TW202412838A - 包含結合γ-δ T細胞受體之抗體之組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於包含能夠結合人類Vγ9Vδ2 T細胞受體之抗體之醫藥組合物。本發明進一步係關於本發明之醫藥組合物用於醫學治療之用途。
Description
本發明係關於包含能夠結合人類Vγ9Vδ2 T細胞受體之Vδ2鏈之抗體之新穎醫藥組合物。本發明進一步係關於本發明之該等醫藥組合物用於醫學治療之用途。
γ-δ (γδ) T細胞係表現由γ鏈及δ鏈構成之T細胞受體(TCR)之T細胞。循環中之大部分γδ T細胞表現包含Vγ9及Vδ2區域之TCR。Vγ9Vδ2 T細胞可對對眾多病原體及腫瘤細胞具有反應。應理解,此廣泛反應性係由能夠以TCR依賴性方式特異性活化此T細胞子組之磷酸抗原所賦予。Vγ9Vδ2 T細胞之廣泛抗微生物及抗腫瘤反應性表明,其直接參與癌症及感染之免疫控制。
可活化Vγ9Vδ2 T細胞之藥劑可用於治療感染或癌症,此乃因該等藥劑可促進針對病原體或感染細胞或癌細胞之Vγ9Vδ2 T細胞反應性。WO 2015/156673闡述結合Vγ9Vδ2 TCR且能夠活化Vγ9Vδ2 T細胞之抗體。WO 2020/060405闡述結合Vγ9Vδ2 T細胞及腫瘤細胞靶且由此可將Vγ9Vδ2 T細胞募集至腫瘤並由此刺激治療效應之雙特異性抗體。
抗體在宿主細胞中之重組產生通常產生異質產物,包含具有不同類型及程度之多肽鏈轉譯後修飾之不同抗體形式。該異質性為用於醫學應用之抗體產物所不期望,此乃因轉譯後修飾可改變抗體之功能性質,例如關於靶抗原親和力、藥物動力學性質、產物穩定性、聚集等。
本發明提供包含具有改良Vγ9Vδ2 TCR結合抗體序列之抗體之醫藥組合物,該等抗體在產生於宿主細胞中時會產生較均質產物,但保留關於靶結合及靶細胞功能效應之良好功能性質以及良好結構性質(例如穩定性)。
如WO 2022/122973中所闡述,WO 2015/156673及WO 2020/060405中所闡述之5C8 Vγ9Vδ2 TCR結合抗體在抗體中預計不會發生此轉譯後修飾之位點處發生硫酸化。硫酸化部分地發生於各種宿主細胞中,從而產生異質抗體產物。令人吃驚地,發生硫酸化之酪胺酸殘基(Y105)可突變成***酸或絲胺酸而不影響抗體之抗原結合性質,即使胺基酸位於CDR3區域中。經由突變去除硫酸化位點可產生較均質抗體產物。
本發明提供包含該等突變抗體之新穎醫藥組合物。
在一些實施例中,本發明提供包含以下各項之醫藥組合物:(a)抗體,其包含能夠結合人類EGFR且包含SEQ ID NO:5之CDR1序列、SEQ ID NO:6之CDR2序列及SEQ ID NO:7之CDR3序列之第一抗原結合區;(b) 5-20 mM組胺酸,其中組合物具有介於5.5與6.5之間之pH;或5-20 mM乙酸鈉,其中組合物具有介於5.0與6.0之間之pH;(c) 250-350 mM蔗糖;(d) 0.01% - 0.05% (w/v)聚山梨醇酯80;及(e) 0-20 mM甲硫胺酸。
在一些實施例中,組合物包含5-20 mM組胺酸,其中組合物具有介於5.5與6.5之間之pH。在一些實施例中,組合物包含10 mM組胺酸。在一些實施例中,組合物包含介於250 mM與300 mM之間之蔗糖。在一些實施例中,組合物包含280 mM蔗糖。在一些實施例中,組合物包含介於0.01%與0.03%之間之聚山梨醇酯80。在一些實施例中,組合物包含0.02%聚山梨醇酯80。在一些實施例中,組合物包含介於0.5 mM與20 mM之間之甲硫胺酸。在一些實施例中,組合物包含1 mM甲硫胺酸。在一些實施例中,組合物包含10 mM組胺酸、280 mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酯80、pH 6.0及1 mM甲硫胺酸。
在一些實施例中,組合物包含介於0.2 mg/mL與20 mg/mL之間之抗體。在一些實施例中,組合物包含1或10 mg/mL抗體。
在一些實施例中,第一抗原結合區係單域抗體。在一些實施例中,第一抗原結合區係單域抗體且其中第一抗原結合區較佳地包含以下序列或由其組成:SEQ ID NO:8中所示之序列或與SEQ ID NO:8中所示之序列具有至少90% (例如至少92%、例如至少94%、例如至少96%、例如至少98%)序列一致性之序列。
在一些實施例中,抗體進一步包含第二抗原結合區且其中第二抗原結合區較佳係單域抗體。在一些實施例中,抗體係雙特異性抗體且包含能夠結合人類Vδ2之第二抗原結合區。
在一些實施例中,第二抗原結合區包含SEQ ID NO:1之CDR1序列、SEQ ID NO:2之CDR2序列及SEQ ID NO:3之CDR3序列。在一些實施例中,第二抗原結合區包含SEQ ID NO:4或與SEQ ID NO:4具有至少90% (例如至少92%、例如至少94%、例如至少96%、例如至少98%)序列一致性之序列或由其組成。
在一些實施例中,SEQ ID NO:1之X1係S且其中SEQ ID NO:3之X2係F或S。在一些實施例中,CDR1序列包含SEQ ID NO:21,CDR2序列包含SEQ ID NO:2,且CDR3序列包含SEQ ID NO:19。在一些實施例中,第二抗原結合區包含SEQ ID NO:23或由其組成。在一些實施例中,CDR1序列包含SEQ ID NO:21,CDR2序列包含SEQ ID NO:2,且CDR3序列包含SEQ ID NO:20。在一些實施例中,第二抗原結合區包含SEQ ID NO:24或由其組成。
在一些實施例中,本發明揭示一種醫藥組合物,其包含:(a) 1 mg/mL或10 mg/mL抗體,其包含能夠結合人類EGFR且包含SEQ ID NO:5中所示之CDR1序列、SEQ ID NO:6中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:7中所示之CDR3序列之第一抗原結合區;(b) 10 mM組胺酸;(c) 280 mM蔗糖;(d) 0.02%聚山梨醇酯80;(e) pH 6.0;及(f) 1 mM甲硫胺酸。
在一些實施例中,第一抗原結合區係單域抗體且其中第一抗原結合區較佳地包含SEQ ID NO:8或由其組成。
在一些實施例中,抗體係雙特異性抗體且包含能夠結合人類Vδ2之第二抗原結合區。在一些實施例中,第二抗原結合區包含SEQ ID NO:4或由其組成。在一些實施例中,第二抗原結合區包含SEQ ID NO:23或由其組成。在一些實施例中,第二抗原結合區包含SEQ ID NO:24或由其組成。
在一些實施例中,本發明提供一種醫藥組合物,其包含:(a)抗體,其包含能夠結合人類Vδ2且包含SEQ ID NO:1中所示之CDR1序列、SEQ ID NO:2中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:3中所示之CDR3序列之第一抗原結合區;(b) 5-20 mM組胺酸,其中組合物具有介於5.5與6.5之間之pH;或5-20 mM乙酸鈉,其中組合物具有介於5.0與6.0之間之pH;(c) 250-350 mM蔗糖;(d) 0.01% - 0.05% (w/v)聚山梨醇酯80;及(e) 0-20 mM甲硫胺酸。
在一些實施例中,組合物包含5-20 mM組胺酸,其中組合物具有介於5.5與6.5之間之pH。在一些實施例中,組合物包含10 mM組胺酸。在一些實施例中,組合物包含介於250 mM與300 mM之間之蔗糖。在一些實施例中,組合物包含280 mM蔗糖。在一些實施例中,組合物包含介於0.01%與0.03%之間之聚山梨醇酯80。在一些實施例中,組合物包含0.02%聚山梨醇酯80。在一些實施例中,組合物包含介於0.5 mM與20 mM之間之甲硫胺酸。在一些實施例中,組合物包含1 mM甲硫胺酸。在一些實施例中,組合物包含10 mM組胺酸、280 mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酯80、pH 6.0及1 mM甲硫胺酸。在一些實施例中,組合物包含介於0.2 mg/mL與20 mg/mL之間之該抗體。在一些實施例中,組合物包含1或10 mg/mL抗體。
在一些實施例中,第一抗原結合區包含SEQ ID NO:4或與SEQ ID NO:4中所示之序列具有至少90% (例如至少92%、例如至少94%、例如至少96%、例如至少98%)序列一致性之序列或由其組成。
在一些實施例中,SEQ ID NO:1之X1係S且其中SEQ ID NO:3之X2係F或S。在一些實施例中,CDR1序列包含SEQ ID NO:21,CDR2序列包含SEQ ID NO:2,且CDR3序列包含SEQ ID NO:19。在一些實施例中,第一抗原結合區包含SEQ ID NO:23或由其組成。在一些實施例中,CDR1序列包含SEQ ID NO:21,CDR2序列包含SEQ ID NO:2,且CDR3序列包含SEQ ID NO:20。在一些實施例中,第一抗原結合區包含SEQ ID NO:24或由其組成。
在一些實施例中,抗體進一步包含能夠結合人類EGFR且包含SEQ ID NO:5中所示之CDR1序列、SEQ ID NO:6中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:7中所示之CDR3序列之第二抗原結合區。在一些實施例中,第二抗原結合區係單域抗體且其中第一抗原結合區較佳地包含SEQ ID NO:8或與SEQ ID NO:8具有至少90% (例如至少92%、例如至少94%、例如至少96%、例如至少98%)序列一致性之序列或由其組成。
在一些實施例中,本發明提供一種醫藥組合物,其包含:(a) 1 mg/mL或10 mg/mL抗體,其包含能夠結合人類Vδ2且包含SEQ ID NO:1中所示之CDR1序列、SEQ ID NO:2中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:3中所示之CDR3序列之第一抗原結合區;(b) 10 mM組胺酸;(c) 280 mM蔗糖;(d) 0.02%聚山梨醇酯80;(e) pH 6.0;及(f) 1 mM甲硫胺酸。
在一些實施例中,第一抗原結合區係單域抗體且其中第一抗原結合區較佳地包含SEQ ID NO:4或由其組成。在一些實施例中,SEQ ID NO:1之X1係S且其中SEQ ID NO:3之X2係F或S。在一些實施例中,CDR1序列包含SEQ ID NO:21,CDR2序列包含SEQ ID NO:2,且CDR3序列包含SEQ ID NO:19。在一些實施例中,第一抗原結合區包含SEQ ID NO:23或由其組成。在一些實施例中,CDR1序列包含SEQ ID NO:21,CDR2序列包含SEQ ID NO:2,且CDR3序列包含SEQ ID NO:20。在一些實施例中,第一抗原結合區包含SEQ ID NO:24或由其組成。
在一些實施例中,抗體係雙特異性抗體且包含能夠結合人類EGFR之第二抗原結合區。在一些實施例中,第二抗原結合區包含SEQ ID NO:8或由其組成。
在一些實施例中,抗體進一步包含Fc區,其中Fc區較佳係包含兩個Fc多肽之異二聚體,其中第一抗原結合區融合至第一Fc多肽且第二抗原結合區融合至第二Fc多肽,且其中第一及第二Fc多肽包含較形成同二聚體偏好於形成異二聚體之不對稱胺基酸突變,其中較佳地Fc多肽之CH3區域包含該等不對稱胺基酸突變,且其中較佳地第一Fc多肽包含T366W取代且第二Fc多肽包含T366S、L368A及Y407V取代,或反之亦然,其中胺基酸位置根據EU編號系統對應於人類IgG1。
在一些實施例中,第一及第二Fc多肽在位置234及/或235處包含突變,較佳地第一及第二Fc多肽包含L234F及L235E取代,其中胺基酸位置根據EU編號系統對應於人類IgG1。
在一些實施例中,第一Fc多肽包含SEQ ID NO:11中所示之序列且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:12中所示之序列,或第一Fc多肽包含SEQ ID NO:12中所示之序列且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:11中所示之序列。
在一些實施例中,抗體包含SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17中所示之序列或由其組成或包含SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18中所示之序列或由其組成。
在一些實施例中,本發明提供治療受試者之癌症之方法,該方法包含向受試者投與本文所闡述之醫藥組合物。
在一些實施例中,本發明提供用作藥劑、較佳地用於治療癌症之醫藥組合物。
本發明之其他態樣及實施例闡述於下文中。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2022年6月15日提出申請之歐洲申請案第22179260號之權益,該申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用方式併入本文中。
電子序列表之參考
電子序列表(LVAT_025_01WO_SeqList_ST26.xml;大小:35,054個位元組;及創建日期:2023年6月12日)之內容以全文引用方式併入本文中。
定義
本文所用之術語「人類Vδ2」係指Vγ9Vδ2-T細胞受體(TCR)之重排δ2鏈。UniProtKB - A0JD36 (A0JD36_HUMAN)給出可變Vδ2序列之實例。Vδ2係Vγ9Vδ2-TCR之δ鏈之一部分。能夠結合至人類Vδ2之抗體可結合完全位於可變區內之表位,或結合位於恆定區內之表位,或結合係δ鏈之可變及恆定區之殘基之組合的表位。
本文所用之術語「人類Vγ9」係指Vγ9Vδ2-T細胞受體(TCR)之重排y9鏈。UniProtKB - Q99603_HUMAN給出可變TRGV9序列之實例。
本文所用之術語「人類Vγ9Vδ2-T細胞受體」係指發現於人類γδ T細胞上之Vγ9Vδ2-T細胞受體(TCR)。
本文所用之術語「EGFR」係指人類EGFR蛋白(UniProtKB - P00533 (EGFR_HUMAN))。
術語「抗體」意欲係指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子之片段或其任一者之衍生物,其能夠在典型生理條件下特異性結合至抗原,且半衰期之時間段極長,例如至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約一小時、至少約兩小時、至少約四小時、至少約8小時、至少約12小時、約24小時或更長、約48小時或更長、約3、4、5、6、7或更多天等或任何其他相關之功能定義時段(例如足以誘導、促進、增強及/或調節與抗體抗原結合有關之生理反應之時間及/或足以使抗體募集效應活性之時間)。與抗原相互作用之抗原結合區(或抗原結合域)可包含免疫球蛋白分子之重鏈及輕鏈之可變區,或可為單域抗原結合區(例如僅重鏈可變區)。抗體之恆定區(若存在)可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合,該等宿主組織或因子包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞及T細胞)及補體系統之組分(例如C1q,其係補體活化之經典路徑中之第一組分)。
免疫球蛋白之Fc區定義為抗體中通常在使用木瓜酶消解抗體之後生成之片段,其包括免疫球蛋白之兩個CH2-CH3區域及連結區(例如鉸鏈區)。抗體重鏈之恆定域定義抗體同型,例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE。Fc區介導抗體與稱為Fc受體之細胞表面受體及補體系統之蛋白質之效應功能。
本文所用之術語「鉸鏈區」意欲係指免疫球蛋白重鏈之鉸鏈區。因此,舉例而言,人類IgG1抗體之鉸鏈區根據EU編號對應於胺基酸216-230。
本文所用之術語「CH2區域」或「CH2域」意欲係指免疫球蛋白重鏈之CH2區域。因此,舉例而言,人類IgG1抗體之CH2區域根據EU編號對應於胺基酸231-340。然而,CH2區域亦可為如本文所闡述之任一其他亞型。
本文所用之術語「CH3區域」或「CH3域」意欲係指免疫球蛋白重鏈之CH3區域。因此,舉例而言,人類IgG1抗體之CH3區域根據EU編號對應於胺基酸341-447。然而,CH3區域亦可為如本文所闡述之任一其他亞型。
本發明中對Fc區/Fc域中之胺基酸位置之提及係根據EU編號(Edelman等人,Proc Natl Acad Sci U S A. 1969年5月;63(1):78-85;Kabat等人,Sequences of proteins of immunological interest.第5版- 1991 NIH公開案第91-3242號)。
如上文所指示,除非另外陳述或與上下文明顯矛盾,否則本文所用之術語抗體包括保留特異性結合至抗原之能力之抗體片段。已證實,抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來實施。涵蓋於術語「抗體」內之結合片段之實例包括(i) Fab’或Fab片段,亦即由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段或如WO2007059782中所闡述之單價抗體;(ii) F(ab')2片段,亦即包含在鉸鏈區處由二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段;(iii) Fd片段,其基本上由VH及CH1域組成;及(iv) Fv片段,其基本上由抗體單臂之VL及VH域組成。此外,儘管Fv片段之兩個域VL及VH係由單獨基因編碼,但其可使用重組方法藉由合成連接體來接合,使得其能作為單一蛋白質鏈來製備,其中VL及VH區域配對形成單價分子(稱為單鏈抗體或單鏈Fv (scFv));例如參見Bird等人,Science 242, 423-426 (1988)及Huston等人,PNAS USA 85, 5879-5883 (1988))。除非上下文另外指示,否則該等單鏈抗體涵蓋於術語抗體內。儘管該等片段通常包括於抗體之含義內,但其共同地及各自獨立地係本發明之獨特特徵,從而展現不同生物性質及用途。除非另外指定,否則術語抗體亦包括多株抗體、單株抗體(mAb)、嵌合抗體及人類化抗體以及藉由任何已知技術(例如酶促裂解、肽合成及重組技術)提供之抗體片段。
在本發明抗體之一些實施例中,第一抗原結合區或第二抗原結合區或二者係單域抗體。單域抗體為熟習此項技術者所熟知,例如參見Hamers-Casterman等人,(1993) Nature 363:446;Roovers等人,(2007) Curr Opin Mol Ther 9:327及Krah等人,(2016) Immunopharmacol Immunotoxicol 38:21。單域抗體包含單一CDR1、單一CDR2及單一CDR3。單域抗體之實例係純重鏈抗體之可變片段、天然不包含輕鏈之抗體、衍生自習用抗體之單域抗體及經改造抗體。單域抗體可源自任何物種,包括小鼠、人類、駱駝、美洲駝、鯊魚、山羊、兔及牛。舉例而言,單域抗體可源自在駱駝科物種中、例如在駱駝、單峰駱駝、美洲駝、羊駝及原駝中產生之抗體。如同全抗體,單域抗體能夠選擇性結合至特定抗原。單域抗體可僅含有免疫球蛋白鏈之可變域,亦即CDR1、CDR2及CDR3以及框架區。該等抗體亦稱為Nanobody®或VHH。
本文所用之術語「免疫球蛋白」意欲係指一類由兩對多肽鏈(一對輕(L)鏈及一對重(H)鏈)組成之結構相關之醣蛋白,所有4條鏈皆可由二硫鍵互連。本文所用之術語「免疫球蛋白重鏈」、「免疫球蛋白之重鏈」或「重鏈」意欲係指免疫球蛋白之一條鏈。重鏈通常包含重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區(在本文中縮寫為CH,其定義免疫球蛋白之同型)。重鏈恆定區通常包含三個域:CH1、CH2及CH3。重鏈恆定區進一步包含鉸鏈區。在免疫球蛋白(例如IgG)之結構內,兩條重鏈經由鉸鏈區中之二硫鍵互連。與重鏈相同,每一輕鏈通常包含若干區域,亦即輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。另外,VH及VL區域可再分成超變性區域(或序列可具有超變性及/或形成結構界定環之超變區,亦稱為互補決定區(CDR))及較保守之區域(稱為框架區(FR)),二者間雜排列。每一VH及VL通常由三個CDR及四個FR構成,其自胺基端至羧基端按下列順序佈置:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可藉由使用各種方法來測定CDR序列,例如由Chothia及Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901或Kabat等人,(1991) Sequence of protein of immunological interest,第五版. NIH公開案提供之方法。可在www.abysis.org (UCL)上比較CDR確定及胺基酸編號之各種方法。
本文所用之術語「同型」係指免疫球蛋白(子)種類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)或其任何異型,例如由重鏈恆定區基因編碼之IgG1m(za)及IgG1m(f)。每一重鏈同型可與卡帕(κ)或拉姆達(λ)輕鏈進行組合。本發明抗體可擁有任何同型。
術語「親代抗體」應理解為與本發明抗體相同之抗體,但其中親代抗體不具有指定突變中之一或多者。本發明之「變體」或「抗體變體」或「親代抗體之變體」係與「親代抗體」相比包含一或多個突變之抗體分子。胺基酸取代可將天然胺基酸交換為另一天然胺基酸或非天然胺基酸衍生物。胺基酸取代可為保守或非保守的。在本發明之上下文中,保守取代可根據下列三個表中之一或多者中所展示之胺基酸種類內之取代來定義:
保守取代之胺基酸殘基種類
替代保守胺基酸殘基取代種類
胺基酸殘基之替代物理及功能分類
酸性殘基 | Asp (D)及Glu (E) |
鹼性殘基 | Lys (K)、Arg (R)及His (H) |
親水性不帶電殘基 | Ser (S)、Thr (T)、Asn (N)及Gln (Q) |
脂肪族不帶電殘基 | Gly (G)、Ala (A)、Val (V)、Leu (L)及Ile (I) |
非極性不帶電殘基 | Cys (C)、Met (M)及Pro (P) |
芳香族殘基 | Phe (F)、Tyr (Y)及Trp (W) |
1 | A | S | T |
2 | D | E | |
3 | N | Q | |
4 | R | K | |
5 | I | L | M |
6 | F | Y | W |
含有醇基之殘基 | S及T |
脂肪族殘基 | I、L、V及M |
環烯基相關殘基 | F、H、W及Y |
疏水性殘基 | A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W及Y |
帶負電殘基 | D及E |
極性殘基 | C、D、E、H、K、N、Q、R、S及T |
帶正電殘基 | H、K及R |
小殘基 | A、C、D、G、N、P、S、T及V |
極小殘基 | A、G及S |
參與轉角形成之殘基 | A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P及T |
撓性殘基 | Q、T、K、S、G、N、D、E及R |
在本發明之上下文中,變體中之取代指示為:原始胺基酸-位置-取代胺基酸。使用三字母代碼或單字母代碼(包括代碼Xaa及X)來指示胺基酸殘基。因此,記法「T366W」意指,變體在對應於親代抗體位置366中之胺基酸之變體胺基酸位置中使用色胺酸取代蘇胺酸。
另外,術語「取代」涵蓋取代成其他19種天然胺基酸中之任一者,或取代成其他胺基酸(例如非天然胺基酸)。舉例而言,位置366中胺基酸T之取代包括下列取代中之每一者:366A、366C、366D、366G、366H、366F、366I、366K、366L、366M、366N、366P、366Q、366R、366S、366E、366V、366W及366Y。
本文所用之術語「全長抗體」係指含有所有對應於通常發現於該同型之野生型抗體中之彼等域之重鏈及輕鏈恆定及可變域的抗體。
術語「嵌合抗體」係指可變區衍生自非人類物種(例如衍生自齧齒類動物)且恆定區衍生自不同物種(例如人類)之抗體。嵌合抗體可藉由基因改造生成。研發用於治療應用之嵌合單株抗體以減小抗體免疫原性。
術語「人類化抗體」係指經基因改造之非人類抗體,其含有人類抗體恆定域及經修飾以含有與人類可變域之高度序列同源性之非人類可變域。此可藉由將6個一起形成抗原結合位點之非人類抗體互補決定區(CDR)接枝於同源人類受體框架區(FR)上來達成。為完全重構親代抗體之結合親和力及特異性,可能需要將來自親代抗體(亦即非人類抗體)之框架殘基取代成人類框架區(回復突變)。結構同源性建模可有助於鑑別框架區中對於抗體之結合性質較為重要之胺基酸殘基。因此,人類化抗體可包含非人類CDR序列(主要係視情況包含非人類胺基酸序列之一或多個胺基酸回復突變之人類框架區)及視情況全人類恆定區。視情況,可引入未必係回復突變之其他胺基酸修飾以獲得具有較佳特性(例如親和力及生物化學性質)之人類化抗體。對非人類治療抗體實施人類化以最小化其在人類中之免疫原性,而該等人類化抗體同時維持非人類源抗體之特異性及結合親和力。
術語「多特異性抗體」係指對至少兩個不同(例如至少三個)之通常非重疊表位具有特異性之抗體。該等表位可位於相同或不同靶抗原上。若表位位於不同靶上,則該等靶可位於相同細胞或不同細胞或細胞類型上。在一些實施例中,多特異性抗體可包含一或多個單域抗體。
術語「雙特異性抗體」係指對兩個不同之通常非重疊表位具有特異性之抗體。該等表位可位於相同或不同靶上。若表位位於不同靶上,則該等靶可位於相同細胞或不同細胞或細胞類型上。在一些實施例中,雙特異性抗體可包含一或兩個單域抗體。
不同種類之多特異性(例如雙特異性)抗體之實例包括(但不限於) (i) IgG樣分子,其具有互補CH3域以促進異源二聚合;(ii)重組IgG樣雙重靶向分子,其中分子之兩側各自含有至少兩種不同抗體之Fab片段或Fab片段部分;(iii) IgG融合分子,其中全長IgG抗體融合至額外Fab片段或Fab片段部分;(iv) Fc融合分子,其中單鏈Fv分子或穩定二價抗體融合至重鏈恆定域、Fc區或其部分;(v) Fab融合分子,其中不同Fab-片段融合至一起,融合至重鏈恆定域、Fc區或其部分;及(vi) ScFv-與二價抗體基及重鏈抗體(例如域抗體Nanobodies®),其中不同單鏈Fv分子或不同二價抗體或不同重鏈抗體(例如域抗體Nanobodies®)彼此融合或融合至與重鏈恆定域、Fc區或其部分融合之另一蛋白質或載體分子。
具有互補CH3域分子之IgG樣分子之實例包括(但不限於) Triomab® (Trion Pharma/Fresenius Biotech)、隆凸與孔洞(Knobs-into-Holes) (Genentech)、CrossMAbs (Roche)及靜電匹配體(Amgen, Chugai, Oncomed)、LUZ-Y (Genentech, Wranik等人,J. Biol. Chem. 2012, 287(52):43331-9, doi:10.1074/jbc.M112.397869. Epub 2012 Nov 1)、DIG體及PIG體(Pharmabcine, WO2010134666, WO2014081202)、鏈交換改造域體(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonics (Merus, WO2013157953)、FcΔAdp (Regeneron)、雙特異性IgG1及IgG2 (Pfizer/Rinat)、Azymetric架構(Zymeworks/Merck)、mAb-Fv (Xencor)、二價雙特異性抗體(Roche, WO2009080254)及DuoBody®分子(Genmab)。
重組IgG樣雙重靶向分子之實例包括(但不限於)雙重靶向(DT)-Ig (GSK/Domantis, WO2009058383)、二合一抗體(Genentech, Bostrom等人,2009. Science 323, 1610-1614)、交聯Mab (Karmanos Cancer Center)、mAb2 (F-Star)、ZybodiesTM (Zyngenia, LaFleur等人,MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):208-18)、使用公用輕鏈之方式κλBodies (NovImmune, WO2012023053)及CovX-body® (CovX/Pfizer, Doppalapudi, V.R.等人,2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17,501-506)。
IgG融合分子之實例包括(但不限於)雙重可變域(DVD)-Ig (Abbott)、雙重域雙頭抗體(Unilever; Sanofi Aventis)、IgG樣雙特異性分子(ImClone/Eli Lilly, Lewis等人,Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8)、Ts2Ab (MedImmune/AZ, Dimasi等人,J Mol Biol. 2009 Oct 30;393(3):672-92)及BsAb (Zymogenetics, WO2010111625)、HERCULES (Biogen Idec)、scFv融合體(Novartis)、scFv融合體(Changzhou Adam Biotech Inc)及TvAb (Roche)。
Fc融合分子之實例包括(但不限於) ScFv/Fc融合體(Academic Institution, Pearce等人,Biochem Mol Biol Int. 1997 Sep;42(6):1179)、SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Blankenship JW等人,AACR 100th Annual meeting 2009 (第5465號摘要);Zymogenetics/BMS, WO2010111625)、雙重親和力再靶向技術(Fc-DARTTM) (MacroGenics)及雙重(ScFv)2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine - China)。
Fab融合雙特異性抗體之實例包括(但不限於) F(ab)2 (Medarex/AMGEN)、雙重作用或Bis-Fab (Genentech)、Dock-and-Lock® (DNL) (ImmunoMedics)、二價雙特異性抗體(Biotecnol)及Fab-Fv (UCB-Celltech)。
ScFv-、二價抗體基及域抗體之實例包括(但不限於)雙特異性T細胞銜接體(BiTE®) (Micromet)、串聯二價抗體(Tandab) (Affimed)、雙重親和力再靶向技術(DARTTM) (MacroGenics)、單鏈二價抗體(Academic, Lawrence FEBS Lett. 1998 Apr 3;425(3):479-84)、TCR樣抗體(AIT, ReceptorLogics)、人類血清白蛋白ScFv融合體(Merrimack, WO2010059315)及COMBODY分子(Epigen Biotech, Zhu等人,Immunol Cell Biol. 2010 Aug;88(6):667-75)、雙重靶向之nanobodies® (Ablynx, Hmila等人,FASEB J. 2010)、雙重靶向之純重鏈域抗體。
在結合至抗原之抗體之背景中,術語「結合」或「特異性結合」係指抗體結合至預定抗原或靶(例如人類Vδ2或人類EGFR)通常以對應於約10
-6M或更小、例如10
-7M或更小、例如約10
-8M或更小、例如約10
-9M或更小、約10
-10M或更小或約10
-11M或甚至更小之KD之表觀親和力結合,如使用本文實例中所闡述之流式細胞測量術所測定。或者,可使用例如表面電漿共振(SPR)技術在BIAcore T200中或使用雙層干涉術(BLI)在Octet RED96儀器中、使用抗原作為配體且使用結合部分或結合分子作為分析物來測定KD值。特異性結合意指,抗體結合至預定抗原以親和力對應於KD低於其結合至預定抗原或密切相關抗原以外之非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)之親和力之KD至少10倍,例如低至少100倍、例如低至少1,000倍、例如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍。親和力之較低程度取決於結合部分或結合分子之KD,因此在結合部分或結合分子之KD極低(亦即,結合部分或結合分子具有高度特異性)時,抗原親和力低於非特異性抗原親和力之程度可為至少10,000倍。本文所用之術語「KD」 (M)係指抗原與結合部分或結合分子之間之特定相互作用之解離平衡常數。
在本發明文中,「競爭(competition)」或「能夠競爭」或「競爭(competes)」係指特定結合分子(例如EGFR抗體)結合特定結合配偶體(例如EGFR)之傾向在結合該結合配偶體之另一分子(例如不同EGFR抗體)存在下之任何可檢測顯著減小。通常,競爭意指因存在另一分子(例如抗體)而導致結合至少約25%減小,例如至少約50%、例如至少約75%、例如至少90%減小,如藉由例如 ELISA分析或流式細胞測量術使用足夠量之兩種或更多種競爭分子(例如抗體)所測定。測定競爭性抑制之結合特異性之其他方法可參見例如 Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988;Colligan等人編輯,Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley InterScience N. Y., (1992, 1993);及Muller, Meth. Enzymol. 92, 589-601 (1983)。
在一實施例中,本發明抗體與抗體7D12結合至EGFR上之相同表位及/或與抗體5C8結合至Vδ2上之相同表位。業內已知可用於定位靶抗原上之抗體表位之若干方法,包括(但不限於):交聯耦合質譜,其可鑑別係表位之一部分之肽;及X射線晶體分析法,其鑑別抗原上形成表位之個別殘基。表位殘基可確定為至少一個原子距抗體小於或等於5 Å之所有胺基酸殘基。選擇5 Å作為表位截止距離以使原子處於凡得瓦半徑(van der Waals radius)內且達成可能之水介導氫鍵。接下來,表位殘基可確定為至少一個原子小於或等於8 Å之所有胺基酸殘基。選擇小於或等於8 Å作為表位截止距離以達成延伸精胺酸胺基酸之長度。交聯耦合質譜始於使用經質量標記之化學交聯劑結合抗體及抗原。接下來,使用高質量MALDI檢測來證實複合物之存在。因在交聯化學之後Ab/Ag複合物極為穩定,故可將許多各種酶及消解條件施加至複合物以提供許多不同重疊肽。使用高解析度質譜及MS/MS技術來鑑別該等肽。使用連接至交聯試劑之質量標籤來鑑別交聯肽。在MS/MS片段化及數據分析之後,發生交聯且衍生自抗原之肽係表位之一部分,而衍生自抗體之肽係互補位之一部分。來自所發現個別交聯肽之最N-及C末端交聯殘基之間之所有殘基皆可視為表位或互補位的一部分。抗體7D12之表位已藉由闡述於Schmitz等人,(2013) Structure 21:1214中之X射線晶體分析法確定,且由對應於域III配體結合位點之域III (殘基R353、D355、F357、Q384、N420)上之平坦表面組成。
本文所用之術語「第一」及「第二」抗原結合區不指代抗體中之其定向/位置,亦即其並無關於N-或C末端之含義。術語「第一」及「第二」僅用於正確地且一致地指代申請專利範圍及說明書中之兩個不同抗原結合區。
本文所用之「序列一致性%」係指由不同序列共有之相同核苷酸或胺基酸位置之數量(亦即,一致性% =相同位置數/總位置數× 100),其中考慮為達成最佳比對而需要引入之空位數及每一空位之長度。兩條核苷酸或胺基酸序列之間之一致性%可(例如)使用已納入ALIGN程式(2.0版)中之E. Meyers及W. Miller (Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988))算法、使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4來確定。
本發明之其他態樣及實施例
本發明提供包含含有能夠結合至人類Vδ2之抗原結合區之抗體之醫藥組合物。本發明另外提供包含含有能夠結合至人類EGFR之第一抗原結合區及能夠結合至人類Vδ2之第二抗原結合區之抗體的醫藥組合物。本文所闡述之醫藥組合物可包含稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、洗滌劑(例如非離子洗滌劑,例如Tween-20或Tween-80)、穩定劑(例如糖或無蛋白胺基酸)、防腐劑、組織固定劑、增溶劑及/或適於納入醫藥組合物中之其他材料。其他醫藥上可接受之賦形劑包括任何及所有適宜溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑、抗氧化劑及吸收延遲劑及與本發明抗體生理相容之類似試劑。
如所闡述,在第一態樣中,本發明係關於包含以下各項之醫藥組合物:
(a)包含能夠結合至人類Vδ2之抗原結合區之抗體,其中該第一抗原結合區包含如SEQ ID NO:1中所示之CDR1序列、如SEQ ID NO:2中所示之CDR2序列及如SEQ ID NO:3中所示之CDR3序列;
(b)5-20 mM組胺酸,其中組合物具有介於5.5與6.5之間之pH;或5-20 mM乙酸鈉,其中組合物具有介於5.0與6.0之間之pH;
(c)250-350 mM蔗糖;
(d)0.01% - 0.05% (w/v)聚山梨醇酯80;及
(e)0-20 mM甲硫胺酸。
在一實施例中,組合物包含5-20 mM組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH。在一實施例中,組合物包含10 mM組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH。
在另一實施例中,組合物包含5-20 mM乙酸鈉且具有介於5.0與6.0之間之pH。
在一實施例中,組合物包含介於250 mM與300 mM之間之蔗糖。在一實施例中,組合物包含280 mM蔗糖。
在一實施例中,組合物包含介於0.01%與0.03%之間之聚山梨醇酯80。在一實施例中,組合物包含0.02%聚山梨醇酯80。
在一實施例中,組合物包含介於0.5 mM與20 mM之間之甲硫胺酸。在一實施例中,組合物包含1 mM甲硫胺酸。
在一實施例中,組合物包含介於0.2 mg/mL與25 mg/mL之間之該抗體。在一實施例中,組合物包含介於0.2 mg/mL與20 mg/mL之間之該抗體。在一實施例中,組合物包含1或10 mg/mL該抗體。
在一實施例中,組合物包含:
(a)5-20 mM (例如10 mM)組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)介於250 mM與300 mM之間(例如280 mM)之蔗糖,及
(c)介於0.01%與0.03%之間(例如0.02%)之聚山梨醇酯80。
在一實施例中,組合物包含:
(a)10 mM組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)280 mM蔗糖,及
(c)0.02%聚山梨醇酯80。
在一實施例中,組合物包含:
(a)5-20 mM (例如10 mM)組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)介於250 mM與300 mM之間(例如280 mM)之蔗糖,及
(c)介於0.01%與0.03%之間(例如0.02%)之聚山梨醇酯80,及
(d)介於0.5 mM與20 mM之間之甲硫胺酸,例如1 mM甲硫胺酸。
在一實施例中,組合物包含:
(a)10 mM組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)280 mM蔗糖,及
(c)0.02%聚山梨醇酯80,及
(d)1 mM甲硫胺酸。
在一實施例中,組合物包含介於0.2 mg/mL與20 mg/mL之間(例如1或10 mg/mL)之該抗體。
在一實施例中,組合物包含:
(a)5-20 mM (例如10 mM)組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)介於250 mM與300 mM之間(例如280 mM)之蔗糖,及
(c)介於0.01%與0.03%之間(例如0.02%)之聚山梨醇酯80,及
(d)1 mg/mL該抗體。
在一實施例中,組合物包含:
(a)10 mM組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)280 mM蔗糖,及
(c)0.02%聚山梨醇酯80,及
(d)1 mg/mL該抗體。
在一實施例中,組合物包含:
(a)5-20 mM (例如10 mM)組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)介於250 mM與300 mM之間(例如280 mM)之蔗糖,及
(c)介於0.01%與0.03%之間(例如0.02%)之聚山梨醇酯80,及
(d)介於0.5 mM與20 mM之間之甲硫胺酸,例如1 mM甲硫胺酸,及
(e)1 mg/mL該抗體。
在一實施例中,組合物包含:
(a)10 mM組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)280 mM蔗糖,及
(c)0.02%聚山梨醇酯80,及
(d)1 mM甲硫胺酸,及
(e)1 mg/mL該抗體。
在一實施例中,組合物包含:
(a)5-20 mM (例如10 mM)組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)介於250 mM與300 mM之間(例如280 mM)之蔗糖,及
(c)介於0.01%與0.03%之間(例如0.02%)之聚山梨醇酯80,及
(d)10 mg/mL該抗體。
在一實施例中,組合物包含:
(a)10 mM組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)280 mM蔗糖,及
(c)0.02%聚山梨醇酯80,及
(d)10 mg/mL該抗體。
在一實施例中,組合物包含:
(a)5-20 mM (例如10 mM)組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)介於250 mM與300 mM之間(例如280 mM)之蔗糖,及
(c)介於0.01%與0.03%之間(例如0.02%)之聚山梨醇酯80,及
(d)介於0.5 mM與20 mM之間之甲硫胺酸,例如1 mM甲硫胺酸,及
(e)10 mg/mL該抗體。
在一實施例中,組合物包含:
(a)10 mM組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)280 mM蔗糖,及
(c)0.02%聚山梨醇酯80,及
(d)1 mM甲硫胺酸,及
(e)10 mg/mL該抗體。
在一實施例中,組合物包含:
(a)5-20 mM (例如10 mM)組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)介於250 mM與300 mM之間(例如280 mM)之蔗糖,及
(c)介於0.01%與0.03%之間(例如0.02%)之聚山梨醇酯80,及
(d)20 mg/mL該抗體。
在一實施例中,組合物包含:
(a)10 mM組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)280 mM蔗糖,及
(c)0.02%聚山梨醇酯80,及
(d)20 mg/mL該抗體。
在一實施例中,組合物包含:
(a)5-20 mM (例如10 mM)組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)介於250 mM與300 mM之間(例如280 mM)之蔗糖,及
(c)介於0.01%與0.03%之間(例如0.02%)之聚山梨醇酯80,及
(d)介於0.5 mM與20 mM之間之甲硫胺酸,例如1 mM甲硫胺酸,及
(e)20 mg/mL該抗體。
在一實施例中,組合物包含:
(a)10 mM組胺酸且具有介於5.5與6.5之間之pH,及
(b)280 mM蔗糖,及
(c)0.02%聚山梨醇酯80,及
(d)1 mM甲硫胺酸,及
(e)20 mg/mL該抗體。
如上所述,在第一態樣中,本發明係關於包含含有能夠結合至人類Vδ2之抗原結合區之抗體之醫藥組合物,其中抗原結合區包含如SEQ ID NO:1中所示之CDR1序列、如SEQ ID NO:2中所示之CDR2序列及如SEQ ID NO:3中所示之CDR3序列。
在一實施例中,SEQ ID NO:1中之X1係S (Ser)。在另一實施例中,SEQ ID NO:1中之X1係G (Gly)。
在一實施例中,SEQ ID NO:3中之X2係F (Phe)。在另一實施例中,SEQ ID NO:3中之X2係S (Ser)。
在一實施例中,SEQ ID NO:1中之X1係S (Ser)且SEQ ID NO:3中之X2係F (Phe)。
在一實施例中,SEQ ID NO:1中之X1係S (Ser)且SEQ ID NO:3中之X2係S (Ser)。
在一實施例中,SEQ ID NO:1中之X1係G (Gly)且SEQ ID NO:3中之X2係F (Phe)。
在一實施例中,SEQ ID NO:1中之X1係G (Gly)且SEQ ID NO:3中之X2係S (Ser)。
在一些實施例中,本發明係關於包含含有能夠結合至人類Vδ2之抗原結合區之抗體之醫藥組合物,其中抗原結合區包含如SEQ ID NO:21中所示之CDR1序列、如SEQ ID NO:2中所示之CDR2序列及如SEQ ID NO:19中所示之CDR3序列。在一些實施例中,本發明係關於包含含有能夠結合至人類Vδ2之抗原結合區之抗體之醫藥組合物,其中抗原結合區包含如SEQ ID NO:21中所示之CDR1序列、如SEQ ID NO:2中所示之CDR2序列及如SEQ ID NO:20中所示之CDR3序列。
在一較佳實施例中,抗體能夠活化人類Vγ9Vδ2 T細胞。可經由量測基因表現及/或(表面)標記物表現(例如活化標記物,例如CD25、CD69或CD107a)及/或分泌蛋白(例如細胞介素或趨化介素)特徵之改變來量測Vγ9Vδ2 T細胞之活化。在一較佳實施例中,抗體能夠誘導活化(例如CD69及/或CD25表現之上調),從而引起特徵在於Vγ9Vδ2 T細胞之CD107a表現及/或細胞介素產生(例如TNF、IFNγ)有所增加之去粒。
在另一較佳實施例中,在如本文實例9中所闡述進行測試時,在(例如) 1nM、較佳地100pM、較佳地10pM、較佳地1pM、甚至更佳地100fM之濃度下,抗體能夠將CD107a陽性細胞之數量增加至少2倍(例如至少5倍)。在另一較佳實施例中,在如本文在實例9中所闡述使用Vγ9Vδ2 T細胞及A431靶細胞進行測試時,本發明抗體增加CD107a陽性細胞百分比之EC50值為100 pM或更小(例如50 pM或更小、例如25 pM或更小、例如20 pM或更小、例如15 pM或更小)。
在一實施例中,抗原結合區係單域抗體。因此,在一實施例中,本發明醫藥組合物中之抗體包含能夠結合至人類Vδ2之單域抗體,其中抗原結合區包含如SEQ ID NO:1中所示之CDR1序列、如SEQ ID NO:2中所示之CDR2序列及如SEQ ID NO:3中所示之CDR3序列。
在另一實施例中,抗原結合區係人類化的,其中較佳地抗原結合區包含以下序列或由其組成:(a) SEQ ID NO:4中所示之序列;或(b)與SEQ ID NO:4中所示之序列具有至少90% (例如至少92%、例如至少94%、例如至少96%、例如至少98%)序列一致性之序列。
在一實施例中,SEQ ID NO:4中之X1係S (Ser)。在另一實施例中,SEQ ID NO:4中之X1係G (Gly)。在一實施例中,SEQ ID NO:4中之X2係F (Phe)。在另一實施例中,SEQ ID NO:4中之X2係S (Ser)。在一實施例中,SEQ ID NO:4中之X1係S (Ser)且SEQ ID NO:4中之X2係F (Phe)。
在一實施例中,SEQ ID NO:4中之X1係S (Ser)且SEQ ID NO:4中之X2係S (Ser)。在一實施例中,SEQ ID NO:4中之X1係G (Gly)且SEQ ID NO:4中之X2係F (Phe)。在一實施例中,SEQ ID NO:4中之X1係G (Gly)且SEQ ID NO:4中之X2係S (Ser)。
在一些實施例中,抗原結合區係人類化的,其中較佳地抗原結合區包含SEQ ID NO:23中所示之序列或由其組成。在一些實施例中,抗原結合區係人類化的,其中較佳地抗原結合區包含SEQ ID NO:24中所示之序列或由其組成。
在一些實施例中,本發明醫藥組合物中之抗體係多特異性抗體,例如雙特異性抗體。因此,在一實施例中,抗體進一步包含第二抗原結合區。在一實施例中,第二抗原結合區係單域抗體。
在另一實施例中,抗體係雙特異性抗體,其中第一抗原-抗原結合區及第二抗原結合區皆係單域抗體。在另一實施例中,多特異性抗體係雙特異性抗體,其中第一抗原結合區係單域抗體且第二抗原結合區係單域抗體。
在一實施例中,本發明醫藥組合物內所包含之抗體包含第二抗原結合區且第二抗原結合區能夠結合人類EGFR。靶向Vγ9Vδ2-T細胞及EGFR之雙特異性抗體已展示可在活體外及在活體內小鼠異種移植物模型中誘導強效Vγ9Vδ2 T細胞活化及腫瘤細胞溶解(de Bruin等人,(2018) Oncoimmunology 1, e1375641)。
在一些實施例中,抗體包含含有SEQ ID NO:5中所示之CDR1序列、SEQ ID NO:6中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:7中所示之CDR3序列之抗原結合區。
在一實施例中,抗原結合區係人類化的。
在另一實施例中,抗體包含含有以下序列或由其組成之抗原結合區:(a) SEQ ID NO:8中所示之序列;或(b)與SEQ ID NO:8中所示之序列具有至少90% (例如至少92%、例如至少94%、例如至少96%、例如至少98%)序列一致性之序列。
在另一實施例中,該抗體與具有SEQ ID NO:8中所示之序列之抗體競爭(亦即能夠競爭)結合至人類EGFR,較佳地該抗體與具有SEQ ID NO:8中所示之序列之抗體結合人類EGFR上之相同表位。
在另一實施例中,本發明抗體包含第一抗原結合區及第二抗原結合區,其中第一抗原結合區包含SEQ ID NO:1中所示之CDR1序列、SEQ ID NO:2中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:3中所示之CDR3序列,且其中第二抗原結合區包含SEQ ID NO:5中所示之CDR1序、SEQ ID NO:6中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:7中所示之CDR3序列。
在另一實施例中,本發明抗體包含第一抗原結合區及第二抗原結合區,其中第一抗原結合區包含SEQ ID NO:21中所示之CDR1序列、SEQ ID NO:2中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:19中所示之CDR3序列,且其中第二抗原結合區包含SEQ ID NO:5中所示之CDR1序、SEQ ID NO:6中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:7中所示之CDR3序列。
在另一實施例中,本發明抗體包含第一抗原結合區及第二抗原結合區,其中第一抗原結合區包含SEQ ID NO:21中所示之CDR1序列、SEQ ID NO:2中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:20中所示之CDR3序列,且其中第二抗原結合區包含SEQ ID NO:5中所示之CDR1序、SEQ ID NO:6中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:7中所示之CDR3序列。
在另一實施例中,本發明抗體包含第一抗原結合區及第二抗原結合區,其中第一抗原結合區包含SEQ ID NO:4中所示之序列且第二抗原結合區包含SEQ ID NO:8中所示之序列。在本文之其他實施例中:
(a)SEQ ID NO:4中之X1係S (Ser)且SEQ ID NO:4中之X2係F (Phe),或
(b)SEQ ID NO:4中之X1係S (Ser)且SEQ ID NO:4中之X2係S (Ser),或
(c)SEQ ID NO:4中之X1係G (Gly)且SEQ ID NO:4中之X2係F (Phe),或
(d)SEQ ID NO:4中之X1係G (Gly)且SEQ ID NO:4中之X2係S (Ser)。
在另一實施例中,本發明抗體包含第一抗原結合區及第二抗原結合區,其中第一抗原結合區包含SEQ ID NO:23中所示之序列且第二抗原結合區包含SEQ ID NO:8中所示之序列。在另一實施例中,本發明抗體包含第一抗原結合區及第二抗原結合區,其中第一抗原結合區包含SEQ ID NO:24中所示之序列且第二抗原結合區包含SEQ ID NO:8中所示之序列。
在另一實施例中,抗體能夠介導人類EGFR表現細胞之殺死。在一較佳實施例中,在如本文實例9中所闡述進行測試時,抗體能夠將EGFR表現細胞(例如A431細胞)之Vγ9Vδ2 T細胞介導性殺死增加至少25% (例如至少50%、例如至少2倍)。
在另一實施例中,抗體不能介導EGFR陰性細胞(例如EGFR陰性人類細胞)之殺死。
在一實施例中,抗體包含第一抗原結合區及第二抗原結合區,其中第一抗原結合區及第二抗原結合區經由肽連接體(例如長度為1至20個胺基酸、例如1至10個胺基酸、例如2、3、4、5、6、7、8或10個胺基酸之連接體)共價連接。在一實施例中,肽連接體包含SEQ ID NO:9中所示之序列GGGGS或由其組成。
在另一實施例中,抗體包含第一抗原結合區及第二抗原結合區,其中能夠結合人類Vδ2之第一抗原結合區位於能夠結合人類EGFR之第二抗原結合區之C末端。
在一實施例中,本發明醫藥組合物內所包含之抗體進一步包含半衰期延長域。在一實施例中,抗體在投與人類受試者時具有長於約168小時之終末半衰期。最佳地,終末半衰期為336小時或更長。本文所用之抗體「終末半衰期」係指多肽血清濃度在活體內於最終消除期中減小50%所需之時間。
在一實施例中,抗體進一步包含半衰期延長域且半衰期延長域係Fc區。在另一實施例中,抗體係多特異性抗體,例如包含Fc區之雙特異性抗體。製備雙特異性抗體之各種方法已闡述於業內,例如由Brinkmann及Kontermann (2017) MAbs 9:182綜述。在本發明之一實施例中,Fc區係包含兩個Fc多肽之異二聚體,其中第一抗原結合區融合至第一Fc多肽且第二抗原結合區融合至第二Fc多肽,且其中第一及第二Fc多肽包含較形成同二聚體偏好於形成異二聚體之不對稱胺基酸突變。(例如參見Ridgway等人(1996) 「Knobs-into-holes」 engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng 9:617)。在本文之另一實施例中,Fc多肽之CH3區域包含該等不對稱胺基酸突變,較佳地第一Fc多肽包含T366W取代且第二Fc多肽包含T366S、L368A及Y407V取代,或反之亦然,其中胺基酸位置根據EU編號系統對應於人類IgG1。在另一實施例中,第一及第二Fc多肽中位置220處之半胱胺酸殘基已發生缺失或取代,其中胺基酸位置根據EU編號系統對應於人類IgG1。在另一實施例中,該區域包含SEQ ID NO:10中所示之鉸鏈序列。
在一些實施例中,第一及/或第二Fc多肽含有致使抗體變為惰性(亦即不能介導效應功能,或該能力減小)之突變。在一實施例中,惰性Fc區另外不能結合C1q。在一實施例中,第一及第二Fc多肽在位置234及/或235處包含突變,較佳地第一及第二Fc多肽包含L234F及L235E取代,其中胺基酸位置根據EU編號系統對應於人類IgG1。在另一實施例中,抗體含有L234A突變、L235A突變及P329G突變。在另一實施例中,抗體含有L234F突變、L235E突變及D265A突變。
在一較佳實施例中,第一抗原結合區包含SEQ ID NO:4中所示之序列,第二抗原結合區包含SEQ ID NO:8中所示之序列,且
(a)第一Fc多肽包含SEQ ID NO:11中所示之序列且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:12中所示之序列,或
(b)第一Fc多肽包含SEQ ID NO:12中所示之序列且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:11中所示之序列。
在一實施例中,SEQ ID NO:11中之X3係K。在另一實施例中,SEQ ID NO:11中之X3不存在。
在一實施例中,SEQ ID NO:12中之X3係K。在另一實施例中,SEQ ID NO:12中之X3不存在。
在另一較佳實施例中,抗體包含SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17中所示之序列或由其組成。
在一實施例中,SEQ ID NO:16中之X3係K。在另一實施例中,SEQ ID NO:16中之X3不存在。
在一實施例中,SEQ ID NO:17中之X3係K。在另一實施例中,SEQ ID NO:17中之X3不存在。
在另一較佳實施例中,抗體包含SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18中所示之序列或由其組成。
在一實施例中,SEQ ID NO:18中之X3係K。在另一實施例中,SEQ ID NO:18中之X3不存在。
在另一主態樣中,本發明係關於用作藥劑之如本文所闡述之本發明醫藥組合物。
用於本發明醫藥組合物中之抗體能夠產生有益於藉由Vγ9Vδ2 T細胞殺死腫瘤細胞之微環境。因此,在一較佳實施例中,抗體係用於治療癌症。
在一實施例中,醫藥組合物係用於治療原發性或轉移性結腸或結腸直腸癌。在另一實施例中,醫藥組合物係用於治療腹膜癌。在另一實施例中,醫藥組合物係用於治療肝癌。在另一實施例中,醫藥組合物係用於治療頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)。在另一實施例中,醫藥組合物係用於治療非小細胞肺癌(NSCLC)。在另一實施例中,醫藥組合物係用於治療皮膚鱗狀細胞癌。
類似地,本發明係關於治療疾病之方法,其包含向有需要之人類受試者投與如本文所闡述之本發明醫藥組合物。在一實施例中,疾病係癌症。
在一些實施例中,醫藥組合物係作為單一療法投與。然而,本發明醫藥組合物亦可以組合療法投與,亦即與相關於擬治療疾病或病狀之其他治療劑進行組合。
「治療(treatment或treating)」係指投與有效量之本發明醫藥組合物以用於減輕、改善、阻止、根除(治癒)或預防症狀或疾病狀態。「有效量」係指可在所需時間段內以所需劑量有效地達成期望治療結果之量。多肽(例如抗體)之有效量可根據下述因素變化:例如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重及抗體引起個體中之期望反應之能力。有效量亦為抗體之治療有益效應勝過其任何毒性或有害效應的量。可藉由任何適宜途徑實施投與,但通常為非經腸,例如靜脈內、肌內或皮下。
用於本發明中之多特異性抗體通常以重組方式產生,亦即藉由在適宜宿主細胞中表現編碼抗體之核酸構築體且隨後自細胞培養物純化所產生之重組抗體。可藉由業內熟知之標準分子生物技術來產生核酸構築體。通常使用表現載體將構築體引入宿主細胞中。適宜核酸構築體及表現載體為業內所已知。適於重組表現抗體之宿主細胞為業內所熟知,且包括CHO、HEK-293、Expi293F、PER-C6、NS/0及Sp2/0細胞。
表 1 : 序列表
SEQ ID. | 代碼 | 說明 | 序列 |
22 | 5C8 | CDR1 | NYAMG |
2 | 5C8 | CDR2 | AISWSGGSTSYADSVKG |
15 | 5C8 | CDR3 | QFSGADYGFGRLGIRGYEYDY |
13 | 5C8 | VHH | EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFS NYAMG WFRQAPGKEREFVA AISWSGGSTSYADSVKG RFTISRDNAKNTVYLQMNSPKPEDTAIYYCAA QFSGADYGFGRLGIRGYEYDY WGQGTQVTVSS |
1 | 5C8 var | CDR1 | NYAMX 1,其中X 1係S或G |
21 | 5C8 var1 | CDR1 | NYAMS |
2 | 5C8 var | CDR2 | AISWSGGSTSYADSVKG |
3 | 5C8 var (Y105) | CDR3 | QFSGADX 2GFGRLGIRGYEYDY,其中X 2係F或S |
19 | 5C8 var (Y105F) | CDR3 | QFSGADFGFGRLGIRGYEYDY |
20 | 5C8 var (Y105S) | CDR3 | QFSGADSGFGRLGIRGYEYDY |
4 | 5C8 var | VHH | EVQLLESGGGSVQPGGSLRLSCAASGRPFSNYAMX 1WFRQAPGKEREFVSAISWSGGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQFSGADX 2GFGRLGIRGYEYDYWGQGTQVTVSS,其中X 1係S或G,且其中X 2係F或S |
14 | 5C8var1 | VHH | EVQLLESGGGSVQPGGSLRLSCAASGRPFS NYAMS WFRQAPGKEREFVS AISWSGGSTSYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA QFSGADYGFGRLGIRGYEYDY WGQGTQVTVSS |
23 | 5C8 var1 (Y105F) | VHH | EVQLLESGGGSVQPGGSLRLSCAASGRPFS NYAMS WFRQAPGKEREFVS AISWSGGSTSYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA QFSGADFGFGRLGIRGYEY DYWGQGTQVTVSS |
24 | 5C8 var1 (Y105S) | VHH | EVQLLESGGGSVQPGGSLRLSCAASGRPFS NYAMS WFRQAPGKEREFVS AISWSGGSTSYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAA QFSGADSGFGRLGIRGYEY DYWGQGTQVTVSS |
5 | 7D12 (EGFR) | CDR1 | SYGMG |
6 | 7D12 (EGFR) | CDR2 | GISWRGDSTGYADSVKG |
7 | 7D12 (EGFR) | CDR3 | AAGSAWYGTLYEYDY |
8 | 7D12var8 (EGFR) | VHH | EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLRAEDTAVYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTLVTVSS |
9 | 連接體 | GGGGS | |
10 | 經修飾鉸鏈 | AAASDKTHTCPPCP | |
11 | IgG1 L234F L235E T366W | 重鏈恆定區變體 | AAASDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX 3,其中X 3係K或不存在 |
12 | IgG1 L234F L235E T366S L368A Y407V | 重鏈恆定區變體 | AAASDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX 3,其中X 3係K或不存在 |
16 | 7D12var8-Fc | VHH-Fc | EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLRAEDTAVYYCAAAAGSAWYGTLYEYDYWGQGTLVTVSSAAASDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX 3,其中X 3係K或不存在 |
17 | 5C8var1 (Y105F)-Fc | VHH-Fc | EVQLLESGGGSVQPGGSLRLSCAASGRPFSNYAMSWFRQAPGKEREFVSAISWSGGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQFSGADFGFGRLGIRGYEYDYWGQGTQVTVSSAAASDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX 3,其中X 3係K或不存在 |
18 | 5C8var1 (Y105S)-Fc | VHH-Fc | EVQLLESGGGSVQPGGSLRLSCAASGRPFSNYAMSWFRQAPGKEREFVSAISWSGGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQFSGADSGFGRLGIRGYEYDYWGQGTQVTVSSAAASDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX 3,其中X 3係K或不存在 |
出於所有目的,本文所引用之所有參考文獻、文章、出版物、專利、專利公開案及專利申請案之全部內容皆以引用方式併入本文中。然而,在本文中提及任何參考文獻、文章、出版物、專利、專利公開案及專利申請案並不且不應理解為承認或以任何形式表明其在世界上任何國家構成有效先前技術或形成一般通常知識之一部分。
實例 實例 1 : VHH 化合物之產生及純化
VHH化合物主要係藉由以下方式來產生:在HEK293-E 253細胞中瞬時轉染編碼質體並藉由蛋白質A親和層析自條件化培養基純化蛋白質(在產生一週之後),隨後實施製備型凝膠過濾。純化在使用Superdex-75管柱之製備型粒徑篩析中所觀察之主要單體峰(級分1E11-1G2),如
圖 1中所見
。
在聚丙烯醯胺凝膠電泳中,經純化蛋白質展示為在還原及非還原條件下以單帶形式進行遷移。
圖 2展示代表性實例。
實例 2 : 經純化 VHH 化合物之 HP-SEC 分析
使用Waters Acquity ARC-bio系統對經純化VHH化合物實施HP-SEC分析。將10µg抗體(10µL濃度為1mg/mL之抗體)注於Waters BEH200 SEC管柱(珠粒大小:2.5µm,管柱尺寸:7.8 x 300 mm)。移動相由50mM磷酸鈉、0.2M氯化鈉緩衝液(pH7.0)組成且使用0.8mL/min之緩衝液速度以供運行。藉由量測214nm波長下之吸收來檢測蛋白質。每一注入之總分析時間為15分鐘。如實例1中所闡述來產生VHH化合物並純化。令人吃驚地,當在HP-SEC分析中測試VHH 5C8 (SEQ ID NO:13) (先前闡述於WO 2015/156673中)及5C8var1 (SEQ ID NO:14) (先前闡述於WO 2020/060405中)之完整性及單一性時,觀察到兩個峰。(參見
圖 3A- 圖 3B)。
實例 3 : 5C8 之質譜分析揭示 80Da 之額外質量
為確定5C8之兩種同功型(isoform)是否具有不同質量,藉由LC-ESI-MS質譜分析5C8之蛋白質製劑。此分析中所發現之主要物種係無轉譯後修飾或信號肽之5C8。第二物種係質量相差+ 80.3道爾頓(Da)之蛋白質,此指示可能硫酸化或磷酸化。 藉由使用磷酸酶或硫酸酶處理且隨後在蛋白水解消化之後對肽實施LC-ESI-MS質譜分析來進一步探究此結果。顯示硫酸酶處理將含有Y105 (CDR3 (SEQ ID NO:15)之第7殘基)之肽之質量減小80Da,而磷酸酶處理並無效應。此證實5C8中之Y105藉由硫酸化轉譯後修飾。此硫酸化存在於大約30%之蛋白質製劑中。
實例 4 : 含有相同抗 V γ 9V δ 2 VHH 之 1D12var5-5C8var1 顯示相同 HP-SEC 異質性及 80Da 之相同額外質量
1D12var5-5C8var1係由抗CD1d VHH經由撓性連接體偶合至5C8var1 (闡述於WO 2020/060405中之SEQ ID NO:87中)構成之雙特異性VHH化合物。此蛋白質表現於如上文所闡述之HEK 293 E細胞中。另外,自不同表現系統獲得蛋白質製劑:該雙特異性VHH亦表現於巴斯德畢赤酵母中及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中。當在HP-SEC分析中測試不同蛋白質製劑時,系統性觀察一個預峰。(參見
圖 4A- 圖 4B)。
所觀察之預峰指示顯著百分比之不同同功型之蛋白質。因5C8 VHH顯示為經硫酸化且5C8var1含有完全相同之CDR3序列,故亦藉由質譜分析1D12var5-5C8var1批料之分子量。端視蛋白質批料,發現15%至40%含有80Da之額外質量。此與針對VHH 5C8所觀察之硫酸化一致。
實例 5 : VHH 5C8 及 5C8var1 之電腦分析
使用Maestro (Schrödinger)基於PDB ID 5M2W來構建5C8及5C8var1之同源模型。CDR1及CDR3需要藉由從頭循環預測使用Prime (Schrödinger)來進行精修。所生成模型顯示,CDR3殘基Y105展示205.1 Å
2(在5C8var1之模型中)及122.2 Å
2(在5C8之模型中)之高溶劑可及性表面積且由此預計會有助於抗原結合。隨後,分析模型之反應性殘基,從而指示易於發生轉譯後修飾(PTM)之殘基。接下來,使用ModPred (一種基於序列之PTM預測工具)來分析蛋白質序列。兩種結構及序列中所預測之修飾列示於表2中。個別預測PTM不能闡釋HP-SEC分析中所觀察之質量差異。類型闡述藉由Maestro預測之PTM。*僅針對5C8預測有Q13去醯胺化。
表 2 : Maestro 及 ModPred 中 5C8 及 5C8var1 之預測 PTM 。
實例 6 : 5C8var1 VHH CDR3 突變體 Y105F 及 Y105S 之設計及產生
殘基編號 | 殘基 | 類型 |
13 * | Q | 去醯胺化 |
32 | Y | 氧化 |
39 | Q | 去醯胺化 |
60 | Y | 氧化 |
62 | D | 蛋白水解(ASP) |
73 | D | 蛋白水解(ASP) |
74 | N | 去醯胺化 |
80 | Y | 氧化 |
84 | N | 去醯胺化 |
90 | D | 蛋白水解(ASP) |
94 | Y | 氧化 |
95 | Y | 氧化 |
104 | D | 蛋白水解(ASP) |
105 | Y | 氧化 |
115 | Y | 氧化 |
117 | Y | 氧化 |
118 | D | 蛋白水解(ASP) |
119 | Y | 氧化 |
122 | Q | 去醯胺化 |
使用如實例5中所闡述之同源模型引入防止5C8及5C8var1中之Y105硫酸化之突變。基於VHH:Y105S (保留醇功能)及Y105F (保留芳香族環)之模型結構來設計兩種不同突變體。殘基Y105係CDR3之第7殘基;藉由引入突變,預計會對結合產生效應。在人類化VHH序列5C8var1中設計兩種突變,且在HEK293E細胞中產生兩種蛋白質並如上文所闡述進行純化。人類化VHH之CDR3胺基酸序列與非人類化之序列保持一致。
充分產生5C8var1-Y105F及5C8var1-Y105S並在製備型粒徑篩析中表現為單體蛋白(數據未展示)。兩種蛋白質皆係高純的(
圖 5)並在聚丙烯醯胺凝膠電泳中以單一物質形式遷移。
實例 7 : 含有經設計 CDR3 突變之經純化 VHH 之 HP-SEC 分析
如針對5C8所闡述來實施HP-SEC分析。分析5C8var1-Y105F以及5C8var1-Y105S。
圖 6A- 圖 6B。
如可自含有經設計CDR3突變之經純化VHH分子之HP-SEC分析推斷出,針對任一突變體未觀察到異質性。此指示,所觀察Y105轉譯後修飾不存在,且蛋白質係均質的。
實例 8 : 使用生物層干涉術 (BLI) 對 5C8var1 、 5C8var1-Y105F 及 5C8va1-Y105S 之親和力量測展示並無親和力差異
藉由生物層干涉術使用Octet RED96儀器(ForteBio)來量測5C8var1 VHH抗體片段及變體5C8var1-Y105F及5C8var1-Y105S與Vy9Vδ2TCR之結合。將重組人類Vy9Vδ2-Fc融合蛋白(20 μg/ml)作為配體捕獲於抗人類Fc捕獲生物感測器上。在將捕獲配體之生物感測器與VHH抗體片段之稀釋系列(40 nM至0.63 nM)在10X動力學緩衝液(ForteBio)中一起培育時,記錄感測圖。使用1:1結合模型之整體數據擬合來估計k
on(締合速率常數)及
koff(解離速率常數)之值。使用該等值且使用KD = k
off/k
on來計算KD (平衡解離常數)。
如可自
圖 7A- 圖 7C及自表3推斷出,針對兩種不同Y105 VHH突變體發現之KD值並不與針對5C8var1發現之值實質上不同。尤其地,Y105F突變體具有與針對5C8var1所發現者相當之親和力。表3中所繪示之值係至少三個獨立量測之平均值+/-標準偏差。
表 3 : VHH 與重組 V γ 9V δ 2 TCR 蛋白之結合之 BLI 量測中所發現之親和力值。
實例 9 : 含有 Y105F 突變之抗 (EGFR x V γ 9V δ 2 TCR) 雙特異性 VHH 之功能性得以完全保留
VHH化合物 | KD (nM) +/- SD |
5C8var1 | 0.81 +/- 0.02 |
5C8var1-Y105F | 0.78 +/- 0.23 |
5C8var1-Y105S | 1.59 +/- 0.31 |
為確定VHH 5C8var1-Y105F與5C8var1相比之相等親和力是否可轉換成可比功能性,設計雙特異性VHH 7D12var8-5C8var1-Y105F:將人類化抗EGFR VHH 7D12var8 (基於闡述與Gainkam等人,(2008) J Nucl Med 49(5):788中之VHH)經由G4S連接體偶合至5C8var1-Y105F VHH,從而形成7D12var8-5C8var1-Y105F。兩個VHH分子由撓性G4S連接體序列隔開。如上文所闡述產生此分子並純化,且然後測試其誘導Vγ9Vδ2 T細胞活化(依賴於EGFR陽性腫瘤細胞系(A431))及引起T細胞介導之腫瘤細胞溶解之能力。簡言之,使用磁活化細胞分選(MACS)與抗Vδ2抗體根據標準化程序自健康供體之血液來分離Vγ9Vδ2 T細胞。然後使用細胞介素及經輻照飼養細胞(JY細胞系及來自不同供體之PBMC之混合物)之混合物將該等細胞擴增一週。在用於分析中時,Vγ9Vδ2 T細胞總是>90%純(在FACS中針對Vγ9及Vδ2雙陽性染色)。根據供應商之推薦來培養A431細胞系(ATCC,目錄號:CRL-1555)。對於活化或細胞毒性分析而言,在分析前一天將50,000個腫瘤靶細胞平鋪於96孔組織培養板中。第二天,將50,000個經擴增、純化之Vγ9Vδ2 T細胞與一定濃度範圍之雙特異性VHH化合物一起添加於培養基中。在活化分析中,使用添加至混合物中之經標記抗CD3及抗CD107A抗體混合物來評價Vy9Vδ2-T細胞去粒。在4小時之後,收穫細胞,洗滌並藉由FACS分析去粒標記物CD107A之表現。對於細胞毒性分析而言,在第二天使用CytoTox-Glo細胞毒性分析套組(Promega G9290)檢驗共培養物之上清液中蛋白酶之存在(指示細胞死亡)。在分析結束時,藉由使用洗滌劑之細胞溶解來設定100%殺死。
圖 8A- 圖 8D展示,7D12var8-5C8var1-Y105F以及非人類化7D12-5C8會誘導強效Vγ9Vδ2 T細胞活化(
圖 8A及
圖 8B)及腫瘤細胞溶解(
圖 8C及
圖 8D)。該等結果與不含Y105突變7D12wt-5C8之非人類化「前體」分子之功效一致。表4展示在曲線擬合之後獲得之EC50值。7D12var8-5C8var1-Y105F在細胞毒性分析中之EC50略低於7D12-5C8。
表 4 : 在使用 GraphPad 軟體對圖 8A- 圖 8D 中所示數據進行曲線擬合之後發現之 EC50 值。
所用抗體 | EC50去粒(pM) | EC50細胞毒性(pM) |
7D12-5C8 | 10 | 9 |
7D12var8-5C8var1-Y105F | 11 | 2.5 |
7D12var8-5C8var1-Y105F之情形中之最大腫瘤細胞殺死程度略低於針對7D12-5C8所觀察之腫瘤細胞殺死程度。然而,該等分析係使用兩種不同Vγ9Vδ2 T細胞供體之兩種不同量測且此最大細胞毒性程度可尤其具有供體依賴性。
實例 10 : 含有 Y105 突變之 VHH 5C8var1 之溫度穩定性不變
為確定引入不同變體中之突變是否影響VHH摺疊之熱穩定性,使用NanoDSF (差示掃描螢光法)量測突變體之熔融溫度。使用PBS稀釋抗體試樣直至其等同於具有最低濃度之試樣為止。隨後將抗體試樣填充於nanoDSF級毛細管中並使用Prometheus NT.48進行量測。在實驗期間,使溫度自20℃斜升至95℃。在350及330 nm下檢測蛋白質之固有螢光且記錄該固有螢光以及反射光之量。自該等量測值測定表觀熔融溫度(Tm)及聚集起始溫度(Tagg)。對於所有三個抗體片段而言,報告起始熔融溫度(T
on)及VHH完全展開之熔融溫度(Tm) (表5)。針對5C8var1-Y105F及5C8var1-Y105S量測之熔融溫度與5C8var1之熔融溫度一致:表5。
表 5 : 5C8var1-Y105F 及 5C8var1-Y105S 展示與 5C8var1 類似之熔融溫度 , 此指示穩定性不因所引入突變而受到損害。
實例 11 : 半衰期延長 ( 含有 Fc) 之雙特異性構築體
T on(℃) | Tm (℃) | |
5C8var1 | 61.8 | 86.7 |
5C8var1-Y105F | 64.5 | 85.5 |
5C8var1-Y105S | 63.9 | 86.6 |
為獲得具有較長活體內血漿半衰期之分子,將7D12var8-5C8var1-Y105F雙特異性VHH再格式化成含有人類Fc之治療抗體形式。使兩個VHH域偶合至具有下列特性之人類IgG1 Fc (亦即CH2及CH3)域:使VHH偶合至經修飾鉸鏈(AAA、隨後SDKTHTCPPCP,缺失半胱胺酸220)以及人類CH2及CH3域。藉由LFLE突變對(L234F、L235E)使CH2域Fc沉默且使用在兩條鏈共表現於相同細胞中時增強異源二聚合之「隆凸與孔洞」突變(隆凸:T366W及孔洞:T366S、L368A及Y407V)使CH3域進行突變。此突變對已闡述於科學文獻中(Ridgway等人,(1996) Protein Eng 9:617)。構築體之序列示於SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17中。具有Fc區之所得抗體構築體7D12var8-5C8var1(Y105F)稱為7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc。類似地,製備位置105處之Y經S代替之構築體(7D12var8-5C8var1(Y105S)-Fc)。該構築體之序列示於SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18中。
經由以下方式來製備蛋白質:在HEK293E細胞中共轉染兩個編碼表現載體並藉助蛋白質A親和層析自培養上清液純化,隨後藉由製備型粒徑篩析層析純化,如實例1中所闡述。此會產生高度單體性蛋白質製劑。
實例 12 : 7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc 與自健康人類 PBMC 分離之原代 V γ 9V δ 2 T 細胞之結合
為證實7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc與Vγ9Vδ2 T細胞受體(TCR)之結合,藉由磁活化細胞分選(MACS)自健康周邊血單核細胞(PBMC)分離人類Vγ9Vδ2 T細胞且隨後如文獻所闡述(de Bruin等人,Clin. Immunology 169 (2016), 128-138;de Bruin等人,J. Immunology 198(1) (2017), 308-317)進行擴增。然後以50000個細胞/孔之濃度接種經擴增之多株及純(>95%) Vγ9Vδ2T細胞,並與7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc抗體或GP120-5C8var1(Y105F)-Fc抗體(作為陽性對照,以始於100 nM之半對數滴定)在4℃下一起培育一小時。藉由流式細胞術使用經螢光標記之二級抗IgG1抗體使抗體與Vγ9Vδ2 TCR之結合可視化。
圖 9展示抗IgG1抗體染色之平均螢光強度(MFI)信號,如藉由流式細胞術針對兩種不同PBMC供體(D336及D339)所量測。S形曲線突出顯示了7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc與Vγ9Vδ2 T細胞之顯著結合,其中半數最大有效濃度(EC50)在低毫微莫耳範圍內(~3 nM)。
實例 13 : 藉由基於細胞之 ELISA 測得之 7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc 與 EGFR 陽性腫瘤細胞之結合
在基於細胞之酶聯免疫吸附分析(ELISA)中使用表現EGFR之腫瘤細胞系A-431、HCT-116及HT-29來測試7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc與表皮生長因子受體(EGFR)之結合。為此,首先在第-1天以不同濃度接種腫瘤細胞以在第0天達到大約50000個細胞/孔之濃度。在第0天,將經半對數滴定之7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc抗體或GP120-5C8var1(Y105F)-Fc抗體(作為陰性對照)自100 nM起添加至腫瘤細胞中並在37℃下一小時。然後在二級培育步驟中於37℃下使用抗IgG1-HRP將結合抗體標記一小時。然後藉由添加3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺及由HRP誘導之比色變化且隨後添加H2SO4以停止反應來解析二級抗體結合。然後在UV光譜儀中於450 nm之波長下來量測光學密度(OD)。
圖 10A- 圖 10C展示,7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc以約7 nM之EC50強烈結合至A-431 (
圖 10B)、HCT-116 (
圖 10C)及HT-29 (
圖 10A)腫瘤細胞,而非靶向對照抗體不可量測地結合所測試細胞系中之任一者。
實例 14 : 由 7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc 誘導之依賴於 A-431 細胞之 V γ 9V δ 2 T 細胞之去粒
為探究7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc活化Vγ9Vδ2 T細胞之潛力,首先如之前所闡述分離Vγ9Vδ2 T細胞並擴增。接下來,然後將Vγ9Vδ2 T細胞與A-431腫瘤細胞以1:1 E:T比率在不同濃度之7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc抗體及經PE標記之抗CD107a螢光抗體存在下一起培養。在24h之後,收穫細胞並使用經螢光標記之抗Vγ9及抗CD3抗體染色以區分Vγ9Vδ2 T細胞與腫瘤細胞。使用流式細胞術,探究Vγ9Vδ2 T細胞上之CD107a表現程度,其反映靶依賴性去粒。
圖 11展示,使用增加濃度之7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc,Vγ9Vδ2 T細胞會有效地誘導依賴於A-431細胞之去粒。由7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc誘導之Vγ9Vδ2 T細胞去粒之EC50位於皮莫耳範圍內(~40-90 pM)。
實例 15 : 抗體 7D12-5C8 誘導 T 細胞介導之靶細胞細胞毒性
為探究雙特異性VHH 7D12-5C8是否有效誘導針對靶細胞之Vγ9Vδ2 T細胞介導之細胞毒性,在與Vγ9Vδ2 T細胞及bsVHH抗體片段之共培養環境中評價A-388表皮樣腫瘤細胞系(ATCC, CRL-7905)之生存力。在此分析中,如先前所闡述自健康PBMC分離Vγ9Vδ2 T細胞,但隨後在-150℃下冷凍及儲存。將經冷凍Vγ9Vδ2 T細胞解凍並在IL-2補充培養基中靜置過夜。單獨或與經靜置Vγ9Vδ2 T細胞一起以1:1或1:0.1比率在使用或不使用7D12-5C8(10 nM)下來接種A-388腫瘤細胞。作為另一對照,在使用或不使用抗體7D12-5C8 (10 nM)下單獨接種Vγ9Vδ2 T細胞。在72h之後,藉由添加ATP Lite (Perkin Elmer, 6016731)來測定細胞生存力且使用微量板讀數儀讀出發光信號。
圖 12展示代表活細胞之代謝活性及由此其數量之ATP源螢光信號。在1:1 E:T比率下可觀察到,抗體誘導約50%之活細胞減少,而A-388及Vγ9Vδ2 T細胞之未處理共培養物不受影響,此突顯了其可誘導T細胞介導之細胞毒性。
實例 16 : 經 7D12-5C8 及 7D12-5C8var1(Y105S)-Fc 活化之 V γ 9V δ 2 T 細胞之腫瘤細胞殺死
為探究bsVHH 7D12-5C8及抗體7D12-5C8var1(Y105S)-Fc是否能夠誘導針對患者源腫瘤細胞之Vγ9Vδ2 T細胞介導之細胞毒性,在與Vγ9Vδ2 T細胞及抗體之共培養環境中評價該等腫瘤細胞之生存力。測試腫瘤細胞之各種不同類型。
在獲得書面知情同意書之後,自Amsterdam UMC (地點:VUmc)處之癌症患者收集組織試樣(亦即衍生自結腸、腹膜及肝、頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)及非小細胞肺癌(NSCLC)之原發性及轉移性腫瘤物質)。使用手術刀(大小編號:22;Swann Morton Ltd)將組織切割成小切片,再懸浮於由補充有0.1% DNAse I、0.14%膠原酶A、5% FCS、100 IU/ ml青黴素鈉(sodium penicillin)、100 µg/ml硫酸鏈黴素(streptomycin sulfate)及2.0 mM L-麩醯胺酸之IMDM構成之解離培養基中,轉移至具有攪拌棒之無菌燒瓶中並在37℃水浴中於磁攪拌器上培育45分鐘。在培育之後,使細胞懸浮液通過100 µM細胞過濾器。將腫瘤解離三次,然後洗滌細胞以使用台盼藍(trypan blue)排除分析活細胞計數。
將經解離患者源腫瘤細胞與健康供體源Vγ9Vδ2 T細胞(1:1 E:T比率)在存在或不存在50 nM 7D12-5C8 (4小時)或7D12-5C8var1(Y105S)-Fc或gp120-5C8var1(Y105S)-Fc (24小時)下一起培育。
視需要在培養期之後使用胰蛋白酶-EDTA剝離黏附細胞並再懸浮於FACS緩衝液(PBS,補充有0.5%牛血清白蛋白及20 µg/ml NaN3)中,在4℃下與螢光染料標記抗體一起培育30分鐘,然後藉由流式細胞術使用LSR Fortessa XL-20 (BD)來量測染色。
根據製造商說明書使用活/死標記物7AAD與123counting eBeads
TM之組合來鑑別活細胞。使用Kaluza分析第1.3版(Beckman Coulter)及FlowJo第10.6.1及10.7.2版(Becton Dickinson)分析流式細胞術數據。
藉由一起培育經擴增健康供體源Vγ9Vδ2 T細胞與各種惡性腫瘤(原發性CRC、腹膜及肝中之CRC轉移、頭頸鱗狀細胞癌及非小細胞肺癌)之單細胞懸浮液來評價經7D12-5C8及7D12-5C8var1(Y105S)-Fc誘導之Vγ9Vδ2 T細胞介導之腫瘤細胞細胞毒性。
如
圖 13中所圖解說明,7D12-5C8誘導Vγ9Vδ2 T細胞對患者腫瘤細胞之實質性溶解(由7D12-5C8誘導之平均溶解%:原發性CRC 52.3%及p值0.0003,腹膜CRC 46.0%及p值0.0052,肝CRC 31.8%及p值0.0360,頭頸鱗狀細胞癌46.1%及p值0.0187以及非小細胞肺癌64.1%及p值0.0153)。
另外,如
圖 14中所展示,7D12-5C8var1(Y105S)-Fc誘導Vγ9Vδ2 T細胞對患者腫瘤細胞之顯著程度之溶解(由7D12-5C8var1 (Y105S)-Fc誘導之平均溶解%:71.2%及p <0.0001及0.0012)。對照化合物gp120-5C8var1(Y105S)-Fc不誘導任何可量測之腫瘤細胞溶解。
實例 17 : 用於非人類靈長類動物研究之構築體之設計、產生及純化
對於非人類靈長類動物中之活體內研究而言,生成具有與食蟹猴Vγ9 TCR鏈交叉反應之結合域之構築體(
圖 15)。此結合域係基於抗體7A5 (一種TCR Vγ9特異性抗體) (Janssen等人,J. Immunology 146(1) (1991), 35-39)。已發現,基於7A5之抗體會結合食蟹猴Vγ9Vδ2 T細胞(參見WO 2021/052995之實例1)。構築包含7A5及抗EGFR VHH 7D12var8之雙特異性含Fc抗體。該分子含有經改造以用於使用隆凸與孔洞技術(KiH;Carter等人,2001 Imm. Meth. 2001:248, 7;隆凸:T366W;孔洞:T366S、L368A及Y407V)進行異源二聚合之人類IgG1 Fc尾部。使7A5抗體之Vγ9結合scFv偶合至「隆凸」鏈;與KiH Fc對之「孔洞」鏈框內選殖結合EGFR之VHH 7D12var8。另外,將上鉸鏈改造成「AAASDKTHTCPPCP」 (SEQ ID NO:25)以去除通常橋接至CL之半胱胺酸(C220)並藉由將「EPK」變為「AAA」來引入較大撓性。改造CH2之N-末端部分以消除Fc受體(CD16、-32及-64)相互作用(沉默突變L234F、L235E),而維持FcRN結合。所得構築體稱為7A5-7D12var8-Fc。
藉由在HEK293E細胞中瞬時共轉染編碼兩條不同鏈之兩個質體來產生分子並藉由蛋白質A親和層析、隨後製備型粒徑篩析層析自培養上清液進行純化(實例1)。分子展示為以大約3毫微莫耳(nM)之表觀親和力結合至任一靶(使用ELISA測得)及重組形式之兩種抗原(
圖 16A- 圖 16B)。分子之功能性係藉由展示其引起經活體外擴增之Vγ9Vδ2 T細胞之靶依賴性活化(CD107a表現) (
圖 17A)及後續T細胞介導之腫瘤細胞溶解(
圖 17B)來予以證實。
實例 18 : 雙特異性抗體 7A5-7D12var8-Fc 在探索性多劑量非人類靈長類動物 (NHP: 食蟹猴 ) 研究中充分耐受
在多劑量探索性NHP研究中,分別以1mg/kg、5mg/kg及23mg/kg劑量向三隻雌性食蟹猴投與7A5-7D12var8-Fc。以半小時輸注在5mL/kg下給予抗體;投與4個每週輸注。向1及5mg/kg之前兩個劑量組(1隻動物/劑量)同時投藥且在三個(每週)劑量之後,使第三劑量組(23mg/kg)接受第一劑量。定期自動物提取血液以供PK分析、臨床化學參數分析、細胞介素含量量測及血細胞子組分析(藉由流式細胞術)。在給予最後劑量之後一天,對動物實施安樂死且收穫組織並備用於組織病理學檢驗及免疫組織化學(IHC)分析。
經治療動物之血液中7A5-7D12var8-Fc濃度之藥物動力學分析(以ELISA量測,
圖 18)揭示,抗體顯示IgG樣PK且半衰期介於84與127小時之間。在以1mg/kg投用之動物中,抗體在第三注射之後展示較短半衰期,此可能因為該動物中之可能抗藥物抗體(ADA)反應。
實驗清除率值介於0.36 mL/h/kg與0.72 mL/h/kg之間且分佈體積介於58.5 mL/kg與115.2 mL/kg之間。全身性暴露在1 mg/kg與23 mg/kg之間劑量比例性增加。然而,在重複投藥之後未觀察到累積。
可藉由IHC在不同組織(淋巴結、肌肉、皮膚及結腸)中檢測到化合物;如所預計,在該等組織中化合物染色具有劑量比例性強度(數據未展示)。血細胞之流式細胞術分析展示淋巴球之若干瞬時降低,該等瞬時降低通常觀察於該等種類之多劑量研究中且與程序相關。
圖 19A展示在投藥之後2小時每一時間點下T細胞計數之瞬時降低。然而,T細胞之數量在注射之後兩天返回基線值。
與之相比,周邊血中之Vγ9陽性T細胞數量有所降低且不恢復其先前頻率(
圖 19B)。該等細胞在研究過程中保持幾乎不存在,從而證實了化合物之特定藥效動力學效應。經治療動物之血液中之細胞介素量測展示,該治療引起極小細胞介素釋放且此幾乎僅限於使用化合物之第一注射。作為一實例,
圖 20展示所量測IL-6之含量。
作為一般結論,使用7A5-7D12var8-Fc之NHP治療極為耐受且不展示臨床毒性體徵。另外,在組織病理學分析中未發現任一檢驗器官之宏觀及微觀異常(數據未展示)。作為對比:抗EGFR x CD3 BiTE在31µg/kg/天之連續輸注之劑量下可使NHP致死(Lutterbuese等人,Proc Natl Acad Sci U S A 2010:107(28), 12605)。
實例 19 : 7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc 之穩定調配物
生成表現7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc之穩定CHO細胞純系且經由產生於生物反應器系統中來獲得抗體產物。在收穫及純化之後,以1 mg/mL及10 mg/mL之濃度使用4種類型之調配緩衝液(展示於表6中)來調配抗體產物。
表 6 :所測試配方之概述
緩衝液 | 配方 |
緩衝液 1 | 10 mM組胺酸 + 280 mM蔗糖 + 0.02%聚山梨醇酯80 (pH 6.0) + 1 mM甲硫胺酸 |
緩衝液 2 | 10 mM組胺酸 + 280 mM蔗糖 + 0.02%聚山梨醇酯80 (pH 6.0) |
緩衝液 3 | 10 mM乙酸鈉 + 280 mM蔗糖 + 0.02%聚山梨醇酯80 (pH 5.5) + 1 mM甲硫胺酸 |
緩衝液 4 | 10 mM乙酸鈉 + 280 mM蔗糖 + 0.02%聚山梨醇酯80 (pH 5.5) |
使經調配試樣經受若干儲存條件(定義於下文中)最長6週。另外,施加若干應力測試:
• 儲存於5℃ ± 3℃下
• 儲存於-80℃ ± 10℃下
• 25℃ ± 2℃/ 60%相對濕度(RH) ± 5%下之加速儲存條件
• 40℃ ± 2℃/ 75% RH ± 5%下之熱應力
• 冷凍/解凍循環:將試樣完全冷凍至-80 ± 10℃。隨後,在使試樣在室溫(15 - 25℃)下完全解凍之後實施5個冷凍/解凍循環。
• 攪動應力:將試樣以240 rpm在室溫(EP15℃ - 25℃)下攪動7天。
• 氧化:向試樣中摻加0.01% (v/v)過氧化氫(H
2O
2)並在室溫下培育24小時。
• 光穩定性:在25℃ ± 2℃/ 60% RH ± 5%下施加> 1.2百萬勒克司時(lux hour)及> 1000瓦特小時/平方米之近紫外線能量。
初始(= t0) 5℃ ± 3℃試樣用作參考。使用表7中所展示之下列分析方法來分析試樣。
表 7 : 用於調配物評價之分析程序
方法 | 評價 |
清澈度 | 外觀 |
色彩 | 外觀 |
pH | pH |
A 280(UV/VIS) | 含量 |
SE-HPLC | 完整性 |
陽離子交換(CIEX)-HPLC | 完整性 |
凝膠電泳十二烷基硫酸鈉(CE-SDS非還原) | 完整性 |
CE-SDS (還原) | 完整性 |
活性分析 - PSMA結合ELISA | 功效 |
肽定位 | 身份 |
差示掃描 | 完整性 |
液相層析-質譜(LC-MS) (氧化) | 完整性 |
在儲存溫度-80℃ ± 10℃、5℃ ± 3℃、25℃ ± 2℃ / 60% RH ± 5%及40℃ ± 2℃ / 75% RH ± 5%下清澈度、色彩、pH、A
280(UV-VIS)、SE-HPLC、CIEX-HPLC、CE-SDS及PSMA結合、差示掃描及肽指紋之隨時間穩定性研究之結果高度相當。量測結果指示,產物在每一所選緩衝液條件下較為穩定且僅隨時間觀察到輕微效應。另外,應力測試(冷凍/解凍(5個F/T循環)、光-、攪動-及氧化應力)之結果展示,產物在該等條件中之每一者下較為穩定。
在熱應力及氧化應力條件下檢測到區分緩衝液之主要效應。試樣保持於40℃ ± 2℃ / 75% RH ± 5%下之CIEX-HPLC分析展示,在所有所測試緩衝液及產物濃度中主要變體有所減少且酸性變體有所增加。然而,基於組胺酸之調配物展示低於基於乙酸酯之調配物之減少。另外,在氧化應力之後進行之LC-MS分析展示,添加甲硫胺酸可有效防止產物之氧化。
1 mg抗體/mL及10 mg抗體/mL調配物在溫度穩定性及氧化應力之後最受影響分析結果之概述分別展示於表8及9中。
總而言之,所測試之所有調配緩衝液皆視為適用於7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc。然而,在調配於緩衝液1中時,抗體最為穩定且變化幅度較小。
表 8 : 1 mg/mL 7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc 在調配物中之溫度穩定性及氧化應力穩定性之分析結果。
* 組胺酸 / 甲硫胺酸緩衝液中之氧化程度用於釋放參考 表 9 : 10 mg/mL 7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc 在調配物中之溫度穩定性及氧化應力穩定性之分析結果。
* 在 1 mg/mL 下組胺酸 / 甲硫胺酸緩衝液中之氧化程度用於釋放參考
緩衝液 | 分析 | 讀出 | 1 mg/ml | |||||||
釋放 | 2-8C | 25C | 40C | 氧化 | ||||||
0w | 3w | 6w | 3w | 6w | 3w | 6w | 受應力 | |||
乙酸鹽 | CIEX-HPLC | 主要(%) | NA | 70.4 | ||||||
酸性(%) | 11.5 | |||||||||
鹼性(%) | 18.1 | |||||||||
LC-MS | Lava223-M34* | 1.8 | NA | 12.1 | ||||||
Lava224-M34* | 1.8 | 3.2 | ||||||||
乙酸鹽/甲硫胺酸 | 一般 | 含量(mg/ml) | 1.1 | 1.1 | 1.1 | 1.1 | 1.1 | 1.1 | 1.1 | NA |
pH | 5.6 | 5.7 | 5.6 | 5.6 | 5.6 | 5.7 | 5.6 | |||
SE-HPLC | 主峰(%) | 99.6 | 99.1 | 99.0 | 99.1 | 99.0 | 99.2 | 99.0 | NA | |
HMW (%) | 0.4 | 0.9 | 1.0 | 0.9 | 1.0 | 0.7 | 0.7 | |||
LMW (%) | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.1 | 0.3 | |||
CIEX-HPLC | 主要(%) | 79.8 | 79.9 | 79.7 | 77.4 | 75.4 | 64.4 | 50.8 | 73.6 | |
酸性(%) | 13.7 | 14.1 | 14.2 | 16.3 | 18.1 | 28.7 | 42.4 | 11.8 | ||
鹼性(%) | 6.4 | 6.0 | 6.1 | 6.4 | 6.5 | 6.8 | 6.8 | 14.6 | ||
LC-MS | Lava223-M34* | 1.8 | NA | 11.8 | ||||||
Lava224-M34* | 1.8 | 3.1 | ||||||||
組胺酸 | CIEX-HPLC | 主要(%) | NA | 70.6 | ||||||
酸性(%) | 11.3 | |||||||||
鹼性(%) | 18.1 | |||||||||
LC-MS | Lava223-M34* | 1.8 | NA | 11.8 | ||||||
Lava224-M34* | 1.8 | 2.9 | ||||||||
組胺酸/甲硫胺酸 | 一般 | 含量(mg/ml) | 1.0 | 1.0 | 1.1 | 1.1 | 1.1 | 1.1 | 1.1 | NA |
pH | 5.9 | 6.0 | 5.9 | 6.0 | 5.9 | 6.0 | 5.9 | |||
SE-HPLC | 主峰(%) | 99.7 | 99.3 | 99.2 | 99.2 | 99.2 | 99.2 | 99.1 | NA | |
HMW (%) | 0.3 | 0.7 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.6 | 0.6 | |||
LMW (%) | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.1 | 0.3 | |||
CIEX-HPLC | 主要(%) | 80.4 | 80.2 | 80.3 | 78.0 | 76.5 | 65.7 | 54.6 | 74.4 | |
酸性(%) | 13.6 | 14.2 | 14.3 | 16.2 | 17.7 | 27.6 | 38.9 | 11.8 | ||
鹼性(%) | 5.9 | 5.6 | 5.4 | 5.8 | 5.8 | 6.8 | 6.6 | 13.9 | ||
LC-MS | Lava223-M34* | 1.8 | NA | 10.3 | ||||||
Lava224-M34* | 1.8 | 2.8 |
緩衝液 | 分析 | 讀出 | 10 mg/ml | |||||||
釋放 | 2-8C | 25C | 40C | 氧化 | ||||||
0w | 3w | 6w | 3w | 6w | 3w | 6w | 受應力 | |||
乙酸鹽 | CIEX-HPLC | 主要(%) | NA | 70.5 | ||||||
酸性(%) | 11.3 | |||||||||
鹼性(%) | 18.2 | |||||||||
LC-MS | Lava223-M34* | 1.8 | NA | 11.6 | ||||||
Lava224-M34* | 1.8 | 3.3 | ||||||||
乙酸鹽/甲硫胺酸 | 一般 | 含量(mg/ml) | 10.6 | 10.6 | 10.6 | 10.7 | 10.6 | 10.8 | 10.7 | NA |
pH | 5.6 | 5.6 | 5.6 | 5.6 | 5.6 | 5.6 | 5.6 | |||
SE-HPLC | 主峰(%) | 99.5 | 99.4 | 99.4 | 99.4 | 99.3 | 98.9 | 98.3 | NA | |
HMW (%) | 0.5 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.7 | 1.0 | 1.3 | |||
LMW (%) | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.1 | 0.3 | |||
CIEX-HPLC | 主要(%) | 80.2 | 79.9 | 79.9 | 76.1 | 75.3 | 63.7 | 50.0 | 73.3 | |
酸性(%) | 13.6 | 14.0 | 14.2 | 16.1 | 17.9 | 28.5 | 42.2 | 11.7 | ||
鹼性(%) | 6.2 | 6.1 | 6.1 | 7.9 | 6.8 | 7.8 | 7.8 | 15.0 | ||
LC-MS | Lava223-M34* | 1.8 | NA | 10.2 | ||||||
Lava224-M34* | 1.8 | 2.9 | ||||||||
組胺酸 | CIEX-HPLC | 主要(%) | NA | 70.8 | ||||||
酸性(%) | 11.2 | |||||||||
鹼性(%) | 18.0 | |||||||||
LC-MS | Lava223-M34* | 1.8 | NA | 11.4 | ||||||
Lava224-M34* | 1.8 | 3.0 | ||||||||
組胺酸/甲硫胺酸 | 一般 | 含量(mg/ml) | 10.4 | 10.4 | 10.5 | 10.6 | 10.3 | 10.9 | 10.5 | NA |
pH | 5.9 | 6.0 | 5.9 | 6.0 | 5.9 | 6.0 | 5.9 | |||
SE-HPLC | 主峰(%) | 99.6 | 99.5 | 99.5 | 99.4 | 99.3 | 98.9 | 98.5 | NA | |
HMW (%) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.9 | 1.2 | |||
LMW (%) | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.1 | 0.3 | |||
CIEX-HPLC | 主要(%) | 80.3 | 79.8 | 80.1 | 77.1 | 76.3 | 65.7 | 54.8 | 73.4 | |
酸性(%) | 13.6 | 14.1 | 14.2 | 15.8 | 17.4 | 27.0 | 38.0 | 11.7 | ||
鹼性(%) | 6.1 | 6.1 | 5.7 | 7.1 | 6.2 | 7.3 | 7.1 | 14.9 | ||
LC-MS | Lava223-M34* | 1.8 | NA | 10.5 | ||||||
Lava224-M34* | 1.8 | 3.0 |
圖 1展示使用Superdex-75管柱之經蛋白質A純化之LAVA化合物(展示VHH 5C8)之粒徑篩析特徵的代表性層析圖。彙集主要單體峰之級分(級分1E11-1G2)並量化。
圖 2展示經純化VHH 5C8之labchip聚丙烯醯胺凝膠電泳之代表性實例。左側:非還原條件;右側:還原條件。
圖 3A- 圖 3B展示經純化VHH 5C8 (圖3A)及VHH 5C8var1 (圖3B)之HP-SEC特徵。
圖 4A- 圖 4B展示經純化雙特異性VHH (bsVHH) 1D12var5-5C8var1之代表性HP-SEC特徵。
圖 4A :表現自巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)培養物之上清液並藉由蛋白質A親和層析純化之bsVHH 1D12var5-5C8var1批次。
圖 4B :表現自HEK-293 E細胞並藉由蛋白質A及粒徑篩析層析純化之bsVHH 1D12var5-5C8var1批次。
圖 5展示經純化VHH 5C8var1-Y105F及5C8var1-Y105S在非還原條件下之Labchip分析。
圖 6A- 圖 6B展示VHH 5C8var1-Y105F (
圖 6A)及5C8var1-Y105S (
圖 6B)之HP-SEC分析。
Fig 7A- 圖 7C展示使用BLI對結合至重組Vγ9Vδ2-TCR蛋白之VHH片段之親和力量測。繪製隨時間而變化之蛋白質質量(反應,以nm表示)。垂直虛線分隔締合期(左側)與解離期(右側)。VHH 5C8var1 (
圖 7A);VHH 5C8var1-Y105F (
圖 7B);VHH 5C8var1-Y105S (
圖 7C)。黑色直線代表實際量測反應之擬合數據。
圖 8A- 圖 8D展示,bsVHH 7D12var8-5C8var1-Y105F及bsVHH 7D12-5C8皆誘導強效Vγ9Vδ2 T細胞活化並引起Vγ9Vδ2 T細胞介導之腫瘤細胞溶解。
圖 8A- 圖 8B展示4小時去粒分析:繪製隨所用抗體濃度(7D12-5C8 (非人類化) (
圖 8A)或7D12var8-5C8var1-Y105F (
圖 8B))而變化之CD107A (LAMP-1)+ Vγ9Vδ2 T細胞之百分比。
圖 8C- 圖 8D展示24小時細胞毒性分析,該分析展示隨所用抗體濃度(7D12-5C8 (非人類化) (
圖 8C)或7D12var8-5C8var1-Y105F (
圖 8D))而變化之A431腫瘤細胞殺死之百分比。
圖 9展示使用流式細胞術測得之7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc與自健康人類PBMC分離之原代γδ T細胞之結合。兩個圖代表兩種不同供體。
圖 10A- 圖 10C分別展示HT29 (
圖 10A)、A-431 (
圖 10B)及HCT-116 (
圖 10C)細胞中藉由基於細胞之ELISA測得之腫瘤細胞上7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc與EGFR之結合。
圖 11展示依賴於A431細胞系之藉由7D12var8-5C8var1(Y105F)-Fc誘導之患者源γδ T細胞之去粒。
圖 12展示與患者源γδ T細胞及7D12-5C8一起共培養之A-388細胞之生存力。
圖 13展示經解離腫瘤細胞懸浮液(原發性CRC:n=10,腹膜腔CRC轉移:n=5,肝CRC轉移:n=3,原發性HNSCC:n=5,及反應性NSCLC:n=4)與健康供體源Vγ9Vδ2 T細胞(1:1 E:T比率)及7D12-5C8 (50 nM)或培養基對照之4小時培養後之經溶解腫瘤細胞。
圖 14展示經解離腫瘤細胞懸浮液(腹膜腔CRC轉移:n=4)與健康供體源Vγ9Vδ2 T細胞(1:1 E:T比率)及7D12-5C8var1(Y105S)-Fc (50 nM)、gp120-5C8var1(Y105S)-Fc (50 nM)或培養基對照之24小時培養後之溶解腫瘤細胞。
圖 15展示用於非人類靈長類動物研究之構築體之結構。
圖 16A- 圖 16B展示7A5-7D12var8-Fc與EGFR (
圖 16A)及TCR (
圖 16B)抗原靶之結合。
圖 17A- 圖 17B展示藉由7A5-7D12var8-Fc介導之去粒(
圖 17A)及細胞毒性(
圖 17B)。
圖 18展示三隻經治療動物之血液中7A5-7D12var8-Fc濃度之PK分析。展示證實分子具有IgG樣PK之濃度-時間曲線。
圖 19A- 圖 19B展示經治療動物之血液中T細胞之總數(CD3+,
圖 19A)及Vγ9陽性細胞之數量(以CD3+群體之百分比形式) (
圖 19B)。箭頭指示使用化合物之注射。圖例中之數字係經治療猴之數量。
圖 20展示經治療動物之血液中隨時間而變化之IL-6細胞介素含量。僅觀察到低含量之細胞介素,且釋放主要限於第一注射之後。箭頭指示治療時刻。
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Claims (64)
- 一種醫藥組合物,其包含: (a)抗體,其包含能夠結合人類EGFR且包含SEQ ID NO:5之CDR1序列、SEQ ID NO:6之CDR2序列及SEQ ID NO:7之CDR3序列之第一抗原結合區; (b) 5-20 mM組胺酸,其中該組合物具有介於5.5與6.5之間之pH;或5-20 mM乙酸鈉,其中該組合物具有介於5.0與6.0之間之pH, (c) 250-350 mM蔗糖; (d) 0.01% - 0.05% (w/v)聚山梨醇酯80;及 (e) 0-20 mM甲硫胺酸。
- 如請求項1之醫藥組合物,其中該組合物包含5-20 mM組胺酸,其中該組合物具有介於5.5與6.5之間之pH。
- 如請求項1或2之醫藥組合物,其中該組合物包含10 mM組胺酸。
- 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含介於250 mM與300 mM之間之蔗糖。
- 如請求項1至4中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含280 mM蔗糖。
- 如請求項1至5中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含介於0.01%與0.03%之間之聚山梨醇酯80。
- 如請求項1至6中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含0.02%聚山梨醇酯80。
- 如請求項1至7中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含介於0.5 mM與20 mM之間之甲硫胺酸。
- 如請求項1至8中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含1 mM甲硫胺酸。
- 如請求項1至9中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含10 mM組胺酸、280 mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酯80、pH 6.0及1 mM甲硫胺酸。
- 如請求項1至11中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含介於0.2 mg/mL與20 mg/mL之間之該抗體。
- 如請求項1至11中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含1或10 mg/mL之該抗體。
- 如請求項1至12中任一項之醫藥組合物,其中該第一抗原結合區係單域抗體。
- 如請求項1至13中任一項之醫藥組合物,其中該第一抗原結合區係單域抗體且其中該第一抗原結合區較佳地包含以下或由以下組成: a. SEQ ID NO:8中所示之序列,或 b. 與SEQ ID NO:8中所示之序列具有至少90%、例如至少92%、例如至少94%、例如至少96%、例如至少98%序列一致性之序列。
- 如請求項1至14中任一項之醫藥組合物,其中該抗體進一步包含第二抗原結合區且其中該第二抗原結合區較佳係單域抗體。
- 如請求項15之醫藥組合物,其中該抗體係雙特異性抗體且包含能夠結合人類Vδ2之第二抗原結合區。
- 如請求項16之醫藥組合物,其中該第二抗原結合區包含SEQ ID NO:1之CDR1序列、SEQ ID NO:2之CDR2序列及SEQ ID NO:3之CDR3序列。
- 如請求項17之醫藥組合物,其中該第二抗原結合區包含以下或由以下組成: a. SEQ ID NO:4,或 b. 與SEQ ID NO:4具有至少90%、例如至少92%、例如至少94%、例如至少96%、例如至少98%序列一致性之序列。
- 如請求項17之醫藥組合物,其中SEQ ID NO:1之X1係S且其中SEQ ID NO:3之X2係F或S。
- 如請求項19之醫藥組合物,其中該CDR1序列包含SEQ ID NO:21,該CDR2序列包含SEQ ID NO:2,且該CDR3序列包含SEQ ID NO:19。
- 如請求項20之醫藥組合物,其中該第二抗原結合區包含SEQ ID NO: 23或由其組成。
- 如請求項19之醫藥組合物,其中該CDR1序列包含SEQ ID NO:21,該CDR2序列包含SEQ ID NO:2,且該CDR3序列包含SEQ ID NO:20。
- 如請求項22之醫藥組合物,其中該第二抗原結合區包含SEQ ID NO: 24或由其組成。
- 一種醫藥組合物,其包含: (a) 1 mg/mL或10 mg/mL抗體,其包含能夠結合人類EGFR且包含SEQ ID NO:5中所示之CDR1序列、SEQ ID NO:6中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:7中所示之CDR3序列之第一抗原結合區; (b) 10 mM組胺酸, (c) 280 mM蔗糖, (d) 0.02%聚山梨醇酯80, (e) pH 6.0,及 (f) 1 mM甲硫胺酸。
- 如請求項24之醫藥組合物,其中該第一抗原結合區係單域抗體且其中該第一抗原結合區較佳地包含SEQ ID NO:8或由其組成。
- 如請求項24或25之醫藥組合物,其中該抗體係雙特異性抗體且包含能夠結合人類Vδ2之第二抗原結合區。
- 如請求項24至26中任一項之醫藥組合物,其中該第二抗原結合區包含SEQ ID NO:4或由其組成。
- 如請求項24至26中任一項之醫藥組合物,其中該第二抗原結合區包含SEQ ID NO:23或由其組成。
- 如請求項24至26中任一項之醫藥組合物,其中該第二抗原結合區包含SEQ ID NO:24或由其組成。
- 一種醫藥組合物,其包含: (a)抗體,其包含能夠結合人類Vδ2且包含SEQ ID NO:1中所示之CDR1序列、SEQ ID NO:2中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:3中所示之CDR3序列之第一抗原結合區; (b) 5-20 mM組胺酸,其中該組合物具有介於5.5與6.5之間之pH;或5-20 mM乙酸鈉,其中該組合物具有介於5.0與6.0之間之pH, (c) 250-350 mM蔗糖; (d) 0.01% - 0.05% (w/v)聚山梨醇酯80;及 (e) 0-20 mM甲硫胺酸。
- 如請求項30之醫藥組合物,其中該組合物包含5-20 mM組胺酸,其中該組合物具有介於5.5與6.5之間之pH。
- 如請求項30或31之醫藥組合物,其中該組合物包含10 mM組胺酸。
- 如請求項30至32中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含介於250 mM與300 mM之間之蔗糖。
- 如請求項30至33中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含280 mM蔗糖。
- 如請求項30至34中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含介於0.01%與0.03%之間之聚山梨醇酯80。
- 如請求項30至35中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含0.02%聚山梨醇酯80。
- 如請求項30至36中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含介於0.5 mM與20 mM之間之甲硫胺酸。
- 如請求項30至37中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含1 mM甲硫胺酸。
- 如請求項30至38中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含10 mM組胺酸、280 mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酯80、pH 6.0及1 mM甲硫胺酸。
- 如請求項30至39中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含介於0.2 mg/mL與20 mg/mL之間之該抗體。
- 如請求項30至40中任一項之醫藥組合物,其中該組合物包含1或10 mg/mL之該抗體。
- 如請求項30至41中任一項之醫藥組合物,其中該第一抗原結合區包含SEQ ID NO:4或與SEQ ID NO:4中所示之序列具有至少90%、例如至少92%、例如至少94%、例如至少96%、例如至少98%序列一致性之序列,或由其組成。
- 如請求項30至42中任一項之醫藥組合物,其中SEQ ID NO:1之X1係S且其中SEQ ID NO:3之X2係F或S。
- 如請求項43之醫藥組合物,其中該CDR1序列包含SEQ ID NO:21,該CDR2序列包含SEQ ID NO:2,且該CDR3序列包含SEQ ID NO:19。
- 如請求項44之醫藥組合物,其中該第一抗原結合區包含SEQ ID NO: 23或由其組成。
- 如請求項43之醫藥組合物,其中該CDR1序列包含SEQ ID NO:21,該CDR2序列包含SEQ ID NO:2,且該CDR3序列包含SEQ ID NO:20。
- 如請求項46之醫藥組合物,其中該第一抗原結合區包含SEQ ID NO: 24或由其組成。
- 如請求項30至47中任一項之醫藥組合物,其中該抗體進一步包含能夠結合人類EGFR且包含SEQ ID NO:5中所示之CDR1序列、SEQ ID NO:6中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:7中所示之CDR3序列之第二抗原結合區。
- 如請求項48之醫藥組合物,其中該第二抗原結合區係單域抗體,且其中該第一抗原結合區較佳地包含SEQ ID NO:8或與SEQ ID NO:8具有至少90%、例如至少92%、例如至少94%、例如至少96%、例如至少98%序列一致性之序列,或由其組成。
- 一種醫藥組合物,其包含: (a) 1 mg/mL或10 mg/mL抗體,其包含能夠結合人類Vδ2且包含SEQ ID NO:1中所示之CDR1序列、SEQ ID NO:2中所示之CDR2序列及SEQ ID NO:3中所示之CDR3序列之第一抗原結合區; (b) 10 mM組胺酸, (c) 280 mM蔗糖, (d) 0.02%聚山梨醇酯80, (e) pH 6.0,及 (f) 1 mM甲硫胺酸。
- 如請求項50之醫藥組合物,其中該第一抗原結合區係單域抗體且其中該第一抗原結合區較佳地包含SEQ ID NO:4或由其組成。
- 如請求項50至51中任一項之醫藥組合物,其中SEQ ID NO:1之X1係S且其中SEQ ID NO:3之X2係F或S。
- 如請求項52之醫藥組合物,其中該CDR1序列包含SEQ ID NO:21,該CDR2序列包含SEQ ID NO:2,且該CDR3序列包含SEQ ID NO:19。
- 如請求項53之醫藥組合物,其中該第一抗原結合區包含SEQ ID NO: 23或由其組成。
- 如請求項52之醫藥組合物,其中該CDR1序列包含SEQ ID NO:21,該CDR2序列包含SEQ ID NO:2,且該CDR3序列包含SEQ ID NO:20。
- 如請求項55之醫藥組合物,其中該第一抗原結合區包含SEQ ID NO: 24或由其組成。
- 如請求項50至56中任一項之醫藥組合物,其中該抗體係雙特異性抗體且包含能夠結合人類EGFR之第二抗原結合區。
- 如請求項57之醫藥組合物,其中該第二抗原結合區包含SEQ ID NO: 8或由其組成。
- 如請求項1至58中任一項之醫藥組合物,其中該抗體進一步包含Fc區,其中該Fc區較佳係包含兩個Fc多肽之異二聚體,其中該第一抗原結合區融合至第一Fc多肽且該第二抗原結合區融合至第二Fc多肽,且其中該等第一及第二Fc多肽包含較形成同二聚體偏好於形成異二聚體之不對稱胺基酸突變,其中較佳地該等Fc多肽之CH3區域包含該等不對稱胺基酸突變,且其中較佳地該第一Fc多肽包含T366W取代且該第二Fc多肽包含T366S、L368A及Y407V取代,或反之亦然,其中胺基酸位置對應於人類IgG1,根據EU編號系統。
- 如請求項59之醫藥組合物,其中該等第一及第二Fc多肽包含突變在位置234及/或235,較佳地該等第一及第二Fc多肽包含L234F及L235E取代,其中胺基酸位置對應於人類IgG1,根據EU編號系統。
- 如請求項59或60之醫藥組合物,其中 a. 該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:11中所示之序列且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:12中所示之序列,或 b. 該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:12中所示之序列且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:11中所示之序列。
- 如請求項1至61中任一項之醫藥組合物,其中該抗體包含SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17中所示之序列或由其組成,或包含SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18中所示之序列或由其組成。
- 一種治療個體之癌症之方法,該方法包含向該個體投與如請求項1至62中任一項之醫藥組合物。
- 如請求項1至62中任一項之醫藥組合物,其用作藥劑,較佳地用於治療癌症。
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