KR101366823B1 - Method for Surface Expressing of Target Protein Using E. coli YiaT Protein - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표면발현모체로 C-말단이 제거된 YiaT 단백질을 코딩하는 유전자와 목적단백질을 코딩하는 유전자가 융합단백질 형태로 발현되록 결합된 DNA를 포함하는 목적단백질의 표면발현 벡터. 상기 벡터를 이용한 목적단백질을 세포표면에 발현시키는 방법 및 상기 표면발현벡터를 이용한 목적단백질의 개량방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 고분자량의 외래단백질을 세포표면에 안정적이면서도 고효율로 발현시킬 수 있어, 단백질어레이, 항체제작, 생물전환공정 및 외래단백질 개량에 유용하게 이용될 수 있다. The present invention provides a surface expression vector of a target protein comprising a DNA encoding a YiaT protein from which a C-terminus has been removed and a gene encoding a target protein in the form of a fusion protein. The present invention relates to a method for expressing a target protein using the vector on a cell surface and a method for improving the target protein using the surface expression vector.
According to the present invention, it is possible to express a high molecular weight foreign protein on the cell surface stably and with high efficiency, so that it can be usefully used for protein array, antibody production, bioconversion process and foreign protein improvement.

Description

대장균 ＹｉａＴ 단백질을 이용한 목적단백질의 표면발현 방법{Method for Surface Expressing of Target Protein Using E. coli YiaT Protein}Method for Surface Expressing of Target Protein Using E. coli YiaT Protein}

본 발명은 표면발현모체로 C-말단이 제거된 YiaT 단백질을 코딩하는 유전자와 목적단백질을 코딩하는 유전자가 융합단백질 형태로 발현되록 결합된 DNA를 포함하는 목적단백질의 표면발현 벡터. 상기 벡터를 이용한 목적단백질을 세포표면에 발현시키는 방법 및 상기 표면발현벡터를 이용한 목적단백질의 개량방법에 관한 것이다.
The present invention provides a surface expression vector of a target protein comprising a DNA encoding a YiaT protein from which a C-terminus has been removed and a gene encoding a target protein in the form of a fusion protein. The present invention relates to a method for expressing a target protein using the vector on a cell surface and a method for improving the target protein using the surface expression vector.

세포 표면발현은 단백질이나 펩티드 등을 적절한 표면발현 모체 (anchoring motif)와 융합시켜서 원핵세포에서 진핵세포에 이르기까지 다양한 세포의 표면에 발현시키는 기술을 말한다 (Lee S.Y. et al., Trends Biotechnol., 21:45, 2003). 이러한 세포 표면발현의 응용 범위는 매우 다양하다. 예를 들면, 특정 단백질을 세포표면에 발현하여 펩티드나 항체, 수용체(receptor) 등의 스크리닝을 간단하게 수행할 수 있으며 (Francisco J.A. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA ., 90:10444, 1993), 항원 에피토프(epitope)를 세포표면에 발현시켜서 강력한 면역반응을 나타낼 수 있는 생백신(live vaccine)을 생성할 수 있다. 또한 정밀화학, 농약, 의약 등에서 요구되는 특정효소를 세포표면에 발현하여 세포 생촉매로 사용하거나, 오염물질을 분해하거나, 금속이온을 흡착할 수 있는 단백질을 발현하여 생물적 환경정화 (bioremediation)에도 사용할 수 있다 (Sousa C. et al., Nat. Biotechnol., 14:1017, 1996; Chen W. and Mulchandani A., Trends Biotechnol., 16:71, 1998).Cell surface expression refers to a technique for expressing a variety of cells from prokaryotic to eukaryotic cells by fusing proteins or peptides with appropriate anchoring motifs (Lee SY et al ., Trends Biotechnol., 21) . : 45, 2003). The range of application of such cell surface expression is very diverse. For example, specific proteins can be expressed on the cell surface to simplify screening of peptides, antibodies, receptors, etc. (Francisco JA et al. al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 90: 10444, 1993), antigen epitopes can be expressed on the surface of cells to produce live vaccines that can exhibit potent immune responses. In addition, specific enzymes required for fine chemistry, pesticides, and medicines are expressed on the cell surface to be used as cell biocatalysts, to decompose contaminants, or to adsorb metal ions and to express bioremediation. Sousa C. et al ., Nat. Biotechnol ., 14: 1017, 1996; Chen W. and Mulchandani A., Trends Biotechnol ., 16:71, 1998).

세포의 복잡한 내막구조를 통과해서 세포표면에 성공적으로 발현시키기 위해서는 우선 세포표면에 발현시키고자 하는 외래 단백질을 세포표면까지 안정적이며 효율적으로 이동시킬 수 있는 표면발현 모체의 개발이 가장 중요한 부분이다. 모체는 다음과 같은 이상적인 성질 가지는 것이 바람직하다: (1) 세포내막을 통과할 수 있는 분비신호 서열(signal sequence)를 가지고 있다; (2) 세포 외막표면에 안정적으로 부착될 수 있는 표적 서열(targeting sequence) 또는 모체(anchoring motif)을 가지고 있다; (3) 세포의 성장을 저해하지 않는 범위 내에서 세포표면에 다량으로 발현되어 단백질의 활성이 높게 나타날 수 있어야 한다; (4) 단백질의 크기에 관계없이 안정적으로 발현되어 다양한 분야에 이용될 수 있어야 한다. In order to successfully express the cell surface through the complex inner membrane structure of the cell, the development of a surface expression matrix capable of stably and efficiently transferring foreign proteins to be expressed on the cell surface to the cell surface is the most important part. The parent preferably has the following ideal properties: (1) it has a signal sequence that can pass through the intracellular membrane; (2) has a targeting sequence or anchoring motif that can be stably attached to the outer membrane surface; (3) expressed in a large amount on the cell surface within a range that does not inhibit the growth of the cell to be able to exhibit high protein activity; (4) Regardless of the size of the protein, it must be stably expressed and used in various fields.

세포표면 발현 방법은 크게 모체에 삽입될 외래 단백질의 위치에 따라, N-말단, C-말단, 또는 샌드위치(중앙위치) 형태로 나눠진다. 지금까지 대장균에서 사용된 표면발현 모체는 외막 단백질(LamB, OmpA, OmpC, OmpS, OprF, PhoE), 지질단백질(lipoprotein; Lpp), autotransporter, surface appendage의 subunit, S-layer 단백질 등이 있다. 특히 이 중에서 외막 단백질은 3차원 구조상에서 세포 밖으로 노출된 구조 부분에 외래 단백질을 전시할 수 있으므로 표면발현 모체로 많이 이용되고 있다. Cell surface expression methods are largely divided into N-terminus, C-terminus, or sandwich (central position) depending on the position of foreign protein to be inserted into the mother. The surface expression matrixes used in E. coli so far include outer membrane proteins (LamB, OmpA, OmpC, OmpS, OprF, PhoE), lipoproteins (Lpp), autotransporters, subunits of surface appendages, and S-layer proteins. In particular, the outer membrane protein is widely used as a surface-expressing parent because it can display the foreign protein in the structural part exposed outside the cell on the three-dimensional structure.

하지만 세포표면 발현 시스템은 대부분 표면에 발현하고자 하는 단백질의 크기가 상대적으로 제한된다는 한계점을 가지고 있다. 보고된 대부분의 모체들은 상대적으로 분자량이 작은 펩티드, 항체, 도메인(domain), 수용체 등의 발현에 사용되고 있다. 이는 삽입된 외래 단백질의 C-말단과 N-말단이 입체적으로 가깝게 위치해야 하므로, 단백질이 큰 경우에는 단백질의 안정성이 낮아진다. 실제로 LamB 또는 PhoE의 경우, 50내지 60개 이상의 아미노산으로 이루어진 외래 단백질을 삽입하면, 구조적 제한을 가져와 안정적으로 외막 단백질을 형성하지 못하고, 대장균의 포린(porin) 단백질을 사용하는 경우, 최고 150개의 아미노산으로 구성된 단백질이 아닌 에피토프나 금속결합 모티브(metal binding motif) 등에 국한되어 사용되었다 (Stahl S. and Uhlen M., Trends Biotechnol. 15:185, 1997; Kjaergaard K. et al., Appl. Environ. Microbiol., 66:10, 2000).However, most cell surface expression systems have a limitation in that the size of the protein to be expressed on the surface is relatively limited. Most reported mothers are used for the expression of relatively low molecular weight peptides, antibodies, domains, receptors and the like. This is because the C-terminus and the N-terminus of the inserted foreign protein should be closely located three-dimensionally, when the protein is large, the stability of the protein is low. Indeed, in the case of LamB or PhoE, the insertion of a foreign protein consisting of 50 to 60 or more amino acids results in structural limitations, preventing the formation of a stable outer membrane protein, and up to 150 amino acids when using porin protein of E. coli. Not limited to epitopes or metal binding motifs, but not to proteins (Stahl S. and Uhlen M., Trends Biotechnol. 15: 185, 1997; Kjaergaard K. et al., Appl. Environ.Microbiol ., 66:10, 2000).

최근에 상대적으로 분자량이 큰 외래 단백질을 세포표면 발현할 수 있는 모체가 개발되고 있다 (Lee S. H., et al., Appl. Environ. Microbiol. 70:5074, 2004; Lee S. H. et al., Biotechnol. Bioeng. 90:223, 2005). 하지만 세포표면에 발현되는 양이 적은 단점을 가지고 있다. 따라서 분자량이 큰 외래 단백질을 안정적으로 고활성, 고효율로 세포표면에 발현시키기 위해서는 새로운 세포표면 발현모체 개발이 필요한 실정이다.Recently, mothers capable of expressing cell surfaces of relatively high molecular weight foreign proteins have been developed (Lee SH, et al., Appl. Environ. Microbiol. 70: 5074, 2004; Lee SH et al. , Biotechnol. 90: 223, 2005). However, the amount of expression on the cell surface has a disadvantage. Therefore, in order to stably express high molecular weight foreign protein on the cell surface with high activity and high efficiency, it is necessary to develop a new cell surface expression matrix.

이에, 본 발명자들은 고분자량의 외래 단백질을 세포표면에 안정적이고 고효율로 발현시키고자 예의 노력한 결과, 대장균의 YiaT 단백질의 C- 말단이 제거된 단편을 표면발현 모체로 사용하여, YiaT 단백질의 C- 말단이 제거된 단편과 목적단백질이 융합하여 발현되도록 설계한 표면발현용 벡터를 사용할 경우, 고분자량의 외래단백질을 안정적이고 효율적으로 세포표면에 발현시킬 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made efforts to express a high molecular weight foreign protein on the cell surface stably and with high efficiency. As a result, the present inventors have used a fragment from which the C-terminus of E. coli YiaT protein has been removed as a surface-expressing parent. When using the surface expression vector designed to express the fusion fragment and the target protein is removed, the present invention was confirmed that high molecular weight foreign protein can be stably and efficiently expressed on the cell surface.

본 발명의 목적은 고분자량의 외래 단백질을 세포표면에 안정적이고 고효율로 발현시킬 수 있는 표면발현모체를 찾고 이를 포함하는 표면발현용 벡터를 제공하는데 있다. Disclosure of Invention An object of the present invention is to find a surface expressing parent capable of expressing a high molecular weight foreign protein on a cell surface stably and with high efficiency, and to provide a surface expression vector including the same.

본 발명의 다른 목적은 상기 표면발현용벡터로 형질전환된 세포를 제공하는데 있다.Another object of the present invention to provide a cell transformed with the surface expression vector.

본 발명의 또다른 목적은 상기 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 목적단백질을 세포표면에 발현시키는 방법을 제공하는데 있다.
Still another object of the present invention is to provide a method for expressing a protein of interest on a cell surface, which comprises culturing the cell.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표면발현모체로 C-말단이 제거된 YiaT 단백질을 코딩하는 유전자와 목적단백질을 코딩하는 유전자가 융합단백질 형태로 발현되록 결합된 DNA를 포함하는 목적단백질의 표면발현 벡터를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is a surface of the target protein comprising a DNA encoding the gene encoding the YiaT protein from which the C-terminus has been removed and the gene encoding the target protein in the form of a fusion protein. Provide an expression vector.

본 발명은 또한, 상기 표면발현용벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.The present invention also provides a cell transformed with the surface expression vector.

본 발명은 또한, 상기 형질전환된 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 목적단백질을 세포 표면에 발현시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for expressing a protein of interest on a cell surface, which comprises culturing the transformed cell.

본 발명은 또한, (a) 표면발현모체로 C-말단이 제거된 YiaT 단백질을 코딩하는 유전자와 목적단백질을 코딩하는 유전자가 융합단백질 형태로 발현되록 결합된 DNA를 포함하는 목적단백질의 표면발현 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 표면발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 세포를 배양하여 목적단백질을 표면발현시키는 단계를 포함하는 목적단백질을 세포표면에 발현시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a surface expression vector of a target protein comprising (a) a gene encoding a YiaT protein from which the C-terminus has been removed and a gene encoding the target protein in the form of a fusion protein. Preparing a; (b) transforming the surface expression vector into a host cell; And (c) culturing the transformed cells to surface express the protein of interest, thereby providing a method of expressing the protein of interest on the cell surface.

본 발명은 또한, (a) 목적단백질을 코딩하는 유전자의 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; (b) 상기 목적단백질의 변이체가 C-말단이 제거된 YiaT 단백질과 융합된 상태로 발현되도록 목적단백질의 유전자 변이체 라이브러리와 C-말단이 제거된 YiaT 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 유전자 재조합체를 제작하는 단계; (c) 상기 유전자 재조합체 또는 상기 유전자 재조합체를 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; (d) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 상기 유전자 변이체 라이브러리를 세포표면에 발현하는 단계; 및 (e) 개량된 형질을 갖는 목적단백질이 발현된 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는 목적단백질의 개량방법을 제공한다.
The invention also comprises the steps of (a) constructing a variant library of genes encoding the protein of interest; (b) a gene recombinant comprising a gene variant library of the protein of interest and a gene encoding the YiaT protein from which the C-terminus is removed such that the variant of the protein of interest is expressed in a fused state with the YiaT protein from which the C-terminus has been removed; Manufacturing step; (c) transforming the host cell with the genetic recombinant or a vector comprising the genetic recombinant; (d) culturing the transformed host cell to express the gene variant library on a cell surface; And (e) screening cells expressing the protein of interest having the improved trait.

본 발명에 따르면, 고분자량의 외래단백질을 세포표면에 안정적이면서도 고효율로 발현시킬 수 있어, 단백질어레이, 항체제작, 생물전환공정 및 외래단백질 개량에 유용하게 이용될 수 있다.
According to the present invention, it is possible to express a high molecular weight foreign protein on the cell surface stably and with high efficiency, so that it can be usefully used for protein array, antibody production, bioconversion process and foreign protein improvement.

도 1은 YiaT 단백질이 세포 외막에 발현되는 것을 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것으로, T는 전체세포 단백질(total protein), M은 외막 단백질 (outer membrane protein), 화살표는 YiaT 단백질을 나타낸다.
도 2은 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 재조합 벡터인 pTrcYR181, pTrcYR232, pTrcY, pTrcYR181PL, pTrcYR232PL, pTrcYPL, pTrcYR181PLFG, pTrcYR232PLFG, 및 pTrcYPLFG의 유전자 지도이다.
도 3은 본 발명에 따라 세포표면에 발현된 lipase(리파제)의 활성 여부를 나타내는 고체 평판 사진이다.
도 4는 본 발명에 따라 세포표면에 발현된 리파제의 유무를 나타내는 Western blot 사진이다.
도 5는 pH 변화에 따른 세포표면에 발현된 리파제 활성을 나타낸 것이다.
도 6는 온도 변화에 따른 세포표면에 발현된 리파제 활성을 나타낸 것이다. Figure 1 shows the SDS-PAGE results confirmed that the YiaT protein is expressed in the outer membrane, T is the total cell protein (total protein), M is the outer membrane protein (arrow membrane protein), the arrow represents the YiaT protein.
Figure 2 is a genetic map of the recombinant plasmid recombinant vectors pTrcYR 181 , pTrcYR 232 , pTrcY, pTrcYR 181 PL, pTrcYR 232 PL, pTrcYPL, pTrcYR 181 PLFG, pTrcYR 232 PLFG, and pTrcYPLFG according to the present invention.
Figure 3 is a solid plate picture showing the activity of the lipase (lipase) expressed on the cell surface according to the present invention.
4 is a Western blot photograph showing the presence or absence of lipase expressed on the cell surface according to the present invention.
Figure 5 shows the lipase activity expressed on the cell surface according to the pH change.
Figure 6 shows the lipase activity expressed on the cell surface with temperature changes.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에서 "목적단백질"은 당업자가 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현할 수 있는 모든 단백질을 의미한다.In the present invention, "target protein" refers to any protein that can be expressed in a transformant by inserting a polynucleotide encoding the protein into a recombinant expression vector.

본 발명에서 "융합단백질"은 원래의 외래단백질의 서열의 N-말단 또는 C- 말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산이 부가되어 하나의 폴리펩타이드로 발현되는 단백질을 의미한다.As used herein, the term “fusion protein” refers to a protein in which another protein is linked to another N-terminus or C-terminus of an original foreign protein or is added to another amino acid to express one polypeptide.

일 관점에서, 본 발명은 표면발현모체로 C-말단이 제거된 YiaT 단백질을 코딩하는 유전자와 목적단백질을 코딩하는 유전자가 융합단백질 형태로 발현되록 결합된 DNA를 포함하는 목적단백질의 표면발현 벡터에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a surface expression vector of a target protein comprising a DNA encoding a YiaT protein whose C-terminus has been removed and a gene encoding a target protein in the form of a fusion protein. It is about.

대장균의 YiaT 단백질은 현재까지 세포 내의 기능뿐만 아니라 세포 내 위치가 실험적으로 보고된 바가 없었다. 본 발명에서는 세포표면 발현시스템을 제작하기 전에 YiaT 단백질의 정확한 세포내 위치를 확인하고자, 대장균 W3110(ATCC 39936) 염색체로부터 YiaT 유전자를 클로닝하여 대장균 XL1-Blue에서 과발현시킨 후, 세포외막단백질 분획을 분리하고, 상기 세포외막단백질 분획에서 YiaT 단백질이 존재하는 것을 확인하고, YiaT 단백질이 세포표면에 발현하는 표면발현모체로 사용될 수 있다는 것을 확인하였다. E. coli's YiaT protein has not been reported experimentally as well as intracellular function as well as intracellular function. In the present invention, to confirm the exact intracellular location of the YiaT protein before constructing the cell surface expression system, by cloning the YiaT gene from E. coli W3110 (ATCC 39936) chromosome, overexpression in E. coli XL1-Blue, extracellular membrane protein fractions are separated. In addition, it was confirmed that the YiaT protein was present in the extracellular membrane protein fraction, and it was confirmed that the YiaT protein could be used as a surface expressing parent expressed on the cell surface.

본 발명의 일 실시예에서는 YiaT 단백질의 전체 아미노산 서열(서열번호 9) 중 232번째 아미노산까지를 포함하는 YiaT 단백질 단편 또는 181번째 아미노산까지를 포함하는 표면발현모체를 제작하고 상기 표면발현모체와 목적단백질인 슈도모나스 플루레센스(Pseudomonas fluorescens) 유래의 리파제를 각각 융합단백질형태로 발현할 수 있도록 벡터를 제작하여 대장균에 형질전환시킨 후, 리파제가 성공적으로 표면발현되는 것을 확인하였다. In one embodiment of the present invention, the YiaT protein fragment including the 232th amino acid or the 181 th amino acid of the entire amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) of the YiaT protein is prepared, and the surface expression parent and the target protein are prepared. After transforming Escherichia coli into vectors capable of expressing lipases derived from Pseudomonas fluorescens in the form of fusion proteins, it was confirmed that surface lipases were successfully expressed.

용어 “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. The term “vector” refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing the DNA in a suitable host. The vector may be a plasmid, phage particle, or simply a potential genome insert. Once transformed into the appropriate host, the vector may replicate and function independently of the host genome, or, in some cases, integrate into the genome itself. Since plasmids are currently the most commonly used form of vectors, "plasmids" and "vectors" are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. However, the present invention includes other forms of vectors having functions equivalent to those known or known in the art.

“발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다. The expression “expression control sequence” refers to a DNA sequence essential for the expression of a coding sequence operably linked in a particular host organism. Such regulatory sequences include promoters for effecting transcription, any operator sequence for regulating such transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites, and sequences that control termination of transcription and translation. For example, suitable control sequences for prokaryotes include promoters, optionally operator sequences, and ribosomal binding sites. Eukaryotic cells include promoters, polyadenylation signals, and enhancers. The factor that most influences the amount of gene expression in the plasmid is the promoter. As the promoter for high expression, an SRα promoter, a promoter derived from cytomegalovirus, and the like are preferably used.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 E. coli에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.In order to express the DNA sequences of the present invention, any of a wide variety of expression control sequences may be used in the vector. Examples of useful expression control sequences include, for example, early and late promoters of SV40 or adenovirus, lac system, trp system, TAC or TRC system, T3 and T7 promoters, major operator and promoter region of phage lambda, fd Regulatory regions of the code protein, promoters for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolysis enzymes, promoters of the phosphatase such as Pho5, promoters of the yeast alpha-crossing system and prokaryotic or eukaryotic cells or viruses thereof And other sequences of constitution and induction known to modulate the expression of the genes, and various combinations thereof. The T7 RNA polymerase promoter Φ10 can be used to express protein NSP in E. coli .

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다. Nucleic acids are “operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences. This may be genes and regulatory sequence (s) linked in such a way as to allow gene expression when appropriate molecules (eg, transcriptional activating proteins) bind to regulatory sequence (s). For example, the DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to the DNA for the polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide; A promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; Or the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence; Or the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation. In general, “operably linked” means that the linked DNA sequences are in contact, and in the case of a secretory leader, are in contact and present within the reading frame. However, the enhancer need not be in contact. Linking of these sequences is performed by ligation (linking) at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods are used.

본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.As used herein, the term " expression vector " is usually a recombinant carrier into which a fragment of different DNA is inserted, and generally means a fragment of double-stranded DNA. Here, heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not naturally found in host cells. Once the expression vector is in the host cell, it can replicate independently of the host chromosomal DNA and several copies of the vector and its inserted (heterologous) DNA can be produced.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.As is well known in the art, to raise the expression level of a transfected gene in a host cell, the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the selected expression host. Preferably, the expression control sequence and the gene of interest are included in one expression vector including the bacterial selection marker and the replication origin. If the expression host is a eukaryotic cell, the expression vector must further comprise an expression marker useful in the eukaryotic expression host.

본 발명에 있어서, 상기 C-말단이 제거된 YiaT 단백질은 232 번째 아미노산 이후의 C-말단이 제거된 단백질 또는 181 번째 아미노산 이후의 C-말단이 제거된 단백질인 것이 바람직하다. In the present invention, the Y-T protein from which the C-terminus has been removed is preferably a protein from which the C-terminus after the 232th amino acid is removed or a C-terminus after the 181th amino acid is removed.

특히, 본 발명의 일실시예에서, YiaT 단백질의 전체서열을 표면발현모체로 사용한 경우에는 표 1에 나타난 바와 같이, 목적단백질인 리파제에 의하여 세포분해가 일어나거나, C- 말단이 제거된 YiaT 단백질 단편을 표면발현모체로 사용하였을 때보다, 표면발현된 리파아제효율이 현저히 떨어지는 것으로 나타났다.Particularly, in one embodiment of the present invention, when the entire sequence of the YiaT protein is used as the surface expression parent, as shown in Table 1, YiaT protein in which cytolysis is caused by a lipase as a target protein or C-terminal is removed It was shown that the surface-expressed lipase efficiency was significantly lower than when the fragment was used as the surface-expressing parent.

본 발명에서 목적단백질은 당업자가 원하는 모든 단백질이 가능하며, 특히, 의료, 연구용 및 산업용 단백질, 예를 들어, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 혹은 그 일부분, 항체, 항원 혹은 그 일부분, 단쇄항체, 세포수용체, 결합단백질, 결합도메인, 펩타이드, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절인자, 혈액응고인자 및 식물 생체방어 유도 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 생물학적 활성을 갖는 다양한 외래단백질을 목적단백질로 발현시킬 수 있다. The protein of interest in the present invention may be any protein desired by those skilled in the art, and in particular, medical, research and industrial proteins, such as hormones, hormone analogs, enzymes, inhibitors, signaling proteins or portions thereof, antibodies, antigens or the like. Selected from the group consisting of partial, short chain antibody, cell receptor, binding protein, binding domain, peptide, adhesion protein, structural protein, regulatory protein, toxin protein, cytokine, transcription regulator, coagulation factor and plant biodefense inducing protein Various foreign proteins with biological activity can be expressed as the protein of interest.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 표면발현벡터로 형질전환된 세포와 상기 형질전환된 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 목적단백질을 세포 표면에 발현시키는 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a method for expressing a target protein on a cell surface, characterized in that the cell is transformed with the surface expression vector and the transformed cell.

또다른 관점에서, 본 발명은 (a) 표면발현모체로 C-말단이 제거된 YiaT 단백질을 코딩하는 유전자와 목적단백질을 코딩하는 유전자가 융합단백질 형태로 발현되록 결합된 DNA를 포함하는 목적단백질의 표면발현 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 표면발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 세포를 배양하여 목적단백질을 표면발현시키는 단계를 포함하는 목적단백질을 세포표면에 발현시키는 방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention (a) a surface expression of the target protein comprising a DNA encoding a YiaT protein from which the C-terminus has been removed and a gene encoding the protein of interest is expressed in the form of a fusion protein. Preparing a surface expression vector; (b) transforming the surface expression vector into a host cell; And (c) culturing the transformed cells to express the target protein on the surface of the cell.

본 발명에서는 목적 단백질을 세포표면에 안정적으로 다량 발현시키는 시스템을 개발하였으며 이는 단백질어레이, 항체제작, 생물전환공정 및 외래단백질 개량 등의 다양한 생명공학 분야에 이용될 수 있다.In the present invention, a system for stably expressing a large amount of a target protein on a cell surface has been developed, which can be used in various biotechnology fields such as protein array, antibody production, bioconversion process, and foreign protein improvement.

또다른 관점에서, 본 발명은 (a) 목적단백질을 코딩하는 유전자의 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; (b) 상기 목적단백질의 변이체가 C-말단이 제거된 YiaT 단백질과 융합된 상태로 발현되도록 목적단백질의 유전자 변이체 라이브러리와 C-말단이 제거된 YiaT 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 유전자 재조합체를 제작하는 단계; (c) 상기 유전자 재조합체 또는 상기 유전자 재조합체를 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; (d) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 상기 유전자 변이체 라이브러리를 세포표면에 발현하는 단계; 및 (e) 개량된 형질을 갖는 목적단백질이 발현된 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는 목적단백질의 개량방법에 관한 것이다.In another aspect, the invention provides a method of constructing a variant library of genes encoding a protein of interest; (b) a gene recombinant comprising a gene variant library of the protein of interest and a gene encoding the YiaT protein from which the C-terminus is removed such that the variant of the protein of interest is expressed in a fused state with the YiaT protein from which the C-terminus has been removed; Manufacturing; (c) transforming the host cell with the genetic recombinant or a vector comprising the genetic recombinant; (d) culturing the transformed host cell to express the gene variant library on a cell surface; And (e) screening for cells expressing the protein of interest having the improved trait.

본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 그람 음성균, 그람 양성균, 방선균, 효모 곰팡이로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 상기 스크리닝 단계는 목적단백질의 활성, 목적단백질에 라벨링된 물질을 인식하는 단백질, 목적단백질에 결합하는 라벨링된 리간드 또는 목적단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the host cell may be selected from the group consisting of Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, actinomycetes, yeast fungi, the screening step is the protein of interest, the protein of interest to recognize the substance labeled with the protein of interest It may be characterized by using a labeled ligand that binds to or an antibody that specifically binds to the protein of interest.

본 발명의 목적단백질 개량방법에 있어서, 유전자 라이브러리를 구축하는 단계는 DNA 셔플링법 (Stemmer, Nature, 370:389-91, 1994), StEP법 (Zhao, H., et al., Nat. Biotechnol., 16: 258-61, 1998), RPR법 (Shao, Z., et al., Nucleic Acids Res., 26:681-3, 1998), 분자육종법 (Ness, J.E., et al., Nat. Biotechnol. 17:893-6, 1999), ITCHY법 (Lutz S.,et al., Cur. Opi. Biotechnol., 11:319-24, 2000), 에러 유발(error-prone) PCR (Cadwell, R.C., et al., PCR Methods Appl., 2:28-33, 1992), 포인트 돌연변이법 (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)을 이용하여 야생형 목적단백질의 유전자를 변이시킴으로써 얻을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the protein improvement method of the present invention, the step of constructing the gene library is DNA shuffling method (Stemmer, Nature, 370: 389-91, 1994), StEP method (Zhao, H., et al., Nat. Biotechnol. , 16: 258-61, 1998), RPR method (Shao, Z., et al., Nucleic Acids Res., 26: 681-3, 1998), molecular breeding method (Ness, JE, et al., Nat. Biotechnol 17: 893-6, 1999), ITCHY method (Lutz S., et al., Cur. Opi. Biotechnol., 11: 319-24, 2000), error-prone PCR (Cadwell, RC, et al., PCR Methods Appl., 2: 28-33, 1992), and the use of point mutagenesis (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989) It can be obtained by mutating the gene, but is not limited thereto.

본 발명의 목적단백질의 개량방법에 있어서, 상기 스크리닝 단계는 목적단백질의 활성, 목적단백질에 라벨링된 물질을 인식하는 단백질, 목적단백질에 결합하는 라벨링된 리간드 또는 목적단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝 단계는 유세포 분석기 (Georgiou, G., Adv Protein Chem., 55:293-315, 2000)를 이용하여 실시할 수도 있고, 단백질의 활성을 이용하는 경우에는 단백질이 발현되는 숙주의 성장을 측정하거나, 또는 단백질에 의해 촉매되는 발색반응을 측정하여 스크리닝할 수 있다. In the method for improving the protein of the present invention, the screening step includes a protein that recognizes the activity of the protein of interest, a substance labeled with the protein of interest, a labeled ligand that binds to the protein of interest, or an antibody that specifically binds to the protein of interest. It may be characterized by using. In addition, the screening step may be carried out using a flow cytometer (Georgiou, G., Adv Protein Chem., 55: 293-315, 2000), or, if the activity of the protein is used, growth of the host in which the protein is expressed. It can be measured or screened by measuring the color reaction catalyzed by the protein.

상술한 바와 같은 특징을 갖는 본 발명의 단백질 개량방법을 이용할 경우, 종래의 방법으로는 용이하게 얻을 수 없는, 생물학적으로 발생하지 않는 화학반응을 촉매하는 효소(예: Diels-Alder 축합반응), 비자연적인 입체 선택성 또는 레지오선택성(regioselectivity)을 갖는 효소, 유기용매 또는 유기용매-수용액 이상의 용액에서 반응을 촉매할 수 있는 효소, 그리고 고온 고압과 같은 극한 조건에서 반응을 촉매하는 효소 등을 야생형 효소로부터 신속하게 얻을 수 있다
When using the protein improvement method of the present invention having the characteristics described above, enzymes (e.g., Diels-Alder condensation reactions), which catalyze biologically occurring chemical reactions, which are not easily obtained by conventional methods, Enzymes with natural stereoselectivity or regioselectivity, enzymes capable of catalyzing reactions in solutions of organic or organic solvent-aqueous solutions, and enzymes catalyzing reactions under extreme conditions, such as high temperature and high pressure, from wild type enzymes Can be obtained quickly

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예 1: YiaT 단백질의 세포 내의 위치 확인Example 1: Positioning of YiaT Protein in Cells

YiaT 단백질은 현재까지 세포 내의 기능뿐만 아니라 세포 내 위치가 실험적으로 보고된 바가 없다. 따라서 세포표면 발현시스템을 제작하기 전에 YiaT 단백질의 정확한 세포내 위치를 확인하고자, YiaT 단백질을 과발현시켜, 전체세포 단백질과 외막 단백질을 분리하여 SDS-PAGE로 분석하였다. 대장균 유래의 yiaT 유전자를 획득하기 위하여, 대장균 W3110(ATCC 39936) 염색체(chromosomal DNA)를 주형으로 하고, 서열번호 1과 2번의 프라이머를 사용하여 PCR (첫번째 변성 95℃ 5분, 두번째 변성 95℃ 30초, 교잡 55℃ 1분, 연장 72℃ 1분 30초, 30회 반복)을 수행하였다.The YiaT protein has not been reported experimentally as well as its intracellular function as of now. Therefore, in order to confirm the exact intracellular location of the YiaT protein before constructing the cell surface expression system, the YiaT protein was overexpressed, and the whole cell protein and the outer membrane protein were separated and analyzed by SDS-PAGE. In order to obtain the yiaT gene derived from E. coli, E. coli W3110 (ATCC 39936) chromosomal DNA was used as a template, and PCR (first denaturation at 95 ° C for 5 minutes and second denaturation at 95 ° C 30) was carried out using primers of SEQ ID NOs: 1 and 2. Sec, hybridization 55 ° C. 1 min, extension 72 ° C. 1 min 30 sec, 30 repetitions).

서열번호 1: 5-ggaattcATGTTAATTAATCGCAATATTGTGSEQ ID NO: 5-g gaattc ATGTTAATTAATCGCAATATTGTG

서열번호 2: 5-cccaagcttTTAAAAACGCCAGCTCACCCCG
SEQ ID NO: 5-ccc aagctt TTAAAAACGCCAGCTCACCCCG

상기 PCR 산물을 아가로즈 겔 전기영동법으로 전기영동한 후, 아가로즈 젤에서 약 741bp 크기의 DNA 절편을 분리하고, 제한효소 EcoRI과 HindIII으로 절단하였다. 이를 trc 프로모터를 갖고 있는 플라스미드 pTrc99A (Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)를 상기와 동일한 제한효소인 EcoRI과 HindIII으로 절단하여 수득한 DNA 절편과 연결시켜 재조합 플라스미드를 수득하고, 열충격 (heat shock) 방법으로 대장균 XL1-Blue에 도입하여 형질전환시킨 다음, 엠피실린(50㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하여, 이로부터 재조합 플라스미드 pTrcYE를 성공적으로 수득하였다. After the PCR product was electrophoresed by agarose gel electrophoresis, DNA fragments of about 741 bp in size were isolated from the agarose gel and digested with restriction enzymes Eco RI and Hin dIII. The plasmid pTrc99A having a trc promoter (Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden) was linked with a DNA fragment obtained by cleaving with the same restriction enzymes Eco RI and Hin dIII to obtain a recombinant plasmid, and a heat shock. The method was introduced into E. coli XL1-Blue, transformed, and then screened in LB plate medium to which empicillin (50 µg / L) was added, thereby successfully obtaining a recombinant plasmid pTrcYE.

형질전환균주 XL1-Blue (pTrcYE)와 대조균으로 XL1-Blue (pTrc99a)을 앰피실린(50㎍/L)이 첨가된 100 mL의 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 배양하고, 배양액의 흡광도가 600nm에서 0.4일 때 IPTG 농도가 1mM이 되도록, 첨가하여 YiaT 단백질의 발현을 유도하였다. 발현유도 4시간 경과 후, 4℃, 6000 rpm에서 5분 동안 배양액을 원심분리 하여 세포를 수득하고, 10 mM Na2HPO4 (pH 7.2) 용액으로 세척한 후, 10 mM Na2HPO4 (pH 7.2) 용액 0.2mL으로 재현탁하였다. 현탁된 세포를 초음파법을 이용하여 파괴시킨 후, 실온에서 10,000rpm, 2분 동안 원심분리 하여 파괴되지 않은 세포는 제거하고 다시 18℃, 10,000 rpm에서 30분 동안 상등액을 원심분리하여 펠렛(pellet)을 0.5% sarcosyl 용액 0.5 mL에 현탁하였다. 이 현탁액을 4℃, 12,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 펠렛을 수확한 후, 다시 10 mM Na2HPO4 (pH 7.2) 용액 0.5 mL으로 재현탁하여 같은 조건으로 원심분리 하였다. 펠렛을 증류수에 현탁하여 최종적으로 세포의 외막 단백질들을 획득하여 -20℃에 보관하였다. 이들 외막 단백질과 전체세포 단백질을 10% SDS-PAGE를 이용하여 분자량 크기별로 분리한 결과, YiaT 단백질(약 27 kDa)이 세포 외막에 위치함을 알 수 있었다 (도 1).
Transgenic strains XL1-Blue (pTrcYE) and control bacteria were inoculated in 100 mL LB liquid medium to which ampicillin (50 µg / L) was added and incubated at 37 ° C. It was added to induce the expression of YiaT protein so that the IPTG concentration was 1 mM at 0.4 at 600 nm. After 4 hours of expression induction, the cells were obtained by centrifugation of the culture solution at 4 ° C. and 6000 rpm for 5 minutes, washed with 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7.2) solution, and then 10 mM Na 2 HPO 4 (pH). 7.2) Resuspend in 0.2 mL of solution. The suspended cells were disrupted by ultrasonication, and then centrifuged at 10,000 rpm for 2 minutes at room temperature to remove unbroken cells, followed by pelleting the supernatant at 18 ° C. and 10,000 rpm for 30 minutes. Was suspended in 0.5 mL of a 0.5% sarcosyl solution. The suspension was centrifuged at 4 ° C., 12,000 rpm for 30 minutes to harvest pellets, then resuspended in 0.5 mL of 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7.2) solution and centrifuged under the same conditions. The pellet was suspended in distilled water to finally obtain the outer membrane proteins of the cell and stored at -20 ° C. These outer membrane proteins and whole cell proteins were separated by molecular weight using 10% SDS-PAGE, and it was found that YiaT protein (about 27 kDa) was located in the outer membrane (FIG. 1).

실시예 2: 재조합 벡터들 pTrcYRExample 2: Recombinant Vectors pTrcYR 232232 , pTrcYR, pTrcYR 181 181 및 pTrcY의 제조And preparation of pTrcY

세포 외막 단백질을 발현시키기 위해서 3 가지 형태의 모체들을 제조하였다. 대장균 yiaT 유전자의 C-말단 제거하여, 대장균 W3110(ATCC 39936) 염색체(chromosomal DNA)를 주형으로 하고, 서열번호 1과 3, 및 서열번호 1과 4번의 프라이머를 사용하여 PCR (첫번째 변성 95℃ 5분, 두번째 변성 95℃ 30초, 교잡 55℃ 1분, 연장 72℃ 1분 30초, 30회 반복)을 수행하였다. 또한 정지신호서열(stop codon)만 제거된 정상적인 전체 yiaT 유전자를 서열번호 1과 5번의 프라이머를 사용하여 PCR를 수행하였다.Three types of mothers were prepared to express extracellular membrane proteins. The C-terminus of the E. coli yiaT gene was removed, and the E. coli W3110 (ATCC 39936) chromosomal DNA was used as a template, and PCR (first denaturation at 95 ° C 5) was performed using primers SEQ ID NOs: 1 and 3, and SEQ ID NOs: 1 and 4. Minute, second denaturation 95 ° C. 30 sec, hybridization 55 ° C. 1 min, extension 72 ° C. 1 min 30 sec, 30 repetitions). In addition, PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 1 and 5 for the normal whole yiaT gene from which only stop codons were removed.

서열번호 3: 5-gctctagaACGATCAATCATCGGGCTGTCGGT [Arg_232]SEQ ID NO: 5-gc tctaga ACGATCAATCATCGGGCTGTCGGT [Arg_232]

서열번호 4: 5-gctctagaACGACGGGACTCACTCTCTGAAAT [Arg_181]SEQ ID NO: 5-gc tctaga ACGACGGGACTCACTCTCTGAAAT [Arg_181]

서열번호 5: 5-gctctagaAAAACGCCAGCTCACCCCG [full gene]
SEQ ID NO: 5-gc tctaga AAAACGCCAGCTCACCCCG [full gene]

상기 PCR 산물로 아가로즈 겔 전기영동을 수행하여, 아가로오즈 절편에서 각각 약 696bp, 543bp, 741bp 크기의 DNA 절편을 분리하고, 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단하였다. 이를 trc 프로모터를 갖고 있는 플라스미드 pTrc99A (Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)에 같은 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 절단하여 수득한 DNA 절편과 연결시켜 재조합 플라스미드를 수득하고, 열충격 (heat shock) 방법으로 대장균 XL1-Blue에 도입하여 형질전환시킨 다음, 엠피실린(50㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하여, C 말단이 제거되어, YiaT 단백질 서열 중 232번째 Arg까지의 단편을 코딩하는 유전자 단편이 삽입된 재조합 플라스미드 pTrcYR232, C 말단이 제거되어, YiaT 단백질 서열 중 181번째 Arg까지의 단편을 코딩하는 유전자 단편이 삽입된 재조합 플라스미드 pTrcYR181, 및 YiaT 단백질 전체를 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드 pTrcY를 성공적으로 수득하였다 (도 2).
Agarose gel electrophoresis was performed on the PCR product, DNA fragments of about 696bp, 543bp, and 741bp were isolated from the agarose fragments, respectively, and digested with restriction enzymes Eco RI and Xba I. The plasmid pTrc99A with trc promoter (Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden) was linked with a DNA fragment obtained by cleavage with the same restriction enzymes Eco RI and Xba I to obtain a recombinant plasmid, and by heat shock method, E. coli Gene fragment introduced into XL1-Blue, transformed, and then selected from LB plate medium to which empicillin (50 μg / L) was added and the C terminus was removed to encode fragments up to the 232th Arg in the YiaT protein sequence. This inserted recombinant plasmid pTrcYR 232 , the recombinant plasmid pCrcYR 181 with the gene fragment encoding the fragment up to the 181th Arg of the YiaT protein sequence inserted, and the gene encoding the entire YiaT protein inserted pTrcY was obtained successfully (FIG. 2).

실시예 3: 리파제 효소를 발현하는 재조합 벡터들 pTrcYRExample 3: Recombinant Vectors pTrcYR Expressing Lipase Enzyme 232232 PL, pTrcYRPL, pTrcYR 181181 PL, pTrcYPL, pTrcYRPL, pTrcYPL, pTrcYR 232232 PLFG, pTrcYRPLFG, pTrcYR 181181 PLFG 및 pTrcYPLFG의 제조Preparation of PLFG and pTrcYPLFG

슈도모나스 플루레센스(Pseudomonas fluorescens) 유래의 리파제 효소를 세포표면에 발현하는 재조합 플라스미드를 다음과 같이 제작하였다. 슈도모나스 플루레센스(Ahn J.H. et al., J. Bacteriol., 181:1847, 1999)의 염색체(chromosomal DNA)를 주형으로 하고, 서열번호 6과 7, 서열번호 6과 8의 프라이머를 사용하여, PCR (첫번째 변성 95℃ 5분, 두번째 변성 95℃ 30초, 교잡 55℃ 30초, 연장 72℃ 1분 30초, 30회 반복)을 수행하였다A recombinant plasmid expressing the lipase enzyme derived from Pseudomonas fluorescens on the cell surface was prepared as follows. Using the chromosomal DNA of Pseudomonas fluresense (Ahn JH et al. , J. Bacteriol., 181: 1847, 1999) as a template and using the primers of SEQ ID NOs: 6 and 7, SEQ ID NOs: 6 and 8, PCR was performed (first denaturation 95 ° C. 5 minutes, second denaturation 95 ° C. 30 seconds, hybridization 55 ° C. 30 seconds, extension 72 ° C. 1 minute 30 seconds, 30 repetitions).

서열번호 6: 5-gctctagaATGCTTCATGCCTTCGAACGCSEQ ID NO: 5-gc tctaga ATGCTTCATGCCTTCGAACGC

서열번호 7: 5-cccaagctttcaactgatcagcacaccSEQ ID NO: 5-ccc aagctt tcaactgatcagcacacc

서열번호 8: 5-cccaagcttttacttgtcgtcatcgtccttgtagtcACTGATCAGCACACC
SEQ ID NO: 5-ccc aagctt ttacttgtcgtcatcgtccttgtagtcACTGATCAGCACACC

상기 PCR 산물로 아가로즈 젤 전기영동을 수행하고, 아가로즈 젤로부터 각각 약 1.4kb와 1.5kb 크기의 DNA 절편인 리파제 유전자와 리파제에 FLAG 꼬리가 융합된 형태의 유전자를 수득하였다. 이들 유전자들을 XbaI과 HindIII으로 절단하고, 실시예 2에서 제작된 플라스미드들 pTrcYR232, pTrcYR181 및 pTrcY에 삽입시켜서, 재조합 발현벡터 pTrcYR232PL, pTrcYR181PL, pTrcYPL, pTrcYR232PLFG, pTrcYR181PLFG 및 pTrcYPLFG을 각각 제조하고, 열충격 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하여 형질 전환시켰다 (도 2). 형질전환된 균주는 엠피실린 (50㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 선별된 균주는 LB 액체배지에서 배양하여 -80℃ 냉동고에 보관하였다. 또한, 다른 숙주 세포 XL10-Gold(Stratagene Cloning System, La Jolla, CA)와 W3110에 제작된 재조합 발현벡터 pTrcYR232PL, pTrcYR181PL, pTrcYPL, pTrcYR232PLFG, pTrcYR181PLFG 및 pTrcYPLFG를 도입하여 형질전환시켜서, 최종적으로 형질전환세포들을 선별하여 획득하였다.
Agarose gel electrophoresis was performed with the PCR product, and a lipase gene, which is a DNA fragment of about 1.4 kb and 1.5 kb, was obtained from the agarose gel, and a gene in which the lipase was fused with the FLAG tail. These genes were cleaved with Xba I and Hin dIII and inserted into the plasmids pTrcYR 232 , pTrcYR 181 and pTrcY prepared in Example 2, and the recombinant expression vectors pTrcYR 232 PL, pTrcYR 181 PL, pTrcYPL, pTrcYR 232 PLFG, pTrcYR 181 PLFG and pTrcYPLFG, respectively, were prepared and transformed by introduction into E. coli XL1-Blue using the thermal shock method (FIG. 2). Transformed strains were selected in LB plate medium added with empicillin (50 μg / L), and the selected strains were cultured in LB liquid medium and stored in a -80 ° C freezer. In addition, the recombinant expression vectors pTrcYR 232 PL, pTrcYR 181 PL, pTrcYPL, pTrcYR 232 PLFG, pTrcYR 181 PLFG and pTrcYPLFG were introduced into other host cells XL10-Gold (Stratagene Cloning System, La Jolla, Calif.) And W3110. Finally, transformed cells were selected and obtained.

실시예 4: 세포표면에 발현된 리파제의 활성도 측정Example 4 Measurement of Activity of Lipase Expressed on Cell Surface

실시예 3에서 제조된 형질전환균주 XL1-Blue (pTrcYR232PL), XL1-Blue (pTrcYR181PL), XL1-Blue (pTrcYPL), XL10-Gold (pTrcYR232PL), XL10-Gold (pTrcYR181PL), XL10-Gold (pTrcYPL), W3110 (pTrcYR232PL), W3110 (pTrcYR181PL), 및 W3110 (pTrcYPL)을 엠피실린(50㎍/L)이 첨가된 100 mL의 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 배양액의 흡광도가 600nm에서 0.4일 때 최종농도가 1mM이 되도록 IPTG를 첨가하여 리파제 유전자 발현을 유도하였다. 발현유도 4시간 경과 후, 배양액을 회수하고, 4℃, 6000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 세포를 수득하고, 세포를 PBS로 세척한 후, 리파제의 활성은 p-nitrophenyl decanoate를 기질(substrate)로 사용하여, 생성물의 발색정도를 분광광도계로 측정하였다 (Lee SH, et al., Biotechnol. Bioeng., 90:223, 2005). 10 mM p-nitrophenyl decanoate를 acetonitrile에 용해시킨 용액, 에탄올, 50mM Tris-HCl (pH 8.0)를 각각 1:4:95 부피비율로 섞어서 기질 용액을 제조하였다. 리파제가 발현된 세포에 3 mL의 기질 용액을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 0.5mM EDTA를 2㎕ 첨가하여 반응을 종결하였다. 최종적으로 리파제 활성은 405nm 파장에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 그 결과, XL10-Gold (pTrcYPL)와 W3110 (pTrcYPL)는 리파제 발현을 유도 한 후, 세포성장이 저해되면서 세포 용해(cell lysis)로 인해 더 이상 실험을 수행할 수 없었다. 또한, XL1-Blue (pTrcYPL)는 세포성장에는 문제가 없지만, 세포표면에 발현되는 리파제가 매우 약함을 알 수 있었다 (표 1). Transformation strain XL1-Blue (pTrcYR 232 PL), XL1-Blue (pTrcYR 181 PL), XL1-Blue (pTrcYPL), XL10-Gold (pTrcYR 232 PL), XL10-Gold (pTrcYR 181 PL) prepared in Example 3 ), XL10-Gold (pTrcYPL), W3110 (pTrcYR 232 PL), W3110 (pTrcYR 181 PL), and W3110 (pTrcYPL) were inoculated in 100 mL of LB liquid medium containing empicillin (50 μg / L) to obtain 37 Incubated at ℃. The lipase gene expression was induced by adding IPTG so that the final concentration was 1 mM when the absorbance of the culture was 0.4 at 600 nm. After 4 hours of expression induction, the culture was recovered, centrifuged at 4 ° C. and 6000 rpm for 5 minutes to obtain cells. After washing the cells with PBS, the activity of the lipase was determined using p- nitrophenyl decanoate as a substrate. The color development of the product was measured by spectrophotometer (Lee SH, et al ., Biotechnol. Bioeng. , 90: 223, 2005). A substrate solution was prepared by mixing 10 mM p- nitrophenyl decanoate in acetonitrile, ethanol, and 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) in a 1: 4: 95 volume ratio, respectively. After adding 3 mL of the substrate solution to the lipase-expressing cells and reacting at 37 ° C. for 10 minutes, the reaction was terminated by adding 2 μl of 0.5 mM EDTA. Finally, lipase activity was analyzed by measuring absorbance at 405 nm wavelength. As a result, after XL10-Gold (pTrcYPL) and W3110 (pTrcYPL) induced lipase expression, cell growth was inhibited and cell lysis could not be performed anymore. In addition, XL1-Blue (pTrcYPL) has no problem in cell growth, but the lipase expressed on the cell surface was found to be very weak (Table 1).

반면, yiaT 유전자 단편을 형질전환 모체로 사용한, 형질전환균주 XL1-Blue (pTrcYR232PL), XL1-Blue (pTrcYR181PL), XL10-Gold (pTrcYR232PL), XL10-Gold (pTrcYR181PL), W3110 (pTrcYR232PL), 및 W3110 (pTrcYR181PL)들은 전체 yiaT 유전자를 모체(pTrcY)로 사용한 것에 비해 훨씬 리파제 활성이 높음을 보였다. 세포 표면 발현 균주 중에서 XL10-Gold가 가장 좋은 것으로 나타났으며, 제작된 모체 중에서 YiaTR232가 가장 효율적으로 안정하게 리파제를 세포표면에 전시시킴을 알 수 있었다.On the other hand, transgenic strains XL1-Blue (pTrcYR 232 PL), XL1-Blue (pTrcYR 181 PL), XL10-Gold (pTrcYR 232 PL), XL10-Gold (pTrcYR 181 PL), using the yiaT gene fragment as a transformation parent , W3110 (pTrcYR 232 PL), and W3110 (pTrcYR 181 PL) showed much higher lipase activity than the whole yiaT gene as a parent (pTrcY). Among the cell surface expression strains, XL10-Gold was shown to be the best, and among the prepared mothers, YiaTR232 exhibited the most efficient and stable lipase display on the cell surface.

또한, 본 발명에서 제작된 시스템이 기존에 보고된 세포표면 발현시스템에 사용된 OprF 및 FadL의 모체로 형질전환된 균주 XL1-Blue (pTrcOprFPL), XL1-Blue (pTrcFadLPL), XL10-Gold (pTrcOprFPL), XL10-Gold (pTrcFadLPL), W3110 (pTrcOprFPL), 및 W3110 (pTrcFadLPL)에 비해 훨씬 효율적으로 리파제를 발현시킴을 알 수 있었다.In addition, the strains of the present invention were transformed into the parent of OprF and FadL used in the previously reported cell surface expression system, XL1-Blue (pTrcOprFPL), XL1-Blue (pTrcFadLPL), XL10-Gold (pTrcOprFPL) It was found that lipase expression was much more efficient than XL10-Gold (pTrcFadLPL), W3110 (pTrcOprFPL), and W3110 (pTrcFadLPL).

리파제가 표면발현된 재조합 균주의 리파제 활성Lipase Activity of Recombinant Strains with Lipase Surface Expression 균주명Strain name 리파제특이활성(U/mg동결건조세포)Lipase Specific Activity (U / mg Lyophilized Cells ) 레퍼런스reference XL1-BlueXL1-Blue 00 XL1-Blue (pTrcYR232PL)XL1-Blue (pTrcYR 232 PL) 4340 ±1214340 ± 121 XL1-Blue (pTrcYR181PL)XL1-Blue (pTrcYR 181 PL) 177 ±9177 ± 9 XL1-Blue (pTrcYPL)XL1-Blue (pTrcYPL) 18 ±2.8318 ± 2.83 XL1-Blue (pTrcOprFPL)XL1-Blue (pTrcOprFPL) 206 ±18206 ± 18 Lee et al., 2005Lee et al., 2005 XL1-Blue (pTrcFadLPL)XL1-Blue (pTrcFadLPL) 240 ±17240 ± 17 Lee et al., 2004Lee et al., 2004 XL10-GoldXL10-Gold 00 XL10-Gold (pTrcYR232PL)XL10-Gold (pTrcYR 232 PL) 7440 ±2777440 ± 277 XL10-Gold (pTrcYR181PL)XL10-Gold (pTrcYR 181 PL) 3230 ±1213230 ± 121 XL10-Gold (pTrcYPL)XL10-Gold (pTrcYPL) Cell lysisCell lysis XL10-Gold (pTrcOprFPL)XL10-Gold (pTrcOprFPL) 378 ±35378 ± 35 Lee et al., 2005Lee et al., 2005 XL10-Gold (pTrcFadLPL)XL10-Gold (pTrcFadLPL) 243 ±33243 ± 33 Lee et al., 2004Lee et al., 2004 W3110W3110 00 W3110 (pTrcYR232PL)W3110 (pTrcYR 232 PL) 2427 ±922427 ± 92 W3110 (pTrcYR181PL)W3110 (pTrcYR 181 PL) 767 ±27767 ± 27 W3110 (pTrcYPL)W3110 (pTrcYPL) Cell lysisCell lysis W3110 (pTrcOprFPL)W3110 (pTrcOprFPL) Cell lysisCell lysis Lee et al., 2005Lee et al., 2005 W3110 (pTrcFadLPL)W3110 (pTrcFadLPL) 176 ±38176 ± 38 Lee et al., 2004Lee et al., 2004

실시예 5: 고체 평판 위에서의 세포표면에 발현된 리파제의 활성 확인Example 5: Confirmation of activity of lipase expressed on cell surface on solid plate

대장균 세포표면 발현된 리파제가 활성을 가지는지 여부를 확인 하기 위해서, 실시예 3에서 제조된 형질전환균주 XL1-Blue (pTrcYR232PL), XL1-Blue (pTrcYR181PL), XL10-Gold (pTrcYR232PL), XL10-Gold (pTrcYR181PL), W3110 (pTrcYR232PL), 및 W3110 (pTrcYR181PL)을 엠피실린(50㎍/L), 1 mM IPTG과 트리뷰티린(1% v/v)이 첨가된 고체 LB 평판배지에서 배양하였다. 하지만, 형질전환균주 XL1-Blue (pTrcYPL), XL10-Gold (pTrcYPL), W3110 (pTrcYPL)들은 세포 용해 및 리파제 활성이 낮은 이유로 더 이상 추가 실험을 진행하지 않았다. 20시간 경과 후, 리파제 활성으로 인하여 배지에 투명한 구역(clear zone)가 생성되었다 (도 3). 대조균 XL1-Blue (pTrcYE)는 세포 주위에 투명한 구역이 생성되지 않았다.
To confirm whether E. coli cell surface expressed lipase has activity, the transforming strains XL1-Blue (pTrcYR 232 PL), XL1-Blue (pTrcYR 181 PL), XL10-Gold (pTrcYR 232 ) prepared in Example 3 PL), XL10-Gold (pTrcYR 181 PL), W3110 (pTrcYR 232 PL), and W3110 (pTrcYR 181 PL) were treated with empicillin (50 μg / L), 1 mM IPTG and tributyrin (1% v / v) Cultured in the added solid LB plate medium. However, the transgenic strains XL1-Blue (pTrcYPL), XL10-Gold (pTrcYPL), and W3110 (pTrcYPL) no longer performed further experiments due to low cell lysis and lipase activity. After 20 hours, the lipase activity produced a clear zone in the medium (FIG. 3). Control XL1-Blue (pTrcYE) did not produce a clear zone around the cells.

실시예 6: Western blot 실험을 통한 외래 단백질 리파제의 세포표면 발현 확인Example 6: Confirmation of cell surface expression of foreign protein lipase by Western blot experiment

외래 단백질 리파제가 세포 표면에 정확히 위치하는지를 확인하기 위하여, 세포의 외막 단백질만을 분리하여 FLAG 꼬리를 인식하는 항체를 이용하여 Western blot 분석을 수행하였다. 실시예 3에서 제조된 형질전환균주 XL1-Blue (pTrcYR232PLFG), XL1-Blue (pTrcYR181PLFG), XL10-Gold (pTrcYR232PLFG), XL10-Gold (pTrcYR181PLFG), W3110 (pTrcYR232PLFG), 및 W3110 (pTrcYR181PLFG)을 엠피실린(50㎍/L)이 첨가된 100 mL의 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 흡광도가 0.4일 때 1 mM IPTG를 첨가하여 리파제 유전자 발현을 유도하였다. 발현유도 4시간 경과 후, 4℃, 6000 rpm에서 5분 동안 배양액을 원심분리 하여 세포를 수득하고, 실시예 1과 같은 방법으로 외막 단백질을 분리하였다. 이들 외막 단백질을 10% SDS-PAGE를 이용하여 분자량 크기별로 분리한 후, PVDF 막에 이동시켜서 3 wt% BSA가 첨가된 PBS용액에 1:500의 비율로 1차 항체인 mouse anti-FLAG 항체 (monoclonal ANTI-FLAG M2; Sigma-Aldrich, Inc., cat. F1804)를 첨가한 후, 실온(room temperature)에서 1시간 배양하였다. PBS용액으로 5번 세척한 후, horseradish peroxidase가 컨쥬게이트된 2차 항체 goat anti-mouse IgG (Invitrogen Corp., cat. AMI3404)를 1:20,000의 비율로 첨가해준 후, 실온에서 1시간 배양하였다. 반응하지 않은 2차 항체를 제거하기 위하여, PBS용액으로 5번 세척한 후, ECL(enhanced chemiluminescence) 키트(GE Healthcare) 용액의 화학반응을 통하여 발생하는 빛을 필름에 노출하여 사진을 획득하였다. 그 결과, 정확히 리파제가 세포표면에 발현된 것을 확인하였다 (도 4).
In order to confirm that the foreign protein lipase is correctly located on the cell surface, Western blot analysis was performed using an antibody that recognizes the FLAG tail by separating only the outer membrane protein of the cell. Transformation strain XL1-Blue (pTrcYR 232 PLFG), XL1-Blue (pTrcYR 181 PLFG), XL10-Gold (pTrcYR 232 PLFG), XL10-Gold (pTrcYR 181 PLFG), W3110 (pTrcYR 232 PLFG) prepared in Example 3 ), And W3110 (pTrcYR 181 PLFG) were inoculated in 100 mL LB liquid medium to which empicillin (50 μg / L) was added and incubated at 37 ° C. The lipase gene expression was induced by adding 1 mM IPTG when the absorbance measured at 600 nm with a spectrophotometer was 0.4. After 4 hours of expression induction, the cells were obtained by centrifuging the culture solution at 4 ° C. and 6000 rpm for 5 minutes, and outer membrane proteins were isolated in the same manner as in Example 1. These outer membrane proteins were separated by molecular weight size using 10% SDS-PAGE, and then transferred to PVDF membranes. The mouse anti-FLAG antibody (the primary antibody in the ratio of 1: 500 in PBS solution added with 3 wt% BSA) was used. monoclonal ANTI-FLAG M2; Sigma-Aldrich, Inc., cat.F1804) was added and incubated for 1 hour at room temperature. After washing five times with PBS solution, the horseradish peroxidase conjugated secondary antibody goat anti-mouse IgG (Invitrogen Corp., cat. AMI3404) was added in a ratio of 1: 20,000, and then incubated at room temperature for 1 hour. In order to remove the unreacted secondary antibody, after washing five times with PBS solution, the light generated through the chemical reaction of the enhanced chemiluminescence (ECL) kit (GE Healthcare) solution was exposed to the film to obtain a photograph. As a result, it was confirmed that the lipase was correctly expressed on the cell surface (FIG. 4).

실시예 7: pH 변화에 따른 세포표면에 발현된 리파제 활성의 영향Example 7: Effect of Lipase Activity Expressed on Cell Surface with pH Change

실시예 3에서 제작된 형질전환균주 중에서 리파아제의 효율이 가장 우수한 XL10-Gold (pTrcYR232PL)를 이용하여 외부의 pH 변화에 따른 세포표면에 발현된 리파제 활성의 영향을 조사하였다. 실시예 4과 동일한 방법으로 수득한 세포를 동일한 온도 (37℃)에서 다양한 pH값의 50 mM Tris-HCl (pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12)가 첨가된 기질용액을 사용하여 리파제 활성을 실시예 4에 나타낸 것과 동일한 방법으로 측정하였다. 도 5에서 Y축의 상대적 활성도(relative activity)는 37℃, pH 8.0에서 리파제 활성도를 100%로 할 때의 상대적인 값을 의미한다. 그 결과, pH 10에서 가장 높은 리파제 활성을 나타내었다 (도 5).
The effect of lipase activity expressed on the surface of the cell according to external pH change was investigated using XL10-Gold (pTrcYR 232 PL), the most efficient lipase among the transformed strains prepared in Example 3. Cells obtained by the same method as in Example 4 were added with 50 mM Tris-HCl (pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) at various pH values at the same temperature (37 ° C). Lipase activity was measured using the same method as shown in Example 4. In Figure 5, the relative activity (relative activity) of the Y axis means a relative value when the lipase activity at 100% at 37 ℃, pH 8.0. As a result, it showed the highest lipase activity at pH 10 (FIG. 5).

실시예 8: 온도 변화에 따른 세포표면에 발현된 리파제 활성의 영향Example 8 Influence of Lipase Activity Expressed on Cell Surface by Temperature Change

실시예 3에서 제작된 형질전환균주 중에서 리파아제 효율이 가장 우수한 XL10-Gold (pTrcYR232PL)를 이용하여 외부의 온도 변화에 따른 세포표면에 발현된 리파제 활성의 영향을 조사하였다. 실시예 4과 동일한 방법으로 수득한 세포를 동일한 pH 8 조건에서 다양한 온도 16℃, 30℃, 37℃, 40℃, 45℃, 55℃, 65℃, 75℃에서 리파제 활성을 실시예 4에 나타낸 것과 동일한 방법으로 측정하였다. 도 6에서 Y축의 상대적 활성도(relative activity)는 37℃, pH 8.0에서 리파제 활성도를 100%로 할 때의 상대적인 값을 의미한다. 그 결과, 온도 40℃에서 가장 높은 리파제 활성을 나타내었다 (도 6).
The effect of lipase activity expressed on the surface of the cell according to the external temperature change was investigated using XL10-Gold (pTrcYR 232 PL), which has the highest lipase efficiency among the transformed strains prepared in Example 3. The cells obtained in the same manner as in Example 4 were shown in Example 4 to show lipase activity at various temperatures of 16 ° C., 30 ° C., 37 ° C., 40 ° C., 45 ° C., 55 ° C., 65 ° C., and 75 ° C. under the same pH 8 conditions. It was measured in the same way as. In Figure 6, the relative activity (relative activity) of the Y axis means a relative value when the lipase activity at 100% at 37 ℃, pH 8.0. As a result, the highest lipase activity was shown at a temperature of 40 ° C. (FIG. 6).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

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Claims (10)

표면발현모체로 서열번호 9의 아미노산 서열에서 232 번째 아미노산 이후의 C-말단 또는 181 번째 아미노산 이후의 C-말단이 제거된 YiaT 단백질을 코딩하는 유전자와 목적단백질을 코딩하는 유전자가 융합단백질 형태로 발현되도록 결합된 DNA를 포함하는 목적단백질의 표면발현 벡터.
In the surface expression parent, the gene encoding the YiaT protein from which the C-terminal after the 232th amino acid or the C-terminal after the 181th amino acid is removed from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and the gene encoding the protein of interest are expressed in the form of a fusion protein. Surface expression vector of the protein of interest comprising DNA bound as possible.
삭제delete 삭제delete 제1항의 벡터로 형질전환된 세포.
A cell transformed with the vector of claim 1.
제4항의 형질전환된 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 목적단백질을 세포 표면에 발현시키는 방법.
A method for expressing a protein of interest on a cell surface, comprising culturing the transformed cell of claim 4.
다음 단계를 포함하는 목적단백질을 세포표면에 발현시키는 방법:
(a) 표면발현모체로 서열번호 9의 아미노산 서열에서 232 번째 아미노산 이후의 C-말단 또는 서열번호 9의 181 번째 아미노산 이후의 C-말단이 제거된 YiaT 단백질을 코딩하는 유전자와 목적단백질을 코딩하는 유전자가 융합단백질 형태로 발현되도록 결합된 DNA를 포함하는 목적단백질의 표면발현 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 표면발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 단계; 및
(c) 상기 형질전환된 세포를 배양하여 목적단백질을 표면발현시키는 단계.
A method of expressing a protein of interest on a cell surface comprising the following steps:
(a) a gene for encoding a YiaT protein and a target protein encoding the C-terminal after the 232rd amino acid or the C-terminal after the 181th amino acid of SEQ ID NO: 9 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 Preparing a surface expression vector of a protein of interest comprising DNA bound to express the gene in the form of a fusion protein;
(b) transforming the surface expression vector into a host cell; And
(c) culturing the transformed cells to surface express the protein of interest.
삭제delete 삭제delete 다음 단계를 포함하는 목적단백질의 개량방법:
(a) 목적단백질을 코딩하는 유전자의 변이체 라이브러리를 구축하는 단계;
(b) 상기 목적단백질의 변이체가 서열번호 9의 아미노산 서열에서 232 번째 아미노산 이후의 C-말단 또는 서열번호 9의 181 번째 아미노산 이후의 C-말단이 제거된 YiaT 단백질과 융합된 상태로 발현되도록 목적단백질의 유전자 변이체 라이브러리와 서열번호 9의 아미노산 서열에서 232 번째 아미노산 이후의 C-말단 또는 서열번호 9의 181 번째 아미노산 이후의 C-말단이 제거된 YiaT 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 유전자 재조합체를 제작하는 단계;
(c) 상기 유전자 재조합체 또는 상기 유전자 재조합체를 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계;
(d) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 상기 유전자 변이체 라이브러리를 세포표면에 발현하는 단계; 및
(e) 개량된 형질을 갖는 목적단백질이 발현된 세포를 스크리닝하는 단계.
Method for improving the protein of interest comprising the following steps:
(a) constructing a variant library of genes encoding the protein of interest;
(b) wherein the variant of the protein of interest is expressed in a fused state with the Y-T protein from which the C-terminal after the 232th amino acid or the C-terminal after the 181th amino acid of SEQ ID NO: 9 is removed from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 A gene recombinant containing a gene variant library of proteins and a gene encoding the YiaT protein from which the C-terminal after the 232th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or the C-terminal after the 181th amino acid of SEQ ID NO: 9 is removed; Manufacturing step;
(c) transforming the host cell with the genetic recombinant or a vector comprising the genetic recombinant;
(d) culturing the transformed host cell to express the gene variant library on a cell surface; And
(e) screening cells expressing the protein of interest with improved traits.
제9항에 있어서, 상기 스크리닝 단계는 목적단백질의 활성, 목적단백질에 라벨링된 물질을 인식하는 단백질, 목적단백질에 결합하는 라벨링된 리간드 또는 목적단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 개량방법.The method of claim 9, wherein the screening step is characterized in that the activity of the protein of interest, a protein that recognizes the substance labeled with the protein of interest, a labeled ligand that binds to the protein of interest or an antibody that specifically binds to the protein of interest Method of improving protein.
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