BRPI0708145A2 - compostos orgánicos - Google Patents

Abstract

COMPOSTOS ORGáNICOS. A presente invenção refere-se a anticorpos contra linfopoetina linfopoietina dó estroma tímico humana (hTSLP) e, especialmente aqueles que neutralizam a atividade de hTSLP. Ela refere-se ainda a métodos em que moléculas de anticorpo anti-hTSLP são utilizadas no diagnóstico ou tratamento de doenças relacionadas com hTSLP, como asma, dermatite atópica, rinite alérgica, fibrose, doença inflamatória intestinal e linforma de Hodgkin.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"COMPOSTOS ORGÂNICOS".

Campos de Aplicação

A presente invenção refere-se a anticorpos contra linfópoietinado estroma tímico humana (hTSLP) e, especialmente aqueles queneutralizam a atividade de hTSLP. Ela refere-se ainda a métodos em quemoléculas de anticorpo anti-hTSLP são utilizadas no diagnóstico outratamento de doenças relacionadas com hTSLP, como asma, dermatiteatópica, rinite alérgica, fibrose, doença inflamatória intestinal e Iinforma deHodgkin.

Antecedentes da Invenção

Linfopoetina do estroma tímico humana (hTSLP) (Número deacesso do GenBank: NM_033035), uma citocina semelhante à interleucina-7(IL-7) produzida por células do estroma epitelial e mastócitos humanos, iniciaa resposta alérgica pela estimulação de células dendríticas (DC)1. A proteínadeduzida dé 159 aminoácidos é 43% idêntica a TSLP de camundongo econtém uma seqüência de sinalização de 28 resíduos, 6 cisteínàs e 2suspostos sítios de N-glicosilação. A análise por Eletroforese em Gel dePoliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) nativomostrou a expressão de uma proteína de 23 quiloDalton (kDa), enquantoque a massa molecular calculada da proteína madura é de 14,9 kDa,sugerindo que a hTSLP é glicosilada. A hTSLP contém 7 aminoácidos (aa)básicos no C-terminal, N-Lisina-Arginina-Arginina-Arginina-Lisina-Arginina-Lysina-C (KKRRKRK), e 6 cisteínàs, provavelmente envolvidas na formaçãode ligações dissulfeto.

A hTSLP é altamente expressada por células epiteliais deamídalas inflamadas e ceratinócitos na dermatite atópica e esta expressão éassociada à migração e ativação de células de Langerhans2.

O complexo do receptor da TSLP é um heterodímero formadopelo receptor da TSLP (TSLPR) e uma cadeia alfa do receptor de IL-7 (IL-7Ra). O receptor é expresso primariamente em monócitos e DC derivadasde tecido mielóide, bem como em linfócitos B3.A alergia é resultante de uma cascata imune complexa que levaà produção desregulada de citocinas derivadas da subpopulação delinfócitos do tipo 2 de células auxiliares {ίΐθΐρβή do Timo (Th2), da geraçãode linfócito B produtores de IgE específica do alérgeno e da ativaçãosubseqüente e desgranulação de mastócitos ao serem confrontados com oalérgeno.

A DC desempenha um importante papel em vários modelos dealergia, pelo qual DC humanas ativadas por TSLP produzem quimiocinasque atraem Th2, porém não IL-12, e induzem a diferenciação de linfócito Tsem memória, positivo para antígeno CD4 e CD8 em células efetoras comfenótipo pró-alérgico típico.

A dermatite atópica (AD) representa uma doença inflamtória depele crônica e recorrente com aspectos clínicos característicos4.Antecedente genético, exposições ambientais, como alérgenos emalimentos, aeroalérgenos, antígenos microbianos ou estresse, epredisposições imunológicas distintas contribuem todos para odesenvolvimento de lesões periódicas pruriginòsas eczematosas empacientes acometidos. Foi demonstrado que diversos fatores solúveis estãoaumentados no sangue periférico de pacientes com AD. Essas citocinas equimiocinas desempenham um importante papel na regulação dadiferenciação, ativação e migração de DC e são importantes na coordenaçãodo trânsito de células imunes. hTSLP, produzida por células do estromaepitelial e mastócitos humanos, inicia a resposta alérgica pela estimulaçãode DC. As DC ativadas por TSLP produzem as quimiocinas CC que induzema quimiotaxia e polarização de linfócitos efetores específicos de alérgenos5.Dessa forma, TSLP, derivada de células epiteliais e estromais,possivelmente representa um dos fatores que iniciam as respostas alérgicase poderia ser um alvo de uma abordagem terapêutica curativa para alergia.

Em estudos recentes, foi descrito um anticorpo policlonal anti-TSLP humana (R&D Systems, AF1398). Este anticorpo foi produzido emovelha imunizada com TSLP recombinante derivada de E. coli. A IgG deovelha específica de TSLP humana foi purificada por cromatogria porafinidade com hTSLP. Este anticorpo policlonal foi selecionado por suacapacidade para neutralizar a bioatividade da hTSLP, tendo exibido menosde 1% de reatividade cruzada com a TSLP recombinante murina. A Dose deNeutralização^ (ND50), para este anticorpo, foi definida como aconcentração de anticorpos necessária, em um ensaio, para inibiçãomáxima, em metade, da ação da hTSLP recombinante sobre a linhagem decélulas responsivas de camundongo BaF/3, co-transfectadas com cadeiasde IL-7Ra e hTSLPR. A ND5O foi determinada como sendo deaproximadamente 0,05 - 0,25 Mg/ml, na presença de 0,5 ng/ml de hTSLPrecombinante. A desvantagem de anticorpos policlonais é o seu suprimentolimitado, uma vez que o suprimento de soro proveniente do mesmo animaltratado é restrito. Adicionalmente, anticorpos policlonais reconhecemepítopos múltiplos no mesmo antígeno, podendo haver reatividade cruzadanão desejada. Embora soro policlonal contenha uma mistura de Iigantes dealta e baixa afinidade que têm como alvo uma faixa de epítopos, umaabordagem de anticorpo monoclonal assegura a seleção do candidato maisútil para aplicação terapêutica.

Anticorpos policlonais derivados de animal, quando injetados emseres humanos, constituem uma proteína estranha em um hospedeirohumano, freqüentemente provocando uma resposta de antiglobulina emdecorrência de sua imunogenicidade em seres humanos. Esta resposta deantiglobulina, predominantemente dirigida contra os domínios constantesdos anticorpos do animal, impede geralmente o tratamento apósadministração repetida.

Resumo da Invenção

Uma concretização da invenção provê nesta exposição umanticorpo isolado humano ou humanizado, ou fragmento funcional domesmo, com uma região de ligação com antígeno específica para a hTSLPprotéica visada, e o anticorpo ou fragmento funcional deste liga-se a hTSLP.Em uma concretização relacionada, a ligação com hTSLP é determinada,pelo menos, por ligação com receptor de superfície celular da hTSLP,impedindo a liberação do mediador inflamatório.Em ainda uma outra concretização, a invenção provê uma regiãode ligação com antígeno isolada de um anticorpo ou fragmento funcionaldeste. Em certas concretizações, a região de ligação com antígeno isoladainclui uma região de H-CDR1, contendo uma seqüência de aminoáçidosselecionada entre as SEQ ID N-: 1-7, e variações conservadoras destas.

Conforme são descritas nesta exposição, as variações conservadorasincluem resíduos de ; aminoáçidos em quaisquer das seqüências deaminoáçidos identificadas. Em uma concretização relacionada, a região deligação com antígeno isolada é uma região de H-CDR2, contendo umaseqüência de aminoáçidos selecionada entre as SEQ ID N-: 8-25, evariações conservadoras destas. Em uma outra concretização relacionada, aregião de ligação com antígeno isolada é uma região de H-CDR3, contendouma seqüência de aminoáçidos selecionada entre as SEQ ID N-: 26-31, evariações conservadoras destas.

Em uma outra concretização, a região de ligação com antígenoisolada é uma região de L-CDR1, contendo uma seqüência de aminoáçidosselecionada entre as SEQ ID N-: 32-40, e variações conservadoras destas.

Em ainda uma outra concretização relacionada, a região deligação com antígeno isolada é uma região de L-CDR2, contendo umaseqüência de aminoáçidos selecionada entre as SEQ ID N-: 41-49, evariações conservadoras destas. Em ainda outra concretização relacionada,a região de ligação com antígeno isolada é uma região de L-CDR3,contendo uma seqüência de aminoáçidos selecionada entre as SEQ ID N-:50-66, e variações conservadoras destas.

Em uma outra concretização, a região de ligação com antígenoisolada é uma cadeia pesada contendo uma seqüência de aminoáçidosselecionada entre de uma a três da SEQ ID 1-31, e uma seqüência com,pelo menos, 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade de seqüência, nasregiões de CDR, com as regiões de CDR com as SEQ ID N-: 1-31. Em umaconcretização relacionada, a região de ligação com antígeno isolada é umacadeia leve contendo uma seqüência de aminoáçidos selecionada entre deuma a três das SEQ ID N-: 32-66, e uma seqüência com, pelo menos, 60,70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade de seqüência nas regiões de CDRcom as regiões de CDR com as SEQ ID N25: 32-66.

Em uma certa concretização, o anticorpo isolado é uma IgG. Emuma outra concretização, o anticorpo isolado é uma IgGI, lgG2 ou lgG4.

Em ainda outra concretização, a invenção provê um anticorpoisolado humano ou humanizado, ou fragmento funcional deste, com umaregião de ligação com antígeno, específica para um epítopo da hTSLP, e oanticorpo ou fragmento funcional deste liga-se a receptores de superfície dehTSLP em uma célula. Em uma concretização relacionada, a invenção provêum anticorpo humano ou humanizado isolado, ou fragmento funcional deste,com uma região de ligação com antígeno, específica para um epítopo dahTSLP visada, e o epítopo contém um ou mais resíduos de aminoácidos dosresíduos dos aminoácidos 1-112 da hTSLP visada. Em uma concretizaçãorelacionada, o epítopo é um epítopo conformacional.

Em ainda outra concretização, o anticorpo ou fragmentofuncional é um fragmento de anticorpo Fab ou scFv. Em uma concretizaçãorelacionada, o anticorpo isolado é uma IgG. Em uma outra concretizaçãorelacionada, o anticorpo isolado é uma IgGI, lgG2 ou lgG4.

Em outra concretização, a invenção provê uma composiçãofarmacêutica compreendendo, pelo menos, um de quaisquer dos anticorposou fragmentos funcionais acima, ou variações conservadoras, e um veículoou excipiente farmaceuticamente aceitável para a mesma.

Em ainda uma outra concretização, a invenção provê um animaltransgênico com um gene que codifica qualquer um dos anticorpos acima,ou fragmentos funcionais destes.

Em certas concretizações, a invenção provê um método paratratamento de um distúrbio ou condição, associado com a presença decélulas com hTSL, alvo. de receptor. O método envolve a administração deuma quantidade efetiva de qualquer uma das composições farmacêuticasacima para um indivíduo em necessidade da mesma. Em uma concretizaçãorelacionada, o distúrbio ou condição a ser tratado é uma doença respiratória.

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição a sertratado é asma brônquica, uma doença inflamatória persistente do pulmão,caracterizada por hiperresponsividade das vias aéreas (AHR), produçãoexcessiva de muco, fibrose e níveis elevados de IgE sérica. Um papelsignificativo da TSLP foi demonstrado em um modelo com camundongo, emque a expressão específica em pulmão de transgene de TSLP induziuinflamação alérgica, hiperplasia de células globosas, fibrose subepitelial eníveis aumentados de IgE (Zhou B, et a! Nat. Immunol. 6: 1047-1053). Alémdisso, camundongos desprovidos do receptor de TSLP eram protegidos derespostas alérgicas quando expostos à presença de antígenos em aerossol.Ademais, foi descrito haver um vínculo entre níveis de expressão de TSLPem células epiteliais do pulmão e gravidade dá doença asmática em sereshumanos (Ying, S.B. et ai. J. Immunol. 174: 8183-8190).

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição a sertratado é dermatite atópica (alérgica), uma das doenças mais comuns depele na infância e caracterizada por prurido intenso e placas eczematosascrônicas. Um papel significativo da TSLP foi demonstrado em um modelocom camundongo, em que a expressão específica em pele de transgene deTSLP induziu lesões cutâneas eczematosas, contendo infiltrados de célulasinflamatórias, aumento em células Th2 na circulação e aumento em IgEsérica (Yoo, J. et al. J. Exp. Med. 202: 541-549). Além disso, foi constatadoem seres humanos um nível de expressão bastante alto de TSLP em seçõesde tecidos de lesões de dermatite atópica que foi associado à migração eativação de células de Langherans (Soumelis, V. et al. Nat. Immunol. 3: 673-680).

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição a sertratado é selecionado entre outras doenças e condições inflamtórias ouobstrutivas das vias aéreas, como doença pulmonar obstrutiva crônica(DPOC), lesão pulmonar aguda (LPA), síndrome de angústia respiratóriaaguda/ do adulto (SARA), dispnéia, inflamação alérgica das vias aéreas,doença de pequenas vias aéreas, carcinoma de pulmão, síndrome torácicaaguda em pacientes com doença das células falciformes e hipertensãopulmonar, bem como exacerbação de hiperreatividade das vias aéreas,secundária a uma outra terapia com fármaco, especialmente outra terapiacom fármaco inalado.

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição a sertratado é bronquite de qualquer tipo ou gênese, incluindo, entre outras,bronquite aguda, araquídica, catarral, membranosa, crônica ou fibrinosa.

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição a sertratado inclui pneumoconiose (uma doença inflamatória, geralmenteocupacional dos pulmões, freqüentemente acompanhada por obstrução dasvias aéreas, quer crônica ou aguda, e ocasionada por inalação repetida depoeiras) de qualquer tipo ou gênese, incluindo, por exemplo, aluminose,antracose, asbestosé, calicose, ptilose, siderose, silicose, tabacose ebissinose.

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição a sertratado é selecionado entre rinite atópica (febre do feno) e sinusite crônica.

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição a sertratado é selecionado entre outras condições inflamatórias da pele, porexemplo, psoríase ou Iupus eritematoso.

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição a sertratado é doença intestinal inflamatória, como colite ulcerativa e doença deCrohn.

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição à sertratado é selecionado entre outras condições fibróticas, como esclerosesistêmica, fibrose hepática, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática oupulmão fibróide.

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição a sertratado é recorrência de tumor ou metástase. Foi mostrado que a inibição decitocinas Th2 intensificam vacinas antivirais em modelos de animais, e podeser benéfica no tratamento de HIV e de outras doenças infecciosas [Ahlers,J. D. et ai Proc Natl Acad Sci U S A, 2002].

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição a sertratado é uma infecção viral respiratória que exacerba condições crônicassubjacentes, como asma, bronquite crônica, DPOC, otite média e sinusite. Ainfecção viral respiratória tratada pode estar associada à infecção bacterianasecundária, como otite média, sinusite ou pneumonia.

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição a sertratado é selecionado entre outras doenças ou condições, especialmentedoenças ou condições que tenham componente inflamatório, por exemplo,doenças do osso e articulações, incluindo artrite reumatóide, artritepsoriática e outras doenças como aterosclerose, esclerose múltipla erejeição aguda e crônica a aloenxerto, por exemplo, após transplante decoração, rim, fígado, pulmão ou medula óssea.

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição a sertratado é choque endotóxico, glomerulonéfrite, isquemia cerebral e cardíaca,doença de Alzheimer, fibrose cística, infecções por vírus e as exacerbaçõesassociadas às mesmas, síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS),esclerose múltipla (EM), gastrite associada a Helicobacter pylori e cânceres,especialmente o crescimento de câncer ovariano.

Em uma outra concretização, o distúrbio ou condição a sertratado inclui os sintomas provocados por infecção viral em ser humano,causada pelo rinovírus humano, outros enterovírus, coronavírus, vírus deherpes, vírus Influenza, vírus Parainfluenza, vírus sincicial respiratório ouadenovírus.

• O tratamento de acordo com a presente invenção pode sersintomático ou profilático.

A efetividade de um agente da invenção em inibir condiçõesinflamatórias, por exemplo, em doenças inflamatórias das vias aéreas, podeser demonstrada em um modelo animal, por exemplo, modelo comcamundongo, rato ou coelho, de inflamação de vias aéreas ou outrascondições inflamatórias, por exemplo, conforme descrito por Wâda et al, J.Exp. Med (1994) 180:1135-40; Sekido et al, Nature (1993) 365:654-57; Mo-delska et ai, Am. J. Respir. Crit. Care. Med (1999) 160:1450-56; e Laffon etal (1999) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160:1443-49.

Em ainda uma outra concretização, a invenção provê um métodopara identificação de uma célula que possua um receptor para hTSLP. Estemétodo envolve o contato da célula com qualquer um dos anticorpos oufragmentos de anticorpos acima, contendo ainda uma marcação que possaser detectada. As marcações são radioativas, fluorescentes, magnéticas,paramagnéticas ou quimioluminescentes. O método pode envolver aindaqualquer visualização das imagens acima ou separação da célula marcada.

Em uma outra concretização, qualquer um dos anticorposhumanos ou humanizados, ou fragmentos de anticorpos, são sintéticos.

Em uma outra concretização, a invenção provê uma composiçãofarmacêutica e um agente terapêutico adicional.

O agente terapêutico adicional pode ser selecionado do grupoconsistindo em princípios ativos antiinflamatórios, broncodilatadores,antihistamínicos ou antitussígenos, especialmente no tratamento de doençasobstrutivas ou inflamatórias das vias aéreas, como aquelassupramencionadas, por exemplo, como potenciadores de ação terapêuticadesses fármacos ou como meio para reduzir as doses requeridas oupossíveis efeitos colaterais destes fármacos. Um agente terapêutico dainvenção pode ser misturado com o outro princípio ativo em umacomposição farmacêutica definida, ou pode ser administradoseparadamente, antes, simultaneamente ou após o outro princípio ativo. Deacordo com o mesmo, a invenção inclui uma combinação de um agente dainvenção, conforme descrito anteriormente nesta exposição, com umprincipio ativo antiinflamatório, broncodilatador, antihistamínico ouantitussígeno, o referido agente da invenção e o referido princípio ativoestando na mesma ou em diferente composição farmacêutica.

Fármacos antiinflamatórios adequados incluem esteróides,especialmente, glicocorticosteróides, como budesonida, dipropionato debeclametasona, propionato de fluticasona, furoato de ciclesonida oumometasona, ou esteróides descritos em WO 02/88167, WO 02/12266, WO02/100879, WO 02/00679 (especialmente aqueles dos Exemplos 3, 11, 14,17, 19, 26, 34, 37, 39, 51, 60, 67, 72, 73, 90, 99 e 101), WO 03/35668, WO03/48181, WO 03/62259, WO 03/64445, WO 03/72592, WO 04/39827 e WO04/66920; agonistas de receptores de glicocorticóides não esteróidais, comoaqueles descritos em DE 10261874, WO 00/00531, WO 02/10143, WO03/82280, WO 03/82787, WO 03/86294, WO 03/104195, WO 03/101932,WO 04/05229, WO 04/18429, WO 04/19935 e WO 04/26248; antagonistasde LTB4, como BIIL 284, CP-195543, DPC11870, LTB4 etanolamida, LY293111, LY 255283, CGS025019C, CP-195543, ONO-4057, SB 209247,SC-53228 e aqueles descritos em US 5451700; antagonistas de LTD4,incluindo montelukast, pranlukast, zafirlukast, acolato, SR2640, Wy-48,252,ICI 198615, MK-571, LY-171883, Ro 24-5913 e L-648051; inibidores dePDE4m, como cilomilast (Ariflo® GIaxoSmithKIine), Roflumilast (BykGulden), V-11294A (Napp), BAY19-8004 (Bayer), SCH-351591 (Schering-Plough), Arofilina (Almirall Prodesfarma), PD189659 / PD168787 (Parke-Davis), AWD-12-281 (Asta Medica), CDC-801 (Celgene), SeICID(TM) CC-10004 (Celgene), VM554/UM565 (Vernalis), T-440 (Tanabe), KW-4490(Kyowa Hakko Kogyo) e aqueles expostos em WO 92/19594, WO 93/19749,WO 93/19750, WO 93/19751, WO 98/18796, WO 99/16766, WO 01/13953,WO 03/104204, WO 03/104205, WO 03/39544, WO 04/000814, WO04/000839, WO 04/005258, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457,WO 04/018465, WO 04/018431, WO 04/018449, WO 04/018450, WO04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/019944, WO 04/019945,WO 04/045607 e WO 04/037805; agonistas de A2a, como aqueles descritosem EP 1052264, EP 1241176, EP 409595A2, WO 94/17090, WO 96/02543,WO 96/02553, WO 98/28319, WO 99/24449, WO 99/24450, WO 99/24451,WO 99/38877, WO 99/41267, WO 99/67263, WO 99/67264, WO 99/67265,WO 99/67266, WO 00/23457, WO 00/77018, WO 00/78774, WO 01/23399,WO 01/27130, WO 01/27131, WO 01/60835, WO 01/94368, WO 02/00676,WO 02/22630, WO 02/96462, e WO 03/086408; e antagonistas de A2b, comoaqueles descritos em WO 02/42298.

Fármacos broncodilatadores adequados incluem agentesanticolinérgicos ou antimuscarínicos, especialmente brometo de ipratrópio,brometo de oxitrópio, sais de tiotrópio e CHF 4226 (Chiesi), e glicopirrolato,porém também aqueles descritos em EP 424021, US 3714357, US 5171744,WO 01/04118, WO 02/00652, WO 02/51841, WO 02/53564, WO 03/00840,WO 03/33495, WO 03/53966, WO 03/87094, WO 04/018422 e WO04/05285; e agonistas de adrenoceptor beta-2, como albuterol (salbutamol),metaproterenol, terbutalina, salmeterol, fenoterol, procaterol eespecialmente, formoterol, carmoterol e sais farmaceuticamente aceitáveisdos mesmos, e compostos (em forma livre ou de sal ou solvato) da fórmula Ide WO 00/75114, cuja exposição é aqui incorporada por referência nestepedido, de preferência os compostos dos Exemplos da mesma, por exemplo,(5-[(R)-2-(5,6-dietil-indan-2-ilamino)-1 -hidroxi-etil]-8-hidroxi-1 H-quinolin-2-ona) e sais farmaceuticamente aceitáveis destes, bem como compostos (emforma livre ou dè sal ou solvato) da fórmula I de WO 04/16601, e tambémcompostos de EP 1440966, JP 05025045, WO 93/18007, WO 99/64035, US2002/0055651, WO 01/42193, WO 01/83462, WO 02/66422, WO 02/ 70490,WO 02/76933, WO 03/24439, WO 03/42160, WO 03/42164, WO 03/72539,WO 03/91204, WO 03/99764, WO 04/16578, WO 04/22547, WO 04/32921,WO 04/33412, WO 04/37768, WO 04/37773, WO 04/37807, WO 04/39762,WO 04/39766, WO 04/45618 WO 04/46083 , WO 04/80964, EP1460064,WO 04/087142, WO 04/089892, EP 01477167, US 2004/0242622, US2004/0229904, WO 04/108675, WO 04/108676, WO 05/033121, WO05/040103 e WO 05/044787.

Fármacos duplos antiinflamatórios e broncodilatadoresaceitáveis incluem o agonista adrenoceptor beta-2 duplo / antagonistasmuscarínicos, como aqueles expostos em US 2004/0167167, WO 04/74246e WO 04/74812.

Princípios ativos antihistamínicos adequados incluem cloridrato de cetirazina, acetaminofen, fumarato de clemastina, prometazina, loratidina,desloratidina, difenidramina e cloridrato de fexofenadina, activastina,astemizol, azelastina, ebastina, epinastina, mizolastina e tefenadina, bemcomo aqueles expostos em JP 2004107299, WO 03/099807 e WO04/026841.

Combinações de agentes terapêuticas da invenção e agentesanticolinérgicos ou antimuscarínicos, esteróides, agonistas beta-2, inibidoresde PDE4, agonistas de receptores de dopamina, antagonistas de LTD4 ouantagonistas de LTB4 podem ser utilizados também. Outras combinaçõesúteis de agentes da invenção com fármacos antiinflamatórios são aquelascom outros antagonistas de receptores de quimiocinas, por exemplo, CCR-1,CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 e CCR10, CXÇR1,CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, especialmente antagonistas de CCR-5,como os antagonistas SC-351125, SCH-55700 e SCH-D da Schering-Plough, antagonistas da Takeda como cloreto de N-[[4-[[[6,7-dihidro-2-(4-

metilfenil)-5H-benzociclohepten-8-il]carbonil]amino]fenil]-metil]-tetrahidro-N,N-dimetil-2H-piran-4-amônio (TAK-770), antagonistas de CCR-5 descritosem US 6166037 (especialmente, reivindicações 18 e 19), WO 0066558(especialmente, reivindicação 8), WO 0066559 (especialmente, reivindicação9), WO 04/018425 e WO 04/026873.

O agente terapêutico adicional pode ser selecionado do grupoconsistindo em outras moléculas que se ligam a citocinas, especialmenteanticorpos de outras citocinas, em particular uma combinação com umanticorpo anti-IL4, conforme descrito em PCT/EP2005/00836, um anticorpoan anti-IgE, como Xolair®, um anticorpo anti-IL31, um anticorpo anti-IL31 R,um anticorpo anti-IL13, conforme descrito em W005/007699, um anticorpoanti-endoglina, um anticorpo anti-IL1b, um anticorpo anti-TSLPR ou outroanticorpo anti-hTSLP.

Em uma certa concretização, a invenção provê um anticorpocom uma primeira seqüência de aminoácidos, como cadeia pesada,selecionada entre de.uma a três das SEQ ID N-: 1-31, e uma seqüênciacom, pelo menos, 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade de seqüêncianas regiões de CDR com as regiões de CDR com as SEQ ID N-: 1-31; euma segunda seqüência de aminoácidos, como cadeia leve, selecionadaentre de uma a três das SEQ ID Nes: 32-66, e uma seqüência com, pelomenos, 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade de seqüência nasregiões de CDR com as regiões de CDR, mostradas nas SEQ ID N-: 32-66.

Em ainda uma outra concretização, a invenção provê umimunoconjugado formado por um anticorpo ou fragmento deste comoprimeiro componente e um segundo componente com uma segundaseqüência de aminoácidos. Por exemplo, o imunoconjugato é umacitotoxina, ou o imunoconjugado é uma proteína de conjugação ou anticorpocom especificidade de ligação por um alvo diferente de hTSLP.

Em certas concretizações, a invenção provê um anticorpo bi-específico.

Em uma outra concretização, a invenção provê um kit com umanticorpo ou fragmento de um anticorpo destes. Em algumasconcretizações, o kit contém ainda um veículo ou excipientefarmaceuticamente aceitável para o mesmo. Em outras concretizaçõesrelacionadas, o anticorpo presente no kit é em dose unitária. Em ainda umaoutra concretização relacionada, ò kit inclui instruções a serem utilizadas naadministração para um indivíduo.

Descrição Resumida das figuras

A figura 1 descreve ov etor de expressão HuCAL® FabpMORPH®X9_Fab_FH (carregando o anti-TSLP Fab MC>R04494)FDescrição Detalhada da Invenção

A presente invenção refere-se a anticorpos isolados,especialmente anticorpos humanos que se ligam especificamente a hTSLP eque inibem propriedades funcionais da hTSLP. Em certas concretizações, osanticorpos da invenção são derivados de seqüências especiais de cadeiapesada e leve e/ou compreendem características estruturais especiais, comoregiões de CDR incluindo seqüências de aminoácidos especiais. A invençãoprovê anticorpos isolados, métodos de produção destes anticorpos,imunoconjungados e moléculas bi-específicas compreendendo estesanticorpos, e composições farmacêuticas contendo os anticorpos,imunoconjugados ou moléculas bi-específicas da invenção. A invençãorefere-se também a métodos de uso dos anticorpos para inibir um distúrbioou condição, associado à presença de hTSLP visada por receptor celular,por exemplo, no tratamento de uma condição inflamatória ou alérgica,especialmente uma doença inflamatória ou obstrutiva das vias aéreas.

Inicialmente, é apresentada a definição de certos termos paraque a presente invenção possa ser entendida mais rapidamente. Definiçõesadicionais são apresentadas em toda a descrição detalhada.

O termo "hTSLP" refere-se a TSLP humana. A presenteinvenção provê anticorpos para a TSLP humana, especialmente anticorposhumanos que' apresentam reação cruzada com TSLP de primatas nãohumanos, incluindo TSLP de macaco cynomolgus e de macaco rhesus.

Anticorpos de acordo com algumas concretizações da presente invençãopodem reconhecer uma isoforma variante truncada de TSLP, na qual aproteína termina na alanina no resíduo 99, resultante de serem excluídos osúltimos 60 aminoácidos do C-terminal, e também um polimorfismo denucleotídeo isolado (SNP) da TSLP, no qual o resíduo cisteína é substituídopela tirosina ná posição 90 da seqüência de aminoácidos. O termo "respostaimune" refere-se à ação de, por exemplo, linfócitos, células apresentadorasde antígenos, fagócitos, granulócitos e macromoléculas solúveis, produzidaspelas células acima ou o fígado (incluindo anticorpos, citocinas ecomplemento) que resulta em lesão seletiva, destruição ou eliminação docorpo humano de patógenos invasores, células ou tecidos infectados porpatógenos, células cancerosas ou, em casos de autoimunidade ouinflamação patológica, células ou tecidos humanos normais.

Uma "via de transdução de sinal" refere-se à relação bioquímicaentre uma variedade de moléculas de transdução de sinais quedesempenham um papel na transmissão de sinal de parte de uma célulapara uma outra parte de uma célula. Conforme utilizada nesta exposição, afrase "receptor de superfície celular" inclui, por exemplo, moléculas ecomplexos de moléculas capazes de receber um sinal e capazes detransmitir este sinal através da membrana plasmática de uma célula. Umexemplo de "receptor de superfície celular" é o receptor da hTSLP ao qualliga-se a molécula da proteína hTSLP.

O termo "anticorpo", conforme referido nesta exposição, incluianticorpos completos e qualquer fragmento de ligação de antígeno (ou seja,"porção de ligação de antígeno"), ou cadeias isoladas dos mesmos. Um"anticorpo" que ocorre naturalmente é uma glicoproteína compreendendo,pelo menos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), conectadasentre si por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é composta por umaregião variável de cadeia pesada (abreviada nesta exposição como VH) euma região constante de cadeia pesada. A região constante da cadeiapesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve écomposta por uma região variável de cadeia leve (abreviada nestaexposição como Vl)- e uma região constante de cadeia leve. A regiãoconstante da cadeia leve compreende um domínio, CL. As regiões Vh e Vlpodem ser subdivididas ainda em regiões de hipervariabilidade,denominadas regiões determinantes de variabilidade (CDR), entremeadascom regiões mais conservadas, denominadas regiões framework (FR). CadaVh e Vl são compostas por três CDRs e quatro FRs, arranjadas do grupoamino terminal para carboxi terminal, na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2,CDR2, FR3 CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e levescontêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiõesconstantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina atecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune(por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (CIq) do sistemaclássico de componentes.

O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo (ousimplesmente, "porção de antígeno"), conforme utilizado nesta exposição,refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidadede ligar-se especificamente a um antígeno (por exemplo, hTSLP). Foidemonstrado que a função de ligação com antígeno de um anticorpo podeser executada por fragmentos de um anticorpo completo. Exemplos defragmentos de ligação abrangidos pelo termo "porção de ligação deantígenos" de um anticorpo incluem fragmento Fab, um fragmentomonovalente consistindo nos domínios VL, VH, Cl e CH1; fragmento F(ab)2,um fragmento divalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados poruma ponte dissulfeto na região de articulação (hinge); fragmento Fdconsistindo nos domínios Vh e CH1; fragmento Fv composto pelos domíniosVl e Vh de um único braço de um anticorpo; fragmento dAb (Ward et ai,1989 Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; e uma regiãodeterminante de complementaridade (CDR) isolada.

Além do mais, embora os dois domínios do fragmento Fv1 Vl e

VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos,empregando métodos de recombinação, por um Iigante sintético quepossibilita que sejam produzidos como cadeia protéica única, em que asregiões Vl e Vh unem-se para formar moléculas monovalentes (conhecidocomo Fv de cadeia única (scFv); consultar, por exemplo, Bird et ai., 1988Science 242:423-426; e Huston et ai.,Λ988 Proc. NatL Acad. Sei. 85:5879-5883). Conforme pretendido, o termo "porção de ligação de antígenos" deum anticorpo deve abranger também estes anticorpos de cadeia única.Estes fragmentos de anticorpos são obtidos empregando técnicasconvencionais conhecidas de especialistas na técnica, e os fragmentos sãoselecionados em função de sua utilidade, na mesma maneira que anticorposinteiros.

Um "anticorpo isolado", conforme utilizado nesta exposição,refere-se a um anticorpo substancialmente livre de outros anticorpos comespecificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isoladoque se liga especificamente com hTSLP está substancialmente livre deanticorpos que se ligam especificamente com antígenos diferentes dahTSLP). Um anticorpo isolado que se liga especificamente com hTSLP pode,no entanto, apresentar reatividade cruzada com outros antígenos, comomoléculas de TSLP de outras espécies. Ademais, um anticorpo isolado podeestar substancialmente livre de outro material celular e/ou substânciasquímicas. "Anticorpo isolado" refere-se também a um anticorpo contra o alvoque exibe reatividade cruzada com homólogos/ortólogos conhecidos, bemcomo anticorpos contra o alvo que não exibe reatividade cruzada comhomólogos/ortólogos conhecidos.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorposmonoclonais", conforme utilizados nesta exposição, referem-se a umpreparado de moléculas de anticorpos de uma única composição molecular.Uma composição de anticorpos monoclonais exibe uma única especificidadee afinidade de ligação para um epítopo em particular.O termo "anticorpo humano", conforme utilizado nestaexposição, pretende incluir anticorpos com regiões variáveis, em que tantoas regiões framework (conservadas) como CDR são derivadas deseqüências de origem humana. Além do mais, se o anticorpo contiver umaregião constante, esta é derivada também destas seqüências humanas, porexemplo, seqüências de linhagem germinativa humana ou versões mutadasde seqüências de linhagens germinativas humanas. Os anticorpos humanosda invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados porseqüências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênesealeatória ou sítió-específico in vitro ou por mutação somática in vivo). Noentanto, o termo "anticorpo humano", conforme utilizado nesta exposição,não pretende incluir anticorpos nos quais seqüências de CDR, derivadas dalinhagem germinativa de outras espécies de mamíferos, como decamundongo, foram enxertadas em seqüências humanas da estruturaprincipal. Anticorpos com CDR enxertadas, ou tecnologia alternativa criadapara minimizar a resposta do Anticorpo Humano Anti-murino (Tecnologia deengenharia de humanização (humaneering) da Kalobios ou tecnologia dehumanização da PDL). Xoma possui também tecnologia de "engenhariahumana"; consultar, por exemplo, a patente US 5766886.

O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a umanticorpo obtido de uma população substancialmente homogênea deanticorpos, que reconhece e se liga a um determinante (ou epítopo) noantígeno. Anticorpos monoclonais exibem especificidade de ligação únicacom regiões variáveis em que as regiões framework e CDR são derivadasde seqüências humanas. Em uma concretização, os anticorpos monoclonaishumanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida deum animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongotransgênico, contendo um genoma compreendendo um transgene de cadeiapesada humana e um transgene de cadeia leve fundido a uma célulaimortalizada.

O termo "anticorpo humano recombinante", conforme utilizadonesta exposição, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados,expressados, criados ou isolados por meios recombinantes, como anticorposisolados de um animal (por exemplo, um camundongo), transgênico outranscromossômico quanto a genes de imunoglobulina humana, ou de umhibridoma preparado dos mesmos, anticorpos isolados de uma célulahospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo,de um transfectoma, anticorpos isolados de uma biblioteca combinatorial deanticorpos humanos, e anticorpos preparados, expressados, criados ouisolados por quaisquer outros meios que involvam montagem de genes(splicing) de todo ou de uma parte de um gene de imunoglobulina humana,de seqüências para outras seqüências de DNA. Estes anticorpos humanosrecombinantes possuem regiões variáveis em que as regiões framework eCDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de linhagensgerminativas humanas. Em certas concretizações, no entanto, estesanticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos a mutagênese invitro (ou, quando um animal transgênico para seqüências de IgG humana éutilizado, mutagênese somática in vivo) e, dessa forma, as seqüências deaminoácidos das regiões Vh e Vl dos anticorpos recombinantes sãoseqüências que, embora derivadas e relacionadas com as seqüências de Vhe Vl de linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente norepertório de linhagem germinativa humana de anticorpos in vivo.

Conforme utilizado nesta exposição, "isotipo" refere-se à classedo anticorpo (por exemplo, IgM, IgE, IgG como IgGI, lgG2 ou lgG4)codificado pelos genes da região constante da cadeia pesada.

As frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "umanticorpo específico para um antígeno" são utilizadas alternadamente, nestaexposição, com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a umantígeno."

Conforme utilizado nesta exposição, um anticorpo que "se ligaespecificamente a hTSLP" pretende referir-se a um anticorpo que se liga aTSLP humna com K0 de 1 χ 10"9 M ou menos. Um anticorpo que "reagecruzado com um antígeno diferente da hTSLP" pretende referir-se a umanticorpo que se liga àquele antígeno com 1 χ 10"9 M ou menos. Umanticorpo que "não reage cruzado com um antígeno em particular" pretendereferir-se a um anticorpo que se liga àquele antígeno com K0 de 1,5 χ 10'8 Mou mais, ou K0 de 5-10 χ 10'8 M ou 1 χ 10~7 M ou mais. Em certasconcretizações, estes anticorpos que não reagem cruzado com o antígenoexibem ligação essencialmente não detectável contra estas proteínas emensaios de ligação convencionais.

Conforme utilizado nesta exposição, um anticorpo que "inibe aligação de hTSLP com o receptor de hTSLP" refere-se a um anticorpo queinibe a ligação de hTSLP ao receptor com KD de 5 nM ou menos.

Conforme utilizado nesta exposição, um anticorpo que "inibe aliberação de mediadores inflamatórios" pretende referir-se a um anticorpoque inibe a expressão induzida de hTSLP de Iuciferase de uma linhagem decélula Baf-3 transfectada com o receptor de TSLP e um sistema repórter deluciferase e secreção de hTSLP induzida de TARC de monócitos humanosprimários, isolados de PBMCs com IC5O inferior a 1,0 nM.

O termo "KassOc" ou "Ka", conforme utilizado nesta exposição,pretende referir-se à taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno especificada, enquanto que o termo "Kdis" ou "KD," conformeutilizado nesta exposição, pretende referir-se à taxa de dissociação de umainteração anticorpo-antígeno especificada. O termo "KD", conforme utilizadonesta exposição, pretende referir-se à constante de dissociação, obtida darelação entre Kd e Ka (ou seja, Kd/Ka) e expressa em concentração molar(M). Valores de K0 de anticorpos podem ser determinados por métodos bemestabelecidos na técnica. Um método para determinação da K0 de umanticorpo emprega ressonância plasmônica de superfície ou um sistemabiossensor, como um sistema Biacore®.

Conforme utilizado nesta exposição, o termo "alta afinidade" deum anticorpo IgG refere-se a anticorpos com K0 de 10"9 M ou menos emrelação a um antígeno-alvo.

Conforme utilizado nesta exposição, o termo "indivíduo" refere-se a animal não humano ou ser humano.

O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, porexemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos,ovelhas, cachorros, gatos, cavalos, vacas, coelhos, anfíbios, répteis, etc.

Várias características da invenção são descritas maisdetalhadamente nas subseções subseqüentes.

Ensaios convencionais para avaliar a capacidade de ligação dosanticorpos com hTSLP de várias espécies são conhecidos na técnica,incluindo, por exemplo, ELISAs, wèstern blots e RIAs. Ensaios adequadossão descritos em detalhes nos Exemplos. A cinética de ligação (porexemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos pode ser avaliada por ensaiosconvencionais conhecidos na técnica, como por análise da Biacore. Ensaiospara avaliar os efeitos dos anticorpos sobre propriedades funcionais dahTSLP são descritos mais detalhadamente nos Exemplos.

De acordo com o mesmo, se entenderá que um anticorpo que"inibe" uma ou mais destas propriedades funcionais da hTSLP (por exemplo,atividades bioquímicas, imunoquímicas, celulares, fisiológicas ou outrasatividades biológicas ou similares), conforme determinadas de acordo commetodologias conhecidas na técnica, está relacionado com diminuiçãoestatisticamente significativa na atividade em particular, em relação àobservada na ausência do anticorpo (por exemplo ou quando um anticorpode controle de especificidade irrelevante estiver presente). Um anticorpo queinibe a atividade da hTSLP efetua esta diminuição estatisticamentesignificativa em, pelo menos, 10% do parâmetro medido, em, pelo menos,50%, 80% ou 90%, e, em certas concretizações, um anticorpo da invençãopode inibir mais do que 95%, 98% ou 99% da atividade funcional da hTSLP.

Anticorpos Monoclonais

Os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonaishumanos, isolados e estruturalmente caracterizados conforme descritos nosExemplos 1-5. As seqüências de aminoácidos de Vh dos anticorpos sãomostradas nas SEQ ID N-: 1-31, respectivamente. As seqüências deaminoácidos de Vl dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID N-: 32-66,respectivamente. Outros anticorpos da invenção incluem aminoácidos queforam mutados, embora ainda apresentando, pelo menos, 60, 70, 80, 90 ou95 por cento de identidade nas regiões CDR com as regiões CDR retratadasnas seqüências descritas acima.

Como cada um destes anticorpos pode ligar-se a hTSLP, asseqüências de Vh e Vl podem ser "misturadas e combinadas" de forma aserem criadas outras moléculas de ligação anti- hTSLP da invenção. Aligação com hTSLP destes anticorpos "misturados e combinados" pode sertestada empregando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos(por exemplo, ELISAs). Quando as cadeias de Vh e Vl são misturadas ecombinadas, uma seqüência de Vh de um pareamento Vh/Vl em particulardeve ser substituída por uma seqüência de Vh estruturalmente semelhante.Igualmente, uma seqüência de Vl de um pareamento Vh/Vl em particulardeve ser substituída por uma seqüência de Vl estruturalmente semelhante.As seqüências de Vh e Vl dos anticorpos da presente invenção sãoparticularmente adaptáveis para mistura e combinação, uma vez que asseqüências de Vh e Vl destes anticorpos derivam de seqüências da mesmalinhagem germinativa, exibindo, conseqüentemente, semelhança estrutural.

Em outra característica, a invenção provê anticorpos quecompreendem CDRIs, CDR2s e CDR3s de cadeia pesada e de cadeia levedos anticorpos, ou combinações destes. As seqüências de aminoácidos dasCDRIs de Vh dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID №: 1-7. Asseqüências de aminoácidos das CDR2s de Vh dos anticorpos são mostradasnas SEQ ID №: 8-25. As seqüências de aminoácidos das CDR3s de Vh dosanticorpos são mostradas nas SEQ ID N25: 26-31. As seqüências deaminoácidos das CDRIs de Vl dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID№: 32-40. As seqüências de aminoácidos das CDR2s de Vl dos anticorpossão mostradas nas SEQ ID №: 41 -49. As seqüências de aminoácidos dasCDR3s de Vl dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID №: 50-66. Asregiões CDR regions são delineadas empregando o sistema de Kabat(Kabat, E. A. et ai, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIHPublication

91 -3242).

Dado que cada um destes anticorpos é capaz de ligar-se ahTSLP e que a especificidade de ligação com antígeno é providaprimariamene pelas regiões CDR1, 2 e 3, as seqüencias da CDR1, 2 e 3 deVh e as seqüências de CDR1, 2 e 3 de Vl podem ser "misturadas ecombinadas" (óu seja, CDRs de anticorpos diferentes podem ser misturadase combinadas, embora cada anticorpo tenha que conter uma CDR1, 2 e 3 deVh e uma CDR1, 2 e 3 de VL) a fim de serem criadas outras moléculas deligação anti-hTSLP da invenção. A ligação com hTSLP destes anticorpos"misturados e combinados" pode ser testada empregando os ensaios deligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, ELISAs). Quandoseqüências de CDR de Vh CDR são misturadas e combinadas, a seqüênciada CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência de Vh em particular deve sersubstituída por seqüência(s) de CDR estruturalmente semelhante(s).Igualmente, quando seqüências de CDR de Vl são misturadas ecombinadas, a seqüência da CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência deVl em particular deve ser substituída por seqüência(s) de CDRestruturalmente semelhante(s). Tornará-se rapidamente aparente paraqualquer técnico no assunto que novas seqüências de Vh e Vl poderão sercriadas pela substituição de uma ou mais seqüências da CDR de Vh e/ou Vlpor seqüências estruturalmente semelhantes daquelas seqüências de CDRapresentadas nesta exposição para anticorpos monoclonais da presenteinvenção.

Um anticorpo monoclonaí isolado, ou porção de ligação comantígeno do mesmo, possui: uma região CDR1 variável de cadeia pesadacompreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupoconstituído pelas SEQ ID N-: 1-7; uma região CDR2 variável de cadeiapesada, compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo constituído pelas SEQ ID N2s: 8-25; uma região CDR3 variável decadeia pesada, compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadado grupo constituído pelas SEQ ID N-: 26-31; uma região CDR1 variável decadeia leve, compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo constituído pelas SEQ ID Nss: 32-40; uma região CDR2 variável decadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo constituído pelas SEQ ID N22: 41-49; uma região CDR3 variável decadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo constituído pelas SEQ ID N2s: 50-66; em que o anticorpo liga-seespecificamente a hTSLP.

Em uma certa concretização, o anticorpo é constituído por: umaregião CDR1 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 3;uma região CDR2 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO:15; uma região CDR3 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ IDNO: 28; uma região CDR1 variável de cadeia leve compreendendo a SEQ IDNO: 38; uma região CDR2 variável de cadeia leve compreendendo a SEQ IDNO: 47; e uma região CDR3 variável de cadeia leve compreendendo a SEQID NO: 60.

Em uma outra concretização, o anticorpo é constituído por: umaregião CDR1 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 3;uma região CDR2 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ IDNO: 17; uma região CDR3 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQID NO: 28; uma região CDR1 variável de cadeia leve compreendendo a SEQID NO: 38; uma região CDR2 variável de cadeia leve compreendendo a SEQID NO: 47; e uma região CDR3 variável de cadeia leve compreendendo aSEQ ID NO: 60.

Em ainda uma outra concretização, o anticorpo é constituído por:uma região CDR1 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO:3; uma região CDR2 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ IDNO: 18; uma região CDR3 variável de cadeia pesada compreendendo aSEQ ID NO: 28; uma região CDR1 variável de cadeia leve compreendendo aSEQ ID NO: 38; uma região CDR2 variável de cadeia leve compreendendo aSEQ ID NO: 47; e uma região CDR3 variável de cadeia leve compreendendoa SEQ ID NO: 60.

Em uma outra concretização, o anticorpo é constituído por: umaregião CDR1 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 3;uma região CDR2 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO:19; uma região CDR3 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ IDNO: 28; uma região CDR1 variável de cadeia leve compreendendo a SEQ IDNO: 38; uma região CDR2 variável de cadeia leve compreendendo a SEQ IDNO: 47; e uma região CDR3 variável de cadeia leve compreendendo a SEQID NO: 60.

Em uma outra concretização, o anticorpo é constituído por: umaregião CDR1 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 3;uma região CDR2 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO:20; uma região CDR3 variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ IDNO: 28; uma região CDR1 variável de cadeia leve compreendendo a SEQ IDNO: 38; uma região CDR2 variável de cadeia leve compreendendo a SEQ IDNO: 47; e uma região CDR3 variável de cadeia leve compreendendo a SEQID NO: 60.

Conforme utilizado nesta exposição, um anticorpo humanocompreende regiões variáveis de cadeia pesada ou de cadeia leve que são"o produto" ou "derivadas de" uma seqüência de linhagem germinativa emparticular se as regiões variáveis do anticorpo forem obtidas de um sistemaque emprega genes de imunoglobulina de linhagens germinativas humanas.Estes sistemas incluem a imunização de um camundongo transgênico,portando genes de imunoglobulina humana, com o antígeno de interesse, oua seleção em uma biblioteca de genes de imunoglobulina humana exibidaem fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano que é "oproduto" ou "derivado de" uma seqüência de imunoglobulina de linhagemgerminativa humana pode ser identificado como tanto pela comparação daseqüência de aminoácidos do anticorpo humano com as seqüências deaminoácidos de imunoglobulinas de linhagens germinativas humanas e aseleção da seqüência de imunoglobulina da linhagem germinativa humanamais próxima em termos de seqüência (ou seja, com o % de identidade maisalto) em relação à seqüência do anticorpo humano. Um anticorpo humanoque é "o produto" ou "derivado de" uma seqüência de imunoglobulina delinhagem germinativa humana pode conter diferenças em aminoácidos emcomparação com a seqüência da linhagem germinativa em decorrência de,por exemplo, mutações somáticas que ocorram naturalmente ou aintrodução intencional de mutação sítio-direcionada. No entanto, umanticorpo humano selecionado é tipicamente, pelo menos, 90% idêntico, emtermos de seqüência de aminoácidos, a uma seqüência de aminoácidoscodificada por um gene de imunoglobUlina de linhagem germinativa humanae contém resíduos de aminoácido que identificam o anticorpo humano comohumano, quando comparado às seqüências de aminoácidos daimunoglobulina de linhagens germinativas de outras espécies (por exemplo,seqüências de linhagens germinativas murinas). Em certos casos, umanticorpo humano pode ser, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 90% ou, pelomenos, 95%, ou até mesmo, pelo menos, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico,em termos de seqüência de aminoácidos, à seqüência de aminoácidoscodificada pelo gene da imunoglobulina de linhagem germinativa humana.

Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma seqüência de linhagemgerminativa humana em particular exibira não mais do que 10 aminoácidosdiferentes da seqüência de aminoácidos codificada pelo gene daimunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em certos casos, oanticorpo humano pode exibir não mais do que 5, ou até mesmo não maisdo que 4, 3, 2, ou 1 aminoácido diferente da seqüência de aminoácidoscodificada pelo gene da imunoglobulina de linhagem germinativa humana.

Anticorpos Homólogos

Em ainda uma outra concretização, um anticorpo da invençãopossui regiões variáveis de cadeia pesada e de leve com seqüências deaminoácidos homólogas às seqüências de aminoácidos dos anticorposdescritos nesta exposição, e em que os anticorpos retêm as propriedadesfuncionais desejadas dos anticorpos anti-hTSLP da invenção.

Por exemplo, a invenção provê um anticorpo monoclonalisolado, ou porção de ligação com antígeno do mesmo, compreendendouma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve,em que: a região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência deaminoácidos, pelo menos, 80% homóloga a uma seqüência de aminoácidos,selecionada do grupo constituído pelas SEQ ID N-: 1-31; a região variávelde cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos, pelo menos,80% homóloga a uma seqüência de aminoácidos, selecionada do grupoconstituído pelas SEQ ID N-: 32-66; o anticorpo liga-se especificamente ahTSLP e exibe, pelo menos, uma das seguintes propriedades funcionais: oanticorpo inibe' a proteína de ligação da hTSLP ao receptor da hTSLP ouinibe o receptor de ligação da hTSLP, impedindo ou atenuando umacondição inflamatória ou alérgica, especialmente uma doença inflamatória ouobstrutiva das vias aéreas, ou o anticorpo inibe a ligação do receptor dahTSLP, impedindo ou atenuando asma ou o anticorpo inibe a ligação doreceptor da hTSLP, impedindo ou atenuando DPOC.

Em várias concretizações, o anticorpo pode exibir uma ou mais,duas ou mais ou três ou mais das propriedades funcionais discutidas acima.O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpohumanizado ou um anticorpo quimérico.

Em outras concretizações, as seqüências de aminoácidos de Vhe/ou Vl podem ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%homólogas às seqüências expostas acima. Um anticorpo contendo regiõesde Vh e Vl com alta (ou seja, 80% ou mais) homologia com as regiões de Vhe Vl das SEQ ID N-: 1-31 e 32-66, respectivamente, pode ser obtido pormutagênese (por exemplo, mutagênese sítio-direcionada ou mediada porPCR) de moléculas de ácido nucléico, codificadoras das SEQ ID N-: 1-31e/ou 32-66, seguida por testes do anticorpo codificado alterado quanto àfunção retida (ou seja, as funções expostas acima), empregando os ensaiosfuncionais descritos nesta exposição.

Conforme utilizado nesta exposição, o percentual de homologiaentre duas seqüências de aminoácidos é equivalente ao percentual deidentidade entre as duas seqüências. O percentual de identidade entre asduas seqüências é função do número de posições idênticas compartilhadaspelas seqüências (ou seja, % de homologia = número de posições idênticas/número total de posições χ 100), levando em conta o número de lacunas e aextensão de cada lacuna que precisam ser introduzidos para o alinhamentomais adequado das duas seqüências. A comparação de seqüências edeterminação de percentual de identidade entre as duas seqüências podemser realizadas empregando um algoritmo matemático, conforme descrito nosexemplos não restritivos abaixo.

O percentual de identidade entre duas seqüências deaminoácidos pode ser determinado com o algoritmo de E. Meyers e W. Miller(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) que foi incorporado no programaALIGN (versão 2.0), utilizando a tabela de peso de resíduo PAM120,penalidade por extensão de lacuna de 12 e penalidade por lacuna de 4.Ademais, o percentual de identidade entre duas seqüências de aminoácidospode ser determinado empregando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J.Mol, BioL 48:444-453, 1970) que foi incorporado no programa GAP,constante do pacote de software da GCG (disponível no endereçohttp://www.gcg.com), utilizando a matriz Blossom 62 ou matriz PAM250, epeso de coluna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e peso de extensão de 1, 2, 3, 4,5 ou 6.

Adicional ou alternativamente, as seqüências de proteínas dapresente invenção podem ser utilizadas ainda como "seqüência de consulta"para pesquisa em banco de dados públicos para, por exemplo, identificarseqüências relacionadas. Estas pesquisas podem ser conduzidasempregando o programa XBLAST (versão 2.0) de Altschul etal., 1990 JMolBiol. 215:403-10. As pesquisas de proteína BLAST podem ser feitas com oprograma XBLAST, pontuação = 50, extensão de palavra = 3, para seremobtidas seqüências de aminoácidos homólogas às moléculas do anticorpoda invenção. Para serem obtidos alinhamentos de lacunas, para finscomparativos, o programa Gapped BLAST pode ser utilizado, conformedescrito em Altschul et ai, 1997 Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402.Quando se utilizam os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetrospadrões dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST)podem ser empregados. Consultar o endereço http:www.ncbi.nlm.nih.gov.

Anticorpos com Modificações Conservadoras

Em certas concretizações, um anticorpo da invenção possui umaregião variável de cadeia pesada, constituída por seqüências de CDR1,CDR2 e CDR3, e uma região variável de cadeia leve, constituída porseqüências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que uma ou mais destasseqüências de CDR possuem seqüências de aminoácidos especificadas,baseadas nos anticorpos descritos nesta exposição, ou modificaçõesconservadoras' das mesmas, e em que os anticorpos conservam aspropriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti- hTSLP da invenção.

De acordo com o mesmo, a invenção provê um anticorpo monoclonalisolado, ou porção de ligação com antígeno deste, consistindo em umaregião variável de cadeia pesada, constituída por seqüências de CDR1,CDR2 e CDR3, e uma região variável de cadeia leve, constituída porseqüências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que: as regiões variáveis dacadeia pesada de CDR1 são seqüências consistindo em seqüências deaminoácidos, selecionadas do grupo constituído por seqüências deaminoácidos das SEQ ID N-: 1-7, e modificações conservadoras dasmesmas, a região variável da cadeia pesada de CDR2 são seqüênciasconsistindo em seqüências de aminoácidos, selecionadas do grupoconstituído por seqüências de aminoácidos das SEQ ID N-: 8-25, emodificações conservadoras das mesmas, a região variável da cadeiapesada de CDR3 são seqüências consistindo em seqüências deaminoácidos, selecionadas do grupo constituído por seqüências deaminoácidos das SEQ ID N-: 26-31, e modificações conservadoras dasmesmas, as regiões variáveis da cadeia leve de CDR1 são seqüênciasconsistindo em seqüências de aminoácidos, selecionadas do grupoconstituído por seqüências de aminoácidos das SEQ ID N-: 32-40, emodificações conservadoras das mesmas, as regiões variáveis da cadeialeve de CDR2 são seqüências consistindo em seqüências de aminoácidos,selecionadas do grupo constituído por seqüências de aminoácidos das SEQID N-: 41-49, e modificações conservadoras das mesmas, as regiõesvariáveis da cadeia leve de CDR3 são seqüências consistindo emseqüências de aminoácidos, selecionadas do grupo constituído porseqüências de aminoácidos das SEQ ID N-: 50-66, e modificaçõesconservadoras destas; o anticorpo liga-se especificamente a hTSLP; e oanticorpo inibe a ligação do receptor da hTSLP, impedindo a liberação demediadores inflamatórios.

Em várias concretizações, o anticorpo pode exibir uma ou mais,duas ou mais ou três ou mais das propriedades funcionais discutidas acima.Estes anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos humanos, anticorposhumanizados ou anticorpos quiméricos.

Conforme utilizado nesta exposição, o termo "modificaçõesconservadoras de seqüência" pretende referir-se a modificações deaminoácidos que não afetam ou alteram significativamente as característicasde ligação do anticorpo que contém a seqüência de aminoácidos. Estasmodificações conservadoras incluem substituições, adições e exclusões deaminoácidos. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo dainvenção por técnicas convencionais conhecidas na arte, como mutagênesesítio-direcionada e mutagênese mediada por PCR.

Substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas emque o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácidocom cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos comcadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Estas famíliasincluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina,arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico,ácido glutâmico), cadeias laterais sem carga polar (por exemplo, glicina,asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeiaslaterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina,prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (porexemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (porexemplo, tirosiina, fenilalanina, triptofano, histidina). Dessa forma, um oumais resíduos de aminoácidos nas regiões CDR de um anticorpo dainvenção podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos damesma família de cadeia lateral, e o anticorpo alterado pode ser testadoquanto à função conservada empregando os ensaios funcionais descritosnesta exposição.

Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo, conforme osanticorpos anti-hTSLP da invenção.Em uma outra concretização, a invenção provê anticorpos quese ligam ao mesmo epítopo conforme o fazem os vários anticorpos anti-hTSLP da invenção, providos nesta exposição. Estes anticorpos adicionaispodem ser identificados de acordo com a sua capacidade de competir demaneira cruzada (ou seja, inibir competitivamente a ligação de maneiraestatisticamente significativa) com outros anticorpos da invenção em ensaiosconvencionais de ligação da hTSLP. A capacidade de um anticorpo em testede inibir a ligação de anticorpos da invenção a hTSLP humana demonstraque o anticorpo em teste é capaz de competir com aquele anticorpo pelaligação com hTSLP; este anticorpo pode, de acordo com teoria não restritiva,ligar-se ao mesmo epítopo, ou a um relacionado (por exemplo, umestruturalmente semelhante ou espacialmente próximo), na hTSLP,conforme o anticorpo contra qual ele compete. Em uma certa concretização,o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo na hTSLP, conforme osanticorpos da presente invenção, é um anticorpo monoclonal humano. Estesanticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isoladosconforme descrito nos Exemplos.Anticorpos Construídos e Modificados

Um anticorpo da invenção pode ser preparado ainda utilizandoum anticorpo com uma ou mais das seqüências de Vh e/ou Vl seqüências,apresentadas nesta exposição, como matéria-prima para construção de umanticorpo modificado, sendo que este anticorpo modificado pode possuirpropriedades alteradas daquelas do anticorpo inicial. Um anticorpo pode serconstruído pela modificação de um ou mais resíduos em uma ou ambas asregiões variáveis (ou seja, Vh e/ou VL), por exemplo, em uma ou maisregiões CDR e/ou em uma ou mais regiões framework. Adicional oualternativamente, um anticorpo pode ser construído pela modificação deresíduos na(s) região(ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s)função(ões) efetora(s) do anticorpo.

Um tipo de construção de região variável que pode ser efetuadaé o enxerto de CDR. Os anticorpos interagem com antígenos visados,predominantemente através de resíduos de aminoácidos localizados nasseis regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada e leve(CDRs). Por esse motivo, as seqüências de aminoácidos em CDRs são maisvariadas entre anticorpos individuais do que seqüências localizadas fora deCDRs. Em virtude de as seqüências de CDR serem responsáveis pelamaioria das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorposrecombinantes que imitam as propriedades de anticorpos específicos queocorrem naturalmente pela construção de vetores de expressão que incluemseqüências de CDR do anticorpo específico que ocorre naturalmente,enxertadas nas seqüências da estrutura principal de um anticorpo diferentecom propriedades diferentes (consultar, por exemplo, Riechmann, L. et al.,1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525;Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Consultar U.S.A. 86:10029-10033; apatente U.S. N9 5 225 539, para Winter, e as patentes U.S. N- 5 530 101, 5585 089, 5 693 762 e 6 180 370 para Queen et ai)

De acordo com o mesmo, uma outra concretização da invençãopertence a um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação comantígeno do mesmo, contendo uma região variável de cadeia pesada,compreendendo as seqüências de CDR1 com uma seqüência deaminoácidos, selecionada do grupo constituído pelas SEQ ID N-: 1-7;seqüências de CDR2 com uma seqüência de aminoácidos, selecionada dogrupo constituído pelas SEQ ID N-: 8-25; seqüências de CDR3 com umaseqüência de aminoácidos, selecionada do grupo constituído pelas SEQ IDN-: 26-31, respectivamente; e uma região variável de cadeia leve comseqüências de CDR1 com uma seqüência de aminoácidos, selecionada dogrupo constituído pelas SEQ ID N25: 32-40; seqüências de CDR2 com umaseqüência de aminoácidos, selecionada do grupo constituído pelas SEQ IDN-: 41-49; e seqüências de CDR3 consistindo em uma seqüência deaminoácidos, selecionada do grupo constituído pelas SEQ ID N-: 50-66,respectivamente. Dessa forma, estes anticorpos contêm as seqüências deCDR de Vh e Vl de anticorpos monoclonais, embora possam conter aindaseqüências da estrutura principal diferentes daquelas destes anticorpos.

Estas seqüências de estrutura principal podem ser obtidas debancos de dados públicos de DNA ou de referências publicadas que incluemseqüências de genes de anticorpos de linhagens germinativas. Por exemplo,seqüências de DNA de linhagens germinativas para genes de regiõesvariáveis de cadeia pesada e de cadeia leve podem ser encontradas nobanco de dados de seqüências de linhagens germinativas humanas "VBase"(disponível na Internet no endereço www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bemcomo em Kabat, E. A. et ai, 1991 Sequences of Proteins of Immunologicallnterest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIHPublication Ne91-3242; Tomlinson, I. M. et al., 1992 J. foi. Bioi 227:776-798;e Cox1 J. P. L. et ai, 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836, cujos conteúdos sãoaqui expressamente incorporados por referência neste pedido.

Um exemplo de seqüências de estrutura principal a seremutilizadas nos anticorpos da invenção são aquelas estruturalmentesemelhantes às seqüências de estrutura principal, utilizadas por anticorposselecionados da invenção, por exemplo, seqüências consenso e/ou deestrutura principal, utilizadas por anticorpos monoclonais da invenção. Asseqüências de CDR1, 2 e 3 de Vh e as seqüências de CDR1, 2 e 3 de Vlpodem ser enxertadas nas regiões framework que possuem a seqüênciaidêntica à encontrada no gene da imunoglobulina da linhagem germinativado qual a seqüência da estrutura principal é derivada, ou as seqüências daCDR podem ser enxertadas nas regiões framework que contêm uma oumais mutações, quando comparadas às seqüências da linhagemgerminativa. Por exemplo, foi constatado que em certas circunstâncias, évantajoso alterar resíduos nas regiões framework para modificar ouaprimorar a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo (consultar, porexemplo, as patentes U.S. Nes 5 530 101, 5 585 089, 5 693 762 e 6 180 370para Queen et al.)

Outro tipo de modificação de região variável é alterar resíduosde aminoácidos nas regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de Vh e/ou Vl para,pelo mesmo, melhorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo,afinidade) do anticorpo de interesse, conhecido, como "maturação deafinidade". Mutagênese sítio-direcionada ou mutagênese mediada por PCRpodem ser realizadas para introdução da(s) mutação(ões), e o efeito sobre aligação de anticorpos, ou outra propriedade funcional de interesse, pode seravaliado em ensaios in vitro ou in vivo, conforme descritos nesta exposição efornecidos nos Exemplos. Modificações conservadoras (conforme discutidasacima) podem ser introduzidas. As mutações podem ser substituições,adições ou exclusões de aminoácidos. Ademais, tipicamente não mais doque um, dois, três, quatro ou cinco resíduos são alterados em uma regiãoCDR.

De acordo com o mesmo, em uma outra concretização, ainvenção provê anticorpos monoclonais isolados anti- hTSLP, ou porções deligação com antígenos dos mesmos, constituídos por uma região variável decadeia pesada com: uma região CDRtde Vh consistindo em uma seqüênciade aminoácidos, selecionada do grupo com SEQ ID N-: 1-7 ou umaseqüência de aminoácidos com uma, duas, três, quatro ou cincosubstituições, exclusões ou adições de aminoácidos, em comparação comas SEQ ID N-: 1-7; uma região CDR2 de Vh com uma seqüência deaminoácidos, selecionada do grupo constituído pelas SEQ ID N-: 8-25 ouuma seqüência de aminoácidos com uma, duas, três, quatro ou cincosubstituições, exclusões ou adições de aminoácidos, em comparação comas SEQ ID N2s: 8-25; uma região CDR3 de Vh com uma seqüência deaminoácidos, selecionada do grupo constituído pelas SEQ ID N-: 26-31 ouuma seqüência de aminoácidos com uma, duas, três, quatro ou cincosubstituições, exclusões ou adições de aminoácidos, em comparação comas SEQ ID N-: 26-31; uma região CDR1 de Vl com uma seqüência deaminoácidos, selecionada do grupo constituído pelas SEQ ID N-: 32-40 ouuma seqüência de aminoácidos com uma, duas, três, quatro ou cincosubstituições, exclusões ou adições de aminoácidos, em comparação comas SEQ ID N-: 32-40; uma região CDR2 de Vl com uma seqüência deaminoácidos, selecionada do grupo constituído pelas SEQ ID N-: 41-49 ouuma seqüência de aminoácidos com uma, duas, três, quatro ou cincosubstituições, exclusões ou adições de aminoácidos, em comparação comas SEQ ID N25: 41-49; uma região CDR3 de Vl com uma seqüência deaminoácidos, selecionada do grupo constituído pelas SEQ ID N-: 50-66 ouuma seqüência de aminoácidos com uma, duas, três, quatro ou cincosubstituições, exclusões ou adições de aminoácidos, em comparação comas SEQ ID N-: 50-66.

anticorpos construídos da invenção incluem aqueles nos quaisforam efetuadas modificações aos resíduos da estrutura principal em Vhe/ou VL, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Estasmodificações do anticorpo são efetuadas, tipicamente, para diminuir aimunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma estratégia é efetuar uma"mutação reversa" (back mutate) de um ou mais resíduos da estruturaprincpal para retornar à seqüência correspondente da linhagem germinativa.

Mais especificamente, um anticorpo que tenha sofrido uma mutaçãosomática pode conter resíduos da estrutura principal que diferem daquelesna seqüência da linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Estesresíduos podem ser identificados por comparação das seqüências deestrutura principal do anticorpo com as seqüências da linhagem germinativadas quais o anticorpo é derivado. Para que as seqüências da regiãoframework retornem às suas configurações da linhagem germinativa, asmutações somáticas podem sofrer uma mutação reversa para retornarem àseqüência da linhagem germinativa, por exemplo, por mutagênese sítio-direcionada ou mutagênese mediada por PCR. Também se pretende queestes anticorpos submetidos à "mutação reversa" sejam abrangidos pelainvenção.

Outro tipo de modificação da estrutura principal envolve amutação de um ou mais resíduos na região framework, ou até mesmo emuma ou mais regiões CDR, para remover epítopos de célula T a fim dereduzir, pelo menos, o potencial de imunogenicidade do anticorpo. Estaestratégia é referida também como "desimunização" e é exposta maisdetalhadamente na Publicação da Patente U.S. Ns 20030153043 por Carr et al.

Em acréscimo ou alternativa a modificações efetuadas nasregiões framework ou CDR, os anticorpos da invenção podem serconstruídos de forma a incluírem modificações na região Fc, tipicamentepara alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, como meia-vida sérica, fixação de complemento, ligação do receptor Fc e/oucitotoxicidade celular antígeno-dependente. Além do mais, um anticorpo dainvenção pode ser modificado quimicamente (por exemplo, um ou maisgrupamentos químicos podem ser anexados ao anticorpo) ou ser modificadoa fim de alterar a sua glicosilação, mais uma vez, para alterar uma ou maispropriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas concretizações édescrita mais detalhadamente abaixo. A numeração de resíduos na regiãoFc é de acordo com o índice EU de Kabat.

Em uma concretização, a região de articulação (hinge) dé CH1 émodificada de forma que o número de resíduos de cisteína, na região dearticulação, é alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Estaestratégia é descrita ainda na patente U.S. Ns 5 677 425 por Bodmer et al. Onúmero de resíduos de cisteína, na região de articulação de CH1, é alterado,por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leve e pesada ou paraaumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

Em uma outra concretização, a região de articulação Fc de umanticorpo é modificada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Maisespecificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidasna região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de articulação Fcde forma a comprometer a ligação do anticorpo com a proteína Aestafilocócica (SpA) em relação à ligação com SpA do domínio original dearticulação do Fc. Esta estratégia é descrita mais detalhadamente napatente U.S. Ne 6.165.745 por Ward etal.

Em uma outra concretização, o anticorpo é modificado paraaumentar a sua meia-vida biológica. Várias estratégias são possíveis. Porexemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas:T252L, T254S, T256F, conforme descritas na Patente U.S. N9 6 277 375 porWard. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpopode ser alterado na região CH1 ou CL para conter um epítopo de ligaçãorecuperado do receptor, retirado de duas alças de um domínio CH2 de umaregião Fc de uma IgG1 conforme descrito nas patentes U.S. N— 5 869 046 e6 121 022 por Presta et al. A região constante de Fc de um anticorpo éfundamental para determinação de meia-vida sérica e funções efetoras, ouseja, atividades de citoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) oucitotoxidade dependente de complemento (CDC). É possível construirmutantes específicos do fragmento Fc para alterar a função efetora e/oumeia-vida sérica (consultar, por exemplo, a tecnologia de Xencor)(Consultar, por exemplo, W02004029207).

Um método para alterar a função efetora e meia-vida sérica deum anticorpo é enxertar a região variável de um fragmento de anticorpo comfragmento Fc exibindo a função efetora apropriada. ísotipos de IgGI ou lgG4podem ser selecionados quanto à ação sobre eliminação de células,enquanto que o isotipo lgG2 pode ser utilizado para anticorpos silenciosos(sem qualquer ação sobre eliminação de células).

Anticorpos silenciosos com meia-vida sérica prolongada podemser obtidos efetuando fusão quimérica de regiões variáveis de um anticorpocom uma proteína sérica como HSA ou uma proteína que se liga a estaproteína sérica, como a proteína de ligação de HSA.

Em ainda outras concretizações, a região Fc é alterada pelasubstituição de pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduodiferente de aminoácido para alterar as funções efetoras do anticorpo. Porexemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um resíduodiferente de aminoácido de forma que o anticorpo apresente afinidadealterada para um Iigante efetor, porém conserve a capacidade de ligaçãocom antígeno do anticorpo original. O Iigante efetor para o qual a afinidade éalterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente C1 docomplemento. Essa estratégia é descrita mais detalhadamente nas patentesU.S. N- 5 624 821 e 5 648 260, ambas por Winter et al.

Em uma outra concretização, um ou mais aminoácidosselecionados entre resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por umresíduo diferente de aminoácido de forma a alterar a ligação com Clq doanticorpo e/ou reduzir ou abolir citotoxidade dependente de complemento(CDC). Essa estratégia é descrita mais detalhadamente nas patentes U.S.N- 6 194 551 por Idusogie etat.

Em uma outra concretização, um ou mais resíduos deaminoácidos são alterados para alterar, pelo mesmo, a capacidade doanticorpo de fixar complemento. Esta estratégia é descrita ainda em PCTPublication WO 94/29351 por Bodmer et al.

Em ainda uma outra concretização, a região Fc é modificadapara aumentar a capacidade do anticorpo de mediar citotoxicidade celulardependente de anticorpo (ADCC) e/ou aumentar a afinidade do anticorpo porreceptor Fcy, modificando-se um ou mais aminoácidos. Esta estratégia édescrita ainda em PCT Publication WO 00/42072 por Presta. Além disso, ossítios de ligação em IgGI humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn forammapeados, tendo sido descritas variantes com ligação melhorada (consultarShields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604).

Em ainda uma outra concretização, a glicosilação de umanticorpo é modificada. Por exemplo, pode ser produzido um anticorpoaglicosilado (ou seja, o anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação podeser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticopor por"antígeno". Estas modificações em carboidratos podem ser conseguidas, porexemplo, alterando-se um ou mais sítios de glicosilação na seqüência doanticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podemser efetuadas que resultem em eliminação de um ou mais sítios deglicosilação da região variável da estrutura principal para eliminar, pelomenos, a glicosilação naquele sítio. Esta aglicosilação pode aumentar aafinidade do anticorpo por antígenos. Essa estratégia é descrita maisdetalhadamente nas patentes U.S. N25 5 714 350 e 6 350 861 por Co etal.

Adicional ou alternativamente, pode ser produzido um anticorpoque possua um tipo alterado de glicosilação, como um anticorpohipofucosilado com quantidades reduzidas de resíduos fucosil ou umanticorpo com número aumentado de estruturas de GIcNac, divididas aomeio. Foi demonstrado que esses padrões alterados de glicosilaçãoaumentam a capacidade de ADCC de anticorpos. Essas modificações decarboidratos podem ser obtidas, por exemplo, expressando-se o anticorpoem uma célula hospedeira com mecanismo alterado de glicosilação. Célulasexibindo mecanismo alterado de glicosilação foram descritas na técnica eestas podem ser utilizadas como células hospedeiras nas quais sãoexpressos anticorpos recombinantes da invenção para, pelo mesmo,produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, a EP 1 176195 por Hang et al. descreve uma linhagem de células com gene FUT8funcionalmente rompido e que codifica uma fucosol transferase, de formaque anticorpos expressados nesta linhagem de células exibamhipofucosilação. A PCT Publication WO 03/035835 por Presta descreve umavariante da linhagem celular CHO, células Lecl3, com capacidade reduzidade prender fucose a carboidratos ligados por Asn(297), resultando tambémem hipofucosilação de anticorpos expressados naquela célula hospedeira(consultar também Shields, R.L. et al., 2002 J. BioL Chem. 277:26733-26740). A PCT Publication WO 99/54342 por Umana et al. descrevelinhagens de células construídas para expressar glicosil transferasesmodificadas por glicoproteínas (por exemplo, beta(1,4)-Nacetilglicosaminiltransferase Ill (GnTIII)), de forma que anticorposexpressados nas linhagens celulares construídas exibem estruturas deGIcNac divididas ao meio, resultando em atividade aumentada de ADCC dosanticorpos (consultar também Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).

Uma outra modificação dos anticorpos, contemplada pelainvenção, é peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado para, por exemplo,aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, sérica) do anticorpo. Parapeguilar um anticorpo, é feito com que o anticorpo, ou fragmento deste, reajatipicamente com polietilenoglicol (PEG), de forma que um éster reativo ouderivado de aldeído do PEG, sob condições nas quais um ou mais grupos dePEG unam-se ao anticorpo ou fragmento do anticorpo. A peguilação podeser conduzida por reação de acilação ou de alquilação com uma molécula dePEG reativa (ou um polímero análogo reativo solúvel em água). Conformeutilizado nesta exposição, o termo "polietilenoglicol" pretende incluirquaisquer das formas de PEG, utilizadas para que outras proteínas sejamderivadas, como mono (C1-C10) alcoxi ou ariloxi-polietilenoglicol oupolietilenoglicol-maleimida. Em certas concretizações, o anticorpo a serpeguilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para peguilação deproteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorposda invenção. Consultar, por exemplo, a EP 0 154 316 por Nishimura et al. eEP 0 401 384 por Ishikawa et ai

Funções efetoras podem ser alteradas por modulação do padrãode glicosilação do anticorpo. Glycart (por exemplo, US 6 602 684), Biowa(por exemplo, US 6 946 292) e Genentech (por exemplo, WO03/035835)construíram linhagens de células de mamíferos para produção de anticorposcom função efetora aumentada ou diminuída. Especialmente, anticorpos nãofucosilados apresentarão atividades de ADCC intensificadas. Glycofidesenvolveu também linhagens celulares de leveduras, capazes de produzirglicoformas específicas de anticorpos. Além destas, a tecnologia de KyowaHakka/Biowa reduz fucose também. Consultar, por exemplo, WO 03/085102.

Uma ampla variedade de estruturas principais ou arcabouços deanticorpo/ imunoglobulina pode ser empregada, desde que o polípeptídeoresultante inclua uma ou mais regiões de ligação, específicas para aproteína hTSLP. Estas estruturas principais ou arcabouços incluem os 5principais idiotipos de imunoglobulinas humanas, ou fragmentos destes(como aqueles expostos em outros locais no presente), e incluemimunoglobulinas de outras espécies de animais, de preferência, comcaracterísticas humanizadas. Anticorpos de cadeia pesada única, comoaqueles identificados em camelídeos, são de especial interesse nesseaspecto. Novas estruturas principais, arcabouços e fragmentos continuam aser descobertos e desenvolvidos por especialistas na técnica.

Alternativamente, arcabouços e estruturas principais, conhecidosou futuros, diferentes daqueles de imunoglobulinas, podem ser empregados,desde que compreendam uma região de ligação específica para a proteínahTSLP. Estes compostos são conhecidos nesta exposição como"polipeptídeos compreendendo uma região de ligação específica comcMAC". Estruturas principais ou arcabouços conhecidos, diferentes daquelesde imunoglobulinas, incluem Adnectinas (fibronectina) (CompoundTherapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG,Zurique, Suíça), anticorpos de domínios (Domantis, Ltd (Cambridge, MA) eAblynx nv (Zwijnaarde, Bélgica)), Iipocalina (AnticaIina) (Pieris Proteolab AG,Freising, Alemanha), produtos farmacêuticos imunológicos de módulopequeno (Trubion Pharmaeeuticals Inc., Seattle, WA), maxybodies (Avidia,Inc. (Mountain View, CA)), Proteína A (Affibody AG, Suécia) e afilina (gama-cristalina ou ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemanha).

De acordo com a presente invenção, o anticorpo anti-hTSLP oufragmento deste, ou o polipeptídeo compreendendo uma região de ligaçãoespecífica com hTSLP, independentemente da estrutura principal ouarcabouço utilizados, pode estar ligado, quer covalentemente ou não, a umgrupamento adicional. O grupamento adicional pode ser um polipeptídeo, umpolímero inerte, como PEG, molécula pequena, radioisótopo, metal, íon,ácido nucléico ou outro tipo de molécula biologicamente relevante. Estaconstrução, que poderá ser conhecida como imunoconjugado, imunotoxinaou similar, está incluída também no significado de anticorpo, fragmento deanticorpo ou de polipeptídeo compreendendo uma região de ligaçãoespecífica com hTSLP, conforme utilizado nesta exposição.

Métodos de Construção de Anticorpos

Conforme foi discutido acima, os anticorpos anti- hTSLP comseqüências de Vh e Vl mostradas nesta exposição podem ser utilizados paracriar novos anticorpos anti- hTSLP, modificando-se as seqüências de Vhe/ou Vl ou a(s) região(ões) constantes, unidas às mesmas. Dessa forma, emuma outra característica da invenção, os atributos estruturais de umanticorpo anti- hTSLP da invenção são utilizados para criar anticorpos anti-hTSLP estruturalmente relacionados que conservam, pelo menos, umapropriedade funcional dos anticorpos da invenção, como de ligação ahTSLP, além de inibição de uma ou mais propriedades funcionais da hTSLP(por exemplo, ligação a receptor, inibição de liberação de mediadores).

Por exemplo, uma ou mais regiões CDR dos anticorpos dapresente invenção, ou mutações destes, podem ser combinadas, de maneirarecombinante, com regiões framework conhecidas e/ou outras CDRS paracriar anticorpos anti-hTSLP adicionais, construídos por recombinação, dainvenção, conforme discutido acima. Outros tipos de modificações incluemaquelas descritas na seção anterior. A matéria-prima para o método déconstrução é uma ou mais das seqüências de Vh e/ou VL, providas nestaexposição, ou uma ou mais regiões CDR destas. Para criar o anticorpoconstruído, não é necessário preparar efetivamente (ou seja, expressarcomo proteína) um anticorpo com uma ou mais das seqüências de Vh e/ouVl aqui providas, ou uma ou mais regiões CDR destas. De preferência, ainformação contida na(s) seqüência(s) é(são) utilizada(s) como o materialinicial para criar seqüência(s) de "segunda geração", derivada(s) da(s)seqüência(s) original(is) e, em seguida, a(s) seqüências da "segundageração" é(são) preparada(s) e expressa(s) como proteína.

De acordo com o mesmo, em uma outra concretização, ainvenção provê um método para o preparo de um anticorpo anti-hTSLP,compreendendo: uma seqüência de região variável de cadeia pesada deanticorpo com seqüência de CDR1 selecionada do grupo constituído pelasSEQ ID N-: 1-7, uma seqüência de CDR2 selecionada do grupo constituídopelas SEQ ID N-: 8-25 e/ou uma seqüência de CDR3 selecionada do grupoconstituído pelas SEQ ID N-: 26-31 e uma seqüência de região variável decadeia leve de anticorpo com seqüência de CDR1 selecionada do grupoconstituído pelas SEQ ID N25: 32-40, uma seqüência de CDR2 selecionadado grupo constituído pelas SEQ ID N-: 41-49 e/ou uma seqüência de CDR3selecionada do grupo constituído pelas SEQ ID N-: 50-66; alteração de pelomenos um resíduo de aminoácido na seqüência da região variável da cadeiapesada do anticorpo e/ou na seqüência da região variável da cadeia leve doanticorpo para criar, pelo menos, uma seqüência alterada do anticorpo; eexpressão da seqüência alterada do anticorpo como proteína.

Técnicas convencionais de biologia molecular podem serutilizadas para preparar e expressar a seqüência alterada do anticorpo. Oanticorpo codificado pela(s) seqüência(s) alterada(s) é aquele que conservauma, alguma ou todas as funções funcionais dos anticorpos anti-hTSLPdescritos nesta exposição, propriedades estas que incluem, entre outras,ligação especificamente com hTSLP; e o anticorpo exibe, pelo menos, umadas seguintes propriedades funcionais: o anticorpo inibe a ligação daproteína hTSLP ao receptor da hTSLP ou inibe o receptor de ligação dahTSLP, impedindo ou atenuando uma condição inflamatória, fibrótica oualérgica, especialmente uma doença inflamatória ou obstrutiva das viasaéreas, ou o anticorpo jnibe a ligação do receptor da hTSLP, impedindo ouatenuando, pelo mesmo, asma.

O anticorpo alterado pode exibir uma ou mais, duas ou mais outrês ou mais das propriedades funcionais discutidas acima.

As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem seravaliadas com ensaios padrões disponíveis na técnica e/ou descritos nestaexposição, conforme aqueles apresentados nos Exemplos (por exemplo,ELISAs).

Em certas concretizações dos métodos de construção deanticorpos da invenção, as mutações podem ser introduzidas aleatória ouseletivamente, ao longo de toda seqüência codificadora, ou em parte, de umanticorpo anti-hTSLP, e os anticorpos anti-hTSLP modificados resultantespodem ser selecionados quanto à atividade de ligação e/ou outraspropriedades funcionais, conforme descritas nesta exposição. Métodos paramutação foram descritos na técnica. Por exemplo, a PCT Publication WO02/092780 por Short descreve métodos para criação e seleção de mutaçõesde anticorpos, empregando mutagênese por saturação, montagem sintéticade ligação, ou uma combinação destas. Alternativamente, a PCT PublicationWO 03/074679 por Lazar et aí. descreve métodos que empregam métodosde seleção computacional para otimizar propriedades fisico-químicas deanticorpos.

Moléculas de Ácidos Nucléicos que Codificam Anticorpos da Invenção

Outra característica da invenção pertence a moléculas de ácidonucléico que codificam os anticorpos da invenção. Os ácidos nucléicospodem estar presentes em células inteiras, em Iisado de células ou podemser ácidos nucléicos parcialmente purificados ou substancialmente puros.Um ácido nucléico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quandopurificado e separado de outros componentes celulares ou de outroscontaminantes, por exemplo, outros ácidos nucléicos ou proteínas decélulas, por técnicas convencionais, incluindo tratamento alcalino/SDS,bandeamento de CsC1, cromatografia em coluna, eletroforese em gel deagarose e outras bem conhecidas na arte. Consultar, F. Ausubel et al., ed.1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wileylnterscience, New York. Ácido nucléico da invenção pode ser, por exemplo,DNA ou RNA e pode conter ou não seqüências de intron. Em umaconcretização, ó ácido nucléico é uma molécula de cDNA. O ácido nucléicopode estar presente em vetor, como um vetor de exibição em fago, ou emum vetor de plasmídeo recombinante.

Ácidos nucléicos da invenção podem ser obtidos empregandotécnicas convencionais de biologia molecular. Para anticorpos expressos porhibridomas (por exemplo, hibridomas preparados a partir de camundongostransgênicos com genes de imunoglobulina humana, conforme descrito maisabaixo), cDNAs codificadores das cadeias leves e pesadas do anticorpo feitopelo hibridoma podem ser obtidos por técnicas convencionais deamplificação por PCR ou clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos apartir de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (por exemplo, comtécnicas de exibição em fago), o ácido nucléico que codifica o anticorpopode ser recuperado de vários clones de fagos, integrantes da biblioteca.

Uma vez obtidos os fragmentos de DNA que codificam Vh e VL,estes fragmentos de DNA podem ser ainda manipulados por técnicasconvencionais de DNA recombinante, por exemplo, para converter os genesda região variável em genes de anticorpos de cadeia completa, em genes defragmento Fab ou em um gene de scFv. Nessas manipulações, fragmentosde DNA que codificam Vl ou Vh estão ligados operacionalmente a uma outramolécula de DNA ou a um fragmento codificador de uma outra proteína,como região constante de um anticorpo ou um Iigante flexível. O termo"ligado operacionalmente", conforme utilizado neste contexto, pretendesignificar que os dois fragmentos de DNA são unidos de maneira funcional,por exemplo, de forma que as seqüências de aminoácidos codificadas pelosdois fragmentos de DNA permaneçam dentro da estrutura, ou de forma quea proteína seja expressa sob controle de um promotor desejado.

O DNA isolado, codificador da região VH, pode ser convertido emgene de cadeia pesada completa, ligando-se operacionalmente o DNAcodificador de Vh a uma outra molécula de DNA que codifica as regiõesconstantes (CH1, CH2 e CH3) da cadeia pesada. As seqüências de genesde região constante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica(consultar, por exemplo, Kabat, E. A. el ai, 1991 Sequences of Proteins ofImmunological lnterest, Fifth Editionl U.S. Department of Health and HumanServices, NIH PubIication He 91-3242), e fragmentos de DNA incluindo estasregiões podem ser obtidos por amplificação por PCR convencional. A regiãoconstante da cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGI, lgG2,lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD. Para um gene de cadeia pesada defragmento Fab, o DNA codificador de Vh pode ser ligado operacionalmente auma outra molécula de DNA que codifica somente a região constante CH1da cadeia pesada.

O DNA isolado que codifica a região Vl pode ser convertido emum gene de cadeia leve completa (bem como em um gene de cadeia leve deFab), ligando-se operacionalmente o DNA codificador de Vl a uma outramolécula de DNA que codifica a região constante da cadeia leve, CL. Asseqüências de genes de região constante de cadeia leve humana sãoconhecidas na técnica (consultar, por exemplo, Kabat, E. A. et ai, 1991Sequences of Proteins of Immunological lnterest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication Ne 91-3242), efragmentos de DNA incluindo estas regiões podem ser obtidos poramplificação por PCR convencional. A região constante da cadeia leve podeser uma região constante kapa ou lambda.

Para criar um gene scFv, os fragmentos codificadores de Vh e Vlsão ligados operacionalmente a um outro fragmento que codifica um Iiganteflexível, por exemplo, codificando a seqüência de aminoácidos (Gli4 -Ser)3,de forma que as seqüências de Vh e Vl possam ser expressas sob a formade proteína contígua de cadeia única, com as regiões de Vl e Vh unidas peloIigante flexível (consultar, por exemplo, Bird et ai, 1988 Science 242:423-426; Huston et ai, 1988 Proc. Nati Acad. Sei. USA 85:5879-5883;McCafferty et ai, 1990 Nature 348:552-554).

Produção de Anticorpos Monoclonais da Invenção

Anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos por umavariedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpomonoclonal, por exemplo, a técnica convencional de hibridização de célulasomática de Kohler e Milstein, descrita em Nature 256: 495, 1975. Muitastécnicas para produção de anticorpos monoclonais podem ser empregadas,por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.

Um sistema com animal utilizado para preparar hibridomas é osistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é umprocedimento bem estabelecido. Os protocolos de imunização e técnicaspara isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos naarte. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murinos) eprocedimentos de fusão são conhecidos também. Anticorpos monoclonaispodem ser produzidos também utilizando um hibridoma específico,depositado em uma coleção de cepas.

Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invençãopodem ser preparados com base na seqüência de um anticorpo monoclonalmurino, preparado conforme descrito acima. DNA codificador dasimunoglobulinas de cadeia pesada e leve pode ser obtido a partir dohibridoma murino de interesse, e construído para conter seqüências deimunoglobulina não murina (por exemplo, humana), utilizando técnicasconvencionais de biologia molecular. Por exemplo, para criar um anticorpoquimérico, as regiões variáveis murinas podem ser ligadas a regiõesconstantes humanas, utilizando métodos conhecidos na arte (consultar, porexemplo, a patente U.S. N5 4 816 567 para Cabilly et ai). Para criar umanticorpo humanizado, as regiões CDR murinas podem ser inseridas emuma estrutura principal humana, utilizando métodos conhecidos na arte(consultar, por exemplo, a patente U.S. Ng 5 225 539, para Winter, e aspatentes U.S. N25 5 530 101, 5 585 089, 5 693 762 e 6 180 370 para.Queen.et a/.).

Em uma certa concretização, os anticorpos da invenção sãoanticorpos moríoclonais humanos. Estes anticorpos monoclonais humanos,direcionados contra hTSLP, podem ser gerados com camundongostransgênicos ou transcromossômicos, carregando prtes do sistema imunehumano, em vez de o sistema de camundongos. Estes camundongonstransgênicos e transcromossômicos incluem camundongos referidos comocamundongo HuMAb e camundongo KM, respectivamente, e sãocoletivamente referidos, nesta exposição, como "camundongos com Ighumana".

O camundongo® HuMAb (Medarex, Inc.) contém miniloci gênicosde imunoglobulina humana que codificam seqüências humanas nãorearranjadas de cadeia pesada (μ e γ) e cadeia leve κ de imunoglobulinas,juntamente com mutações direcionadas que inativam os Iociendógenos decadeia μ e κ (consultar, por exemplo, Lonberg et ai, 1994 Nature 368(6474):856-859). De acordo com o mesmo, os camundongos exibem expressãoreduzida de IgM ou κ de camundongo e, em resposta à imunização, ostrangenes introduzidos de cadeia pesada e leve humanas passam por trocade classe e mutação somática para gerar IgGK monoclonal humana de altaafinidade (Lonberg, N. et ai, 1994 supra', revisão em Lonberg, N., 1994Handbook òf Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar,D., 1995 lntern. Rev. Jmmunoi 13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N., 1995Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 764:536-546). O preparo e uso de camundongos25 HuMAb e as modificações genômicas transmitidas por estes camundongossão descritos ainda em Taylor, L. et ai, 1992 Nucleic Aeids Research20:6287-6295; Chen, J. et ai, 1993 International Immunology 5: 647-656;Tuaillon et ai, 1993 Proe. Nati Acad. Sei. USA 94:3720-3724; Choi et ai,1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et ai, 1993 EMBO J. 12: 821-830;Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor1 L. et ai, 1994International Immunology 579-591; e Fishwild, D. et ai, 1996 NatureBiotechnology 14: 845-851, cujos conteúdos são aqui especificamenteincorporados em sua totalidade por referência neste pedido. Consultar ainda,as patentes U.S. Nes 5 545 806, 5 569 825, 5 625 126, 5 633 425, 5 789 650,5 877 397, 5 661 016, 5 814 318, 5 874 299 e 5 770 429, todas para Lonberge Kay; a patente U.S. N9 5 545 807 para Surani etal.·, as PCT Publication N-WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay, e a PCT Publication Ne WO01/14424 para Korman etal.

Em uma outra concretização, anticorpos humanos da invençãopodem ser cultivados, utilizando um camundongo com seqüências deimunoglobulina humana em transgenes e transcromossomos, como umcamundongo que carregue um transgene de cadeia pesada humana e umtranscromossomo de cadeia leve humana. Estes camundongos, referidosnesta exposição como "camundongos KM", são descritos em detalhes naPCT Publication WO 02/43478 para Ishida et al.

Ainda mais, sistemas alternativos de animais transgênicos,expressando genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnicae podem ser utilizados para criação de anticorpos anti-hTSLP da invenção.Por exemplo, um sistema transgênico alternativo, referido como oXenomouse (Abgenix, Inc.) pode ser utilizado; estes camundongos sãodescritos, por exemplo, nas patentes U.S. Nss 5 939 598, 6 075 181, 6 114598, 6 150 584 e 6 162 963 para Kucherlapati et al.

Além disso, sistemas alternativos de animaistranscromossômicos, expressando genes de imunoglobulina humana estãodisponíveis na técnica e podem ser utilizados para criação de anticorposanti-hTSLP da invenção. Por exemplo, podem ser utilizados camundongoscarregando transcromossomo de cadeia pesada humana etranscromossomo de cadeia leve humana, referidos como "camundongosTC"; estes camundongos são descritos em Tomizuka etal., 2000 Proc. NatiAcad. Sei. USA 97:722-727. Além do mais, vacas carregandotranscromossos de cadeia pesada e cadeia leve humana foram descritas natécnica (Kuroiwa etal., 2002 Nature Biotechnology20:889-894) e podem serutilizadas para criação de anticorpos anti-hTSLP da invenção.Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem serpreparados também utilizando métodos de exibição em fagos, em que sãoinvestigadas bibliotecas de genes de imunoglobulinas humanas. Estesmétodos de exibição em fagos de isolamento de anticorpos humanos estãoestabelecidos na técnica. Consultar, por exemplo: as patentes U.S. N- 5223 409, 5 403 484 e 5 571 698 para Ladner et al·, as patentes U.S. N- 5427 908 e 5 580 717 para Dower et al·, as patentes U.S. N- 5 969 108 e 6172 197 para McCafferty et al·, as patentes U.S. Nos 5 885 793, 6 521 404,6.544.731, 6 555 313, 6 582 915 e 6 593 081 para Griffiths et al.

Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem serpreparados também utilizando camundongos SClD, nos quais célulasimunes humanas foram reconstituídas de forma que uma resposta deanticorpo humano possa ser gerada ao ser efetuada imunização. Estescamundongos são descritos em, por exemplo, as patentes U.S. N— 5 476996 e 5 698 767 para Wilson et al.

Anticorpos obtidos de investigação de bibliotecas de anticorposhumanos (por exemplo, de exibição em fagos com Morphosys), debibliotecas como a biblioteca HuCaI de Morphosys, a tecnologia dematuração de afinidade e, ainda, tecnologias de otimização de seqüênciasde códon, podem ser utilizados também. Maturação de afinidade pode serutilizada também em anticorpos produzidos de outras maneiras (porexemplo, hibridomas).

Geração de Transfectomas Produtores de Anticorpos Monoclonais

Anticorpos da invenção podem ser produzidos também em umtransfectoma de célula hospedeira, utilizando, por exemplo, umacombinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção degenes, conforme bem conhecido na arte (por exemplo, Morrison, S. (1985)Science 229:1202).

Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos deanticorpos destes, DNAs codificadores de cadeias pesadas e levescompletas ou parciais podem ser obtidos por técnicas convencionais debiologia molecular (por exemplo, amplificação por PCR ou clonagem deDNA1 empregando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse), eos DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão de forma que osgenes sejam ligados operacionalmente a seqüências de controle detranscrição e tradução. Nesse contexto, o termo "ligado operacionalmente"pretende significar que um gene de anticorpo está ligado em um vetor deforma que as seqüências de controle de transcrição e tradução, no vetor,atuem em sua função pretendida de regular a transcrição e tradução dogene do anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle sãoescolhidos para que sejam compatíveis com a célula hospedeira utilizada deexpressão. O gene da cadeia leve e o gene da cadeia pesada do anticorpopodem ser inseridos em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos osgenes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes do anticorposão inseridos no vetor de expressão por métodos convencionais (porexemplo, ligação de sítios de restrição de complementaridade no fragmentogênico do anticorpo e vetor, ou ligação de extremidade de forma abrupta(blunt eneO, em caso dé não haver sítios de restrição). As regiões variáveisde cadeia leve e pesada dos anticorpos, descritas nesta exposição, podemser utilizadas para criar genes completos de anticorpos de qualquer isotipode anticorpos, inserindo-os em vetores de expressão que já codificamregiões constantes de cadeia pesada e de cadeia leve do isotipo desejado,de forma que o segmento Vh seja ligado operacionalmente ao(s)segmento(s) CH no vetor e o segmento Vl seja ligado opercionalmente aosegmento CL no vetor. Adicional ou alternativamente, o vetor de expressãorecombinante pode codificar um peptídeo de sinalização que facilita asecreção da cadeia do anticorpo, proveniente de uma célula hospedeira. Ogene da cadeia do anticorpo pode ser clonado no vetor de forma que opeptídeo de sinalização esteja ligado, estruturalmente, ao amino terminal dogene da cadeia do anticorpo. O peptídeo de sinalização pode ser umpeptídeo dê sinalização de imunoglobulina ou um peptídeo de sinalizaçãoheterólogo (ou seja, um peptídeo de sinalização de uma proteína que nãoseja imunoglobulina).

Além dos genes de cadeias do anticorpo, os vetores deexpressão recombinantes da invenção carregam seqüências reguladorasque controlam a expressão dos genes das cadeias do anticorpo em umacélula hospedeira. O termo "seqüência reguladora" pretende incluirpromotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão(por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição outradução dos genes de cadeias do anticorpo. Estas seqüências reguladorassão descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology.Methods in EnzymoIogy 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Seráapreciado por especialistas na técnica que a criação do vetor de expressão,incluindo a seleção de seqüências reguladoras, pode depender de fatorescomo a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível deexpressão da proteína desejada, etc. Seqüências reguladoras de expressãode célula hospedeira mamífera incluem elementos virais que direcionamníveis altos de expressão de proteínas em células mamíferas, comopromotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV), VírusSímio 40 (SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor tardio principal doadenovírus (AdMLP)) e polioma. Alternativamente, seqüências reguladorasnão virais podem ser utilizadas, como o promotor de ubiquitina ou promotorde P-globulina. Ainda mais, elementos regulados compostos por seqüênciasde origens diferentes, comom o sistema promotor SRa que contémseqüências do promotor inicial de SV40 e a repetição terminal longa do vírusde leucemia de célula T humana tipo 1 (Takebe, Y. et ai, 1988 Moi CeHBiol. 8:466-472).

Além dos genes de cadeias do anticorpo e as seqüênciasreguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podemcarregar seqüências adicionais, como seqüências que regulam a replicaçãodo vetor nas células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) egenes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita aseleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (consultar,por exemplo, as patentes U.S. Nes 4 399 216, 4 634 665 e 5 179 017, todaspor by Axel et ai). Por exemplo, o gene marcador selecionável confere,tipicamente, resistência a fármacos, como G418, higromicina oumetotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor tenha sidointroduzido. Genes marcadores selecionáveis incluem o gene dadihidrofolato redutase (DHFR) (para uso em céluls hospedeiras dhfr comseleção/amplificação para metrotrexato) e o neo gene (para seleção paraG418).

Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(s) deexpressão que codificam a cadeia leve e a pesada é transfectado em umacélula hospedeira por técnicas convencionais. As várias formas do termo"transfecção" pretendem abranger uma ampla variedade de técnicascomumente utilizadas para a introdução de DNA exógeno em célulahospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, életroporação,precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano esimilares. Teoricamente, é possível expressar os anticorpos da invenção emcélulas procarióticas ou eucarióticas. A expressão de anticorpos em célulaseucarióticas, especialmente em células hospedeiras mamíferas, é discutívelporque é mais possível que estas células eucarióticas e, especialmentecélulas mamíferas, se juntem e secretem um anticorpo devidamente dobradoe imunologicamente ativo do que as células procarióticas. Expressãoprocariótica de genes de anticorpos foi relatada como ineficiente paraprodução de níveis altos de anticorpo ativo (Boss, M. A. and Wood, C. R.,1985 Immunology Today 6:12-13).

Células hospedeiras mamíferas para expressão dos anticorposrecombinantes da invenção incluem células de Ovário de Hamster Chinês(células CHO) (incluindo células dhfr-CHO, descritas por Urlaub e Chasin11980 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220) utilizadas com um marcadorselecionável DH FR, por exemplo, conforme descrito em R.J. Kaufman eP.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621, células de mieloma NSO, célulasCOS e células SP2. Quando vetores de expressão recombinantes,codificadores de genes de anticorpos, são introduzidos em célulashospedeiras mamíferas, os anticorpos são produzidos por cultura dascélulas hospedeiras por um período de tempo suficiente que permita aexpressão do anticorpo nas células hospedeiras ou secreção do anticorpono meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Osanticorpos podem ser recuperados do meio de cultura utilizando métodosconvencionais de purificação de proteínas.

Seqüências que codificam cadeias leves e pesadas parciais oucompletas são expressas pela transfecção do(s) vetor(es) de expressão quecarrega(m) estas seqüências em uma célula hospedeira por técnicasconvencionais de transfecção. Células hospedeiras eucarióticas são usadas,tipicamente, para expressão de anticorpos, uma vez que anticorpos são, demodo geral, glicoproteínas e, por conseguinte, células procarióticas são nãoapropriadas. Células hospedeiras mamíferas que podem ser utilizadas paraexpressar os anticorpos recombinantes incluem células de Ovário deHamster Chinês (células cells) (incluindo células dhfr-CHO), células demieloma NOS, células COS e células SP2. Alternativamente, é possívelutilizar uma célula hospedeira construída para produzir glicoproteínas compadrões de glicosilação semelhantes aos de mamíferos, incluindo linhagenscelulares de levedura, fungos ou plantas. Os anticorpos podem serproduzidos, por exemplo, em linhagens celulares de leveduraglicoconstruídas, incluindo as espécies Pichia, Saccharomyces ouKluyveromyces e, de preferência, Piehia pastoris ou Saccharomyeeseerevisae ou Kluyveromyces laetis, consultar, por exemplo, EP1297172B1(Glycofi). Os anticorpos podem ser produzidos também em linhagenscelulares de plantas glicoconstruídas e, de preferência linhagens celularesde briófitos, conforme descrito em W02004057002 (Greenovation). Osanticorpos são produzidos por cultura das células hospedeiras por umperíodo de tempo suficiente que permita a expressão do anticorpo nascélulas hospedeiras ou secreção do anticorpo no meio de cultura. Osanticorpos são recuperados do meio de cultura utilizando métodosconvencionais de purificação de proteínas.

Imunoconiuqados

Em uma outra característica, a presente invenção apresenta umanticorpo anti-hTSLP, ou fragmento deste, conjugado a um grupamentoterapêutico, como uma citotoxina, um fármaco (por exemplo, umimunossupressor) ou uma radiotoxina. Estes conjugados são referidos nestaexposição como "imunoconjungados". Imunoconjugados que incluem umaou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas." Uma cítotoxina ouagente citotóxico inclui qualquer agente nocivo (por exemplo, elimina) paracélulas. Exemplos incluem táxon, citocalasina B, gramicidina D, brometo deetídeo, emetina, mitomicinà, etoposide, etoposide, tenoposide, vincristina,vimblastina, t. colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1 -dehidrotestosterona,glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina eanálogos ou homólogos destes. Agentes terapêuticos incluem também, porexemplo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluoruracil decarbazina), agentes de ablação (porexemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, meifaian, carmustina (BSNU) eIomustina (CCNU)), ciclofosfamida, bussulfan, dibromomanitol,estreptozotocina, mitomicinà C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP),cisplatina, antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (antiga daunomicina) edoxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinoríiicina (antigaactinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentesantimitóticos (por exemplo, vincristina e vimblastina).

Outros exemplos de citotoxinas terapêuticas que podem serconjugadas a um anticorpo da invenção incluem duocarmicinas,caliqueamicinas, maitansinas e auristatinas e derivados destas. Hádisponível comercialmente um exemplo de conjugado formado porcaliqueamicina e anticorpo (MylotargTm; Wyeth-Ayerst).

As citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos da invençãoempregando tecnologia de ligante, disponível na técnica. Exemplos de tiposde Iigantes que foram utilizados para conjugar uma citotoxina a um anticorpoincluem, entre outros, hidrazonas, tioésteres, ésteres, dissulfetos e Iigantescontendo peptídeos. É possível escolher um ligante, por exemplo,susceptível à clivagem por pH baixo no compartimento Iisossomal oususceptível à clivagem por proteases, como proteases expressadas, depreferência, em tecido tumoral, como catepsinas (por exemplo, catepsinas B,CeD).

Para mais discussão sobre tipos de citotoxinas, Iigantes emétodos para conjugação de agentes terapêuticos a anticorpos, consultar,também, Saito,' G. et ai, 2003 Adv. Drug DeIiv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A.et al., 2003 Câncer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G., 2003Câncer Cell 3:207-212; Allen, T.M., 2002 Nat. Rev. Câncer 2:750-763; Pas-tan, I. e Kreitman, R. J., 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091;Senter1 P.D. e Springer, C.J., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

Anticorpos da presente invenção podem ser conjugados tambéma isótopo radioativo para gerar substâncias radiofarmacêuticas citotóxicas,também referidos como radioimunoconjugados. Exemplos de isótoposradioativos que podem ser conjugados a anticorpos para uso diagnóstico outerapêutico incluem, entre outros, iodo131, índio111, ítrio90 e lutécio177. Métodospara o preparo de radioimunoconjugados estão estabelecidos na técnica.Exemplos de radioimunoconjugados disponíveis comercialmente incluemZevalin™ (DEC Pharmaceuticals) e Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), emétodos semelhantes podem ser utilizados para prepararradioimunoconjugados com os anticorpos da invenção.

Os conjugados dos anticorpos da invenção podem ser utilizadospara modificar uma resposta biológica específica, sendo que o grupamentodo fármaco não deve ser interpretado como estando limitado aos agentesquímicos terapêuticos clássicos. Por exemplo, o grupamento do fármacopode ser uma proteína ou polipeptídeo que possua uma atividade biológicadesejada. Estas proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxinaenzimaticamente ativa, ou fragmento ativo desta, como abrina, ricina A,exotoxina de pseudomonas ou toxina diftérica; uma proteína como o fator denecrose tumoral ou interferon-γ; ou modificadores de resposta biológicacomo, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"),interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulante de colônias de macrófagos egranulócitos ("GM-CSF"), fator estimulante de colônia de granulócitos ("G-CSF") ou outros fatores de crescimento.

Técnicas para conjugação destes grupamentos terapêuticos aanticorpos são bem conhecidos, consultar, por exemplo, Amon et ai,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therap/,em Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et ai (eds.), pág.243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et ai, "Antibodies For DrugDelivery", in Controlled Drug Delivery {2.- Ed.), Robinson et al. (eds.), pág.623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Câncer Therapy. A Review", in Monoclonal Antibodies '84:Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), pág. 475-506(1985); uAnaIysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic UseOf Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em Monoclonal AntibodiesFor Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pág. 303-16(Academic Press 1985) e Thorpe et ai, "The Preparation And CytotoxicProperties OfAntibody-Toxin ConjugatesT, Inmunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Moléculas Bi-específicas

Em uma outra característica, a presente invenção apresentamoléculas bi-específicas, compreendendo um anticorpo anti-hTSLP, oufragmento deste, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou porções deligação a antígenos deste, pode ser derivado ou vinculado a uma outramolécula funcional, por exemplo, um outro peptídeo ou proteína (porexemplo, um outro anticorpo ou Iigante de um receptor) para gerar umamolécula bi-específica que se liga a, pelo menos, dois sítios de ligação oumoléculas-alvo. O anticorpo da invenção pode ser, de fato, derivado ouvinculado a mais do que uma outra molécula funcional para gerar moléculasmulti-específicas que se ligam a mais do que dois sítios de ligação diferentese/ou moléculas-alvo; também se pretende que estas moléculas multi-específicas sejam abrangidas pelo termo "molécula bi-específica", conformeutilizado nesta exposição. A fim de criar uma molécla bi-específica dáinvenção, um anticorpo da invenção pode ser ligado funcionalmente (porexemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação covalente ououtros) a uma ou mais outras moléculas de ligação, como um outroanticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, deforma a resultar uma molécula bi-específica.De acordo com o mesmo, a presente invenção inclui moléculasbi-específicas, compreendendo, pelo menos, uma primeira especificidade deligação para hTSLP e uma segunda especificidade de ligação para umsegundo epítopo-alvo. Por exemplo, o segundo epítopo-alvo é um receptorFc, por exemplo, FcyRI humano (CD64) ou receptor Fca humano (CD89).Por conseguinte, a invenção inclui moléculas bi-específicas, capazes de seligarem a FcyR, FcaR ou FceR que expressam células efetoras (porexemplo, monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs) e acélulas-alvo que expressam hTSLP. Estas moléculas bi-específicas visamcélulas que expressam hTSLP para célula efetora e desencadeiamatividades de células efetoras mediadas peio Fc, como fagocitose de célulasque expressam hTSLP, citotoxicidade mediada por célula dependente deanticorpo (ADCC), liberação de citocinas ou geração de ânion superóxido.

Adicionalmente, para a invenção na qual a molécula bi-específica é multi-específica, a molécula pode incluir ainda uma terceiraespecificidade de ligação, além de especificidade de ligação anti-Fc eespecificidade de ligação anti-hTSLP. Por exemplo, a terceira especificidadede ligação poderia ser uma porção de fator anti-intensificação (EF), porexemplo, uma molécula que se liga a uma proteína de superfície envolvidaem atividade citotóxica e, pelo mesmo, aumenta a resposta imune contra acélula-alvo. A "porção do fator anti-intensificação" poderia ser um anticorpo,fragmento funcional de anticorpo ou um Iigante que se liga a uma moléculaespecífica, por exemplo, um antígeno ou receptor, resultando, pelo mesmo,em intensificação do efeito dos determinantes da ligação para o receptor Fcou antígeno da célula-alvo.

A "porção do fator anti-intensificação" pode ligar-se a umreceptor Fc ou antígeno de uma célula-alvo. Alternativamente, a porção dofator anti-intensificação poderia ligar-se a uma entidade diferente daquela àqual a primeira e segunda especificidades de ligação ligam-se. Por exemplo,a porção do fator anti-intensificação pode ligar-se a uma célula T citotóxica(por exemplo, por CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD44, ICAM-1 ou outracélula imune que resulte em resposta imune aumentada contra a célula-alvo).

Em uma concretização, as moléculas bi-específicas da invençãocompreendem, como uma especificidade de ligação, pelo menos, umanticorpo, ou fragmento deste, incluindo, por exemplo, Fab, Fab1, F(ab')2, Fvou Fv de cadeia única. O anticorpo pode ser também um dímero de cadeialeve ou cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo deste, como Fv ouuma construção de cadeia única, conforme descrito em Ladner et al. PatenteU.S. Ng 4 946 778, cujo conteúdo é aqui expressamente incorporado porreferência neste pedido.

Em uma concretização, a especificidade de ligação parareceptor Fcy é provida por um anticorpo monoclonal, cuja ligação não ébloqueada por imunoglobulina G humana (IgG). Conforme utilizado nestaexposição, o termo "receptor de IgG" refere-se a quaisuqer dos genes dasoito cadeias γ, localizadas no cromossomo 1. Estes genes codificam, nototal, doze isoformas transmembranas ou solúveis do receptor, que sãoagrupadas em três classes de receptor Fy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32) eFcyRIII (CD 16). Em uma outra concretização, o receptor Fcy é um receptorFcyRI humano de alta afinidade. O FcyRI humano é uma molécula de 72kDa que exibe alta afinidade por IgG monomérica (108 -109 M"1).

A produção e caracterização de certos anticorpos monoclonaisanti-Fcy são descritas por Fanger et al. na PCT Publication WO 88/00052 ena patente U.S. N9 4 954 617, cujos ensinamentos são inteiramenteincorporados por referência neste pedido. Estes anticorpos ligam-se a umepítopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII, em um sítio distinto do sítio de ligaçãodo Fcy do receptor e, dessa forma, sua ligação não é substancialmentebloqueada por níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos específicos antí-FcYRI,úteis nesta invenção, incluem mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197.O hibridoma que produz mAb 32 é disponibilizado pela American TypeCulture Collection, Número de Acesso da ATCC HB9469. Em outrasconcretizações, o anticorpo anti-receptor Fcy é uma forma humanizada doanticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpoH22 são descritas em Graziano, R.F. et al., 1995 J. Immunol 155 (10): 4996-5002 e PCT Publication WO 94/10332. A linhagem celular produtora doanticorpo 1122 foi depositada na American Type Culture Collection sob adesignação HA022CL1 e possui o número de acesso CRL 11177.

Eni ainda outras concretizações, a especificidade de ligação porreceptor Fc é provida por um anticorpo que se liga a um receptor de IgAhumano, por exemplo, um receptor Fc-alfa (FcaRI (CD89), cuja ligação nãoprecisa ser bloqueada por imunoglobulina A humana (IgA). O termo"receptor de IgA" pretende incluir o produto gênico de um gene (FcaRI)localizado no cromossomo 19. Este gene é conhecido por codificar váriasisoformas transmembrnas alternativamente divididas de 55 a 110 kDa.FcaRI (CD89) é expresso construtivamente em monócitos/macrófagos,granulócitos eosinófilos e neutrófilos, porém não em populações de célulasnão efetoras. FcaRI possui média afinidade (5 χ 107 M"1) por IgAI e lgA2, oqual é aumentado em exposição a citocinas como G-CSF ou GM-CSF(Morton, H.C. et ai, 1996 Criticai Reviews in Immunology 116:423-440).Foram descritos quatro anticorpos monoclonais específicos para FcaRI1identificados como A3, A59, A62 e Α77, que se ligam a FcaRI fora dodomínio de ligação do Iigante de IgA (Monteiro, R.C. et ai, 1992 J. Immunol.148:1764).

FcaRI e FcyRI são receptores que desencadeiam o uso dasmoléculas bi-específicas da invenção porque são expressos primariamenteem células imunes efetoras, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos ecélulas dendríticas; expressados em níveis altos (por exemplo, 5.000-100.000 por célula); mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo,ADCC, fagocitose); intermedeiam apresentação intensificada de antígeno deantígenos, incluindo auto-antígenos, visados pelos mesmos.

Outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas bi-específicas da invenção são anticorpos monoclonais murinos, quiméricos ehumanizados.

As moléculas bi-específicas da presente invenção podem serpreparadas por conjugação das especificidades de ligação constituintes, porexemplo, as especificidades de ligação anti-FcR e anti-hTSLP, utilizandométodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade deligação da molécula bi-específica pode ser gerada separadamente econjugada uma à outra em seguida. Quando as especificidades de ligaçãosão proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento oude ligação cruzada pode ser utilizada para conjugação covalente. Exemplosde agentes de ligação cruzada incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA)1 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico)(DTNB), o-fenilenedimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) e sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)cyclohaxano-l-carboxilato (sulfo-SMCC) (consultar, por exemplo, Karpovskyet ai, 1984 J. Exp. Méd. 160:1686; Liu1 MA et ai, 1985 Proc. Nati Acad. Sei.USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus, 1985Behring Ins. Mitt. Ns 78,118-132; Brennan et ai, 1985 Science 229:81-83 eGlennie et ai, 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375. SATA e sulfo-SMCC sãoagentes de conjugação, ambos disponíveis, fornecidos por Pierce ChemicalCo. (Rockford, IL).

Quando as especificidades de ligação são anticorpos, estespodem ser conjugados, unindo-se resíduos sulfidrila das regiões dearticulação do C-terminal das duas cadeias pesadas. Em uma concretizaçãoespecial, a região de articulação é modificada de forma a conter um númeroímpar de resíduos sulfidrila, por exemplo, um, antes de ser efetuada aconjugacão,

Alternativamente, as duas especificidades de ligação podem sercodificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célulahospedeira. Esse método é particularmente útil quando a molécula bi-específica é mAb χ mAb, mAb χ Fab, Fab χ F(ab')2 0U Iigante χ proteína defusão Fab. Uma molécula bi-específica da invenção pode ser uma moléculade cadeia única, compreendendo um anticorpo de cadeia única e umdeterminante de ligação, ou uma molécula bi-específica de cadeia única,compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas bi-específicaspodem compreender, pelo menos, duas moléculas de cadeia única. Métodospara o preparo de moléculas bi-específicas são descritos, por exemplo, naPatente U.S. Número 5 260 203; Patente U.S. Número 5 455 030; PatenteU.S. Número 4 881 175; Patente U.S. Número 5 132 405; Patente U.S.Número 5 091 513; Patente U.S. Número 5 476 786; Patente U.S. Número 5013 653; Patente U.S. Número 5 258 498 e Patente U.S. Número 5 482 858.

A ligação das moléculas bi-específicas a seus alvos específicospode ser confirmada, por exemplo, por ensaio imunoenzimático de adsorção(ELISA), radioimoensaío (REA), análise FAGS, bioensaio (por exemplo,inibição de crescimento) ou ensaio por Western Blot. Cada um destesensaios detecta geralmente a presença de complexos proteína-anticorpo deinteresse em particular, empregando um reagente marcado (por exemplo,um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, oscomplexos FcR-anticorpo podem ser detectados com, por exemplo, umanticorpo ligado a uma enzima, ou fragmento de anticorpo, que reconhece ese liga especificamente aos complexos anticorpo-FcR.

Alternativamente, os complexos podem ser detectados utilizandoqualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, oanticorpo pode ser marcado radioativamente e utilizado em umradioimunoensaio (RIA) (consultar, por exemplo, Weintraub; B., Principies offíadioimmunoassays, Sevenih Training Course on Radioligand AssayTechniques, The Endocrine Society, Marco de 1986, o qual é aquiincorporado por referência neste pedido). O isótopo radioativo pode serdetectado por meios como o uso de um contador γ ou contador de cintilaçãoou por auto-radiografia.

Arcabouços que não são de Imunoalobulinas

Uma ampla variedade de estruturas ou arcabouços deanticorpos/ imunoglobulinas pode ser empregada, desde que o polipeptídeoresultante inclua uma ou mais regiões de ligação, específicas para aproteína hTSLP. Estas estruturas principais ou arcabouços incluem os 5principais idiotipos de imunoglobulinas humanas, ou fragmentos destas(como aquelas expostos em outros locais no presente), e incluemimunoglobulinas de outras espécies de animais, de preferência, comcaracterísticas humanizadas. Anticorpos de cadeia pesada única, comoaqueles identificados em camelídeos, são de especial interesse nesseaspecto. Novas estruturas principais, arcabouços e fragmentos continuam aser descobertos e desenvolvidos por especialistas na técnica.

Em uma característica, a invenção pertence à geração deanticorpos que não se baseiam em imunoglobulinas, empregandoarcabouços diferentes daqueles de imunoglobulinas, nos quais CDRs dainvenção podem ser enxertadas. Estruturas principais e arcabouços,conhecidos ou futuros, diferentes daqueles de imunoglobulinas podem serempregados, desde que compreendam uma região de ligação específicapara a proteína visada. Estes compostos são conhecidos nesta exposiçãocomo "polipeptídeos compreendendo uma região de ligação alvo-específica".Estruturas principais ou arcabouços conhecidos diferentes daqueles deimunoglobulinas, incluem Adnectinas (fibronectina) (CompoundTherapeutics, Inc., Waltham, MA), ancirina (Molecular Partners AG, Zurique,Suíça), anticorpos de domínios (Domantis, Ltd (Cambridge, MA) e AbIynx nv(Zwijnaarde, Bélgica)), Iipocalina (AnticaIina) (Pieris Proteolab AG, Freising,Alemanha), produtos farmacêuticos imunológicos de módulo pequeno(Trubion Pharmaeeuticals Inc., Seattle, WA), maxybodies (Avidia, Inc.(Mountain View, CA)), Proteína A (Affibody AG, Suécia) e afilina (gama-cristalina ou ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemanha),

(i) Adneetinas - Compound Therapeutics

Os arcabouços da adnectina baseiam-se em domínio dafibronectina tipo Ill (por exemplo, o décimo módulo da fibronectina tipo Ill(domínio 10 Fn3)). O domínio da fibronectina tipo Ill possui 7 ou 8 fitas beta,distribuídas entre duas folhas beta, empilham-se uma contra as outras paraformar o núcleo da proteína e contém ainda alças (análogas a CDRs) queconectam as fitas beta umas às outras e são expostas em solvente. Há, pelomenos, três destas alças em cada margem do sanduíche de folhas beta, emque a margem é borda da proteína, perpendicular à direção das fitas beta.(US 6 818 418).

Estes arcabouços à base de fibronectina não são umaimunoglobulina, embora a dobra final esteja estreitamente relacionadaàquela do menor fragmento funcional de anticorpo, a região variável dacadeia pesada, que compreende toda a unidade de reconhecimento deantígeno em IgG de camelo e de llama. Por causa dessa estrutura. oanticorpo não-imunoglobulina imita propriedades de ligação, cuja natureza eafinidade são semelhantes àquelas de anticorpos. Estes arcabouços podemser utilizados, seguindo uma estratégia de distribuição aleatória ebaralhamento (shuffling) de alças in vitro, semelhante ao processo dematuração de afinidade de anticorpos in vivo. Essas moléculas à base defibronectina podem ser utilizadas como arcabouços, em que as regiões dealças da molécula podem ser substituídas por CDRs da invenção,empregando técnicas convencionais de clonagem.

(ii) Ancirina - Molecular Partners

A tecnologia baseia-se no uso de proteínas com módulosrepetidos derivados de ancirina, como arcabouços para sustentar regiõesvariáveis que podem ser utilizadas para ligação a alvos diferentes. O módulorepetido de ancirina é um polipeptídeo de 33 aminoácidos, consistindo emduas hélices-α anti-paralelas e um volta-β. A ligação das regiões variáveis éotimizada principalmente pelo uso de exibição em ribossoma.

(iii) Maxybodies/Ayimeros - Avidia

Avímros são derivados de proteína natural contendo o domínioA, como LRP-1. Estes domínios são utilizados pela natureza para interaçõesproteína-proteína e, em seres humanos, a estrutura de mais de 250 proteinsbaseia-se em domínios A. Os avímeros são constituídos por algunsmonômeros diferentes de "domínio A" (2-10), unidos por agentes de ligaçãoformados por aminoácidos. É possível criar avímeros que podem se ligar aoantígeno-alvo, empregando a metodologia descrita em, por exemplo,20040175756, 20050053973,20050048512e20060008844.

(vi) Proteína A - Affibody

Ligantes de afinidade Affibody® são proteínas pequenas esimples, compostas por um feixe de três hélices, baseados no arcabouço deum dos domínios de ligação de IgG da Proteína A. A Proteína A é umaproteína de superfície da bactéria Staphylococcus aureus. O domínio destearcabouço consiste em 58 aminoácidos, 13 dos quais são distribuídosaleatoriamente para gerar bibliotecas de Affibody® com número grande devariantes de Iigantes (Consultar, por exemplo, US 5 831 012). As moléculasde Affibody® imitam anticorpos, possuem 6 kDa de peso molecular,comparado ao peso molecular de anticorpos que é de 150 kDa. Apesar deseu pequeno tamanho, o sítio de ligação de moléculas de Affibody® ésemelhante ao de um anticorpo.

(v) Anticalinas - Pieris

Anticalins® são produtos desenvolvidos pela companhia PierisProteoLab AG. Elas são derivadas de lipocalinas, um grupo extenso deproteínas pequenas e robustas que estão geralmente envolvidas notransporte de fisiológico ou armazenamento de compostos quimicamentesensíveis ou insolúveis. Diversas lipocalinas naturais estão presentes emtecidos humanos ou líquidos do corpo.

A arquitetura protéica é reminescente de imunoglobulnas comalças hipervariáveis na parte superior de uma estrutura principal rígida. Noentanto, ao contrário de anticorpos ou de seus fragmentos recombinantes,as lipocalinas são compostas por um polipeptídeo de cadeia única com 160a 180 resíduos de aminoácidos, sendo um pouco maior do que um únicodomínio de imunoglobulina.

O conjunto de quatro alças que formam o bolso de ligação exibeacentuada plasticidade estrutural e sustenta uma variedade de cadeiaslaterais. O sítio de ligação pode ser, portanto, reformado em um processo depropriedade exclusiva, visando reconhecer moléculas alvo prescritas deforma diferente com alta afinidade e especificidade.

Uma proteína da família de lipocalinas, a bilina-proteína deligação (BBP) de Pieris Brassicae foi utilizada para desenvolver anticalinas,submetendo-se o conjunto de quatro alças à mutagênse. Um exemplo de umpedido de patente, descrevendo "anticalinas" é o PCT WO 199916873.

(vi) Afilina - Scil Proteins

As moléculas de Affilin™ são proteínas pequenas não-imunoglobulinas que são criadas para exibierem afinididades específicasdirecionadas a proteínas e moléculas pequenas. Novas moléculas de Affilin™ podem ser selecionadas muito rapidamente dentre duas bibliotecas, cadauma das quais baseada em uma proteína diferente derivada de arcabouçohumano,

As moléculas de Affilin™ não exibem qualquer homologiaestrutural com as proteínas de imunoglobulinas. Scil Proteins emprega doisarcabouços de Affilin™, um destes é uma proteína estrutural gama cristalinade lentes dos olhos e a outra é uma proteína da superfamília da "ubiquitina".Ambos os arcabouços humanos são muito pequenos, exibem estabilidade aalta temperatura e quase resistentes a alterações de pH e agentesdesnaturizantes. Esta alta estabilidade é decorrente principalmente daestrutura expandida de folhas beta das proteínas. Exemplos de proteínasgama cristalinas derivadas são descritos em W0200104144 e exemplos deproteínas "semelhantes à ubiquitina", em W02004106368.

Composições Farmacêuticas

Em uma outra característica, a presente invenção provê umacomposição, por exemplo, uma composição farmacêutica contendo um ouuma combinação de anticorpos monoclonais, ou porção(ões) de ligação comantígeno destes, formulados juntos com um veículo farmaceuticamenteaceitável. Estas composições podem incluir um ou uma combinação (porexemplo, dois ou mais diferentes) de anticorpos, ou imunoconjungados oumoléculas bi-específicas da invenção. Por exemplo, uma composiçãofarmacêutica da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos(ou imunoconjugados ou bi-específicos) que se ligam a epítopos diferentesno antígeno-alvo ou que possuem atividades de complementaridade.

Composições farmacêuticas da invenção podem seradministradas também em terapia combinada, ou seja, combinadas a outrosagentes. Por exemplo, a terapia combinada pode incluir um anticorpo anti-hTSLP da presente invenção combinado a, pelo menos, um outro agenteantiinflamatório. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser utilizadosem terapia combinada são descritos mais detalhadamente abaixo, na seçãosobre usos dos anticorpos da invenção.Conforme utilizado nesta exposição, "veículo farmaceuticamenteaceitável" inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão,revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardo deabsorção e isotônicos e similares que sejam fisiologicamente compatíveis. Oveículo deve ser adequado para administração intravenosa, intramuscular,subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ouinfusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, ou seja,anticorpo, imunoconjugado ou molécula bi-específica pode ser revestido porum material que o proteja da ação de ácidos e outras condições naturais quepossam inativar ò composto.

Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um oumais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamenteaceitável" refere-se a um sal que conserva a atividade biológica desejada docomposto original e não transmite quaisquer efeitos toxicológicos nãodesejados (consultar, por exemplo, Berge, S.M. et ai, 1977 J. Pharm. Sei.66:1-19). Exemplos destes sais incluem sais de adição de ácido e sais deadição de base. Sais de adição de ácido incluem aqueles derivados deácidos inorgânicos não tóxicos, como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico,bromídrico, iodrídico, fosforoso e similhares, bem como de ácidos orgânicosnão tóxicos, como ácidos mono e di-carboxílicos alifáticos, ácidos fenil-substituídos alcanóicos, ácidos hidroxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidossulfônicos alifáticos e aromáticos e similares. Sais de adição de baseincluem aqueles derivados de metais alcalino-terrosos, como sódio,potássio, magnésio, cálcio e similares, bem como de aminas orgânicas nãotóxicas, como Ν,Ν'-dibenziletilenediamina, N-metilglucamina, cloroprocaína,colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similares.

Uma composição farmacêutica da invenção pode incluir tambémum antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantesfarmaceuticamente aceitáveis incluem: antioxidantes solúveis em água,como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio,metabissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares;antioxidantes solúveis em óleo, como ascorbil palmitato, butilatohidroxianisol (BHA), butilato hidroxitolueno (BHT), Iecitina1 propil gaiato, alfa-tocoferol e similares; e agentes de quelação de metais, como ácido cítrico,ácido etilenodiamina tetracético (EDTA)1 sorbitol, ácido tartárico, ácidofosfórico é os semelhantes.

Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados quepodem ser empregados nas composições farmacêuticas da invençãoincluem água, etanol, polióis (como glicerol, propielnoglicol e ossemelhantes) e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, como óleode oliva, e estéres orgânicos injetáveis, como etil oleato. A fluidez adequadapode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, comolecitina, pela manutenção do tamanho de partículas exigido, no caso dedispersões, e pelo uso de surfactantes.

Estas composições podem conter também adjuvantes comoconservantes, agentes umidificantes, agentes emulsificantes e agentesdispersantes. A prevenção de presença de microorganismos pode serassegurada por procedimentos de esterilização, supra, e pela inclusão devários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, paraben,clorbutanol, ácido fenol sórbico e os semelhantes. Pode ser desejáveltambém incluir agentes isotônicos, como açúcares, cloreto de sódio e ossemelhantes nas composições. Ademais, absorção prolongada da formafarmacêutica injetável pode ser promovida pela inclusão de agentes queretardam a absorção, como monoestearato de alumínio e gelatina.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluçõesaquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para preparaçãoextemporânea de soluções injetáveis ou dispersão estéreis.Pharmaceuticallyacceptable carriers include sterile aqueous solutions or dispersions andsterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectablesolutions or dispersion. O uso desses meios e agentes para substânciasfarmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Desde que qualquer meioconvencional ou agente seja compatível com o composto ativo, o uso destenas composições farmacêuticas da invenção é contemplado. Componentesativos complementares podem ser incorporados também nas composições.As composições terapêuticas precisam tipicamente ser estéreise estáveis, sob as condições de fabricação e armazenamento. A composiçãopode ser formulada sob forma de solução, microemulsão, lipossoma ou outraestrutura organizada adequada para concentração alta de fármaco. Oveículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo,água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicollíquido e os semelhantes), e misturas adequadas destes. A fluidez adequadapode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, comolecitina, pela manutenção do tamanho de partículas exigido, no caso dedispersão, e pelo uso de surfactantes. Em muitos casos, é possível incluiragentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcóois, como manitol,sorbitol ou cloreto de sódio, na composição. Absorção prolongada dascomposições injetáveis pode ser promovida pela inclusão na composição deum agente que retarde absorção, por exemplo, sais de monoestearato egelatina.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas,incorporando-se o composto ativo na quantidade exigida ém um solventeapropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima,conforme exigido, seguido por esterilização por micro-filtração. De modogeral, dispersões são preparadas, incorporando-se o composto ativo em umveículo estéril que contenha um meio básico de dispersão e os outrosingredientes exigidos dentre estes enumerados acima. Em caso de pósestéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos depreparação são secagem a vácuo e secagem pelo frio (liofilização) queproduzem um pó do ingrediente ativo, acrescentado de qualquer ingredienteadicional desejado de uma solução filtrada estéril prévia do mesmo.

A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada comum veículo para produzir uma forma de dose única variará dependendo doindivíduo a ser tratado, e o modo de administração em particular. Aquantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada a um veículo paraproduzir uma forma de dose única será, de modo geral, aquela quantidadeda composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, dentre cempor cento, esta quantidade variará de aproximadamente 0,1 por cento aaproximadamente noventa e nove por cento de ingrediente ativo, deaproximadamente 0,1 por cento a aproximadamente 70 por cento ou deaproximadamente 1 por cento a próximo de 30 por cento do ingredienteativo, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Regimes de doses são ajustados para fornecerem a respostaótima desejada (ou seja, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um únicobolus pode ser administrado, várias doses divididas podem seradministradas ao longo do tempo ou a dose pode ser reduzidaproporcionalmente ou aumentada, conforme indicado pelas exigências dasituação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composiçõesparenterais, em forma de dose unitária, para facilitar a administração euniformidade de doses. Forma de dose unitária, conforme utilizada nestaexposição, refere-se a unidades fisicamente distintas, adequadas comodoses unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contémuma quantidade pré-determinada de composto ativo, calculada para produziro efeito terapêutico desejado, em associação ao veículo farmacêuticoexigido. A especificação para formas de doses unitárias da invenção é ditadae depende diretamente das características únicas do composto ativo e doefeito terapêutico em particular a ser atingido, além de as limitaçõesinerentes na técnica de composição deste composto ativo para o tratametnode sensibilização em indivíduos.

Para administração do anticorpo, as faixas de doses variam deaproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg e, mais geralmente, de 0,01 a 5mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as doses podem ser0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de pesocorporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou na faixade 1-10 mg/kg. Um exemplo de regime de tratamento requer administraçãouma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada trêssemanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez a cada mês, uma vez acada 3 meses ou uma vez a cada três a 6 meses. Regimes de doses de umanticorpo anti-hTSLP da invenção inclui 1 mg/kg de peso corporal ou 3mg/kg de peso corporal, por administração intravenosa, com o anticorposendo fornecido empregando um dos seguintes esquemas paraadministração de doses: a cada quatro semanas para seis doses, emseguida, a cada três meses; a cada três semanas; 3 mg/kg de peso corporal,seguidos por 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.

Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais, comespecificidades de ligação diferentes, são administrados simultaneamente,em cujo caso, a dose de cada anticorpo administrado enquadra-se nasfaixas indicadas. O anticorpo é geralmente administrado em múltiplasocasiões. Intervalos entre doses únicas podem ser, por exemplo, semanais,mensais, a cada três meses ou anuais. Os intervalos podem ser tambémirregulares, conforme indicado pela medição de níveis sangüíneos doanticorpo em relação ao antígeno visado no paciente. Em alguns métodos, adose é ajustada para que ser obtida concentração plasmática do anticorpode aproximadamente 1 -1000 pg/ml, e em alguns métodos, aproximadamente25-300 μ g/ml.

Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado em fórmulade liberação prolongada, em cujo caso, é requerida administração menosfreqüente. A dose e freqüência variam, dependendo da meia-vida doanticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanos exibem a meia-vidamais longa, seguidos por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos eanticorpos não humanos. A dose e freqüência de administração podemvariar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Emaplicações profiláticas, uma dose relativamente baixa é administrada emintervalos relativamente infreqüentes ao longo de um período prolongado detempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento pelo resto de suasvidas. Em aplicações terapêuticas, uma dose relativamente alta emintervalos relativamente curtos é, às vezes, exigida até que a progressão dadoença tenha reduzido ou finalizado, ou até que o paciente apresentemelhora parcial ou completa de sintomas de doença. Posteriormente, podeser administrado no paciente um regime profilático.

Os níveis reais.de doses dos ingredientes ativos, presentes nascomposições farmacêuticas da presente invenção, podem variar de forma aser obtida uma quantidade do ingrediente ativo efetiva para ser atingida aresposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo deadministração èm particular, sem ser tóxica para o paciente. O nível de doseselecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos,incluindo a atividade das composições em particular da presente invençãoempregadas, ou o éster, sal ou amido destas, a via de administração, ohorário de administração, a taxa de excreção do composto em particularsendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostose/ou materiais utilizados em combinação com as composições em particularempregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde em geral e históriamédica anterior do paciente sendo tratado e fatores semelhantes bemconhecidos nas artes médicas.

Uma "dose terapeuticamente efetiva" de um anticorpo anti-hTSLP da invenção pode resultar em diminuição em gravidade de sintomasde sintomas, aumento em freqüência e duração de períodos livres desintomas de doença ou prevenção de comprometimento ou deficiência,decorrente do acometimento da doença.

Uma composição da presente invenção pode ser administradapor uma ou mais vias de administração, usado um ou mais de umavariedade de métodos conhecidos na técnica. Conforme será apreciado peloespecialista, a via e/ou modo de administração variarão dependendo dosresultados desejados. Vias de administração para anticorpos da invençãoincluem intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal,subcutânea, espinhal ou outras vias de administração parenteral, porexemplo, por injeção ou infusão. A frase "administração parenteral",conforme utilizada nesta exposição, significa modos de administraçãodiferentes de administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e inclui,entre outras, injeção ou infusão intravenosa, intramuscular, intraarterial,intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica,intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular,subcapsular, subaracnóide, intra-espinhal, epidural e intra-esternal.Alternativamente, um anticorpo da invenção pode seradministrado por via não-parenteral, como tópica, epidérmica ou via deadministração por mucosa, por exemplo, intranasal, oral, vaginal, retal,sublingual ou tópica.

Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que oprotegerão contra liberação rápida, como em fórmula de liberaçãocontrolada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemasmicroencapsulados de liberação. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveispodem ser utilizados, como etileno vinil acetato, polianidridos, ácidopoliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodospara o preparo destas formulações são patenteados ou conhecidosgeralmente por especialistas na técnica. Consultar, por exemplo, Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., MareeiDekker, Inc., New York, 1978.

As composições terapêuticas podem ser administradas comdispositivos médicos, conhecidos na técnica. Por exemplo, uma composiçãoterapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivohipodérmico sem agulha, como os dispositivos apresentados nas patentesU.S. N25 5 399 163, 5 383 851, 5 312 335, 5 064 413, 4 941 880, 4 790 824ou 4 596 556. Exemplos de implantes bem conhecidos e de módulos úteisna presente invenção incluem: patente U.S. N9 4 487 603 que apresentauma bomba de micro-infusão implantável para dispensar medicação em taxacontrolada; patente U.S. Nq 4 486 194 que apresenta um dispositivoterapêutico para administração de medicamentos através da pele; patenteU.S. Ne 4 447 233 que apresenta uma bomba de infusão de medicação paraliberação de medicação em uma taxa precisa de infusão; patente U.S. N9 4447 224 que apresenta um aparelho de infusão implantável de fluxo variávelpara liberação contínua de fármaco; patente U.S. N8 4 439 196 queapresenta um sistema de liberação de fármaco por osmose comcompartimentos multi-câmaras; e patente U.S. Ne 4 475 196 que apresentaum sistema de liberação de fármaco por osmose. Estas patentes são aquiincorporadas por referência neste pedido. Muitos outros destes implantes,sistemas de liberação e módulos são conhecidos de especialistas natécnica.

Em certas concretizações, os anticorpos monoclonais dainvenção podem ser formulados para assegurar uma distribuição apropriadain vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BHE) exclui muitoscompostos altamente hidrofílicos. Para assegurar que os compostosterapêuticos da invenção atravessam a BHE-(se desejado), eles podem serformulados, por exemplo, em lipossomos. Para métodos de produção delípossomos, consultar, por exemplo, as patentes U.S. 4 522 811,5 374 548 e5 399 331. Os lipossomos podem compreender um ou mais grupamentosque são transportados seletivamente para dentro de células ou órgãosespecíficos, intensificando, dessa forma, a liberação pretendida do fármaco(consultar, por exemplo, V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685).Exemplos de grupamentos intencionados incluem folato ou biotina(consultar, por exemplo, a patente U.S. 5 416 016 para Low et ai.);manosides (Umezawa et ai, 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun.153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman et ai., 1995 FEBS Lett. 357:140; M.Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180); surfactante dereceptor de proteína A (Briscoe et aí., 1995 Am. J. Physioi. 1233:134); p120(Schreier et al., 1994 J. Biol Chem. 269:9090); consultar também K.Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler,1994 Imrnunomethods 4:273.

Usos e Métodos da Invenção

Os anticorpos (e imunoconjugados e moléculas bi-específicas)da presente invenção podem ser aplicados para diagnóstico in vitro e in vivoe terapia. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a célulasem cultura, por exemplo, in vitro ou in vivo, ou a um indivíduo, por exemplo,in vivo, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de distúrbios. Otermo "indivíduo", conforme utilizado nesta exposição, pretende incluir sereshumanos e animais não humanos. Animais não humanos incluem todos osvertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas nãohumanos, ovelhas, cachorros, gatos, cavalos, vacas, coelhos, anfíbios, rép-teis, etc. Os métodos são particularmente adequados para tratamento depacientes humanos com um distúrbio associado à expressão aberrante dehTSLP. Quando anticorpos contra hTSLP são administrados juntos com umoutro agente, os dois podem ser administrados em ordem ou simultaneamente.

Em uma concretização, os anticorpos (e imunoconjugados e mo-léculas bi-específicas) da invenção podem ser utilizados para detectar níveisde hTSLP ou níveis de células que contêm hTSLP. Essa detecção pode serefetuada, por exemplo, por contato de uma amostra (como uma amostra ·invitro) e uma amostra de controle com o anticorpo anti-hTSLP, sob condiçõesque possibilitem a formação de um complexo entre o anticorpo e hTSLP.Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e hTSLP são detectados ecomparados na amostra e no controle. Por exemplo, métodos convencionaisde detecção, bem conhecidos na técnica, como ELISA e ensaios de citome-tria de fluxo, podem ser conduzidos empregando as composições da invenção.

De acordo com o mesmo, em uma característica, a invençãoprovê ainda métodos para detecção da presença de hTSLP (por exemplo,antígeno de hTSLP) em uma amostra, ou medição da quantidade de hTSLP,compreendendo o contacto da amostra, e de uma amostra de controle, comum anticorpo da invenção, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo,que se liga especificamente a hTSLP, sob condições que possibilitem a for-mação de um complexo entre o anticorpo ou porção do mesmo e hTSLP. Aformação de um complexo é detectada, em seguida, onde a diferença, emformação de complexos, entre a amostra comparada à amostra de controle éindicativa da presença de hTSLP na amostra.

A invenção abrange ainda kits consistindo em as composições(por exemplo, anticorpos, anticorpos humanos, imunoconjugados e molécu-las bi-específicas) da invenção e instruções para uso. O kit pode conter ain-da, pelo menos, um reagente adicional, ou um ou mais anticorpos adicionaisda invenção (por exemplo, um anticorpo com atividade de complementarida-de que se liga a um epítopo no antígeno-alvo, distinto do primeiro anticorpo).Os kits incluem tipicamente uma etiqueta, indicando o uso pretendido doscomponentes do kit. O termo etiqueta inclui qualquer material por escrito ougravado, suprido sobre ou com o kit, ou que acompanha, de outra forma, o kit.

A invenção tendo sido inteiramente descrita, é ainda ilustradapelos exemplos e reivindicações seguintes, os quais são ilustrativos e nãopretendem ser ainda mais restritivo. Especialistas na técnica reconhecerãoou serão capazes de averiguar, empregando nao mais do que experimenta-ção de rotina, inúmeros equivalentes aos procedimentos específicos descri-tos neste pedido. Estes equivalentes estão incluídos no alcance da presenteinvenção e reivindicações. Os conteúdos de todas as referências, incluindopatentes emitidas e publicações de pedidos de patentes, citados por todoeste pedido, são aqui incorporados por referência.

Os exemplos seguintes descrevem anticorpo monoclonal, espe-cialmente monoclonal humano, anti-TSLP humana que se liga especifica-mente a TSLP humana e neutraliza a sua atividade biológica em ensaiosdiferentes fundamentados em células, incluindo ensaios de célula humanaprimária. Os anticorpos desenvolvidos demonstraram afinidade extremamen-te alta na faixa de baixo pM.

Exemplos

Para a geração de anticorpos terapêuticos contra proteína TSLPhumana, foram conduzidas seleções com a biblioteca de exibição em fago,HuCAL GOLD® da MorphoSys. HuCAL GOLD® é uma biblioteca de Fab,fundamentada no conceito HuCAL® concept6'8 9, na qual todas as seis CDRsestão diversificadas e emprega a tecnologia CysDisplay™ para ligar frag-mentos Fab à superfície do fago10.

Exemplo 1: Geração de anticorpos específicos contra TSLP humana a partirda biblioteca HuCAL GOLD®

Resgate de fagemídeo, amplificação em fago e purificação

A biblioteca HuCAL GOLD® foi amplificada em meio 2xYT, con-tendo 34 pg/ml de cloranfenicol e 1% de glicose (2xYT-CG). Após infecçãocom fagos auxiliares VCSM13 em ODeoonm de 0,5 (30 min a 37°C sem agi-tação; 30 min a 37°C, com agitação a 250 rpm), as células foram giradasem orientação negativa (spin down) (4120 g; 5 min; 4 °C), ressuspendidasem 2xYT/ 34 pg/ml de cloranfenicol/ 50 pg/ml de canamicina/ IPTG a 0,25mM, e cultivadas durante a noite a 22 °C. Os fagos foram PEG-precipitadosduas vezes do sobrenadante, ressuspendidos em PBS/ 20% de glicerol earmazenados a -80 °C.

A amplificação em fagos entre duas rodadas de panning (técnicade seleção e separação que resulta no objeto focado e fundo borrado) foiconduzida da forma como segue: Células TG1 de E. coli de fase Iog médiaforam infectadas com fagos eluídos e espalhados em placas de LB agar,complementado com 1% de glicose e 34 pg/ml de cloranfenicol (placas LB-CG). Após incubação durante a noite a 30 °C, as colônias de TGI foramraspadas das placas de agar e utilizadas para inocular 2xYT-CG até queODeoonm de 0,5 fosse atingido e fagos auxiliares VCSM13 acrescentados pa-ra infecção, conforme descrito acima.

Panninas com HuCAL GOLD®

Para a seleção de anticorpos que reconheçam TSLP humana,foram aplicadas duas estratégias diferentes de panning. Em resumo, fagos-anticopors HuCAL GOLD® foram separados em quatro grupos, compreen-dendo combinações diferentes de genes principais de VH (grupo 1: VH1/5λκ, grupo 2: VH3 λκ, grupo 3: VH1/4 λκ, grupo 4: VH1-6 λκ). Estes grupossão submetidos individualmente a três rodadas de panning em fase sólidaem TSLP humana que reveste diretamente placas Maxisorp, e além destas,três de pannings em solução sobre TSLP biotinilada.

A primeira variante de panning foi panning em fase sólida contraTSLP humana:

2 cavidades em uma placa Maxisorp (F96 Nunc-lmmunoplate)foram revestidas com 300 μΙ de TSLP a 5 pg/ml - cada o/n a 4 °C. As cavi-dades revestidas foram lavadas 2 vezes com 350μΙ de PBS e bloqueadascom 350μΙ de MPBS a 5% por 2h, em temperatura ambiente (RT) em umagitador de placa de microtitulação. Para cada panning, aproximadamente10 13 de fagos-anticorpos HuCAL GOLD® foram bloqueados com volume e-quivalente de PBST/MP a 5% por 2h em temperatura ambiente. As cavida-des revestidas foram lavadas 2x com 350μΙ de PBS após o bloqueio. 300 μΙde fagos-anticorpos HuCAL GOLD® pré-bloqueio foram acrescentados a ca-da cavidade revestida e incubados por 2 h, em RT, em um agitador. Foi efe-tuada lavagem, acrescentando-se, cinco vezes, 350 μl de PBS/Tween a0,05%, seguido por mais quatro lavagens com PBS. A eluição de fagos daplaca foi executada com 300 μl de DTT a 20 mM em Tris a 10mM/HCI pH 8,por cavidade, por 10 mín. O eluado de fagos por DTT foi adicionado a 14 mlE.coli TG1, cultivados até OD600 de 0,6 - 0,8 a 37°C, em meio 2YT e incu-bados em tubos de plástico de 50ml por 45 min a 37°C, sem agitação, parainfecção dos fagos. Após centrifugação por 10 min a 5000 rpm, os pelletsbacterianos foram ressuspendidos individualmente em 500 μl de meio 2xYT,espalhados em placas de agar 2xYT-CG e incubados, durante a noite, a 30°C. As colônias foram removidas em seguida das placas e os fagos, resga-tados e amplificados, conforme descrito acima. A segunda e terceira rodadade panning em fase sólia sobre TSLP diretamente revestido foram executa-das de acordo com o protocolo da primeira rodada, exceto pelo aumento dorigor do procedimento para lavagem.

A segunda variante do panning foi panning em solução contraTSLP humana biotinilada:

Para o panning em solução, usando-se TSLP biotinilada acopla-da a Dynabeads M-280 (Dynal), foi aplicado o seguinte protocolo: Tubos deEppendorf de 1,5 ml foram bloqueados com 1,5 ml 2x de Chemiblocker, dilu-ído em 1:1 com PBS.durante a noite a 4 °C. 200 μl de Dynabeads M-280(Dynal) magnéticas revestidas com estreptovidiina foram lavadas 1x com200 μl de PBS e ressuspendidas em 200 μl 1x Chemiblocker (diluído em 1xPBS). O bloqueio das partículas foi efetuado em tubos pré-bloqueados du-rante a noite a 4 °C. Fagos diluídos em 500μl de PBS, para cada condiçãode panning, foram misturados com 500μΙ de 2x Chemiblocker / Tween a0,1% 1 h a RT (girador). Foi executada pré-adsorção de fagos duas vezes:50 μl de partículas magnéticas bloqueadas com Estreptavidina foram acres-centados aos fagos bloqueados e incubados por 30 min a RT em um rata-dor. Após separação de partículas, por meio de um dispositivo magnético(Dynal MPC-E), o sobrenadante com fago (~1ml) foi transferido para um no-vo tubo bloqueado e a pré-adsorção foi repetida em 50 μΙ de partículas blo-queadas por 30 min. Em seguida, hTSLP biotinilada a 200 nM foi acrescen-tada aos fagos bloqueados em um novo tubo de 1,5 ml e incubada por 1 h aRT em um girador. 100 μΙ de partículas magnéticas bloqueadas com estrep-tavidina foram acrescentados aos fagos bloqueados e incubados por 10 mina RT em um girador. Fagos ligados a TSLP biotinilada foram imobilizadosnas partículas magnéticas e recolhidos com um separador de partículasmagnéticas (Dynal MPC-E). As partículas foram lavadas em seguida 7x comPBS/Tween a 0,05%, empregando um girador, seguido por mais três lava-gens com PBS. A eluição de fagos das Dynabeads foi executada, acrescen-tando-se 300 μΙ de DTT a 20 mM em Tris a 10 mM /HCI pH 8 a cada tubopor 10 min. As Dynabeads foram retiradas pelo separador de partículasmagnéticas e o sobrenadante foi acrescentado a 14 ml de uma cultura deE.coli TG-1, cultivada para OD6oonm de 0,6 - 0,8. As partículas foram lavadasem seguida uma vez com 200μΙ de PBS e, juntamente com fagos adicional-mente removidos, o PBS foi acrescentado a 14 ml da cultura de E.coli TG-1.Para infecção dos fagos, a cültura foi incubada em tubos plásticos de 50 mlpor 45 min a 37 0C, sem agitação. Após centrifugaçãò por 10 min a 5000rpm, os pellets bacterianos foram ressuspendidos individualmente em 500 μΙde meio 2xYT, espalhados em placas de agar 2xYT-CG e incubados, duran-te a noite, a 30 °C. As colônias foram removidas em seguida das placas e osfagos, resgatados e amplificados, conforme descrito acima.

A segunda e terceira rodada de panning em fase sólida sobreTSLP biotinilada foram executadas de acordo com o protocolo da primeirarodada, exceto pelo aumento do rigor do procedimento para lavagem.Subclonaqem e Expressão de Fragmentos Fab solúveis

Os insertos codificadores de Fab dos fagemídeos selecionadosHuCAL GOLD® foram subclonados no vetor de expressão pMOR-PH®X9_Fab_FH (Fig 1) para facilitar expressão rápida e eficiente de Fabssolúveis. Para essa finalidade, o DNA do plasmídeo dos clones selecionadosfoi digerido com Xba\ e EcoRI, sendo extirpado, pelo mesmo, o inserto codi-ficador de Fab (ompA-VLCL e phoA-Fd), e clonado no vetor de expressãopMORPH®X9_Fab_FH, digerido por Xba\/EcoR\. Fabs expressados destevetor transmitem dois tags (seqüências curtas) C-terminal (FLAG™ e 6xHis,respectivamente) para ambas, detecção e purificação.

Microexpressão de Anticorpos Fab HuCAL GOLD® em E. coli

Colônias únicas resistentes a cloranfenicol, obtidas após subclo-nagem dos Fabs selecionados no vetor de expressão pMOR-PH®X9_Fab_FH, foram utilizadas para inocular as cavidades de uma placade microtitulação de 96 cavidades, contendo 100 μΙ de meio 2xYT-CG porcavidade, e cultivadas durante a noite a 37 °C. 5 μΙ de cada cultura de E. coliTG-1 foi transferida para uma nova placa de microtitulação estéril de 96 ca-vidades, pré-preenchida com 100 μΙ de meio 2xYT complementado com 34μ g/m I de cloranfenicole glicose a 0,1%, por cavidade. As placas de microti-tulação foram incubadas a 30 °C, sendo agitadas a 400 rpm, em um agitadorde microplacas até que as culturas se tornassem ligeiramente turvas (-2-4horas) com OD6OOnm de~0,5.

A estas placas de expressão, foram acrescentados 20 μΙ demeio 2xYT, complementado com 34 μg/ml de cloranfenicol e IPTG a 3 mM(isopropil-B-D-tiogalactopiranosida) por cavidade (concentração final: IPTG a0,5 mM), as placas de microtitulação foram lacradas com fita permeável agás e incubadas, durante a noite, a 30 °C, sob agitação a 400 rpm.

Geração de Iisados de células inteiras (extratos BEL): Á cadacavidade das placas de expressão, foram acrescentados 40 μΙ de tampãoBEL(2x BBS/ EDTA: 24,7 g/l de ácido bórico, 18,7 g de NaCI/l, 1,49 g deEDTA/I, pH 8,0), contendo 2,5 mg/ml de lisozima, e incubados por 1 h a 22°C em um agitador de placa de microtitulação (400 rpm). Os extratos BELforam utilizados para análise de ligação por ELISA ou em analisador M-series® 384 da BioVeris (consultar o Exemplo 2).

Técnicas de Imunoensaio Enzimático de absorção (ELISA)

5 μ g/m I de TSLP humano recombinante (R&D Systems) em PBSforam revestidos em placas Maxisorp com 384 cavidades (Nunc-Immunoplate) o/n a 4 0C. Após terem sido revestidas, as cavidades foramlavadas uma vez com PBS / Tween a 0,05% (PBS-T) e 2x com PBS. Emseguida, as cavidades foram bloqueadas com PBS-T com BSA a 2% por 2 hem RT. Em paralelo, 15 μl de extrato BEL e 15 μl de PBS-T com BSA a 2%foram incubados por 2 h em RT. As placas Maxisorp bloqueadas foram Iava-das 3x com PBS-T, antes de serem acrescentados 10 μl dos extratos BELbloqueados às cavidades e incubados por 1 h em RT. Para detecção dosanticorpos Fab primários, foram aplicados os seguintes anticorpos secundá-rios: fosfatase alcalina (AP)-conjugada ao fragmento AffiniPure F(ab')2 decabra anti-lgG humana, de camundongo ou de coelho (Jackson Immuno Re-search). Para a detecção de AP-conjugados, substratos fluorogênicos, comoAttoPhos (Roche), foram utilizados de acordo com as instruções do fabrican-te. Entre todas as etapas de incubação, as cavidades da placa de microtitu-lação foram lavadas três com PBS-T, e três vezes após a incubação final,com o anticorpo secundário. A fluorescência foi medida em um leitor de pla-ca TECAN Spectrafluor.

Expressão de Anticorpos Fab HuCAL GOLD® em E colie purificação

A expressão de fragmentos Fab, codificados por pMOR-PH®X9_Fab_FH em células TG-1, foi conduzida em culturas em frascos deagitador, empregando 750 ml de meio 2xYT, complementado com 34 μg/mlde cloranfenicol. As culturas foram agitadas a 30 °C, até que a OD60Onm atin-gisse 0,5. A expressão foi induzida pelo acréscimo de IPTG a 0,75 mM por20 h a 30°C. As células foram rompidas com Iisozima e os fragmentos FABisolados por cromatografia em Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Alemanha). As con-centrações de proteína foram determinadas por UV-espectrofotometria 11.

Exemplo 2: Identificação de neutralização de candidatos Fab anti-hTSLPhumana que inibem sinalização induzida pela TSLP do receptor de TSLP22 anticorpos diferentes, específicos contra TSLP humana, sele-cionados da biblioteca HuCAL GOLD®, foram testados quanto à potênciapara neutralizar TSLP humana.

Bloqueio de ligação da TSLP ao receptor de TSLP pelos Fabsanti-TSLP humana em ensaio por FACS

A inibição da ligação de TSLP biotinilada a células Ba/F3, ex-pressando hTSLPR, hlL7Ra foi analisada por FACS. Os anticorpos Fab fo-ram diluídos em tampão FACS (cellwash (B&D) / FCS a 3%). 50 μl de TSLPbiotinilada em 100 ng/ml foram incubados com 50 μl de Fab a 100 pg/ml por1 h em RT. Pára prevenir internalização do receptor de TSLP1 todas as ou-tras etapas posteriores com células foram conduzidas a 4°C ou em gelo.100 μl de células Ba/F3 em 2x 106 células/ml foram transfectadas para cadacavidade de uma placa de 96 cavidades (NUNC), e centrifugados a 2000rpm; 4 °C. As células foram lavadas 2x com 150 μl de tampão FACS gelado,ressuspendidas com a mistura Fab / TSLP biotinilada e incubadas por 1 h a 4°C em um agitador. Estreptavidina PE 1:400 em tampão FACS foi acrescen-tado para detecção. Após 30 min de incubação, as células foram centrifuga-das, conforme mencionado acima, e lavadas 2x com 150 μl de tampãoFACS gelado. 5000 células foram analisadas FACS. MOR04494,MOR04496, MOR04497 e MOR04609 exibiram inibição de ligação de célula.

Inibicão de ativação de STAT5 dependente de TSLP

Células Ba/F3, expressando hTSLPR, hlL7Ra e um gene repór-ter Stat5-Luc foram cultivas na presença de 5 ng/ml de TSLP. 10 μl de 1 x10células/ml em tampão de ensaio (RPMI-1640 sem fenol vermelho, FCS a10%, penicilina 10 UmrVestreptomicina 10 Mgmr1l 1% de puromicina) foramacrescentados a uma placa branca de 96 cavidades Costar (Corning). 70 μlde tampão de ensaio e 10 μl de anticorpo anti-TSLP (10x), em tampão deensaio, foram acrescentados e incubados por 20 min a 37 °C. 10 μΙ de 5ng/ml de TSLP (R&D Systems; concentração final de 0,5 ng/ml), em tampãode ensaio, foram acrescentados para fornecer um volume final do ensaio de100 μl. A placa foi revestida e deixada por 5-6 h a 37°C em incubadora umi-dificada. Foram acrescentados 100 μl (1:1 com volume de ensaio) de Iucife-rase Bright-GIo™ (Promega) e incubados por 5 min em RT. A placa foi la-crada com TopSeal™ antes de ser registrada a luminescência. MQR04493,MOR04494, MOR04496, MOR04497 e MOR04609 neutralizaram TSLP, neste ensaio.

Determinação da atividade de neutralização em monócito primário

Isolamento de monócitos humanos sangüíneos - 150 ml de san-gue foram coletadas de voluntários adultos saudáveis no painel de doadoresdo NHRC. O sangue foi coletado em tubos contendo 1 ml de anticoagulante(20 mg/ml de EDTA em PBS) por 10 ml de sangue e, em seguida, diluídocom 12,5 ml de PBS por 20 ml de sangue. As hemácias foram sedimenta-das, em seguida, pela mistura do sangue diluído com 12,5 ml de Dextrano a4% (em PBS) por tubo e incubação por 40 minutos em gelo. PBMCs foramisoladas por centrifugação por densidade, utilizando Ficoll e a "buffy coaf(placa leucocitária), contendo PBMCs, foi recuperada com pasta plástica. Ascélulas foram lavadas uma vez (300xg por 7 minutos) em PBS, e contadas.O isolamento dé células por MACS foi conduzido de acordo com as instru-ções dos fabricantes, empregando o kit Il de Isolamento de Monócitos (Mil-tenyi Biotec). Todos os acréscimos de tampão e lavagens foram efetuadoscom tampão MACS a 4 0C (PBS, BSA a 0,5%, EDTA a 2mM, pH 7,2), a nãoser que declarado de outra forma. Resumidamente, para 107 células, 30 μΙde tampão e 10 μΙ de Reagente de Bloqueio FcR e de Coquetel de Biotina-Anticorpo foram acrescentados, misturados bastante e incubados por 10 mi-nutos. Foram acrescentados ainda 30 μΙ de tampão e 20 μΙ de Micropartícu-las Anti-Biotina, em seguida, às células e incubadas por 15 minutos. As célu-las foram lavadas (300xg por 10 minutos), ressuspendidas em IO8 célulaspor 500 μΙ de tampão e aplicadas à coluna LS "preparada". A fração de mo-nócitos "não tocada" foi coletada pela retenção de todos os outros tipos decélulas na coluna. Diramte procedimento do isolamento, amostras foram co-letadas para análise posterior por citometria de fluxo.

Produção de TARC por monócitos tratados com TSLP e blo-queio de resposta com anticorpos anti-TSLP- Monócitos recém isolados fo-ram ressuspendidos em 1 χ 106 células por ml do tampão de ensaio (RPMI1640, FCS a 10%, 10 U/ml de penicilina /10 μg/ml de estreptomicina). 100 μΙde células foram acrescentados a cada cavidade de uma placa de fundoplano de 96 cavidades para ser fornecida uma concentração de 100.000 cé-lulas por cavidade. 80 μΙ de tampão de ensaio foram acrescentados às cavi-dades que foram utilizadas para a curva de resposta à dose de TSLP, e 60μl foram acrescentados às cavidades nas quais estavam os anticorpos anti-TSLP a serem testados. Para os testes de anticorpos anti-TSLP, 20 μΙ desolução de estoque de 10x cada anticorpo anti-TSLP foram acrescentadosàs células e incubados a 37 °C, em CO2 a 5%, por 20 minutos. rhTSLP foiacrescentada ém seguida, a 0,5 ng/ml, a cada cavidade (20 μΙ de 10x solu-ção estoque por cavidade) contendo anticorpo anti-TSLP. Uma curva deresposta à dose de TSLP foi incluída em cada placa. As placas foram incu-badas por 24 horas a 37 °C, em CO2 a 5%, após o qual, os sobrenadantesforam recolhidos e armazenados a-20 0C para análise futura.

ELISA de sobrenadantes de monócitos para medir TARC - Me-dições de TARC produzido em sobrenadantes de cultura foram conduzidas,empregando o kit TARC duoset ELISA (R+D Systems), de acordo com asinstruções do fabricante. Resumidamente, sobrenadantes de monócitos fo-ram diluídos para 1:2 em tampão de ensaio (RPMI 1640, FCS a 10% FCS,U/ml de penicilina /10 μg/ml de estreptomicina) e acrescentados, em tri-plicata, à metade da área de placas de 96 cavidades, previamente revesti-das com anticorpo de captura TARC. As placas foram incubadas por 2 horasem RT e, em seguida, lavadas novamente. 50 μΙ de mAb biotinilado de de-tecção foram acrescentados, em seguida, a cada cavidade e incubados pormais 2 horas em RT. As placas foram lavadas e peroxidase de rábano foiacrescentada, em 50 μΙ por cavidade, e incubadas por 20 minutos em RT noescuro. Uma lavagem final foi conduzida, e 100 μΙ de substrato TMB foramacrescentados por cavidade e as placas foram incubadas em RT no escuro.O desenvolvimento de cor foi interrompido após 20 minutos de incubação,acrescentando-se 50 μΙ de hidróxido de sódio a 1M. As placas foram lidasimediatamente em um leitor de microplacas Spectramax, definido em 450nm(Molecular Devices). Os dados foram analisados com o software SoftmaxProe o percentual de inibição de resposta máxima de absorvência por anticor-pos anti-TSLP foi calculado em uma planilha de dados do programa Excel.

Neutralização de TSLP humana natural em ensaio de gene de receptor

TSLP humana natural foi gerada pelo tratamento de células fi-broblásticas humanas primárias (CIonetics) com um coquetel de citocinas,contendo IL-1 β (1 ng/ml), TNF-a (1 ng/ml) e IL-13 (10 ng/ml), por 24 horas a37°C em RPMI livre de fenol vermelho, contendo FBS a 10%. Foi demons-trado que o sobrenadante da cultura de células, contendo TSLP natural in-duzida, era ativo no RGA descrito acima.

Uma diluição de 1 em 10 da TSLP natural, contendo TSLP, cor-respondeu a aproximadamente o mesmo nível de atividade no RGA de 0,5ng/ml de rhTSLP e, por conseguinte, foi utilizada como a diluição final, quan-do foram efetuados testes de possíveis anticorpos.

Ensaio BioVeris de inibicão de ligação de TSLP / receptor de TSLP

Para o ensaio de inibição de ligação a TSLP, TSLP humana re-combinante (R&D Systems) foi acoplada diretamente (acoplamentoNHS/EDC) a partículas magnéticas M-270 Dynal de ácido carboxílico. 50 μΙde anticorpos Fab por cavidade (estoque a 10 μΜ, etapas de diluição 1:5)foram incubados por 2 h com 25 μΙ de partículas revestidas com TSLP emplacas de 96 cavidades (Nunc). 50 μΙ de TSLP-receptor a 100 pM/fusão deFc e anticorpo anti-Fc humano, diluído em 1:1000 e marcado com BV-tag™,de acordo com as instruções do fornecedor (BioVeris, Europe, Witney, Ox-forfshire, Reino Unido), foram acrescentados a cada cavidade e incubadospor 1 h. (Concentração final de Fab: 32 nM - 4 μΜ, conc. final de TSLP: 40pM). A detecção foi conduzida pelo M-384 SERIES® Workstation da BioVe-ris (BioVeris Europe, Witney, Oxforfshire, Reino Unido). MOR04493,MOR04494, MOR04496, MOR04497, MOR04609 e MOR04832 mostraraminibir a ligação ao receptor de TSLP neste ensaio.

Determinação de afinidades nanomolares. utilizando ressonância plasmôni-ca de superfície (Biacore)

A análise cinética por SPR foi realizada em um chip SA (Biacore,Suécia) que foi revestido com TSLP i biotinilada humana recombinante comdensidade de -400 RU. Uma quantidade correspondente de albumina séricahumana (HSA) biotinilada foi imobilizada na célula do fluxo de referência.PBS (NaCI a 136 mM, KCI a 2,7 mM, KCI1 Na2HP04 a 10 mM, KH2P04 a1,76 mM, pH 7,4) foi utilizado como o tampão do teste. Os Fabs foram apli-cados em séries de concentração de 16 - 500 nM em uma vazão de 20μl/min. A fase de associação foi definida em 60 s e a fase de dissociação em120 s. As afinidades dos anticorpos Fab parentais 4493, 4494, 4496, 4497,4832 e 4609 para TSLP, determinada por aquele método, variam, em resu-mo, na faixa de 8 - 1400 nM.

Exemplo 3: Maturação de afinidade de Fabs anti-TSLP selecionados, portroca paralela de cassetes de LCDR3 e HCDR2

Geração de bibliotecas de Fab para maturação de afinidade

A fi de aumentar a afinidade e atividade inibidora dos anticorposidentificados anti-TSLP antibodies, 6 clones de Fab, MOR04493,MOR04494, MOR04496, MOR04497, MOR04609 e MOR04832, foram sub-metidos à maturação de afinidade. Para essa finalidade, regiões CDR foramotimizadas por mutagênese de cassete, empregando mutagênese direciona-do a trinucleotídeo12,13.

O parágrafo seguinte descreve, resumidamente, o protocolo uti-lizado para clonagem de bibliotecas de maturação e otimização de Fabs.Fragmentos Fab, do vetor de expressão pMORPH®X9_Fab_FH, foram clo-nados no vetor fágemídeo pMORPH®25 (US 6 753 136). Foram aplicadasem paralelo duas estratégias diferentes para otimizar a afinidade e a eficáciados Fabs parentais.

Seis bibliotecas do anticorpo Fab em fago foram geradas, nasquais a LCDR3 de seis clones parentais foram substituídas por um repertóriode seqüências individuais de cadeia leve de CDR3. Em paralelo, a regiãoHCDR2 dé cada clone parental foi substituída por um repertório de seqüên-cias individuais de cadeia pesada de CDR2, Foram geradas bibliotecas dematuração de afinidade por procedimentos convencionais de clonagem, etransformação dos clones diversificados em células T0P10F1 de E. coli ele-trocompententes (Invitrogen). Fagos apresentando Fab foram preparados,conforme descrito no Exemplo 1A. Foram construídos quatro grupos de ma-turação e mantidos separados durante o processo de seleção subseqüente:

grupo 1: Bibliotecas de LCDR3 de MOR04493 e MOR04832

grupo 2: Bibliotecas de HCR2 de MOR04493 e MOR04832

grupo 3: Bibliotecas de LCDR3 de MOR04494; MOR04496;MQR04497; MQR04609grupo 4: Bibliotecas de HCDR2 de MOR04494; MÜR04496;MOR04497; MOR04609Estratégias de dannina de maturação

Pannings utilizando quatro grupos de anticorpos foram executa-dos em TSLP humana recombinante biotinilada (R&D Systems) in solutionfor three rounds, respectively as described in Example 1B, solution panningagainst biotinylated human TSLP. O rigor da seleção foi aumentado pela re-dução de antígeno biotinilado da rodada de panning, prolongando-se as eta-pas de lavagem é pela adição de antígeno não biotinilado para seleção deocorrência {off-ràte).

Eletroquimioluminescência (BioVeris)1 baseada em análise deligação para detecção de Fab ligado a TSLP em Iisados de bactérias

A ligação de anticorpos Fab, otimizados em Iisados de E. coli(extratos BEL), a TSLP foi analisada no Analisador M-SERIES® 384 da Bio-veris (BioVeris Europe, Witney1 Oxforfshire, Reino Unido). Extratos BEL fo-ram diluídos em tampão de ensaio (PBS/Tween 20 a 0,05%/BSA a 0,5%)para uso na seleção pelo BioVeris. TSLP biotinilada (R&D Systems) foi aco-plada a partículas paramagnéticas revestidas com estrapavidina, Anti-(Fab)'2humano (Dianova) foi marcado com rutênio, empregando o BV-tag™ (BioVe-ris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido). Este anticorpo secundário foiacrescentado às partículas acopladas com TSLP antes de ser efetuada amedição no Analisador M-SERIES® 384 da BioVeris. Após análise de se-qüências de acertos, obtidas da seleção pelo BioVeris screening, 20 clonesúnicos de Fab foram identificados: MOR05008; MOR05009; MOR05010;MOR05011; MQR05012; MOR05013; MOR05014; MOR05015; MOR05016;MOR05017; MOR05018; MOR05019; MOR05020; MOR05021; MOR05022;MOR05023; MOR05024; MOR05025; MOR05026; MOR05027.

Conversão de IgG e transfecção cruzada de duas cadeias variá-veis independentemente otimizadas foram efetuadas para melhorar aindamais as afinidades dos anticorpos

Todos os 20 anticorpos Fab otimizados foram subclonados emformato de IgGI. A afinidade de todas as 20 IgGI de MOR05008;MOR05009; MOR05010; MOR050T1; MOR05012; MOR05013; MOR05014;MOR05015; MOR05016; MOR05017; MOR05018; MOR05019; MOR05020;MOR05021; MOR05022; MOR05023; MOR05024; MOR05025; MOR05026;MOR05027 foi medida em titulação de solução em equilíbrio do sobrenadan-te da cultura de tecido.

Para melhorar mais a afinidade, as H-CDR2 e L-CDR3, otimiza-das independentemente, de IgGIs maduras, derivadas do mesmo clone pa-rental, foram combinadas porque havia uma alta probabilidade de que essacombinação levaria a um ganho posterior em afinidade 14"16. A cadeia pesa-dâ e a leve da IgGI estavam em vetores separados e, por conseguinte, portransfecção cruzada, foi possível combinar as duas cadeias diferentes otimi-zadas que foram, em seguida, co-expressas em uma célula e montadas paraformar anticorpos IgG. Este método foi aplicado para agentes de ligações,derivados do clone parental MOR04494 e MOR04497, em que foram identi-ficadas, em paralelo, as cadeias otimizadas das bibliotecas de H-CDR2 e L-CDR3. Para MOR04494, todas as seis cadeias pesadas otimizadas deMOR05010 - MOR05015 foram combinadas, uma a uma, com as três ca-deias leves otimizadas de MOR05016 - MOR05018, resultando em 18 no-vos anticorpos. Para MOR04497, a H-CDR2 otimizada de MOR5019 foicombinada com as três cadeias leves otimizadas de MOR05020 -MOR05022, resultando em 3 novos anticorpos.

Determinação de afinidades picomolares. empregando Titulação de Soluçãoem Equilíbrio (SET) .

Para determinação de KD, foram utilizadas frações de monôme-ros (com, pelo menos, 90% de conteúdo do monômero, analisado por SECanalítico; Superdex75, Amersham Pharmacia) de Fab. Ademais, foi possíveldeterminar as afinidades de IgGI, uma vez supõem-se que o antígeno TSLPé um monômero em solução. A determinação de afinidade em soluçãopor eletroquimioluminescência (ECL) e a avaliação dos dados foram basi-camente efetuadas, conforme descrito por Haenel et ai, 2005. Uma quanti-dade constante de Fab ou IgGI foi equilibrada com concentrações diferentes(séries de 3n diluições) de TLSP humana recombinante (R&D Systems) emsolução. TSLP humana biotinilada acoplada a partículas paramagnéticas (M-280 Streptavidin1 Dynal), e BV-tag™ (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire,Reino Unido) anti-(Fab)'2 humano marcado (Dianova) foram acrescentados ea mistura incubada por 30 min. Subseqüentemente, a concentração de Fabnão ligado foi quantificada por detecção de ECL com o analisador M-SERIES® 384 (BioVeris Europe).

A determinação de afinidade com TSLP de cynomolgus (expres-são mamífera e purificação em NVS) em solução foi conduzida essencial-mente conforme descrito acima, substituindo a TSLP humana pela TSLP decynomolgus. Para detecção de Fab livre, foi utilizada TSLP humana biotini-lada acoplada a partículas paramagnéticas. As afinidades foram calculadasde acordo com Haenel et ai (2005)17. Usando as condições do ensaio des-crito acima, foram determinadas afinidades (monoméricas) para IgGs anti-TSLP otimizadas para afinidade em solução. As afinidades para TSLP hu-mana e de cynomolgus estão resumidas na Tabela 5.

Tabela 5: Afinidades de IaG1 otimizada.

<table>table see original document page 88</column></row><table>Dessa forma, como uma outra característica da presente inven-ção, é apresentado o uso de uma região de ligação a hTSLP isolada de um

<table>table see original document page 89</column></row><table>anticorpo ou fragmento funcional deste com KD inferior a 100 pM, adequa-damente inferior a 50pM, de preferência inferior a 30pM, no tratamento deuma doença associada à presença de hTSLP, alvo de receptor celular, comoasma ou dermatite atópica.

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MOR04493 VH, SEQID NO: 67:

QVQCVQSGAEyKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAlSWyRQAPGQOLEWMGGIIPDFGW ANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGMFYSILFDYWGQGTL VTVSS

MOR04493 VL, SEQID NO: 68:diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdiynylnwyqqkpgkapklliygass

MOR04494 VH, SEQID NO: 69:QVQLVESGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYMSWVRQAPGKGLEWVSNISYDSSDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQQYFDHIDIWGQGTL VTVSS

MOR04494 VL, SEQID NO: 70:DIELTQPPSVSVAPGOTARISCGGDSLGGKYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISTQAEDEAYYCQSYTNALSTVFGGGTKLTVLGQ

MOR04496 VH, SEQID NO: 71:QVQLVESGGLVQPGGSLRSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWVSSISYSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYYCARMEYWYHLLYMDYWGQGTL VTVSS

MOR04496 VL, SEQID NO: 72:D1VLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSIGDNYLAWYQQKPGQAPRLL1YDANNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDF ATY YrCQQYDDHPLTFGQGTKVEIKRT

MOR04497 VH, SEQID NO: 73:QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHALSWVRQAPGKGLEWVSGIYWGQGTLVTVSS

MOR04497 VL, SEQ ID NO: 74:dieltqppsvsvapgqtariscsgdnlgskyvhwyqqkpgqapvlviyadnnrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqaedeadyycqsydhmlqvfgggtkltvlgqMOR04609 VH, SEQID NO: 75:

Yyrskwlndyavsvksritinpdtsknqfslqlnsvtpedtavyycardggwyidvwgqgtlvtvss

MOR04609 VL, SEQID NO: 76:

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLGSYYANWYQQKPGQAP VLVIYEDKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSFDSYHSDYVFGGGTKLTVLGQ

MOR04832 VH, SEQID NO: 77:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGNIYPIFGYANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYGQYGQHFSH

GGMD VWGQGTL VTVSS

MOR04832 VL, SEQID NO: 78:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISISLTWYQQKPGKAPKLLIYGAFSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYGTSATFGQGTK VEIKRT

MORO50O8 VH, SEQID NO: 79:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGII

PEFGFTKYAQKFQGRNnrrrADESTSTAlYMELSSLRSEOT

WGQGTlArrVSS

MOR05008 VL, SEQ ID NO: «8:

DIQMTpSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIYNYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA VY YCQQQNDYPLTFGQGTKVEIKRT

MOR0S009 VH, SEQID NO: 80:

WGQGTLVTVSS

MOR05009 VL, SEQ ID NO: 68:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIYNYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQQNDYPLTFGQGTKVEIKRT

MOROSO 10 VH, SEQID NO: 81:QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSGLFFDGETYY AGSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQQYFDHIDIWG

QGTLVTVSS

MOROSOIO VL, SEQID NO: 70:

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCGGDSLGGKYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYTNALSTVFGGGTKLTVLGQ

MOROSOtl VH, SEQID NO: 82:

MOR05012 VH, SEQID NO: 83:

QGTLVTVSS

MOROSO 12 VL, SEQID NO: 70:

QGTLVTVSS

MOR05013 VL, SEQID NO: 70:

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCGGDSLGGKYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGIPERFSGSNSGWATLTISGTQAEDEADYYCQSYTNALSTVFGGGTKLTVLGQ

MOR05014 VH, SEQID NO: 85:mgr05014 vl, seqid no: 70:

moroso 15 vh, seqid no: 86:

moroso! 5 vl, seqid no: 70:

mor05016 vh, seqid no: 69:

gqgtlvtvss

morosolâ vl, seqid no: 87:

mor05017 vh, seqid no: 69:

gqgtlvtvss

morosoi7 vl, seq id no: 88:

dieltqppsvsvapgqtarjscggdslggkyvywyqqkpgqapvlviygdsk

rpsgiperfsgsnsgntatltisgtqaedead yycqsydlkslnvvfgggtiatvlgq

morosoj 8 vh, seqid no: 69:GQGTL VTVSS

MOR05018 VL, SEQID NO: 89:

DIELTQPPSVSVAPGQTAR1SCGGDSLGGKYVYWYQQKPGQAP VL VIYGDSKRPSGiPERFSGSNSGKrATLTISGTQAEDEADYYCQSYDLGSLNLVFGGGTKLTVLGQ

MOR05019 VH, SEQID NO: 90:

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKHALSWVRQAPGKGLEWVSVÍSroGVKFYADSVKGRF^SRDNSKKn.YLQMNSLRAEDTAVYYCARYYGYSYM^

GQGTL VTVSS

MOR05019 VL, SEQID NO: 74:

DIELTQPPSVSVAPGQTAR1SCSGDNLGSKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYDHMLQVFGGGTKLTVLGQ

MQR05020 VH, SEQID NO: 73:

YWGQGTL VTVSS

MQR05020 VL, SEQID NO: 91:

MOR05021 VH, SEQID NO: 73:

YWGQGTLVTVSS

MOR05021 VL, SEQID NO: 92:

DIELTQPPSVSVAPGQTARJSCSGDNLGSKYVHWYQQKPGQAPVLV1YADNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCSSYDLDGVRVFGGGTÍCLTVLGQ

MQR05022 VH, SEQID NO: 73:YWGQGTL VTVSS

MOR05022 VL, SEQID NO: 93:

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLGSKyVHWYQQKPGQAPVL VIYADNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCSSYTTSGIRVFGGGTKLTVLGQ

MOROSOZ3 VH, SEQID NO: 77:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGNIYPIFGY ANYAQKFQGRVT1TADESTSTAYMELSSLRSEDTA VYYCAR YGQ YGQHFSH

GGMDVWGQGTL VTVSS

MOR05023 VL, SEQID NO: 94:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRÀSQDISISLTWYQQKPGKAPKLLIYGAFSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFYFHSPTFGQGTICVEIKRT

MOR05024 VH, SEQID NO: 77:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGNIYPIFGY ANY AQK.FQGRVT1TADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYGQYGQHFSH

GGMDVWGQGTLVTVSS

MOR05024 VL, SEQID NO: 95:

DIQMTQSPSSLSASVGDR\nnTeRASQDISISLTlVYQQKPGKAPKLLIYGAFSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFWFEPVTFGQGTKVEIKRT

MOR0502S VH, SEQID NO: 77:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGNIYPIFGYANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTA VYYCAR YGQYGQHFSH

GGMDVWGQGTLVTVSS

MOR05025 VL, SEQ ID NO: 96:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISISLTWYQQKPGKAPKLLIYGAFSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFWFHPVTFGQGTKVEIKRT

MQR05026 VH, SEQID NO: 77:QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSGKASGGTFSSYA1SWVRQAPGQGLEWMGNIYPlFGY ANYAQKFQGR.VT1TADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYGQYGQHFSH

GGMDVWGQGTLVTVSS

MOR05026 VL, SEQID NO: 97:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISISLTWYQQKPGKAPKLLIYGAFSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFWSEPVTFGQGTICVEIKRT

MOR0S027 VH, SEQI» NO: 77:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGNI

MOR05154 VH, SEQID NO: 81:

QGTLVTVSS

MOROS154 VL, SEQID NO: 87:

MOR0S155 VH, SEQID NO: 81:

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSGI^FDGETYYAGSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQQYFDHIDIWG

QGTLVTVSS

MOR05I55 VL, SEQID NO: 88:

DIELTQPPSVSV APGQT ARISCGGDSLGGKYVYWYQQKPGQ APVL VIYGDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYDLKSLNVVfGGGTKLTVLGQ

MOROS156 VH, SEQID NO: 81:fdgetyyagsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarqqyfdhidiwgqgtl vtvss

morq5156 vl, seqld no: 89:

moros157 vh, seqid no; 82:

moros1s8 vh5 seqid no: 82:

moros158 vl, seqid no: 88:

dieltqppsvsvapgqtariscggdslggkyvywyqqkpgqapvlviygdskrpsgiperpsgsnsgntatltisgtqaedeadyycqsydlkslnwfgggtkltvlgq

moros1s9 vh, seqid no: 82:

qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssyymswvrqapgkglewvsgif -

qgtlvtvss

morosi59 vl, seqid no: 89:

dieltqppsvsvapgqtariscggdslggkyvywyqqkpgqapvlviygdsk

rpsgiperfsgsnsgntatlt1sgtqaedeadyycqsydlgslnlvfgggtkltvlgq

mor05160 vh, seqid no: 83:qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssyymswvrqapgkolewvsg1f

ftgetyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarqqyfdhídiwgqgtl vtvss

morosiéo vl, seq id no: 87:

dieltqppsvsvapgqtariscggdslggkyvywyqqkpgqapvlviygdskrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqaedeadyycqsydlqslnivfgggtkltvlgq

moros16i vh, seqid no: 83:

qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssyymswvrqapgkglewvsgifftgetyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarqqyfdhidiwg

qgtlvtvss

mor05161 vl, seqid no: 88:

dieltqppsvsvapgqtariscggdslggkyvywyqqkpgqapvlviygdskrpsgiperfsgsnsgotatltisgtqaedeadyycqsydlkslnvvfgggtxltvlgq

moros162 vh, seqid no: 83:

qgtlvtvss

mor05162 vl, seqid no: 89:

dieltqppsvsvapgqtariscggdslggkyvywyqqkpgqapvlviygdskrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqaedeadyycqsydlgslnlvfgggtkltvlgq

moros163 vh, seqid no: 84:

qgtlvtvss

moros163 vl, seqid no: 87:

mqr05164 vh, seqid no: 84:QGTLVTVSS

MORQ5164 VL, SEQ ID NO: 88:

MORQ5165 VH, SEQID NO: 84:

MORQ5166 VH, SEQ ID NO: 85:

QGTL VTVSS

MOROSKft VL, SEQID NO: 87;

MOROSl 67 VH, SEQID NO: 85:

QvQLvEsGGGLvQpGGsLRLscAAsGFTFssYyMswvRQAPGKGLEwvsGIFFDGTTYV ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQQYFDHIDIWG

QGTLVTVSS

MOROS167 VL, SEQID NO: 88:

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCGGDSLGGKYVYWYQQKPGQAPVLVÍYGDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYDLKSLNVVFGGGTKLTVLGQ

MOR05J68 VH, SEQ ID NO: 85:QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSGIFFDGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQQYFDHIDIWG

QGTLVTVSS

MOROS168 VL, SEQID NO: 89:

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCGGDSLGGK YV YWYQQKPGQAP VL VIYGDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYDLGSLNLVFGGGTKLTVLGQ

MOROS169 VH, SEQID NO: 86:

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSGTFFDGSTYYADSVKGRFTrSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQQYFDHIDlW

GQGTL VT VSS

MOROSI69 VL, SEQID NO: 87:

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCGGDSLGGKYVYWYQQKPGQ AP VL VIYGDSKRPSGIPERFSGSNSGNTA^SGTQAEDEADYYCQSYDLQSLNIVFGGGTKLTVLGQ

MOR05170 VH, SEQID NO: 86:

GQGTL VTVSS

MOR05170 VL, SEQID NO: 88:

MOR05I71 VH, SEQID NO: 86:

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSGTFFDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQQ YFDHIDIW

GQGTL VTVSS

MOROS171 VL, SEQID NO: 89:

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCGGDSLGGK YVYWYQQKPGQAPVLViYGDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYDLGSLNLVFGGGTKLTVLGQ

MQR05172 VH, SEQID NO: 90:gqgtl vtvss

moros172 vl, seq id no: 91:

d1eltqppsvsvapgqtariscsgdnlgskyvhwyqqkpgqapvlviyadnnrpsgipei^sgsnsghrratltisgtqaedeadyycssydsnsirvffxígtkltvlgq

MOROS173 VH, SEQID NO: 90:

GQGTL VTVSS

MOROS173 VL, SEQID NO: 92:

dieltqppsvsvapgqtafjscsgdnlgskyvhwyqqkpgqapvlviyadnnrpsgiperfsgsnsgntatlnsgtqaedeadyycssydldgvrvfgggtkltvlgq

MOROS174 VH, SEQID NO: 90:

qvql vesgggl vqpggslrlscaasgftfsnhalswvrqapgkglewvsvisfdgvkfyadsvkgrfnsrdnskntlylqmnslraedtavyycaryygysymdyw

GQGTL VTVSS

MOROS174 VL, SEQ ID NO: 93:

dieltqppsvsvapgqtariscsgdnlgskyvhwyqqkpgqapvlviyadnnrpsgiperfsgsnsgntatlnsgtqaedeadyycssytrsgírvfgggtkltvlgq

CADEIA LEVE LAMBDA MOR 5164, 5167, 5170

A seqüência de aminoácidos da LC lambda, apresentada na SEQ ID NO: 99,

é codificada pela seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 100.

VEKTVAPTECS (SEQID NO: 99:)

atggcctgggctctgctgctcctcaccctcctcactcagggcacaggatcc

tgggctgatatcgaactgacccagccgccttcagtgagcgttgcaccaggtcag

accgcgcgtatctcgtgtggcggcgattctcttggtggtaagtatgtttattggtaccagcagaaacccgggcaggcgccagttcttgtgatttatggtgattctaagcgtccctcaggcatcccggaacgctttagcggatccaacagcggcaacaccgcgaccctgaccattagcggcactcaggcggaagacgaagcggattattattgccagtcttatgatctiaagtctcttaatgttgtgtttggcggcggcacgaagttaaccgtcc

taggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccch:gctcctctgagga

gcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccggga

gccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca (SEQ

ID NO: 100:)

CADEIA LEVE LAMBDA (OTIMIZADA) MOR 5164, 5167, 5170A seqüência de aminoácidos da LC lambda, apresentada na SEQ ID NO:

101, é codificada pela seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 102.

TVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: IOl:)

atgagtgtgctcactcaggtcctggcgttgctgctgctgtggcttacaggtacgcgttgcgacatcgagctgacccagccccccagcgtgtctgtggcccctggccagaccgcccggatcagctgtggcggcgacagcctgggcggcaagtacgtgtact

ggtatcagcagaagcccggccaggcccgcgtgctggtgatctacggcgacagca

agcgggccagcggcatccccgagcggttcagcggcagcaacagcggcaacaccg

ccaccctgaccatcagcggcacccaggccgaggacgaggccgagtactactgcc

agagctacgacctgaagagcctgaacgtggtgtttggcggcggaacaaagctta

ccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctct

gaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacc

cgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcggga

gtggagacaaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcag

ctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgcca

ggtcacgcatgaagggagcaccgtggaaaagacagtggcccctacagaatgttc

ATAG (SEQ ID NO: 102)

CADEIAPESADADEIgGI MOR 5164:

A seqüência de aminoácidos da HC lambda, mostrada na SEQ ID NO: 103,é codificada pela seqpência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 104

mkhlwfflll va apr w vlsq vqlvesgggl vqpggslrlsc aasgftfss y

HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 103)atgaaacacctgtggtrcttcctcctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcccaggtgcaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcc

tgcgtctgagctgcgcggcctccggatttaccttttcttcttattata^

gtgcgccaagcccgtgggaagggtctcgagtgggtga gcggtattttttttgatg

gtgtattattgcgcgcgtcagcagtattttgatcatattgatatttggggccaag

cagcggcgtgcacaccitcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcaccgagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaa

atcitgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcgtggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctccc

ccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgacx:aagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgcggtggagtg

acacgcagaagagcctctccctgtgtccgggtaaatga (SEQid no: 104)

CADEIA PESADA DE IgGI MOR 5164 (OTIMIZADA):A seqüência de aminoácidos da HC lambda, apresentada na SEQ ID NO:105, é codificada pela seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 106

mawvwti.pflmaaaqsvqaqvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssy

healhnhytqkslslspgk (SEQ id no: 105)

atggcttgggtgtggaccttgccattcctgatggcagctgcccaaagtgtc

cgacggcgagacctactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgtccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggogcacagcggccctgggctg

cctggtcaaggagtacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgc

cctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctac

tccctcagcagcgtcgtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccacacctaca

tctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagc

ccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagtcct

ggggggagcgtcagtcttcctcttcgcccgaaaaccgaaggacagcctcatgatc

tcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgãagaccct

gaggtcaagttcaactggtacgtggacggggtggaggtgcataatgccaagaca

aagcggcgggaggaggagtacaacagcacgtacggtgtggtcagggtgctcagc

CADEIA PESADA DE IgGI MOR 5167:

A seqüência de aminoácidos da HC lambda, apresentada na SEQ ID NO:107, é codificada pela seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 108

MKHLAi^FLLLVAAPRWVLSQ V^YMS WWQAPGKGLE\WSGIFFDGTTYYADS VKGRF

DTAVYYCARQQYFDfflDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL

vkdyfpepvtvsvwsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvn

hkpsntkvdkrvepkscdktíitcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtc

vwdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwln

gkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgf

ypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysícltvdksrwqqgnvfscsvm

HEALHHHYTQKSLSLSPGK (SEQ ro NO: 107)

atgaaacacctgtggttcttcctcctgctggtggcagctcccagatgggtcCTGTCCCAGGTGCAATTGGTGGAAA8CGGCGGCGGCGTGGTGCAACCGGGCGGCagcctgcgtctgagctgcgcggcctccggatttaccitttcttctta^^TTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGGTAl 1 liiuiGATGGTACT ACTTATT ATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTnACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCXSCGCGTCAGCAGTATrrrGATCATATrGATATTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCAGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCITCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCtGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT

gcaacgtgaatcacaagcccagcaacacçaaggtggacaagagagttgagccc

AAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGCADEIA PESADA DE IgGI MOR 5167 (OTIMIZADA):A seqüência de aminoácidos da HC lambda, apresentada na SEQ ID NO:109, é codificada pela seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 110healhnhytqkslslspgk (seqid no: 109)

atggcttgggtgtggaccttgccattcctgatgocagctgcccaaagtgtccaggcccaggtgcagctggtggaatctggcggcggactggtgcaggctggcggcagcctgagactgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagc AGCTAeTAGATGÁckn-chxítgcggcagck^ccctggcaagggcctggaatgggtgtccggcatcttcttcgacgggaccacctactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggcggaggacaccgccgtgtactactgcgccaggcagcagtacttcgaccacatcgacatctggggccagggcaccctggtcagcgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtgttccccctggca€€ctcct€caagagcacctctgggggcacagcggccctgggctg

cctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgc

cctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctac

tccctcagcagcgtcgtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctaca

tctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagc

ccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagtcct

ggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatc

tcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccct

gaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagaca

aagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcacc

gtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaac

aaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccc

cgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaac

gaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtgg

agtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgc

tggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcag

gtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac

cacjacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga (seq id no: 110)

CADEIA PESADA DE IgGI MOR 5170:A seqüência de aminoácidos da HC Iambda1 apresentada na SEQ ID NO:111, é codificada pela seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 112

mkhlwfflllvaaprwvlsqvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssy

mhealhnhytqkslslspgk (seqid no: 111)

TTTTTT

ggccgtgtawattgcgcgcgtcacxagtattitgatcatattgatatttggggc

NO: 112)

CADEIA PESADA DE IgGI MOR 5170 (OTIMIZADA):A seqüência de aminoácidos da HC Iambda1 apresentada na SEQ ID NO:113, é codificada pela seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 114

mawvwtlpflmaaaqsvqaqvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssy

mhealhnhytqkslslspgk (seq ib no: 113)atggcttgggtgtggaccttgccattcctgatggcagctgcccaaagtgtc

caggcccaggtgc AGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTX3CAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGGTGCGCCGCCAGGGGCTTCACCTTCAGCAGCTACTACATGAGCTGGGTGCGGCAGGCCeCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGGCACCTTCTTCGACGGCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCC

gggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgagg

ACACCGCGGTGTACTACTGCGCCAGGCAGCAGTACTTCGACCACATCGACATGTG

GGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC

TTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCT

GCCTGGTCAAGGACTACTrCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGGG

ccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtccracagtcctcaggactcta

ctccctcagcagcgtcgtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctac

ATCTGC AACGTGAATCACAAGGCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTrGAG

CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCC

TGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT

CTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCe

TGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAÇ

aaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagggtcctcac

CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCGAA

CAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC

CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAA

ccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtg

g agtggg a gagcaa tgggc agccggagaac a actacaagaccacgcctcccgt

GCTGGACTCCGACGGCrCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC

AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCnX^CGTGATGCATGAGGCTCrGCAÇ^^^^í

AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA (SEQID NOr

114)

Claims (41)

1. Anticorpo humano ou humanizado, ou fragmento funcionaldeste, compreendendo uma região de ligação a antígeno específica paraTSLP, em que o anticorpo ou fragmento funcional deste liga-se a TSLP.

2. O anticorpo ou fragmento funcional deste acordo com a rei-vindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento funcional deste liga-se a TS-LP com KD de 1 χ 10'9 Μ ou menos.

3. Região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste, compreendendo uma região H-CDR1 retratadana seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 e variações conservadorasdesta.

4. Região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste, compreendendo uma região H-CDR2 retratadaem uma seqüência de aminoácidos, selecinada do grupo constituído da SEQID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20, e variações conservadoras destas.

5. Região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste, compreendendo uma região H-CDR3 retratadana seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 e variações conservadorasdesta.

6. Região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste, compreendendo uma região H-CDR1 retratadana seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, uma região H-CDR2 retra-tada em uma seqüência de aminoácidos, selecionada do grupo constituídopela SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 eSEQ ID NO: 20, e uma região H-CDR3 retratada na seqüência de aminoáci-dos SEQ ID NO: 28 e variações conservadoras desta.

7. A região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste, compreendendo uma região L-CDR1 retratada naseqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38 e variações conservadorasdesta.

8. A região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste, compreendendo uma região L-CDR2 retratada naseqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e variações conservadorasdesta.

9. A região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste, compreendendo uma região L-CDR3 retratada naseqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 e variações conservadorasdesta.

10. A região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste, compreendendo uma região L-CDR1 retratada naseqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, e uma região L-CDR2 retra-tada na seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 47, e uma região L-CDR3retratada na seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 60 e variações conser-vadoras desta.

11. Região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste, compreendendo uma região H-CDR1 retratadana seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, uma região H-CDR2 retra-tada em uma seqüência de aminoácidos, selecionada do grupo constituídopela SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 eSEQ ID NO: 20, e uma região H-CDR3 retratada na seqüência de aminoáci-dos SEQ ID NO: 28, e uma região L-CDR1 retratada na seqüência de ami-noácidos SEQ ID NO: 38, e uma região L-CDR2 retratada na seqüência deaminoácidos SEQ ID NO: 47, e uma região L-CDR3 retratada na seqüênciade aminoácidos SEQ ID NO: 60 e variações conservadoras desta.

12. A região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste de acordo com a reivindicação 11, em que a regi-ão H-CDR2 é a SEQ ID NO: 15 e variações conservadoras desta.

13. A região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste de acordo com a reivindicação 11, em que a regi-ão H-CDR2 é a SEQ ID NO: 17 e variações conservadoras desta.

14. A região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste de acordo com a reivindicação 11, em que a regi-ão H-CDR2 é a SEQ ID NO: 18 e variações conservadoras desta.

15. A região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste de acordo com a reivindicação 11, em que a regi-ão H-CDR2 é a SEQ ID NO: 19 e variações conservadoras desta.

16. A região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste de acordo com a reivindicação 11, em que a regi-ão H-CDR2 é a SEQ ID NO: 20 e variações conservadoras desta.

17. A região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste, compreendendo uma seqüência com, pelo me-nos, 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento de identidade de seqüência nas regiõesCDR com as regiões CDR descritas em qualquer uma das reivindicações 1-16.

18. Anticorpo anti-TSLP humano ou humanizado isolado, com-preendendo uma região de ligação a antígeno isolada de um anticorpo oufragmento funcional deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17.

19. O anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 18, o qualé uma IgG1, lgG2 ou uma lgG4.

20. O anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 18 ou 19,compreendendo uma região variável de cadeia pesada, selecionada entre aSEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 e SEQ ID NO: 86 e variações conservado-ras desta.

21. O anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 18-20, compreendendo uma região variável de cadeia leve com aSEQ ID NO: 88.

22. O anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 18-21, em que a região variável da cadeia pesada é a SEQ ID NO: 84 e variações conservadoras desta.

23. O anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 18-21, em que a região variável da cadeia pesada é a SEQ ID NO: 85 e variações conservadoras desta.

24. O anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 18-21, em que a região variável da cadeia pesada é a SEQ ID NO:- 86 e variações conservadoras desta.

25. O anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 18-21, o qual é uma IgGI com seqüência Iambda de cadeia leve,selecionado entre a SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 101, e uma seqüênciade cadeia pesada, selecionada entre SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105,SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 113 evariações conservadoras desta.

26. Polinucleotídeo isolado ou recombinante que codifica umpolipeptídeo compreendendo uma região de ligação a antígeno de um anti-corpo ou fragmento funcional deste, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1-17, ou um anticorpo de acordo com qualquer uma das reividi-cações 18-25.

27. O polinucleotídeo da reivindicação 26, em que o anticorpo éum anticorpo huma Ns

28. O polinucleotídeo da reivindicação 26 ou reivindicação 27,em que o polinucleotídeo codifica um anticorpo compreendendo seqüênciasde H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3 e seqüências de L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3, selecionadas entre:(a) H-CDR SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 28;L-CDR SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 60.(b) H-CDR SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 28;L-CDR SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 60.(c) H-CDR SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28;L-CDR SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 60.(d) H-CDR SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28;L-CDR SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 60.(e) H-CDR SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28; eL-CDR SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 60.

29. O polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 26-28,em que o anticorpo compreende (i) uma seqüência de região madura variá-vel de cadeia leve e (ii) uma seqüência de região madura variável de cadeiapesada, selecionadas entre:(a) (i) SEQ ID NO: 101, (ii) SEQ ID NO: 105;(b) (i) SEQ ID NO: 101, (ii) SEQ ID NO: 107; e(c) (i) SEQ ID NO: 101, (ii) SEQ ID NO: 109;cada uma das quais, pelo menos, 80% idêntica à região madura das referi-das seqüências de cadeias leve e pesada.

30. O polinucleotídeo da reivindicação 29, em que a seqüênciade região madura variável de cadeia leve do anticorpo e uma seqüência deregião madura variável de cadeia pesada são idênticas às referidas seqüên-cias.

31. O polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 26-30,o qual é um DNA.

32. Célula hospedeira isolada compreendendo (1) um segmentode DNA recombinante que codifica uma cadeia pesada do anticorpo dequalquer uma das reivindicações 18-25, e (2) um segundo segmento deDNA recombinante que codifica uma cadeia leve do anticorpo; em que osreferidos segmentos de DNA são respectivamente ligados operacionalmentea um primeiro e um segundo promotor, e são capazes de serem expressosna referida célula hospedeira.

33. A célula hospedeira da reivindicação 32, em que o anticorpomonoclonal é um anticorpo humano.

34. A célula hospedeira da reivindicação 32 ou reivindicação 33,em que o anticorpo monoclonal compreende uma seqüência de cadeia pe-sada e leve, selecionada entre:(a) H-CDR SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 28;L-CDR SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 60.(b) H-CDR SEQ ID NO; 3, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 28;L-CDR SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 60.(c) H-CDR SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28;L-CDR SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 60.(d) H-CDR SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28;L-CDR SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 60.(e) H-CDR SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28; eL-CDR SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 60.

35. A célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 32-34, em que o anticorpo compreende (i) uma seqüência de região maduravariável de cadeia leve e (ii) uma seqüência de região madura variável decadeia pesada, selecionadas entre:(a) (i) SEQ ID NO: 101, (ii) SEQ ID NO: 105;(b) (i) SEQ ID NO: 101, (ii) SEQ ID NO: 107; e(c) (i) SEQ ID NO: 101, (ii) SEQ ID NO: 109;cada uma das quais, pelo menos, 80% idêntica à região madura das referi-das seqüências de cadeias leve e pesada.

36. A célula hospedeira da reivindicação 35, em que a seqüênciada região madura variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal e umaseqüência da região madura variável de cadeia pesada são idênticas às re-feridas seqüências.

37. A célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 32-36 que é de uma linhagem celular mamífera não humana.

38. Composição farmacêutica compreendendo üm anticorpo oufragmento funcional, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-25,e um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente para a mesma.

39. Método de tratamento de um distúrbio ou condição, associa-do à presença de hTSLP, alvo de receptor celular, compreendendo adminis-tração para um indivíduo de uma quantidade efetiva da composição farma-cêutica de acordo com a reivindicação 38.

40. O método de acordo com a reivindicação 39, em que o dis-túrbio ou condição é asma. ·

41. O método de acordo com a reivindicação 39, em que o dis-túrbio ou condição é dermatite atópica.