KR101383472B1 - 알레르기 질병 치료를 위한 흉선 간질 림포포이에틴수용체에 대한 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명에서 인간 TSLP 수용체를 특이적으로 인식하고 길항하는 항체, 및 TSLP 신호 전달에 의해 매개된 질병 또는 질환을 치료하거나 경감하기 위해 상기 항체를 사용하는 방법이 개시된다.

인간 TSLP 수용체, 항체, TSLP 신호 전달, 알레르기, 아토피 피부염, 천식, 알레르기 비염

Description

알레르기 질병 치료를 위한 흉선 간질 림포포이에틴 수용체에 대한 항체 {Antibodies Against Thymic Stromal Lymphopoietin Receptor for Treating Allergic Diseases}

시토킨 및 면역 세포는 특정 생리학적 메카니즘 또는 경로, 예를 들어, 다양한 염증성 질환을 일으키는 경로를 매개한다. 인간 흉선 간질 림포포이에틴 (TSLP)은 인간 상피세포로부터 생산되는 IL-7-유사 시토킨이다. 이는 B-세포 분화를 촉진하고 또한 흉선세포 및 성숙 T-세포 모두를 동시자극할 수 있다. TSLP는 인간 CD11c+ 수지상 세포 (DC) 상의 특이적 이종이량체 (heterodimer) 수용체에 결합한다. 수용체 이종이량체는 공통적인 감마-유사 수용체 사슬 (TSLP 수용체; TSLPR) 및 IL-7R-α 사슬로 이루어진다 (예를 들어, 문헌 ([Tonozuka et al., Cytogenet. Cell Genet. 93:23-25, 2001]; [Pandey et al., Nat. Immunol. 1:59-64, 2000]; [L. S. Park et al., J. Exp. Med. 192:659-670, 2000]; 및 [Reche et al., J. Immunol. 167:336-343, 2001]) 참조). 수용체에 결합하는 리간드는 DC가 T_H2-유인성 케모킨, TARC (흉선 및 활성화-제어 케모킨) 및 MDC (대식세포-유래 케모킨)을 분비하도록 유도한다. 또한, TSLP는 또한 강력한 DC 활성화, 비시험된 (naive) CD4+ T 세포 팽창, 및 T_H2 표현형으로의 후속적인 분극을 유도하여 알레르 기 유발성 시토킨 인터루킨 4 (IL-4), IL-5, IL-13 및 종양 괴사 인자-α를 생성시킨다.

TSLP 신호 전달이 Stat5 전사 인자의 활성화를 일으키는 것이 또한 밝혀졌다. 또한, 급성 및 만성 아토피 피부염 환자는 피부 병변에서 TSLP를 과다 발현하는 것으로 보고되었고, 이는 TSLP 발현이 생체내 알레르기성 염증과 연관됨을 제안한다. 피부 각질 세포 이외에, 높은 수준의 TSLP 발현은 또한 기관지 상피세포, 평활근 및 폐 섬유모세포에서 발견되었고, 이는 호흡기 알레르기 적응증에서 TSLP의 잠재적인 역할을 또한 지지한다. 또한, IgE 활성화된 비만 세포는 매우 높은 수준의 TSLP를 발현하고, 그 메카니즘은 T_H2 표현형의 유지에 참여할 수 있다.

서구 사회의 인구의 약 20%가 염증성 질환, 예를 들어, 천식, 비염, 아토피 피부염, 및 식품 알레르기를 포함하는 알레르기 질병에 걸린다. 50% 내지 80%의 아토피 피부염 환자는 천식 또는 알레르기 비염에 걸린다. 현재까지, 알레르기 유발 천식, 아토피 피부염, 및 알레르기 비염에 대한 치유법은 없다. 현재의 처치, 예를 들어 천식에 대한 베타-2 아드레날린 수용체 길항제, 아토피 피부염에 대한 Elidel, 및 알레르기 비염에 대한 H1-항히스타민제는 증상을 표적화하도록 사용된다. 따라서, 당업계에서는 상기 염증성 질환, 특히 알레르기성 염증을 치료하기 위한 보다 우수한 치료법에 대한 요구가 증가하고 있다. 본 발명은 상기 및 다른 문제를 해결하기 위한 것이다.

<발명의 개요>

본원에서 본 발명의 한 실시태양은 표적 단백질인 인간 흉선 간질 림포포이에틴 수용체 (hTSLPR)에 대해 특이적인 단리된 인간 또는 인간화 항체 또는 항원 결합 구역을 갖는 그의 기능적 단편을 제공하고, 항체 또는 그의 기능적 단편은 hTSLPR에 결합한다. 관련 실시태양에서, hTSLPR에 대한 결합은 염증 매개체 방출을 방지하는 세포 표면 hTSLP 수용체 결합에 의해 적어도 결정된다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 항체의 단리된 항원 결합 구역 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 특정 실시태양에서, 단리된 항원 결합 구역은 아미노산 서열 TYGMS (서열 7)를 갖는 H-CDR1 구역, 및 그의 보존적 변이체를 포함한다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 보존적 변이체는 확인된 임의의 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기를 포함한다. 관련 실시태양에서, 단리된 항원 결합 구역은 아미노산 서열 WINTYSGVPRYADDFKG (서열 8)을 갖는 H-CDR2 구역, 및 그의 보존적 변이체이다. 다른 관련 실시태양에서, 단리된 항원 결합 구역은 아미노산 서열 EGFITTVVGAAGRFVY (서열 9)를 갖는 H-CDR3 구역, 및 그의 보존적 변이체이다.

다른 실시태양에서, 단리된 항원 결합 구역은 아미노산 서열 KASQDVGTAVA (서열 10)를 갖는 L-CDR1 구역, 및 그의 보존적 변이체이다. 또다른 관련 실시태양에서, 단리된 항원 결합 구역은 아미노산 서열 WASTRHT (서열 11)을 갖는 L-CDR2 구역 및 그의 보존적 변이체이다. 또다른 관련 실시태양에서, 단리된 항원 결합 구역은 아미노산 서열 QQYSTYPT (서열 12)을 갖는 L-CDR3 구역, 및 그의 보존적 변이체이다.

다른 실시태양에서, 단리된 항원 결합 구역은 서열 5의 가변 구역 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열 5의 CDR 구역과 CDR 구역에서 적어도 60, 70, 80, 90 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 서열이다. 관련 실시태양에서, 단리된 항원 결합 구역은 서열 6의 가변 구역 아미노산 서열을 갖는 경쇄, 및 서열 6의 CDR 구역과 CDR 구역에서 적어도 60, 70, 80, 90 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 서열이다.

다른 측면에서, 본 발명은 hTSLPR에 대한 모노클로날 길항 항체를 제공한다. 본 발명의 항-TSLPR 항체 중 일부는 서열 5의 중쇄 가변 구역 서열 및 서열 6의 경쇄 가변 구역 서열을 함유하는 참조 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는다. 상기 항체 중 일부는 참조 항체와 동일한 결합 특이성을 나타내는 완전 인간 항체이다. 일부 항체는 TYGMS (서열 7), WINTYSGVPRYADDFKG (서열 8) 또는 EGFITTVVGAAGRFVY (서열 9)의 중쇄 상보성 결정 구역 (CDR) 서열; 또는 KASQDVGTAVA (서열 10), WASTRHT (서열 11), 또는 QQYSTYPT (서열 12)의 경쇄 CDR 서열을 갖는다.

일부의 항-hTSLPR 항체는 각각 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열인 TYGMS (서열 7), WINTYSGVPRYADDFKG (서열 8) 및 EGFITTVVGAAGRFVY (서열 9); 및 각각 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열인 KASQDVGTAVA (서열 10), WASTRHT (서열 11), 및 QQYSTYPT (서열 12)를 갖는다. 본 발명의 일부 다른 항체는 서열 5에 적어도 85% 동일한 중쇄 가변 구역 아미노산 서열 및 서열 6에 적어도 85% 동일한 경쇄 가변 구역 아미노산 서열을 함유한다. 본 발명의 일부 다른 항-TSLPR 항체는 서열 5에 동일한 중쇄 가변 구역 아미노산 서열 및 서열 6에 동일한 경쇄 가변 구역 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 일부 항-hTSLPR 항체는 마우스 항체이다. 일부 다른 것은 키메라 항체이다. 키메라 항체의 일부는 인간 중쇄 불변 구역 및 인간 경쇄 불변 구역을 갖는다. 본 발명의 일부 다른 항-TSLPR 항체는 인간화 항체이다. 본 발명의 일부 다른 항-TSLPR 항체는 서열 5의 중쇄 가변 구역 서열 및 서열 6의 경쇄 가변 구역 서열을 함유하는 항체와 동일한 결합 특이성을 나타내는 완전 인간 항체이다. 본 발명에서 단일쇄 항체, 예를 들어, Fab 단편을 또한 제공한다. 일부 항-hTSLPR 항체는 IgG1 이소형의 항체이다. 일부 다른 항체는 IgG4 이소형의 항체이다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-hTSLPR 항체의 중쇄 가변 구역 또는 경쇄 가변 구역을 함유하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA)를 제공한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 각각 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열인 TYGMS (서열 7), WINTYSGVPRYADDFKG (서열 8) 및 EGFITTVVGAAGRFVY (서열 9)를 함유하는 항체 중쇄를 코딩할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 각각 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열인 KASQDVGTAVA (서열 10), WASTRHT (서열 11), 및 QQYSTYPT (서열 12)를 함유하는 항체 경쇄를 코딩할 수 있다. 본 발명의 일부 폴리뉴클레오티드는 서열 5의 성숙 구역에 적어도 90% 동일한 성숙 중쇄 가변 구역 서열을 코딩한다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 서열 6의 성숙 구역에 적어도 90% 동일한 성숙 경쇄 가변 구역 서열을 코딩한다. 상기 폴리뉴클레오티드의 일부는 서열 5의 성숙 구역에 동일한 성숙 중쇄 가변 구역 서열 또는 서열 6의 성숙 구역에 동일한 성숙 경쇄 가변 구역 서열을 코딩한다.

다른 측면에서, 본 발명은 (1) 본 발명의 항-hTSLPR 항체의 중쇄를 코딩하는 제1 재조합 DNA 세그먼트, 및 (2) 항체의 경쇄를 코딩하는 제2 재조합 DNA 세그먼 트를 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 일부 숙주 세포에서, 재조합 DNA 세그먼트는 각각 제1 및 제2 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 상기 숙주 세포 중 일부는 각각 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열인 TYGMS (서열 7), WINTYSGVPRYADDFKG (서열 8) 및 EGFITTVVGAAGRFVY (서열 9); 및 각각 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열인 KASQDVGTAVA (서열 10), WASTRHT (서열 11), 및 QQYSTYPT (서열 12)를 갖는 모노클로날 항체를 발현한다. 일부 다른 숙주 세포는 서열 5의 성숙 구역에 적어도 90% 동일한 성숙 중쇄 가변 구역 서열; 및 서열 6의 성숙 구역에 적어도 90% 동일한 성숙 경쇄 가변 구역 서열을 함유하는 항-hTSLPR 항체를 발현한다. 상기 숙주 세포의 일부는 서열 5의 성숙 구역에 동일한 성숙 중쇄 가변 구역 서열 및 서열 6의 성숙 구역에 동일한 성숙 경쇄 가변 구역 서열을 함유하는 항-hTSLPR 항체를 발현한다. 일부 숙주 세포는 비-인간 포유동물 세포이다.

다른 측면에서, 본 발명은 대상, 예를 들어, 인간 환자에서 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상에게 유효량의 항-hTSLPR 항체를 함유하는 제약 조성물을 투여하는 것을 수반한다. 일반적으로, 항-hTSLPR 항체는 서열 5의 중쇄 가변 구역 서열 및 서열 6의 경쇄 가변 구역 서열을 함유하는 항-hTSLPR 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는다. 일부의 상기 치료 방법에서, 완전 인간 항체가 사용된다. 일부 방법에서, 항-TSLPR 항체는 각각 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열인 TYGMS (서열 7), WINTYSGVPRYADDFKG (서열 8) 및 EGFITTVVGAAGRFVY (서열 9); 및 각각 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열인 KASQDVGTAVA (서열 10), WASTRHT (서열 11), 및 QQYSTYPT (서열 12)를 함유한다. 일부 방법에서, 사용된 항-hTSLPR 항체는 서열 5의 성숙 구역에 동일한 성숙 중쇄 가변 구역 서열, 및 서열 6의 성숙 구역에 동일한 성숙 경쇄 가변 구역 서열을 함유한다. 일부 방법은 알레르기성 염증 질병에 걸린 대상을 치료하기 위한 것이다. 치료를 받을 수 있는 알레르기성 염증 질병의 예는 아토피 피부염, 천식, 또는 알레르기 비염을 포함한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 항체 또는 그의 단편인 제1 성분 및 제2 아미노산 서열을 갖는 제2 성분으로 이루어진 면역컨쥬게이트 (immunoconjugate)를 제공한다. 예를 들어, 면역컨쥬게이트는 세포독소이거나, 면역컨쥬게이트는 hTSLPR과 상이한 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 단백질 또는 항체이다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 항체 또는 그의 항체 단편을 갖는 키트를 제공한다. 일부 실시태양에서, 키트는 추가로 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 함유한다. 다른 관련 실시태양에서, 키트 내의 항체는 단위 용량으로 존재한다. 또다른 관련 실시태양에서, 키트는 대상에게 투여하는데 사용하기 위한 지시서를 포함한다.

본 발명의 특성 및 잇점은 명세서의 나머지 부분 및 청구의 범위를 참조하여 추가로 이해될 수 있다.

도 1은 BaF3/hTSLPR/hIL7Rα 세포에서 hTSLP-의존 세포 증식 분석을 사용하는 항-TSLPR 길항 항체에 대한 스크리닝을 보여준다.

도 2A-2C는 마우스 및 키메라 항-hTSLPR 모노클로날 항체의 정제를 도시한 것이다. A: 키메라 IgG1 항체; B: 키메라 IgG4 항체; 및 C: 마우스 IgG1 항체.

도 3A-3C는 세포 증식 분석 및 루시퍼라제 리포터 분석에 의한, 정제된 마우스 항-hTSLPR 항체 (클론 1D6.C9)의 길항 활성을 보여준다. A: Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα 세포의 증식; B: BaF3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5-Luc 세포의 증식; 및 C: BaF3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5-Luc 세포의 루시퍼라제 활성.

도 4는 마우스 항-hTSLPR 모노클로날 항체 1D6.C9 클론의 가변 구역의 뉴클레오티드 서열을 보여준다.

도 5는 마우스 항-hTSLPR 항체 클론 1D6.C9의 가변 구역 아미노산 서열을 보여준다. 상보성 결정 구역 (CDR) 및 프레임워크 구역 (FR)은 밑줄친 잔기 또는 이탤릭체 잔기로 표시한다.

도 6은 hTSLPR, hIL7Rα, 및 Stat5-Luc를 과다발현하는 Ba/F3 세포에서, 정제된 마우스 및 키메라 항-hTSLPR 항체의 길항 활성을 비교하는 루시퍼라제 리포터 분석 결과를 도시한 것이다.

도 7은 마우스 및 키메라 항-hTSLPR 항체에 의한 인간 단핵구로부터의 TSLP-매개 TARC 분비의 억제를 보여준다.

도 8은 항체 결합 도메인의 확인을 보여주고, TSLPR 항체는 불연속 에피토프에 결합한다.

본 발명은 부분적으로는 본 발명자들에 의한 인간 TSLPR에 대한 길항 항체의 개발에 기초로 한 것이다. 마우스에서 생성된 항-hTSLPR 항체 또는 시험관 내에서 생성된 키메라 항-hTSLPR 항체는 TSLP 신호 전달에 의해 매개되는 활성, 예를 들어, TSLP-매개 세포 증식을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 항체는 TSLP 신호 전달 활성에 의해 매개되거나 이와 연관되는 많은 질병 또는 질환, 예를 들어, 알레르기성 염증 질병, 예를 들어 아토피 피부염 및 천식에 대한 치료제 또는 예방제로서 유용하다. 다음 섹션은 본 발명의 조성물을 제조하고 사용하기 위한, 및 본 발명의 방법을 실행하기 위한 지침을 제공한다.

I. 정의

달리 규정되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 숙련자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 다음 참조 문헌은 본 발명에서 사용되는 많은 용어의 일반적인 정의를 당업자에게 제공한다: [Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al., (eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000)]; [Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al., (Eds.), John Wiley & Sons (3PrdP ed., 2002)]; 및 [A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4PthP ed., 2000)]. 또한, 다음 정의는 본 발명의 실시를 돕기 위해 제공된다.

본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있기 위해, 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전체에 기재된다.

용어 "면역 반응"은 침습 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역성 또는 병리학적 염증의 경우에, 정상 인간 세포 또는 조직을 선택적으로 손상시키거나, 파괴하거나, 또는 인체로부터 제거하는, 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 포식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에서 생산되는 가용성 거대분자 (항체, 시토킨, 및 보체 포함)의 작용을 의미한다.

"신호 전달 경로"는 세포의 한 부분에서 세포의 다른 부분으로 신호를 전달하는 기능을 수행하는 다양한 신호 전달 분자 사이의 생화학적 관계를 의미한다.

본원에서 언급되는 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원 결합 부분") 또는 단일쇄를 포함한다. 자연 발생 "항체"는 디술파이드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 구역 (본원에서 V_H로 약칭함) 및 중쇄 불변 구역으로 이루어진다. 중쇄 불변 구역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 구역 (본원에서 V_L로 약칭함) 및 경쇄 불변 구역으로 이루어진다. 경쇄 불변 구역은 하나의 도메인, 즉 C_L로 이루어진다. V_H 및 V_L 구역은 보다 보존된, 프레임워크 구역 (FR)으로 불리는 구역이 산재하는, 상보성 결정 구역 (CDR)으로 불리는 초가변성 구역으로 추가로 분할될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 구역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 구역은 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포) 및 전통적인 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어인 항체의 "항원 결합 부분" (또는 간단히 "항원 부분")은 항원 (예를 들어, TSLPR)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 전장 항체 또는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원 결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab 단편, 즉, V_L, V_H, C_L 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편; F(ab)₂ 단편, 즉, 힌지 구역에서 디술파이드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; V_H 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; V_H 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 구역 (CDR)을 포함한다.

또한, Fv 단편의 2개의 도메인, 즉 V_L 및 V_H는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 두 도메인은 V_L 및 V_H 구역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 공지됨)를 형성하는 단일 단백질 사슬로 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다 [예를 들어, 문헌 ([Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; 및 [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883]) 참조]. 상기 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원 결합 부분"에 포함되는 것이다. 상기 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 얻고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.

본원에서 사용되는 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 나타낸다 (예를 들어, TSLPR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 TSLPR 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, TSLPR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예를 들어 다른 종으로부터의 TSLPR 분자에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 의미한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 보인다.

본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 구역 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래한 가변 구역을 갖는 항체를 포함하는 의미이다. 또한, 항체가 불변 구역을 포함하면, 불변 구역은 또한 상기 인간 서열, 예를 들어, 인간 생식세포 서열, 또는 인간 생식세포 서열의 돌연변이된 형태로부터 유도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서의 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이 생성 또는 생체 내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.

용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 및 CDR 구역 모두가 인간 서열로부터 유래한 가변 구역을 갖는 단일 결합 특이성을 보이는 항체를 의미한다. 한 실시태양에서, 인간 모노클로날 항체는 트랜스제닉 (transgenic) 비인간 동물, 예를 들어, 인간 중쇄 도입유전자 (transgene) 및 경쇄 도입유전자를 포함하는 게놈이 무한 증식 세포에 융합된 트랜스제닉 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.

본원에서 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 염색체 도입된 (transchromosomal) 동물 (예를 들어 마우스), 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체, 조합형 재조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 면역글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열에 스플라이싱시키는 것을 수반하는 임의의 기타 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이같은 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 구역이 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 구역을 갖는다. 그러나, 특정 실시태양에서, 상기 재조합 인간 항체에 대해 시험관내 돌연변이 생성 (또는 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 사용된 경우에는, 생체내 체세포 돌연변이 생성)이 이루어질 수 있고, 따라서 재조합 항체의 V_H 및 V_L 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포 V_H 및 V_L 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만 생체 내에서 인간 항체 생식세포 레파토리 (repertoire) 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

"키메라 항체"는 (a) 항원 결합 부위 (가변 구역)가 상이한 또는 변경된 클래스, 효과기 기능 및/또는 종의 불변 구역, 또는 새로운 특성을 키메라 항체에 부여하는 전적으로 상이한 분자, 예를 들어, 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 불변 구역, 또는 그의 일부가 변경, 대체 또는 교환되거나; 또는 (b) 가변 구역, 또는 그의 일부가 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 구역으로 변경, 대체 또는 교환된 항체 분자이다. 예를 들어, 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 마우스 항-hTSLPR 항체는 그의 불변 구역을 인간 면역글로불린으로부터의 불변 구역으로 대체함으로써 변형시킬 수 있다. 인간 불변 구역으로 대체함으로써, 키메라 항체는 원래의 마우스 항체에 비해 인간에서 감소된 항원성을 보이면서 인간 TSLPR을 인식하는 그의 특이성을 보유할 수 있다.

"인간화" 항체는 인간에서 면역원성이 작으면서 비-인간 항체의 반응성을 보유하는 항체이다. 이것은 예를 들어 비-인간 CDR 구역을 보유시키고 항체의 나머지 부분을 그의 인간 대응물 (즉, 불변 구역 및 가변 구역의 프레임워크 부분)으로 대체하여 달성할 수 있다 [예를 들어, 문헌 ([Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855. 1984]; [Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988]; [Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991]; 및 [Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994]) 참조]. 인간 공학처리 기술의 다른 예는 US 5,766,886에 개시된 Xoma 기술을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "휴머니어링 (Humaneering)"은 비-인간 항체를 공학적으로 처리된 인간 항체로 전환하기 위한 방법을 나타낸다 (예를 들어, 칼로바이오스 (KaloBios)의 Humaneering™ 기술 참조).

본원에서 사용되는 바와 같이, "이소형"은 중쇄 불변 구역 유전자에 의해 제공되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4)를 의미한다.

구문 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "인간 TSLPR에 특이적으로 결합하는" 항체는 200 x 10^-12 M 이하, 150 x 10^-12 M 이하, 또는 100 x 10^-12 M 이하의 K_D로 인간 TSLPR에 결합하는 항체를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "결합 특이성"은 단지 하나의 항원 결정자와만 반응하는 개별 항체 결합 부위의 능력을 나타낸다. 항체의 결합 부위는 분자의 Fab 부분에 위치하고, 중쇄 및 경쇄의 초가변 구역으로부터 이루어진다. 항체의 결합 친화도는 단일 항원성 결정자와 항체 상의 단일 결합 부위 사이의 반응 강도이다. 이것은 항원성 결정자와 항체의 결합 부위 사이에 작용하는 인력 및 척력의 총합이다. 친화도는 항원-항체 반응을 설명하는 평형 상수이다.

2가지 물질 사이의 특이적 결합은 평형 상수 (K_A)가 적어도 1 x 10⁷ M^-1, 10⁸ M^-1, 10⁹ M^-1, 또는 10¹⁰ M^-1인 결합을 의미한다. 구문 항체 (예를 들어, 항-hTSLPR 항체)에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하는"은 단백질 및 다른 생물학적 물질의 불균일 집단에서 동족 (cognate) 항원 (예를 들어, 인간 TSLPR 폴리펩티드)의 존재를 결정하는 결합 반응을 의미한다. 상기한 바와 같은 평형 상수 (K_A) 이외에, 본 발명의 항-hTSLPR 항체는 또한 해리 상수 (K_d)가 일반적으로 약 1 x 10^-2 s^-1, 1 x 10^-3 s^-1, 1 x 10^-4 s^-1 또는 그 미만이고, 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA)에 대한 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 2배 더 큰 친화도로 인간 TSLPR에 결합한다. 구문 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환가능하게 사용된다.

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정자를 의미한다. 에피토프는 대체로 분자, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면기로 구성되고, 대체로 특이적인 3차원 구조 특징, 및 특이적 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 및 비입체형태적 에피토프는 입체형태적 에피토프에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에 상실되지만 비입체형태적 에피토프에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다.

용어 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환가능하게 사용되고, 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 나타낸다. 이 용어는 합성된 것이거나, 자연 발생하거나, 또는 자연 발생하지 않고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는, 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함한다. 상기 유사체의 예는 비제한적으로 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA)을 포함한다.

달리 나타내지 않으면, 특정 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열 뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 다의성 코돈 치환) 및 상보성 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 다의성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3의 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 달성할 수 있다 ([Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991]; [Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985]; 및 [Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994]).

용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산, 및 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것, 및 추후 변형된 아미노산, 예를 들어, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기, 및 R기에 결합된 알파 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 의미한다. 상기 유사체는 변형된 R기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 의미한다.

용어 "폴리펩티드 "및 "단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 이 용어는 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체 뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다. 달리 나타내지 않으면, 특정 폴리펩티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체도 함축적으로 포함한다.

용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열에 대해서, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 코딩하는 핵산을 의미한다. 유전자 코드의 다의성 (degeneracy) 때문에, 많은 수의 기능상 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변경시키지 않으면서 임의의 대응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 상기 핵산 변이는 "침묵 변이"이고, 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 또한, 본원에서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변이도 설명한다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변형되어 기능상 동일한 분자를 생성시킬 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 설명된 서열에 내재하는 것이다.

폴리펩티드 서열에 대해, "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는, 폴리펩티드 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 공지되어 있다. 상기 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 추가적인 것으로서 이들을 배제하지 않는다. 다음 8개의 군은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:

1) 알라닌 (A), 글리신 (G);

2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);

3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);

4) 아르기닌 (R), 라이신 (K);

5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);

6) 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y), 트립토판 (W);

7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및

8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조).

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성 %"는 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 두 서열은 다음 서열 비교 알고리즘의 하나를 사용하거나 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 측정시에, 비교 창 (window), 또는 지정된 구역에 걸친 최대의 일치를 위해 정렬되어 비교할 때 2개의 서열이 특정 비율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 (즉, 특정 구역에 걸쳐, 또는 특정되지 않은 경우에는 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 임의로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성)를 가질 경우에 "실질적으로 동일한" 것이다. 임의로, 동일성은 적어도 약 50개의 뉴클레오티드 (또는 10개의 아미노산) 길이의 구역에 걸쳐, 보다 바람직하게는 100 내지 500개 또는 1000개 또는 그보다 많은 뉴클레오티드 (또는 20, 50, 200개 또는 그보다 많은 아미노산) 길이에 걸쳐 존재한다.

서열 비교를 위해, 일반적으로 하나의 서열이 시험 서열이 그와 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우 하위 서열 좌표 (coordinate)가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 (default) 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대체 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기초로 하여 참조 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성 %를 계산한다.

본원에서 사용되는 "비교 창"은 2개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 인접 위치의 동일한 수의 참조 서열에 서열을 비교할 수 있는, 20 내지 600, 일반적으로 약 50 내지 약 200, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군에서 선택되는 인접 위치의 수 중의 임의의 하나의 세그먼트를 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬의 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 국소 상동성 알고리즘 (Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c), 상동성 정렬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970), 유사성 검색 방법 (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988), 상기 알고리즘의 컴퓨터에 의한 실행 (GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, 위스콘신 지네틱스 소프트웨어 패키지 (Wisconsin Genetics Software Package), 지네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 메디슨 사이언스 드라이브 575), 또는 수동 정렬 및 시각적 검사 (예를 들어, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003) 참조)에 의해 수행할 수 있다.

서열 동일성 % 및 서열 유사성을 결정하기 위해 적합한 알고리즘의 2개의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이들은 각각 문헌 ([Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977]; 및 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990])에 설명되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information을 통해 공개적으로 입수가능하다. 상기 알고리즘은 데이타베이스 서열 내의 동일한 길이의 단어와 정렬할 때 일부의 + 값의 역치 스코어 T에 일치하거나 T를 충족시키는 문의 서열 내의 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 높은 스코어 서열쌍 (HSP)을 먼저 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 단어 (neighborhood word) 스코어 역치로 칭해진다 (Altschul et al., 상기 문헌). 상기 초기 이웃 단어 히트 (hit)는 그를 포함하는 보다 긴 HSP를 발견하기 위한 검색을 개시하는 출발점으로서 작용한다. 단어 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한 멀리까지 각각의 서열을 따라 두 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M (일치하는 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 > 0) 및 N (일치하지 않는 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 < 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열에 대해, 누적 스코어를 계산하기 위해 스코어링 매트릭스 (scoring matrix)가 사용된다. 각각의 방향으로 단어 히트의 연장은 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성 값으로부터 양 X만큼 감소할 때; 누적 스코어가 하나 이상의 음의 스코어링 잔기 정렬의 축적에 의해 0 이하가 될 때; 또는 어느 한 서열의 끝에 도달할 때 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대한)은 디폴트로서 단어 길이 (W) 11, 예상 (E) 10, M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어 길이 3, 및 예상 (E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989] 참조) 정렬 (B) 50, 예상 (E) 10, M=5, N=-4, 및 두 가닥의 비교를 사용한다.

BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생할 확률을 나타내는, 최소 전체 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교시에 최소 전체 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우에 참조 서열에 유사한 것으로 간주된다.

상기 나타낸 서열 동일성% 외에, 2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 아래에 설명되는 바와 같이 제2 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대해 생산된 항체와 면역학상 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 예를 들어 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에 일반적으로 제2 폴리펩티드에 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일함을 보여주는 다른 표시는 2개의 분자 또는 그의 상보체가 아래에서 설명되는 바와 같이 엄격한 조건 하에 서로 혼성화한다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일함을 보여주는 또다른 표시는 동일한 프라이머가 서열을 증폭시키기 위해 사용될 수 있다는 것이다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 세그먼트 사이의 기능적 관계를 의미한다. 일반적으로, 이 용어는 전사 조절 서열의 전사되는 서열에 대한 기능적 관계를 의미한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열은 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현계에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조절할 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사되는 서열에 물리적으로 인접하여 위치한다. 즉, 전사 조절 서열은 시스 작용성 (cis-acting)이다. 그러나, 일부 전사 조절 서열, 예를 들어 인핸서는 전사를 향상시키고자 하는 코딩 서열에 물리적으로 인접하거나 또는 근접하여 위치할 필요가 없다.

용어 "벡터"는 연결된 또다른 폴리뉴클레오티드를 수송할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 의미하고자 한 것이다. 한 종류의 벡터는 추가의 DNA 세그먼트가 그 내부에 라이게이션될 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 루프를 의미하는 "플라스미드"이다. 다른 종류의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 그들이 내부에 도입되는 숙주 세포 (예를 들어, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)에서 자가 복제할 수 있다. 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내에 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 그들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")로 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 플라스미드는 벡터의 가장 흔히 사용되는 형태이므로, 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 그 내부에 도입된 세포를 의미한다. 상기 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 상기 세포의 자손체도 의미하고자 함을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향에 의해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 상기 자손체는 모 세포와 실제로 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다.

용어 "염증성 질병 또는 병태"는 손상 또는 감염 부위에서의 국소 염증을 특징으로 하는 임의의 병태를 의미하고, 자가면역 질병, 특정 형태의 감염성 염증 상태, 장기 이식편 또는 다른 임플랜트의 바람직하지 않은 호중구 활성 특성 및 국소 조직 부위에서 바람직하지 않은 호중구 축적을 특징으로 하는 실질적으로 임의의 다른 병태를 포함한다. 상기 병태는 수막염, 뇌부종, 관절염, 신장염, 성인 호흡 곤란 증후군, 췌장염, 근육염, 신경염, 결합 조직 질병, 정맥염, 동맥염, 혈관염, 알레르기, 과민증, 에를리히증 (ehrlichiosis), 통풍, 장기 이식 및/또는 궤양성 대장염을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

용어 "대상"은 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 달리 표시된 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

용어 "치료하는"은 질병 (예를 들어, 알레르기성 염증성 질병)의 증상, 합병증, 또는 생화학적 징후의 억제 또는 발생의 지연, 질병, 병태, 또는 질환의 증상 완화 또는 정지 또는 추가 발생의 억제를 위해 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 포함한다. 치료는 예방적 (질병 발생의 억제 또는 지연, 또는 그의 임상적 또는 준임상적 증상의 소견 억제를 위한) 또는 질병 소견 후의 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다.

구문 "신호 전달 경로" 또는 "신호 전달 경로" (예를 들어, TSLP 신호 전달 경로)는 세포의 자극 화합물 또는 물질과의 상호작용에 의해 발생하는 적어도 하나의 생화학적 반응, 보다 통상적으로는 일련의 생화학적 반응을 의미한다. 따라서, 자극 화합물 (예를 들어, TSLP)과 세포의 상호작용은 신호 전달 경로를 통해 전달되어 최종적으로 세포 반응, 예를 들어, 면역 반응을 유도하는 "신호"를 생성시킨다.

II . 인간 TSLPR 에 대한 길항 항체

1. 개요

본 발명은 인간 TSLPR에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 상기 항-hTSLPR 항체는 하기 실시예에 설명된 바와 같은 TSLP 매개된 신호 전달 활성, 예를 들어, TSLP 매개된 세포 증식을 길항할 수 있다. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 제조를 위한 일반적인 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ([Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1998]; [Kohler & Milstein, Nature 256:495-497, 1975]; [Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983]; 및 [Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985]) 참조).

바람직하게는, 본 발명의 항-hTSLPR 항체는 하기 실시예에 설명된 바와 같이 인간 TSLPR에 대해 생성시킨 마우스 모노클로날 항체 (클론 1D6.C9)와 같은 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 단일 클론으로부터 유도된 항체를 의미한다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 임의의 기술, 예를 들어, B 림프구의 바이러스 또는 종양유전자 형질전환을 사용하여 본 발명의 항-hTSLPR 항체를 생산할 수 있다. 하이브리도마를 제조하기 위한 하나의 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 과정이다. 하기 실시예에 설명된 바와 같이, 모노클로날 항-hTSLPR 항체는 비-인간 동물 (예를 들어, 마우스)을 hTSLPR 폴리펩티드, 또는 그의 단편, 융합 단백질, 또는 변이체로 면역화시킴으로써 생성할 수 있다. 이어서, 동물로부터 단리된 B 세포는 골수종 세포에 융합되어 항체-생산 하이브리도마를 생성한다. 모노클로날 마우스 항-hTSLPR 항체는 hTSLPR 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 사용하여 ELISA 분석에서 하이브리도마를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 융합을 위한 면역화 비장세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차는 또한 당업계에 잘 공지되어 있다 [예를 들어, Harlow & Lane, 상기 문헌].

하기 실시예에서 설명되는 예시적인 마우스 항-TSLPR 항체의 중쇄 (서열 5) 및 경쇄 가변 구역 (서열 6)의 아미노산 서열을 도 5에 도시한다. 또한, 도면에 나타낸 바와 같이, 상기 항체의 중쇄 가변 구역의 CDR 서열은 TYGMS (CDR1; 서열 7), WINTYSGVPRYADDFKG (CDR2; 서열 8), 및 EGFITTVVGAAGRFVY (CDR3; 서열 9)이다. 경쇄 가변 구역의 CDR 서열은 KASQDVGTAVA (CDR1; 서열 10), WASTRHT (CDR2; 서열 11), 및 QQYSTYPT (CDR3; 서열 12)이다.

항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 구역 (CDR)에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 일반적으로, 본 발명의 항-hTSLPR 항체는 도 5에 도시된 대응하는 CDR 서열에 대해 동일한 그들의 중쇄 CDR 서열 또는 경쇄 CDR 서열 중 적어도 하나를 갖는다. 본 발명의 일부 상기 항-hTSLPR 항체는 하기 실시예에 개시된 예시적인 마우스 항-TSLPR 항체 (클론 1D6.C9)와 동일한 결합 특이성을 갖는다. 상기 항체는 hTSLPR에 대한 결합에 대해 마우스 항-hTSLPR 항체 (클론 1D6.C9)와 경쟁할 수 있다. 본 발명의 일부 항-hTSLPR 항체는 각각 도 5에 도시된 대응하는 CDR 서열에 대해 동일한 그들의 중쇄 및 경쇄의 가변 구역 내에 모든 CDR 서열을 갖는다. 따라서, 상기 항-hTSLPR 항체는 각각 서열 7, 서열 8, 및 서열 9에 동일한 3개의 중쇄 CDR 서열, 및 각각 서열 10, 서열 11, 및 서열 12에 동일한 3개의 경쇄 CDR 서열을 갖는다.

각각 마우스 항-hTSLPR 항체 (클론 1D6.C9)의 대응하는 CDR 서열에 동일한 CDR 서열을 갖는 것에 추가하여, 일부의 본 발명의 항-hTSLPR 항체는 각각 도 5에 도시된 마우스 항체의 대응하는 가변 구역 서열 (즉, 서열 5 및 서열 6)에 동일한 그들의 전체 중쇄 및 경쇄 가변 구역 서열을 갖는다. 일부 다른 실시태양에서, 동일한 CDR 서열 이외에, 항체는 도 5에 도시된 대응하는 아미노산 잔기 (예를 들어, 하기 설명되는 인간화 항-hTSLPR 항체 중 일부)와 상이한 가변 구역의 프레임워크 부분 내의 아미노산 잔기를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 상기 항체는 일반적으로 도 5에 도시된 대응하는 가변 구역 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 75%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%) 전체 가변 구역 서열을 갖는다.

본 발명의 항-hTSLPR 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 무손상 항체일 수 있다. 이 항체는 또한 무손상 항체 또는 단일쇄 항체의 항원 결합 단편일 수 있다. 본 발명의 항-hTSLPR 항체는 비-인간 동물에서 생산된 항체 (예를 들어, 도 5에 도시된 마우스 항-hTSLPR 항체)를 포함한다. 이 항체는 또한 도 5에 도시된 마우스 항-hTSLPR 항체의 변형된 형태인 변형된 항체를 포함한다. 종종, 변형된 항체는 예시적인 마우스 항체에 비해 유사하거나 개선된 특성을 갖는 재조합 항체이다. 예를 들어, 하기 실시예에 예시된 마우스 항-hTSLPR 항체는 불변 구역을 삭제하고 이를 항체의 반감기, 예를 들어, 혈청 반감기, 안정성 또는 친화도를 증가시킬 수 있는 상이한 불변 구역으로 대체함으로써 변형시킬 수 있다. 변형된 항체는 예를 들어 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열에 그래프팅 (grafting)된, 마우스 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 제조함으로써 생성시킬 수 있다 (Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525). 상기 프레임워크 서열은 공공 DNA 데이타베이스로부터 얻을 수 있다.

일부의 변형된 항체는 부분적인 인간 면역글로불린 서열 (예를 들어, 불변 구역) 및 부분적인 비-인간 면역글로불린 서열 (예를 들어, 도 5에 도시된 마우스 항-hTSLPR 항체 가변 구역 서열)을 포함하는 키메라 항체이다. 다른 일부의 변형된 항체는 인간화 항체이다. 일반적으로, 인간화 항체는 그 내부에 도입된, 비-인간 공급원으로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,585,089 및 5,693,762; 문헌 [Jones et al., Nature 321: 522-25, 1986]; [Riechmann et al., Nature 332: 323-27, 1988]; 및 [Verhoeyen et al., Science 239: 1534-36, 1988]). 상기 방법은 인간 항체의 대응하는 구역 대신에 비-인간 항-hTSLPR 항체로부터의 CDR의 적어도 일부를 사용함으로써 본 발명의 인간화 항-hTSLPR 항체를 생성시키기 위해 쉽게 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항-hTSLPR 항체는 대응하는 인간 프레임워크 구역에 그래프팅된, 도 5에 도시된 마우스 항-hTSLPR 항체로부터의 3개의 모든 CDR을 각각의 면역글로불린 사슬에 갖는다.

상기 설명된 항-hTSLPR 항체는 결합 특이성 또는 효과기 기능의 손실, 또는 허용되지 않는 결합 친화도의 감소를 야기하지 않으면서 가변 및 불변 구역 모두에서 중요하지 않은 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 겪을 수 있다. 대체로, 상기 변경을 포함하는 항체는 이들이 그로부터 유래되는 참조 항체 (예를 들어, 도 5에 도시된 마우스 항-hTSLPR 항체)와 실질적인 서열 동일성을 보인다. 예를 들어, 본 발명의 일부의 항-hTSLPR 항체의 성숙 경쇄 가변 구역은 도 5에 도시된 항-hTSLPR 항체의 성숙 경쇄 가변 구역의 서열과 적어도 75% 또는 적어도 85%의 서열 동일성을 보인다. 이와 유사하게, 항체의 성숙 중쇄 가변 구역은 일반적으로 도 5에 도시된 항-hTSLPR 항체의 성숙 중쇄 가변 구역의 서열과 적어도 75% 또는 적어도 85%의 서열 동일성을 보인다. 일부의 변형된 항-hTSLPR 항체는 도 5에 도시된 마우스 항-hTSLPR 항체 (클론 1D6.C9)에 비해 동일한 특이성 및 증가된 친화도를 갖는다. 대체로, 변형된 항-hTSLPR 항체 (예를 들어 인간화 항체)의 친화도는 원래의 마우스 항체와 동일하거나 보다 양호한 결합 친화도를 갖는다. 변형된 항체의 결합 친화도는 원래의 마우스 항체의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%이다.

2. 키메라 및 인간화 항- hTSLPR 항체

일부의 본 발명의 항-hTSLPR 항체는 인간 항체의 구역과 함께 비-인간 항-hTSLPR 항체 길항제로부터의 구역으로 이루어진 키메라 (예를 들어, 마우스/인간) 항체이다. 예를 들어, 키메라 H 사슬은 인간 중쇄 불변 구역의 적어도 일부에 연결된, 마우스 항-TSLPR 항체의 중쇄 가변 구역의 항원 결합 구역 (예를 들어, 서열 5에 제시된 서열)을 포함할 수 있다. 상기 키메라 중쇄는 인간 경쇄 불변 구역의 적어도 일부에 연결된, 마우스 항-hTSLPR 항체의 경쇄 가변 구역의 항원 결합 구역 (예를 들어, 서열 6에 제시된 서열)을 포함하는 키메라 L 사슬과 조합될 수 있다.

본 발명의 키메라 항-hTSLPR 항체는 하기 실시예의 개시 내용 및 당업계에 공지된 방법에 따라 생산할 수 있다. 예를 들어, 뮤린 항-hTSLPR 모노클로날 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 유전자는 뮤린 Fc 구역을 제거하기 위해 제한 효소로 소화되고 인간 Fc 불변 구역을 코딩하는 유전자의 등가 부분으로 대체될 수 있다. 재조합 항체 및 특히 인간화 항체의 발현에 적합한 발현 벡터 및 숙주 세포는 당업계에 잘 공지되어 있다. 항-hTSLPR 면역글로불린 사슬을 코딩하는 키메라 유전자를 발현하는 벡터는 표준 재조합 기술을 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어, [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3^rd ed., 2001)]; 및 [Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)]). 인간 불변 구역 서열은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991]에 나열된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 참고 공급원으로부터 선택될 수 있다. DNA 재조합에 의해 키메라 항체를 생산하는 보다 구체적인 내용이 또한 당업계에 교시되어 있다 (예를 들어, Robinson et al.,, 국제 특허 출원 PCT/US 86/02269; Akira, et al., 유럽 특허 출원 184,187; Taniguchi, M., 유럽 특허 출원 171,496; Morrison et al., 유럽 특허 출원 173,494; Neuberger et al., 국제 출원 공개 WO 86/01533; Cabilly et al., 미국 특허 4,816,567; Cabilly et al., 유럽 특허 출원 125,023; 문헌 ([Better (1988) Science 240:1041-1043]; [Liu (1987) PNAS 84:3439-3443]; [Liu (1987) J. Immunol. 139:3521-3526]; [Sun (1987) PNAS 84:214-218]; [Nishimura (1987) Cane. Res. 47:999-1005]; [Wood (1985) Nature 314:446-449]; [Shaw (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559]).

비-인간 항체로부터의 전체 가변 구역을 갖는 키메라 항체는 인간에서 항체의 항원성을 감소시키기 위해 추가로 인간화될 수 있다. 이것은 일반적으로 Fv 가변 구역 (프레임워크 구역 또는 비-CDR 구역)의 특정 서열 또는 아미노산 잔기를 인간 Fv 가변 구역으로부터의 등가 서열 또는 아미노산 잔기로 대체함으로써 달성된다. 상기 추가로 치환된 서열 또는 아미노산 잔기는 대체로 항원 결합에 직접적으로 관여되지 않는다. 보다 종종, 비-인간 항체의 인간화는 비-인간 항체 (예를 들어, 도 5에 도시된 마우스 항체)의 CDR만으로 인간 항체 내의 CDR을 대체함으로써 진행한다. 일부 경우에, 이후에 인간 프레임워크 구역 내의 일부 추가의 잔기를 비-인간 공여 항체로부터의 대응하는 잔기로 대체한다. 항원에 대한 결합을 개선시키기 위해서 상기한 추가의 그래프팅이 종종 필요하다. 이것은 단지 비-인간 항체로부터 그래프팅된 CDR을 갖는 인간화 항체가 비-인간 공여 항체에 비해 완전한 결합 활성보다 작은 활성을 가질 수 있기 때문이다. 따라서, CDR에 추가하여, 본 발명의 인간화 항-hTSLPR 항체는 종종 인간 프레임워크 구역 내의 일부 아미노산 잔기가 비-인간 공여 항체 (예를 들어, 도 5에 도시된 마우스 항체)로부터의 대응하는 잔기로 대체될 수 있다. 대체를 위한 프레임워크 잔기를 선택하기 위한 기준을 포함하여 CDR 치환에 의해 인간화 항체를 생성시키는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 상기한 키메라 항체 생산에 관한 기술에 추가하여, 인간화 항체 제조에 대한 추가의 교시내용은 예를 들어 문헌 (Winter et al., UK 특허 출원 GB 2188638A (1987), 미국 특허 5,225,539; [Jones (1986) Nature 321:552-525]; [Verhoeyan et al., 1988 Science 239:1534]; 및 [Beidler (1988) J. Immunol. 141:4053-4060])에 제시되어 있다. CDR 치환은 예를 들어 WO 94/10332 (명칭: Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes)에 기재된 올리고뉴클레오티드 부위 지정 돌연변이 생성을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 키메라 또는 인간화 항-hTSLPR 항체는 1가, 2가, 또는 다가 면역글로불린일 수 있다. 예를 들어, 1가 키메라 항체는 상기 나타낸 바와 같이 키메라 L 사슬과 디술파이드 다리를 통해 연결된 키메라 H 사슬에 의해 형성된 이량체 (HL)이다. 2가 키메라 항체는 적어도 하나의 디술파이드 다리를 통해 연결된 2개의 HL 이량체에 의해 형성된 사량체 (H₂L₂)이다. 다가 키메라 항체는 사슬의 응집을 기초로 한다.

3. 인간 항- hTSLPR 항체

키메라 또는 인간화 항-hTSLPR 항체에 추가하여, 동일한 결합 특이성 및 동등한 또는 보다 양호한 결합 친화도를 나타내는 완전 인간 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 인간 항체는 서열 5의 중쇄 가변 구역 서열 및 서열 6의 경쇄 가변 구역 서열을 함유하는 참조 비인간 항체에 비해 동일한 또는 보다 양호한 결합 특징을 가질 수 있다. 키메라 또는 인간화 항체에 비해, 본 발명의 인간 항-hTSLPR 항체는 인간 대상에게 투여될 때 추가로 항원성이 감소된다.

인간 항-hTSLPR 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 비인간 항체에 비해 동일한 결합 특징을 유지하거나 또는 보다 양호한 결합 특징을 제공하면서 항체에서 비인간 항체 가변 구역을 인간 가변 구역으로 대체하는 생체내 방법은 미국 특허 출원 10/778,726 (공개 20050008625)에 개시되어 있다. 이 방법은 비-인간 참조 항체의 가변 구역을 에피토프에 의해 유도되어 완전 인간 항체로 대체하는 것에 기초한다. 생성되는 인간 항체는 일반적으로 참조 비인간 항체에 구조적으로 관련되지 않지만, 참조 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 간단히 설명하면, 연속적인 에피토프 유도된 상보성 대체 방법은 항원에 대한 참조 항체 ("시험 항체")의 결합에 반응하는 리포터 시스템의 존재 하에 제한된 양의 항원에 대한 결합을 위해 "경쟁자"와 시험 항체의 다양한 하이브리드 라이브러리의 세포 내에서의 경쟁을 확립함으로써 가능하게 된다. 경쟁자는 참조 항체 또는 그의 유도체, 예를 들어 단일쇄 Fv 단편일 수 있다. 경쟁자는 또한 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항원의 천연 또는 인공 리간드일 수 있다. 경쟁자의 유일한 요건은 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하고, 항원 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 것이다. 시험 항체는 비인간 참조 항체로부터의 공통적인 하나의 항원 결합 V-구역, 및 다양한 공급원, 예를 들어 인간 항체의 레퍼토리 라이브러리로부터 무작위로 선택된 다른 V-구역을 갖는다. 참조 항체로부터의 공통적인 V-구역은 가이드로서 기능하여 시험 항체를 항원 상의 동일한 에피토프에 동일한 배향으로 위치시키고, 따라서 참조 항체에 대해 가장 높은 항원 결합 충실도 쪽으로 편향되도록 선택할 수 있다. TSLPR 결합 도메인은 에피토프 매핑 (mapping)에 의해 확인하였고, 도 8에 제시하였다. TSLPR 항체는 불연속적인 에피토프에 결합한다.

많은 종류의 리포터 시스템이 시험 항체와 항원 사이의 목적하는 상호작용을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 항원에 결합할 때 단편 상보성에 의한 리포터 활성화만이 발생하도록 상보성 리포터 단편이 항원 및 시험 항체에 각각 연결될 수 있다. 시험 항체- 및 항원-리포터 단편 융합체가 경쟁자와 동시 발현될 때, 리포터 활성화는 항원에 대한 시험 항체의 친화도에 비례하는, 경쟁자와 경쟁하는 시험 항체의 능력에 의존하게 된다. 사용될 수 있는 다른 리포터 시스템은 미국 특허 출원 10/208,730 (공개 20030198971)에 개시된 자가억제된 리포터 재활성화 시스템 (RAIR)의 재활성화제 (reactivator) 또는 미국 특허 출원 10/076,845 (공개 20030157579)에 개시된 경쟁적 활성화 시스템을 포함한다.

연속적인 에피토프 유도된 상보성 대체 시스템을 사용하여, 선택은 경쟁자, 항원, 및 리포터 성분과 함께 단일 시험 항체를 발현하는 세포를 확인하기 위해 수행된다. 상기 세포에서, 각각의 시험 항체는 제한된 양의 항원에 대한 결합을 위해 경쟁자와 일대일로 경쟁한다. 리포터의 활성은 시험 항체에 결합된 항원의 양에 비례하고, 이는 다시 항원에 대한 시험 항체의 친화도 및 시험 항체의 안정성에 비례한다. 시험 항체는 초기에 시험 항체로 발현될 때 참조 항체에 비교한 그들의 활성을 기초로 하여 선택된다. 제1 라운드의 선택의 결과는 "하이브리드" 항체의 세트이고, 그 각각은 참조 항체로부터의 동일한 비-인간 V-구역 및 라이브러리로부터의 인간 V-구역으로 이루어지고, 참조 항체와 동일한 항원 상의 에피토프에 결합한다. 제1 라운드에서 선택된 하이브리드 항체 중 하나 이상은 참조 항체와 동등하거나 이보다 높은 항원에 대한 친화도를 가질 것이다.

제2의 V-구역 대체 단계에서, 제1 단계에서 선택된 인간 V-구역이 나머지의 비-인간 참조 항체 V-구역을 동족 인간 V-구역의 다양한 라이브러리로 대체하기 위한 선택의 가이드로서 사용된다. 제1 라운드에서 선택된 하이브리드 항체는 또한 제2 라운드의 선택에 대해 경쟁자로서 사용될 수 있다. 제2 라운드의 선택 결과는 참조 항체와 구조상 상이하지만, 동일한 항원에 대한 결합을 위해 참조 항체와 경쟁하는 완전 인간 항체의 세트이다. 선택된 인간 항체의 일부는 참조 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 상기 선택된 인간 항체들 중에서, 하나 이상의 항체는 참조 항체와 동등하거나 이보다 높은 친화도로 동일한 에피토프에 결합한다.

참조 항체로서 상기 설명된 마우스 또는 키메라 항-hTSLPR 항체 중 하나를 사용하여, 상기 방법은 동일한 결합 특이성 및 동일하거나 보다 양호한 결합 친화도로 인간 TSLPR에 결합하는 인간 항체를 생성시키기 위해 용이하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 인간 항-hTSLPR 항체는 인간 항체를 통상적으로 생산하는 회사, 예를 들어, 칼로바이오스, 인크. (KaloBios, Inc., 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.

4. 다른 종류의 항- hTSLPR 항체

본 발명의 항-hTSLPR 항체는 또한 단일쇄 항체, 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 단일쇄 항체이다. 단일쇄 항체는 안정하게 폴딩된 (folded) 단일 폴리펩티드 사슬에 중쇄 및 경쇄 모두로부터의 항원 결합 구역을 포함한다. 따라서, 단일쇄 항체는 일반적으로 모노클로날 항체의 결합 특이성 및 친화도를 보유하지만, 크기는 전통적인 면역글로불린보다 상당히 작다. 특정 용도를 위해, 본 발명의 항-hTSLPR 단일쇄 항체는 무손상 항-hTSLPR 항체에 비해 많은 유리한 특성을 제공할 수 있다. 이들은 예를 들어 마우스-기반 항체에 비해 신체로부터 보다 신속한 소실, 진단 영상화 및 치료 모두를 위한 더 큰 조직 침투, 및 면역원성의 유의한 감소를 포함한다. 단일쇄 항체를 사용하는 다른 잠재적인 잇점은 고효율 스크리닝 방법에서 향상된 스크리닝 능력 및 비-비경구 용도를 위한 가능성을 포함한다.

본 발명의 단일쇄 항-hTSLPR 항체는 당업계에 설명된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 기술의 예는 미국 특허 4,946,778 및 5,258,498; 문헌 ([Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88, 1991]; [Shu et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:7995-7999, 1993]; 및 [Skerra et al., Science 240:1038-1040, 1988])에 기재된 것을 포함한다.

일부 실시태양에서, 본 발명은 다수의 결합 부위 또는 표적 에피토프에 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 생성시키기 위해 유도체화되거나 다른 기능적 분자에 연결된 항-hTSLPR 항체를 제공한다. 기능적 분자는 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 시토킨, 세포독성제, 면역 자극제 또는 억제제, Fab' 단편 또는 상기 논의한 바와 같은 다른 항체 결합 단편)을 포함한다. 예를 들어, 항-hTSLPR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 하나 이상의 다른 결합 분자, 예를 들어 또다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 등에 의해) 기능적으로 연결될 수 있다. 따라서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 항-hTSLPR 항체는 인간 TSLPR에 대한 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 모노클로날 항-hTSLPR 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어, 인간 FcγRI 또는 인간 Fcγ 수용체일 수 있다. 따라서, 본 발명은 FcγRI, FcγR 또는 FcεR 발현 효과기 세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포 (PMNs)) 및 인간 TSLPR을 발현하는 표적 세포 (예를 들어, 인간 CD11c+ 수지상 세포) 모두에 결합할 수 있는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 상기 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적 또는 다중특이적) 분자는 인간 TSLPR 발현 세포를 효과기 세포에 대해 표적화하고, Fc 수용체-매개 효과기 세포 활성, 예를 들어 인간 TSLPR 발현 세포의 포식작용, 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC), 시토킨 방출, 또는 수퍼옥시드 음이온의 생성을 촉발시킨다.

본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 항-hTSLPR 분자는 당업계에 설명된 방법에 의해 제조할 수 있다. 이들은 화학 기술 (예를 들어, Kranz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807, 1981), 폴리도마 (polydoma) 기술 (예를 들어, 미국 특허 4,474,893), 또는 재조합 DNA 기술을 포함한다. 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한 당업계에 공지되고 본원에 설명된 방법을 사용하여 구성하는 결합 특이성 성분, 예를 들어, 항-FcR 및 항-인간 TSLPR 결합 특이성 성분을 컨쥬게이팅시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 각각의 결합 특이성 성분은 별개로 생성시킨 후, 서로 컨쥬게이팅시킬 수 있다. 결합 특이성 성분이 단백질 또는 펩티드일 때, 다양한 커플링제 또는 가교결합제가 공유 컨쥬게이션을 위해 사용될 수 있다. 가교결합제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다. 결합 특이성 성분이 항체 (예를 들어, 2개의 인간화 항체)일 경우, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 구역의 술프히드릴 결합을 통해 컨쥬게이팅될 수 있다. 힌지 구역은 컨쥬게이션 전에 홀수의 술프히드릴 잔기, 예를 들어 하나를 포함하도록 변형될 수 있다.

이중특이적 및 다중특이적 분자의 그들의 특이적 표적에 대한 결합은 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA), 방사성 면역 분석 (RIA), 또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인할 수 있다. 상기 분석은 각각 일반적으로 목적하는 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용하여 특히 목적하는 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 예를 들어 항체-FcR 복합체를 인식하고 특이적으로 결합하는 효소 결합 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있다. 별법으로, 복합체는 임의의 다양한 다른 면역분석을 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 항체는 방사성 표지되고 방사성 면역 분석 (RIA)에 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986] 참조). 방사성 동위원소는 γ 계수기 또는 섬광 계수기 또는 자가방사기록법과 같은 수단에 의해 검출할 수 있다.

III . 항- hTSLPR 항체의 생산을 위한 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 상기 설명된 항-hTSLPR 항체 사슬의 세그먼트 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA)를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 일부는 서열 13에 제시된 중쇄 가변 구역의 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 14에 제시된 경쇄 가변 구역의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 서열 13 또는 서열 14의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 65, 80%, 95%, 또는 99%) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적절한 발현 벡터로부터 발현될 때, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 항원 결합 능력을 보일 수 있다.

또한, 본 발명에서 도 5에 도시된 항-hTSLPR 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 적어도 하나의 CDR 구역 및 대체로 3개의 모든 CDR 구역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 도 5에 도시된 항-hTSLPR 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 구역 서열을 모두 또는 실질적으로 모두 코딩한다. 예를 들어, 일부의 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 5에 제시된 중쇄 가변 구역의 아미노산 서열 및/또는 서열 6에 제시된 경쇄 가변 구역의 아미노산 서열을 코딩한다. 코드의 다의성으로 인해, 다양한 핵산 서열이 각각의 면역글로불린 아미노산 서열을 코딩할 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 항-hTSLPR 항체의 가변 구역 서열만을 코딩할 수 있다. 이들은 또한 항체의 가변 구역 및 불변 구역을 모두 코딩할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 서열 5에 제시된 1D6.C9 마우스 항-hTSLPR 항체의 성숙 중쇄 가변 구역 서열에 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 90%, 또는 99%) 성숙 중쇄 가변 구역 서열을 코딩한다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 6에 제시된 1D6.C9 마우스 항체의 성숙 경쇄 가변 구역 서열에 실질적으로 동일한 성숙 경쇄 가변 구역 서열을 코딩한다. 일부 폴리뉴클레오티드 서열은 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 구역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 각각 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 구역에 실질적으로 동일한 2개의 폴리펩티드 세그먼트를 코딩한다.

폴리뉴클레오티드 서열은 드 노보 (de novo) 고체상 DNA 합성에 의해 또는 항-hTSLPR 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 기존의 서열 (예를 들어, 하기 실시예에 설명된 바와 같은 서열)의 PCR 돌연변이 생성에 의해 생산할 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 포스포트리에스테르 방법 (Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90); 포스포디에스테르 방법 (Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979); 디에틸포스포르아미다이트 방법 (Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981); 및 고체 지지체 방법 (미국 특허 4,458,066)에 의해 달성할 수 있다. 돌연변이를 PCR에 의해 폴리뉴클레오티드 서열에 도입하는 것은 예를 들어 문헌 ([PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992]; [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990]; [Manila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991]; 및 [Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991])에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.

본 발명에서 상기 설명된 항-hTSLPR 항체를 생산하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 또한 제공된다. 항-TSLPR 항체 사슬 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위해 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 항체를 생산하기 위해 바이러스-기반 및 비바이러스 발현 벡터가 모두 사용될 수 있다. 비바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 일반적으로 단백질 또는 RNA를 발현하기 위한 발현 카세트를 갖는 에피솜 벡터, 및 인간 인공 염색체 (예를 들어, 문헌 [Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997] 참조)를 포함한다. 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간) 세포에서 항-hTSLPR 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 유용한 비바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C, (인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고)), MPSV 벡터, 및 다른 단백질을 발현하기 위해 당업계에 공지된 수많은 다른 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스에 기반한 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바 (Epstein Barr) 바이러스, 우두 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트 (Semliki Forest) 바이러스 (SFV)에 기반한 벡터를 포함한다 (문헌 [Brent et al., 상기 문헌]; [Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995]; 및 [Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992] 참조).

발현 벡터의 선택은 벡터가 발현되는 의도된 숙주 세포에 좌우된다. 일반적으로, 발현 벡터는 항-hTSLPR 항체 사슬 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열 (예를 들어, 인핸서)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 유도가능 프로모터는 유도 조건 하인 경우를 제외하고 삽입된 서열의 발현을 억제하기 위해 사용된다. 유도가능 프로모터는 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 충격 프로모터를 포함한다. 형질감염된 유기체의 배양액은 그 발현 산물이 숙주 세포에 의해 보다 양호하게 관용되는 서열을 코딩하는 집단으로 편향되지 않으면서 비유도 조건 하에서 팽창될 수 있다. 프로모터에 추가로, 항-hTSLPR 항체 사슬 또는 단편의 효율적인 발현을 위해 다른 조절 요소가 또한 요구되거나 바람직할 수 있다. 상기 요소는 일반적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현의 효율성은 사용하는 세포 시스템에 적절한 인핸서의 도입에 의해 향상될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994]; 및 [Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서가 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

발현 벡터는 또한 삽입된 항-hTSLPR 항체 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 융합 단백질을 형성하기 위한 분비 신호 서열 위치를 제공할 수 있다. 보다 종종, 삽입된 항-hTSLPR 항체 서열은 벡터에 포함시키기 전에 신호 서열에 연결된다. 항-hTSLPR 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열을 수용하기 위해 사용된 벡터는 때때로 또한 불변 구역 또는 그의 일부를 코딩한다. 상기 벡터는 불변 구역과의 융합 단백질로서 가변 구역의 발현을 허용함으로써 무손상 항체 또는 그의 단편을 생산할 수 있다. 일반적으로, 상기 불변 구역은 인간의 불변 구역이다.

항-hTSLPR 항체 사슬을 내포하고 발현하는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵세포일 수 있다. 이. 콜라이 (E. coli)가 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현시키기 위해 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주는 간균, 예를 들어 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 및 다른 장내세균, 예를 들어 살모넬라 (Salmonella), 세라티아 (Serratia), 및 다양한 슈도모나스 (Pseudomonas) 종을 포함한다. 상기 원핵 숙주에서, 일반적으로 숙주 세포와 적합성인 발현 조절 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 또한, 임의의 많은 다양한 잘 공지된 프로모터, 예를 들어 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 일반적으로 임의로 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 조절하고, 전사 및 번역을 개시시키고 종료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 본 발명의 항-hTSLPR 폴리펩티드를 발현하기 위해 다른 미생물, 예를 들어 효모가 또한 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 조합한 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.

일부 바람직한 실시태양에서, 포유동물 숙주 세포가 본 발명의 항-hTSLPR 폴리펩티드를 발현시키고 제조하기 위해 사용된다. 예를 들어, 이들은 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 (예를 들어, 실시예에서 설명되는 바와 같은 1D6.C9 골수종 하이브리도마 클론) 또는 외인성 발현 벡터를 내포하는 포유동물 세포주 (예를 들어, 아래에 예시된 SP2/0 골수종 세포)일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 사멸될 또는 정상 또는 비정상적인 불사의 (immortal) 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함하여 무손상 면역글로불린을 분비할 수 있는 많은 적합한 숙주 세포주가 개발되었다. 폴리펩티드를 발현하기 위해 포유동물 조직 세포 배양액을 사용하는 것은 예를 들어 문헌 (Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987)에 전반적으로 논의되어 있다. 포유동물 숙주 세포를 위한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예를 들어 복제 기점, 프로모터, 및 인핸서 (예를 들어, 문헌 [Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예를 들어 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 상기 발현 벡터는 대체로 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유도된 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 종류-특이적, 단계-특이적, 및/또는 조정가능한 또는 조절가능한 것일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적인 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도가능 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도가능 CMV 프로모터 (예를 들어 인간 최조기 (immediate early) CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 당업계에 공지된 프로모터-인핸서 조합체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

목적하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 종류에 따라 상이하다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 통상적으로 원핵 세포에 대해 사용되고, 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 대해 사용될 수 있다 (일반적으로 문헌 [Sambrook, et al., 상기 문헌] 참조). 다른 방법은 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜-매개 형질전환, 주사 및 미세주사, 발리스틱 (ballistic) 방법, 비로솜, 면역리포솜, 다양이온:핵산 컨쥬게이트, 네이키드 (naked) DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합 (Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997), DNA 흡수 향상제, 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해, 종종 안정한 발현이 요망될 것이다. 예를 들어, 항-hTSLPR 항체 사슬 또는 결합 단편을 안정적으로 발현하는 세포주는 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선택가능 마커 유전자를 포함하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조할 수 있다. 벡터의 도입 후에, 세포는 1-2일 동안 농축 배지에서 성장시킨 후, 선택 배지로 전환할 수 있다. 선택가능 마커의 목적은 선택에 대한 저항성을 부여하기 위한 것이고, 마커의 존재는 선택 배지에서 도입 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장을 가능하게 한다. 안정하게 형질감염된 저항성 세포는 세포 종류에 적합한 조직 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다.

IV . 항- hTSLPR 항체의 특성

상기 설명된 항-hTSLPR 항체가 숙주 세포에서 발현 벡터로부터 발현되거나 또는 하이브리도마에서 내인성으로 발현된 후, 이들은 배양 배지 및 숙주 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. 대체로, 항체 사슬은 신호 서열을 보유한 상태로 발현되고, 따라서 배양 배지 내로 방출된다. 그러나, 항체 사슬이 숙주 세포에 의해 자연적으로 분비되지 않으면, 항체 사슬은 약한 세제를 사용한 처리에 의해 방출될 수 있다. 이어서, 항체 사슬을 황산암모늄 침전, 고정화된 표적에 대한 친화도 크로마토그래피, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함한 통상적인 방법에 의해 정제할 수 있다. 상기 방법은 당업계에 모두 잘 공지되어 있고 통상적으로 실시되고 있다 (예를 들어, 문헌 ([Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982]; 및 [Harlow & Lane, 상기 문헌]).

예로서, 본 발명의 항-hTSLPR 항체를 발현하는 선택된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제를 위해 2-리터 스피너 (spinner)-플라스크 내에서 성장시킬 수 있다. 상등액을 여과하고 단백질 A-세파로스 또는 단백질 G-세파로스 (파마시아 (Pharmacia; 미국 뉴저지주 피스카타웨이))를 사용한 친화도 크로마토그래피 전에 농축한다. 용출된 IgG는 순도를 보장하기 위해 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 조사할 수 있다. 버퍼 용액은 PBS로 교환될 수 있고, 농도는 OD280 판독에 의해 결정할 수 있다. 모노클로날 항체는 분취되고 -80℃에서 저장될 수 있다.

그들의 제조 방법에 무관하게, 본 발명의 항-hTSLPR 모노클로날 항체는 hTSLPR 또는 그의 항원 단편에 특이적으로 결합한다. 특이적 결합은 hTSLPR 또는 그의 항원 단편에 대한 항체 결합을 위한 해리 상수가 ≤ 1 μM, 바람직하게는 ≤ 100 nM, 가장 바람직하게는 ≤ 1 nM일 때 발생한다. hTSLPR에 결합하는 항체의 능력은 목적하는 항체를 직접 표지함으로써 검출될 수 있거나, 항체는 표지되지 않고, 결합은 다양한 샌드위치 분석 포맷을 이용하여 간접적으로 검출될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Harlow & Lane, 상기 문헌] 참조). 상기한 결합 특이성을 갖는 항체는 하기 실시예에서 논의되는 1D6.C9 마우스 항-hTSLPR 항체가 보이는 유익한 특성을 나타낼 가능성이 더 크다.

본 발명의 항-TSLPR 모노클로날 항체는 TSLP에 의해 매개된 신호 전달 활성을 길항할 수 있다. 상기 활성은 예를 들어 수지상 세포에 의한 T_H2-유인성 케모킨, 예를 들어 TARC 및 MDC의 분비; 수지상 세포의 활성화, 비시험된 CD4+ T 세포 팽창 및 T_H2 표현형으로의 분극, 알레르기 유발성 시토킨, 예를 들어 IL-4, IL-5, IL-13 TNFα의 생산을 포함한다. 항-hTSLPR 항체가 TSLP 매개된 세포 활성을 억제할 수 있는지 결정하기 위해 많은 분석이 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어 실시예에 설명된 임의의 분석, 예를 들어 Ba/F3/hTSLPR/hIL7Rα 세포를 사용한 세포 증식 분석, Ba/F3/hTSLPR/IL7Rα/Stat5-Luc 세포를 사용한 루시퍼라제 리포터 분석, 및 TARC 분비 분석을 포함한다. TSLP 신호 전달 활성을 측정하기 위한 추가의 분석도 문헌에 설명되어 있다 (예를 들어, [Reche et al., J. Immunol., 167:336-43, 2001]; 및 [Isaksen et al., J Immunol. 168:3288-94, 2002]).

일부 실시태양에서, 본 발명의 항-hTSLPR 항체는 도 5에 제시된 가변 구역 서열을 갖는 참조 항-hTSLPR 항체 (예를 들어, 하기 실시예에 설명된 마우스 1D6.C9 항체 또는 그의 키메라 항체)의 hTSLPR 폴리펩티드에 대한 결합을 차단하거나 결합을 위해 경쟁한다. 이들은 상기 설명된 완전 인간 항-hTSLPR 항체일 수 있다. 이들은 또한 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 다른 마우스, 키메라 또는 인간화 항-hTSLPR 항체일 수 있다. 참조 항체 결합을 차단하거나 결합을 위해 경쟁하는 능력은 시험 중인 항-hTSLPR 항체가 참조 항체에 의해 규정된 것과 동일하거나 유사한 에피토프, 또는 참조 항-hTSLPR 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분하게 근접하는 에피토프에 결합함을 나타낸다. 상기 항체는 특히 참조 항체에서 확인된 유익한 특성을 보일 가능성이 있다. 참조 항체를 차단하거나 경쟁하는 능력은 예를 들어 경쟁 결합 분석에 의해 결정될 수 있다. 경쟁적 결합 분석에서, 시험 중인 항체는 참조 항체의 공통적인 항원, 예를 들어 TSLPR 폴리펩티드에 대한 특이적 결합을 억제하는 능력에 대해 조사된다. 과량의 시험 항체가 참조 항체의 결합을 실질적으로 억제한다면, 시험 항체는 항원에 대한 특이적 결합을 참조 항체와 경쟁한다. 실질적인 억제는 시험 항체가 참조 항체의 특이적 결합을 대체로 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 90% 감소시킴을 의미한다.

인간 TSLPR에 대한 결합을 위한 항-hTSLPR 항체의 참조 항-hTSLPR 항체와의 경쟁을 평가하기 위해 사용될 수 있는 많은 공지된 경쟁 결합 분석이 존재한다. 이들은 예를 들어 고체상 직접 또는 간접 방사성 면역 분석 (RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역 분석 (EIA), 샌드위치 경쟁 분석 (Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986); 고체상 직접 표지된 분석, 고체상 직접 표지된 샌드위치 분석 (Harlow & Lane, 상기 문헌); I-125 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA (Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990); 및 직접 표지된 RIA (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32: 77-82, 1990)를 포함한다. 일반적으로, 상기 분석은 고체 표면에 결합된 정제된 항원 또는 표지되지 않은 시험 항-hTSLPR 항체 및 표지된 참조 항체 중의 하나를 포함하는 세포의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정한다. 대체로, 시험 항체는 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항체 (경쟁 항체)는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 입체 장애가 일어나도록 참조 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.

선택된 항-TSLPR 모노클로날 항체가 특유한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 각각의 항체는 상업적으로 이용가능한 시약 (예를 들어, 피어스 (Pierce, 미국 일리노이주 록포드)의 시약)을 사용하여 비오티닐화시킬 수 있다. 비표지된 모노클로날 항체 및 비오티닐화 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 연구는 TSLPR 폴리펩티드 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다. 비오티닐화 MAb 결합은 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로 검출할 수 있다. 정제된 항-TSLPR 항체의 이소형을 결정하기 위해, 이소형 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 미세역가 플레이트의 웰은 1 ㎍/ml의 항-인간 IgG로 4℃에서 철야 코팅할 수 있다. 1% BSA로 차단한 후, 플레이트를 1 ㎍/ml 이하의 모노클로날 항-hTSLPR 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰은 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이팅된 프로브와 반응시킬 수 있다. 이어서, 플레이트를 정제된 항체의 이소형을 결정할 수 있도록 현상하여 분석한다.

hTSLPR 폴리펩티드를 발현하는 살아있는 세포에 대한 모노클로날 항-hTSLPR 항체의 결합을 입증하기 위해, 유동 세포계를 사용할 수 있다. 간단히 설명하면, hTSLPR을 발현하는 세포주 (표준 성장 조건 하에 성장한)를 0.1% BSA 및 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 PBS 중 다양한 농도의 항-hTSLPR 항체와 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅할 수 있다. 세척 후, 세포를 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 샘플은 단일 세포에 대해 게이팅되는, 광 및 측면 산란 특성을 이용하는 FACScan 장치에 의해 분석될 수 있다. 형광 현미경을 사용하는 다른 분석이 유동 세포계 분석에 추가하여 또는 그 대신에 사용될 수 있다. 세포는 상기 설명된 바와 같이 정확하게 염색하고 형광 현미경에 의해 검사할 수 있다. 상기 방법은 개별 세포의 시각화를 허용하지만, 항원의 밀도에 따라 감도를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 항-hTSLPR 항체를 웨스턴 블로팅에 의해 hTSLPR 폴리펩티드 또는 항원 단편과의 반응성에 대해 추가로 시험할 수 있다. 간단히 설명하면, 정제된 hTSLPR 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 TSLPR을 발현하는 세포로부터의 세포 추출물을 제조하여 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막에 옮기고, 10% 태아 송아지 혈청으로 차단하고, 시험되는 모노클로날 항체로 프로빙한다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출하고, BCIP/NBT 기질 정제 (시그마 켐. 컴퍼니 (Sigma Chem. Co., 미국 미쥬리주 세인트 루이스)로 현상할 수 있다.

V. 비-면역글로불린 스캐폴드 ( scaffold )

생성되는 폴리펩티드가 표적 단백질에 특이적인 적어도 하나의 결합 구역을 포함하는 한, 매우 다양한 항체/면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드가 사용될 수 있다. 상기 프레임워크 또는 스캐폴드는 5개의 주요 개별특이형의 인간 면역글로불린, 또는 그의 단편 (예를 들어 본원의 다른 부분에 개시된 것)을 포함하고, 바람직하게는 인간화 측면을 갖는 다른 동물 종의 면역글로불린을 포함한다. 이와 관련하여 단일 중쇄 항체, 예를 들어 카멜리드로 확인되는 것이 특히 중요하다. 신규한 프레임워크, 스캐폴드 및 단편은 당업자들이 계속 개발하고 발견하고 있다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 그래프팅될 수 있는 비-면역글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-면역글로불린 기반 항체를 생산하는 것에 관한 것이다. 서열 X의 표적 단백질에 특이적인 결합 구역을 포함하는 한, 공지의 또는 향후 확인될 비-면역글로불린 프레임워크 및 스캐폴드가 사용될 수 있다. 상기 화합물은 본원에서 "표적-특이적 결합 구역을 포함하는 폴리펩티드"로서 언급된다. 공지된 비-면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 애드넥틴 (피브로넥틴) (캄파운드 테라퓨틱스, 인크. (Compound Therapeutics, Inc., 미국 매사추세츠주 월썸)), 안키린 (몰레큘라 파트너스 아게 (Molecular Partners AG, 스위스 쮜리히)), 도메인 항체 (도만티스, 엘티디 (Domantis, Ltd , 미국 매사추세츠주 캠브리지) 및 압링크스 엔브이 (Ablynx nv, 벨기에 즈뷔나아르드)), 리포칼린 (안티칼린 (Anticalin)) (피어리스 프로테오랩 아게 (Pieris Proteolab AG, 독일 프라이징)), 작은 모듈형 (modular) 면역 제약물 (트루비온 파카슈티칼스 인크. (Trubion Pharmaceuticals Inc., 미국 워싱턴주 시애틀)), 맥시보디스 (아비디아, 인크 (Avidia, Inc., 미국 캘리포니아주 마운틴뷰)), 단백질 A (아피보디 아게 (Affibody AG, 스웨덴)) 및 아필린 (감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴) (스실 프로테인스 게엠베하 (Scil Proteins GmbH, 독일 할레))를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

(i) 애드넥틴 - 캄파운드 테라퓨틱스

애드넥틴 스캐폴드는 피브로넥틴 타입 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 타입 III의 제10 모듈 (10 Fn3 도메인))을 기초로 한 것이다. 피브로넥틴 타입 III 도메인은 2개의 베타 시트 사이에 분포하고 자체가 서로에 대해 뭉쳐서 단백질의 코어 (core)를 형성하는 7 또는 8개의 베타 스트랜드를 갖고, 베타 스트랜드를 서로 연결하고 용매 노출된 루프 (CDR에 유사)를 추가로 포함한다. 베타 시트 샌드위치의 각각의 가장자리에 적어도 3개의 상기 루프가 존재하고, 가장자리는 베타 스트랜드의 방향에 수직인 단백질의 경계이다 (US 6,818,418).

상기 피브로넥틴 기반 스캐폴드는 면역글로불린이 아니지만, 전체적인 폴드 (fold)는 최소 기능적 항체 단편, 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 중쇄의 가변 구역에 밀접하게 관련된다. 상기 구조 때문에, 비-면역글로불린 항체는 항체와 특성 및 친화도가 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 상기 스캐폴드는 생체 내에서 항체의 친화도 성숙 과정과 유사한 시험관 내에서의 루프 무작위화 및 셔플링 (shuffling) 전략에 사용될 수 있다. 상기 피브로넥틴-기반 분자는 분자의 루프 구역이 표준 클로닝 기술을 사용하여 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로서 사용될 수 있다.

( ii ) 안키린 - 몰레큘라 파트너스

이 기술은 상이한 표적에 대한 결합을 위해 사용될 수 있는 가변 구역을 보유하기 위해 스캐폴드로서 안키린 유래 반복 모듈을 갖는 단백질을 사용하는 것을 기초로 한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역평행한 α-나선 및 β-회전 (turn)으로 구성된 33개 아미노산의 폴리펩티드이다. 가변 구역의 결합은 대체로 리보솜 디스플레이를 사용하여 최적화된다.

( iii ) 맥시보디스 ( Maxybodies )/ 아비머스 ( Avimers ) - 아비디아

아비머스는 LRP-1과 같은 단백질을 포함하는 천연 A-도메인으로부터 유래한다. 상기 도메인은 특성상 단백질-단백질 상호작용을 위해 사용되고, 인간에서 250개를 초과하는 단백질에서 구조적으로 A-도메인을 기초로 한 것이다. 아비머스는 아미노산 링커를 통해 연결된 많은 상이한 "A-도메인" 단량체 (2-10)로 구성된다. 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머스는 예를 들어 미국 특허 출원 공개 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 설명된 방법을 이용하여 생성될 수 있다.

( vi ) 단백질 A - 아피보디 ( Affibody )

아피보디(등록상표) 친화도 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중의 하나의 스캐폴드를 기초로 한 3개 나선의 번들로 이루어진 작은 간단한 단백질이다. 단백질 A는 세균 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질이다. 상기 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 구성되고, 이 중 13개가 무작위로 선발되어 매우 많은 리간드 변이체를 갖는 아피보디(등록상표) 라이브러리를 생성시킨다 (예를 들어, US 5,831,012 참조). 아피보디(등록상표) 분자는 항체를 모방하고, 150 kDa인 항체의 분자량에 비해 6 kDa의 분자량을 갖는다. 그의 작은 크기에도 불구하고, 아피보디(등록상표) 분자의 결합 부위는 항체와 유사하다.

(v) 안티칼린 - 피어리스

안티칼린(등록상표)는 피어리스 프로테오랩 아게에서 개발된 제품이다. 안티칼린은 화학적으로 민감하거나 불용성인 화합물의 생리학적 수송 또는 저장에 대체로 관련되는, 널리 보급된 작은 강력한 단백질인 리포칼린으로부터 유도된다. 복수의 천연 리포칼린이 인간 조직 또는 체액에서 발생한다.

단백질 구조는 면역글로불린을 연상시키고, 경질 프레임워크 상에 초가변 루프가 존재한다. 그러나, 항체 또는 그의 재조합 단편과 달리, 리포칼린은 160 내지 180개의 아미노산 잔기를 갖는 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어지고, 단일 면역글로불린 도메인보다 단지 약간 더 크다.

결합 포켓을 구성하는 4개 루프의 세트는 현저한 구조적 유연성을 보이고, 다양한 측쇄를 수용할 수 있다. 따라서, 결합 부위는 높은 친화도 및 특이성을 갖는 상이한 형태의 소정의 표적 분자를 인식하기 위해 독점적인 (proprietary) 방법으로 재성형될 수 있다.

리포칼린 패밀리의 한 단백질인 피어리스 브래시카에 (Pieris Brassicae)의 빌린-결합 단백질 (BBP)은 4개 루프의 세트를 돌연변이시켜 안티칼린을 개발하기 위해 사용되었다. "안티칼린"을 설명하는 특허 출원의 예는 PCT 공개 WO 199916873이다.

(vi) 아필린 (Affilin) - Scil 단백질

아필린™ 분자는 단백질 및 소분자에 대한 선택적 친화도를 위해 디자인된 작은 비-면역글로불린 단백질이다. 새로운 아필린™ 분자는 각각 상이한 인간 유래 스캐폴드 단백질을 기초로 한 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선택될 수 있다. 아필린™ 분자는 면역글로불린 단백질에 대한 임의의 구조적 상동성을 보이지 않는다. Scil 단백질은 2개의 아필린™ 스캐폴드를 사용하고, 그 중 하나는 인간 구조적 수정체 단백질인 감마-크리스탈린이고, 다른 하나는 "유비퀴틴" 수퍼패밀리 단백질이다. 두 인간 스캐폴드는 매우 작고, 고온 안정성을 보이고, pH 변화 및 변성제에 대해 거의 안정성이다. 상기 높은 안정성은 주로 단백질의 팽창된 베타 시트 구조에 의한 것이다. 감마-크리스탈린 유래 단백질의 예는 WO200104144에 설명되고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO2004106368에 설명된다.

VI . 항- hTSLPR 항체의 치료 용도

항-hTSLPR 항체는 TSLP 신호 전달 활성을 억제함으로써 많은 치료 또는 예방 용도로 사용될 수 있다. 이들은 B-세포 발생, T-세포 발생, T-세포 수용체 유전자 재배열, 또는 Stat5 전사 인자의 조절에 영향을 주는 것과 같은, TSLP 신호전달에 의해 매개된 질병 또는 병태를 치료하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항-hTSLPR 길항 항체가 T_H2 세포에 의해 매개된 바람직하지 않은 면역 반응을 억제하거나 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 특히, 이들은 TSLP 신호 전달과 연관되거나 이에 의해 매개되는 알레르기성 염증 질환에 걸린 인간 환자의 치료에 적합하다. 본 발명의 항-hTSLPR 항체를 사용한 치료를 시행할 수 있는 알레르기성 염증 질병은 예를 들어 (1) 기류 폐색 및 기관지 과민반응성과 연관된 기도의 만성 염증성 질병인 천식; (2) 장기간의 간헐적 치료를 필요로 하는 만성의 악화되는 염증성 피부 질병인 아토피 피부염, 및 (3) 아토피와 관련된 T_H2 림프구에 의해 매개되는 비점막의 알레르기 비염, 염증성 질환을 포함한다. 미국 및 유럽의 여러 주요 국가에서, 천식, 아토피 피부염 및 알레르기 비염으로 진단된 유병률은 각각 2013년까지 현재 46백만에서 53백만으로, 현재 31.7백만에서 37.2백만으로, 현재 55.9백만에서 64.5백만으로 증가할 것으로 예상된다. 아토피 피부염에 걸린 환자의 약 50 내지 80%가 천식 또는 알레르기 비염을 갖거나 발병할 것이다.

알레르기를 치료하기 위해 현재 이용가능한 대부분의 약물은 증상 경감을 제공하기 위한 것이지만, 장기간의 질병 완화를 제공하기 위한 면역조절 분야의 노력은 상대적으로 거의 이루어지지 않고 있다. 본 발명의 항-hTSLPR 항체는 임의의 상기 알레르기 질병으로 고통받는 대상 (특히, 인간 환자)의 신규하고 효과적인 치료를 제공할 수 있다. TSLP가 TSLP 수용체 신호 전달 경로를 활성화시키는 것을 억제함으로써, 알레르기성 염증의 개시 및 유지 모두에 작용하는 T_H2 반응 및 시토킨의 생산을 차단할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 아토피 피부염, 천식 및 알레르기 비염 환자에서 장기간 치료 효과 및 질병 완화 효과를 유도하는 잠재력을 갖는다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 임의의 상기 항체 또는 기능적 단편 또는 보존적 변이체, 및 그에 대한 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 갖는 제약 조성물을 제공한다.

특정 실시태양에서, 본 발명은 수용체 표적 hTSLP를 갖는 세포의 존재와 연관된 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 유효량의 임의의 상기 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 관련 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 호흡기 질환이다.

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 기도 과민반응성 (AHR), 점액 과다생성, 섬유증 및 상승된 혈청 IgE 수준을 특징으로 하는 폐의 일반적인 지속적 염증성 질병인 기관지 천식이다.

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 아동기에 가장 흔한 피부 질병으로 심한 가려움증과 만성 습진성 반점을 특징으로 하는 아토피 (알레르기) 피부염이다.

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 다른 염증 또는 폐색성 기도 질병 및 병태, 예를 들어 COPD, 급성 폐 손상 (ALI), 급성/성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 호흡곤란, 알레르기성 기도 염증, 소기도 질병, 폐 암종, 겸상적혈구 질병의 환자에서 급성 흉부 증후군 및 폐성 고혈압, 및 다른 약물 요법, 특히 다른 흡입 약물 요법에 이은 기도 과민반응성의 악화 중에서 선택된다.

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 어떠한 종류나 기원의 것이든지 기관지염, 예를 들어, 급성, 식물성 (arachidic), 카타르성, 크루우프성 (croupus), 만성 또는 결핵성 기관지염이다.

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 어떠한 종류나 기원의 것이든지 진폐증 (염증성, 통상적으로 직업성, 폐의 질병, 빈번하게 기도 폐색을 동반함, 만성 또는 급성, 분진의 반복 흡입에 의해 야기됨), 예를 들어, 알루미늄침착증, 탄분증, 석면증, 석폐증, 첩모탈락증, 철침착증, 규폐증, 연초 중독증 및 면폐증을 포함한다.

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 아토피 비염 (건초열) 및 만성 부비동염 중에서 선택된다.

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 피부의 다른 염증성 병태, 예를 들어, 건선 또는 홍반성 루푸스 중에서 선택된다.

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 염증성 대장 질병, 예를 들어 궤양성 대장염 및 크론병이다.

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 다른 섬유성 병태, 예를 들어 전신 경화증, 간 섬유증, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증 또는 섬유양 (fibroid) 폐 중에서 선택된다.

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 종양 재발 또는 전이이다. Th2 시토킨의 억제는 동물 모델에서 항-바이러스 백신을 향상시키는 것으로 나타났고, HIV 및 다른 감염성 질병의 치료에서 유익할 수 있다 [Ahlers, J. D., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2002].

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 근원적인 만성 병태, 예를 들어 천식, 만성 기관지염, COPD, 중이염, 및 부비동염을 악화시키는 호흡기 바이러스 감염이다. 치료될 호흡기 바이러스 감염은 2차 세균 감염, 예를 들어 중이염, 부비동염 또는 폐렴과 연관될 수 있다.

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 다른 질병 또는 병태, 특히 염증 성분을 갖는 질병 또는 병태, 예를 들어, 뼈 및 관절의 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염, 건선 관절염, 및 다른 질병, 예를 들어 죽상경화증, 다발 경화증, 및 예를 들어 심장, 신장, 간, 폐 또는 골수 이식 후의 급성 및 만성 동종이식편 거부 중에서 선택된다.

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 내독소 쇼크, 사구체신염, 뇌 및 심 허혈, 알츠하이머병, 낭성 섬유증, 바이러스 감염 및 이와 관련된 악화, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 다발 경화증 (MS), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 연관 위염, 및 암, 특히 난소암의 성장이다.

다른 실시태양에서, 치료될 질환 또는 병태는 인간 리노바이러스, 다른 엔테로바이러스, 코로나바이러스, 헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 또는 아데노바이러스에 의해 유발되는 인간에서 바이러스 감염에 의해 유발되는 증상이다.

본 발명에 따른 처치는 증상적 또는 예방적일 수 있다.

예를 들어 염증성 기도 질병에서 염증성 병태를 억제하는데 있어서 본 발명의 물질의 유효성은 예를 들어 문헌 ([Wada et al., J Exp. Med (1994) 180:1135-40]; [Sekido et al., Nature (1993) 365:654-57]; [Modelska et al., Am. J. Respir. Crit. Care. Med (\999) 160:1450-56]; 및 [Laffon et al (1999) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160:1443-49])에 기재된 바와 같이 기도 염증 또는 다른 염증성 병태의 동물 모델, 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼 모델에서 입증될 수 있다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 hTSLP 수용체를 갖는 세포를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포를 추가로 검출가능 표지를 갖는 임의의 상기 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 것을 포함한다. 표지는 방사성, 형광, 자성, 상자성 (paramagnetic), 또는 화학발광성이다. 방법은 추가로 표지된 세포를 영상화 또는 분리하는 것을 포함할 수 있다.

다른 실시태양에서, 임의의 상기 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편은 합성된 것이다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 제약 조성물 및 추가의 치료제를 제공한다.

추가의 치료제는 특히 상기 언급된 것과 같은 폐색성 또는 염증성 기도 질병의 치료에서, 예를 들어 상기 약물의 치료 활성의 강화제로서 또는 상기 약물의 요구되는 용량 또는 잠재적인 부작용을 감소시키는 수단으로서 소염제, 기관지확장제, 항히스타민제 또는 진해제 약물로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 본 발명의 치료제는 다른 약물과 고정된 제약 조성물로 혼합될 수 있거나, 다른 약물 전에, 동시에 또는 후에 따로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 설명된 본 발명의 물질과 소염제, 기관지확장제, 항히스타민제 또는 진해제 약물의 조합물을 포함하고, 본 발명의 상기 물질 및 상기 약물은 동일하거나 상이한 제약 조성물로 존재한다.

적합한 소염제는 스테로이드, 특히 글루코코르티코스테로이드, 예를 들어 부데소니드, 베클라메타손 디프로피오네이트, 플루티카손 프로피오네이트, 시클레소니드 또는 모메타손 푸로에이트, 또는 WO 02/88167, WO 02/12266, WO 02/100879, WO 02/00679 (특히 실시예 3, 11, 14, 17, 19, 26, 34, 37, 39, 51, 60, 67, 72, 73, 90, 99 및 101의 것), WO 03/35668, WO 03/48181, WO 03/62259, WO 03/64445, WO 03/72592, WO 04/39827 및 WO 04/66920에 기재된 스테로이드; 비-스테로이드성 글루코코르티코이드 수용체 효능제, 예를 들어 DE 10261874, WO 00/00531, WO 02/10143, WO 03/82280, WO 03/82787, WO 03/86294, WO 03/104195, WO 03/101932, WO 04/05229, WO 04/18429, WO 04/19935 및 WO 04/26248에 기재된 것; LTB4 길항제, 예를 들어 BIIL 284, CP-195543, DPC11870, LTB4 에탄올아미드, LY 293111, LY 255283, CGS025019C, CP-195543, ONO-4057, SB 209247, SC-53228 및 US 5451700에 기재된 것; LTD4 길항제, 예를 들어 몬테루카스트, 프란루카스트, 자피르루카스트, 아콜레이트, SR2640, Wy-48,252, ICI 198615, MK-571, LY-171883, Ro 24-5913 및 L-648051; PDE4 억제제, 예를 들어 실로밀라스트 (아리플로 (Ariflo)(등록상표) 글락소스미스클라인 (GlaxoSmithKline)), 로플루밀라스트 (비크 굴덴 (Byk Gulden)), V-11294A (나프 (Napp)), BAY19-8004 (바이엘 (Bayer)), SCH-351591 (쉐링-플라우 (Schering-Plough)), 아로필린 (알미랄 프로데스파르마 (Almirall Prodesfarma)), PD189659/PD168787 (파르케-데이비스 (Parke-Davis)), AWD-12-281 (아스트라 메디카 (Asta Medica)), CDC-801 (셀젠 (Celgene)), SelCID™ CC-10004 (셀젠), VM554/UM565 (베르날리스 (Vernalis)), T-440 (다나베 (Tanabe)), KW-4490 (교와 하꼬 고교 (Kyowa Hakko Kogyo)), 및 WO 92/19594, WO 93/19749, WO 93/19750, WO 93/19751, WO 98/18796, WO 99/16766, WO 01/13953, WO 03/104204, WO 03/104205, WO 03/39544, WO 04/000814, WO 04/000839, WO 04/005258, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/018431, WO 04/018449, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/019944, WO 04/019945, WO 04/045607 및 WO 04/037805에 기재된 것; A_2A 효능제, 예를 들어 EP 1052264, EP 1241176, EP 409595A2, WO 94/17090, WO 96/02543, WO 96/02553, WO 98/28319, WO 99/24449, WO 99/24450, WO 99/24451, WO 99/38877, WO 99/41267, WO 99/67263, WO 99/67264, WO 99/67265, WO 99/67266, WO 00/23457, WO 00/77018, WO 00/78774, WO 01/23399, WO 01/27130, WO 01/27131, WO 01/60835, WO 01/94368, WO 02/00676, WO 02/22630, WO 02/96462, 및 WO 03/086408에 기재된 것; 및 A_2B 길항제, 예를 들어 WO 02/42298에 기재된 것을 포함한다.

적합한 기관지확장 약물은 항콜린제 또는 항무스카린제, 특히 이프라트로퓸 브로마이드, 옥시트로퓸 브로마이드, 티오트로퓸 염 및 CHF 4226 (치에시 (Chiesi)), 및 글리코피롤레이트, 및 또한 EP 424021, US 3714357, US 5171744, WO 01/04118, WO 02/00652, WO 02/51841, WO 02/53564, WO 03/00840, WO 03/33495, WO 03/53966, WO 03/87094, WO 04/018422 및 WO 04/05285에 기재된 것; 및 베타-2 아드레날린 수용체 효능제, 예를 들어 알부테롤 (살부타몰), 메타프로테레놀, 터부탈린, 살메테롤 페노테롤, 프로카테롤, 및 특히 포르모테롤, 카르모테롤 및 그의 제약상 허용되는 염, 및 본원에 참조로 포함된 WO 00/75114의 화학식 I의 화합물 (유리 또는 염 또는 용매화물 형태), 바람직하게는 그의 실시예의 화합물, 특히 화합물 (5-[(R)-2-(5,6-디에틸-인단-2-일아미노)-1-히드록시-에틸]-8-히드록시-1H-퀴놀린-2-온) 및 그의 제약상 허용되는 염, 및 WO 04/16601의 화학식 I의 화합물 (유리 또는 염 또는 용매화물 형태), 및 또한 EP 1440966, JP 05025045, WO 93/18007, WO 99/64035, US 2002/0055651, WO 01/42193, WO 01/83462, WO 02/66422, WO 02/70490, WO 02/76933, WO 03/24439, WO 03/42160, WO 03/42164, WO 03/72539, WO 03/91204, WO 03/99764, WO 04/16578, WO 04/22547, WO 04/32921, WO 04/33412, WO 04/37768, WO 04/37773, WO 04/37807, WO 04/39762, WO 04/39766, WO 04/45618 WO 04/46083, WO 04/80964, EP 1460064, WO 04/087142, WO 04/089892, EP 01477167, US 2004/0242622, US 2004/0229904, WO 04/108675, WO 04/108676, WO 05/033121, WO 05/040103 및 WO 05/044787의 화합물을 포함한다.

적합한 이중 소염 및 기관지확장 약물은 이중 베타-2 아드레날린 수용체 효능제/무스카린성 길항제, 예를 들어 US 2004/0167167, WO 04/74246 및 WO 04/74812에 개시된 것을 포함한다.

적합한 항히스타민제 약물은 세티리진 염산염, 아세트아미노펜, 클레마스틴 푸마레이트, 프로메타진, 로라타딘, 데스로라타딘, 디펜히드라민 및 펙소페나딘 염산염, 악티바스틴, 아스테미졸, 아젤라스틴, 에바스틴, 에피나스틴, 미졸라스틴 및 테르페나딘과 JP 2004107299, WO 03/099807 및 WO 04/026841에 개시된 것을 포함한다.

본 발명의 치료제 및 항콜린제 또는 항무스카린제, 스테로이드, 베타-2 효능제, PDE4 억제제, 도파민 수용체 효능제, LTD4 길항제 또는 LTB4 길항제의 조합물이 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 물질과 소염제의 다른 유용한 조합물은 케모킨 수용체의 다른 길항제, 예를 들어 CCR-1, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 및 CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, 특히 CCR-5 길항제, 예를 들어 쉐링-플라우 길항제 SC-351125, SCH-55700 및 SCH-D, 다케다 (Takeda) 길항제, 예를 들어 N-[[4-[[[6,7-디히드로-2-(4-메틸페닐)-5H-벤조시클로헵텐-8-일]카르보닐]아미노]페닐]-메틸]-테트라히드로-N,N-디메틸-2H-피란-4-알미늄 클로라이드 (TAK-770), US 6166037 (특히 청구항 18 및 19), WO 0066558 (특히 청구항 8), WO 0066559 (특히 청구항 9), WO 04/018425 및 WO 04/026873에 기재된 CCR-5 길항제와의 조합물이다.

추가의 치료제는 또한 다른 시토킨 결합 분자, 특히 다른 시토킨의 항체, 특히 항-IL4 항체, 예를 들어 PCT/EP2005/00836에 기재된 것, 항-IgE 항체, 예를 들어 Xolair(등록상표), 항-IL31 항체, 항-IL31R 항체, 항-IL13 항체, 예를 들어 WO05/007699에 기재된 것, 항-엔도글린 항체, 항-IL1b 항체, 항-TSLP 항체 또는 다른 항-hTSLPR 항체와 조합으로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 항-hTSLPR 길항 항체는 대상을 치료적으로 및 예방적으로 처치하기 위해 사용될 수 있다. 치료 용도에서, 항-hTSLPR 길항 항체 (예를 들어, 인간화 항-hTSLPR 항체)를 포함하는 조성물은 이미 TSLP 신호 전달에 의해 유발되거나 그와 연관된 알레르기 질병에 걸린 대상에게 투여된다. 조성물은 항체를 병태 및 그의 합병증을 치유하거나, 그 진행을 부분적으로 정지시키거나, 탐지가능하게 느리게 하기에 충분한 양으로 함유한다. 예방 용도에서, 모노클로날 항-hTSLPR 항체를 함유하는 조성물은 이미 알레르기성 염증 질환에 걸리지 않은 환자에게 투여된다. 오히려, 조성물은 알레르기성 염증 질환을 발병할 위험이 있거나 소인을 갖는 대상에게 처방된다. 상기 용도는 대상에게 환자의 저항을 향상시키거나, TSLP 신호 전달에 의해 매개된 알레르기성 염증 질환의 진행을 저지하도록 허용한다.

VII . 제약 조성물

본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 항-hTSLPR 모노클로날 항체 (무손상 또는 결합 단편)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 조성물은 주어진 알레르기 질환을 치료 또는 예방하기 위해 적합한 다른 치료제, 예를 들어, 상기한 공지의 항-알레르기제를 추가로 함유할 수 있다. 제약상 담체는 조성물을 향상시키거나 안정화시키거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 한다. 제약상 허용되는 담체는 생리학상 적합성인 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.

본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여할 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 변한다. 투여가 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하이거나, 표적의 부위에 근접하게 투여되는 것이 바람직하다. 제약상 허용되는 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한)에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 산의 작용 및 화합물을 불활성화할 수 있는 다른 자연 조건으로부터 화합물을 보호하기 위해 물질로 코팅될 수 있다.

조성물은 무균이고 유체이어야 한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사가능 조성물의 장기 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 포함시킴으로써 일어날 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 당업계에 잘 공지되고 일상적으로 실시되는 방법에 따라 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20^th ed., 2000] 및 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]) 참조). 제약 조성물은 바람직하게는 GMP 조건 하에 제조된다. 일반적으로, 항-hTSLPR 항체의 치료 유효 용량 또는 효능 용량이 본 발명의 제약 조성물에 사용된다. 항-hTSLPR 항체는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제제화된다. 용량 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼러스 (bolus)가 투여될 수 있거나, 수회 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 위급에 의해 지시될 때 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 단위 투여형으로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 단위 투여형은 치료될 대상에 대한 단위 투여량에 적합한 물리적으로 별개의 단위를 나타내고; 각각의 단위는 목적하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 요구되는 제약상 담체와 함게 함유한다.

본 발명의 제약 조성물 내의 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에게 독성이 아니면서 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하기 위해 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 변화될 수 있다. 선택된 용량 수준은 다양한 약동학적 인자, 예를 들어 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배설 속도, 치료의 지속 시간, 사용된 특정 조성물과 조합으로 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강 및 기왕력 등의 인자에 좌우된다.

의사 또는 수의사는 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 것보다 더 낮은 수준에서 제약 조성물 내에 사용되는 본 발명의 항체의 투여를 시작할 수 있고, 목적하는 효과가 달성될 때까지 용량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본원에서 설명된 알레르기성 염증 질환의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 효과적인 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 또는 동물인지, 투여된 다른 의약, 및 처치가 예방적인지 또는 치료적인지를 포함한 많은 상이한 인자에 따라 변한다. 치료 용량은 안정성 및 효능을 최적화하도록 적정할 필요가 있다. 항체를 사용하는 투여에 대해, 용량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg 숙주 체중, 보다 일반적으로 0.01 내지 5 mg/kg 범위이다. 예를 들어, 용량은 1 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중일 수 있거나, 1-10 mg/kg 범위일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회, 또는 매월 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다.

항체는 대체로 다수 경우로 투여된다. 단일 용량 사이의 간격은 매주, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 항-hTSLPR 항체의 혈액 수준을 측정하여 지시될 때 불규칙할 수 있다. 일부 방법에서, 용량은 1-1000 ㎍/ml의 혈장 항체 농도, 일부 방법에서는 25-300 ㎍/ml을 달성하도록 조정된다. 별법으로, 항체는 지속 방출 제형으로서 투여될 수 있고, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 용량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 변한다. 일반적으로, 인간화 항체는 키메라 항체 및 비인간 항체보다 더 긴 반감기를 보인다. 용량 및 투여 빈도는 처치가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 변할 수 있다. 예방 용도에서, 비교적 낮은 용량이 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 나머지 생애 동안 계속 치료를 받는다. 치료 용도에서, 비교적 짧은 간격에서 비교적 높은 용량은 때때로 질병의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질병 증상의 부분적 또는 완전한 경감을 보일 때까지 요구된다. 그 후, 환자는 예방 요법으로 투여될 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 더욱 예시하기 위해 제공되지만, 그 범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 다른 변형은 당업계의 통상의 기술자에게 쉽게 자명할 것이고, 첨부된 청구의 범위 내에 포함된다.

실시예 1. 마우스 항- hTSLPR 길항 항체의 개발

본 실시예는 마우스 항-hTSLPR 길항 항체의 개발을 설명한다. Bcl2 Wehi22 마우스 (#1770)를 인간 TSLPR (Met 1 - Lys 231)/인간 IgG1 Fc (Pro 100 - Lys 330) 융합 단백질 (알앤디 시스템 (R&D System, 미국 미네소타주 미네아폴리스)로부터 구입 (Cat. No. 981-TR, Lot No. EDY1312A)로 면역화시켰다. 면역화는 18일에 걸쳐 총 8회의 주사로 수행하였다. 말초 림프절로부터 B-세포를 단리하고, F0 골수종 세포 (ATCC, 미국 버지니아주 매나사스)에 융합시켰다. 항체 생산은 hTSLPR/Fc 단백질에 대한 ELISA에 의해 스크리닝하였다. hTSLPR을 특이적으로 인식하는 항체를 생산하는 총 24개의 클론을 얻었다. hTSLPR 항체의 세포 표면 TSLPR에 대한 결합을 FACS 분석 (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 산 호세))으로 분석하였다. 간단히 설명하면, BaF3/hTSLPR/hIL7Rα 세포를 하이브리도마 배양 상등액에 이어 FITC-컨쥬게이팅된 항-마우스 IgG와 함께 인큐베이팅하고, FACS 기계 상에서 분석하였다. 결과는 24개의 클론 중 14개의 하이브리도마 클론이 세표 표면 수용체에 결합할 수 있음을 보여주었다.

이어서, hTSLPR 길항 항체에 대해 스크리닝하기 위해 BaF3/hTSLPR/hIL7Rα 세포 내에서 hTSLP-의존 세포 증식 분석을 사용하였다. 세포는 인간 TSLPR 및 IL7Rα 모두를 발현하고, 인간 TSLP의 자극에 반응할 수 있다 (Reche et al., J. Immunol., 167:336-43, 2001). 세포 증식 분석은 본질적으로 상기 문헌 [Reche et al.,]에 설명된 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, BaF3/hTSLPR/hIL7Rα 세포를 배양 상등액으로부터의 항체와 함께 1시간 동안 예비인큐베이팅하고, hTSLP로 도 1에 나타낸 표시된 농도에서 유도하였다. 세포 증식을 Alamar Blue (트렉 다이아노스틱 시스템즈 (TREK Diagnositc Systems, 미국 오하이오주 클레블랜드))를 사용하여 측정하였다. 각각의 모 클론에 대해, 1 내지 3개의 하위클론을 분석에서 사용하였다. 도 1에 도시된 결과는 클론 1D6으로부터의 3개의 하위클론이 강한 길항 활성을 보였음을 나타낸다.

하위클론 중 하나, 1D6.C9로부터의 모노클로날 항체 (mAb)를 정제하였다 (도 2C). 간단히 설명하면, Miniperm 배양액 (비바사이언스 (Vivascience, 미국 캘리포니아주 칼스바드))의 무혈청 조건화 배지를 Cleanascite (리고켐 (LigoChem, 미국 뉴저지주 페어필드))로 처리하였다. 이어서, 항체를 단백질 G 수지 (아머샴 바이오사이언시스 (Amersham Biosciences, 미국 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 정제하였다. 정제된 항체를 상기 설명된 바와 같이 세포 증식 분석으로 시험하였다. Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα 세포 또는 Baf3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5-Luc 세포를 상이한 농도의 항체로 1시간 동안 처리한 후 1 ng/ml hTSLP를 첨가하였다. 결과는 BaF3/hTSLPR/hIL7Rα 세포 (도 3A) 및 Baf3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5-Luc 세포 (도 3B) 모두의 TSLP-의존 증식이 마우스 항-hTSLPR 항체의 첨가에 의해 용량-의존 방식으로 억제되었음을 나타낸다.

또한, TSLP-매개 신호 전달 활성에 대한 항체의 효과를 검사하기 위해 루시퍼라제 리포터 분석을 또한 사용하였다. TSLP는 Baf3/hTSLPR/hIL7Ra 세포에서 Stat3 및 Stati의 인산화를 유도한다 (Reche et al., 상기 문헌). 상기 분석은 TSLP 신호 전달에 반응하여 Baf3/hTSLPR/hIL7Ra/Stat5-Luc 세포에서 Stat5의 제어 하에 리포터 유전자 발현을 측정하기 위해 설계되었다. 간단히 설명하면, Stat 컨센서스 결합 부위를 프로모터 및 인핸서를 함유하지 않는 pGL2 기초 Luc 리포터 벡터 (프로메가 (Promega, 미국 뉴저지주 매디슨)) 내로 삽입함으로써 Stat-Luc 리포터 구성체를 생성하였다. 삽입된 Stat 결합 부위는 TTCCCGGAA의 코어 Stat 결합 서열 (서열 16)을 내포하는 8개의 카피의 GATTTCCCCGAAATG 서열 요소 (서열 15)를 함유한다 (Yan et al., Cell. 84:421-30, 1996; 및 Saylors et al., Gene Ther. 6:944-6, 1999). Stat-Luc 리포터 구성체를 BaF3/hTSLPR/hIL7Rα 세포 내로 도입하였다. 생성되는 BaF3/hTSLPR/hIL7Rα/Stat5-Luc 세포를 상이한 농도의 마우스 항체로 1시간 동안 처리한 후, 1 ng/ml의 hTSLP를 첨가하였다. 루시페라제 활성을 Bright Glo (프로메가)를 사용하여 측정하였다. 분석으로부터 얻은 결과를 도 3C에 도시한다. 세포 증식 분석의 결과와 유사하게, Stat5-Luc 리포터 분석으로부터의 데이타는 또한 마우스 항-hTSLPR 항체의 용량-의존 항길항 활성을 입증하였다.

mAb 1D6.C9 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 구역을 RT-PCR에 의해 클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄의 가변 구역의 확인을 위해 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다. VH에 대한 프라이머는 (1) VH9: GATGGCAGCWGCYCAAAG (서열 1); 및 (2) H-불변: GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC (서열 2)이다. VL에 대한 프라이머는 (1) LCV3: GGGTCTAGACACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA (서열 3); 및 L-불변: GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG (서열 4)이다.

간단히 설명하면, 1D6.C9 클론으로부터 총 RNA를 단리하였다. 중쇄 또는 경쇄 가변 구역의 신호 서열에 대항한 전방향 프라이머, 및 중쇄 CH1 구역 또는 경쇄 카파 불변 구역에 대항한 역방향 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR 산물을 서열 결정을 위해 pCR II 또는 pcDNA3.1/V5-His-TPOP-TA 벡터 내로 클로닝하였다. 이어서, 상기 항체 클론의 중쇄 및 경쇄 가변 구역 서열의 폴리뉴클레오티드 서열을 결정하였다 (도 4). 가변 구역의 대응하는 아미노산 서열 (서열 5 및 서열 6)을 도 5에 도시한다. 또한, 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]의 넘버링 (numbering) 시스템에 따라 추론된 CDR 구역 및 프레임워크 구역을 도 5에 표시한다.

실시예 2. 키메라 항- hTSLPA 항체의 생성

본 실시예는 키메라 항-hTSLPR 항체의 생성 및 특성화를 설명한다. 키메라 항체는 상기 나타낸 마우스 항-hTSLPR 항체 1D6.C9 클론으로부터의 가변 구역 및 인간 면역글로불린으로부터의 불변 구역을 함유한다.

키메라 항체를 생성하기 위해, 인간 TSLPR 클론 1D6.C9에 대한 마우스 항체의 가변 구역을 PCR 기술, 및 카세트 벡터 내로 클로닝하기 위해 설계된 실시예 1에 설명된 프라이머 서열을 사용하여 제조하였다. 이어서, PCR 산물을 각각 표 1에 도시된 서열을 사용하여 인간 면역글로불린 리더 (leader) 서열, J-세그먼트 및 스플라이서 (splicer)-공여 신호와의 인-프레임 융합체를 함유하는 카세트 벡터 내로 클로닝하였다. 이어서, 서열을 인간 면역글로불린 불변 구역을 함유하는 포유동물 발현 벡터, 예를 들어 SP2/0 벡터 내로 전달하였다.

IgG1 카파 발현 벡터 내로 클로닝하기 위한 프라이머 서열

프라이머	서열
NV115-3B-VH 전방향	5' 인산화 CAGGCCCAGGTCCAGCTGGTGCAG 서열 18
NV115-3B-VH 역방향	GGAGCTCACGGTCACCAGGG 서열 19
NV115-3B-VK 전방향	GAGTACGCGTTGTGACATCCAGATGACCCAG 서열 20
NV115-3B-VK 역방향	GCTCAAGCTTCGTACCTTGGCCAAACG 서열 21

중쇄를 발현하는 클론에 대한 선택은 네오마이신 선택을 기초로 한 반면에, 경쇄를 발현하는 클론은 dhfr 선택을 이용하여 선택하였다. 유전자 증폭은 메토트렉세이트를 사용하여 개시하였다. 중쇄에 대한 가변 구역 카세트를 각각 인간 IgG1 및 IgG4 포유동물 발현 벡터에 전달하였다.

서브클로닝에 이어, IgG1 키메라 항체를 생산하기 위해, 키메라 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄의 DNA 플라스미드를 SP2/0 골수종 세포 내로 동시에 전기천공하였다. 마찬가지로, IgG4 키메라 항체를 생산하기 위해, 키메라 IgG4 중쇄 및 카파 경쇄를 SP2/0 골수종 세포 내로 동시에 전기천공하였다. 세포를 게네티신을 사용하여 선택한 후, 게네티신 및 메토트렉세이트를 함유하는 성장 배지에서 배양하고 팽창시켰다. 세포를 항체 정제를 위해 무혈청 배지 내에 적응시킨다. 형질감염된 SP2/0 세포로부터 분비된 키메라 IgG1 및 IgG4 항체를 정제하였다 (도 2A 및 도 2B). 정제된 키메라 IgG1 및 IgG4 항체의 길항 활성을 Luc 리포터 분석으로 마우스 항체에 비교하였다. 치사 수용체 5 (DR5)에 대한 IgG1 키메라 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. hTSLPR, hIL7Rα, 및 Stat5-Luc을 과다발현하는 Ba/F3 세포에서 리포터 유전자 발현에 의해 측정할 때, 결과는 키메라 항-hTSLPR 항체가 마우스 IgG1 항체와 유사한 길항 활성을 나타냈음을 보여준다 (도 6).

실시예 3. 항- hTSLPR 항체는 TSLP -매개 TARC 분비를 억제한다

본 실시예는 항-hTSLPR 길항 항체에 의한 인간 단핵구로부터의 TSLP-매개 TARC 분비의 억제를 설명한다. 상기 나타낸 마우스 및 키메라 항-hTSLPR 항체 모두를 인간 단핵구에 의한 T_H2-유인성 흉선 및 활성화-제어 케모킨 (TARC)의 TSLP-매개 분비에 대한 효과에 대해 검사하였다. 항-hTSLPR 항체의 첨가를 제외하고는, TARC 분비 분석을 본질적으로 문헌 [Soumelis et al., Nat Immunol. 3:673-80, 2002]에 설명된 바와 같이 수행하였다. 결과를 도 7에 도시한다. 도면의 상부 2개의 패널은 각각 TSLP로 자극된 인간 단핵구 및 CD11+ 수지상 세포로부터의 TARC 분비를 보여준다. 하부 3개의 패널은 각각 인간 단핵구로부터의 TSLP-매개된 TARC 분비에 대한 3가지 상이한 항-hTSLPR 항체의 효과를 보여준다. 도면에 나타난 바와 같이, 마우스 항-hTSLPR 항체 및 키메라 항-hTSLPR 항체 (IgG1 및 IgG4 이소형 모두)는 모두 인간 단핵구로부터의 TARC 분비를 용량 의존 방식으로 억제할 수 있었다. 이는 TSLP 신호 전달에 대한 항-hTSLPR 항체의 길항 활성을 추가로 확인하였다.

항-hTSLPR 항체의 결합 친화도를 결정하기 위한 결합 연구는 "온 (on)" (ka) 및 "오프 (off)" (kd) 레이트를 측정하기 위해 표준 Biacore 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 수행하였다. 상기 측정으로 항체에 대한 결합 상수 (KD)를 계산할 수 있다. 용액 결합 운동학을 검사하기 위해 ForteBiop를 사용하여 추가의 분석을 또한 수행하였다. 또한, 항체에 대한 IC50을 결정하기 위해 세포 분석을 사용하였다. 상기 연구의 결과를 표 3에 요약한다.

표적 항체에 대한 친화도, 생물학적 활성, 특이성 및 Cyno 반응성 데이타

	친화도		생물학적 활성					특이성	반응성
항체	Biacore KD [pm] 인간 TSLPR	Forte KD [pm] 인간 TSLPR	IC50 [pM] 인간 TSLPR RGA (15% 혈청)	IC50 [pM] 인간 TSLPR (15% 혈청)	IC50 [pM] 인간 TSLPR 증식	IC50 [pM] 인간 TSLPR 증식 (15% 혈청)	IC50 [pM] 인간 TSLPR 단핵구	IL-%Ra 반응성 %hTSLPR 결합	Cyno 반응성 %hTSLPR 결합
NV115-3B (Fab)	101	51	270	950	210	200	-	0	93
표적	<200	<200	200	N/A	200	N/A	200	0	동등함

항체 서열

NV115 -3B 서열

VH

VK

NV115 -3E 서열

VH

VK

NV115 -3E 서열

VH

VK

상기 본 발명은 이해의 명확성을 위해 설명 및 예로서 일부 상세하게 설명하였지만, 첨부된 청구의 범위의 취지와 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에 대한 특정 변경 및 변형이 가능함이 본 발명의 개시 내용에 비추어 당업계의 통상의 기술자에 자명할 것이다.

본 명세서에서 언급된 모든 공개, 데이타베이스, Genbank 서열, 특허 및 특허 출원은 마치 각각을 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함하는 것으로 표시된 것처럼 본원에 참고로 포함된다.

Claims (32)

1. 각각 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열인 TYGMS (서열 7), WINTYSGVPRYADDFKG (서열 8) 및 EGFITTVVGAAGRFVY (서열 9); 및 각각 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열인 KASQDVGTAVA (서열 10), WASTRHT (서열 11) 및 QQYSTYPT (서열 12)를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
2. 제1항에 있어서, 서열 5의 서열의 아미노산 10 내지 134의 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
3. 제2항에 있어서, 서열 6의 서열의 아미노산 21 내지 128의 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역을 추가로 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
4. 제1항에 있어서, 마우스 항체인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
5. 제1항에 있어서, 키메라 항체인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
6. 제1항에 있어서, 인간 중쇄 불변 구역 및 인간 경쇄 불변 구역을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
7. 제1항에 있어서, 인간화된 것인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
8. 제1항에 있어서, 단일쇄 항체 또는 그의 항원 결합 부분인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
9. 제1항에 있어서, Fab 단편인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
10. 제1항에 있어서, IgG1 또는 IgG4 이소형인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄의 가변 구역 또는 경쇄의 가변 구역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
12. 제11항에 있어서, DNA인 폴리뉴클레오티드.
13. (1) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄를 코딩하는 제1 재조합 DNA 세그먼트, 및 (2) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 경쇄를 코딩하는 제2 재조합 DNA 세그먼트를 포함하고; 상기 제1 및 제2 재조합 DNA 세그먼트들은 각각 제1 및 제2 프로모터에 작동가능하게 연결되어 숙주 세포에서 발현될 수 있는 것인, 단리된 숙주 세포.
14. 제13항에 있어서, 비-인간 포유동물 세포주인 숙주 세포.
15. 유효량의 제1항의 항체를 포함하는, 대상에서 수막염, 뇌부종, 관절염, 신장염, 성인 호흡 곤란 증후군, 췌장염, 근육염, 신경염, 결합 조직 질병, 정맥염, 동맥염, 혈관염, 알레르기, 과민증, 에를리히증 (ehrlichiosis), 통풍, 장기 이식 및 궤양성 대장염으로부터 선택되는 염증성 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
16. 제15항에 있어서, 항체가 인간 항체인 제약 조성물.
17. 제15항에 있어서, 대상이 인간인 제약 조성물.
18. 제15항에 있어서, 대상이 알레르기성 염증 질병에 걸린 대상인 제약 조성물.
19. 제18항에 있어서, 알레르기성 염증 질병이 아토피 피부염, 천식 또는 알레르기 비염인 제약 조성물.
20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제

Images