형성시켰다. 3T3-L1세포에 MDI를 첨가하여 분화시키는 첫 날부터 이틀 동안 락토바실러스 플란타륨 DSR920을 10⁹ CFU/ml의 농도로 처리하였다. 락토바실러스 플란타륨 DSR920은 DMEM 배지에 희석하여 사용했으며, DMEM 배지만 첨가한 음성대조군을 실험에 포함시켰다.

총 14일간 배양하여 분화가 완성된 시점에 배양액을 제거하고 분화된 지방세포에 함유된 지방구를 염색하였다. 이를 위해 PBS(phosphate buffered saline)로 세포를 2회 세척한 후 10% 포르말린(10% formalin, 시그마-알드리치, 미국)으로 세포를 1시간 고정하고 다시 PBS로 1회 세척한 후, 지방을 특이적으로 붉게 염색시키는 오일-래드-O 다이(Oil-red-O dye, 시그마-알드리치, 미국) 2 ㎖를 6-웰 플레이트에 가하여 5분 동안 지방구를 염색하고 증류슈로 4회 세척하였다. 분화된 3T3-L1 세포에 함유된 중성지방농도를 측정하기 위해 염색된 지방구를 2 ㎖의 이소프로판올에 녹인 후, 520 nm에서 O.D. 값을 측정하였다.

도 1의 (a)는 지방세포로 분화하기 전의 지방전구세포의 사진이고(ND), 도 1의 (b)는 MDI를 첨가하면서 본 발명의 DSR920 대신 DMEM 배지만 첨가한 음성대조군의 사진이며(MDI), 도 1의 (c)는 MDI와 함께 본 발명의 DSR920 균주를 첨가한 플레이트의 지방세포 사진이다(DSR920). 도 1의 (b)와 (c)를 비교하면 본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR920은 지방전구세포의 분화를 유의하게 감소시켜 사진에서 붉게 염색된 지방세포의 지방구가 감소됨을 확인할 수 있었다.

또한 상기 각 군에서 오일-레드-O로 염색된 세포내 지방의 양을 분광분석기(spectrophotometry, Versamax, MDS Analytical Technology, 미국)에 의해 정량한 결과를 분화전 지방전구세포의 지방 함량을 100%로 하여 상대 백분율로 도 2에 나타내었다. MDI 처리로 151%까지 증가되었던 지방 함량이 분화전의 지방전구세포와 동등한 량으로 감소되었음을 확인하였다.

실험예 2: 염증 억제 효과

마우스 단핵구/대식세포 세포주, RAW 264.7(ATCC TIB-71)는 염증 반응을 조사하기 위한 리포터 세포로 이용하였다. RAW264.7세포를 96-웰 플레이트에 대략 2 x 10⁵세포를 분주하고 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Gibco, 미국), 10% 우태아혈청(fatal bovine serum, Gibco, 미국)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 안정화 시켰다. 안정화시킨 RAW 264.7 세포에 락토바실러스 플란타륨 DSR920을 10⁹ CFU/ml의 농도로 24시간 동안 처리한 후 대장균(E. coli) 혈청형 0127:B8의 정제된 LPS(시그마-알드리치, 미국) 0.5㎍/㎖의 농도로 4시간 동안 노출시켰다.

세포 배양 상층액에서 MCP-1, TNF- α, IL-6의 존재는 샌드위치 효소 면역분석법, (Duoset, R & D Systems, 미국)로 측정하였다. 락토바실러스 플란타륨 DSR920의 전 처리하여LPS-활성화된 대식세포의 MCP-1, TNF-α, IL-6 생산 억제를 확인하였다.

도 3에서는 LPS 단독과 비교하여 락토바실러스 플란타륨DSR920 균주에 의해 MCP-1, TNF-α, IL-6의 발현이 억제됨을 보여주었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1: 정제의 제조

락토바실러스 플란타륨 DSR920 동결건조시킨 분말 100㎎(1 X 10 ⁹ CFU/g), 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 폴리비닐피롤리돈 97㎎을 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 2㎎을 가하여 혼합한 후 1정이 400㎎이 되도록 타정하였다.

제제예 2: 캡슐제의 제조

락토바실러스 플란타륨 DSR920 동결건조시킨 분말 100㎎(1 X 10 ⁹ CFU/g), 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 3: 음료의 제조

먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56 Brix 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다. 그리고 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 상기 락토바실러스 플란타륨 DSR920의 배양상등액을 동결건조시킨 분말 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 음료를 제조하였다.

제제예4 : 건강기능식품 경질캡슐제의 제조

락토바실러스 플란타륨 DSR920 동결건조시킨 분말(1 X 10 ⁹ CFU/g) 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기의 실시예 1의 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10, DSR M2를 포함한 동결건조분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.

제제예 5: 사료의 제조

락토바실러스 플란타륨 DSR920 동결건조시킨 분말(1 X 10 ⁹ CFU/g) 3중량%와 탈지강 97 중량%를 단순 혼합한 후 40 ℃ 이하에서 건조시켰으며, 건조된 혼합물을 분쇄하여 사료를 제조하였다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11210P 20111006

<110> DAESANG FNF CORPORATION <120> Lactobacillus plantarum DSR920 having effect of treatment and prevention of metabolic or inflammatory diseases <130> HPC2829 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1358 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <400> 1 gaactggtga gtaacacgtg ggaaacctgc ccagaagcgg gggataacac ctggaaacag 60 atgctaatac cgcataacaa cttggaccgc atggtccgag cttgaaagat ggcttcggct 120 atcacttttg gatggtcccg cggcgtatta gctagatggt ggggtaacgg ctcaccatgg 180 caatgatacg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat tgggactgag acacggccca 240 aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca 300 acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc tgttgttaaa gaagaacata 360 tctgagagta actgttcagg tattgacggt atttaaccag aaagccacgg ctaactacgt 420 gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc 480 gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg gctcaaccga agaagtgcat 540 cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa 600 tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg taactgacgc 660 tgaggctcga aagtatgggt agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc ataccgtaaa 720 cgatgaatgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg ctgcagctaa cgcattaagc 780 attccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 840 caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 900 atactatgca aatctaagag attagacgtt cccttcgggg acatggatac aggtggtgca 960 tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1020 tattatcagt tgccagcatt aagttgggca ctctggtgag actgccggtg acaaaccgga 1080 ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1140 caatggatgg tacaacgagt tgcgaactcg cgagagtaag ctaatctctt aaagccattc 1200 tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg 1260 atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga 1320 gagtttgtaa cacccaaagt cggtggggta acctttta 1358

Claims (6)

1. 대장균 혈청형 0127:B8의 정제된 리포폴리사카라이드 처리로 활성화된 RAW264.7 대식세포의 MCP-1, TNF-α 및 IL-6의 생성 억제 활성과 함께 3T3-L1 지방세포의 분화 억제 활성을 갖는 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantrum) DSR920 [기탁번호: KCCM11210P].
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항의 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantrum) DSR920 [기탁번호: KCCM11210P] 또는 이의 배양물을 함유하는 식품 조성물.
6. 삭제

Images