KR101365056B1 - 세라리신의 폴리펩티드 분획을 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다른 조직의 유래로 활성화된 내피 세포의 종양 세포의 성장을 억제할 수 있는 조성물에 관련된 것이다. 상기 조성물의 조성은, 분자의 말단을 통해 내부 메티오닌으로부터 C-말단 분획에 상응하는 세라리신의 폴리펩티드 분획으로, 이들 사이에 조합되어질 수 있고 선택적으로 조성물의 항종양 효과를 강력하게 하는 프로디기오신과 조합될 수 있다. 조성물 내에서 프로디기오신은 0.1-100 nM의 농도로 되어질 수 있다. 이 조성물의 항-증식성 활성은 어팝토틱 메커니즘에 의해 매개되어진다. 이의 "생체 내" 투여는 항종양, 항혈관신생 및 악성종양에 대한 보호효과를 가진다.

세라리신, 메티오닌, 어팝토시스, 항종양,

Description

세라리신의 폴리펩티드 분획을 포함하는 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING POLYPEPTIDE FRAGMENTS OF SERRALYSINS}

본 발명은 생명공학, 약학 산업 및 특히 종양 세포의 성장을 저해할 수 있는 조성물의 생산에 관한 것이다. 이 조성물은 손상되지 않은 단백질의 분해로부터 얻어진, 세라리신(SERRALISINS)으로부터의 폴리펩티드 분획을 포함하여, 전체 세라리신 분자보다 보다 높은 항증식성 활성을 가진다. 상기 분획은 시퀀스의 내재 메티오닌으로부터 분자의 말단까지가 세라리신의 C-말단에 속하고, 이들의 프로디기오신(prodigiosins)과의 조합은 이 조성물의 항-종양 효과를 증진한다.

암의 화학 치료요법은 전통적으로 암 세포 증식을 저해하기 위한 것이다. 그럼에도 불구하고, 근년들어 아팝토시스를 유도하는 항종양 제품에 대한 흥미가 증가되고 있는데, 이는 암이 증식의 과잉 대신에 아팝토시스의 상대적인 결핍에 관련된 병상으로 확립되었기 때문이다.

박테리아 또는 그의 추출물은 약 100년 동안 암 치료를 위해 사용되어 왔다. 반드시 인용되어야 할 보고서는 슬로건-케티버그 메모리얼 호스피털(Sloan- Kettering Memorial Hospital)로 불리는 뉴욕시의 메모리얼 호스피털의 내과 및 외과의사인 William B. Coley의 것이다. 그는 몇 종류의 암을 갖는 많은 그의 환자가 병원성 박테리아에 의해 접촉되어진 후 종양의 퇴화를 경험했다는 것을 관찰했다(Coley, W. B. 1991-reprinted from 1893-. Clin. Orthop. 262:3).

감염된 환자 또는 동물에 있어 종양에 대한 저항성은 부수적 세포 매개 항종양 면역성에 기인된다(Paglia, P. and Guzman, C. A. 1998. Cancer immunol. Immunother. 46:88). 병원성 또는 박테리아 단세포 동물 감염은 선천적 또는 후천적 면역성의 활성화를 통해 암 퇴화를 활성화할 수 있다는 생각이 근년 들어 Hunter 등에 의해 제기되었다(Hunter, C. A., Yu, D., Gee, M., Ngo, C. V., Sevignani, C., Goldschmidt, M., Golovkina, T. V., Evans, S., Lee, W. F. and Thomas-Tekhonenko, A. 2001. J. Immunol. 166:5878). 이들은 포자충강 톡소플라스마(T. Gondii)에 의해 감염된 조직이 종양 내에 혈관의 형성을 회피하여 강력한 치료 물질이 될 수 있는 가용성 항혈관형성 인자를 생성한다는 것을 입증했다. 혈관신생작용으로 알려진 새로운 모세혈관의 형성 과정은 암 및 이들의 전이에 대한 새로운 치료법의 수행을 위해 주의를 끄는 중요한 포커스가 되고 있다. 항혈관형성 인자는 새로운 항암 치료 전략에의 기초이다 (Folkman, J. 2003. Seminars in Cancer Biology. 13:159). 근년 들어 화학적 치료욧법제 및 선택적 항혈관제로서 혐기성 박테리아의 사용은 마우스에서 피하(sc) 종양의 유의적인 퇴화의 결과를 가져왔다. 이 치료는 조합된 세균분해 치료법(combined bacteriolytic therapy; COBALTO)으로 명명되었다(Dang , L. H., Bettegowda , C., Huso , D.L., KInzler , K.W. and Vogelstein , B. 2001. Proc Natl Arad Sci USA. 98: 15155). 그럼에도 불구하고, 생균은 인간 암에 대한 이들의 사용을 제한하는 중요한 독성 및 부차적인 반응을 형성한다.

최근 들어, 혐기성 박테리아가 종양 세포 아팝토시스를 유도하는 산화환원 단백질을 방출한다는 것을 나타내는 보고서가 나타나고 있다(Yamada, T., Goto, M., Punj, V., Zaborina, O. and Chen, M.L. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 14088; Goto, M., Yamada, T., Kimbara, K., Horner, J., Newcomb, M., Gupta, T.K. and Chakrabarty, A. M. 2003. Mol Microbiol. 47:549). 산화환원 단백질이 원핵 세포 원종에 의해 분비된 가용성 단백질의 군에 포함되어 질 수 있고 이들의 작용은 원종의 진핵 세포의 제거일 수 있다는 것이 공리화되고 있다(Punj, V. and Chakrabarty, A. M. 2003. Cellular Microbiology. 5:225). 일반적으로 암 세포에 이들 세포사와 동시적으로 종양의 퇴화를 유발하는, 특이적 방식으로 암세포에 작용할 수 있는 이들 원핵 생물에 의한 가용성 분비 인자의 생산에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.

세라티아 마르세센스(Serratia marcescens; 영균)는 다른 환경에도 살 수 있는 혐기성 박테리아이다. 이들 균주의 몇몇으로부터 항종양 특성을 갖는 몇가지의 조제가 얻어져왔는데, 연구된 대분분은: [a] ImuVert^®(Budagov, R.S. and Ulianova, L.P. 2001. Radiats Biol Radioecol Russian. 41:38), 환자의 면역 시스템을 활성화하는 리보솜 멤브레인의 조제; [b] 세라티아의 프로테아제 Mr 56,000 (Wu, J., Akaike, T., Hayashida, K., Okamoto, T., Okuyama, A. and Maeda, H. 2001. Jpn. J. Cancer Res. 92:439), a-2 매크로글로불린의 발현에 의존하는 괴상에 의한 세포사를 유도함; 그리고 [c] 아팝토시스의 유도를 통한 면역억제자 및 항암형성으로 작용하는 색소류인 프로디기오신 (Montaner, B and Perez Tomas, R. 2003. Curr Cancer Drug Targets. 3:57; Perez Tomas, R. y Montaner, B. 2003. Histol Histopathol. 18:379).

본 발명자 등은 전 분자보다 높은 세포독성 활성을 갖는 세라리신의 비-단백질분해적 분획을 수득하였다. 이것은 이들 분획이 낮은 복용량의 프로디기오신과의 조합을 가능하게 하여 색소에 대해 보고된 독성을 낮추고 종양 세포에 대한 항증식성 효과를 증가한다.

본 발명의 조성물은 종양 세포의 성장을 억제할 수 있고, 항-종양 효과를 증진하는 프로디기오신(prodigiosins)과 조합되어 질 수 있는, 전체 세라리신 분자보다 보다 높은 항증식성 효과를 가진 세라리신(SERRALISINS)의 폴리펩티드 분획에 의해 형성된다.

본 발명의 기술에서는, MG2327 조제의 획득은 폴리펩티드 및 프로디기오신 양자가 공존하여, 형질전환된 종양 세포 및 이들의 성장을 활성하는 세포에 특이적으로 선택적 효과로 악성 세포 라인에 광범위한 세포 독성 활성을 갖는다. 종양성이거나 또는 아닌 다른 세포 라인에 대한 민감성 연구는 정상 세포 라인은 MG2327 조제에 단지 덜 민감하지만 흑색종, 라링겔라 암종, 피브로사콤, 간장 암종 및 자궁경부 암종(인간 유두종 바이러스에 대해 양성이거나 아님)으로부터 유래된 세포는 매우 민감하다는 것을 입증하였다. 혈액종 유래의 암종은 덜 민감하다. 이들의 성장을 위해 활성화된 HUVEC 세포는 이들이 전혀 활성화 되지 않는 MG2327에 더욱 민감하다. MG2327 조제는 세포 분할의 과정 동안 발현되거나 또는 과발현된 인자에 특이적으로 작용할 수 있다. 이들 인자는 증식원의 암 또는 다른 질환에 대해 치료적 타겟을 형성한다. 더욱이, 이들 인자는 또는 분화 또는 비-분화된 세포의 비제어된 증식에 의해 또는 증식의 과잉에 의해 유래된 질병의 조기 진단을 위한 타겟을 구성한다. 이들 분자를 포함하는 조절된 방출 형식은 이들에 의해 특이적 방식으로 작용하는 이들 증식하는 타겟에 향해질 수 있는데; 이는 정상세포는 그 작용에 대해 보다 저항적이기 때문이다.

MG2327 조제의 항종양 활성을 입증하기 위해, BALB/c 마우스가 애시틱 뮤라인 종양을 야기할 수 있는 미에로이드 유래의 종양 세포 CB Hep.1로 복막내 접종된다(Fontirrochi, G., Duenas, M., Fernandez de Cossio, M.E., Fuentes, P., Perez, M., Mainet, D., Ayala, M., Gavilondo, J.V. and Duarte, C.1993. Biotecnol Aplic. 10: 24-30). 10일 후, 마우스에 복막 내로 MG2327 조제 또는 PBS가 주사된다. 최초 처리 45일 후 1 mg/kg으로 처리된 동물의 60%는 생존하고 반면 대조군은 단지 25% 만이 살아있었다(도 8). 전체 종양의 퇴화는 건강한 상태를 나타내는 처리된 생존 개체에서 관찰되었으며, 반면 대조군에서는 큰 고체 덩어리를 형성하는 종양의 진행과 마우스는 일반적인 상태의 저하를 보였다.

1 mg/kg의 MG2327 조제 중량의 일회 복용량으로 처리된 미에로이드 유래의 종양을 가지는 BALB/c 마우스는 전체의 퇴화로 생존하였다. 이 동일 복용량은 E6/E7 형질전환된 피브로블라스트에 의해 유래된 종양을 가지는 BALB/c 마우스에서 종양 부피의 유의성 있는 감소로 생존율을 증가한다. MG2327은 BALB/c 마우스를 미에로이드 종양의 이식로부터 보호한다.

MG2327 조제는 항증식성의 분자를 생산하는 배양 조건의 최적화의 결과로 얻어진다. MG2327 조제는 항증식성 분자를 생산하는 배양 조건의 최적화의 결과로 얻어져, 이런 방식에서 정상 세포 및 종양 세포에서 항-증식성, 아팝토시스 및 항-혈관형성 분자의 생산의 유도자로서 악성 종양의 이식 및 전개에 대해 보호제를 구성하여, 암, 더욱이는 이와 관련된 다른 질환의 예방법 및 치료법에 유익하게 사용될 수 있다.

CMIB 4202 균주는 45-50 및 20-30 kDa (50 및 25 kDa by SDS-PAGE, with one determination coefficient of 0.984) 의 범위로 가용성 단백질을 과-발현한다. p25로 지칭되는 25 Kda의 분획은 EDTA로 배양된 HEp-2 세포들의 라인으로 수행한 실험에서 복용량-의존적인 강력한 항-증식 활성을 나타내고, 반면 p50으로 지칭되는 50 KDa 분획은 성장을 저해하지 않았다. 그러나, 5 μM Zn₂SO₄ 내에서 p50 분획을 배양한 것은 항-증식적인 활성을 나타냈지만, p25 분획의 것보다 덜 강력했다. p25 및 p50 분획의 IC₅₀은 각각 0.48 nM 및 16 nM이다.

항-증식 효과를 갖는 단백질인 생체 분자(폴리펩티드 및 프로디기오신)의 분리는 본 발명에서 단지 하나의 크로마토그라피 단계에 의하여 수행되었다: 단속적인 기울기의 NaCl을 사용한 이온 교환. 이것은 하나의 pH 8.00의 50 mM의 포스페이트 완충액으로 평형화된 하나의 DEAE o QAE 세파로스 패스트 플로우 매트릭스(Sepharosa Fast Flow matriz)를 사용했다. 용리는 일 단속적인 기울기의 NaCl: 50 mM의 포스페이트 완충액 -0.1 M NaCl, pH 8.00; 50 mM의 포스페이트 완충액-0.2 M NaCl, pH 8.00; 50 mM -2 M NaCl, pH 8.00로 수행되고, 마지막으로 70%의 무수 에탄올로 매트릭스에 흡착된 색소 분획이 용리되었다. 그 결과는 25 kDa의 단백질의 조성분 조제는 동일 조제의 50 kDa의 단백질의 조성분의 것보다 세포 종양의 성장을 저해하는 능력이 크다는 것과 양자는 생체 외에서 독립 형태의 생물학적 활성이 존재한다는 것을 확인한다.

25 kDa의 분획에 포함된 분자 크기의 분획은 p50의 분해를 야기한다. p50의 분해의 증가는 고온으로 얻어지고, p25의 발생은 이 온도의 증가와 반면 감소된 p50에 비례된다. 양에서 얻어진 항-p50 폴리크로날 항체는 웨스턴 블럿 어세이에서 p25에 인식되고, 따라서 p25 fue는 p50 단백질의분해의 산물로 유래된다. 분해의 산물은 분해의 산물의 항증식적 활성과 비례적으로 증가했다. 이 결과는 p50 오토라이시스가 원래 분자 p50의 것보다 강력한 항증식적 활성으로 분해의 분획을 생산할 수 있다는 것을 확인한다. 더욱이, p25 단백질은 또한 미에로이드 근원의 악성 종양의 전체적인 퇴화를 또한 유도한다. p50의 분획은, 항체 분획의 몇 가지 알려진 방법학에 의해 유전적으로 컨쥬게이트될 수 있고 증식적 원인 질병의 치료에 유용한 면역독성을 발생할 수 있다. 또한 이 분획 단독 또는 다른 단백질성 분자와 조합이 세포의 내부로부터 또는 특정 리셉터로부터 캐리어로 채용될 수 있다. p50의 분획은 또한 특정 타겟으로부터 직접적인 제어를 유지하기 위해 조정된 유리 시스템의 외부 배지에 그 자체를 노출할 수 있다.

p50의 단백질 분해 활성은 7 mM의 EDTA로 저해되고, p50은 세라리신류에 속하는 메탈로프로테아제인 것으로 질량 스펙트로메터로 동정된 것이 입증되었다.

주요한 유사성이 스위스포트 프로테인(Swissprot proteins)의 데이터 베이스에서의 동정자 PRZN_SERSP 및 PRZN_SERMA를 갖는 종에서 발견되었다. p25 단백질이 효소적 활성이 존재하지 않는 크로마토그라피에 의해 정제되고 이것은 비촉매적인 세라리신 카르복실-말단 영역과 상응한다.

단백질성 성분 및 프로디기오신은, 그 단일의 조제에 비해 저해적 효과가 유의적으로 증가한(p<0.005) 하나의 동일한 조성으로 조제된다. 이 조성물은 독립 형태의 조성분을 평가하기 위해 채용한 단백질과 프로디기오신의 동일한 관계를 유지하기 위해 수득되었다. 이러한 조성에 있어서, 프로디기오신은 0.1-100 nM의 농도로 발견될 수 있고, 세라리신 분획은 0.1 - 150 ㎍/mL 사이로 된다.

세라리신 합체 분자에 비해 증가된 항-증식적 효과를 가지는, 세라리신으로부터 유도된 폴리펩티드의 분획을 포함하는 조성물 및 조성물의 강력한 생물학적 활성을 선택적으로 증가한 세라리신-프로디기오신 분획 조합의 획득.

약전에 의해, 이들 폴리펩티드 분획은 발암성의 세포들에 대해 아팝토시스의 효과를 가진다. 이 아팝토시스의 효과는 미토콘드리아, 미세소관 및 DNA에 포함되고, 세포사 신호를 프로그램하기 위해 증폭한 분획은 이 조성의 복용량을 줄이기 위해 사용된다. 이러한 것은 또한 폴리펩티드와 프로디기오신의 조합된 조성으로 관찰된다.

MG2327 및 항-증식성 폴리펩티드 분획의 항-혈관신생 효과는 짧은 튜브형의 구조의 형성 방법에 의해 평가되었다. MG2327 및 이들의 분획 p25 및 p50의 비 세포독성 농도가 인간의 미소혈관계 내피 세포(HMEC)에 접종되었다. 최종 결론으로 이것은 형성된 튜브형의 구조 길이와 이들 사이에 상호작용의 수를 고려하는 것을 평가한다. 이를 위해 프로 익스프레스 4.5 이미지-프로그램이 사용되었다(Pro Express 4.5 Image- program). 이 결과는 MG2327 조성물로의 처리는, 이렇게 분리된 폴리펩티드인 MG2327는 항-혈관신생 활성을 가지는 것을 입증하는 단백질 및 이들의 항증식성 폴리펩티드가 내피세포의 분화 및 유지를 형성하는 것을 유의적(p<0.05, ANOVA)으로 저해한다는 것을 설명한다는 것을 확인한다.

아팝토시스, 항-혈관신생 활성 및 선택성은 암에 대해 잠재적인 치료 및 보호자로 본 발명의 대상 조성물의 가장 중요한 특징적인 것 중의 하나를 유지한다.

세라리신 및 프로디기오신 류의 조합이 독립적으로 발암성인 것에 대해 가장 강력하고 선택적인 것을 입증되었다. 이들 폴리펩티드는 예방법 및 암의 치료를 위해 또는 내피 및 전이된 세포의 증식과 관련된 다른 질환을 위해 재조합 독성 및 면역독성의 수득에 사용될 수 있다.

이들 폴리펩티드 및 이의 프로디기오신과의 가능한 조합은 암과 매우 선택적이고 광범위한 범위의 작용을 갖는 각종의 증식성 기타 병증에 대해 인간 및 동물용의 치료적 또는 진단적인 혈관 조제의 획득을 위한 약학 산업에 바로 적용된다.

도 1. 종양 세포 CB Hep.1과 S. 마르세센스의 상호작용이 높은 항증식성능 및 변화된 단백질 발현을 갖는 박테리아 균주를 발생한다. A- 세포 생존. 72 시간 후, 세포 생존은 MTT 방법에 의해 평가되었다. 균주 CMIB 4202는 인간 종양 세포 HEp-2에 대해 강한 항증식적 효과를 나타내는 반면 SM1995 균주의 효과는 매우 약했다. 이들 결과는 샘플 당 4 복제를 사용한 독립적 실험의 평균이다. B- SDS-PAGE 일렉트로포르시스 (은 염색). CMIB 4202는 약 25 kDa으로 되는 가용성 단백질을 과-발현했다.

도 2. 세포 라인 HEp-2에 대한 25 및 50 kDa 분획의 항증식적 활성. 세포 생존성은 MTT법에 의해 결정되고 대조 세포에 대해 백분율로 표현되었다. 분획은 SDS 겔 (아연-이미다졸로 염색됨)로부터 회수되고 다시 원상화 되었다. 25 kDa 근방의 분획은 강한 항증식성(IC₅₀ 0.35 nM/mL)을 보이고, 반면 p50은 성장을 저해할 수 없었다. Zn₄SO₂ 5 μM가 p50에 부가될 때, 비록 p25의 것에 비해서는 열등하지만 항증식성 활성에서의 증가가 관찰되었다 (IC₅₀ 45 nM/mL). 곡선은 5번의 독립적인 실험의 평균 값으로부터 구해져 상응하는 표준 편차 (SD)로 타점되었다.

도 3. 균주 CBMI 4202에 의한 단백질 및 프로디기오신의 운동학. 배양 배지에 대한 프로디기오신의 발현이 성장 상에서 정지 상으로 전이 기간 동안 발생하여, CBMI 4202가 그의 보다 높은 복제기에 도달한다. A- 세포 복제기의 운동학. B- 프로디기오신 발현의 효능(생산물/바이오매스). C- MTT법에 의해 결정된, Hep-2 세 포에 대한 항-증식성 효과의 운동학. D- 광학적 밀도에 의해 결정된 세포성장 및 단백질 생합성의 운동학.

도 4. MG2327로의 치료에 대한 종양 및 정상 인간 세포의 민감성. 정상 세포는 낮은 민감성을 가지고 혈액암종 유래의 것은 분석된 세포 라인의 다른 것에 비해 민간성이 낮다. 한편, 성장 간에 활성화된 세포 (HUVEC bFGF) 및 악성 종양성 손상으로부터 유래된 세포는 보다 민감하다.

도 5. CBHep1로 종양이 형성되고 MG2327조제로 처리되거나 또는 되지 않은 후의 BALB/c 마우스의 생존 분석. A- 1 mg/kg의 복용은 처리된 동물의 60%에서 종양 퇴화를 유도했고, 반면 치료되지 않은 동물의 100%가 60일 내에 죽었다. B- 종양 세포 접종 45일 후, 비처리된 동물은 고체 종양 및 복수증이 나타나면서 극단적으로 쇠약한 상태를 나타내고, 반면 1mg/kg로 처리된 동물은 종양의 징조를 발현하지 않고 300일 이상 생존했다.

도 6. 종양 모델 3T316에 대한 MG2327의 항종양 효과. A- 각 군에 대한 일일 평균의 플롯은 처리된 동물 및 비처리된 동물의 종양의 부피 사이에 통계적으로 유의성 있는 차이를 나타낸다 (p<0.003). 시간을 통한 종양 성장의 분석은 MG2327로 처리된 군에 대해서는 아무런 유의성 있는 변동(p= 0.109)이 없음이 입증되었고, 반면 음성 대조군은 이 변수에서 유의성 있는 증가 (p= 0.04)를 나타냈다. B- 처리된 및 처리되지 않은 동물에 대한 생존율.

도 7. MG2327로부터 단백질성 활성 주제의 분리. (A) SDS-PAGE에서 일렉트로포러시스 (12.5 %). 쿠마시(coomassie) 염색의 결과. 레인 1은 0.2 M NaCL, pH 8.00로 용리된 것에 상당하는 샘플을 나타내는 것으로 , 여기서 50kDa에 상당하는 단백질성 밴드가 관찰될 수 있음. 레인 2는 25kDa에서의 단백질 밴드를 나타냄. 염색은 쿠마시 방법에 의해 수행됨. (B) 인간 종양 세포에 대한 p50 및 p25 단백질의 HEp-2에 대한 항-종양성 효과. p25, p50 및 MG2327에 대한 복용량-반응 관계는 전체 단백질 농도의 관점으로 표현됨.

도 8. HEp-2 세포에 대한 MG2327으로부터 분리된 활성 주제의 항증식적 효과. MG2327에 포획된 50 및 25 kDa 단백질은 성장 저해 활성을 나타냈음. 프로디기오신과 이들 단백질의 조합은 대조군에 비해 종양 세포의 50%의 성장을 저해(IC₅₀)할 수 있는 복용량을 감소했다.

도 9. SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿. (A) MG2327로부터 수득된 단백질의 패턴. 샘플은 SDS-PAGE 겔 (12 %) 및 은 염색에 의해 분석되었다. (B) 대략 50 및 25 kDa (화살표)의 단백질성 밴드가 아연-이미다졸로 염색된 유사한 겔로부터 절단되고, 다시 원상화되고 그리고 새로운 SDS-PAGE에 다시 주입된다. 이것은 니트로셀룰로스 멤브레인으로 이전되고 항 -p50 항체로 웨스턴 블럿이 전개된다. 염소로부터 수득된 폴리크로날 항체는 p25 및 p50의 분해를 인식할 수 있게 하고, 비관련된 단백질 밴드 (Neg C)는 인식할 수 없게한다.

도 10. p50 자가용혈. A- SDS PAGE 일렉트로포르시스: 1- 24 ℃, 2- 37 ℃, 3- 45 ℃, 4- 60 ℃, 5- 4 ℃. B- p50 및 p25의 밀도계 분석은 배양 온도의 증가로 p50 밴드의 강도는 감소되고 반면 p25 밴드의 강도는 증가되었다는 것을 보여준다.

도 11. DEAE 세파로스 패스트 플로우 크로마토그라피에 의해 정제된 p50. P50 (0.2 M NaCl로 용리된 것)은 모 분자보다 높은 항증식성 활성을 갖는 분해물을 발생한다.

도 12. 다른 크로마토그라피에서 수득된 p25 및 p50의 효소적 활성. A- p25는 활성을 나타내지 않고, 반면 p50은 효소적 활성을 나타냈다. B- p50의 효소적 활성은 7mM의 EDTA로 전체적으로 저해되었다.

도 13. MG2327는 종양 세포 P3X63Ag8의 시간-의존적 DNA 분획화를 유도했다. 배양 6시간 이래로, 올리고뉴클레오좀의 분획이 발견될 수 있고, 이것은 시간에 따라 증가하여, 24시간에 180-200 염기 쌍의 올리고뉴클레오좀의 분획을 갖는 전형적인 팝토틱 패턴(poptotic pattern)에 도달한다.

도 14. 22 ㎍/ml로 MG 조제로 처리되거나 처리되지 않은 (대조 세포) P3X63AG8 뮤린 미엘로마 세포의 초미세구조. (A) 대조군 P3X63Ag8미엘로마 뮤린 세포의 전자 현미경은 정상 세포에 전형적인 미토콘드리아의 초미세구조를 보여주는 이들 세포의 세포질 및 핵이 나타난다: 미토콘드리아의 매트릭스는 주위 세포질(

) 보다 높은 밀도를 가짐. (B) 액포 (변형된 미토콘드리아(

)로부터 유래된 부분임), 미토콘드리아 팽윤 및 크리스타의 파열이 MG 처리 2 시간 후에 정상적인 핵(

)을 가지고 세포질(▲)에 나타남. (C,D) 미토콘드리아 군 및 각각의 크리스타가 용융되고(

), 또한 (B)에서의 처리 2시간 후 관찰됨. (E) 어팝토틱 형태의 전자현미경: 크로마틴의 축합 (

), 마진화 및 분획화(

), MG2327로 처리 6시간 후 아팝토틱 바디 (△). (F) 축합된 크로마틴에 의해 밝혀진 아팝토시스, 응축된 크로마틴의 주변 패치를 나타낸 핵. {주: 미토콘드리아의 팽윤 및 크리스타의 파열, 전 세포질 멤브레인이 다른 모든 시간에 존재됨}. 배율: x6000 (E), x 10 000 (A,B,D), 15 000 (C) 및 x40 000 (F).

도15 . 마트리겔(Matrigel) 내에 내피 세포의 분화에 대한 MG2327, p25 및 p50(크로마토그라피에 의해 정제된 것) 및 이들의 분획의 영향. HMEC 세포는 MG2327 (A), p50 (B) 및 p25 (C), 비처리 (E) 및 활성화 없이 (D)의 유사한 농도의 존재 하에서 활성화 농도(10 ng/mL EGF, 1 ㎍/mL의 하이드로코티손)에서 배양되었다. 그래프 (F)에는 3번의 독립적 실험의 결과가 그룹화되어져, 마트리겔 내의 튜브형 네트의 형성에 대한 MG2327및 그의 조성의 저해 활성을 나타낸다. MG2327 및 p50 양자는 비-활성화된 세포의 수준으로 유도된 활성화로 완전하게 복귀된다 (ANOVA MG2327, p50 및 CN p>0.05). p25로 처리된 세포는 MG2327 및 p50에 대해 관찰된 것에 비해 열등한 네트 형성의 지수를 보였다(각각 쌍을 이루지 않은 t p=0.0107 및 p=0.0498).

도 16. X63 미엘로마 세포가 도입되고 MG2327로 면역화되거나 되지 않은 BALB/c의 생존율. 1 mg/kg의 MG2327을 3 및 6 복용을 사용하여, 면역화된 동물의 100%가 골수 종양을 거부했다.

실시예 1. 균주 CMIB 4202의 획득.

항종양 분자의 박테리아 균주 생산자를 얻기 위해, 야생형 세라티아 마르세센스 SM1995가 BALB/c 마우스의 복부 표면으로부터 분리되고 종양 세포 CBHEp.1와 혼합되어져 (Aleman, M.R., Valdes, R., Perez, M., Ibarra, N., Reyes, B., Gonzalez, M., Mendoza, O., Padilla, S., Agraz, A. and Rodriguez, M. P. 2000. Biopharm 13:48-52) 중액체 가솔린이 10일 전에 미리 접종된 BALB/c 마우스에 복부 내로 접종된다. 세포 혼합물의 접종 8일 후, 애시틱 추출이 2일 마다 수행되어진다. 종양 성장의 운동학이 분석되고, 미생물학적 제어가 종양 퇴화를 나타내는 각 동물의 애시틱에 대해 수행되었다.

분리된 박테리아는 다른 배지 및 배양 조건으로 배양되었다. 배양 상등액은 0.22μm의 멤브레인 필터를 사용하여 멸균 여과되고 CBHEp.1 세포에 대한 그 독성이 평가되었다. 보다 높은 세포 독성을 갖는 균주는 쿠바, 하바나시에 있는 "유전적 엔지니어링 및 생명공학 센터의 생명공학적으로 주요성을 갖는 마이크로오르가니즘 컬렉션"에 수탁 번호 CMIB4202로 기탁되었다. CMIB4202 및 그의 모주인 SM1995는 28℃에서 펩톤-글리세롤 배지에서 5L 배양조에서 평등하게 배양되었다. MTT 방법을 사용한 항증식성 분석에서 CMIB 4202의 멸균 여액은 복용량 의존적 활성을 입증했으며 반면 SM1995으로부터의 하나는 단지 인간 암 세포 라인 HEp-2 (도 1A)에 대해 적은 활성을 가진다(Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., Mcmahon, J., Vistica, D., Warren, J. T., Bokesch, H., Kenney, S. and Boyd, M. R. 1990. J. Natl. Cancer. Inst. 82:1107).

균주 CMIB 4202는 45-50 및 20-30 kDa (0.984의 결정 계수로 SDS-PAGE에 의 해 결정된 것으로 50 및 25 kDa) 범위의 가용성 단백질을 과-발현했다, 도 1B 참고.

아연-이미다졸로 염색된 SDS 젤 내에 존재하는 밴드로부터 회수된 p25 분획(Hardy, E., Santana, H., Sosa, A., Hernandez, L., Fernandez-Padron, C. and Castellanos-Serra, L. 1996. Analytical Biochemistry. 240:150)은 HEp-2에서 강한 항증식성의 복용량 의존성 활성을 나타냈으며 반면 p50 분획은 세포 성장을 저해하지 않았다. 그럼에도 불구하고, p50이 5μM Zn₂SO₄로 배양될 때 항증식성 활성을 나타냈지만 p25에 대해 관찰된 것보다 낮았다(도 2). 분획 p25 및 p50의 IC₅₀은 각각 0.48 nM 및 16 nM이다.

단백질을 발현하는 양 균주의 능력을 비교할 목적으로, 팩토리얼 ANOVA가 적용되었다. 상호작용의 개연성 값은 유의적이지 않았다(p= 0.93). 더욱이, 양자 주 성분의 개연성은 영향을 미친다. 한편, 양자 주제의 개연성은 양 값이 유의적으로 다른 값(P =0.01)으로 발현된다는 것과 그 값의 크기는 매우 유의성이 있다(P =0.0004). 부가하여, 이들 양자 단백질 사이에 매우 유의성 있는 발현의 차이가 존재한다(P<0.001).

실시예 2. MG2327 항-증식성 조제의 획득.

항-증식성 조제를 수득하기 위해 CMIB 4202 S. 마르센세스의 일부가 1L의 미생물 배양을 생성하고 배양 배지는 대상 분자를 생산하기 위해 최적화된다(도 3). CMIB 4202 배양액은 30분 동안 12 000 g 및 4 ℃에서 원심분리된다. 상등액이 수집되고 이어서 멸균 상태하에서 0.2μ로부터 분자성 타미자제(tamizaje)에 의해 여과된다. 상등액의 부피는 멸균의 동일한 조건에서 10배 감소한다. 상등액은 10 kDa 배제 멤브레인을 사용하여 10배 감소되고 생리학적 조건에서 24시간 동안 4℃에서 PBS에 대해 투석된다. 투석된 물질은 멸균 조건에서 여과되고, 5 mL의 퓨에론(fueron) 분배 크리스탈 바이알에 배분된다. 이 조제는 4℃에서 저장되고, MG2327로 명명된다.

5L 발효조는 스크린으로 다음의 이미 확립된 조건으로 실현된다: 펩톤-글리세롤 배지에 28℃에서 14시간 동안, 통기 1 vvm, 250 rpm 및 0.1의 초기 최적 밀도. 배양 배지는 생리학적인 pH로 조정되고 발효는 자유로운 pH에서 된다. 나머지 상태는 스크린으로 동일한 형태로 실현된다.

실시예 3. "생체 외"에서 MG2327 조제의 항증식성 활성의 평가.

"생체 외"에서 MG2327의 항증식성 활성의 평가를 위하여, 인간 세포 라인의 판넬이 측정되었다(표 1). PBMC (20000)를 제외한 2000 세포의 전체는 96웰 배양 웰에 접종되고, 다른 농도의 MG2327이 부가되었다. 72 시간 후, MTT의 부가에 의해 생존 세포의 수가 측정되었다(Skehan , P., Storeng , R., Scudiero , D., Monks , A., Mcmahon, J., Vistica , D., Warren , J. T., Bokesch , H., Kenney , S. and BOYD , M. R. 1990. J Natl Cancer Inst. 82:1107). 가용성 포마잔(formazan) 산물이 멀티스캔 플레이트 리더에서 540nm에서 검지되었다. MG2327는 분석된 인간 세포 라인에 대해 광범위한 세포독성 활성을 나타냈다. IC₅₀은 ㎍/mL 범위이었다.

'생체 외' 연구에서 사용된 세포 및 배양 배지.

Fibhum	인간 포피 유래 피브로블라스트 , p 3-6	DMEM , 15% FBS *, Insulin 30 μG/ mL
H82	인간 폐암	RPMI 1640, 10% FBS
MDA - MB145S	인간 유방선암	DMEM , 10% FBS
Colo -205	인간 결장암	RPMI 1640, 10% FBS
HT1080	인간 섬유육종	DMEM , 10% FBS
Hela	인간 자궁경부암	DMEM , 10% FBS
HEp -2	인간 후두암	MEM , 10% FBS
HepG2	인간 간장암	DMEM , 10% FBS
A375	인간 흑색종	DMEM , 10% FBS
PBMC	인간 말초 단핵 세포	RPMI 1640, 10% FBS , IL -2
HuT78	인간 피부 T세포 임파종	RPMI 1640, 10% FBS
HL60	인간 프로미엘로사이트 백혈병	RPMI 1640, 10% FBS
K562	인간 적백혈병	RPMI 1640, 10% FBS
CRL 1682	인간 췌장선암	RPMI 1640, 10% FBS
A 431	인간 외음암	RPMI 1640, 10% FBS
SiHa	인간 자궁경부암	RPMI 1640, 10% FBS
CaSki	인간 자궁경부암	RPMI 1640, 10% FBS
HUVEC	인간 혈관 내피세포	M199 30% FBS 10 ng / mL bFGF

* FBS : 우태아 혈청

MG2327 선택성은 상업적 시판 약품인 독소루비신(Doxorrubicine; DXR)에 HT1080 세포 라인(피브로사코마로부터의 것) 및 일차적인 섬유아세포를 사용하여 비교되었다. 사용된 항증식성 분석은 상기에 기술되어 졌다. DXR 및 MG2327 조제의 단계 희석은 10㎍/mL로부터 적용되고 5 포인트 커브가 발생하였다. 치사율은 HT1080에 대한 생존 백분율과 일차적인 섬유아세포에 대한 생존 백분율과의 관계로 각 포인트에 대해 계산되었다. 보다 큰 차이점이 시험된 낮은 농도(MG2327 9:1, DXR 1.7:1)에서 감지되었다. MG2327은 2㎍/mL 아래의 농도에서 매우 선택적이었다.

후두부 암종으로부터 유래된 HEp-2 세포는 분석된 다른 세로 라인에 비교할 때 임상적으로 사용된 항종양에 대해 매우 저항성이 있다. 이러한 이유 때문에, 이것을 MG2327 조제의 효과에 대한 '생체 외' 연구에 대한 모델로 사용하였다. 공지된 항종양 약물로 처리된 HEp-2 세포에 대해 발생한 세포독성 커브의 비교는 MG2327 조제, 시스플라틴 (CDDP), 독소루비신 (DXR), 빈크리스틴 (VC), 빈블라스틴 (VB) 및 택솔 (TX)에 대해 3㎍/mL에서는 증식의 유사한 결과(40 %)를 나타냈다 (p> 0.05, ANOVA 테스트). 동일한 조건에서, Ara C, 메토트렉세이트(Metotrexate; MTC), 블레오미신(Bleomicine; Bleo) 및 시클로포스파미드(Ciclophosfamide; CPA)와 같은 다른 항종양제는 효과를 나타내지 않았다. CDDP는 후두암의 치료를 위해 FDA에 의해 승인된 항종양제의 하나이고, MG2327 조제 및 CDDP에 대한 생존 곡선의 분석은 IC₁₀, IC₅₀ 및 IC₉₀에 대한 유사한 값을 나타냈다.

다른 암종 세포라인 또는 비암종의 민감성 연구(도 4)는 정상 세포 라인은 거의 민감성을 나타내지 않고, 반면 흑색종, 라링겔라 암종, 피브로사콤, 간장 암종 및 자궁경부 암종(인간 유두종 바이러스의 캐리어)는 매우 민감한 것을 나타냈다. 원래 혈액원의 암종은 덜 민감하다. 이것을 성장하기 위한 세포의 HUVEC 활성은 활성화하지 않은 MG2327 조제에 대해 가장 민감하다.

이전의 결과는 조제 MG2327이 종양/이것을 성장하기 위해 전이되거나 활성화하는 것에 대한 효과에 선택적인 효과를 가지고, 악성 세포라인에 대해 증진된 범위의 세포독성을 가진다는 것을 보여준다.

실시예 4 MG2327조제의 항종양 활성.

MG2327조제의 항종양 활성을 입증하기 위해, 뮤린에 어시틱 종양을 유발할 수 있는 미엘로이드 유래의 CB Hep.1 종양 세포가 복막 내(i.p.)로 이식된 BALB/c 마우스를 사용하였다(Fontirrochi, G., Duenas, M., Fernandez de Cossio, M.E., Fuentes, P., Perez, M., Mainet, D., Ayala, M., Gavilondo, J.V. and Duarte, C.1993. Biotecnol Aplic. 10: 24-30). 10일 후, 마우스는 MG2327 또는 PBS가 i.p.로 주사되었다. 1 mg/kg의 중량으로 처리된 동물의 60%가 생존한 반면, 대조군의 단지 25% 만이 초기 처리 후 45일 후에 살아남았다(도 5). 전체 종양의 퇴화는 건강한 상태를 보인 모든 생존된 동물에서 관찰되고, 반면 대조군에서는 종양이 진행되어 큰 고체 덩어리를 형성하고 동물은 일반적으로 건강하지 않은 상태를 보였다.

E6/E7로 형질전환된 섬유모세포의 종양을 갖는 BALB/c마우스는 MG2327 조제로 처리된 후 유의성 있는 종양 크기의 감소를 나타내며 그 생존율이 증가하였다.

또한, MG232의 항종양 활성을 평가하기 위해, Hernandez 등 (Hernandez, P., Merina, N., Lopez-Ocejo, O. and Arana, M. J. 2000. Biochem Biophys Res Commun.270:119-124) 에 의해 전개된 인간 유두종 바이러스(HPV16)에 연관된 암의 모델이 사용되었다. 두 그룹의 BALB/c 마우스가 좌 복부의 영역에 2x10⁶ 3T316 세포로 피하(s.c.)로 주입되었다. 48시간 후, MG2327 또는 PBS 0.75 mg/kg 중량의 복용량이 대조군에서 일차 세포 접종 부근에 s.c.로 투여되고, 매일의 측정은 캘리퍼로 수행되었다. 종양 부피는 표준식 V= 0.52 x a² x b을 사용하여 계산되고, 여기서, a는 종양의 수평직경의 폭이고 b 는 종양의 수평직경의 길이이다(Hernandez, P., Merina, N., Lopez-Ocejo, O. and Arana, M. J. 2000. Biochem Biophys Res Commun.270:119-124). 거동은 도 6에 도시된다.

종양 전개의 시간에 있어서의 차이점은 처리된 동물과 비처리된 동물과의 사이에 있어서 통계적으로 유의성(p=0.0054)이 있다. 시간 관련성의 연구: ANOVA 시험으로 처리는 동일한 정도의 차이가 처리군과 비처리군과의 사이에 유지되지 않았음을 보여준다: 이것은 동물에 적용된 처리에 관련된 차이의 존재를 지시한다.

윌콕슨 테스트가 각 군의 21일과 45일 사이의 측정에 대해 쌍을 형성한 데이타에 적용될 때, 대조군에 대한 종양 부피의 유의성 있는 증가가 검출되고(p=0.043), 이것은 처리된 군에 대한 경우는 아니다(도 6A). 각 평가의 순간에 각 군 사이에 유의성 있는 차이의 존재를 분석하기 위해, 제1 점에서의 것(p<0.01)을 제하고, 유의성 있는 차이점을 검지한 Mann-Whitney U 테스트가 적용되었다. 또한, 종양의 성장 속도에 있어서의 중요한 차이점이 검지되었다. 성장 곡선은 하나의 라인으로 조정되고, 슬로프는 최적의 적합도에 의해 발생한 식으로부터 계산된다. 슬로프의 비교는 대조군에서의 종양이 처리군에서 관찰된 것에 비하여 유의적으로 큰 속도로 성장한다는 것을 나타낸다(p=0.0088).

대조군의 마우스는 종양의 전이에 기인하여 45 및 64일 사이에 죽었고, 반면 처리된 군에서의 동물은 시간 내(170일)에 유지된 20%의 생존율을 가지며, 52일에 죽기 시작하였다, 도 6B.

Bayesian 하이어라키 모델 (500 반복을 갖는 Weibull 역행)에 생존율 데이타를 조정하여, 평균 생존 시간에 대한 신뢰 간격이 전체적으로 배제된 것이 나타날 때 확인되는 통계적으로 유의성 있는 차이(p= 0.02447)를 얻었다.

실시예 5. MG2327 조제의 분획화 . 비 단백질성 생체분자의 분리.

MG2327 조제의 조성물을 결정하기 위해 이들 분자의 분획화가 실행되고 생체 외에서 Hep-2 인간 종양 세포 라인의 세포의 성장을 저해하는 능력이 평가되었다.

폴리사카라이드 분획(tr = 6.85 분)이 아미넥스 겔(Aminex gel) HPX 87-N 크로마토그라피 (디멘션: 300 x 7.8 mm, 플로우: 0.5 ml/min)에서 분리되었다. 플럭토스 tr = 13.15 min., 글루코스 tr = 12.12 min., 디사카라이드 tr = 9.40 min., 트리사카라이드 tr = 8.24 min., 폴리사카라이드 tr = 7.01 min.의 패턴이 이용되었다. 색소 분획이 인산염 20 mM, pH=7로 평형된 MERCK의 부틸로 TSK 컬럼을 매개로 분리되어, 매트릭스에 잔류된 후 이어서 무수 에탄올을 이용하여 용리되었다. 수득된 제품의 흡수 스펙트럼(100% 에탄올, pH 5.00)은 보고된 항-증식성 활성을 각각 가지는 모노머 및 다이머의 기술된 특징에 상당하는 537 nm에서 최대 피크와 최대 470 및 490 nm의 밴드를 나타냈다(Perez-Tomas, R. and Montaner, B. 2003 Histol. Histopathol. 18: 379-385; Montaner, B., and Perez Thomas, R. 2003. Curr Cancer Drug Targets. 3:57-65). 분리된 폴리사카라이드는 저해 활성을 나타내지 않고, 반면 프로디기오신에 상당하는 분획은 복용량-의존적 항-증식성 활성을 나타냈다.

실시예 6. MG2327 조제의 분획화 . 단지 일 크로마토그라피 단계: NaCl 단속적 기울기로 이온 교환을 매개로 항증식성 -효과를 갖는 단백질성 생체분자의 분리.

MG2327 조제는 50 mM의 인산염 완충액, pH 8.00로 평형화된 DEAE 세파로스 패스트 플로우 마트릭스에 적용된다. 용리는 NaCl 단속적 기울기: 50 mM의 인산염 완충액-0.1 M NaCl, pH 8.00; 50 mM의 인산염 완충액-0.2 M NaCl, pH 8.00; 50 mM의 인산염 완충액-2 M NaCl, pH 8.00로 수행되고, 마지막으로 70% 무수 에탄올로 매트릭스에 흡착된 색소 분획을 용리한다.

0.2 M NaCl, pH 8.00에 상응하는 분획 및 흡착되지 않은(통과) 분획의 수집인 제일 용리액은 이미 기술된 테스트에서 복용량-의존적 항-증식성 활성을 나타냈다. SDS- PAGE 전기영동으로 각각 50 kDa의 높이에 밴드 및 25 kDa의 높이에 최대 밴드(pureza > 90 %) 단백질이 관찰되었다(도 7A). 분자량은 밴드의 이동거리; r²=0.984를 갖는 상업적 패턴의 분자량에 관련된 작용을 매개로 하여 계산되었다.

도 7B는 MG2327 조제와 비교하여 p50 및 p25의 항-증식성 효과를 나타낸다. p50와 p25는 HEp.2에 대해 항-증식성 효과를 보였다.

표 2는 변동성의 통계적 분석(ANOVA)을 채용하여 p50, p25 및 MG2327 조제의 사이에 비교된 결과를 나타낸다. 모든 채용된 복용량에 대한 반응의 비교가 수행되었다. 세 가지 분석된 샘플의 활성들 사이에 유의성 있는 차이가 존재하는 것이 관찰될 수 있다. 이들의 차이는 채용된 복용량에 의존한다. 조제의 조성분의 고 농도(9 및 18㎍/mL)에 대해 25 및 50 kDa의 분획 사이에 유의성 있는 차이가 존재하고, 여기서 25 kDa의 분획은 가장 활성적이고, 이 방식에서는 낮은 농도(2.25 및 4.5 ㎍/mL)에서는 활성이 존재하지 않는다.

변동성의 통계적 분석(ANOVA)을 채용하여 단백질성 조성과 MG2327 조제의 사이에 비교된 결과.

농도 (㎍/ mL )	ANOVA
	내부-샘플	25-50	25- MG2327	50- MG2327
2.25	0.0110	0.0649	0.0089	0.0958
4.5	0.0316	0.0685	0.0081	0.3728
9	0.0040	0.0318	0.0151	0.4271
18	0.0015	0.0243	0.3206	0.0243

50 kDa의 단백질성 조성과 MG2327 조제의 사이에는 조제가 가장 활성적인 18 ㎍/mL의 복용량에 대해 유의성 있는 차이가 존재하여, 종양 세포의 100%의 성장 저해를 얻을 수 있는, 반면 50 kDa의 단백질 조성은 약 80%의 성장 저해를 얻는다. 2.25, 4.5, 및 9㎍/mL의 복용량에 대해서는 50 kDa의 분획 및 MG2327 조제를 유발하는 반응 사이에 아무런 유의성 있는 차이가 존재하지 않는다.

그러나, 25 kDa의 단백질성 조성의 활성은 2.5, 4.5 및 9 ㎍/mL의 복용량에서 MG2327 조제에 대해 유의적으로 차이가 있고, 반면 25 kDa의 단백질성 조성은 주요한 생물학적 활성을 보이고 18 ㎍/mL의 복용량에 대해서는, 이미 양자가 같이 종양 세포의 100%를 저해하여 아무런 유의성 차이가 존재하지 않는다.

이들 결과는 25 kDa의 단백질성 조성이 종양 세포의 성장을 저해하는 능력을 가지며, 50 kDa의 단백질성 조성 및 양자 조성은 독립적인 방식으로 생체 외에서 생물학적 활성을 나타낸다는 것을 입증한다.

정제의 이들 결과는 다시 세 가지로 하나의 균일한 결과를 얻는다.

실시예 7. 프로디기오신을 갖는 세라리신의 폴리펩티드 조성물.

단백질성 조성 및 프로디기오신이 그 각각의 독립된 형태의 효과에 비하여 저해 효과가 유의적으로 증가한(p<0.005) 하나의 동일한 조성물로 제제화된다. 도 8에서는 MG2327 조제 및 그의 조성물을 분리한 항-증식성 생체분자의 IC₅₀을 그래프로 나타냈다. MG2327 조제는 전체 단백질을 언급한다. 조성물은 독립 형태의 조성을 평가할 때 채용된 단백질과 프로디기오신의 동일한 관계를 확고하게 유지하기 위해 실현된다. 이런 조성물에 있어서, 프로디기오신은 0.1 - 100 nM의 농도 및 0.1 - 150㎍/mL의 세라리신 분획의 하나로 될 수 있다.

실시예 8. p50 발생 p25 .

양에서 얻은 항-p50이 p25와 p50 사이의 관계를 밝히기 위해 이용되었다. MG2327는 이미다졸-아연 염색을 하여 SDS-PAGE 겔에 12%로 적용되었다(Hardy, E., Santana, H., Sosa, A., Hernandez, L., Fernandez-Padron, C. and Castellanos-Serra, L. 1996. Analytical biochemistry. 240:150-152). 대략적으로, 50 및 25 kDa의 단백질 밴드(도 9)가 단리되고, 겔에서 다시 환원되어 SDS-PAGE에 적용된다. 이들은 니트로셀룰로스 멤브레인에 전이되고 웨스턴 블럿이 실행되었다. 분자 사이즈 p25 및 p50의 분해물을 인식하는 항-p50 폴리크로날 항체가 표지된 예비 염색 분자 계량으로 측정되었다(Bio-Rad). 여기에 나타난 웨스턴 블럿은 세 동일 실험의 대표이다.

실시예 9. 온도에 대해 p50 생산물 원의 분해물은 그 자체 p50 의 것보다 가장 활성적임.

실시예 6에서 얻어진 p50은 다른 온도에서 배양되고 그의 항-증식성 활성이 HEp.2에 대해 시험되고, 이전에 이미 기술된 MTT법을 사용하였다. 모든 조건(4, 37, 45 및 60 ℃)에 대해 생산된 분해 패턴은 밀도계로 계산되었다.

분해의 분획 산물의 생성은 온도의 증가와 직접적으로 비례되고, 따라서 p50의 양이 감소할 때 p50의 분해의 산물로 p25를 증가한다 (도 10). p50의 분해의 산물은 원래 p50 보다 주요한 항-증식성 활성을 나타냈다(도 11).

실시예 10. 악성 종양의 p25 유도 퇴화.

실시예 6에서 기술된 크로마토그라피에 의해 얻어진 단백질 p25는 그의 균질성 및 순도를 증명하기 위해 (RP-HPLC)의 역상 크로마토그라피에 적용되었다. 100분 간 0-100의 아세토니트릴 기울기로 채용되었다. 주로 90%의 순도를 갖는 단백질의 피크가 관찰되어, 용리 정제의 균일성이 입증되었다.

p25는 그런 다음 P3X63Ag8 미엘로이드 종양의 이식과 완전한 전개 8일 후의 BALB/c 마우스에 i.p.로 주입되었다. 복용량 22 ㎍/kg의 중량의 p25는 처리 동물의 80 %에서 완전한 퇴화를 유도하였다. 음성 대조군은 컴팩트한 전개가 이미 이루어져 30일 만에 죽었다.

실시예 11 p50 는 메탈로프로테아제이고 , 반면 p25 는 단백질 가수분해 활성을 가지지 않음.

기질로서 카제인을 사용한 Anson and Mirsky (Anson, M.L., Mirsky, A.E. 1932. J. Gen. Physiol. 16: 59)의 변형 방법이 트립신을 가지고 본 실험에 조정되었다(y=1.9314x-0.682; R²=0.999). 실시예 6에서 기술된 크로마토그라피에서 얻어진 단백질성 분획이 이 방법으로 분석되었다. P50은 7 mM의 EDTA로 저해하는 단백질 가수분해 활성을 보였으며, 따라서 이것은 메탈로프로테아제라는 결론이다. p25는 효소적 활성을 나타내지 않았다, 도12.

p50 및 p25의 단백질 가수분해 활성을 입증하기 위해 기질로서 젤라틴을 사용한 시모게노(cimogeno)의 방법 (Vacca, A., Iurlaro, M., Ribatti, D., Minischetti, M., Nico, B., Ria, R., Pellegrino, A. and Dammacco, F. 1999. Blood. 94:4143-4155)이 채용되었다. 더욱이, p50의 분해물의 효소적 능력이 분석되었다. 이 분석에서 실시예6에서 기술된 크로마토그라피에 의해 얻어진 단백질 p50은 효소적 활성을 나타냈다. 25 kDa (MG2327로부터)의 높이에서의 겔의 단백질 분획은 단백질 가수분해의 활성을 보이고; 반면 크로마토그라피에 의해 얻어진 p25는 이 활성을 보여주지 않았다.

실시예 12. MG2327 로부터 25 kDa 의 항-증식성 폴리펩티드의 동정.

25 kDa의 밴드에 존재하는 항-증식성 활성을 갖는 단백질의 동정을 위해, MG2327 적용으로 SDS-PAGE gel (실시예 8에 기술된 것)가 단리되었다. 이 밴드는 완전히 투명해질 때까지 5분 동안 1 mL 의 Tris/HCl (100 mM pH 8.5) 완충액에 침지된다. 이 밴드는 거의 1 mm³의 적은 입방크기로 단리되어 아세토니트릴을 흡수하여 12.5 ng/μL의 농도로 트립신 또는 LEP을 포함하는 암모니움 비카보네이트의 가장 적은 부피(25 mM)에서 원상복귀된다. 겔 내에서의 단리는 온도조절장치의 혼합기에서 18시간 동안 37℃까지 배양된다.

LEP 단리로 얻어진 펩티드는 MALDI-MS에 의해 분석된다. 가장 강한 신호의 모노이소토프 이온이 안전 데이터 베이스에서 대상 단백질의 동정을 위해 ProFound 프로그램에 도입된다. 비록 이 데이터 베이스에서의 조사 동안에 분류학상의 제한을 수행하지는 않았지만, 세라티아 마르세센스 EC 3.4.24.40 의 50 kDa 프로테아제는 주요한 유사물로서 배제할 수 있다. 네 가지의 펩티드 (51-57, 58-66, 67-80 및 81-90)가 단백질의 N-말단 영역에 속하고 하나의 펩티드(402-409)는 C-말단 영역에 속한다. 분자 사이즈 EC 3.4.24.40은 분석된 밴드 내에 존재하는 것들을 지연한다 (거의 25 kDa, SDS-PAGE에 의해 측정). 이들 발견은 25 kDa 의 밴드는 세라리신 류에 속하는 50 kDa EC 3.4.24.40의 단백질의 것에 유사한 25 kDa의 두 가지 분획 동시 이동을 포함한다.

이 가설을 확인하기 위해, 트립신의 단리로 단백질의 25KDa 밴드의 전개를 하였다. 제거된 펩티드의 ESI-MS 스펩트럼이 풀려지고 가장 강한 시그널이 Profound에 도입되었다. 이 방법은 이미 동정된 동일한 단백질을 밝혀냈다(EC 3.4.24.40). 트립신 단리의 시퀀스 커버(21 %)는 주로 이전 단리의 것(10 %)이다. 시퀀스 커버 맵은 단백질의 트립신 분획 PRZN_SERMA/PRZN_SERSP을 갖는 매우 양호한 것으로 고려되는 일곱 펩티드를 입증했다. 이들의 다섯(28-41, 58-66, 67-80, 81-90 및 163-171)은 N-말단 영역에 상응하고, 반면 나머지 두 펩티드(351-373 및 374-393)는 C-말단 영역에 상응한다. 이들 결과는 단백질의 이전 동정을 뒷받침할 뿐 아니라, 맵 커버가 분석된 밴드에 PRZN_SERMA/PRZN_SERSP으로 25 kDa의 동정 단백질의 두 가지 동시 이동 분획의 제시한다.

이미 언급된 단백질의 N- 및 C-말단 영역의 펩티드에 상응하는 ESI-MS/MS 스펙트럼이 손쉽게 설명되고 부분적인 시퀀스는 그 동정에 의해 제거된다, 표 3.

25 kDa 밴드에 존재하는 다섯 펩티드의 ESI-MS/MS 스펙트럼의 해독 매뉴얼. 1-4의 펩티드는 PRZN_SERMA/PRZN_SERSP 단백질의 N-말단 영역에 속하고 반면 5 펩티드는 이 동일한 단백질의 C-말단 영역에 상응한다.

m 1	시퀀스 태그	m 2	펩티드 시퀀스	z	m/z 기대치	이론적m/z	차이
705.47	AQENS	1235.74	28-41	2	792.91	792.89	0.02
522.28	TFSF	1004.54	58-66	2	559.29	559.28	0.01
677.38	AVN	961.58	67-80	2	692.35	692.34	0.01
730.40	EAS	1017.58	81-90	2	582.79	582.79	0.00
1117.84	GGFX	1493.08	351-373	2	1031.45	1031.48	0.03

사용된 방법 및 얻어진 결과로 분석된 25 kDa 밴드에 단백질 N 및 C-말단의 유사 PRZN _ SERMA / PRZN _ SERSP 를 갖는 분획을 가지는 단백질의 일 혼합물이 존재한다는 것으로 귀결되었다.

실시예 13. p50 의 동정.

항-증식성 활성을 갖는 단백질 p50을 동정하기 위해, 실시예 6에 기술된 정제 프로토콜로 얻어진 50 kDa 단백질에 상응하는 단백질성 분획이 Lys-C 엔도프로테이나제(endoproteinase)로 단리된다. 펩티드의 동정은 FAB 캐논을 갖는 JMS HX- 110 더블 섹터 매스 스펙트로메터 및 자동화 에드만 데그라데이션(Edman Degradacion)에 의해 시퀀스화의 수단에 의해 수행되었다. 이들의 결과 및 스위스포트(Swissprot) 및 PIR 소프트웨어에 의해 실현된 조정은 이런 단백질은 50 kDa 분자 중량을 갖는 세라리신의 류의 것이라는 결론을 내었다. 중요한 유사성이 스위스포트 뱅크에서의 PRZN_SERSP 및 PRZN_SERMA 동정을 갖는 종에 발견되었다. 매스 스펙트로메터에 의해 분석된 모든 펩티드의 분자 질량은 Lys-C 엔도프로테이나제로 이들 단리 단백질의 펩티드에 기대 분자량과 일치한다.

실시예 14. 크로마토그라피에 의한 정제된 p25의 동정.

항-증식성, 어팝토틱 및 항-혈관신생 활성을 갖는 25 kDa 단백질을 동정하기 위해, 실시예 6에서 기술된 DEAE 크로마토그라피에 의해 정제된 p25가 SDS-PAGE에 적용되었다. 단백질 밴드는 5분 동안 500 μL의 물로 수세되고, 그 후 시트릭산 용액 100 mM로 탈색되고, 이어서 밀리큐 워터(MilliQ water)로 다시 수세되고, 약 1 mm³의 적은 입방크기로 절단되었다. 그 후, 이의 탈수화시까지 아세토니트릴이 부가되고 과잉량은 제거되었다. 겔 입방은 증류식 원심분리로 완전하게 탈수화되고 이어서 12.5 ng/μL의 농도로 트립신에 포함된 암모니움 비카보네이트 용액(50 mM)에서 다시 수화된다. 그 후 밤새도록 37 ℃에서 30분 동안 자동온도조절장치 혼합기에서 배양된다.

이 펩티드는 20 μL의 암모니움 비카보네이트 용액을 부가하고 부가적으로 45분 동안 37℃에서 배양을 위해 수동적으로 회피된다. 펩티드는 ZipTip_C18 ^TM 의 사용으로 제거되고 이어서 이것은 5 μL의 유리 포름산을 부가하여 혼합 반응물을 산성으로 하고 ZipTip_C18 ^TM 의 사용에 의해 펩티드를 다시 제거한다. ZipTip_C18 ^TM 에 부착된 펩티드는 5 % 포름산 용액으로 지속적으로 수세되고 이어서 1 % 포름산을 포함하는 부피 2-3 μL의 60 % 아세토니트릴 용액으로 퇴피된다.

단리 간에 생성된 펩티드는 (QTOF-2^TM) 나노스프레이 파운틴을 장착하는 오르도고날 지오메트릭 히브리도 매스 스펙트로메터의 이온화 파운틴에 도입된 금으로 커버된 하나의 보로실리케이트 모세관에 적하된다.

ESI-MS 매스 스펙트럼이 1초 동안 350-2000 Da의 범위에서 얻어진다. 가장 강한 시그날이 그의 후위 ESI-MSMS 시퀀스에서 선택된다. 충돌 개스 채용은 아르곤이고, 이것은 데이터 베이스에서 명백한 동정을 가능하게 하는 선택된 펩티드의 포괄적인 분획화를 하기에 적절한 충돌 에너지로 사용된다.

ESI-MS 스펙트럼은 풀려지고 펩티드 질량 지문(Peptide Mass Fingerprint; PMF)의 방법을 매개하여 SWISSPROT 및 NCBInr 데이터 베이스에서 단백질의 동정을 위해 DTA 포맷으로 보내지고 MASCOT 프로그램에 유입된다. 단백질의 정확한 동정을 위해, 트립신의 펩티드 자동 단백질 가수분해를 채용하기 위한 안쪽으로 캘리브레이션을 사용하여 이것을 0.05 Da에 고정하여 스펙트럼에서 관찰된 펩티드의 조사를 실현하고 베이스 피크의 강도보다 10% 강한 강도를 갖는 이들 시그날을 선택했다.

분석된 밴드에 존재하는 4개의 펩티드가 ESI-MSMS에 의해 시퀀스되었다(표 4). 이미 이전의 실시예에서 기술된 바와 같이 단백질의 이들 펩티드 PRZN_SERMA/PRZN_SERSP는 C-말단 영역(표 6의 시퀀스에서 빨강으로 나타난 부분)에 관련된다.

ESI-MSMS에 의해 시퀀스된 S. 마르세센스의 p25에 관한 펩티드.

#	아미노산의 시퀀스	m/z teor .	m/z exp	편차
1	DFLSTTSNSQK	1226.51	1226.58	0.07
2	SAASDSAPGASDWIR	1489.75	1489.68	0.07
3	GGAGNDVLFGGGGADELWGGAGK	2060.96	2060.87	0.11
4	TGDTVYGFNSNTGR	1488.65	1488.60	0.05

비록 전혀 시퀀스되지 않은 다른 시그날의 발견되어지는 것과 마찬가지로, 그 질량 값은 단백질 C-말단 영역의 PRZN _ SERMA / PRZN _ SERSP 로 동정된 트립틱 펩티드에 대한 질량 값의 기대치에 매우 양호하게 일치한다, 표 55 (표 6에서 블루로 나타난 부분). 이 펩티드들 사이에 PRZN _ SERMA / PRZN _ SERSP 단백질 C-말단의 펩티드와 일치할 수 있는 적하된 이중 시그날이 나타난다. 특정의 PRZN _ SERMA / PRZN _ SERSP 단백질 N-말단 영역을 절단하기 위한 할당부위일 수 있는 펩티드는 발견되지 않았다.

ESI-MS 스펙트럼 내에서 검지된 PRZN_SERMA 단백질에 속하는 트립틱 펩티드.

#	아미노산의 시퀀스	m/z exp .	m/z calc .	z	편차
1	325 SFSDVGGLK 333	455.20	455.24	2	0.04
2	417 IDLSFFNK 424	492.24	492.26	2	0.02
3	475 IVGQVDVATDFIV 487	688.35	688.38	2	0.03

이 실시예에서 보여준 방법 및 결과는 p25 밴드의 DEAE 크로마토그라피에 의해 정제된 강력한 항-증식성에는 단백질의 25 kDa 의 C-말단 분획인 PRZN_SERMA/PRZN_SERSP가 존재한다는 것을 공고히 하는 것을 가능하게 한다.

표 6. DEAE 크로마토그라피에 의해 얻어진 p50 및 p25 의 동정. 이 시퀀스에서 성숙 단백질에 존재하지 않는 아미노산으로 폴트가 발견된다. 이 아미노산이 없다면, 이 단백질 PRZN_SERSP 및 PRZN_SERMA의 분자량은 각각은 50595.4 Da 및 50293.4 Da이다. 분자들 사이에 지연을 위한 트립틱 펩티드의 동정은 양자 종이 공존으로 존재하고 포함될 수 있거나(녹색(이태릭체)): 매스 스펙트로메터에 의해 동정된 적갈색(강조)이거나: 이드만 분해에 의해 동정된 것(연속적인 직사각형의 내부)일 수 있음을 제시한다. 펩티드 마킹(

및

)은 실시예 6에서 기술된 크로마토그라피에 의해 얻어진 p25에서 동정된다. 펩티드 마킹(

) 및 밑줄친 것은 실시예 6에서 기술된 크로마토그라피에 의해 얻어진 p50에서 동정되고 (이태릭체로된) 펩티드는 겔 분획으로부터 동정되었다.

실시예 15. 25 kDa을 갖는 N- 및 C-말단의 단백질.

SDS-PAGE 내의 높이 25 kDa에 공존할 수 있는 단백질의 분자 크기를 결정하기 위해, PRZN_SERMA/PRZN_SER의 분해 부분에 그 시퀀스를 만들고 GenRun 프로그램에 도입된다. 25 kDa (±2 kDa)의 N- 및 C-말단에 상당하는 분획이 표 7에 나타난다.

표 7. PRZN_SERMA/PRZN_SERSP의 분해 쌍에 발견된 25 ± 2 kDa의 크기를 갖는 단백질. 분자량은 N- 및 C-말단의 부위에 대해 GenRun 프로그램을 고려하여 결정된다.

단백질	시퀀스
ARA1	MSYWSETNTGGDNGGHYAAAPLLDDIAAIQHLYGANPSTRTGDTVYGFNSNTGRDFLSTT SNSQKVIFAAWDAGGNDTFDFSGYTANQRINLNEKSFSDVGGLKGNVSIAAGVTIENAIG GSGNDVIVGNAANNVLKGGAGNDVLFGGGGADELWGGAGKDIFVFSAASDSAPGASDWIR DFQKGIDKIDLSFFNKEANSSDFIHFVDHFSGTAGEALLSYNASSNVTDLSVNIGGHQAP DFLVKIVGQVDVATDFIV
ARA2	MSYWSETNTGGDNGGHYAAAPLLDDIAAIQHLYGANLSTRTGDTVYGFNSNTGRDFLSTT SNSQKVIFAAWDAGGNDTFDFSGYTANQRINLNEKSFSDVGGLKGNVSIAAGVTIENAIG FRQRLIVGNAANNVLKGGAGNDVLFGGGGADELWGGAGKDIFVFSAASDSAPGASDWIRD FQKGIDKIDLSFFNKEAQSSDFIHFVDHFSGAAGEALLSYNASNNVTDLSVNIGGHQAPD FLVKIVGQVDVATDFIV
ARA3	TRTGDTVYGFNSNTGRDFLSTTSNSQKVIFAAWDAGGNDTFDFSGYTANQRINLNEKSFS DVGGLKGNVSIAAGVTIENAIGFRQRLIVGNAANNVLKGGAGNDVLFGGGGADELWGGAG KDIFVFSAASDSAPGASDWIRDFQKGIDKIDLSFFNKEAQSSDFIHFVDHFSGAAGEALL SYNASNNVTDLSVNIGGHQAPDFLVKIVGQVDVATDFIV
ARA4	TRTGDTVYGFNSNTGRDFLSTTSNSQKVIFAAWDAGGNDTFDFSGYTANQRINLNEKSFS DVGGLKGNVSIAAGVTIENAIGFRQRLIVGNAANNVLKGGAGNDVLFGGGGADELWGGAG KDIFVFSAASDSAPGASDWIRDFQKGIDKIDLSFFNKEAQSSDFIHFVDHFSGAAGEALL SYNASNNVTDLSVNIGGHQAPDFLVKIVGQVDVATDFIV

실시예 16. MG2327-유도 어팝토시스.

MG2327 은 분획화된 DNA 를 포함하고 미토콘드리아 및 미세소관을 포함하는 미엘로마 X63 세포에 대한 아팝토시스를 포함한다.

종양성 세포사의 종류를 결정하기 위해, 뮤린 미엘로마 P3X63Ag8 세포 (2*10⁷)는 22 ㎍/mL의 MG2327로 생체외에서 처리되었다. 처리된 세포 및 처리되지 않은 세포는 다른 시간에 초미세구조의 투과형 전자 현미경 검사 연구를 위해 준비되었으며, 유전자의 DNA가 DNA의 레이더링 분석을위해 추출되었다.

DNA 분획화는 2 % 아가로스 겔 전기영동에 의해 시금되었다. 아팝토시스는 내부-뉴클레오솜의 거리의 대표적인 180-200 bp의 세포 DNA 레이더링을 주로 포함한다(Soldatenkov, V. A., Prasad, S., Voloshin, Y., and Dritschilo, A. 1998. Cell Death Differ. 5:307-12). 도 13에 도시된 바와 같이, 중요한 증가가 배양에서 형태학상의 변화에 서로 관련되고 전자 현미경 검사에 의해 확증된 올리고뉴클레오좀에서 관찰되었다.

내부-뉴클레오솜의 분획화는 광학적 현미경에 의해 검지된 어팝토시스의 형태학상의 징조에 의해 검지된다. 더욱이, 현미경 사진은 변형된 세포질의 기관(미토콘드리아, 2h)를 보여주고, 크로마틴 응축(4h) 및 내부뉴클레오좀의 분획화(6h)를 진행한다.

MG2327 은 미토콘드리아의 초미세구조의 조직화 및 미세소관에 영향을 미쳐, P3X63Ag8 세포의 어팝토시스를 증가한다.

비처리된 세포는 전형적인 미토콘드리아의 초미세구조: 명확히 볼 수 있는 미토콘드리아의크리스타 및 보다 높은 밀도의 미토콘드리아 매트릭스로, 세포질 전체에 걸쳐 균일하게 분포된 것을 나타낸다(도 14A).

MG2327로 처리된 세포는 증가된 사이즈의 미토콘드리아, 보다 낮은 매트릭스 밀도 및 크게 영향을 받은 크리스타 형태를 나타낸다(도 14B-E). 이들 초미세구조의 변화는 주로 기능장애가 있는 기관을 나타낸다.

더욱이, 처리 2 시간 후 또한 미토콘드리아 및 핵 구조로 소포체에 관한 광범위한 세포질 액포를 관찰했다(도 14B).

다른 형태학적 변화가 처리 6시간 후 핵에서 관찰되었다(크로마틴 응축, 융합 및 레이더링). MG2327로 처리된 P3X63Ag8 세포의 나중 상 어팝토시스 현미경 사진(8 hr)에서, 크로마틴은 컴팩트하게 나타났다(도 14F). 신생은 어느 때도 감지되지 않았다.

흥미롭게, 2시간 동안 처리된 P3X63Ag8 세포에 대한 미토콘드리아는 세포질 멤브레인 주변에서 덩어리져(도 14B-E), 미세소관 파열과 이 기관을 따라 간섭된 미토콘드리아 전이를 초래한다 (Schatten, H., and Lewis, M.L. 2001. Acta Astronaut. 49:399-418).

도14C 및 D는 또한 내부 미토콘드리아의 멤브레인에 부착된 농축된 구조를 갖는 보다 큰 미토콘드리아를 나타낸다. 이들 구조는 연속적인 크리스타 용융에 의해 발생되어지는 것으로 보인다. MG2327은 사이즈를 증가하면서 미토콘드리아 외부 멤브레인 팽창 후 시토졸 내에 시토크롬 c의 방출에 의해, 카스파제 활성화 및 어팝토시스가 뒤따라 어팝토시스를 발생할 수 있다(Green, D.R. and Reed, J.C. 1998. Science. 28:1309-1312. Review).

사이즈의 증가 없이, 시토크롬 c는 또한 융합 후 내부멤브레인 공간과 크리스타 사이의 접합점을 통해 미토콘드리아의 손상된 크리스타로부터 시토졸로 완전하고 빠르게 방출될 수 있다(Scorrano, L.., Ashiya, M., Buttle, K., Weiler, S., Oakes, S.A., Mannella, C.A. and Korsmeyer, S.J. 2002. Dev Cell. 2:55-67). 이 기술된 과정은 MG2327에 의해 발생된 어팝토시스 시그날을 세포 내로 유의적으로 증폭했다.

실시예 17. 어팝토시스 유도 P25 및 P50

MG2327에 의해 유도된 어팝토틱 발생에서 p25 및 p50의 역할을 식별하기 위해, 이것은 다른 농도로 P3X63Ag8 세포에 개별적으로 투여되고 전자 현미경 검사에 의해 분석되었다. 모든 경우에 있어서, 크로마틴 농축, 손상된 미토콘드리아 크리스타 및 덩어리진 미토콘드리아가 검지되었다. 실제로, MG2327에 의한 어팝토시스 유도는 이들 두 단백질의 효과에 연결된다.

실시예18 . MG2327의 항혈관신생의 효과 및 항-증식성 폴리펩티드

마트리겔에 튜브형 구조의 전개

인간 마이크로-혈관계-유래 인간 내피 세포(HMEC)가 마트리겔 상에 내피 선 형성(Crum R, Szabo S, Folkman J. 1985. Science. 230:1375-8; Vacca, A., Ribatti, D., Presta, M., Minischettti, M., Iurlaro, M, Ria, R, Albini, A, Bussolino, F. and Dammaacco, F. 1999. Blood 93:3064) 에 대해, 비-세포독성적MG2327 및 p25 및 p50 농도 하에서 배양 (Sanz, L., Pascual, M., Munoz, A., Gonzalez, M.A., Salvador CH, Alvarez-Vallina L. 2002. Microvascular Research 63:335-339) 후 평가되었다. 결과는 이미지-프로 익스프레스 4.5팩키지를 사용하여 계산된 바와 같이, 이들 사이에 상호 연결의 수 및 튜브형 구조의 길이를 고려했다. 이것은 MG2327 조제 및 이의 p25 및 p50 분획으로 처리 후 내피 세포(도 15)의 분화 또는 성숙의 유의성 있는 저해(p<0.05, ANOVA) 를 나타낸다.

실시예 19. 증식하는 세포에 대한 MG2327의 간접적 효과.

MG2327는 Balb/c 마우스를 미엘로이드 종양 임플란트로부터 보호함.

임플란트된 종양에 대해 MG2327의 보호적 활성을 분석하기 위해, Balb/c 마우스가 다른 면역화 스케쥴 하에서 1 mg/ml의 이 항종양 조제가 접종(i.p.)되었다. 세 가지 복용량이 투여되었으며, 일 복용량은 매주, 그리고 두 복용량은 복용 간에 적어도 3일의 간격을 가지고 삼 주 동안에 매주 복용되었다. 음성 대조군은 1X PBS가 접종되었다. 이백만의 P3X63Ag8 미엘로마 세포가 제일 복용 150일 후(5개월 후) 실험군(처리 및 대조군)에 i.p.로 접종되었다. 음성 대조군으로부터의 모든 마우스는 처음 25일 동안에 죽었으며, 반면 100%의 처리된 동물은 종양 없이 생존했다(도 16).

실시예 20 다른 세라리신의 C-말단 도메인은 또한 단백질 가수분해 활성 없이 세포독성 효과를 가짐.

ATCC14756 균주는 실시예 2에 따른 CMIB4202 균주와 유사한 조건 하에서 배양되고 그 배양 상등액은 실시예 6에 기술된 것과 같이 처리된다. 양 조제에서, 50 mM 인삼염-0.2 M NaCl, pH 8.00로 용리된 50 kDa 준위에서 단백질을 관찰했다. 이들 단백질은 10 mM의 EDTA로 저해되고 5 μM Zn₂SO₄로 회수된 효소적 활성을 나타냈다. 양 단백질은 CNBr로 화학적으로 단리되고 단리 패턴은 유사하여, 시퀀스 내의 내부 메티오닌으로부터 분자의 말단까지, p50의 C-말단에 상응하는 대략 25 kDa의 유사한 분획을 발생한다.

단리로부터 얻어진 분획은 48시간 동안 투석을 통하여 완충액에서 변화로 다시 복원된다. 이들 분획 의 생물학적 활성이 이들의 존재 하에서 72시간 동안 배양된 HEp.2 세포를 사용하여 여기에 기술된 세포독성 분석에서 시험되었다. 단리에 의해 생산된 분획은 5 mM EDTA의 존재 하에서 단백질 가수분해 활성을 결하고, 완전한 p50 분자의 것 보다 약 2.5배 복용량-의존적인 보다 높은 세포독성 활성을 나타낸다. 일단 이들의 시퀀스가 공지된 이들 분획은 또한 화학적 합성 또는 재조합 기술에 의해 수득될 수 있다.

실시예 21 항체들 또는 항체 분획을 갖는 세라리신 분획의 조합.

실시예 6 및 20에서 얻어진 폴리펩티드의 분획은 모노클로날 항체 CB/ior-CEA.1 (Tormo B et al. APMIS 97:1073-1080, 1989)와, 그 변동가능한 영역에서, 그리고 그의 시퀀스(diabody)로부터 재조합 DNA 기술을 통하여 얻어진 항체 분획과 화학적으로 컨쥬게이트된다(특허 WO 03/093315). 컨쥬게이트된 생체분자는, 실시예 3에서 기술된 것에 유사한 항-증식성 분석을 통해, 배양에서 모두 CEA를 발현하는 인간 종양 세포 라인 LoVo (ATCC CCL-229), AsPC-1 (ATCC CRL-1682) 및 LS 174T (ATCC CL-188)에 대해 분석된다. 컨쥬게이트된 분획은, 복용량-의존적 반응으로, 컨쥬게이트되지 않은 분획과 동등한 세포독성 농도로 사용되고, 반면 컨쥬게이트되지 않은 분자는 아무런 항-증식성 반응이 관찰되지 않았다. 이는 컨쥬게이트된 분획은 세포 상에서 CEA에 결합되어, 세포-ELISA 및 간접적인 면역형광검사법으로 생산물을 사용하는 것을 나타낸다(특허 WO 03/093315). 이들 결과는 여기에 기술된 컨쥬게이트들이 암의 치료 및 진단을 위해 사용될 수 있다는 것을 입증한다.

SEQUENCE LIST. <110> CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION THAT CONTAINING POLYPEPTIDE FRAGMENTS OF SERRALISINS <130> Maria del Carmen <140> <141> 2004-07-08 <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 258 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(258) <223> ARA1 Polypeptide: antiproliferative, apoptotic, antiangiogenic and protector against diseases to be relate with the cellular proliferation and the angiogenic. Sequence of the C-terminal of the SERMA.Serralisin <400> 1 Met Ser Tyr Trp Ser Glu Thr Asn Thr Gly Gly Asp Asn Gly Gly His 1 5 10 15 Tyr Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp Asp Ile Ala Ala Ile Gln His Leu 20 25 30 Tyr Gly Ala Asn Pro Ser Thr Arg Thr Gly Asp Thr Val Tyr Gly Phe 35 40 45 Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Ser Thr Thr Ser Asn Ser Gln 50 55 60 Lys Val Ile Phe Ala Ala Trp Asp Ala Gly Gly Asn Asp Thr Phe Asp 65 70 75 Phe Ser Gly Tyr Thr Ala Asn Gln Arg Ile Asn Leu Asn Glu Lys Ser 80 85 90 95 Phe Ser Asp Val Gly Gly Leu Lys Gly Asn Val Ser Ile Ala Ala Gly 100 105 110 115 Val Thr Ile Glu Asn Ala Ile Gly Gly Ser Gly Asn Asp Val Ile Val 120 125 130 Gly Asn Ala Ala Asn Asn Val Leu Lys Gly Gly Ala Gly Asn Asp Val 135 140 145 Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Glu Leu Trp Gly Gly Ala Gly Lys 150 155 160 Asp Ile Phe Val Phe Ser Ala Ala Ser Asp Ser Ala Pro Gly Ala Ser 165 170 175 Asp Trp Ile Arg Asp Phe Gln Lys Gly Ile Asp Lys Ile Asp Leu Ser 180 185 190 195 Phe Phe Asn Lys Glu Ala Asn Ser Ser Asp Phe Ile His Phe Val Asp 200 205 210 His Phe Ser Gly Thr Ala Gly Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Asn Ala Ser 215 220 225 Ser Asn Val Thr Asp Leu Ser Val Asn Ile Gly Gly His Gln Ala Pro 230 235 240 Asp Phe Leu Val Lys Ile Val Gly Gln Val Asp Val Ala Thr Asp Phe 245 250 255 Ile Val 260 <210> 2 <211> 257 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(257) <223> ARA2 Polypeptide: antiproliferative, apoptotic, antiangiogenic and protector against diseases to be related with the cellular proliferation and the angiogenic. C-terminal Sequence of the SERSP.Serralisin <400> 2 Met Ser Tyr Trp Ser Glu Thr Asn Thr Gly Gly Asp Asn Gly Gly His 1 5 10 15 Tyr Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp Asp Ile Ala Ala Ile Gln His Leu 20 25 30 Tyr Gly Ala Asn Leu Ser Thr Arg Thr Gly Asp Thr Val Tyr Gly Phe 35 40 45 Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Ser Thr Thr Ser Asn Ser Gln 50 55 60 Lys Val Ile Phe Ala Ala Trp Asp Ala Gly Gly Asn Asp Thr Phe Asp 65 70 75 80 Phe Ser Gly Tyr Thr Ala Asn Gln Arg Ile Asn Leu Asn Glu Lys Ser 85 90 95 Phe Ser Asp Val Gly Gly Leu Lys Gly Asn Val Ser Ile Ala Ala Gly 100 105 110 Val Thr Ile Glu Asn Ala Ile Gly Phe Arg Gln Arg Leu Ile Val Gly 115 120 125 Asn Ala Ala Asn Asn Val Leu Lys Gly Gly Ala Gly Asn Asp Val Leu 130 135 140 Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Glu Leu Trp Gly Gly Ala Gly Lys Asp 145 150 155 160 Ile Phe Val Phe Ser Ala Ala Ser Asp Ser Ala Pro Gly Ala Ser Asp 165 170 175 Trp Ile Arg Asp Phe Gln Lys Gly Ile Asp Lys Ile Asp Leu Ser Phe 180 185 190 Phe Asn Lys Glu Ala Gln Ser Ser Asp Phe Ile His Phe Val Asp His 195 200 205 Phe Ser Gly Ala Ala Gly Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Asn Ala Ser Asn 210 215 220 Asn Val Thr Asp Leu Ser Val Asn Ile Gly Gly His Gln Ala Pro Asp 225 230 235 240 Phe Leu Val Lys Ile Val Gly Gln Val Asp Val Ala Thr Asp Phe Ile 245 250 255 Val <210> 3 <211> 219 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(219) <223>: ARA3 Polypeptide: antiproliferative, apoptotic, antiangiogenic and protector against diseases to be related with the cellular proliferation and the angiogenic. C-terminal Sequence of the SERSP.Serralisin <400> 3 Thr Arg Thr Gly Asp Thr Val Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg 1 5 10 15 Asp Phe Leu Ser Thr Thr Ser Asn Ser Gln Lys Val Ile Phe Ala Ala 20 25 30 Trp Asp Ala Gly Gly Asn Asp Thr Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Thr Ala 35 40 45 Asn Gln Arg Ile Asn Leu Asn Glu Lys Ser Phe Ser Asp Val Gly Gly 50 55 60 Leu Lys Gly Asn Val Ser Ile Ala Ala Gly Val Thr Ile Glu Asn Ala 65 70 75 80 Ile Gly Phe Arg Gln Arg Leu Ile Val Gly Asn Ala Ala Asn Asn Val 85 90 95 Leu Lys Gly Gly Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala 100 105 110 Asp Glu Leu Trp Gly Gly Ala Gly Lys Asp Ile Phe Val Phe Ser Ala 115 120 125 Ala Ser Asp Ser Ala Pro Gly Ala Ser Asp Trp Ile Arg Asp Phe Gln 130 135 140 Lys Gly Ile Asp Lys Ile Asp Leu Ser Phe Phe Asn Lys Glu Ala Gln 145 150 155 Ser Ser Asp Phe Ile His Phe Val Asp His Phe Ser Gly Ala Ala Gly 160 165 170 175 Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Asn Ala Ser Asn Asn Val Thr Asp Leu Ser 180 185 190 Val Asn Ile Gly Gly His Gln Ala Pro Asp Phe Leu Val Lys Ile Val 195 200 205 Gly Gln Val Asp Val Ala Thr Asp Phe Ile Val 210 215 <210> 4 <211> 220 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(220) <223> ARA4 Polypeptide: antiproliferative, apoptotic, antiangiogenic and protector against diseases to be related with the cellular proliferation and the angiogenic. C-terminal Sequence of the SERMA. .Serralisin <400> 4 Thr Arg Thr Gly Asp Thr Val Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg 1 5 10 15 Asp Phe Leu Ser Thr Thr Ser Asn Ser Gln Lys Val Ile Phe Ala Ala 20 25 30 Trp Asp Ala Gly Gly Asn Asp Thr Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Thr Ala 35 40 45 Asn Gln Arg Ile Asn Leu Asn Glu Lys Ser Phe Ser Asp Val Gly Gly 50 55 60 Leu Lys Gly Asn Val Ser Ile Ala Ala Gly Val Thr Ile Glu Asn Ala 65 70 75 Ile Gly Gly Ser Gly Asn Asp Val Ile Val Gly Asn Ala Ala Asn Asn 80 85 90 95 Val Leu Lys Gly Gly Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ala Asp Glu Leu Trp Gly Gly Ala Gly Lys Asp Ile Phe Val Phe Ser 115 120 125 Ala Ala Ser Asp Ser Ala Pro Gly Ala Ser Asp Trp Ile Arg Asp Phe 130 135 140 Gln Lys Gly Ile Asp Lys Ile Asp Leu Ser Phe Phe Asn Lys Glu Ala 145 150 155 Asn Ser Ser Asp Phe Ile His Phe Val Asp His Phe Ser Gly Thr Ala 160 165 170 175 Gly Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Asn Ala Ser Ser Asn Val Thr Asp Leu 180 185 190 Ser Val Asn Ile Gly Gly His Gln Ala Pro Asp Phe Leu Val Lys Ile 195 200 205 Val Gly Gln Val Asp Val Ala Thr Asp Phe Ile Val 210 215 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(5) <223> Serralisins Sequence <400> 5 Ala Gln Glu Asn Ser 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> Serralisins Sequence <400> 6 Thr Phe Ser Phe 1 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> Serralisins Sequence <400> 7 Ala Val Asn 1 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> Serralisins Sequence <400> 8 Glu Ala Ser 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> Serralisins Sequence <400> 9 Gly Gly Phe Xaa 1 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Serralisins Sequence <400> 10 Asp Phe Leu Ser Thr Thr Ser Asn Ser Gln Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Serralisins Sequence <400> 11 Ser Ala Ala Ser Asp Ser Ala Pro Gly Ala Ser Asp Trp Ile Arg 1 5 10 15 <210> 12 <211> 23 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Serralisins Sequence <400> 12 Gly Gly Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Glu 1 5 10 15 Leu Trp Gly Gly Ala Gly Lys 20 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Serralisins Sequence <400> 13 Thr Gly Asp Thr Val Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> Serralisins Sequence <400> 14 Ser Phe Ser Asp Val Gly Gly Leu Lys 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> Serralisins Sequence <400> 15 Ile Asp Leu Ser Phe Phe Asn Lys 1 5 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Serralisins Sequence <400> 16 Ile Val Gly Gln Val Asp Val Ala Thr Asp Phe Ile Val 1 5 10

Claims (13)

1. 시퀀스 아디 No.1, No.2, No.3 및 No.4 중 어느 하나의 아미노산 시퀀스로 이루어진 세라리신 분획.
2. 제 1항에 있어서, 세포 배양 상등액으로부터 수득됨을 특징으로 하는 세라리신 분획.
3. 삭제
4. 삭제
5. 시퀀스 아디 No.1, No.2, No.3 및 No.4 중 어느 하나의 아미노산 시퀀스로 이루어진 세라리신 분획을 포함한 종양의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
6. 제5항에 있어서, 추가로 프로디기오신을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 제5항에서 있어서, 상기 세라리신 분획은 분자응집체로서 포함되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
10. 삭제
11. 제5항에 있어서, 혈관신생 또는 세포증식관련 병증의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
12. 제5항에 있어서, 항-혈관신생, 어팝토틱, 항증식 또는 항증식유도제로 사용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
13. 제5항에 있어서, 프로디기오신과 조합되어 사용하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.

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