KR100742218B1 - Secretion of recombinant target protein in Escherichia coli using the secretion signal of organophosphorus hydrolase having twin arginine translocation pathway - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Flavobacterium sp. 유래의 유기인 가수분해효소인 OPH(organophosphorus hydrolase)의 분비서열이 tat(twin arginine translocation) 경로의 분비서열임을 증명하고 이를 대장균에서 목적단백질의 세포간극으로의 분비에 활용하는 기술에 관한 것이다.The present invention is Flavobacterium sp. The secretory sequence of the organophosphorus hydrolase (OPH), which is an organic hydrolase derived from, is a secretory sequence of the tat (twin arginine translocation) pathway and relates to a technique for utilizing it for secretion of the target protein from the E. coli into the cell gap.
OPH(organophosphorus hydrolase), tat(twin arginine translocation) 경로, 대장균, 외래 단백질 OPO (organophosphorus hydrolase), tat (twin arginine translocation) pathway, E. coli, foreign protein
Description
도 1은 미생물에서 세포간극단백질의 분비경로인 sec 분비경로와 tat 분비경로를 도식적으로 나타낸 도면, 1 is a schematic diagram illustrating the secretion pathway of sec and tat secretion pathways of the intercellular protein secretion in microorganisms,
도 2은 PelB 분비서열, TorA 분비서열, OPH 분비서열의 아미노산 서열을 도식적으로 나타낸 도면, 2 is a diagram schematically showing the amino acid sequence of the PelB secretion sequence, TorA secretion sequence, OPH secretion sequence,
도 3는 본 발명에서 사용된 각 프라이머 서열과 OPH 분비서열의 서열목록을 나타낸 도면, Figure 3 shows a sequence listing of each primer sequence and OPH secretion sequence used in the present invention,
도 4는 GFP를 세포간극으로 분비 및 발현시키는 벡터들을 도식적으로 나타낸 도면, 4 is a schematic representation of vectors that secrete and express GFP into the cell gap;
도 5는 도 3내 각 발현 균주들의 GFP 녹색형광 활성을 UV하에서 비교한 도면, 5 is a diagram comparing the GFP green fluorescent activity of each of the expression strains in Figure 3 under UV,
도 6은 도 3내 각 균주들의 발현, 용해도 및 발현위치를 도시한 웨스턴 블롯 사진이다. Figure 6 is a Western blot picture showing the expression, solubility and expression position of each strain in Figure 3.
본 발명은 tat(twin arginine translocation) 분비경로를 가지는 OPH(organophosphorus hydrolase) 분비서열을 이용한 대장균에서의 목적 외래 단백질 분비기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Flavobacterium sp. 유래의 유기인 가수분해효소인 OPH 분비서열이 tat 경로의 분비서열임을 증명하고 이를 대장균에서 외래 단백질의 세포간극 (periplasmic space)으로의 분비에 활용하는 하는 기술에 관한 것이다.The present invention relates to a target foreign protein secretion technology in Escherichia coli using OPH (organophosphorus hydrolase) secretion sequence having a tat (twin arginine translocation) secretion pathway, and more specifically, Flavobacterium sp. The present invention relates to a technique for demonstrating that the secreted sequence of OPH, an organic hydrolase derived from the tat pathway, is used for secreting foreign proteins from the E. coli into the periplasmic space.
외래 단백질을 대장균에서 발현시킬 때 단백질의 분리정제를 용이하게 하기 위한 목적으로 (J.J. Pierce 등, 2002, Journal of Biotechnology, 92, 205-215; A.P. Pugsley 등, 1985, FEBS Microbiology Review, 32, 3-38; J.-M. Nicaud 등, 1986, Journal of Biotechnology, 3, 255-270; F. Baneyx 등, 1991, Journal of bacteriology, 173, 2696-2703) 또는 특정 기질에 대한 전세포 반응활성을 높이기 위한 경우 목적단백질을 분비시켜서 발현시킨다 (D.G. Kang 등, 2005, Journal of Biotechnology, 118, 379-385). For the purpose of facilitating the isolation and purification of proteins when expressing foreign proteins in E. coli (JJ Pierce et al., 2002, Journal of Biotechnology , 92, 205-215; AP Pugsley et al., 1985, FEBS Microbiology Review , 32, 3- 38; J.-M. Nicaud et al., 1986, Journal of Biotechnology , 3, 255-270; F. Baneyx et al., 1991, Journal of bacteriology , 173, 2696-2703) or enhancing whole cell response to specific substrates. For example, the target protein is secreted and expressed (DG Kang et al., 2005, Journal of Biotechnology , 118, 379-385).
대장균에서 목적단백질을 세포간극으로 분비시키기 위해서는 분비서열 (signal sequence or secretion sequence)을 목적단백질의 N-말단에 융합시켜 주어야 한다 (R. Yvonne 등, 1997, Journal of Bacteriology, 179, 5333-5339). 대장균에서 일반적으로 이용되는 분비서열은 약 20~29 아미노산으로 이루어진 일반분비경로인 general secretion pathway (sec)의 분비서열이다. 이러한 분비서열은 양성전 하를 띄고 있는 N-말단 부분, 무극성인 (hydrophobic) 중앙부분, 그리고 특정의 분비서열 분해효소 (leader sequence protease)에 의해 잘려져 나가는 C-말단 부분으로 구성되어 있다. In order to secrete the target protein into the cell gap in E. coli, the secretion sequence (signal sequence or secretion sequence) must be fused to the N-terminus of the target protein (R. Yvonne et al., 1997, Journal of Bacteriology , 179, 5333-5339). . The secretion sequence commonly used in Escherichia coli is the secretion sequence of the general secretion pathway (sec), a general secretion pathway consisting of about 20 to 29 amino acids. These secretion sequences consist of a positively charged N-terminal part, a hydrophobic central part, and a C-terminal part that is cut off by a specific leader sequence protease.
이러한 sec 분비경로의 분비서열을 목적단백질에 융합시켜서 발현시켜주게 되면 세포간극으로의 목적단백질 분비가 일어나게 되는데, 그 기작은 도 1에 도시한 바와 같다. 도 1에서 보듯이, 단백질이 번역과 동시에 접힘(folding)을 거치지 않고 바로 미성숙 형태 (premature form)로 세포간극으로 분비가 일어난다. 단백질의 분비가 끝난 다음 분비서열에 대한 특정 분비서열 분해효소에 의해 분비서열이 잘려져 나가게 되고 목적단백질의 접힘은 세포간극에서 일어난다 (A.P. Pugsley, 1993, Microbiology Review, 57, 50-108). When the secretion sequence of the sec secretion pathway is fused to the target protein and expressed, secretion of the target protein into the cell gap occurs, the mechanism of which is shown in FIG. 1. As shown in Figure 1, the protein is secreted into the cell gap in the premature form (premature form) without going through the folding (folding) at the same time. After the secretion of the protein, the secretory sequence is truncated by specific secretory enzymes for the secretion sequence and the folding of the target protein occurs in the cell gap (AP Pugsley, 1993, Microbiology Review , 57, 50-108).
Sec 분비경로의 이러한 특성 때문에 sec 분비서열을 이용해 분비시킬 때는 세포간극에서 접힘이 일어나는 단백질이어야 한다. 따라서, 세포간극에서 접힘이 일어나지 않는 단백질, 조효소를 필요로 하는 단백질, 그리고 세포내에서 다중체를 구성하여 분비되는 단백질 등은 sec 분비서열을 이용하여 분비가 불가능하다. Because of this characteristic of the secretory secretion pathway, when secreted using the sec secretion sequence, it must be a protein that causes folding in the cell gap. Therefore, proteins that do not fold in the cell gap, proteins requiring coenzymes, and proteins secreted by constituting multiplexes in cells are not secreted using the sec secretion sequence.
최근 몇 년 동안 sec 분비경로와는 다른 분비경로가 발견되었는데 이 분비경로에서는 sec 분비경로와는 달리 단백질의 접힘이 셀 내에서 일어나고 이렇게 접힌 단백질이 세포간극으로 분비된다 (도 1; C. Robinson 등, 2001, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2, 350-356; B.C. Berks, 1996, Molecular Microbiology, 22, 393-404; B.C. Berks 등, 2001, Current Opinion in Microbiology, 8, 174-181). 이 경로의 분비서열에는 twin arginine (RR)서열이 있는데 이러한 서열의 특 성 때문에 이 분비경로의 이름을 twin arginine translocation (tat) 분비경로라 부른다. tat 분비경로는 접힌 단백질을 분비시킬 수 있다는 특성 때문에 많은 관심을 받고 연구되어 왔다. In recent years, a secretory pathway has been found that is different from the sec secretion pathway, where, unlike the sec secretion pathway, protein folding occurs within the cell and the folded protein is secreted into the cell gap (FIG. 1; C. Robinson et al. , 2001, Nature Reviews Molecular Cell Biology , 2, 350-356; BC Berks, 1996, Molecular Microbiology , 22, 393-404; BC Berks et al., 2001, Current Opinion in Microbiology , 8, 174-181). The secretory sequence of this pathway is the twin arginine (RR) sequence. Due to the nature of this sequence, the secretory pathway is called the twin arginine translocation (tat) secretory pathway. The tat secretion pathway has received much attention and research because of its ability to secrete folded proteins.
대장균에서 발견된 timethylamine N-oxide (TMAO) reductase (TorA) 는 이러한 tat 분비경로에 의해 세포간극으로 분비가 일어남이 보고되어 있다. TorA 의 분비서열을 리포터로서 발현확인이 용이하고 세포간극에서 접힘이 일어나지 않는 특성을 가진 녹색형광단백질 (GFP)에 융합시켰을 때 GFP가 세포간극에 분비되어 녹색형광 활성을 나타낸다고 보고되었다 (F. Sargent, 2001, Trends in Microbiology, 9, 196-198). 따라서 tat 분비경로를 가지는 TorA의 분비서열은 sec 분비경로의 분비서열에 의해 분비가 어려운 목적단백질의 대장균에서의 분비에 사용되고 있다.Timethylamine N-oxide (TMAO) reductase (TorA) found in Escherichia coli has been reported to be secreted into the cell gap by this tat secretion pathway. It has been reported that GFP is secreted into the cell gap and exhibits green fluorescence activity when it is fused to the green fluorescent protein (GFP), which has a characteristic of confirming the expression of TorA as a reporter and does not cause folding in the cell gap (F. Sargent). , 2001, Trends in Microbiology , 9, 196-198). Therefore, the secretion sequence of TorA with tat secretion pathway is used for secretion of E. coli of the target protein, which is difficult to secrete by the secretion sequence of sec secretion pathway.
Flavobacterium sp.에서 발견된 유기인 가수분해효소 organohosphorus hydrolase (OPH)는 세포막에 발현되는 단백질로서 중앙에 금속 조효소를 가진 단일 이중체의 구조를 갖는 단백질이다 (K. Lai 등, 1995, Archieves of Biochemistry and Biophysics, 318, 59-64). 이러한 OPH에는 N-말단 부분에 분비서열을 가지고 있는데, 이 분비서열이 대장균에서는 작용하지 않는다고 보고되어 있다 (C.S. McDaniel 등, 1988, Journal of Bacteriology, 170, 2306-2311). The organophosphatase organohosphorus hydrolase (OPH), found in Flavobacterium sp., Is a protein expressed in cell membranes and has a structure of a single duplex with a metal coenzyme in the center (K. Lai et al., 1995, Archieves of Biochemistry and Biophysics , 318, 59-64). These OPHs have secretory sequences at the N-terminus, which have been reported to not work in Escherichia coli (CS McDaniel et al., 1988, Journal of Bacteriology , 170, 2306-2311).
이에, 본 발명자들은 도 2에서 확인할 수 있듯이, OPH 분비서열의 서열내에 트윈 아르기닌 특색인 S-R-R-x-F-L-K와 유사한 트윈 아르기닌(RR) 서열을 가지고 있다는데 착안하여 외래 단백질을 효과적으로 재조합 대장균의 세포 밖으로 분비할 수 있는 신호서열인지에 대한 탐색을 수행한 결과, OPH 분비서열이 tat 경로의 분비서열임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. Therefore, the inventors of the present invention have shown that the twin arginine (RR) sequence similar to the SRRxFLK characteristic of the twin arginine in the sequence of the OPH secretion sequence is conceived, and thus a signal capable of effectively secreting foreign proteins out of the cells of recombinant E. coli. As a result of searching whether the sequence was confirmed, it was confirmed that the OPH secretion sequence is the secretion sequence of the tat pathway, and thus, the present invention was completed.
즉, 본 발명의 목적은 OPH 분비서열이 tat 분비경로의 분비서열임을 확인하고 새로운 tat 분비서열로서의 정보를 제공하는 것이다.That is, an object of the present invention is to confirm that the OPH secretion sequence is the secretion sequence of the tat secretion pathway and to provide information as a new tat secretion sequence.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 분비서열을 GFP를 비롯한 여러 목적단백질의 분비에 응용하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method of applying the secretion sequence of the present invention to the secretion of various target proteins, including GFP.
본 발명에 의하면, Tat(twin arginine translocation) 분비경로의 분비서열로서의 OPH(organophosphorus hydrolase) 분비서열의 용도가 제공된다. According to the present invention, there is provided the use of an organophosphorus hydrolase (OPH) secretion sequence as a secretion sequence of a Tat (twin arginine translocation) secretion pathway.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 대장균내에서 분비서열을 융합시켜 외래 단백질을 세포간극으로 분비하는 방법에 있어서, 상기 분비서열로는 제1항의 OPH 분비서열을 이용하여 접힌 단백질을 세포간극으로 분비하는 것을 특징으로 하는 대장균내에서 외래 단백질을 세포간극으로 분비하는 방법이 제공된다. According to another aspect of the present invention, in a method for fusion of secretion sequences in Escherichia coli to secrete foreign proteins into the cell gap, the secretion sequences secrete the folded protein into the cell gap using the OPH secretion sequence of
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
우선, 도 2를 참조하여, OPH 분비서열의 서열을 살펴보면 서열 내에 twin arginine consensus motif (S-R-R-x-F-L-K)와 유사한 twin arginine(RR) 서열을 가지고 있다. 본 발명에서는 상기 분비서열이 tat 분비서열인지 확인하고 대장균에서의 목적단백질의 분비에 응용하기 위하여 실험을 수행하였다. 목적단백질로서는 sec 분비서열에 의해서는 세포간극에서 분비 후 접힘이 일어나지 않아 활성을 보이지 않는 GFP를 이용하였고, GFP의 N-말단에 OPH 분비서열을 융합시켜 발현시킨 결 과 GFP가 세포간극으로 분비가 일어났고 성공적인 녹색형광 활성을 보였다. First, referring to FIG. 2, the OPH secretion sequence has a twin arginine (RR) sequence similar to the twin arginine consensus motif (S-R-R-x-F-L-K) in the sequence. In the present invention, an experiment was performed to determine whether the secretory sequence is the tat secretory sequence and to apply it to secretion of the target protein in Escherichia coli. As the target protein, GFP was used because of sec secretion sequence and secretion did not occur after secretion in the cell gap, and GFP was secreted into the cell gap as a result of fusion of OPH secretion sequence to the N-terminus of GFP. Arose and showed successful green fluorescence activity.
따라서, OPH 분비서열이 tat 분비서열인지 확인하였고 OPH 의 분비서열이 대장균 TorA 분비서열과 마찬가지로 sec 분비서열에 의해 분비시킬 수 없는 재조합 목적단백질의 대장균에서의 분비에 응용할 수 있음을 입증하였다.Therefore, it was confirmed that the OPH secretion sequence was the tat secretion sequence and demonstrated that the secretory sequence of OPH can be applied to the secretion of E. coli of a recombinant target protein that cannot be secreted by the sec secretion sequence as with the Escherichia coli TorA secretion sequence.
보다 구체적으로, 본 발명에서 OPH 분비서열로서 플라보박테리움 에스피.(Flavobacterium sp.)에서 발견된 유기인 가수분해효소인 OPH의 N-말단 부분에 존재하는 분비서열을 준비하였다(서열번호 7). More specifically, in the present invention, the secretion sequence present in the N-terminal part of OPH, which is an organophosphatase found in Flavobacterium sp. , Was prepared as the OPH secretion sequence (SEQ ID NO: 7). .
이때 외래 단백질로는 세포간극에서 접힘이 일어나지 않는 단백질, 조효소를 필요로 하는 단백질, 그리고 세포내에서 다중체를 구성하여 분비되는 단백질등 종래 sec 분비경로를 이용하여 분비가 불가능한 단백질을 의미한다. At this time, the foreign protein refers to a protein that cannot be secreted by using a conventional sec secretion pathway, such as a protein that does not occur in a cell gap, a protein that requires coenzymes, and a protein that is secreted by forming multiplexes in a cell.
상기한 분비서열의 분비 효율을 알아보기 위하여, T7 프로모터를 이용하여 벡터를 제조하였다. 이때 T7 프로모터는 단백질 발현시 발현되어 단백질의 분비에 영향을 줄 수 있으므로 pTrc 프로모터로 바꾸어 pTrcPeIB 벡터를 제조하였다. In order to determine the secretion efficiency of the secretion sequence, a vector was prepared using the T7 promoter. At this time, since the T7 promoter may be expressed during protein expression and affect protein secretion, the T7 promoter was converted to the pTrc promoter to prepare a pTrcPeIB vector.
이같이 제조된 pTrcPeIB 벡터에 상기 OPH 분비 서열을 근거로 하여 프라이머 OPHSS-N(서열번호 5)와 OPHSS-C(서열번호 6)을 제작한 뒤 PCR하여 증폭시키고, 증폭된 분비서열의 유전자를 pTrcPeIB 벡터의 NdeI과 NcoI 제한 효소 자리에 삽입하여 pTrcOPHSS를 제작하였다. 한편, 목적 단백질로는 sec 분비서열에 의해서는 세포 간극에서 분비후 접힘이 일어나지 않아 활성을 보이지 않는 GFP를 이용하였다. The primers OPHSS-N (SEQ ID NO: 5) and OPHSS-C (SEQ ID NO: 6) were prepared on the pTrcPeIB vector prepared on the basis of the OPH secretion sequence, and then amplified by PCR. The genes of the amplified secretion sequence were pTrcPeIB vectors. PTrcOPHSS was prepared by inserting NdeI and NcoI restriction enzyme sites. On the other hand, the target protein GFP was used because the secretion does not show the folding after secretion in the cell gap by sec secretion sequence.
즉, 상기에서 제조된 벡터에 GFP 유전자를 세포내에 발현시키는 벡터인 pTG 벡터로부터 NcoI와 HindIII로 GFP 유전자를 잘라낸 뒤 pTrcOPHSS 벡터들의 NcoI와 HindIII 제한효소 자리에 각각 삽입하여 GFP를 세포간극으로 분비시키는 벡터 pTOG를 제조하였다. 이때 GFP에는 추후 단백질의 발현 확인을 용이하게 하기 위하여 N-말단에 히스티딘 태그(Histidine tag)가 융합되도록 하였다. That is, a vector which cuts the GFP gene with NcoI and HindIII from the pTG vector, which is a vector expressing the GFP gene in the cell, and inserts into the NcoI and HindIII restriction sites of the pTrcOPHSS vectors to secrete GFP into the cell gap. pTOG was prepared. In this case, in order to facilitate expression confirmation of the protein in the future, the histidine tag was fused to the N-terminus.
한편, 본 발명의 분비서열이 우수한 분비효율을 나타내는지 확인하기 위하여, 상기에서 제조된 벡터 pTOG를 대장균에 도입하고 발현유도인자, 예를 들면 IPTG(Isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 발현을 유도한 다음 형질 전환체를 배양시켰다. 이때 리포터로서 발현확인이 용이함과 동시에 세포간극에서 접힘이 일어나지 않는 특성을 가진 녹색형광단백질 (GFP)에 융합시켰을 때 GFP가 세포간극에 분비되면 녹색형광 활성을 나타낸다(F. Sargent, 2001, Trends in Microbiology, 9, 196-198을 참조하라)는 점을 고려하여, 녹색 형광 활성을 측정하여 분비 여부를 확인하였다. On the other hand, in order to confirm that the secretion sequence of the present invention exhibits excellent secretion efficiency, the vector pTOG prepared above is introduced into Escherichia coli and an expression inducing factor such as IPTG (Isopropyl-β-thiogalactoside) is added to induce expression. The transformants were then cultured. At this time, when GFP is secreted into the cell gap when it is fused to the green fluorescent protein (GFP) which is easy to confirm expression as a reporter and has no characteristic of folding in the cell gap, it shows green fluorescent activity (F. Sargent, 2001, Trends in (See Microbiology , 9, 196-198), the green fluorescence activity was measured to determine whether secretion.
상기 단백질은 웨스턴 블롯으로 분석한 결과, OPH 분비서열을 이용하여 외래 단백질을 분비 생산한 경우 세포내 불용성분액내에서는 발현을 보이지 않았고, 전세포 파쇄액 및 세포간극 분액에서 거의 대부분 성숙된 형태의 발현을 보였으며, 특히 세포간극 분액에서 성숙된 크기(최대 28kDa)의 발현을 확인할 수 있었다. As a result of Western blot analysis, when the foreign protein was produced using OPH secretion sequence, the protein was not expressed in the insoluble component solution of the cell, and almost the mature form was expressed in the whole cell lysate and intercellular separation. In particular, the expression of the mature size (up to 28kDa) was confirmed in the intercellular separation.
따라서, 본 발명에 의하면, OPH의 분비서열이 tat 경로의 분비서열인 것을 확인할 수 있을 뿐만 아니라 이를 이용하여 대장균으로부터 외래 단백질을 세포간극으로 분비시킬 경우 대장균 유래의 TorA 분비서열보다 목적 단백질을 더 효율적으로 분비시켜 단백질의 접힘이 효율적으로 일어나는 것을 간접적으로 확인할 수 있었다. Therefore, according to the present invention, the secretion sequence of OPH is not only confirmed that the secretion sequence of the tat pathway, but also by using this to secrete foreign proteins from the E. coli into the intercellular gap, the target protein is more efficient than the E. coli-derived TorA secretion sequence By indirectly confirming that the folding of the protein efficiently occurs.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 이에 한정하려는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention more specifically, but are not intended to limit the present invention to them.
실시예Example
이하 실시예 에서는 녹색형광단백질인 GFP를 대조군인 sec 분비경로의 PelB 분비서열 및 tat 분비경로의 TorA 분비서열과 각각 융합시키고 그리고 OPH 분비서열의 N-말단에 융합시켜서 각 경우에서의 대장균 내 발현위치 및 녹색형광 활성을 비교 분석하였다.In the following Examples, the green fluorescent protein GFP was fused with the PelB secretion sequence of the sec secretion pathway and the TorA secretion sequence of the tat secretion pathway, respectively, and fused to the N-terminus of the OPH secretion sequence, respectively. And green fluorescence activity.
실시예Example 1: 발현벡터 제작 1: Expression Vector Construction
본 실시예에서는 GFP를 세포간극으로 분비시키는 벡터를 제작하는 방법으로써 sec 분비경로의 대조군인 PelB 분비서열과 tat 분비경로의 대조군인 TorA 분비서열을 OPH 분비서열과 함께 유전자 클로닝하여 발현벡터를 제작하였다.In this embodiment, as a method of producing a vector to secrete GFP into the cell gap, an expression vector was prepared by cloning the PelB secretion sequence, the sec secretion pathway control group, and the TorA secretion sequence, the tat secretion pathway control group, together with the OPH secretion sequence. .
먼저, 첫번째 대조군으로 GFP를 세포내 (cytoplasm)에 발현시키는 벡터로는 pTG (D.G. Kang 등, 2002, Applied Microbiology and Biotechnology, 59, 523-528) 벡터를 이용하였다. First, pTG (DG Kang et al., 2002, Applied Microbiology and Biotechnology , 59, 523-528) vector was used as the first control vector expressing GFP into the cytoplasm.
또한, GFP를 세포간극으로 분비시키는 벡터를 제작하기 위하여 sec 분비경로의 분비서열인 PelB 분비서열을 가지고 있는 pET22b(+) (Novagen, 미국)를 이용하여 제작하였다. pET22b(+) 벡터의 프로모터 (promoter)는 T7 프로모터로써 단백질 발현 시 발현되어 단백질의 분비에 영향을 줄 수 있으므로 먼저 프로모터를 pTrc 프로모터로 바꾸어 주었다. In addition, pET22b (+) (Novagen, USA) having a PelB secretion sequence, which is a secretion sequence of the sec secretion pathway, was prepared to produce a vector that secretes GFP into the cell gap. The promoter of the pET22b (+) vector is a T7 promoter, which is expressed during protein expression and may affect the secretion of the protein, so the promoter was first changed to the pTrc promoter.
상기 pTrc 프로모터의 유전자는 pTrcHisC (Invitrogen, 미국)을 주형으로 하여 프라미어 Trc-N (서열번호 1) 과 Trc-C (서열번호 2)를 사용하여 PCR에 의하여 증폭한 뒤, pET22b(+) 벡터의 BglII 과 NdeI 제한효소 자리에 삽입하여 pTrcPelB 벡터를 제작하였다. The gene of the pTrc promoter was amplified by PCR using primers Trc-N (SEQ ID NO: 1) and Trc-C (SEQ ID NO: 2) using pTrcHisC (Invitrogen, USA) as a template, and then the pET22b (+) vector. The pTrcPelB vector was constructed by inserting into BglII and NdeI restriction enzyme sites.
이렇게 제작된 pTrcPelB 벡터에 분비서열을 TorA 분비서열과 OPH 분비서열로 각각 교체해 주기 위하여 먼저, TorA 분비서열은 pETO (D.G. Kang 등, 2005, Journal of Biotechnology, 118, 379-385)를 주형으로 하여 TorASS-N (서열번호 3)과 TorASS-C (서열번호 4)를 이용하여 PCR 증폭하였고, OPH 분비서열은 Flavobacterium sp. (ATCC 27551)의 플라스미드를 주형으로 하여 유전자은행에 나온 서열 (GenBank, M22863)을 근거로 하여 프라이머 OPHSS-N (서열번호 5)와 OPHSS-C (서열번호 6)을 제작한뒤 PCR 하여 증폭하였다. 증폭된 각 분비서열의 유전자들을 pTrcPelB 벡터의 NdeI과 NcoI 제한효소 자리에 삽입하여 각각의 벡터 pTrcTorASS 및 pTrcOPHSS를 제작하였다. In order to replace the secretion sequence with the TorA secretion sequence and the OPH secretion sequence in the pTrcPelB vector thus prepared, the TorA secretion sequence was formed using pETO (DG Kang et al., 2005, Journal of Biotechnology , 118, 379-385). -N (SEQ ID NO: 3) and TorASS-C (SEQ ID NO: 4) were PCR amplified, OPH secretion sequence was Flavobacterium sp. Using the plasmid of (ATCC 27551) as a template, primers OPHSS-N (SEQ ID NO: 5) and OPHSS-C (SEQ ID NO: 6) were prepared and PCR amplified based on the sequence (GenBank, M22863) from the GenBank. . Genes of each secreted sequence amplified were inserted into the NdeI and NcoI restriction enzyme sites of the pTrcPelB vector to prepare the respective vectors pTrcTorASS and pTrcOPHSS.
마지막으로 이렇게 제작된 벡터들에 GFP 유전자를 삽입하기 위하여 먼저 GFP를 세포내에 발현시키는 벡터인 pTG 벡터로부터 NcoI과 HindIII로 GFP 유전자를 잘라낸 뒤 앞에서 제작한 분비벡터들 pTrcPelB, pTrcTorASS, pTrcOPHSS 벡터들의 NcoI과 HindIII 제한효소 자리에 각각 삽입하여 GFP를 세포간극으로 분비시키는 벡터들 pTPG, pTTG, pTOG를 제작하였다 (도 4 참조). 각각의 GFP에는 단백질의 발현 확인을 용이하게 하기 위해 N-말단에 히스티딘 태그 (histidine tag)가 융합되어 있다. Lastly, in order to insert the GFP gene into the thus constructed vectors, first, the GFP gene was cut from the pTG vector, which is a vector expressing GFP in the cell, and the NcoI and the secretion vectors pTrcPelB, pTrcTorASS, and pTrcOPHSS vectors. Vectors pTPG, pTTG, and pTOG were inserted into the HindIII restriction enzyme sites to secrete GFP into the cell gap (see FIG. 4). Each GFP has a histidine tag fused at the N-terminus to facilitate expression confirmation of the protein.
실시예 2: GFP를 발현 및 분비시키는 대장균의 형질전환체 제조Example 2: Transformant Preparation of Escherichia Coli Expressing and Secreting GFP
통상적으로 클로닝으로 많이 쓰이는 대장균 TOP10 (Invitrogen)의 경우와 단백질 발현용으로 사용된 대장균 W3110의 경우 모두 CaCl2 버퍼를 사용하여 반응력있는(competent) 세포를 만든 후 42℃에서 2분간 방치하는 열충격 방법에 의해 플라스미드를 숙주세포에 넣는 방법을 사용하였다. In the case of E. coli TOP10 (Invitrogen), which is commonly used for cloning, and E. coli W3110, which is used for protein expression, both cells were made with CaCl 2 buffer and allowed to stand for 2 minutes at 42 ° C. Was used to put the plasmid into the host cell.
형질전환된 콜로니의 선별은 사용된 플라스미드의 특성상 앰피실린 (ampicillin, Sigma)을 사용하여 수행하였다. Selection of transformed colonies was performed using ampicillin (Sigma) due to the nature of the plasmids used.
실시예 1에서 제작된 벡터들은 널리 이용되는 대장균 발현용 프로모터인 Trc 프로모터를 포함하고 목적단백질의 발현에는 IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside, Sigma, 미국)를 이용하여 발현을 유도하였다.The vectors prepared in Example 1 include the Trc promoter, which is a widely used E. coli expression promoter, and induced expression using IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside, Sigma, USA) for the expression of the target protein.
pTG 가 형질전환된 W3110 대장균은 TG, 그리고 pTPG는 TPG, pTTG는 TTG, pTOG는 TOG로 각각 명명하였다.E. coli transformed with pTG was designated as TG, pTPG as TPG, pTTG as TTG, and pTOG as TOG.
실시예 3: 각 균주들의 GFP 형광활성분석 Example 3: GFP fluorescence activity analysis of each strain
본 실시예에서는 실시예 2에서 제작된 각 균주들에 대해 고체배지에서 배양한 다음 GFP의 발현을 유도한 뒤 UV하에서 녹색형광활성을 나타내는지 비교하여 보 았다.In this example, the strains prepared in Example 2 were cultured in a solid medium, followed by induction of expression of GFP, and then compared to show green fluorescent activity under UV.
각 균주들을 먼저 50 mg/ml 농도의 암피실린이 첨가된 LB-한천 (5g/l 효모 추출물, 10g/l 트립톤, 10g/l NaCl, 20g/l 한천) 플레이트에서 12시간 동안 배양한 뒤 각 콜로니들을 30 ml LB(5g/l 효모 추출물, 10g/l 트립톤, 10g/l NaCl) 배지에 부유시킨 후 부유액을 다시 0.5 mM의 IPTG 가 첨가된 LB-Agar 플레이트에 옮겨서 배양하였다. 12 시간 동안 37℃ 배양기에서 배양한 뒤 플레이트를 UV-발광체상에 올려 놓은 다음 각 균주들의 형광 활성 정도를 비교하고 그 결과를 도 5에 도시하였다.Each strain was first incubated in LB-agar (5g / l yeast extract, 10g / l tryptone, 10g / l NaCl, 20g / l agar) plate to which ampicillin was added at a concentration of 50 mg / ml for 12 hours before each colony. The suspension was suspended in 30 ml LB (5 g / l yeast extract, 10 g / l tryptone, 10 g / l NaCl) medium, and the suspension was transferred to an LB-Agar plate to which 0.5 mM IPTG was added. After incubation in a 37 ° C. incubator for 12 hours, the plate was placed on a UV-luminescent body, and then the degree of fluorescence activity of each strain was compared and the results are shown in FIG. 5.
도 5에서 확인하듯이,TPG를 제외하고는 모두 녹색형광활성을 보였다. 이는 TPG가 sec 분비경로의 PelB 분비서열을 이용해 GFP를 분비시킨 경우이므로 GFP가 sec 분비경로에 의해 분비되어 활성을 가질 수 없다는 기존의 결과와 일치되는 것이다. As shown in Figure 5, except for TPG all showed green fluorescent activity. This is consistent with the existing results that TPG secreted GFP using the PelB secretion sequence of the sec secretion pathway, and therefore GFP was secreted by the sec secretion pathway and thus had no activity.
한편, TTG의 경우 GFP를 tat 분비경로의 TorA 분비서열로 분비시켰기 때문에 GFP가 활성을 보인 것으로 판단된다. 나아가 GFP를 OPH 분비서열로 분비시킨 TOG 또한 GFP 형광활성을 나타내었으므로 OPH 분비서열이 tat 분비경로의 분비서열 임을 확인할 수 있었으며, 따라서 OPH 분비서열을 대장균에서 GFP와 같은 경우의 목적단백질 분비에 응용할 수 있음을 확인하였다.In the case of TTG, GFP was secreted by the TorA secretion sequence of the tat secretion pathway, indicating that GFP was active. Furthermore, the TOG which secreted GFP into the OPH secretion sequence also exhibited GFP fluorescence activity, indicating that the OPH secretion sequence is the secretory sequence of the tat secretory pathway. Confirmed that it can.
실시예 4: 균주들의 배양 및 세포분액 (cell fractionation) 방법Example 4 Cultivation of Strains and Cell Fractionation Methods
실시예 2의 각 균주들을 발현시키는 배지로서 50 mg/ml 농도의 암피실린이 첨가된 LB배지를 이용하였다. 단백질의 발현을 위하여 배양액의 흡광도 (absorbance)가 600nm에서 0.8 정도가 되었을 때 유도물질인 IPTG를 첨가 (1mM) 하였다.LB medium to which ampicillin was added at a concentration of 50 mg / ml was used as a medium for expressing each strain of Example 2. For protein expression, when the absorbance of the culture medium was about 0.8 at 600 nm, IPTG, an inducer, was added (1 mM).
세포를 12시간 동안 37℃ 배양기에서 배양한 뒤 회수하였다. 전세포 및 전세포 파쇄액 (whole cell lysate)은 먼저 회수된 세포를 PBS(phosphate buffered saline)에 부유시킨뒤 이 부유액의 일부를 전세포 시료로 보관하였고 나머지를 초음파 해체기를 이용해 파쇄하였다. 파쇄된 샘플은 전세포 파쇄액 (whole cell lysate)으로 보관하였다. Cells were harvested after incubating for 12 hours in a 37 ° C. incubator. Whole cells and whole cell lysate were first suspended in the recovered cells in phosphate buffered saline (PBS), and then a portion of the suspension was stored as a whole cell sample and the rest was disrupted using an ultrasonic disintegrator. The crushed samples were stored as whole cell lysate.
세포간극 분액 (periplasmic fraction)은 pET 시스템 매뉴얼(Novagen)에 따라 분리시켰다. 먼저 10ml 분량의 배양액을 회수한뒤 1 mL 30 mM 트리스-HCl pH 8.0, 20% 수크로오스에 부유시키고 2 mL 0.5 M EDTA (pH 8.0)를 첨가시켰다. Periplasmic fractions were isolated according to the pET system manual (Novagen). First, a 10 ml portion of the culture was recovered and then suspended in 1 mL 30 mM Tris-HCl pH 8.0, 20% sucrose and 2 mL 0.5 M EDTA (pH 8.0) was added.
그뒤 세포 부유액을 상온에서 10분간 보관한 뒤 10,000 g에서 10분간 원심분리하였고 상등액을 제거하고 침전물을 얼음에서 냉각시킨 5 mM MgSO4 1ml를 첨가한 뒤 얼음에서 10분간 보관하였다. 10분 뒤 다시 원심분리를 이용하여 분리한 뒤 상등액을 세포간극 분액으로 그리고 침전물을 세포내 분액(cytoplasmic fraction)으로 보관하였다. The cell suspension was then stored at room temperature for 10 minutes, centrifuged at 10,000 g for 10 minutes, the supernatant was removed, and the precipitate was added to 1 ml of 5 mM MgSO 4 cooled in ice and then stored for 10 minutes on ice. After 10 minutes, the resultant was separated by centrifugation, and the supernatant was stored as a cell gap and the precipitate was stored as a cytoplasmic fraction.
세포내 분액은 다시 PBS로 부유시킨 후 전세포 파쇄와 동일한 방법으로 세포를 파쇄해준 뒤 원심분리하여 상등액을 세포내 용해성 분액 (cytoplasmic soluble fraction)과 침전물을 세포내 불용성 분액 (cytoplasmic insoluble fraction)으로 나누었다.Intracellular fractions were suspended in PBS again, and then cells were disrupted in the same manner as whole cell disruption, followed by centrifugation to separate the supernatant into cytoplasmic soluble fraction and sediment into cytoplasmic insoluble fraction. .
실시예 5: 각 분액에 대한 웨스턴 블롯Example 5: Western blot for each aliquot
본 실시예에서는 실시예 4에서 분리된 각 분액을 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용해 GFP 발현 및 용해도, 그리고 발현위치를 확인하였다.In this example, the GFP expression and solubility, and the expression position of each aliquot separated in Example 4 were confirmed using Western blot.
먼저 각 분액들을 SDS-PAGE 용 버퍼 (0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 10% 글리세롤, 5% SDS, 5% 베타-메르캅토에탄올, 0.25% 브로모페놀블루)에 희석한 후 100℃에서 5분간 끓여 변성시켰다. 이 시료를 12% SDS-폴리 아크릴아미드 겔에 전기영동한 후 15V 하에서 니트로셀룰로즈 막에 이동시켰고, 항 폴리히스티딘 단위 배위자용 항체를 이용하여 확인하였다. Each aliquot was first diluted in buffer for SDS-PAGE (0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 10% glycerol, 5% SDS, 5% beta-mercaptoethanol, 0.25% bromophenol blue) at 100 ° C. Boil for 5 minutes to denature. This sample was electrophoresed on a 12% SDS-poly acrylamide gel and then transferred to a nitrocellulose membrane under 15 V and identified using an antibody for anti polyhistidine unit ligand.
도 6에 GFP를 세포내에 발현시키는 균주 TG, GFP를 세포간극으로 발현시키는 균주인 TPG, TOG 및 TTG에 대해 전세포 파쇄액, 세포내 불용성분액, 세포간극 분액, 세포내 용해성분액을 웨스턴 블롯한 사진을 도시하였다. 도 6에서 보듯이, GFP를 세포내에 발현시킨 경우 대부분 높은 용해도를 보이며 세포내 용해성 분액에서 발현을 보였으며, 세포간극 분액에서도 검출이 되기는 하였지만 매우 작은 양이고 이는 세포분액 방법의 효율에 따른 문제인 것으로 여겨진다. FIG. 6 shows Western blot of whole cell lysate, intracellular insoluble component, intercellular separation, and intracellular lysing component solution for strains TG expressing GFP intracellularly, TPG, TOG and TTG strains expressing GFP intercellularly. The picture is shown. As shown in FIG. 6, the expression of GFP in the cells showed high solubility and expression in intracellular soluble aliquots, and although it was detected in the intercellular separation, it was a very small amount, which is a problem due to the efficiency of the cell separation method. Is considered.
GFP를 sec 분비경로의 분비서열인 PelB 분비서열로 분비시킨 경우(TPG)에서는 전세포 파쇄액에서 볼 수 있듯이 거의 적은 발현을 보였고, 대부분 불용성 분액에서 발현을 보였다. 이는 세포간극에 단백질의 분비 후 단백질의 접힘이 일어나지 않아 도 5에서 볼 수 있듯이 녹색형광이 보이지 않았고 응집체(inclusion body)로 형성된 것으로 여겨진다. 즉, 세포간극 분액법에 원심분리 과정이 있으므로 세포간극에 발현되었더라도 불용성단백질은 세포내 불용성분액으로 분리되므로 세포간극 분액에서는 단백질이 검출되지 않았다. When GFP was secreted by PelB secretion sequence (sec) of sec secretion pathway (TPG), the expression was almost low, as in whole cell lysate. This is because the folding of the protein does not occur after secretion of the protein in the cell gap, as shown in FIG. 5, the green fluorescence was not seen and is considered to be formed as an inclusion body. That is, since the cell separation method has a centrifugal separation process, insoluble proteins are separated into intracellular insoluble components even though they are expressed in the cell gap, so no protein was detected in the cell separation.
GFP를 OPH 분비서열로 분비시켜준 경우 (TOG)와 TorA 분비서열로 분비시켜준 경우 (TTG)의 2가지 경우는 도 4에서 확인했듯이, 모두 녹색형광 활성을 나타내었을 뿐만 아니라 세포간극 분액에서도 성숙된 크기로 (최대 ~ 28 kDa) 발현을 보였다. Two cases of GFP secretion by OPH secretion sequence (TOG) and TorA secretion sequence (TTG), as shown in FIG. 4, both showed green fluorescence activity and matured in cell gap separation. At maximum size (up to 28 kDa).
그러나, TTG의 경우는 전세포 파쇄액과 세포내 불용성분액에서 볼 수 있듯이 ~32 KDa의 미성숙 (premature) 형태의 발현이 상대적으로 많았다. 이는 단백질의 분비가 완전히 일어나지 않아 세포내에서 응집체를 형성했음을 의미한다. However, TTG was relatively premature (~ 32 KDa), as seen in whole cell lysate and intracellular insoluble components. This means that the secretion of proteins did not occur completely and formed aggregates in the cells.
이에 반해, TOG의 경우는 세포내 불용성분액에서는 거의 발현을 보이지 않았고 전세포 파쇄액 및 세포간극 분액에서 볼 수 있듯이 거의 대부분 성숙된 형태의 발현만 보였다. 따라서 OPH 분비서열의 경우 대장균 유래의 TorA 분비서열 보다도 목적단백질을 더 효율적으로 분비시켜 단백질의 접힘이 효율적으로 일어남을 간접적으로 확인할 수 있었다. In contrast, TOG showed almost no expression in the insoluble components of the cells, and almost all of the mature forms were observed, as can be seen in whole cell lysate and intercellular separation. Therefore, in the case of OPH secretion sequence, it was possible to indirectly confirm that the protein was folded efficiently by secreting the target protein more efficiently than the E. coli-derived TorA secretion sequence.
상시 실시예들을 통하여 OPH 분비서열이 GFP에 대한 활성을 나타내며 분비시킬 수 있으므로, 결과적으로 tat 분비경로의 분비서열임을 입증할 수 있었다. 따라서 OPH 분비서열을 GFP와 같은 sec 분비경로로 분비시킬 수 없는 목적단백질의 분비에 응용할 수 있음을 확인하였다.OPH secretion sequence can be shown to secrete the activity against GFP through the constant embodiment, and as a result it was able to prove that the secretion sequence of the tat secretion pathway. Therefore, it was confirmed that the OPH secretion sequence can be applied to secretion of the target protein that cannot be secreted by the sec secretion pathway such as GFP.
본 발명에 따르면, tat 분비경로의 분비서열로서 접힌 단백질 (구조를 갖춘)을 세포간극으로 분비시킬 수 있을 뿐만 아니라, sec 분비경로로 분비시킬 수 없는 목적단백질을 OPH 분비서열에 의해 세포간극으로 분비시킬 수 있다.According to the present invention, not only the secreted protein (structured) can be secreted into the cell gap as the secretion sequence of the tat secretion pathway, but also the secreted protein, which cannot be secreted by the sec secretion pathway, is secreted into the cell gap by the OPH secretion sequence. You can.
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