KR100462832B1

KR100462832B1 - Gene for Cell-surface Expression

Info

Publication number: KR100462832B1
Application number: KR10-2002-0019820A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 최종현; 이승환; 박상현
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2002-04-11
Filing date: 2002-04-11
Publication date: 2004-12-20
Also published as: KR20030081548A

Abstract

본 발명은 살모넬라에서 유래한 세포 외막 단백질 C(OmpC)를 세포표면 발현 모체로 사용하여 외래 단백질이나 펩타이드를 세포표면에 효율적으로 발현시킬 수 있는 발현벡터, 전기 발현벡터에 의하여 형질변환된 미생물 및 그를 이용하여 외래 단백질을 박테리아의 세포표면에 효율적으로 발현시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 세포 외막에 외래 단백질을 정상적인 기능을 가진 상태로 발현시킬 수 있으므로, 삽입되는 외래 유전자에 따라 생물학적 변환, 재조합 생백신, 여러 펩타이드나 항체의 선별, 중금속 제거 또는 폐수 처리에 응용할 수 있는 전세포 흡착제에 이용되는 효소 혹은 단백질을 세포표면에 안정적으로 발현시켜 지속적으로 촉매의 활성의 감소없이 안정되게 사용할 수 있는 전세포 생물변환 등의 목적에 유용하게 사용할 수 있다.The present invention uses an extracellular membrane protein C (OmpC) derived from Salmonella as a cell surface expression matrix, an expression vector capable of efficiently expressing foreign proteins or peptides on the cell surface, a microorganism transformed by an electric expression vector, and the same. The present invention relates to a method for efficiently expressing foreign proteins on the cell surface of bacteria. According to the present invention, foreign proteins can be expressed on the outer membrane in a state having a normal function, and according to the foreign genes to be inserted, they can be applied to biological transformation, recombinant live vaccines, selection of various peptides or antibodies, heavy metal removal or wastewater treatment. Enzymes or proteins used in whole cell adsorbents can be stably expressed on the cell surface, and can be usefully used for the purpose of whole cell biotransformation which can be used stably without decreasing the activity of the catalyst continuously.

Description

세포표면 발현용 유전자{Gene for Cell-surface Expression}Gene for Cell-surface Expression

본 발명은 세포표면 발현용 유전자에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본발명은 세포표면에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 고안된 살모넬라 티피뮤리움(Salmonlla typhimurium)에서 유래한 세포 외막 단백질 C의 변형된 유전자, 전기 유전자를 세포표면 발현 모체로 사용하여 외래 단백질이나 펩타이드를 세포표면에 효율적으로 발현시킬 수 있는 발현벡터, 전기 발현벡터에 의하여 형질변환된 미생물 및 그를 이용하여 외래 단백질을 박테리아의 세포표면에 효율적으로 발현시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a gene for cell surface expression. More specifically, the present invention uses a modified gene of the outer membrane protein C, which is derived from Salmonlla typhimurium , which is designed to express a target protein on the surface of the cell, and is used as a cell surface expression matrix. The present invention relates to an expression vector capable of efficiently expressing a protein or peptide on a cell surface, a microorganism transformed by an electric expression vector, and a method of efficiently expressing a foreign protein on a cell surface of a bacteria using the same.

1980년대 중반 스미스(Smith)가 펩타이드나 작은 단백질을 필라멘터스 파아지(filamentous phage)의 pIII와 융합하여 발현시켜 이를 표면 발현 시스템(surface-expression system)이라고 언급한 후, 미생물의 분비 기작에 대한 연구가 활발히 진행되면서 원하는 단백질을 미생물 표면에 안정적으로 발현시키는 세포표면 발현(cell surface display)이라는 새로운 분야가 등장했다. 세포표면 발현은 박테리아나 효모와 같은 미생물의 표면 단백질을 표면 발현 모체(surface anchoring motif)로 사용하여 외래 단백질을 미생물 표면에 안정적으로 발현시키는 새로운 분야이다. 처음에는 파아지의 표면이 박테리아보다 단순하기 때문에 파아지 표면에 외래 단백질을 발현시키는 연구가 먼저 진행되었으나, 파아지를 이용하는 경우, 삽입되어 표면에 발현될 수 있는 외래 단백질의 길이가 매우 제한되고 응용범위에도 한계가 있어, 점차 박테리아를 이용한 세포표면 발현에 많은 과학자들이 관심을 가지고 연구를 진행하고 있다(참조: Georgiou, G.,et al., Nature Biotechnol.,15:29-34, 1997).In the mid-1980s, Smith fused and expressed peptides and small proteins with fIII of filamentous phage and referred to them as surface-expression systems. As vigorously progressed, a new field emerged called cell surface display, which stably expressed desired proteins on microbial surfaces. Cell surface expression is a new field that stably expresses foreign proteins on the surface of microorganisms by using surface proteins of microorganisms such as bacteria and yeast as surface anchoring motifs. Initially, since the surface of the phage is simpler than bacteria, studies on exogenous protein on the surface of the phage were conducted first.However, when using phage, the length of the foreign protein that can be inserted and expressed on the surface is very limited and the range of application is limited. Increasingly, many scientists are interested in studying cell surface expression using bacteria (Georgiou, G., et al., Nature Biotechnol., 15: 29-34, 1997).

복잡한 막구조를 가지고 있는 대장균과 같은 박테리아에서 세포표면 발현을성공적으로 수행하기 위해서는, 우선 세포표면에 발현시키고자 하는 외래 단백질을 세포표면까지 안정적이며 효율적으로 이동시킬 수 있는 표면 발현 모체의 사용이 요구되는데, 표면 발현 모체로서 외래 단백질을 세포표면까지 보내기 위해 세포내막을 통과할 수 있도록 도와주는 매우 효율적인 분비신호 서열을 가지고 있어야 하고, 세포 외막 표면에 안정되게 부착될 수 있는 목적신호(targeting signal)를 갖추어야 하며, 동시에 큰 크기를 가지고 있는 외래 단백질도 전달이 가능하여야 하고, 많은 양을 안정적으로 발현시킬 수 있어야 한다.To successfully perform cell surface expression in bacteria such as Escherichia coli with a complex membrane structure, the use of a surface-expressing matrix capable of stably and efficiently transferring foreign proteins to be expressed on the cell surface to the cell surface is required. As a surface-expressing parent, it must have a highly efficient secretion signal sequence that helps pass foreign cells to send foreign proteins to the cell surface, and provides a targeting signal that can be stably attached to the surface of the extracellular membrane. At the same time, foreign proteins with large size must be able to be delivered, and a large amount can be stably expressed.

지금까지 대장균의 표면 발현 모체로는 OmpA, OmpS, LamB, OprF, PhoE 등과 같은 세포 외막에 존재하는 단백질이 주로 이용되었다(참조: Agterberg, M.,et al., Gene,88:37-45, 1990; Lang, H.,et al.,Eur. J. Bacteriol.,267:163-170, 2000). 이 경우, 외래 단백질을 세포표면에 돌출한 루프구조에 삽입시켜 성공적으로 표면에 발현시킬 수는 있지만, 삽입할 수 있는 단백질의 크기가 구조적으로 제한되어진다(참조: Georgiou, G.,et al., Nature Biotechnol,.15:29-34, 1997). 또한, 삽입된 외래 단백질의 C-말단과 N-말단이 입체적으로 가깝게 위치해야 하므로, 단백질이 큰 경우에는 단백질의 안정성이 낮아진다. 실제로 LamB 또는 PhoE의 경우 50 내지 60개 이상의 아미노산으로 이루어진 외래 단백질을 삽입하면, 구조적 제한을 가져와 안정한 막단백질을 형성하지 못하고, 대장균의 포린(porin) 세포 외막 단백질의 경우, 최고 150개의 아미노산으로 구성된 단백질이 아닌 에피토프(epitope)나 금속결합 모티프(metal binding motif) 등에 국한되어 사용되었다(참고: Stahl., S.,et al., Trends Biotechnol., 15:185-192, 1997;Kjaergaad, K.,et al., Appl. Environ. Microbiol., 66:10-14, 2000).Until now, as a surface expression matrix of Escherichia coli, proteins existing in the outer membrane such as OmpA, OmpS, LamB, OprF, and PhoE have been mainly used (see Agterberg, M., et al., Gene, 88: 37-45, 1990; Lang, H., et al ., Eur. J. Bacteriol., 267: 163-170, 2000). In this case, the foreign protein can be inserted into the loop structure protruding from the cell surface and successfully expressed on the surface, but the size of the protein that can be inserted is structurally limited (Georgiou, G., et al. , Nature Biotechnol, 15: 29-34, 1997). In addition, since the C-terminus and the N-terminus of the inserted foreign protein should be closely located three-dimensionally, when the protein is large, the stability of the protein is low. Indeed, when a foreign protein consisting of 50 to 60 or more amino acids is inserted in the case of LamB or PhoE, it does not have a structural restriction to form a stable membrane protein, and in the case of E. coli porin cell membrane protein, it is composed of up to 150 amino acids. Used only for epitopes or metal binding motifs, but not proteins (see Stahl., S., et al., Trends Biotechnol ., 15: 185-192, 1997; Kjaergaad, K.). , et al., Appl. Environ.Microbiol ., 66: 10-14, 2000).

선택되어진 표면 발현 모체에 우리가 발현하고자 하는 외래 단백질을 용합시켜 세포표면에 발현시킬 때, 지금까지 세포표면 발현에 사용된 융합방법은 크게 세 종류가 있다: 첫 번째 방법은 표면 발현 모체의 N-터미널에 표면에 발현시키고자 하는 외래 단백질을 융합시키는 방법으로, 그램 양성세포의 경우에 해당되며 대장균과 같은 그램 음성균은 이런 시스템을 사용할 수 없다(참조: Gunneriusson. E.,et al., J. Bacteriol.,178:1341-1346, 1996; Stasuss. A,et al., Mol. Microbiol., 21:491-500, 1996; Pozzi, G.,et al., Infect. Immun., 60:1902-1907, 1992); 두 번째 방법은 세포표면에 발현하고자 하는 외래 단백질을 표면 발현 모체로 사용되는 단백질 사이에 융합시키는 샌드위치 융합(sandwich fusion) 방법으로, 대장균에서 사용할 수 있으나, 이와 같은 방법은 외래 유전자의 융합이 어렵고, 발현된 외래 단백질이 활성을 상실하는 경우가 많으며, 삽입시킬수 있는 외래 펩타이드의 크기가 최대 약 150개의 아미노산 정도로 제한된다는 것이 큰 문제라 하겠다(참조: Agterverg, M.,et al.,Gene,88:37-45, 1990; Pallesen, L.,Microbiology,141:2839-2848, 1995; Steidler, L.,et al., J. Bacteriol.,175:7639-7643, 1993; Xu, Z.,et al.,Applied Environ. Microbiol., 65:5142-5147, 1999; Georgiou, G.,et al., Nature Biotechnol.,15:29-34, 1997; Stahl., S.,et al., Trends Biotechnol., 15:185-192, 1997); 세 번째 방법은 표면 발현 모체의 C-말단에 발현하고자 하는 외래 단백질을 융합시키거나 또는 C-말단 부분을 제거시키고 바로 외래 단백질을 융합(C-terminal deletion fusion)시키는 방법으로, 외래 단백질이나 펩타이드를 세포표면 발현 모체에 융합하기가 매우 쉬우며, 삽입된 외래 단백질의 활성에 대한 영향이 적다는 장점이 있으나, 상대적으로 세포표면에 표면 발현 모체가 안정하게 발현되기 어렵다는 단점이 있다.When fusion of the foreign protein we want to express to the surface of the selected surface expression matrix to express on the cell surface, there are three kinds of fusion methods used to express the surface of the cell so far: the first method is N- A method of fusing a foreign protein to be expressed on the surface at a terminal is applicable to Gram-positive cells and Gram-negative bacteria such as Escherichia coli cannot use such a system (Gunneriusson. E., et al., J. Bacteriol., 178: 1341-1346, 1996; Stasuss A, et al., Mol. Microbiol ., 21: 491-500, 1996; Pozzi, G., et al., Infect. Immun ., 60: 1902- 1907, 1992); The second method is a sandwich fusion method in which foreign proteins to be expressed on the cell surface are fused between proteins used as surface expression mothers, and can be used in Escherichia coli, but such a method is difficult to fuse foreign genes. Expressed foreign proteins often lose activity, and the problem is that the size of the foreign peptide to be inserted is limited to about 150 amino acids (see Agterverg, M., et al. , Gene, 88: 37-45, 1990; Pallesen, L., Microbiology, 141: 2839-2848, 1995; Steidler, L., et al., J. Bacteriol., 175: 7639-7643, 1993; Xu, Z., et al ., Applied Environ Microbiol, 65: 5142-5147, 1999; Georgiou, G., et al, Nature Biotechnol, 15:...... 29-34, 1997; Stahl, S., et al, Trends Biotechnol. , 15: 185-192, 1997); The third method is to fuse the foreign protein to be expressed at the C-terminus of the surface-expressing parent or to remove the C-terminal portion and immediately fuse the foreign protein (C-terminal deletion fusion). It is very easy to fuse to the cell surface expressing parent, and has the advantage of having little effect on the activity of the inserted foreign protein, but has the disadvantage of relatively difficult to express the surface expressing matrix on the cell surface relatively.

박테리아의 분비 시스템을 응용한 세포표면 발현의 생물공학적 응용 범위는 매우 넓은데, 이는 세포표면에 발현시키고자 하는 외래 단백질의 종류에 따라 결정된다. 우선, 병원성 유래 항원 에피토프(epitope)를 세포표면에 발현시켜 박테리아 백신을 만들 경우, 약독화된 병원성 세균이나 바이러스를 이용한 재래식 백신보다 훨씬 지속적이고 강력하게 면역 반응을 나타낸다(참조: Nguyen, T. N.,et al., Gene., 128:89-94, 1993). 뿐만 아니라, 특정 단백질을 세포표면에 발현시킬 경우, 여러 펩타이드나 항체의 스크리닝을 쉽고 간단하게 수행할 수 있다(참조: Francisco, J. A. R.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 91:10444-10448, 1993). 이 외에도, 특정 항원을 발현하는 박테리아를 동물에 투여하여 항체를 생산하거나, 세포표면에 금속 흡착 단백질을 발현시켜 중금속 제거 및 폐수 처리에 응용하는 전세포 흡착제, 생물학적 변환에 이용되는 효소를 세포표면에 안정적으로 발현시켜 효소 활성의 감소없이 지속적으로 안정되게 사용할 수 있는 전세포 생물 변환 등 그 응용 가치가 매우 높다고 할 수 있다(참조: Charbit, A.,et al., Gene., 70: 181-189, 1988; Sousa, C.,et al., J. Bacteriol., 180:2280-2284, 1998; Richins, R.,et al., Nat. Biotechnol., 15: 984-987, 1997).The biotechnological application of cell surface expression using the secretion system of bacteria is very wide, which is determined by the type of foreign protein to be expressed on the cell surface. First, when bacterial vaccines are made by expressing pathogenic antigen epitopes on the cell surface, they produce a much more persistent and potent immune response than conventional vaccines using attenuated pathogenic bacteria or viruses (Nguyen, TN, et. al., Gene ., 128: 89-94, 1993). In addition, when a specific protein is expressed on the cell surface, screening of multiple peptides or antibodies can be easily and simply performed (see Francisco, JAR, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA ., 91: 10444-10448, 1993). In addition, the antibody is produced by administering bacteria expressing a specific antigen to an animal, or a cell adsorbent used for removing heavy metals and wastewater treatment by expressing a metal adsorbent protein on the cell surface, and an enzyme used for biological transformation on the cell surface. Its application value is very high, such as whole-cell biotransformation that can be stably expressed and continuously used without decreasing enzyme activity (Charbit, A., et al., Gene ., 70: 181-189). , 1988; Sousa, C., et al., J. Bacteriol. , 180: 2280-2284, 1998; Richins, R., et al., Nat. Biotechnol ., 15: 984-987, 1997).

유지는 자연에서 얻어지는 글리세롤 트리에스테르의 혼합물이고, 지방산은 유지의 가수분해로 얻어지는 긴사슬 카르복시산이며, 리파제는 유지를 가수분해해서 지방산과 글리세롤으로 만드는 활성을 가진 효소이다. 또한, 리파제는 유지분해만이 아니라 글리세롤과 지방산을 에스테르화(esterification)하여 유지를 합성하는 반응 또는 유지를 에스테르교환(transesterification)하여 새로운 유지를 합성하는 반응을 매개하고, 많은 비자연적인 기질(unnatural substrate)의 아실화반응(acylation) 또는 탈아실화반응(deacylation)을 촉매하는데, 이러한 리파제의 촉매작용은 라세미 혼합물에 대해 고도의 광학선택성(high enantioselectivity)을 보인다. 이러한 성질을 가진 리파제를 효모(Saccharomyces cerevisiae)의 세포표면 위에 발현시켜 그 활성을 감소시키지 않고 발현시켰다는 보고가 있었다(참조: Ueda, M. et al., J. Bioscience Bioeng., 90:125-136, 2000).Fat or oil is a mixture of glycerol triester obtained in nature, fatty acid is a long chain carboxylic acid obtained by the hydrolysis of fats and oils, and lipase is an enzyme having an activity of hydrolyzing fats to make fatty acids and glycerol. In addition, lipases mediate not only fatty acid decomposition, but also esterification of glycerol and fatty acids to synthesize fats or oils, or transesterification of fats and oils to synthesize new fats and oils. The catalyst catalyzes acylation or deacylation of the substrate, which catalyzes the high enantioselectivity of the racemic mixture. Lipases having this property have been reported to be expressed on the cell surface of yeast ( Saccharomyces cerevisiae ) without decreasing its activity (Ueda, M. et al., J. Bioscience Bioeng., 90: 125-136 , 2000).

상기의 리파제 촉매작용을 이용하여 라세미 혼합물의 광학분할을 통해 키랄성 화합물을 제조하는 것이 활발하게 보고되었다. 그 예로서, 최근 연구가 활발히 진행되고 있는 탁솔(taxol)의 C-13 곁사슬인 페닐이소세린 유도체(derivatives of phenylisoserine), 비스테로이드 소염진통제인 (S)-이부프로펜(ibuprofen), 고혈압치료제인 캡토프릴(captopril) 중간체, 협심증 및 고혈압치료제인 딜티아젬(diltiazem) 중간체, 베타-블로커(β-blocker)의 중간체, 로쉬(Roche)사의 항우울제 중간체, 비타민 E, 광학활성 락톤 등의 화학·효소적 합성(chemoenzymatic synthesis)을 들 수 있다(참조: R. Brieva et al., J. Org. Chem., 58:1068-1075, 1993; F. X. McConville et al., In Biocatalysis, D. A. Abramowicz ed., p.167, Von Nostrand Reinhold, New York; L. Ghosez et al., In Chiral reactions in heterogeneous catalysis, p.21, Plenum Press, New York; S.B. Desai et al., J. Org. Chem., 61, 1996; S. C. Mohapatra et al., Biotechnol. & Bioeng., 64:213-220, 1999; A. M. McKay, Lett. Appl. Microb., 16:1-6, 1993). 그러나, 라세미 혼합물의 광학분할을 통하여 한 종류의 광학이성질체만을 선택적으로 생산하는 기술(chirotechnology)에 상술한 리파제를 이용한 경우, 기질과의 반응 후에 반응혼합물로부터의 리파제의 회수가 용이하지 않아서 효율적인 정제와 반응의 단순화를 저해 하였고, 값비싼 리파제를 일회적인 사용으로 제한하였다.It has been actively reported to prepare chiral compounds through optical splitting of racemic mixtures using the above lipase catalysis. For example, the C-13 side chain of taxol, which is being actively studied in recent years, derivatives of phenylisoserine, (S) -ibuprofen, a nonsteroidal anti-inflammatory drug, and captopril, a hypertension drug (captopril) intermediates, diltiazem intermediates for the treatment of angina and hypertension, intermediates of beta-blockers, intermediates of antidepressants from Roche, vitamin E, and optically active lactones (chemoenzymatic synthesis) (R. Brieva et al., J. Org. Chem., 58: 1068-1075, 1993; FX McConville et al., In Biocatalysis, DA Abramowicz ed., p. 167). , Von Nostrand Reinhold, New York; L. Ghosez et al., In Chiral reactions in heterogeneous catalysis, p. 21, Plenum Press, New York; SB Desai et al., J. Org.Chem., 61, 1996; SC Mohapatra et al., Biotechnol. & Bioeng., 64: 213-220, 1999; AM McKay, Lett. Appl. Microb., 16: 1-6, 1993). However, when the lipase described above is used in the technique of selectively producing only one type of optical isomer through the optical splitting of the racemic mixture, the lipase is not easily recovered from the reaction mixture after the reaction with the substrate, thereby efficiently purifying it. The simplification of the reaction was inhibited and the expensive lipase was limited to one-time use.

따라서, 리파제의 용이한 회수로 효율적인 정제 및 반응공정의 단순화, 그리고 회수한 리파제를 재활용하는 경제적이고도 환경친화적인 광학이성질체 제조기술을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되고 있다.Therefore, there is a constant need to develop an economical and environmentally friendly optical isomer manufacturing technique that simplifies the efficient purification and reaction process with easy recovery of lipase and recycles the recovered lipase.

이에, 본 발명자들은 경제적이고도 환경친화적인 광학이성질체 제조기술을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 미생물의 세포표면에 리파제를 발현시킬 경우, 리파제의 회수가 용이하여 경제적이고도 환경친화적으로 광학이성질체를 제조할 수 있고, 이를 위하여 살모넬라 유래의 OmpC를 표면발현 모체로 이용할 경우, 외래 단백질이나 펩타이드를 세포표면에 발현시킬 수 있는 재조합 발현벡터를 제조할 수 있으며, 형질변환된 미생물에서 외래 단백질이 효율적으로 형질변환된 미생물의 세포표면에 발현됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the present inventors have diligently researched to develop an economical and environmentally friendly optical isomer manufacturing technique, and when lipase is expressed on the cell surface of a microorganism, the recovery of the lipase is easy and economical and environmentally friendly optical isomers can be produced. For this purpose, when Salmonella-derived OmpC is used as a surface expression parent, a recombinant expression vector capable of expressing a foreign protein or peptide on the cell surface can be prepared, and the foreign protein is efficiently transformed from the transformed microorganism. Confirmed that the expression on the cell surface of the microorganism, the present invention was completed.

결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 대장균 세포표면에 외래 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 표면 발현 모체의 C-말단에 원하는 외래 단백질 혹은 펩타이드 유전자가 융합된 폴리펩티드의 세포표면 발현용 재조합 유전자를 제공하는 것이다.After all, the first object of the present invention is to provide a recombinant gene for cell surface expression of a polypeptide fused with a desired foreign protein or peptide gene at the C-terminus of the surface-expressing parent that can efficiently express the foreign protein on the E. coli cell surface. will be.

본 발명의 두 번째 목적은 전기 재조합 유전자를 포함하는 세포표면 발현벡터를 제공하는 것이다.It is a second object of the present invention to provide a cell surface expression vector comprising an electric recombinant gene.

본 발명의 세 번째 목적은 전기 발현벡터로 형질변환된 미생물을 제공하는 것이다.A third object of the present invention is to provide a microorganism transformed with the electric expression vector.

본 발명의 네 번째 목적은 전기 형질변환된 미생물을 이용하여 광학이성질체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.It is a fourth object of the present invention to provide a method for preparing an optical isomer using an electrotransformed microorganism.

도 1은 플라스미드 placKSC의 유전자 지도이다.1 is a genetic map of the plasmid placKSC.

도 2는 플라스미드 pT7KSC의 유전자 지도이다.2 is a genetic map of plasmid pT7KSC.

도 3은 발현벡터 pT7KSC-H6, pT7KSC-H12 및 pT7KSC-H18의 유전자 지도이다.3 is a genetic map of the expression vectors pT7KSC-H6, pT7KSC-H12 and pT7KSC-H18.

도 4는 발현벡터 pT7KSC-H6, pT7KSC-H12 및 pT7KSC-H18으로 형질변환된 재조합 대장균의 카드늄 흡착능을 보여주는 그래프이다.Figure 4 is a graph showing the cadmium adsorption capacity of recombinant E. coli transformed with the expression vectors pT7KSC-H6, pT7KSC-H12 and pT7KSC-H18.

도 5는 플라스미드 pT7KSC-GFP의 유전자 지도이다.5 is a genetic map of the plasmid pT7KSC-GFP.

도 6a는 발현벡터 pT7KSC-GFP으로 형질변환된 대장균을 UV하에서 촬영한 사진이다.Figure 6a is a photograph of the E. coli transformed with the expression vector pT7KSC-GFP under UV.

도 6b는 발현벡터 형질변환되지 않은 대장균을 UV하에서 촬영한 사진이다.Figure 6b is a photograph of the E. coli unexpressed transformation vector under UV.

도 7은 재조합 플라스미드 placKSC-lip의 유전자 지도이다.7 is a genetic map of the recombinant plasmid placKSC-lip.

본 발명의 세포표면 발현용 유전자는 OmpC의 N-말단으로부터 5번째 루프에 이르는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 포함한다.The gene for cell surface expression of the present invention includes a gene encoding an amino acid sequence from the N-terminus to the fifth loop of OmpC.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명자들은 성공적인 세포표면 발현을 위해서는 표면 발현 모체가 매우 효율적인 분비신호 서열 및 세포 외막 표면에 안정되게 부착될 수 있는 목표신호(targeting signal)를 가지고 있고, 큰 크기를 가지고 있는 외래 단백질의 전달도 가능하게 하며, 많은 양을 안정적으로 발현시킬 수 있어야 한다는 가정아래, 이와 같은 표면 발현 모체의 대상으로서 살모넬라에서 유래한 세포외막 단백질 C(OmpC)를 선택하였다.For successful cell surface expression, the present inventors have a highly efficient secretory signal sequence and a targeting signal that can be stably attached to the surface of the outer membrane for successful cell surface expression, and can also transfer foreign proteins having a large size. Under the assumption that it should be able to stably express a large amount, extracellular membrane protein C (OmpC) derived from Salmonella was selected as a target of such a surface expression parent.

대장균의 주 포린 단백질(major porin protein)인 세포외막 단백질 C의 경우, 21개의 분비신호 서열을 포함하여 367개 아미노산으로 구성되어 있으며, 세포외막 단백질 F(OmpF)와 더불어 배지내의 삼투압(osmolarity)에 반응하여 발현되는 단백질로서, 단위 세포당 약 10⁵개의 분자가 발현될 만큼 다량으로 발현되는 세포외막 단백질이다(참조: Mizuno, T.,et al., J. Biol. Chem.,258:6932-6940, 1983).Extracellular membrane protein C, the major porin protein of E. coli, consists of 367 amino acids, including 21 secretion signal sequences, and in addition to the extracellular membrane protein F (OmpF), A protein expressed in response, an extracellular membrane protein expressed in large amounts such that about 10 ⁵ molecules per unit cell are expressed (Mizuno, T., et al., J. Biol. Chem., 258: 6932-). 6940, 1983).

세포외막 단백질 C의 세포막 위상(membrane topology)을 보면, 단백질의 N-말단과 C-말단이 주변세포질에 존재하고, 8개의 루프(loop)는 세포외막 바깥쪽으로, 7개의 루프는 주변세포질쪽으로 돌출되어 있다(참조: Puente, J.,et al., Gene,156:1-9, 1995). 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)에서 유래한 세포외막 단백질 C의 경우, 세포 외막 바깥쪽으로 돌출되어 있는 8개의 루프 중 4번째와 6번째 루프에 각각 로타바이러스(rotavirus) VP4 캡시드 단백질 에피토프(epitope) RV160(22개의 아미노산)와 RV252(28개의 아마노산)을 성공적으로 발현시켰다(참조: Puente, J.,et al., Gene,156:1-9, 1995).In the membrane topology of extracellular membrane protein C, the N-terminus and C-terminus of the protein are present in the periplasm, with eight loops out of the extracellular membrane and seven loops protruding toward the periplasm. (Puente, J., et al., Gene, 156: 1-9, 1995). Extracellular membrane protein C, derived from Salmonella typhimurium , has a rotavirus VP4 capsid protein epitope RV160 on the fourth and sixth of eight loops protruding out of the outer membrane, respectively. (22 amino acids) and RV252 (28 amino acids) were successfully expressed (Puente, J., et al., Gene, 156: 1-9, 1995).

이에, 본 발명자들은 살모넬라에서 유래한 세포외막 단백질 C(OmpC)의 N-말단으로부터 세포외막 바깥쪽으로 돌출된 8번째 루프까지의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 바람직하게는 N-말단으로부터 세포외막 바깥쪽으로 돌출된 7번째 루프까지의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 가장 바람직하게는 최소한 N-말단으로부터 세포외막 바깥쪽으로 돌출된 5번째 루프까지의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 포함하는 OmpC의 변형된 재조합 유전자를 작제하고, 이의 C-말단 부위에 외래 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 유전자를 융합시킴으로써, 신규한 융합 단백질을 생산하고자 하였다. 이때, 사용되는 외래 단백질 또는 펩타이드가 특별히 제한되는 것은 아니나, 단백질, 효소, 효소 저해제, 모노클로날 항체, 항원 및 호르몬으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종을 사용함이 바람직하다.Accordingly, the present inventors have identified genes encoding amino acid sequences from the N-terminus of extracellular membrane protein C (OmpC) derived from Salmonella to the eighth loop protruding out of the extracellular membrane, preferably from the N-terminus to the outer membrane. A modified recombinant gene of OmpC comprising a gene encoding an amino acid sequence up to a raised seventh loop, most preferably a gene encoding an amino acid sequence up to a fifth loop protruding outward from the extracellular membrane at least By constructing and fusing a gene encoding a foreign protein or peptide to its C-terminal site, it was intended to produce a new fusion protein. At this time, the foreign protein or peptide used is not particularly limited, but it is preferable to use one selected from the group consisting of proteins, enzymes, enzyme inhibitors, monoclonal antibodies, antigens and hormones.

우선, 살모넬라에서 유래한 세포외막 단백질 C 유전자를 확보하기 위해서, 살모넬라 티피뮤리움의 염색체를 표적 DNA로 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이렇게 증폭된 약 1100 bp 크기의 DNA 절편을 아가로즈 젤 전기영동하여 수득하고, 유도성 T7 또는 lac 프로모터를 포함하는 플라스미드에 삽입하여, 재조합 플라스미드 placKSC 및 pT7KSC를 제조하였다. 전기 제조된 재조합 플라스미드 placKSC와 pT7KSC는 lac 또는 T7 프로모터에 의하여 살모넬라에서 유래한 세포외막 단백질 C를 발현시킨다. 아울러, 세포표면에 발현될 모델 단백질 혹은 펩타이드는 세포외막 바깥쪽으로 돌출되어 있는 8개의 루프 중 7번째 루프에 존재하는 제한효소 PstI 이후의 모든 유전자를 절단하고, 그 절단 부위에 삽입하고자 하였다.First, in order to secure the extracellular membrane protein C gene derived from Salmonella, polymerase chain reaction (PCR) was performed using the chromosome of Salmonella typhimurium as a target DNA. Thus amplified DNA fragments of about 1100 bp were obtained by agarose gel electrophoresis and inserted into plasmids containing inducible T7 or lac promoters to prepare recombinant plasmids placKSC and pT7KSC. The previously prepared recombinant plasmids placKSC and pT7KSC express extracellular membrane protein C derived from Salmonella by the lac or T7 promoter. In addition, the model protein or peptide to be expressed on the cell surface was to cut all the genes after the restriction enzyme PstI present in the seventh of eight loops protruding out of the extracellular membrane, and inserted into the cleavage site.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 예시적으로 대장균 세포표면에 발현시킬 대상 펩타이드로 6개의 히스티딘(6His)으로 구성된 폴리-히스티딘(poly-His)링커(linker) 펩타이드를 사용하였는데, 이 대상 펩타이드는 Cd²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺및 Pb²⁺등의 2가 메탈 이온에 대한 킬레이터(chelator)로 작용하며, 중금속 제거를 위한 생물흡착제로서 사용할 수 있기 때문이다. 중합효소 연쇄반응에 의하여 증폭된 DNA중에서 아가로즈 젤 전기영동법으로 약 72 bp 크기의 DNA 절편을 수득한 후, 재조합 발현벡터 pT7KSC의 PstI 및 BamHI 제한효소 부위에 삽입시켜 폴리-히스티딘 링커가 6, 12 및 18개 삽입된 재조합 발현벡터 pT7KSC-H6, pT7KSC-H12 및 pT7KSC-H18를 제조하였다.According to one embodiment of the present invention, a poly-His linker peptide consisting of six histidines (6His) is used as a target peptide to be expressed on the surface of E. coli cells. This is because it acts as a chelator for divalent metal ions such as Cd ²⁺ , Cu ²⁺ , Zn ²⁺ , Ni ²⁺ and Pb ²⁺ , and can be used as a biosorbent for heavy metal removal. DNA fragments of about 72 bp size were obtained by agarose gel electrophoresis from the DNA amplified by the polymerase chain reaction, and then inserted into the PstI and BamHI restriction sites of the recombinant expression vector pT7KSC. And 18 inserted recombinant expression vectors pT7KSC-H6, pT7KSC-H12 and pT7KSC-H18.

상기에서 제조된 재조합 발현벡터 pT7KSC-H6, pT7KSC-H12, pT7KSC-H18를 대장균에 도입하고, 이 형질변환체를 배양하여, 발현유도인자, 예를 들면 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 발현을 유도한 다음, 배양액을 일정량 채취하여 세포 외막 단백질을 분획하였다. 분획한 단백질들은 SDS-PAGE(sodium-dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석한 결과, 살모넬라 티피뮤리움 유래 세포외막 단백질 C에 폴리-히스티딘 링커가 성공적으로 삽입되어 세포표면에 발현되었음을 확인하였다.The recombinant expression vectors pT7KSC-H6, pT7KSC-H12, and pT7KSC-H18 prepared above were introduced into Escherichia coli, and the transformants were cultured, and an expression inducer such as IPTG (isopropyl-β-thiogalactoside) was added thereto. After inducing expression, a certain amount of the culture was taken to fractionate extracellular membrane proteins. The fractionated proteins were analyzed by SDS-PAGE (sodium-dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) and confirmed that poly-histidine linker was successfully inserted into Salmonella typhimurium-derived extracellular membrane protein C and expressed on the cell surface.

이어, 재조합 발현벡터 pT7KSC-H6, pT7KSC-H12, pT7KSC-H18을 가지는 살모넬라 티피뮤리움이 실제로 중금속을 얼마나 흡착할 수 있는지를 카드뮴(Cd²⁺)을 흡착시킨 후, 원자분석 시스템(atomic analysis system)을 이용하여 분석하였다. 각 재조합 발현벡터로 형질변환된 대장균에 각각 단위 그램 세포 건조 중량당34.2μmol의 Cd²⁺이온을 흡착시킨 결과, 과거 소사(Sousa) 등이 보고한 카드뮴 흡착결과와 비교할 때, 매우 높은 효율로 카드뮴을 흡착한 것을 확인할 수 있었다(참조: Sousa, C.,et al., Nature Biotechnol., 14:1017-1020, 1996). 따라서, 본 발명에서 개발한 세포표면 발현 모체를 폐수나 쓰레기 등에 있는 중금속을 제거하는데 이용할 수 있을 것이다.Subsequently, after absorbing cadmium (Cd ²⁺ ), Salmonella typhimurium having the recombinant expression vectors pT7KSC-H6, pT7KSC-H12, and pT7KSC-H18 can actually adsorb heavy metals, followed by atomic analysis system (atomic analysis system). ). As a result of adsorbing 34.2 μmol of Cd ²⁺ ions per unit gram cell dry weight to each E. coli transformed with each recombinant expression vector, cadmium was highly efficient compared with the results of cadmium adsorption reported by Sousa et al. It was confirmed that the adsorbed (Sousa, C., et al., Nature Biotechnol ., 14: 1017-1020, 1996). Therefore, the cell surface expression matrix developed in the present invention can be used to remove heavy metals in waste water or waste.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 펩타이드 뿐만 아니라 단백질이 효율적으로 대장균 세포표면에 발현되는지 알아보기 위하여 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP)을 모델 단백질로 선택하여 확인하였다. GFP는 아쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria)에서 유래한 238개의 아미노산으로 구성된 약 2.7 kDa 크기를 가진 화학적 발광(chemiluminescent) 단백질로서 11개의 베타-쉬트(β-sheet)구조를 포함하고, 그 3차원 구조가 세포외막 단백질의 구조와 매우 유사하다. 전기 단백질은 크로모포아(chromophore)에 해당되는 65 내지 67번째 아미노산(wild type의 경우 Ser-Thr-Gly)의 종류에 따라 크게 6종류로 나뉘고, 각각의 종류마다 방사(emission) 및 여기(excitation) 파장이 달라지는 특성이 있으며, 그 3차원 구조가 바뀌면 보통 UV하에서 형광을 띠지 않는다. 본 발명자들은 전기 제작된 pT7KSC 재조합 플라스미드에 GFP 유전자를 삽입하여 발현벡터를 작제하고, 이를 이용하여 대장균을 형질변환시킨 다음, IPTG를 첨가하며 배양하여 발현을 유도하고, 배양액을 일정량 채취하여 세포 외막 단백질을 수득하였다. 수득한전기 단백질을 SDS-PAGE로 분석하고, 항-GFP 항체를 이용하여 이뮤노블랏(immunoblot)을 수행한 결과, 살모넬라 티피뮤리움 유래 세포외막 단백질 C에 GFP가 성공적으로 삽입되어 세포표면에 발현되었음을 확인하였다. 이어, 세포표면에 발현된 단백질의 활성이 정상적으로 유지되는지 확인하기 위하여, UV 하에서 녹색의 형광을 띠는지 확인해 본 결과, 대장균 세포표면에 발현된 GFP는 밝은 녹색의 형광을 띠었으므로, 본 벡터 시스템은 펩타이드나 단백질을 세포표면 밖에서 효율적으로 발현시킴을 확인할 수 있었다.According to another embodiment of the present invention, in order to determine whether not only peptides but also proteins are efficiently expressed on E. coli cell surface, green fluorescent protein (GFP) was selected as a model protein. GFP is a chemiluminescent protein of approximately 2.7 kDa size consisting of 238 amino acids derived from Aequorea victoria and contains 11 beta-sheet structures and its three-dimensional structure Is very similar to the structure of the extracellular membrane protein. The proteins are divided into six types according to the types of the 65th to 67th amino acids (ser-thr-gly in the wild type) corresponding to chromophores.Each type is classified into emission and excitation for each type. ) There is a characteristic that the wavelength is changed, and when the three-dimensional structure is changed, it is not usually fluorescence under UV. The present inventors construct an expression vector by inserting the GFP gene into the pT7KSC recombinant plasmid prepared before, transform the E. coli using it, induce the expression by adding IPTG and incubate the culture, and extract a certain amount of the cell outer membrane protein Obtained. The obtained electrical protein was analyzed by SDS-PAGE, and immunoblot was performed using an anti-GFP antibody. As a result, GFP was successfully inserted into Salmonella typhimurium-derived extracellular membrane protein C and expressed on the cell surface. It was confirmed. Subsequently, in order to confirm that the activity of the protein expressed on the cell surface is normally maintained, it was confirmed that the green fluorescence under UV light showed that the GFP expressed on the E. coli cell surface was bright green fluorescence. Efficient expression of peptides or proteins outside the cell surface was confirmed.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 전기 개발된 세포표면 발현벡터에 리파제를 퓨전시키고, 이를 라세미 혼합물의 광학분할을 통한 키랄성 화합물의 제조에 응용하고자 하였다. 종래에는 정제된 순수 리파제의 촉매 작용을 이용하여 라세미 혼합물을 광학분할하여 페닐이소세린 유도체(derivatives of phenylisoserine), 캡토프릴(captopril) 중간체, (S)-이부프로펜(ibuprofen), 광학활성 락톤과 같은 키랄성 화합물을 제조하였다(참조: R. Brieva et al., J. Org. Chem., 58:1068-1075, 1993; L. Ghosez et al., In Chiral reactions in heterogeneous catalysis, p. 21, Plenum Press, New York; A. M. McKay, Lett. Appl. Microb., 16:1-6, 1993). 그러나, 이와 같은 방법들은 기질과의 반응 후에 반응혼합물로부터 리파제를 회수하는데 어려움이 있어, 효율적인 정제와 반응의 단순화를 수립할 수 없었을 뿐만 아니라, 값비싼 리파제를 일회적인 사용으로 제한하였다.According to another embodiment of the present invention, a lipase was fused to the previously developed cell surface expression vector, and this was applied to the preparation of chiral compounds through optical division of the racemic mixture. Conventionally, the racemic mixture is optically divided using the catalytic action of purified pure lipase to obtain derivatives of phenylisoserine, captopril intermediates, (S) -ibuprofen, and optically active lactones. Chiral compounds were prepared (R. Brieva et al., J. Org. Chem., 58: 1068-1075, 1993; L. Ghosez et al., In Chiral reactions in heterogeneous catalysis, p. 21, Plenum Press , New York; AM McKay, Lett.Appl.Microb., 16: 1-6, 1993). However, these methods have difficulty recovering lipase from the reaction mixture after reaction with the substrate, which makes it impossible to establish efficient purification and simplification of the reaction, as well as limiting expensive lipase to one-time use.

이에, 본 발명자는 기존 리파제의 촉매 작용을 유지하면서 단점을 보완할 수있는 신규 리파제 세포표면 발현 시스템을 확립하고, 이를 이용하여 라세미 에스테르 화합물로부터 키랄성 알코올, 키랄성 유기산, 키랄성 에스테르의 제조방법을 확립하였다. 즉, 전기 제작된 placKSC 재조합 유전자에 리파제 유전자를 삽입하여 발현벡터 placKSC-lip을 작제하고, 이를 이용하여 대장균을 형질변환시켰으며, 전기 형질변환체를 배양하면서 IPTG를 첨가하여 리파제 융합단백질의 발현을 유도하여, 세포표면에 리파제가 발현되도록 하였다. 전기 발현된 리파제와 라세미 에스테르 화합물을 반응시켜서 키랄성 화합물을 제조할 수 있는데, 이때 라세미 에스테르 화합물은 특별히 제한되는 것은 아니나, 하이드록시카르복실산, 알킬, 에스테르 또는 락탐을 사용함이 바람직하다. 본 발명에서는 전기 발현된 리파제와 라세미 3-하이드록시부티르산 에틸 에스테르를 반응시켜 카파페넴계 항생제 출발물질인 키랄성 (S)-(+)-3-하이드록시부티르산 에틸 에스테르((S)-(+)-3-hydroxybutyrate ethyl-ester)와 (R)-(+)-3-하이드록시부티르산((R)-(+)-3-hydroxybutyric acid)를 수득하고, 세포표면에 발현된 리파아제를 간단한 방법으로 회수하여 효율적인 정제 및 반응공정의 단순성을 제공하는 경제적이고도 환경친화적인 키랄성 화합물을 제조할 수 있었다.Accordingly, the present inventors established a novel lipase cell surface expression system that can compensate for the disadvantages while maintaining the catalytic action of the existing lipase, and using this to establish a method for preparing chiral alcohol, chiral organic acid, and chiral ester from the racemic ester compound. It was. That is, the expression vector placKSC-lip was constructed by inserting a lipase gene into the previously prepared placKSC recombinant gene, transformed into E. coli, and expressing the lipase fusion protein by adding IPTG while culturing the transformant. Induction, the lipase was expressed on the cell surface. The chiral compound may be prepared by reacting the lipase and the racemic ester compound, wherein the racemic ester compound is not particularly limited, but it is preferable to use hydroxycarboxylic acid, alkyl, ester or lactam. In the present invention, the chiral (S)-(+)-3-hydroxybutyric acid ethyl ester ((S)-(+), which is a kappapenem antibiotic starting material, is reacted by reacting an electrically expressed lipase with racemic 3-hydroxybutyric acid ethyl ester. ) -3-hydroxybutyrate ethyl-ester) and (R)-(+)-3-hydroxybutyric acid ((R)-(+)-3-hydroxybutyric acid) to obtain lipase expressed on the cell surface. It was possible to prepare an economical and environmentally friendly chiral compound that was recovered to provide an efficient purification and simplicity of the reaction process.

또한, 전기 발현된 리파제를 라세미 베타-락탐인 라세미 시스-3-아세톡시-4-페닐아제티딘-2-온(racemic cis-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-one)과 반응시켜 키랄성 에스테르 및 키랄성 유기산을 수득하고, 세포표면에 발현된 리파제는 반응 혼합물로부터 원심분리하여 쉽게 분리하였다.In addition, the lipase expressed by the reaction was reacted with racemic cis-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-one, a racemic beta-lactam. Chiral esters and chiral organic acids were obtained and the lipase expressed on the cell surface was easily separated by centrifugation from the reaction mixture.

이상에서 보듯이, 본 발명의 살모넬라 유래의 OmpC를 표면발현 모체로 이용한 외래 단백질이나 펩타이드를 세포표면에 발현시킬 수 있는 재조합 발현벡터는 여러 가지 외래 단백질이나 펩타이드를 원래의 기능을 유지시키면서도, 효율적으로 형질변환체의 세포표면에 발현시킬 수 있음을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 상기 제조된 여러 가지 발현벡터 중에서, GFP를 발현시킬 수 있는 pT7KSC-GFP를 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 제조된 형질변환체를 "대장균 BL21(DE3)/pT7KSC-GFP(Escherichia coli BL21(DE3)/pT7KSC-GFP)"라 명명하고, 이를 2000년 11월 30일자로 국제기탁기관인 생명공학연구원(KRIBB) 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 소재)에 기탁번호 "KCTC-0897BP"로 기탁하였으며, 리파제를 발현시킬 수 있는 placKSC-lip를 대장균 MC4100에 도입하여 제조된 형질변환체를 "대장균 MC4100/placKSC-lip(Escherichia coli MC4100/placKSC-lip)"라 명명하고, 이를 2000년 11월 30일자로 동일한 국제기탁기관인 유전자은행에 기탁번호 "KCTC-0898BP"로 기탁하였다.As described above, the recombinant expression vector capable of expressing the foreign protein or peptide on the cell surface using the Salmonella-derived OmpC of the present invention as a surface-expressing parent can efficiently maintain various foreign proteins or peptides while maintaining their original functions. It was confirmed that the cell surface of the transformant can be expressed. Accordingly, the present inventors introduced a transformant prepared by introducing pT7KSC-GFP capable of expressing GFP into E. coli BL21 (DE3) among the various expression vectors prepared above, "E. coli BL21 (DE3) / pT7KSC-GFP (Escherichia). coli BL21 (DE3) / pT7KSC-GFP), and as of November 30, 2000, was deposited with KRIBB Gene Bank (KCTC, Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon, Korea). 0897BP ", and the transformant prepared by introducing the lipase-expressing placKSC-lip to E. coli MC4100" Escherichia coli MC4100 / placKSC-lip "was named, 2000 On November 30, 2014, he deposited his deposit number "KCTC-0898BP" with Genebank, the same international depositary.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 본 발명의 발현벡터 placKSC와 pT7KSC는 외부 유전자로서 하기 실시예에서 기술하고 있는 폴리-히스티딘 링커 및 GFP 유전자 뿐만 아니라, 각종 외래 단백질이나 펩타이드의 유전자를도입하여 그의 발현에 이용될 수 있다. 따라서, 재조합 발현벡터 placKSC와 pT7KSC에 각종 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터 또한 본 발명의 범주에 속한다고 보아야 할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. . In particular, the expression vectors placKSC and pT7KSC of the present invention can be used to express not only the poly-histidine linker and GFP genes described in the following examples as external genes, but also various foreign proteins or peptides. Therefore, recombinant expression vectors in which various genes are inserted into the recombinant expression vectors placKSC and pT7KSC will also be considered to be within the scope of the present invention.

실시예 1: 재조합 발현벡터 placKSC의 제조 Example 1 Preparation of Recombinant Expression Vector placKSC

lac 프로모터 상에서 세포 외막 단백질을 발현시키기 위하여 lac 프로모터를 가진 재조합 플라스미드 pJHlacK를 제조하였다.Recombinant plasmid pJHlacK with a lac promoter was prepared to express the extracellular membrane protein on the lac promoter.

우선, lac 프로모터와 lac 프로모터를 보다 효율적으로 조절하기 위한 lacI 유전자를 수득하였다. 즉, 재조합 플라스미드 pUC19는 lac 프로모터와 lacI 유전자를 가지고 있다(참조: Yanisch-Perron C. et al.,Gene,33:103-119, 1985). 이 pUC19 플라스미드를 주형으로 사용하고, 하기의 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(첫번째 변성 94℃ 5분, 두번째 변성 94℃ 45초, 교잡 50℃ 50초, 연장 72℃ 1분 10초, 30회 반복)을 수행하였다.First, the lacI gene for controlling the lac promoter and the lac promoter more efficiently was obtained. That is, the recombinant plasmid pUC19 has a lac promoter and a lacI gene (see Yanisch-Perron C. et al., Gene, 33: 103-119, 1985). This pUC19 plasmid was used as a template, and the following primers were used for polymerase chain reaction (first denaturation at 94 ° C for 5 minutes, second denaturation at 94 ° C for 45 seconds, hybridization 50 ° C for 50 seconds, extension 72 ° C for 1 minute, 10 seconds, and 30 times. Repeat).

primer1 5'-GGAATTCCATATGTGTTTCCTGTGTGAAATTGTT-3'(서열번호 1)primer1 5'-GGAATTCCATATGTGTTTCCTGTGTGAAATTGTT-3 '(SEQ ID NO: 1)

primer2 5'-TGCTCACATGTTCTTTCCTG-3'(서열번호 2)primer2 5'-TGCTCACATGTTCTTTCCTG-3 '(SEQ ID NO: 2)

아가로즈 겔 전기영동법으로 전기 중합효소 연쇄반응 방법으로 수득한 절편에서 약 347bp 크기의 DNA 절편을 분리하고, 제한효소NdeI과AflIII으로 절단하였다. 이를, pET3a 플라스미드를 NdeI과AflIII로 절단하여 수득한 2438bp의 DNA 절편과 연결시켜 약 2765bp 길이의 재조합 플라스미드 pJHlac을 수득하였다(참고: Conner G. E. and Udey J. A,DNA Cell Biol.,9(1):1-9, 1990). 이어, pJHlac 플라스미드를 제한 효소DraI과EcoRI으로 절단하고, 카나마이신 유전자를 연결시킨 후, 일렉트로포레이션(electroporation) 방법으로 대장균 XL1-Blue에 도입하여, 형질변환시킨 다음, 카나마이신(10μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하고, 이로부터 약 2568bp 길이를 가진 pJKlacK 재조합 플라스미드를 수득하였다. 이때, 사용된 카나마이신 유전자는 플라스미드 pACYC177를 주형으로 하고, 하기 프라이머를 사용하여, 중합효소 연쇄반응(첫번째 변성 94℃ 5분, 두번째 변성 94℃ 45초, 교잡 51℃ 50초, 연장 72℃ 50초, 30회 반복)을 수행하고, 아가로즈 겔 전기영동법에 의하여 전기 중합효소 연쇄반응 방법으로 얻어진 DNA 절편으로부터 분리한 약 930bp 크기의 DNA 절편이다(참고: Chang A. C. Y. and Cohen S. N,J. Bacteriol.,134:1141-1156, 1978).DNA fragments of about 347 bp were separated from the fragments obtained by the electropolymerase chain reaction method by agarose gel electrophoresis, and digested with restriction enzymes Nde I and Afl III. This was linked to a 2438 bp DNA fragment obtained by cleaving the pET3a plasmid with NdeI and Afl III to obtain a recombinant plasmid pJHlac of about 2765 bp in length (Conner GE and Udey J. A, DNA Cell Biol., 9 (1 ): 1-9, 1990). Subsequently, the pJHlac plasmid was digested with the restriction enzymes Dra I and EcoR I, the kanamycin gene was linked, introduced into E. coli XL1-Blue by electroporation, transformed, and then kanamycin (10 μg / L). This added LB plate was selected and obtained a pJKlacK recombinant plasmid with a length of about 2568 bp. At this time, the kanamycin gene used was plasmid pACYC177 as a template, and using the following primer, polymerase chain reaction (first denaturation 94 ° C 5 minutes, second denaturation 94 ° C 45 seconds, hybridization 51 ° C 50 seconds, extension 72 ° C 50 seconds) , Repeated 30 times), and DNA fragments of about 930 bp separated from DNA fragments obtained by electropolymerase chain reaction by agarose gel electrophoresis (Chang ACY and Cohen S. N, J. Bacteriol). , 134: 1141-1156, 1978).

primer3 5'-GCGGTACCTTTAAAGCCACGTTGTGTCTCAAA-3'(서열번호 3)primer3 5'-GCGGTACCTTTAAAGCCACGTTGTGTCTCAAA-3 '(SEQ ID NO: 3)

primer4 5'-CGAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCA-3'(서열번호 4)primer4 5'-CGAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCA-3 '(SEQ ID NO: 4)

한편, 살모넬라 티피뮤리움의 세포외막 단백질 C(OmpC) 유전자를 확보하기 위하여, 살모넬라 티피뮤리움 염색체 DNA를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(첫번째 변성 94℃ 7분, 두번째 변성 94℃ 1분, 교잡 44℃ 2분, 연장 72℃ 3분, 33회 반복)을 수행하였다.Meanwhile, in order to secure the extracellular membrane protein C (OmpC) gene of Salmonella typhimurium, Salmonella typhimurium chromosomal DNA was used as a template, and the following primer was used to polymerase chain reaction (first denaturation at 94 DEG C for 7 minutes and second). Denaturation at 94 ° C. for 1 minute, hybridization at 44 ° C. for 2 minutes, extension at 72 ° C. for 3 minutes, and 33 repetitions).

primer5 5'-GGAATTCCATATGAAAGTTAAAGTACTG-3'(서열번호 5)primer5 5'-GGAATTCCATATGAAAGTTAAAGTACTG-3 '(SEQ ID NO: 5)

primer6 5'-CCGGGATCCTTATTAGAACTG GTAAACCAG-3'(서열번호 6)primer6 5'-CCGGGATCCTTATTAGAACTG GTAAACCAG-3 '(SEQ ID NO: 6)

아가로즈 겔 전기영동법으로 전기 중합효소 연쇄반응 방법으로 수득한 절편에서 약 1100bp 크기의 DNA 절편을 분리하고, 제한효소 NdeI과 BamHI으로 절단하였다. 이를, lac 프로모터를 포함하는 플라스미드 pHJlacK를 제한효소 NdeI과 BamHI으로 절단하여 수득한 DNA 절편과 연결시켜 재조합 플라스미드를 수득하고, 일렉트로포레이션 방법으로 대장균 XL1-Blue에 도입하여 형질변환시킨 다음, 카나마이신(10μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하고, 이로부터 placKSC 재조합 플라스미드를 수득하였다(참조: 도 1).DNA fragments having a size of about 1100 bp were isolated from the fragments obtained by the electropolymerase chain reaction method by agarose gel electrophoresis, and digested with restriction enzymes NdeI and BamHI. The plasmid pHJlacK containing the lac promoter was linked to a DNA fragment obtained by cleaving with restriction enzymes NdeI and BamHI to obtain a recombinant plasmid, transformed by introducing into E. coli XL1-Blue by the electroporation method, and then transformed into kanamycin ( 10 μg / L) was added and added to LB plate medium to obtain a placKSC recombinant plasmid (see Fig. 1).

실시예 2: 재조합 발현벡터 pT7KSC의 제조 Example 2 Preparation of Recombinant Expression Vector pT7KSC

T7 프로모터 상에서 세포 외막 단백질을 발현시키기 위하여, T7 프로모터를 가진 재조합 플라스미드 pT7KSC를 제조하였다. 즉, 유도성의 강력한 T7 프로모터를 포함하는 플라스미드 pET3a를 제한 효소EcoRI과DraI으로 절단하여 약 3.2 kbp 길이의 DNA 절편을 수득하고, 선택표지인 카나마이신 유전자를 실시예 1과 동일한 방법으로 삽입시킨 후, 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하여 형질변환시켰다. 형질변환된 균주는 카나마이신(10μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pT7K 재조합 플라스미드를 수득한 다음, 전기 수득한 재조합 플라스미드에 살모넬라 티피뮤리움 세포 외막 단백질 C를 삽입시켰다.To express the extracellular membrane protein on the T7 promoter, a recombinant plasmid pT7KSC with a T7 promoter was prepared. That is, the plasmid pET3a containing the inducible strong T7 promoter was cut with restriction enzymes EcoR I and Dra I to obtain a DNA fragment about 3.2 kbp in length, and the optional kanamycin gene was inserted in the same manner as in Example 1. The strain was introduced into E. coli XL1-Blue using the electroporation method. Transformed strains were screened in LB plates added with kanamycin (10 μg / L), from which pT7K recombinant plasmids were obtained, and Salmonella typhimurium cell envelope protein C was inserted into the previously obtained recombinant plasmids.

즉, 실시예 1에서 수득한 살모넬라 티피뮤리움 세포외막 단백질 DNA 절편과 재조합 플라스미드 pT7K 유전자를 두 가지의 제한효소 NdeI과 BamHI으로 절단한 다음, 이들을 연결시키고 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하여 형질변환시켰다. 형질변환된 균주는 카나마이신(10μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pT7KSC 재조합 플라스미드를 수득하였다(참조: 도 2).That is, the Salmonella typhimurium extracellular membrane protein DNA fragment obtained in Example 1 and the recombinant plasmid pT7K gene were cleaved with two restriction enzymes NdeI and BamHI, and then linked to each other, and the electroporation method was used for Escherichia coli XL1-Blue. It was introduced into and transformed. Transformed strains were selected in LB plate medium to which kanamycin (10 μg / L) was added to obtain a pT7KSC recombinant plasmid (see FIG. 2).

실시예 3: 재조합 발현벡터 pT7KSC-H6, pT7KSC-H12, pT7KSC-H18의 제조 Example 3 Preparation of Recombinant Expression Vectors pT7KSC-H6, pT7KSC-H12, pT7KSC-H18

세포표면에 발현시킬 모델 펩타이드로 폴리-히스티딘(poly-His) 펩타이드를 사용하였는데, 1개의 링커(linker) 세트(set)는 6개의 히스티딘으로 구성되어 있으며, 이를 제조하기 위하여, 하기의 프라이머를 사용하여 1차로 중합효소 연쇄반응(첫번째 변성 94℃ 5분, 두번째 변성 94℃ 30초, 교잡 56℃ 30초, 연장 72℃ 30초, 10회 반복), 2차로 중합효소 연쇄반응(변성 94℃ 30초, 교잡 68℃ 30초, 연장 72℃ 30초, 20회 반복)을 수행하였다.Poly-Histidine (poly-His) peptide was used as a model peptide to be expressed on the cell surface. One set of linkers consists of 6 histidines. First polymerase chain reaction (first denaturation 94 ℃ 5 minutes, second denaturation 94 ℃ 30 seconds, hybridization 56 ℃ 30 seconds, extension 72 ℃ 30 seconds, repeated 10 times), second polymerase chain reaction (denaturation 94 ℃ 30 Sec, hybridization 68 ° C. 30 sec, extension 72 ° C. 30 sec, 20 repetitions).

primer7 5'-GATAGATATCCTGCAGGTCGACCCAAGCGGACATCACCATCATCACCAT-3'(서열번호 7)primer7 5'-GATAGATATCCTGCAGGTCGACCCAAGCGGACATCACCATCATCACCAT-3 '(SEQ ID NO: 7)

primer8 5'-CCGGGATCCTTATTACTCGAGACCAGAATGGTGATGATGGTGATG-3'(서열번호 8)primer8 5'-CCGGGATCCTTATTACTCGAGACCAGAATGGTGATGATGGTGATG-3 '(SEQ ID NO: 8)

아가로즈 겔 전기영동법으로 전기 중합효소 연쇄반응 방법으로 수득한 절편에서 약 72bp 크기의 DNA 절편을 분리하였는데, 전기 분리된 폴리-히스티딘 펩타이드 유전자의 5'-말단에는 PstI과 SalI 제한효소 자리가 존재하며, 3'-말단에는 XhoI과 BamHI 제한효소 자리가 존재한다.DNA fragments of about 72 bp in size were isolated from the polymerase chain reaction by agarose gel electrophoresis. PstI and SalI restriction enzyme sites were present at the 5'-end of the poly-histidine peptide gene. At the 3′-end, XhoI and BamHI restriction enzyme sites are present.

전기 수득한 DNA 절편을 PstI과 BamHI 제한효소로 절단하고, 이를 실시예 2에서 제조한 pT7KSC 재조합 발현벡터에 삽입시킨 후, 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하여 형질변환시켰다. 형질변환된 균주는 카나마이신(50μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pT7KSC-H1 재조합 발현벡터를 수득하였다. 전기 재조합 발현벡터는 6개의 히스티딘으로 구성된 폴리-히스티딘 펩타이드 1개의 세트로 구성된 유전자를 포함한다.The obtained DNA fragment was digested with PstI and BamHI restriction enzymes, inserted into the pT7KSC recombinant expression vector prepared in Example 2, and then transformed into E. coli XL1-Blue using the electroporation method. Transformed strains were selected in LB plate medium with kanamycin (50 μg / L) added to obtain a pT7KSC-H1 recombinant expression vector. The recombinant expression vector comprises a gene consisting of one set of poly-histidine peptides consisting of six histidines.

이어, 폴리-히스티딘 펩타이드 2개의 세트로 구성된 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pT7KSC-H2를 제조하기 위해서, 전기 중합효소 연쇄반응을 통해 수득한 폴리-히스티딘 펩타이드 유전자를 제한효소 SalI과 XhoI으로 절단하고, pT7KSC-H1 재조합 발현벡터에 삽입시킨 후, 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하여 형질변환시켰다. 형질변환된 균주는 카나마이신(50μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pT7KSC-H2 재조합 발현벡터를 수득하였다. 전기 재조합 발현벡터는 6개의 히스티딘으로 구성된 폴리-히스티딘 펩타이드2개의 세트로 구성된 유전자를 포함한다.Subsequently, in order to prepare a recombinant expression vector pT7KSC-H2 comprising a gene consisting of two sets of poly-histidine peptides, the poly-histidine peptide gene obtained through the electropolymerase chain reaction was digested with restriction enzymes SalI and XhoI, After insertion into the pT7KSC-H1 recombinant expression vector, it was transformed into E. coli XL1-Blue using the electroporation method. Transformed strains were selected in LB plate medium with kanamycin (50 μg / L) added to obtain a pT7KSC-H2 recombinant expression vector. The recombinant expression vector comprises a gene consisting of two sets of poly-histidine peptides consisting of six histidines.

상기와 같은 방법으로 각각 폴리-히스티딘 펩타이드 6개, 12개 또는 18개를 포함하는 유전자를 가진 재조합 발현벡터 pT7KSC-H6, pT7KSC-H12 또는 pT7KSC-H18을 제조하였다(참조: 도 3).In this manner, recombinant expression vectors pT7KSC-H6, pT7KSC-H12, or pT7KSC-H18 having genes including 6, 12 or 18 poly-histidine peptides were prepared (see FIG. 3).

실시예 4: pT7KSC-H18 융합 단백질의 발현 Example 4 Expression of pT7KSC-H18 Fusion Proteins

실시예 3에서 제작된 재조합 발현벡터 pT7KSC-H18로 형질변환된 대장균 BL21(DE3)에서 모델 단백질이 융합된 살모넬라 티피뮤리움 세포 외막 단백질 C의 발현을 SDS-PAGE 방법을 이용하여 확인하였다. 즉, OmpC-(6His)n 융합 단백질의 발현 정도를 조사하기 위하여 재조합 대장균들을 LB 액체 배지 50mL가 담긴 250mL 삼각 플라스크에 접종하고, IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 유전자 발현을 유도하면서 30℃에서 배양하였다. 이때, 유전자 발현 유도는 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.6일 때 0.01mM의 IPTG를 첨가하여 수행하였다.Expression of Salmonella typhimurium cell outer membrane protein C fused with a model protein in E. coli BL21 (DE3) transformed with the recombinant expression vector pT7KSC-H18 prepared in Example 3 was confirmed using the SDS-PAGE method. That is, in order to investigate the expression level of OmpC- (6His) n fusion protein, recombinant E. coli were inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL of LB liquid medium, and IPTG (isopropyl-β-thiogalactoside) was added to induce gene expression. Incubated at ℃. In this case, gene expression induction was performed by adding 0.01 mM IPTG when the optical density (O.D.) measured at 600 nm wavelength with a spectrophotometer was 0.6.

발현 유도 4시간 후, 배양액 3mL씩을 채취하여 세포 외막 단백질을 다음과 같은 방법으로 분획하였다: 배양액 3mL를 4℃에서 6000rpm으로 5분동안 원심분리 한 후, 침전물을 수득하여 1mL Na₂HPO₄(pH 7.2) 완충용액으로 한번 세척한 다음, 다시 4℃에서 6000rpm으로 5분 동안 원심분리하고, Na₂HPO₄(pH 7.2) 완충용액 0.5mL에현탁하였다. 이어, 현탁한 용액을 초음파 처리(sonication) 하여 현탁액 속의 모든 세포를 파쇄하고, 실온에서 12000rpm으로 2분동안 원심분리하여 세포 파편(debris)이 제거된 상층액을 수득하였다. 전기 상층액을 실온에서 12000rpm으로 30분동안 원심분리한 후, 0.5mL 인산완충용액( 0.5%(w/v) sarcosyl, 10mM Na₂HPO₄, pH 7.2)에 현탁하여 세포막 단백질 분획을 수득하였다. 세포막 단백질 분획을 37℃에서 30분동안 방치한 후, 4℃에서 12000rpm으로 30분동안 원심분리하여 불용상 분획을 수득하고, 인산완충용액(10mM Na₂HPO₄, pH 7.2)으로 세척한 다음, 50㎕ PBS(0.274M NaCl, 0.041M Na₂HPO₄, 0.047M KH₂PO₄, 0.005M KCl, pH 7.4) 용액에 현탁하여 세포 외막 단백질 분획 시료 용액을 준비하였다(참조: Puenete, J.L.,et al., Gene,156:1-9, 1995). 상기 시료 용액을 SDS-PAGE로 분석한 결과, pT7KSC-H18은 성공적으로 살모넬라 세포외막 단백질 C에 삽입되어 살모넬라의 세포외막에 발현되었음을 알 수 있었다.After 4 hours of expression induction, 3 mL of the culture was collected and the outer membrane protein was fractionated in the following manner: 3 mL of the culture was centrifuged at 6000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and then a precipitate was obtained to obtain 1 mL Na ₂ HPO ₄ (pH). 7.2) After washing once with buffer, it was again centrifuged at 6000 rpm for 5 minutes at 4 ° C and suspended in 0.5 mL of Na ₂ HPO ₄ (pH 7.2) buffer. The suspended solution was then sonicated to disrupt all the cells in the suspension and centrifuged at 12000 rpm for 2 minutes at room temperature to give a supernatant free of cell debris. The supernatant was centrifuged at 12000 rpm for 30 minutes at room temperature, and then suspended in 0.5 mL phosphate buffer solution (0.5% (w / v) sarcosyl, 10 mM Na ₂ HPO ₄ , pH 7.2) to obtain a cell membrane protein fraction. Cell membrane protein fractions were left for 30 minutes at 37 ℃, centrifuged at 12000 rpm for 30 minutes at 4 ℃ to obtain an insoluble fraction, washed with phosphate buffer (10 mM Na ₂ HPO ₄ , pH 7.2), Extracellular membrane protein fraction sample solutions were prepared by suspending in 50 μl PBS (0.274M NaCl, 0.041M Na ₂ HPO ₄ , 0.047M KH ₂ PO ₄ , 0.005M KCl, pH 7.4) solution (Puenete, JL, et. al., Gene, 156: 1-9, 1995). Analysis of the sample solution by SDS-PAGE showed that pT7KSC-H18 was successfully inserted into Salmonella extracellular membrane protein C and expressed on Salmonella extracellular membrane.

실시예 5: 재조합 발현벡터 pT7KSC-H6, pT7KSC-H12 또는 pT7KSC-H18을 가지는 재조합 대장균의 중금속(카드늄) 흡착능비교 Example 5 Comparison of Heavy Metal (Cadmium) Adsorption Capacity of Recombinant Escherichia coli with Recombinant Expression Vectors pT7KSC-H6, pT7KSC-H12 or pT7KSC-H18

실시예 3에서 제조한 재조합 발현벡터 pT7KSC-H6, pT7KSC-H12 또는 pT7KSC-H18을 가지는 형질변환체가 세포표면에 히스티딘 링커가 발현되지 않는 재조합 발현벡터 pT7KSC를 가지는 형질변환체에 비하여 실제로 중금속을 얼마나 흡착할 수있는지 비교하였다. 즉, pT7KSC, pT7KSC-H6, pT7KSC-H12 또는 pT7KSC-H18을 포함하는 각 형질변환체를 실시예 4와 동일한 조건으로, 세포를 각각 배양하여 유도 발현시키고, 2시간이 경과하면 세포를 0.85%(w/v) NaCl 용액으로 2번 세척한 후, 세포의 최종 농도가 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 5.0이 되도록 0.85%(w/v) NaCl 용액에 농축하였다. 여기에 동일한 부피의 50ppm(0.85%(w/v) NaCl 용액, pH 5.8) 농도를 가진 카드늄클로라이드(CdCl₂)를 첨가한 후, 이 혼합 용액을 25℃에서 교반하며 24시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후에 다시 세포를 0.85%(w/v) NaCl 용액으로 2번 세척한 후, 실온에서 70%(w/v) 질산(nitric acid) 용액을 첨가하여 완전히 분해시켰다. 이렇게 얻어진 시료를 공기-아세틸렌 불꽃(air-acetylene flame)과 할로우 음극 램프(hollow cathode lamp)를 이용한 원자 분석 시스템(atomic analysis system ; Perkin-Elmer 3100, Norwalk, CT, USA)을 이용하여 분석하고, 용액속의 카드늄 농도를 정량하였다(참조: 도 4). 이때, 사용한 파장은 228.2nm이고, 슬릿 폭(slit width)은 0.7nm 이었다. 도 4에서 보듯이, pT7KSC로 형질변환된 미생물에 비하여 히스티딘 링커가 세포표면에 발현되는 재조합 발현벡터로 형질변환된 미생물은 히스티딘 링커의 수가 증가함에 따라 흡착되는 카드늄 이온의 농도가 높아짐을 알 수 있었다. 이는, 소사(Sousa) 등의 보고와 비교할 때, 본 발명의 형질변환된 대장균이 보다 높은 효율로 카드뮴을 흡착함을 알 수 있었다(참조: Sousa, C.,et al., Nature Biotechnol., 14:1017-1020, 1996).The transformant having the recombinant expression vector pT7KSC-H6, pT7KSC-H12 or pT7KSC-H18 prepared in Example 3 actually adsorbed heavy metals compared to the transformant having the recombinant expression vector pT7KSC without histidine linker expression on the cell surface. I was able to compare. That is, each transformant containing pT7KSC, pT7KSC-H6, pT7KSC-H12, or pT7KSC-H18 was cultured and expressed by incubating the cells under the same conditions as in Example 4, respectively, and after 2 hours, the cells were 0.85% ( w / v) After washing twice with NaCl solution, the cells were concentrated in 0.85% (w / v) NaCl solution so that the optical density (OD) of 5.0 was measured at 600 nm wavelength with a spectrophotometer. Cadmium chloride (CdCl ₂ ) having the same volume of 50 ppm (0.85% (w / v) NaCl solution, pH 5.8) concentration was added thereto, and the mixed solution was reacted for 24 hours with stirring at 25 ° C. After completion of the reaction, the cells were washed twice with 0.85% (w / v) NaCl solution, and then completely decomposed by adding a 70% (w / v) nitric acid solution at room temperature. The sample thus obtained was analyzed using an atomic analysis system (air-acetylene flame and hollow cathode lamp) (Perkin-Elmer 3100, Norwalk, CT, USA), The cadmium concentration in the solution was quantified (see Figure 4). At this time, the used wavelength was 228.2 nm, and the slit width was 0.7 nm. As shown in FIG. 4, compared to the microorganism transformed with pT7KSC, the microorganism transformed with the recombinant expression vector expressing the histidine linker on the cell surface showed that the concentration of cadmium ions adsorbed as the number of histidine linkers increased. . Compared with Sousa et al., It was found that the transformed E. coli adsorbed cadmium with higher efficiency (Sousa, C., et al., Nature Biotechnol ., 14 : 1017-1020, 1996).

실시예 5: 재조합 발현 백터 pT7KSC-GFP의 제조 및 GFP의 발현 Example 5 Preparation of Recombinant Expression Vector pT7KSC-GFP and Expression of GFP

실시예 2에서 제조한 재조합 플라스미드 pT7KSC에 모델 단백질로서 약 27 kDa 크기를 가지는 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)을 부착하여 세포표면에 발현시키기 위하여 pT7KSC-GFP 재조합 발현 벡터를 제조하였다. 즉, GFP 유전자를 얻기 위해 플라스미드 pGFPuv를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용하여 1차 중합효소 연쇄반응(첫번째 변성 94℃ 5분, 두번째 변성 94℃ 30초, 교잡 54℃ 30초, 연장 72℃ 30초, 10회 반복)을 수행하고, 다시 2차로 중합효소 연쇄반응(변성 94℃ 30초, 교잡 60℃ 30초, 연장 72℃ 30초, 20회 반복)을 수행하였다(참고: Crameri. A,Nature. Biotechnol.,14:315-319, 1996).A pT7KSC-GFP recombinant expression vector was prepared in order to attach a green fluorescent protein (GFP) having a size of about 27 kDa as a model protein to the recombinant plasmid pT7KSC prepared in Example 2 and express it on the cell surface. That is, the plasmid pGFPuv as a template to obtain the GFP gene, and using the following primers, the first polymerase chain reaction (first denaturation 94 ℃ 5 minutes, second denaturation 94 ℃ 30 seconds, hybridization 54 ℃ 30 seconds, extension 72 ℃ 30 seconds, 10 repetitions), and the second polymerase chain reaction (denaturation 94 ℃ 30 seconds, hybridization 60 ℃ 30 seconds, extension 72 ℃ 30 seconds, 20 repetitions) (see: Crameri. A) , Nature.Biotechnol ., 14: 315-319, 1996).

primer9 5'-AACTGCAGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3'(서열번호 9)primer9 5'-AACTGCAGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3 '(SEQ ID NO: 9)

primer10 5'-CGGGATCCTTATTTGTAGAGCTCATCCAT-3'(서열번호 10)primer10 5'-CGGGATCCTTATTTGTAGAGCTCATCCAT-3 '(SEQ ID NO: 10)

아가로즈 젤 전기영동법을 이용하여, 중합효소 연쇄반응 방법으로 수득한 DNA 절편으로부터 5'-말단에는 PstII 제한효소 자리가 존재하고, 3'-말단에는 BamHI 자리가 존재하는 약 700bp 크기의 DNA 절편인 GFP 단백질 유전자를 수득하였다.By using agarose gel electrophoresis, DNA fragments obtained from polymerase chain reaction method were DNA fragments of about 700 bp in size with PstII restriction enzyme sites at the 5'-end and BamHI sites at the 3'-end. GFP protein gene was obtained.

전기 수득한 GFP 단백질 유전자를 PstI과 BamHI 제한효소로 절단하고, pT7KSC 재조합 발현벡터에 삽입시킨 다음, 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하여 형질변환시켰다. 형질변환된 균주는 카나마이신(50μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pT7KSC-GFP 재조합 발현벡터를 수득하였다(참조: 도 5). 이어, 전기 발현벡터를 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 형질변환체를 제조하고, 이를 LB 액체 배지 50mL가 담긴 250mL 삼각 플라스크에 접종하여, IPTG로 발현을 유도하며, 30℃에서 배양하였다. 이때, 발현 유도는 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.6일 때 0.01mM의 IPTG를 첨가시킴으로써 행하였다. 각 시료로 실시예 4의 방법으로 SDS-PAGE를 수행하고, 이를 분석한 결과, pT7KSC-GFP은 성공적으로 살모넬라 세포외막 단백질 C에 삽입되어 살모넬라의 세포외막에 발현되었음을 알 수 있었다. 또한, 전기 SDS-PAGE 젤 전기영동 결과를 보다 정확히 하기 위하여, 이뮤노블랏을 수행한 결과, GFP 단백질이 성공적으로 대장균의 세포 외막에서 발현되었음을 알 수 있었다.The obtained GFP protein gene was digested with PstI and BamHI restriction enzymes, inserted into a pT7KSC recombinant expression vector, and transformed by introducing into E. coli XL1-Blue using an electroporation method. Transformed strains were selected in LB plate medium to which kanamycin (50 μg / L) was added to obtain a pT7KSC-GFP recombinant expression vector (see FIG. 5). Subsequently, the expression vector was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) to prepare a transformant, which was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL of LB liquid medium to induce expression by IPTG and incubated at 30 ° C. At this time, expression induction was performed by adding 0.01 mM IPTG when the optical density (O.D.) measured at 600 nm wavelength with a spectrophotometer was 0.6. SDS-PAGE was carried out by the method of Example 4 with each sample, and the analysis result showed that pT7KSC-GFP was successfully inserted into Salmonella extracellular membrane protein C and expressed in Salmonella's extracellular membrane. In addition, in order to more precisely the results of the electrophoresis of the SDS-PAGE gel electrophoresis, the results of immunoblotting, it was confirmed that the GFP protein was successfully expressed in the extracellular membrane of E. coli.

또한, 발현된 GFP가 정상적인 기능을 수행할 수 있도록 발현되었는지를 확인하기 위하여, GFP가 세포표면에 발현된 형질변환체에 UV를 조사하여, GFP가 정상적으로 발광하는지 알아보았다. 이때, 대조군으로는 형질변환되지 않은 BL21(DE3)을 사용하고, UV는 366nm의 파장으로 조사하였다(참조: 도 6). 도 6은 366nm 파장의 UV 하에서 pT7KSC-GFP에 의해 형질 변환된 대장균 BL21(DE3)와 대조군을 관찰한 사진인데, 도 6a는 실험군을 나타내고, 도 6b는 대조군을 나타낸다. 도 6에서 보듯이, UV조사시 대조군은 녹색 빛이 발광되지 않으나, 실험군은 밝은 녹색으로 발광하므로, 세포표면에 발현된 GFP 단백질이 활성화된 상태임을 알 수 있었다.In addition, in order to confirm whether the expressed GFP was expressed to perform a normal function, UV was irradiated to the transformant expressed on the cell surface of the GFP, to determine whether the GFP normally emits light. In this case, the untransformed BL21 (DE3) was used as a control, and UV was irradiated at a wavelength of 366 nm (see FIG. 6). FIG. 6 is a photograph of E. coli BL21 (DE3) transformed with pT7KSC-GFP and a control group under UV of 366 nm wavelength. FIG. 6A shows an experimental group and FIG. 6B shows a control group. As shown in FIG. 6, the control group does not emit green light during UV irradiation, but the experimental group emits light green, indicating that the GFP protein expressed on the cell surface is activated.

따라서, 전기의 표면 발현 벡터를 이용하여 성공적으로 대장균 세포표면에 단백질을 발현시켰음을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the protein was successfully expressed on the surface of E. coli cells using the surface expression vector.

본 발명자들은 GFP를 발현시킬 수 있는 pT7KSC-GFP를 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 제조된 형질변환체를 "대장균 BL21(DE3)/pT7KSC-GFP(Escherichia coli BL21(DE3)/pT7KSC-GFP)"라 명명하고, 이를 2000년 11월 30일자로 국제기탁기관인 생명공학연구원(KRIBB) 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 소재)에 기탁번호 "KCTC 0897BP"로 기탁하였다.The present inventors introduced a transformant prepared by introducing pT7KSC-GFP capable of expressing GFP into Escherichia coli BL21 (DE3), "Escherichia coli BL21 (DE3) / pT7KSC-GFP)." It was named as "KCTC 0897BP" to KRIBB Gene Bank (KCTC, Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon, Korea) as of November 30, 2000.

실시예 6: 리파제를 세포표면 발현하는 재조합 발현벡터 placKSC-lip의 제조 및 형질변환체의 제조 Example 6 : Preparation of recombinant expression vector placKSC-lip expressing lipase cell surface and preparation of transformant

리파제를 세포표면 발현하는 재조합 플라스미드를 제조하기 위하여 우선 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)의 리파제 유전자를 다음과 같이 수득하였다. 즉, 슈도모나스 플루오레센스의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 하기 프라이머를 사용하여, 중합효소 연쇄반응(첫번째 변성 94℃ 5분, 두번째 변성 94℃ 45초, 교잡 60℃ 45초, 연장 72℃ 1분 10초, 30회 반복)을 수행하였다To prepare a recombinant plasmid expressing lipase cell surface, first, a lipase gene of Pseudomonas fluorescens was obtained as follows. That is, the chromosomal DNA of Pseudomonas fluorescens was used as a template, and the following primer was used to polymerase chain reaction (first denaturation at 94 ° C for 5 minutes, second denaturation at 94 ° C for 45 seconds, hybridization at 60 ° C for 45 seconds, and extension at 72 ° C for 1 minute). 10 seconds, 30 repetitions)

primer11 5'-ACCTGCAGATCACGTTGTATACCTATCACA-3'(서열번호 11)primer11 5'-ACCTGCAGATCACGTTGTATACCTATCACA-3 '(SEQ ID NO: 11)

primer12 5'-GCGGATCCAAAACTCAGCACCGTATCG-3'(서열번호 12)primer12 5'-GCGGATCCAAAACTCAGCACCGTATCG-3 '(SEQ ID NO: 12)

아가로즈 젤 전기영동법을 이용하여, 중합효소 연쇄반응 방법으로 수득한 DNA 절편으로 부터 약 1.4kbp 크기의 DNA 절편인 리파제 유전자를 수득하였다. 전기 리파제 유전자를 PstI과 BamHI으로 절단하고, placKSC에 삽입시켜서, 재조합 발현벡터 placKSC-lip를 제조하고, 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 MC4100[F ^- araD139 △(argF-lac)U169 rpsL150(strr) relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR]과 XL1-Blue[supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA46 thi relA 1 lac F'[proAB+ lacIq lacZ △M15 Tn10(tet ^r )]]에 도입하여 형질변환 시켰다. 형질변환된 균주는 카나마이신(10μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 선별된 균주를 LB 액체배지에서 배양하여 -80℃ 냉동고에 보관하였다(참조: 도 7).Agarose gel electrophoresis was used to obtain a lipase gene, a DNA fragment of about 1.4 kbp from a DNA fragment obtained by the polymerase chain reaction method. The lipase gene was digested with PstI and BamHI, inserted into placKSC to prepare a recombinant expression vector placKSC-lip, and E. coli MC4100 [ F ^- araD139Δ (argF-lac) U169 rpsL150 (strr) using an electroporation method . relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR ] and XL1-Blue [ supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA46 thi relA 1 lac F '[proAB + lacIq lacZ ΔM15 Tn10 (tet ^r )] ] were transformed. Transformed strains were selected in LB plate medium to which kanamycin (10 μg / L) was added, and the selected strains were cultured in LB liquid medium and stored in a -80 ° C. freezer (see FIG. 7).

실시예 7: 세포표면발현된 리파제를 이용한 라세미 3-하이드록시부탄산 에틸 에스테르의 광학분할 Example 7 Optical Segmentation of Racemic 3-hydroxybutanoic Acid Ethyl Ester Using Cell Surface Expressed Lipase

실시예 6에서 제조된 형질변환체를 카나마이신(30g/L)이 함유된 100mL의 LB 액체배지가 담긴 250 mL 삼각플라스크에 접종하여 30℃에서 8시간 동안 배양하고, 상기 배양액의 1mL을 취하여 카나마이신(30g/L)이 첨가된 100mL의 LB 액체배지가 담긴 250mL 삼각플라스크에 다시 접종하여 30℃에서 배양하였다. 분광광도계로600nm 파장에서 측정한 흡광도가 0.7일 때 20%(w/v) IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 발현유도 5시간 경과 후, 6000rpm에서 7분 동안 배양액을 원심분리 하여 세포를 수득하고, 세포를 0.1M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)으로 세척하였으며, 3mL의 상기 완충용액으로 재현탁한 다음, 10mL 플라스크에 넣고 20mg의 라세미 3-하이드록시부탄산 에틸 에스테르를 첨가하고, 24시간동안 교반하며 반응시켰다. 이어, 6000rpm에서 7분 동안 원심분리하여 세포를 제거하고, 상등액을 수득한 다음, 10mL의 클로로포름으로 5번 추출하고, 진공 회전식 증류농축기를 사용하여 용매를 제거한 후, 키랄성 (S)-(+)-3-하이드록시부탄산 에틸 에스테르 8mg(수율 40%)을 수득하였다.The transformant prepared in Example 6 was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 100 mL of LB liquid medium containing kanamycin (30 g / L), incubated at 30 ° C. for 8 hours, and 1 mL of the culture solution was taken to kanamycin ( 30 g / L) was inoculated again into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 100 mL of LB liquid medium and incubated at 30 ° C. Gene expression was induced by adding 20% (w / v) IPTG when the absorbance measured at 600 nm with a spectrophotometer was 0.7. After 5 hours of induction, cells were obtained by centrifuging the culture solution at 6000 rpm for 7 minutes, and the cells were washed with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8), resuspended with 3 mL of the above buffer, and then 10 mL flask. 20 mg of racemic 3-hydroxybutanoic acid ethyl ester was added and reacted with stirring for 24 hours. Cells were then removed by centrifugation at 6000 rpm for 7 minutes, supernatant was obtained, extracted 5 times with 10 mL of chloroform, and the solvent was removed using a vacuum rotary distillate, followed by chiral (S)-(+) 8 mg (40% yield) of -3-hydroxybutanoic acid ethyl ester were obtained.

[α]_D+25^o(c 1, CHCl₃);[α] _D +25 ^o (c 1, CHCl ₃ );

IR(neat) 3448, 2979, 2936, 2909, 1735, 1719 cm^-1;IR (neat) 3448, 2979, 2936, 2909, 1735, 1719 cm ⁻¹ ;

¹H NMR(CDCl₃) δ1.23(d,J = 6.3 Hz, 3H, CH₃CH(OH)), ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ1.23 (d, J = 6.3 Hz , 3H, CH ₃ CH (OH)),

1.26(t,J = 7.2 Hz, 3H, CH₃CH₂O), 2.39-2.51(m, 2H, CH₂CO),1.26 (t, J = 7.2 Hz , 3H, CH ₃ CH ₂ O), 2.39-2.51 (m, 2H, CH ₂ CO),

3.15(s, OH), 4.15-4.23(m, 3H, OCH & OCH₂);3.15 (s, OH), 4.15-4.23 (m, 3H, OCH & OCH ₂ );

¹³C NMR(CDCl₃) δ14.19, 22.47, 42.86, 60.67, 64.27, 173.16; ¹³ C NMR (CDCl ₃ ) δ 14.19, 22.47, 42.86, 60.67, 64.27, 173.16;

CIMS, m/z 132(M⁺), 86(base).CIMS, m / z 132 (M ⁺ ), 86 (base).

실시예 8: 세포표면에 발현된 리파제를 이용한 라세미 베타-락탐, 라세미 시스-3-아세톡시-4-페닐아제티딘-2-온의 광학분할 Example 8 Optical Segmentation of Racemic Beta-lactam and Racemic cis-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-one Using Lipase Expressed on Cell Surface

실시예 7과 동일한 방법으로 세포를 수득하고, 3mL의 0.1M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 현탁시킨 다음, 20mg의 라세미 베타-락탐, 라세미 시스-3-아세톡시-4-페닐아제티딘-2-온(racemic cis-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-one)을 첨가하고, 24시간 동안 교반하며 반응시켰다. 이때, 반응시료를 박막크로마토그래피(TLC)에 적용하여(클로로포름:에틸아세테이트:헥산=3:2:3(v:v:v)) 반응의 진행도를 확인하였다.Cells were obtained in the same manner as in Example 7, suspended in 3 mL of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8), followed by 20 mg of racemic beta-lactam, racemic cis-3-acetoxy-4-phenylase Tidin-2-one (racemic cis-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-one) was added and reacted with stirring for 24 hours. At this time, the reaction sample was subjected to thin layer chromatography (TLC) (chloroform: ethyl acetate: hexane = 3: 2: 3 (v: v: v)) to confirm the progress of the reaction.

반응 후, 6000rpm에서 7분 동안 원심분리하여 세포를 제거하고, 상등액을 수득하여, 10mL의 에틸아세테이트로 5번 추출하고, 진공 회전식 증류농축기를 이용하여 용매를 제거한 다음, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 통하여 키랄성 베타-락탐, 8mg의 (-)-시스-3-하이드록시-4-페닐아제티딘-2-온((-)-cis-3-hydroxy-4-phenylazetidin-2-one)(수율 40%)과 6mg의 (-)-시스-3-아세톡시-4-페닐아제티딘-2-온((-)-cis-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-one)(수율 30%)을 수득하였다.After the reaction, the cells were removed by centrifugation at 6000 rpm for 7 minutes, a supernatant was obtained, extracted five times with 10 mL of ethyl acetate, and the solvent was removed using a vacuum rotary distillate, followed by chirality through silica gel column chromatography. Beta-lactam, 8 mg of (-)-cis-3-hydroxy-4-phenylazetidin-2-one ((-)-cis-3-hydroxy-4-phenylazetidin-2-one) (yield 40%) And 6 mg of (-)-cis-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-one ((-)-cis-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-one) (yield 30%) were obtained. .

(-)-시스-3-하이드록시-4-페닐아제티딘-2-온(-)-Cis-3-hydroxy-4-phenylazetidin-2-one

[α]_D-130^o(c 0.5, CH₃OH);[α] _D -130 ^o (c 0.5, CH ₃ OH);

¹H NMR (CDCl₃& DMSO-d₆) δ3.60(s, 1 H, OH), ¹ H NMR (CDCl ₃ & DMSO-d ₆ ) δ 3.60 (s, 1 H, OH),

4.95(d,J = 4.7 Hz, 1 H, C3 H), 5.88(d,J = 4.7 Hz, 1 H, C4 H),4.95 (d, J = 4.7 Hz , 1 H, C3 H), 5.88 (d, J = 4.7 Hz , 1 H, C4 H),

6.22(s, 1 H, NH), 7.27-7.40(m, 5 H, ArH);6.22 (s, 1H, NH), 7.27-7.40 (m, 5H, ArH);

¹³C NMR(CDCl₃& DMSO-d₆) δ58.6, 79.1, 127.6, 128.1, 137.1, 170.5; ¹³ C NMR (CDCl ₃ & DMSO-d ₆ ) δ 58.6, 79.1, 127.6, 128.1, 137.1, 170.5;

CIMS, m/z 163(M⁺), 91(base).CIMS, m / z 163 (M ⁺ ), 91 (base).

(-)-시스-3-아세톡시-4-페닐아제티딘-2-온(-)-Cis-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-one

[α]_D-30^o(c 1, CHCl₃); IR (KBr) 3200, 1750, 1720 cm^-1;[α] _D −30 ^o (c 1, CHCl ₃ ); IR (KBr) 3200, 1750, 1720 cm ⁻¹ ;

¹H NMR(CDCl₃) δ1.68(s, 3 H, CH₃CO), 5.05(d,J = 4.5 Hz, 1 H, C3 H), ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 1.68 (s, 3 H, CH ₃ CO), 5.05 (d, J = 4.5 Hz , 1 H, C3 H),

5.88(dd,J = 2.6 & 4.5 Hz, 1 H, C4 H), 6.25(s, 1 H, NH),5.88 (dd, J = 2.6 & 4.5 Hz , 1 H, C4 H), 6.25 (s, 1 H, NH),

7.29-7.39(m, 5 H, Ar);7.29-7.39 (m, 5H, Ar);

¹³C NMR(CDCl₃) δ19.7, 57.9, 78.3, 127.5, 127.7, 128.2, 128.5, 134.7, ¹³ C NMR (CDCl ₃ ) δ 19.7, 57.9, 78.3, 127.5, 127.7, 128.2, 128.5, 134.7,

165.6((β-lactam CO), 169.0(acetoxy CO);165.6 ((β-lactam CO), 169.0 (acetoxy CO);

CIMS, m/z 205(M⁺), 106(base).CIMS, m / z 205 (M ⁺ ), 106 (base).

실시예 9: 세포표면 발현된 리파제를 이용한 라세미 베타-락탐, 라세미 시스-3-아세톡시-4-페닐아제티딘-2-온의 광학분할 Example 9 Optical Segmentation of Racemic Beta-lactam and Racemic cis-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-one Using Cell Surface Expressed Lipase

세포표면발현 리파제로서 대장균 XL1-Blue에 세포표면 발현된 리파제를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 8과 동일한 방법을 사용하여, 키랄성 베타-락탐, 7mg의 (-)-시스-3-하이드록시-4-페닐아제티딘-2-온(수율 35%)과 6mg의 (-)-시스-3-아세톡시-4-페닐아제티딘-2-온(수율 30%)을 수득하였다.Chiral beta-lactam, 7 mg of (-)-cis-3-hydroxy-, was used in the same manner as in Example 8, except that cell surface-expressed lipase was used as a cell surface-expressed lipase in Escherichia coli XL1-Blue. 4-phenylazetidin-2-one (yield 35%) and 6 mg of (-)-cis-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-one (yield 30%) were obtained.

[α]_D-128^o(c 0.5, CH₃OH);[α] _D -128 ^o (c 0.5, CH ₃ OH);

¹H NMR(CDCl₃& DMSO-d₆) δ3.60(s, 1 H, OH), ¹ H NMR (CDCl ₃ & DMSO-d ₆ ) δ 3.60 (s, 1 H, OH),

CIMS, m/z 163(M⁺), 91(base).CIMS, m / z 163 (M ⁺ ), 91 (base).

[α]_D-28^o(c 1, CHCl₃);[α] _D -28 ^o (c 1, CHCl ₃ );

IR (KBr) 3200, 1750, 1720 cm^-1;IR (KBr) 3200, 1750, 1720 cm ⁻¹ ;

7.29-7.39(m, 5 H, Ar);7.29-7.39 (m, 5H, Ar);

¹³C NMR (CDCl₃) δ19.7, 57.9, 78.3, 127.5, 127.7, 128.2, 128.5, 134.7, ¹³ C NMR (CDCl ₃ ) δ 19.7, 57.9, 78.3, 127.5, 127.7, 128.2, 128.5, 134.7,

CIMS, m/z 205(M⁺), 106(base).CIMS, m / z 205 (M ⁺ ), 106 (base).

상기 실시예 7 내지 9에서 보듯이, 세포표면에 발현된 리파제는 정상적으로 발현되어 키랄화합물의 제조에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 회수가 용이하여, 키랄 화합물의 제조공정을 단순화시킬 수 있었다.As shown in Examples 7 to 9, the lipase expressed on the cell surface can be normally expressed and used for the preparation of the chiral compound, and can be easily recovered, thereby simplifying the manufacturing process of the chiral compound.

이에, 본 발명자들은 리파제를 발현시킬 수 있는 placKSC-lip을 대장균 MC4100에 도입하여 제조된 형질변환체를 "대장균 MC4100/placKSC-lip(Escherichia coli MC4100/placKSC-lip)"라 명명하고, 이를 2000년 11월 30일자로 국제기탁기관인 생명공학연구원(KRIBB) 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 소재)에 기탁번호 "KCTC-0898BP"로 기탁하였다.Accordingly, the present inventors named a transformant prepared by introducing a lipase-expressing placKSC-lip into E. coli MC4100, "E. coli MC4100 / placKSC-lip (Escherichia coli MC4100 / placKSC-lip)," On November 30, it was deposited with KRIBB Gene Bank (KCTC, Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon, Korea) with the deposit number "KCTC-0898BP".

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 세포표면에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 고안된 살모넬라 티피뮤리움(Salmonlla typhimurium)에서 유래한 세포 외막 단백질 C의 변형된 유전자, 전기 유전자를 세포표면 발현 모체로 사용하여 외래 단백질이나 펩타이드를 세포표면에 효율적으로 발현시킬 수 있는 발현벡터, 전기 발현벡터에 의하여 형질변환된 미생물 및 그를 이용하여 외래 단백질을 박테리아의 세포표면에 효율적으로 발현시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 세포 외막에 외래 단백질을 정상적인 기능을 가진 상태로 발현시킬 수 있으므로, 삽입되는 외래 유전자에 따라 생물학적 변환, 재조합 생백신, 여러 펩타이드나 항체의 선별, 중금속 제거 또는 폐수 처리에 응용할 수 있는 전세포 흡착제에 이용되는 효소 혹은 단백질을 세포표면에 안정적으로 발현시켜 지속적으로 촉매의 활성의 감소 없이 안정되게 사용할 수 있는 전세포 생물변환 등의 목적에 유용하게 사용할 수 있다.As described and demonstrated in detail above, the present invention is a cell surface expression matrix, a modified gene of the extracellular membrane protein C derived from Salmonlla typhimurium , which is designed to express the target protein on the cell surface. The present invention provides an expression vector capable of efficiently expressing a foreign protein or peptide on a cell surface, a microorganism transformed by an electric expression vector, and a method of efficiently expressing a foreign protein on a cell surface of a bacterium using the same. According to the present invention, foreign proteins can be expressed on the outer membrane in a state having a normal function, and according to the foreign genes to be inserted, they can be applied to biological transformation, recombinant live vaccines, selection of various peptides or antibodies, heavy metal removal or wastewater treatment. Enzymes or proteins used in whole cell adsorbents can be stably expressed on the cell surface, and can be usefully used for the purpose of whole cell biotransformation, which can be used stably without decreasing catalyst activity continuously.

<110> Korean Advanced Institute of Science and Technology <120> Gene for Cell-surface Expression <160> 12 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 <400> 1 ggaattccat atgtgtttcc tgtgtgaaat tgtt 34 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 <400> 2 tgctcacatg ttctttcctg 20 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer3 <400> 3 gcggtacctt taaagccacg ttgtgtctca aa 32 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer4 <400> 4 cgaattctta gaaaaactca tcgagca 27 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer5 <400> 5 ggaattccat atgaaagtta aagtactg 28 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer6 <400> 6 ccgggatcct tattagaact ggtaaaccag 30 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer7 <400> 7 gatagatatc ctgcaggtcg acccaagcgg acatcaccat catcaccat 49 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer8 <400> 8 ccgggatcct tattactcga gaccagaatg gtgatgatgg tgatg 45 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer9 <400> 9 aactgcagag taaaggagaa gaacttttc 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer10 <400> 10 cgggatcctt atttgtagag ctcatccat 29 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer11 <400> 11 acctgcagat cacgttgtat acctatcaca 30 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer12 <400> 12 gcggatccaa aactcagcac cgtatcg 27<110> Korean Advanced Institute of Science and Technology <120> Gene for Cell-surface Expression <160> 12 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 > primer1 <400> 1 ggaattccat atgtgtttcc tgtgtgaaat tgtt 34 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 <400> 2 tgctcacatg ttctttcctg 20 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer3 <400> 3 gcggtacctt taaagccacg ttgtgtctca aa 32 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer4 < 400> 4 cgaattctta gaaaaactca tcgagca 27 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer5 <400> 5 ggaattccat atgaaagtta aagtactg 28 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer6 <400> 6 ccgggatcct tattagaact ggtaaaccag 30 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer7 <400> 7 gatagatatc ctgcaggtcg acccaagcgg acatcaccat catcaccat 49 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer8 <400> 8 ccgggatcct tattactcga gaccagaatg gtgatgatgg tgatg 45 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer9 <400> 9 aactgcagag taaaggagaa gaacttttc 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer10 <400> 10 cgggatcctt atttgtagag ctcatccat 29 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer11 <400> 11 acctgcagat cacgttgtat acctatcaca 30 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer12 <400> 12 gcggatccaa aactcagcac cgtatcg 27

Claims

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세포외막 단백질 C(OmpC)의 N-말단으로부터 7번째 루프에 이르는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, lac 프로모터, 카나마이신 유전자 및 리파제 유전자를 포함하고, 도 7로 나타내어지는 리파제의 세포표면 발현벡터 placKSC-lip.Cell surface expression vector placKSC-lip of a lipase, including a gene encoding the amino acid sequence from the N-terminus to the seventh loop of the extracellular membrane protein C (OmpC), the lac promoter, the kanamycin gene, and a lipase gene, as shown in FIG. .

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제 4항의 발현벡터 placKSC-lip가 대장균 MC4100에 도입되어 형질변환된 대장균 MC4100/placKSC-lip(Escherichia coliMC4100/placKSC-lip)(KCTC-0898BP). Escherichia coli MC4100 / placKSC-lip (KCTC-0898BP) transformed by introducing the expression vector placKSC-lip of claim 4 into E. coli MC4100.

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제 7항의 형질변환된 대장균 MC4100/placKSC-lip(KCTC-0898BP)을 배양하고, 전기 대장균의 표면에 발현된 리파제를 수득하는 공정을 포함하는 세포표면 발현 리파제의 제조방법.A method of producing a cell surface expression lipase comprising culturing the transformed Escherichia coli MC4100 / placKSC-lip (KCTC-0898BP) of claim 7 and obtaining a lipase expressed on the surface of E. coli.

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제 7항의 형질변환된 대장균 MC4100/placKSC-lip(KCTC-0898BP)을 이용하여, 라세미 에스테르 화합물을 광학분할함으로써, 키랄성 에스테르, 키랄성 유기산 또는 키랄성 알코올을 제조하는 단계를 포함하는 키랄성 화합물의 제조방법.A method for preparing a chiral compound comprising preparing chiral ester, chiral organic acid or chiral alcohol by optically dividing the racemic ester compound using the transformed E. coli MC4100 / placKSC-lip (KCTC-0898BP) of claim 7 .

제 11항에 있어서,The method of claim 11,

라세미 에스테르 화합물은 하이드록시카르복실산 알킬 에스테르The racemic ester compound is a hydroxycarboxylic acid alkyl ester

또는 락탐인 것을 특징으로 하는Or lactam.

키랄성 화합물의 제조방법.Method for producing a chiral compound.