KR101344611B1 - 인간 ｔｗｅａｋ 에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

SEQ ID NO: 8, 16 또는 24 로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3H 을 중쇄 가변 도메인으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 TWEAK 에 결합하는 것을 특징으로 하는 TWEAK 에 결합하는 항체.

Description

인간 ＴＷＥＡＫ 에 대한 항체 및 이의 용도 {ANTIBODIES AGAINST HUMAN TWEAK AND USES THEREOF}
본 발명은 인간 TWEAK 에 대한 항체 (TWEAK 항체), 이의 제조 방법, 이 항체를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
인간 TWEAK (UniProtKB O43508, 아폽토시스의 TNF-관련 약 유도인자) 는 세포 표면 결합의 유형 II 트랜스멤브레인 단백질이다. TWEAK 는 문헌 [Chicheportiche, Y. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 32401-32410; Marsters, S.A. et al., Curr. Biol. 8 (1998) 525-528; Lynch, C.N et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 8455-8459] 에 기술되어 있다. TWEAK 의 활성 형태는 가용성 동종삼합체 (homotrimer) 이다. 인간 및 쥐과동물 TWEAK 는 수용체 결합 도메인에서 93% 서열 동일성을 보인다. TWEAK 수용체 Fn14 (섬유모세포 성장 인자 유도성 14 kDa 단백질) 는 리간드 결합 도메인에서 단 하나의 시스테인 풍부 도메인으로 이루어진 129 aa 유형 I 트랜스멤브레인 단백질이다. TWEAK 의 시그널링은 NF-KB 경로 활성화를 통해 일어난다. TWEAK mRNA 는 다양한 조직에서 발현되고 심장, 뇌, 골격근 및 췌장과 같은 대부분의 큰 기관, 비장, 림프절 및 가슴샘과 같은 면역계와 관련된 조직에서 발견된다. Fn14 mRNA 는 심장, 뇌, 폐, 태반, 혈관 EC 및 민무늬 근육 세포에서 검출되어진다. TWEAK-널 (null) 및 Fnl4-널 노크아웃 (knockout) 마우스는 생존가능하고 건강하며 가임성이고, 더 많은 자연 살해 세포를 갖고 증강된 선천적 염증 응답성을 보인다. TWEAK 는 아폽토시스, 증식, 혈관신생, 허혈성 반음영, 뇌부종, 다발경화증에 관여된다.
항-TWEAK 항체는 하기에 언급되어 있다: WO　1998/005783, WO　2000/042073, WO　2003/086311, WO　2006/130429, WO　2006/130374, WO　2006/122187, WO　2006/089095, WO　2006/088890, WO　2006/052926.
본 발명의 개요
본 발명은 중쇄 가변 도메인으로서 SEQ ID NO: 8, 16 또는 24 로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 영역 (CDR3H) 을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 TWEAK 에 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명은 SEQ ID NO:1 의 가변 경쇄 및 SEQ ID NO:5 의 가변 중쇄를 포함하는 항체의, SEQ ID NO:9 의 가변 경쇄 및 SEQ ID NO:13 의 가변 중쇄를 포함하는 항체의, 또는 SEQ ID NO:17 의 가변 경쇄 및 SEQ ID NO:21 의 가변 중쇄를 포함하는 항체의 키메라 (chimeric), 인간화 또는 T-세포 에피토프 소실된 변이체를 포함한다.
바람직하게, 항체는 SEQ ID NO:6 의 CDR1H, SEQ ID NO:7 의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:8 의 CDR3H 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 SEQ ID NO:14 의 CDR1H, SEQ ID NO:15 의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:16 의 CDR3H 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 SEQ ID NO:22 의 CDR1H, SEQ ID NO:23 의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:24 의 CDR3H 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 SEQ ID NO:22 의 CDR1H, SEQ ID NO:74 의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:24 의 CDR3H 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 SEQ ID NO:22 의 CDR1H, SEQ ID NO:75 의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:24 의 CDR3H 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 SEQ ID NO:6 의 CDR1H, SEQ ID NO:7 의 CDR2H, SEQ ID NO:8 의 CDR3H 및 SEQ ID NO:2 의 CDR1L, SEQ ID NO:3 의 CDR2L, SEQ ID NO:4 의 CDR3L 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 SEQ ID NO:14 의 CDR1H, SEQ ID NO:15 의 CDR2H, SEQ ID NO:16 의 CDR3H 및 SEQ ID NO:10 의 CDR1L, SEQ ID NO:11 의 CDR2L, SEQ ID NO:12 의 CDR3L 을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 SEQ ID NO:22 의 CDR1H, SEQ ID NO:23 의 CDR2H, SEQ ID NO:24 의 CDR3H 및 SEQ ID NO:18 의 CDR1L, SEQ ID NO:19 의 CDR2L, SEQ ID NO:20 의 CDR3L 을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 SEQ ID NO:22 의 CDR1H, SEQ ID NO:74 의 CDR2H, SEQ ID NO:24 의 CDR3H 및 SEQ ID NO:18 의 CDR1L, SEQ ID NO:19 의 CDR2L, SEQ ID NO:20 의 CDR3L 을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 SEQ ID NO:22 의 CDR1H, SEQ ID NO:75 의 CDR2H, SEQ ID NO:24 의 CDR3H 및 SEQ ID NO:18 의 CDR1L, SEQ ID NO:19 의 CDR2L, SEQ ID NO:20 의 CDR3L 을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 경쇄 가변 도메인 서열로서, SEQ ID NO:1, 9, 17, 32, 33, 34, 35, 44, 45, 46, 47, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 중쇄 가변 도메인 서열로서, SEQ ID NO:5, 13, 21, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 또는 73 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는, 경쇄 가변 도메인 서열로서, SEQ ID NO: 1, 32, 33, 34, 35 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 및 중쇄 가변 도메인 서열로서, SEQ ID NO:5, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 경쇄 가변 도메인 서열로서, SEQ ID NO:9, 44, 45, 46, 47 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 및 중쇄 가변 도메인 서열로서, SEQ ID NO:13, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 경쇄 가변 도메인 서열로서, SEQ ID NO:17, 55, 56, 57, 58, 59, 60 으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 및 중쇄 가변 도메인 서열로서, SEQ ID NO:21, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하기로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 경쇄와 가변 중쇄의 조합물이 바람직하다: 1/5, 1/36, 1/37, 1/38 1/39, 1/40, 1/41, 1/42, 1/43, 32/5, 32/36, 32/37, 32/38, 32/39, 32/40, 32/41, 32/42, 32/43, 33/5, 33/36, 33/37, 33/38, 33/39, 33/40, 33/41, 33/42, 33/43, 34/5, 34/36, 34/37, 34/38 34/39, 34/40, 34/41, 34/42, 34/43, 35/5, 35/36, 35/37, 35/38, 35/39, 35/40, 35/41, 35/42, 35/43; 9/13, 9/48, 9/49; 9/50, 9/51, 9/52, 9/53, 9/54, 44/13, 44/48, 44/49; 44/50, 44/51, 44/52, 44/53, 44/54, 45/13, 45/48, 45/49; 45/50, 45/51, 45/52, 45/53, 45/54, 46/13, 46/48, 46/49; 46/50, 46/51, 46/52, 46/53, 46/54, 47/13, 47/48, 47/49; 47/50, 47/51, 47/52, 47/53, 47/54; 17/21, 17/61, 17/62, 17/63, 17/64, 17/65, 17/66, 17/67, 17/68, 17/69, 17/70, 17/71, 17/72, 17/73, 55/21, 55/61, 55/62, 55/63, 55/64, 55/65, 55/66, 55/67, 55/68, 55/69, 55/70, 55/71, 55/72, 55/73, 56/21, 56/61, 56/62, 56/63, 56/64, 56/65, 56/66, 56/67, 56/68, 56/69, 56/70, 56/71, 56/72, 56/73, 57/21, 57/61, 57/62, 57/63, 57/64, 57/65, 57/66, 57/67, 57/68, 57/69, 57/70, 57/71, 57/72, 57/73, 58/21, 58/61, 58/62, 58/63, 58/64, 58/65, 58/66, 58/67, 58/68, 58/69, 58/70, 58/71, 58/72, 58/73, 59/21, 59/61, 59/62, 59/63, 59/64, 59/65, 59/66, 59/67, 59/68, 59/69, 59/70, 59/71, 59/72, 59/73, 60/21, 60/61, 60/62, 60/63, 60/64, 60/65, 60/66, 60/67, 60/68, 60/69, 60/70, 60/71, 60/72, 60/73 (예, 47/52 이란, SEQ ID NO: 47 의 가변 경쇄 및 SEQ ID NO: 52 의 가변 중쇄를 포함하는 항체를 의미함).
가변 경쇄 및 중쇄 SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:68; SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:69; SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:70; SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:71; SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:72; SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:73; SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:68; SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:69; SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:70; SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:71; SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:72; SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:73 로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 쇄 조합물을 포함하는 본 발명에 따른 항체가 특히 바람직하다.
본 발명의 추가 구현예는 SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 의 가변 중쇄 또는 경쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 또는 경쇄이다. 이러한 가변 중쇄 또는 경쇄는 본 발명에 따른 항체의 제조에서 중간체로서 유용하다.
TWEAK 에 결합하고, 상기 언급된 아미노산 서열 및 아미노산 서열 분절이 인간 IgG1 아이소타입인 것을 특징으로 하는 항체가 바람직하다.
본 발명에 따른 항체는 Biacore 로 측정시, 25℃ 에서 가용성 인간 TWEAK (아미노산 99-249) 과 항체 간 복합체의 반감기가 53 분 이하 (바람직하게 20 분 이하 및 특히 바람직하게 10 내지 20 분) 를 나타낸다. 이러한 낮은 반감기를 보이는 항-TWEAK 항체는 종양 질환 치료에서 사용하기에 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 항체는 특히 인간 TWEAK 에 결합하고, 인간 TWEAK 와 Fn14 의 상호작용을 15　ng/ml 이하의 IC50 값으로 억제한다. 항체는 바람직하게 인간 IgG1 아이소타입의 것이다. 바람직하게 항체는 인간화 또는 인간 항체이다. 본원에서 사용된 바, IC50 이란, 인간 TWEAK 와 Fn14 간의 상호 작용의 50% 를 차단하는 항체의 양을 의미한다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게 Biacore 로 측정시 25℃ 에서 가용성 쥐과동물 TWEAK (아미노산 81-225) 과 항체 간 복합체의 반감기가 70 분 이하 (바람직하게 40 내지 70 분) 를 나타내고, 쥐과동물 TWEAK 에 결합하고, 쥐과동물 TWEAK 와 Fn14 간 상호작용을 40 ng/ml 이하의 IC50 값으로 억제한다.
본 발명의 추가 구현예는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 발명의 추가 구현예는 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다.
본 발명의 추가 구현예는 암, 바람직하게는 결장, 폐 또는 췌장암의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다.
본 발명의 추가 구현예는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법이다.
본 발명의 추가 구현예는 본 발명에 따른 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩 (encoding) 하는 핵산이다.
본 발명은 추가로 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 핵산을 발현할 수 있는 본 발명에 따른 상기 핵산을 함유하는 발현 벡터, 및 이러한 항체의 재조합체 생성을 위한 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 재조합 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법을 포함하는데, 이 방법은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 본 발명에 따른 핵산을 발현하고, 상기 항체를 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 회수하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 그러한 재조합 방법으로 수득가능한 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 TWEAK 타겟팅 요법을 필요로 하는 환자에게 이롭다. 본 발명에 따른 항체는 종양 질환, 특히 결장, 폐 또는 췌장암을 앓고 있는 환자에게 이로운 새로운 신규성 및 진보성을 지닌다.
본 발명은 추가로 암, 특히 결장, 폐 또는 췌장암을 앓고 있는 환자의 치료 방법을 제공하는데, 이는 상기 질환으로 진단받은 환자 (그리하여, 이러한 치료를 필요로 하는 환자) 에게 유효량의 본 발명에 따른 TWEAK 와 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 약학적 조성물로 항체를 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 추가 구현예는 암, 특히 결장, 폐 또는 췌장암을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로, 이는 본 발명에 따른 항체를 상기 환자에게 투여하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 추가로 암, 특히 결장, 폐 또는 췌장암을 앓고 있는 환자의 치료를 위한, 및 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다. 게다가, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제조 방법을 포함한다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체를, 임의로는 약학적 용도의 항체 제형물에 유용한 버퍼 및/또는 보조제 (adjuvant) 와 함께 포함하는 약학적 조성물을 추가로 포함한다.
본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 내 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다. 한 구현예에서, 약학적 조성물은 제조 성형품 또는 키트에 포함될 수 있다.
본 발명의 상세한 설명
용어 "항체" 는 이에 제한되지 않지만, 전체 항체, 이중특이성 항체 및 항체 분절을 포함하는 다양한 형태의 항체 구조를 포함한다. 본 발명에 따른 항체는, 본 발명에 따른 특징적인 특성이 보유되는 한, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 나아가 유전자 조작 항체가 바람직하다.
"항체 분절" 은 전장 항체의 일부, 바람직하게는 그의 가변 도메인, 또는 적어도 그의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 분절의 예에는 항체 분절로부터 형성된 디아바디 (diabody), 단일-쇄 항체 분자, 및 다중특이성 항체가 포함된다. scFv 항체가, 예를 들어, 문헌 [Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88] 에 기술되어 있다. 또한, 항체 분절은, VH 도메인의 특성, 즉 VL 도메인과 함께 어셈블링 가능한 특성, 또는 TWEAK 에 결합하는 VL 도메인의 특성, 즉 VH 도메인과 함께 기능적 항원 결합 부위에 어셈블링 가능한 특성을 갖는 단일 쇄 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "단일클론성 항체" 또는 "단일클론성 항체 조성물" 은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자 제조물을 지칭한다.
용어 "인간화 항체" 란, 골격부 (framework) 및/또는 "상보성 결정 부위" (CDR) 가 모 면역글로불린의 것과 비교했을 때 상이한 종의 면역글로불린의 CDR 을 포함하도록 개질된 항체를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 햄스터 CDR 을 인간 항체의 골격부에 이식시켜 "인간화 항체" 를 제조한다. 예를 들어, 문헌 [Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; 및 Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270] 을 참조한다.
용어 "키메라 항체" 란, 통상적으로는 재조합 DNA 기법으로 제조되는, 마우스 유래의 가변 도메인, 즉 결합 부위, 및 적어도 상이한 공급원 또는 종에서 유래된 불변 부위의 일부를 포함하는 단일클론성 항체를 지칭한다. 마우스의 가변 영역 및 인간의 불변 영역을 포함하는 키메라 항체. 그러한 마우스/인간 키메라 항체는, 래트 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 DNA 단편 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 DNA 단편을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 본 발명에 포함되는 기타 형태의 20 개의 "키메라 항체" 는 그 부류 또는 하위부류가 원 항체의 것에서 개질되어 있거나 또는 변형되어 있는 것이다. 이러한 "키메라" 항체는 또한 "부류-전환 항체" 라고도 지칭된다. 키메라 항체 제조 방법에는, 당업계에 익히 공지되어 있는 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 트랜스펙션 (transfection) 기법이 포함된다. 예를 들어, 문헌 [25 Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 특허 제 5,202,238 호 및 제 5,204,244 호] 을 참조한다.
용어 "T 세포 에피토프 소실된 항체" 란, 인간 T 세포 에피토프 (MHC 부류 II 분자에 결합할 능력을 갖는 단백질 내의 펩티드 서열) 를 제거함으로써 면역원성을 제거 또는 감소시키도록 개질한 항체를 지칭한다. 이러한 방법에 의해, 펩티드의 아미노산 측쇄와 MHC 부류 II 결합 홈 (groove) 을 갖는 특이적 결합 포켓 간 상호작용이 동정된다. 동정된 면역원성 영역은 돌연변이되어 면역원성이 제거된다. 이러한 방법이 일반적으로 예를 들면 WO 98/52976 에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "가변 도메인" (경쇄의 가변 도메인 (VL), 중쇄의 가변 도메인 (VH)) 은, 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관련되는 각각의 경쇄 및 중쇄 도메인 한 쌍을 말한다. 가변의 경쇄 및 중쇄 도메인은 동일한 일반적인 구조를 가지며, 각 도메인은 서열이 광범위하게 보전되어 있으면서 3 개의 "고가변 영역" (또는 상보성 결정 부위, CDR) 에 의해 연결되는 4 개의 골격부 (FR) 를 포함한다. 골격부는 β-시트 입체형태를 취하고, CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각 쇄에서의 CDR은 그의 3 차원 구조로 골격부에 의해 유지되며, 다른 쇄에 있는 CDR 과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 특히 중요한 역할을 하므로 이는 본 발명의 추가적인 대상이다.
본원에서 사용되는 경우, 용어 "항체의 항원-결합부" 란, 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 항원-결합부는 "상보성 결정 부위" 또는 "CDR" 의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격부" 또는 "FR" 은, 본원에서 정의된 바와 같은 고가변부 잔기 외의 상기 가변 도메인 부위이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 N- 내지 C-말단으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3 는 항원 결합에 가장 많이 기여하고, 항체의 특성을 한정짓는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 의 표준 정의 및/또는 "고가변 루프" 유래의 잔기에 따라 결정된다.
용어 "CDR1H" 는 Kabat 에 따라 산출된 중쇄 가변 영역의 CDR1 영역이다. CDR2L, CDR3H, 등은 중쇄 (H) 또는 경쇄 (L) 로부터의 각각의 영역을 의미한다. 예를 들어, SEQ ID NO:6 의 CDR1H 을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체란, 이 항체가 그의 가변 중쇄에 중쇄 가변쇄 CDR1 영역으로서 상기 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, SEQ ID NO:6 의 CDR1H, SEQ ID NO:7 의 CDR2H, SEQ ID NO:8 의 CDR3H 을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체란, 항체가 그의 중쇄에 CDR1 의 서열로서, SED ID NO: 6 을, CDR2 의 서열로서, SEQ ID NO:7 을, 및 CDR3 의 서열로서, SEQ ID NO:8 을 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자" 는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 외가닥 또는 이중가닥일 수 있으나, 이중가닥 DNA 인 것이 바람직하다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "아미노산" 은, 알라닌 (3 자리 문자 코드: ala, 1 자리 문자 코드: A), 아르기닌 (arg, R), 아스파라긴 (asn, N), 아스파르트산 (asp, D), 시스테인 (cys, C), 글루타민 (gln, Q), 글루탐산 (glu, E), 글리신 (gly, G), 히스티딘 (his, H), 이소류신 (ile, I), 류신 (leu, L), 리신 (lys, K), 메티오닌 (met, M), 페닐알라닌 (phe, F), 프롤린 (pro, P), 세린 (ser, S), 트레오닌 (thr, T), 트립토판 (trp, W), 티로신 (tyr, Y), 및 발린 (val, V) 을 포함하는 천연 발생 카르복시 α-아미노산의 군을 의미한다.
핵산은 이것이 또 다른 핵산과 작용 관계에 처하게 되는 경우, "작동적으로 (operably) 연결"된다. 예를 들어, 예비-서열 또는 분비 리더 (secretory leader) 용 DNA 는 이것이 폴리펩티드의 분비에 관여하는 프레단백질 (preprotein) 로서 발현되는 경우, 상기 폴리펩티드를 위한 DNA 에 작동적으로 연결되거나; 프로모터 또는 증강자 (enhancer) 는 이것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 코딩 서열에 작동적으로 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는, 이것이 번역을 촉진시키도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로 "작동적으로 연결된" 이란, 연결되어 있는 DNA 서열들이 상호 선형 상에 있고, 분비 리더의 경우, 인접하면서도 리딩 프레임 내에 있음을 의미한다. 그러나, 증강자는 인접되어 있을 필요는 없다. 가까운 제한 부위에서의 결찰로써 연결이 이루어진다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 절차에 따라 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "세포", "세포주" 및 "세포 배양물" 이라는 표현들은 상호교환하여 사용할 수 있고, 이러한 모든 지명은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환주" 및 "형질전환된 세포" 에는, 는 원래의 주체 세포, 및 이전 (transfer) 의 수에 상관없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 계획적 또는 우연적인 돌연변이로 인해, 모든 자손은 DNA 함량에 있어서 정확하게 동일하지 않을 수 있음이 또한 자명하다. 원래 형질전환된 세포내에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
항체의 "Fc 부분" 은 항체의 항원으로의 결합에 직접적으로 관여하지 않으나, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. "항체의 Fc 부분" 은 당업자에게 익히 공지되어 있는 용어이고, 항체의 파파인 절단을 기초로 정의된다. 중쇄의 불변 부위 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 으로 나뉘어지고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들어, IgG 는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA 는 IgA1 및 IgA2 로 추가 나뉘어질 수 있다. 중쇄 불변 영역에 따라, 상이한 부류의 면역글로불린은 α, δ, ε, γ, 및 μ 로 각각 불리운다. 항체의 Fc 부분은 보체 활성화, C1q 결합 및 Fc 수용체 결합을 바탕으로 ADCC (항체-의존 세포-매개 세포독성) 및 CDC (보체-의존 세포독성) 에 직접 관여한다. 보체 활성화 (CDC) 는 보체 인자 C1q 의 대부분의 IgG 항체 하위부류의 Fc 부분과의 결합에 의해 개시된다. 보체계에 대한 항체의 영향은 특정 조건에 좌우되지만, C1q 의 결합은 Fc 부분 내 한정된 결합 부위에 의해 야기된다. 이러한 결합 부위는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Boakle, R.J. et al., Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J. et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R. et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E. et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M. et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A. et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP　0　307　434] 에 기술되어 있다. 이러한 결합 부위는 예를 들어 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, 및 P329 (Kabat 의 EU 지침에 따라 넘버링, 하기 참조) 으로 특징지어진다. 하위 부류 IgG1, IgG2, 및 IgG3 의 항체는 통상적으로 보체 활성화 및 C1q 및 C3 결합을 나타내는 반면에, IgG4 는 보체계를 활성화하지 않으며, C1q 및 C3 을 결합하지 않는다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게 하위부류 IgG1 의 인간 항체의 Fc 부분인 인간 기원의 Fc 부분을 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 불변 쇄가 인간 기원인 것을 특징으로 한다. 이러한 불변 쇄는 당업계에 익히 공지되어 있고, 예를 들어 Kabat (예를 들어, 문헌 [Johnson, G. 및 Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 참조) 에 의해 기재되어 있다. 예를 들어, 유용한 인간 중쇄 불변 영역은 SEQ ID NO:27 또는 28 의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 유용한 인간 경쇄 불변 영역은 SEQ ID NO:25 의 카파-경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 항체가 햄스터 기원의 것이고 Kabat (예를 들어, [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E.A. et al., 5th edition, DIANE Publishing (1992)] 참조) 에 따른 햄스터 항체의 항체 가변 서열 프레임을 포함하는 것이 추가 바람직하다.
본 발명은 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법을 포함하는데, 이 방법은 상기 환자에게 치료적 유효량의 본 발명에 따른 항체를 투여하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 암 치료용 약제 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 염증 질환의 치료, 바람직하게는 암, 특히 결장, 폐 또는 췌장암의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.
본 발명의 추가 구현예는 본 발명에 따른 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산 서열 및 상기 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열이 1 또는 2 개의 발현 벡터(들) 에 삽입되고, 상기 벡터(들)은 진핵 숙주 세포에 삽입되어, 인코딩된 항체가 발현되어 숙주 세포 또는 상청액으로부터 회수하는 것을 특징으로 하는, TWEAK 에 대한 항체의 제조 방법이다.
본 발명에 따른 항체는 재조합 수단으로 제조되는 것이 바람직하다. 이러한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이는 원핵 또는 진핵 세포내에서 단백질을 발현시키고 후속하여 항체 폴리펩티드를 단리하고 통상의 약학적으로 허용가능한 순도로 정제하는 것을 포함한다. 상기 단백질 발현을 위해서는, 경쇄 및 중쇄 또는 이의 분절을 인코딩하는 핵산을 표준 방법으로 발현 벡터에 삽입한다. 발현은, CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 효모, 또는 E. coli 세포와 같은 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 수행되며, 항체는 상기 세포 (상청액 또는 세포 분해 후) 에서 회수된다.
항체의 재조합체 제조는 당업계에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, [Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S. et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880] 의 종설에 기술되어 있다.
항체는 전 (whole) 세포, 세포 분해물, 또는 부분적으로 정제되거나 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 정제는 기타 세포 성분 또는 기타 오염물, 예를 들어 기타 세포성 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동, 및 기타 당업계에 익히 공지된 것을 포함하는 표준 기법을 통해 수행된다. 문헌 [Ausubel, F. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 을 참고한다.
NSO 세포 내 발현은 예를 들어 문헌 [Barnes, L.M. et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M. et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270] 에 기술되어 있다. 일과성 발현은 예를 들어, 문헌 [Durocher, Y. et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9] 에 기술되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 문헌 [Orlandi, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L. et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87] 에 기술되어 있다. 바람직한 일과성 발현 시스템 (HEK 293) 은 문헌 [Schlaeger, E.-J. 및 Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83] 및 [Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199] 에 기술되어 있다.
단일클론성 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로오스, 수산화인회석 크로마토그래피, 투석, 또는 친화 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 절차를 통해 배양 배지에서 적절하게 분리한다. 단일클론성 항체를 인코딩하는 DNA 및 RNA 는 통상의 절차를 이용하여 용이하게 단리 및 서열화한다. 하이브리도마 세포가 이러한 DNA 및 RNA 의 공급원으로서 역할을 할 수 있다. 일단 단리된다면, DNA 를 발현 벡터에 삽입할 수 있고, 그 다음, 면역글로불린 단백질을 달리 생성하지 않는 HEK 293 세포, CHO 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 상기를 트랜스펙션할 수 있어, 숙주 세포 내 재조합 단일클론성 항체를 합성할 수 있다.
항-TWEAK 항체의 아미노산 서열 변이체를 인코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법들로 제조된다. 이들 방법에는, 이에 제한되는 것은 아니나, (천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 천연원으로부터의 단리, 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 위치-특이적) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 미리 제조된 변이체 또는 인간화 항-TWEAK 항체의 비변이체 버젼의 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조가 포함된다.
본 발명에 따른 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 프로모터, 번역 개시부, 불변 영역, 3' 미번역부, 폴리아데닐화 및 전사 종료의 서열과 조합되어 발현 벡터 구축물을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 구축물은 단일 벡터로 조합, 숙주 세포로 공동-트랜스펙션, 연속 트랜스펙션 또는 개별 트랜스펙션된 다음, 융합되어, 상기 양 쇄를 발현하는 단일 숙주 세포를 형성할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 조성물, 예를 들어, 본 발명의 단일클론성 항체 또는 그의 항원-결합 부분 중 하나 또는 조합물을 함유하고 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형되는 약학적 조성물을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체" 에는, 생리학적으로 상용성인 임의의 그리고 모든 용매, 분산액 배지, 코팅제, 항박테리아제 및 항균제, 등장성 및 흡수/재흡수 지연제 등이 포함된다. 바람직하게는, 담체는 주사 또는 주입에 적합하다.
본 발명에 따른 조성물은 당업계에 공지된 각종 방법으로 투여될 수 있다. 당업자가 잘 알다시피, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 다양할 것이다.
약학적으로 허용가능한 담체에는 멸균 주사용액 또는 분산액의 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말이 포함된다. 약학적 활성 물질을 위한 상기 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 담체는 물 뿐 아니라, 예를 들어, 등장 완충 식염수일 수 있다.
선택되는 투여 경로와 관계없이, 적절한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 통상의 방법으로 약학적으로 허용가능한 투여 형태로 제형화된다.
본 발명의 약학적 조성물 내 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성을 나타내지 않게 하면서, 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해서 원하는 치료적 반응을 얻게 하는데 유효한 활성 성분의 양 (유효량) 을 수득하도록 다양할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 활용되는 본 발명의 특정 조성물, 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성도, 투여 경로, 투여 시간, 활용되는 특정 화합물의 배출률, 활용되는 특정 조성물과 조합되어 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 나이, 성별, 체중, 병태, 일반 건강 상태, 이전의 병력, 의학 분야에 익히 공지된 유사한 인자들을 포함하는 각종 약물동력학적 인자에 좌우될 것이다.
본 발명은 암, 특히 결장, 폐 또는 췌장암을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 질병을 앓고 있는 환자의 치료 방법도 포함한다.
본 발명은 유효량의 본 발명에 따른 항체를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법, 및 이러한 방법을 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 유효량의 본 발명에 따른 항체의, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께하는, 암, 특히 결장, 폐 또는 췌장암을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 약학적 제제 제조에 있어서의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명에 따른 항체의, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께하는 암, 특히 결장, 폐 또는 췌장암을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 약학적 제제 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
서열의 기술
Figure 112011076615258-pct00001
Figure 112011076615258-pct00002
Figure 112011076615258-pct00003
Figure 112011076615258-pct00004
Figure 112011076615258-pct00005
본 발명의 이해를 돕고자 하기의 실시예, 서열 목록 및 도면을 제공하였는데, 이들의 적용 범위는 첨부된 청구항에 기재되어 있다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않은 채 기술된 절차에서 변경을 가할 수 있다는 점은 자명하다.
도 1 Panc1 인간 췌장 암종 이종이식 성장에 대한 항-TWEAK 항체의 효과
도 2 ACHN 인간 콩팥 암종 이종이식 성장에 대한 항-TWEAK 항체의 효과
실시예 1
면역화 기술
인간/쥐과동물 TWEAK 로의 아르메니아 햄스터의 면역화
아르메니아 햄스터를, 50　㎍ 재조합 인간 가용성 TWEAK (아미노산 99-249) 으로, 제 0 일에, 프로인트 완전 보조제 (complete Freund's adjuvant) 와 함께, 제 28 일 및 제 56 일에 (양 일 모두에서는 프로인트 불완전 보조제와 함께) 복강내 주사로 면역화하고, 50　㎍ 재조합 마우스 가용성 TWEAK (아미노산 81-225) 으로 제 84 일에 불완전 프로인트 보조제와 함께 복강내 주사로 면역화하였다. 혈액을 제 108 일 및 제 91 일에 채취하여, 이로 혈청을 준비하고, 이를 ELISA (하기 참조) 로 역가 측정하는데 사용하였다. 가장 높은 역가를 갖는 동물을, 50　㎍ 의 재조합 마우스 가용성 TWEAK 으로 정맥 주사함으로써 제 112 일에 부스팅에 대해서 선별하고, 인간 및 마우스 TWEAK 와 결합하는 능력 (실시예 2), 인간 및 마우스 TWEAK-Fn14 상호작용을 중화하는 능력 (실시예 4 및 5), IL9 분비를 억제하는 능력 (실시예 6) 을 기준으로 항체를 선택하였다. 또한, 항체-TWEAK 복합체의 반감기를 조사하였다 (실시예 3). 항체의 항종양 효능은 Panc1 인간 췌장 암종 이종이식 및 ACHN 콩팥 암종 이종이식에서 시험하였다.
실시예 2
인간 및 마우스 TWEAK 와의 결합 (ELISA)
항-TWEAK 항체의 인간 및 마우스 TWEAK 와의 결합을 ELISA 로 측정하였다. 인간 또는 마우스 재조합 TWEAK 를, 384-웰 Nunc Maxisorp 플레이트에 1　㎍/ml, 25　㎕/웰로 0.5 M 카르보네이트 코팅 버퍼, pH 9.5 중 2-8℃ 에서 하룻밤 인큐베이션으로 고정하였다. 플레이트를 PBS/1% BSA 로 1 시간 동안 실온에서 블로킹한 후, 2 회의 세정 단계 (PBS 중 0.1% Tween 20) 를 거치고, 항-TWEAK 항체의 하이브리도마 상청액 또는 블로킹 버퍼 중 상이한 농도의 항-TWEAK 항체로 실온에서의 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 추가 4 회 세정 후, 항체를 실온에서 1 시간 동안 블로킹 버퍼 중 1: 5000 희석된 항-햄스터-HRP 항체로 검출하였다. 시그널을 또 다른 4 회의 세정 단계 후 10-30 분 동안 ABTS®(Roche Diagnostics GmbH) 를 첨가함으로써 발생시켰다. 흡광도를 405 nm 에서 판독했다.
실시예 3
Biacore 를 이용한 항체-TWEAK 복합체의 반감기 측정
시스템에 탑재된 Biacore 스트렙타비딘 코팅된 센서를 갖춘 Biacore 2000 기기를 사용하였다. 시스템 버퍼 HBS-ET (10 mM HEPES pH 7.4, 150　mM NaCl, 1mM EDTA, 0.05% Tween® 20) 를, 100 ㎕/min 의 유속으로 사용했다. 샘플 버퍼는 시스템 버퍼였다. 비오티닐화 (biotinylation) 인간 가용성 TWEAK 및 비오티닐화 쥐과동물 가용성 TWEAK 를 SA 센서 상 상이한 유동 세포 상에서 각각 150 RU 로 고정하였다. 유동 세포 FC1 을 공시험 기준 세포로서 사용했다. 각 항체를 2 분의 연합 시간 동안 100　㎕/min 로 100 nM 에서 분석 대상물로서의 시스템에 주입했다. 면역복합체의 해리를 5 분 동안 모니터링했다. 센서 표면을 10 초간 HBS-ET 로 세정하고, 10 mM 글리신 pH 2.25 로 2x2 분 주입을 이용하여 재생하였다. 이 절차는 25℃ 에서 수행했다. [240s-300s] 간격의 복합체 해리 상의 운동 속도 제한 단계를 구해 해리 속도 kd [1/s] (Biacore Evaluation Software 4.0) 를 산출하였다. 등식 t1/2 diss = ln(2) / (60 x kd) 에 따라, 면역복합체의 반감기 (분) 을 산출하였다. 그 결과를 표 5 및 6b 에 나타낸다.
Figure 112011076615258-pct00006
실시예 4
TWEAK-Fn14 상호작용의 중화 (인간)
인간 TWEAK/인간 Fn14 상호작용의 블로킹을 수용체 상호작용 ELISA 로 나타냈다. 96-웰 Maxisorp® 플레이트 (Nunc) 를, 실온에서 1.5 시간 동안 웰 당 PBS 중 100　㎕ 1　㎍/ml 인간 Fn14:Fc (인간 IgG1 의 Fc 부분에 융합된 인간 Fn14 (아미노산 1-75) 의 세포외 도메인) 으로 코팅하고, 진탕 하 실온에서 30 분 동안 PBS 중 5% FBS 용액으로 블로킹하였다. 그 동안에, 블로킹 용액 중 2.5　ng/ml 에서의 인간 Flag-태깅된 가용성 TWEAK (아미노산 106-249) 을, 진탕 하 실온에서 2 시간 동안 상이한 농도의 항-TWEAK 항체 또는 하이브리도마 상청액으로 인큐베이션하였다. Fn14-코팅된 플레이트를 1 회 세정 버퍼 (PBS 중 0.1% Tween®) 로 세정한 후, 100　㎕ 의 TWEAK-항체 용액을 각 웰에 옮기고 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후 세정 버퍼로 4 회 세정하였다. 웰을 블로킹 버퍼 중 1:5000 희석된 100　㎕ 의 항-FLAG-HRP 검출 항체로 충전하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 4 회의 추가 세정 단계 후, 약 10 분 동안 100　㎕ 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액을 첨가시켜 시그널을 발생시켰다. 100　㎕ 의 1　N HCl 을 첨가함으로써 반응을 중지시키고, 450 nm (기준 파장 620 nm) 에서 흡광도를 측정했다. 그 결과를 표 6 에 나타낸다.
실시예 5
TWEAK-Fn14 상호작용의 중화 (마우스)
마우스 TWEAK/마우스 Fn14 상호작용 ELISA 를, 인간 단백질에 대해 기술한 바와 유사한 원리를 따랐으나, 마우스 가용성 TWEAK 는 태깅되지 않았으므로 상이한 검출 시스템을 이용하였다. 요약하면, Maxisorp 플레이트를, 인간 Fn14:Fc 에 대해 상기에서 기재된 바와 같이, 마우스 Fn14:Fc (인간 IgG1 의 Fc 부분에 융합된 마우스 Fn14 (아미노산 1-75) 의 세포외 도메인) 로 코팅한 후, 블로킹 및 세정했다. 4　ng/ml 로 마우스 가용성 TWEAK 를, 블로킹 버퍼 중 하이브리도마 상청액 또는 항-TWEAK-항체로 예비-인큐베이션하고, 100　㎕ 의 혼합물을 Fn14-코팅된 플레이트의 웰 마다 첨가했다. 1 시간의 실온에서의 인큐베이션 및 4 회의 세정 후, 블로킹 버퍼 중 125 ng/ml 의 비오티닐화 항-마우스 TWEAK 항체를 1 시간 동안 실온에서 첨가한 다음 추가 4 회의 세정 단계를 거쳤다. TWEAK 항체를 블로킹 버퍼 중 1:5000 희석된 스트렙타비딘-HRP 로 30 분 동안 실온에서 인큐베이션하여 검출하였다. 시그널이 발생하고 흡광도를 상기에 기술한 바와 같이 측정했다. 표 6 에 결과를 나타낸다.
실시예 6
IL-8 분비 ELISA
세포 시스템 내 항-TWEAK 항체에 의한 TWEAK 활성의 블로킹을 A376 흑색종 세포를 이용한 IL-8 분비 검정으로 나타냈다. 10,000 A375 세포 (ATCC #CRL1619) 를, 100　㎕ 의 성장 배지 (4.5　g/L 글루코오스, 피루베이트 및 GlutaMAX™/10% FBS 함유 DMEM) 내 96-웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 시딩하고, 48 시간 동안 37℃/5% CO2 에서 인큐베이션하였다. 인간 재조합 가용성 TWEAK 를, 실온에서 30 분 동안 성장 배지 중 상이한 농도의 항-TWEAK 항체로 300　ng/ml 로 예비-인큐베이션하였다. 이어서, 50　㎕ 의 혼합물을 세포 플레이트의 각 웰에 첨가한 다음, 추가 48 시간 인큐베이션하여 IL-8 분비를 허용하였다. 20　㎕ 의 세포 상청액을, 5 분 동안 플레이트를 200　x　g 로 원심분리한 후 제거하고, "CXCL8 Quantikine ELISA" 키트 (R&D Systems) 로부터 980　㎕ 의 RD5P Calibrator Diluent 와 혼합하였다. IL-8 을 제조자의 지침에 따라 ELISA 로 검출하였다. 그 결과를 표 6 에 나타낸다.
Figure 112011076615258-pct00007
Figure 112011076615258-pct00008
Figure 112011076615258-pct00009

실시예 7
Panc1 인간 췌장 암종 이종이식 성장에 대항하는 항 TWEAK 항체의 항종양 효능
연구 설계: Panc1 세포 (1 x 107 세포/마우스) 를 matrigel (1:1) 로 연구 제 0 일에 SCID-베이지 마우스에 sc 이식하였다. 이식 후 제 15 일에 처리를 시작하였다. 연구는 제 56 일에 마쳤다.
그룹
· 비히클 ip, 2x/wk, n=10
· 20 mg/kg TW202, ip, 2x/wk, n=10
· 20 mg/kg TW205, ip, 2x/wk, n=10
· 20 mg/kg TW212, ip, 2x/wk, n=10
각 종양의 무게를 연구 마지막에 재었다. 그 결과를 표 7 에 나타낸다.
Figure 112011076615258-pct00010
종양 부피 대 종양 세포 이식 후 경과일을 도 1 에 나타낸다.
실시예 8
ACHN 콩팥 암종 이종이식 성장에 대한 항-TWEAK 항체의 효과
연구 설계: 연구 제 0 일에 비흉선 누드 마우스에 matrigel (1:1) 로 sc 이식된 ACHN 세포 (1 x 107 세포/마우스). 이식 후 제 10 일 때에 처리를 시작하였다. 제 40 일에 연구를 마쳤다.
그룹:
· 비히클 ip, 2x/wk, n=10
· TW202 (20mg/kg) ip, 2x/wk, n=10
· TW205 (20 mg/kg), ip, 2x/wk, n=10
· TW212 (20mg/kg) ip, 2x/wk, n=10
종양의 평균 부피를 연구 마지막에 재었다. 결과를 표 8 에 나타낸다.
Figure 112011076615258-pct00011
종양 부피 대 종양 세포 이식 후 경과일을 도 2 에 나타낸다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

  1. SEQ ID NO:22 의 CDR1H, SEQ ID NO:74 의 CDR2H, SEQ ID NO:24 의 CDR3H 및 SEQ ID NO:18 의 CDR1L, SEQ ID NO:19 의 CDR2L, SEQ ID NO:20 의 CDR3L 을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 TWEAK 에 결합하는 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:58 의 가변 경쇄 서열 및 SEQ ID NO:68 의 가변 중쇄 서열의 조합을 특징으로 하는 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 TWEAK 에 결합하는 항체를 인코딩하는 핵산.
  5. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 TWEAK 에 결합하는 항체 발현을 위한, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 TWEAK 에 결합하는 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  6. 제 5 항에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 재조합 항체의 제조 방법으로서, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 TWEAK 에 결합하는 항체를 인코딩하는 핵산을 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키고, 이 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 상기 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
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