JP4953547B2 - Ginsenoside glycosidase hydrolyzing ginsenoside sugar group and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、薬用人参（ginseng）中における含量が高いジンセノサイド（ginsenoside）の糖基を加水分解して、稀有なジンセノサイドを製造するジンセノサイド グルコシダーゼに関する。また、本発明は、該ジンセノサイド グリコシダーゼの使用に関する。 The present invention relates to a ginsenoside glucosidase which produces a rare ginsenoside by hydrolyzing the sugar group of ginsenoside having a high content in ginseng. The present invention also relates to the use of the ginsenoside glycosidase.
薬用人参は、有名な植物薬であり、古代から東洋の国々において高価な伝統薬として使用されてきた。薬として使用される主な薬用人参植物は、朝鮮人参（Panax ginseng C.A. Meyer）、米国人参（Panax quinquefolium L.）、三七参（Panax natoginseng）、竹節参（Panax japonicus）及びPanax属のその他の種である。 Ginseng is a famous herbal medicine and has been used as an expensive traditional medicine in ancient countries since ancient times. The main medicinal ginseng plants used as medicines are Panax ginseng CA Meyer, American ginseng (Panax quinquefolium L.), Sanxan ginseng (Panax natoginseng), Bamboo ginseng (Panax japonicus) and other Panax genus It is a seed.
薬用人参植物中の重要な生理学的有効成分のひとつはサポニン（ジンセノサイドと呼ばれる）で、30種以上のジンセノサイドが知られている。ジンセノサイドは3種類、即ち、プロトパナキサジオール系（PPD）、プロトパナキサトリオール系（PPT）及びオレアノール酸系のサポニンに分類することができる。ジンセノサイド Ra1, Ra2, Ra3, Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, F2, Rg3, Rg5, Rh2及びRh3は、プロトパナキサジオール系のジンセノサイドで、ジンセノサイド Re, Rg1, Rg2, Rg4, Rh1及びRh4は、プロトパナキサトリオール系のジンセノサイドである。Roはオレアノール酸系のサポニンである。ジンセノサイド Ra1, Ra2, Ra3, Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, F2, Re及びRg1は、ダンマラン(dammarane)-20(S)-サポニンであるが、ジンセノサイド Rg3, Rh2, Rg2及びRh1は、20(S)-型及び20(R)-型を持つ。主要なジンセノサイドの構造は以下の通りである。 One important physiological active ingredient in ginseng plants is saponin (called ginsenoside), and more than 30 types of ginsenoside are known. Ginsenoside can be classified into three types: protopanaxadiol (PPD), protopanaxatriol (PPT) and oleanolic acid saponins. Ginsenoside Ra 1 , Ra 2 , Ra 3 , Rb 1 , Rb 2 , Rb 3 , Rc, Rd, F 2 , Rg 3 , Rg 5 , Rh 2 and Rh 3 are protopanaxadiol-based ginsenosides, and ginsenoside Re , Rg 1 , Rg 2 , Rg 4 , Rh 1 and Rh 4 are protopanaxatriol-based ginsenosides. Ro is an oleanolic acid saponin. Ginsenoside Ra 1 , Ra 2 , Ra 3 , Rb 1 , Rb 2 , Rb 3 , Rc, Rd, F 2 , Re and Rg 1 are dammarane-20 (S) -saponin, but ginsenoside Rg 3 , Rh 2 , Rg 2 and Rh 1 have a 20 (S) -type and a 20 (R) -type. The main ginsenoside structure is as follows.
薬用人参中での含量が高いジンセノサイドは、Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re及びRg1であり、その他のジンセノサイド Rg3, Rg2, Rg5, Rh2, Rh1, Rh3, Rh4等は、紅参又は野山参にのみ見られる珍しいジンセノサイドである。これらの稀有ジンセノサイドは、しばしば特有の生理活性を有している。例えば、ジンセノサイド Rh2, Rh3, Rg3及びRh1は、良好な抗癌作用を有し、副作用がない。ジンセノサイド Rg3及びRg2は、抗血栓作用を有する。従って、これらの稀有ジンセノサイドは、薬品及び健康食品において重要な適用性を有する。しかし、これらの稀有ジンセノサイドは、紅参及び野山参中での含量が少ないため、紅参及び野山参から得ることは非常に困難である。 Ginsenosides with high content in ginseng are Ra, Rb 1 , Rb 2 , Rc, Rd, Re and Rg 1 and other ginsenosides Rg 3 , Rg 2 , Rg 5 , Rh 2 , Rh 1 , Rh 3 , Rh 4 etc. are rare ginsenosides found only in red ginseng or Noyama ginseng. These rare ginsenosides often have unique physiological activities. For example, ginsenoside Rh 2 , Rh 3 , Rg 3 and Rh 1 have good anticancer activity and no side effects. Ginsenoside Rg 3 and Rg 2 have antithrombotic action. Therefore, these rare ginsenosides have important applicability in medicines and health foods. However, these rare ginsenosides are very difficult to obtain from red ginseng and nosan ginseng because of their low content in red ginseng and nosan ginseng.
ジンセノサイド Rh2などの稀有なジンセノサイドを得るため、化学合成が試みられているが、収率が非常に低い（劉維差（Liu Weicha）等、陽薬学院学報（Journal of Shenyang Medical College）1, 14, 1988）。アルカリ又は酸で加水分解することによって稀有ジンセノサイドを得ることも提案されている（N. Kondo et al., Chem. Pharm. Bull., 21, 2702, 1973)。しかし、この方法は反応選択性が乏しく収率が低い。また、日本の研究者等が、ヒトの腸内におけるジンセノサイドの代謝について研究している（M. Kanaoka et al., J. Traditional Medicine, 11, 241, 1994）。 Chemical synthesis has been attempted to obtain rare ginsenosides such as ginsenoside Rh 2, but the yield is very low (Liu Weicha et al., Journal of Shenyang Medical College) 1 , 14, 1988). It has also been proposed to obtain rare ginsenosides by hydrolysis with alkali or acid (N. Kondo et al., Chem. Pharm. Bull., 21, 2702, 1973). However, this method has poor reaction selectivity and a low yield. Japanese researchers are studying ginsenoside metabolism in the human intestine (M. Kanaoka et al., J. Traditional Medicine, 11, 241, 1994).
稀有なジンセノサイドの大規模生産において、今日まで満足な結果は得られておらず、それゆえ、稀有なジンセノサイドの大規模生産のための新たな方法が未だ求められている。本発明者等は、微生物、薬用人参植物、小麦のフスマ、アーモンド、麦芽及び動物の肝臓から、ジンセノサイドの糖基を加水分解することができる新規な酵素を見出した。このような酵素は、ジンセノサイド グルコシダーゼ（又はジンセノシダーゼ）と名付けられ、薬用人参中に高い含量で存在するジンセノサイド Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re及びRg1を加水分解することができ、それゆえ稀有ジンセノサイドの大規模生産において有用である。 In large-scale production of rare ginsenosides, satisfactory results have not been obtained to date, and therefore new methods for large-scale production of rare ginsenosides are still sought. The present inventors have discovered a novel enzyme capable of hydrolyzing the sugar group of ginsenoside from microorganisms, ginseng plants, wheat bran, almonds, malt and animal liver. Such an enzyme is named ginsenoside glucosidase (or ginsenosidase) and can hydrolyze ginsenoside Ra, Rb 1 , Rb 2 , Rc, Rd, Re and Rg 1 present in high content in ginseng, Therefore, it is useful in large-scale production of rare ginsenosides.
従って、本発明の目的は、ジンセノサイドの糖基を加水分解して、稀有なジンセノサイドを製造することができる新しい種類の酵素を提供することにある。該酵素は、ジンセノサイド グリコシダーゼと称されるものである。
本発明のさらなる目的は、本発明のジンセノサイド グリコシダーゼの様々な使用を提供することにある。
Accordingly, an object of the present invention is to provide a new type of enzyme capable of producing a rare ginsenoside by hydrolyzing the sugar group of ginsenoside. The enzyme is called ginsenoside glycosidase.
It is a further object of the present invention to provide various uses of the ginsenoside glycosidase of the present invention.
本発明は、ジンセノサイドの糖基を加水分解して稀有ジンセノサイドを生産することができる新規な酵素に関する。該酵素はジンセノサイド グルコシダーゼと呼ばれる。本発明の酵素は、微生物、薬用人参植物、小麦のフスマ、アーモンド、麦芽及び動物の肝臓から得ることができる。該酵素を使用することによって、薬用人参中での含量が高いジンセノサイド Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1等のジンセノサイドを加水分解して、ジンセノサイド Rh1, Rh2, C-K, Rg2, Rg3, F2, Rd等の珍しいジンセノサイド及びアグリコンを得ることができ、このようにして、紅参及び野山参の中にのみ存在するこれらの稀有ジンセノサイド及びその他の稀有ジンセノサイドを大量に製造することができる。 The present invention relates to a novel enzyme capable of producing a rare ginsenoside by hydrolyzing the sugar group of ginsenoside. The enzyme is called ginsenoside glucosidase. The enzyme of the present invention can be obtained from microorganisms, ginseng plants, wheat bran, almonds, malt and animal liver. By using the enzyme, ginsenosides such as Ra, Rb 1 , Rb 2 , Rc, Rd, Re, Rg 1 and the like having a high content in ginseng are hydrolyzed to form ginsenoside Rh 1 , Rh 2 , CK , Rg 2 , Rg 3 , F 2 , Rd and other rare ginsenosides and aglycones can be obtained, and in this way, a large amount of these rare ginsenosides and other rare ginsenosides present only in red ginseng and nosan ginseng Can be manufactured.
本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、その酵素反応によって、４つのグループ、即ち、ジンセノサイド グリコシダーゼ Ｉ、ジンセノサイド グリコシダーゼ II、ジンセノサイド グリコシダーゼ III及びジンセノサイド−α−ラムノシダーゼに分類することができる。
ジンセノサイド グリコシダーゼ Ｉは、ジンセノサイド Ra, Rb1, Rb2, Rc及びRdのβ−グルコシド結合、β−キシロシド結合及びα−アラビノシド結合を加水分解することができる。
ジンセノサイド グリコシダーゼ IIは、ジンセノサイド Ra, Rb1, Rb2, Rc及びRdのC-20（第20炭素原子）におけるβ−グルコシド結合、β−キシロシド結合及びα−アラビノシド結合を加水分解して、ジンセノサイド Rdを与えることができる。
ジンセノサイド グリコシダーゼ IIIは、ジンセノサイド RdのC-3におけるアグリコンと糖基との間のグリコシド結合を加水分解して、ジンセノサイド C-Kを与えることができる。
ジンセノサイド−α−ラムノシダーゼは、ジンセノサイド Re及びRg2それぞれのC-6におけるα−ラムノシド結合を加水分解して、ジンセノサイドRg1及びRh1それぞれを与えることができる。
The ginsenoside glucosidases of the present invention can be classified into four groups, namely ginsenoside glycosidase I, ginsenoside glycosidase II, ginsenoside glycosidase III and ginsenoside-α-rhamnosidase, depending on the enzymatic reaction.
Ginsenoside glycosidase I, the ginsenoside Ra, Rb 1, Rb 2, Rc and Rd of beta-glucosidic bonds, beta-xyloside bonds and α- arabinoside couple can be hydrolyzed.
Ginsenoside glycosidase II hydrolyzes the β-glucoside bond, β-xyloside bond and α-arabinoside bond at C-20 (20th carbon atom) of ginsenoside Ra, Rb 1 , Rb 2 , Rc and Rd to produce ginsenoside Rd Can be given.
Ginsenoside glycosidase III can hydrolyze the glycosidic bond between the aglycone and sugar group at C-3 of ginsenoside Rd to give ginsenoside CK.
Ginsenoside-α-rhamnosidase can hydrolyze the α-rhamnoside bond at C-6 of ginsenoside Re and Rg 2 respectively to give ginsenoside Rg 1 and Rh 1 respectively.
上記の４種のジンセノサイド グルコシダーゼのうちの１種以上を使用して、ジンセノサイド Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1等の薬用人参植物中での含量が高いジンセノサイドを加水分解して、稀有なジンセノサイドを製造することができる。 Using one or more of the above 4 kinds of ginsenoside glucosidase, ginsenoside Ra, Rb 1, Rb 2, Rc, Rd, Re, the content of at ginseng plant such Rg 1 high ginsenosides hydrolysis Thus, a rare ginsenoside can be produced.
本発明は、さらに、本発明のジンセノサイド グルコシダーゼの使用に関する。例えば、本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、薬用人参植物中での含量が高いジンセノサイド及びその他の入手が容易なジンセノサイドを処理して、稀有で有用なジンセノサイドを製造するのに用いることができる。本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、ジンセノサイド全体を処理して、稀有ジンセノサイド含量が高い混合ジンセノサイドを製造するのに用いることもできる。本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、薬用人参粉末を処理して、稀有ジンセノサイドの含量が高い薬用人参製品を製造するのに用いることもできる。 The invention further relates to the use of the ginsenoside glucosidase of the invention. For example, the ginsenoside glucosidase of the present invention can be used to produce rare and useful ginsenosides by treating ginsenoside with a high content in ginseng plants and other easily available ginsenosides. The ginsenoside glucosidase of the present invention can also be used to treat mixed ginsenoside to produce mixed ginsenoside with a high content of rare ginsenoside. The ginsenoside glucosidase of the present invention can also be used to produce medicinal carrot products with a high content of rare ginsenoside by treating ginseng powder.
本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、従来のセルラーゼ又はヘミセルラーゼと以下の点で異なる。即ち、セルラーゼ又はヘミセルラーゼは、セルロース及びヘミセルロース等の多糖のグリコシド結合を加水分解するのみであるのに対して、本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、薬用人参ダンマラングリコシド結合を加水分解する。例えば、β−グルコシダーゼ（EC3.2.1.21）は、セルロース及びセロビオースのβ−グリコシド結合を加水分解するが、ジンセノサイドのC-3原子におけるβ−グリコシド結合をほとんど加水分解しない。この理由は、従来のセルラーゼ及びヘミセルラーゼは多糖のグリコシド結合を加水分解するが、本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは30個の炭素原子を有するグリコシドのグリコシド結合を加水分解することにある。 The ginsenoside glucosidase of the present invention differs from the conventional cellulase or hemicellulase in the following points. That is, cellulase or hemicellulase only hydrolyzes glycoside bonds of polysaccharides such as cellulose and hemicellulose, whereas ginsenoside glucosidase of the present invention hydrolyzes ginseng dammaran glycoside bonds. For example, β-glucosidase (EC 3.2.1.21) hydrolyzes cellulose and cellobiose β-glycoside bonds, but hardly hydrolyzes β-glycoside bonds at the C-3 atom of ginsenoside. The reason for this is that conventional cellulases and hemicellulases hydrolyze glycoside bonds of polysaccharides, whereas ginsenoside glucosidase of the present invention hydrolyzes glycoside bonds of glycosides having 30 carbon atoms.
発明の詳細な説明
精製及び特性評価の後、本発明のジンセノサイドグリコシダーゼは、４つの種類、即ち、ジンセノサイド グリコシダーゼ Ｉ、ジンセノサイド グリコシダーゼ II、ジンセノサイド グリコシダーゼ III及びジンセノサイド−α−ラムノシダーゼを有することが分かった。ジンセノサイド グリコシダーゼ Ｉは、ジンセノサイド Ra, Rb1, Rb2, Rc及びRdのβ−グルコシド結合、β−キシロシド結合及びα−アラビノシド結合を加水分解することができる。ジンセノサイド グリコシダーゼ IIは、ジンセノサイド Ra, Rb1, Rb2, Rc及びRdのC-20（第20炭素原子）におけるβ−グルコシド結合、β−キシロシド結合及びα−アラビノシド結合を加水分解して、ジンセノサイド Rdを与えることができる。ジンセノサイド グリコシダーゼ IIIは、ジンセノサイド RdのC-3におけるアグリコンと糖基との間のグリコシド結合を加水分解して、ジンセノサイド C-Kを与えることができる。ジンセノサイド−α−ラムノシダーゼは、ジンセノサイド Re及びRg2それぞれのC-6におけるα−ラムノシド結合を加水分解して、ジンセノサイドRg1及びRh1それぞれを与えることができる。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION After purification and characterization, the ginsenoside glycosidase of the present invention was found to have four types: ginsenoside glycosidase I, ginsenoside glycosidase II, ginsenoside glycosidase III and ginsenoside-α-rhamnosidase. Ginsenoside glycosidase I, the ginsenoside Ra, Rb 1, Rb 2, Rc and Rd of beta-glucosidic bonds, beta-xyloside bonds and α- arabinoside couple can be hydrolyzed. Ginsenoside glycosidase II hydrolyzes the β-glucoside bond, β-xyloside bond and α-arabinoside bond at C-20 (20th carbon atom) of ginsenoside Ra, Rb 1 , Rb 2 , Rc and Rd to produce ginsenoside Rd Can be given. Ginsenoside glycosidase III can hydrolyze the glycosidic bond between the aglycone and sugar group at C-3 of ginsenoside Rd to give ginsenoside CK. Ginsenoside-α-rhamnosidase can hydrolyze the α-rhamnoside bond at C-6 of ginsenoside Re and Rg 2 respectively to give ginsenoside Rg 1 and Rh 1 respectively.
本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、薬用人参の中で含量が高いジンセノサイド及びその他の入手容易なジンセノサイドを処理して、稀有で有用なジンセノサイドを製造するのに用いることができる。本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、ジンセノサイド全体を処理して、稀有ジンセノサイド含量が高い混合ジンセノサイドを製造するのに用いることもできる。本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、薬用人参粉末を処理して、稀有ジンセノサイドの含量が高い薬用人参製品を製造するのに用いることもできる。 The ginsenoside glucosidase of the present invention can be used to produce a rare and useful ginsenoside by treating ginsenoside having a high content in ginseng and other easily available ginsenoside. The ginsenoside glucosidase of the present invention can also be used to treat mixed ginsenoside to produce mixed ginsenoside with a high content of rare ginsenoside. The ginsenoside glucosidase of the present invention can also be used to produce medicinal carrot products with a high content of rare ginsenoside by treating ginseng powder.
本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、微生物培養物、薬用人参植物、小麦のフスマ、アーモンド、麦芽、動物の肝臓等から得ることができる。該微生物としては、細菌、ストレプトマイセス、酵母、アスペルギルス、担子菌等が挙げられる。微生物を用いてジンセノサイド グルコシダーゼを製造する場合、薬用人参抽出物又は薬用人参粉末を、酵素収量の向上のために、添加することができる。微生物は、液体又は固体の培地で培養することができる。固体培地で培養する場合、培養した固体培地を緩衝液で抽出し、遠心分離して酵素溶液を得ることができる。培養した液体培地は、直接遠心分離して酵素を含有する溶液を得ることができる。薬用人参植物又は動物の肝臓を用いて本発明のジンセノサイド グルコシダーゼを製造する場合、これらの材料が、粉砕され、緩衝液で抽出された後、遠心分離されて酵素溶液が得られる。小麦のフスマ、麦芽及びアーモンドの場合、これらが緩衝液で抽出され、遠心分離されて酵素を含有する溶液が得られる。任意で、このようにして得られた溶液中のジンセノサイド グルコシダーゼを、さらに、硫酸アンモニウム又はエタノールを加えることにより沈殿させた後、緩衝液に溶解して、濃縮された酵素溶液を得ることもできる。 The ginsenoside glucosidase of the present invention can be obtained from microbial cultures, ginseng plants, wheat bran, almonds, malt, animal livers and the like. Examples of the microorganism include bacteria, Streptomyces, yeast, Aspergillus, basidiomycetes and the like. When ginsenoside glucosidase is produced using a microorganism, medicinal ginseng extract or medicinal ginseng powder can be added to improve the enzyme yield. The microorganism can be cultured in a liquid or solid medium. When culturing in a solid medium, the cultured solid medium can be extracted with a buffer and centrifuged to obtain an enzyme solution. The cultured liquid medium can be directly centrifuged to obtain a solution containing the enzyme. When the ginsenoside glucosidase of the present invention is produced using a ginseng plant or animal liver, these materials are pulverized, extracted with a buffer, and then centrifuged to obtain an enzyme solution. In the case of wheat bran, malt and almonds, these are extracted with a buffer and centrifuged to obtain a solution containing the enzyme. Optionally, ginsenoside glucosidase in the solution thus obtained can be further precipitated by adding ammonium sulfate or ethanol, and then dissolved in a buffer solution to obtain a concentrated enzyme solution.
酵素の起源の違いによって、本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、上述した４種のジンセノサイド グルコシダーゼそれぞれの含量が異なる。 The ginsenoside glucosidase of the present invention has different contents of the four types of ginsenoside glucosidase described above depending on the origin of the enzyme.
本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、ジンセノサイドを直接処理して珍しいジンセノサイドを調製するのに用いることができる。精製された又は精製されていない酵素を、所望する生成物に応じて用いることができる。酵素反応は、ｐH２〜１１、５〜７０℃、ジンセノサイド基質０．００１〜２０％の条件で行なうことができる。該基質としては、プロトパナキサジオール系ジンセノサイド、プロトパナキサトリオール系ジンセノサイド等が挙げられる。酵素反応からの生成物は、部分的に又は完全に変化した糖基を有するジンセノサイド、例えば、Rh2、Rh1、C-K、Rg2、Rg3、F2、Rg1、Rd、及びこれらの異性体である。
The ginsenoside glucosidase of the present invention can be used to prepare unusual ginsenoside by directly treating ginsenoside. Purified or non-purified enzymes can be used depending on the desired product. The enzymatic reaction can be performed under conditions of
本発明を図面及び実施例を参照してさらに詳細に説明する。 The invention will be described in more detail with reference to the drawings and examples.
微生物からのジンセノサイド グルコシダーゼの調製
1.黒カビ（アスペルギルス ニガー；Aspergillus niger）からのジンセノサイド グルコシダーゼ
使用した菌株は、アスペルギルス ニガーFFCCDL-48g（大連軽工業学院菌種保存所（FFCCDL）から入手。アスペルギルス ニガーFFCCDL-48gは、大連軽工業学院が、中国普通微生物菌種保蔵中心、中国科学院微生物研究所（中国科学院微生物研究所、中国普通微生物菌種保蔵中心編輯：菌種目録、科学出版社、1982年出版）から入手した菌（Aspergillus niger AS3.40菌）である。）である。
Preparation of ginsenoside glucosidase from microorganisms
1. niger.; Jinseno side glucosidase <br/> using strains from (Aspergillus niger Aspergillus niger) are obtained from Aspergillus niger FFCCDL-48g (Dalian Light Industry Institute species storage locations (FFCCDL) Aspergillus niger FFCCDL-48g are , Obtained from the Dalian Light Industrial Academy from the Chinese Common Microbial Species Preservation Center, the Chinese Academy of Sciences Microbiology Research Institute (Chinese Academy of Sciences Microbiology Research Institute, Chinese Common Microorganisms Species Preservation Center: Bacterial Inventory, Science Publishing Co., Ltd., published in 1982) A fungus (Aspergillus niger AS3.40) .
1.1 酵素の製造
アスペルギルス ニガー FFCCDL-48gは、薬用人参抽出物1％及び小麦のフスマ抽出物3％を含有する培地中で、30℃にて54時間培養された。遠心分離により細胞を除去した後、細胞を含有しない上澄み液2000mlに、(NH4)2SO4粉末を65％飽和度まで攪拌しながら加えた。この溶液を4℃で一晩放置した後、沈殿した蛋白質を遠心分離により採取し、80mlの蒸留水に再び懸濁させ、pH5の0.01M酢酸緩衝液に対して透析した。不溶物を遠心分離により除去した後、この溶液をpH5の0.01M酢酸緩衝液を用いて200mlに調整した。この粗酵素溶液は、ジンセノサイドの加水分解又は酵素の精製に用いることができる。
1.1 Enzyme Production Aspergillus niger FFCCDL-48g was cultured at 30 ° C. for 54 hours in a medium containing 1% ginseng extract and 3% wheat bran extract. After removing the cells by centrifugation, (NH 4 ) 2 SO 4 powder was added to 2000 ml of the supernatant containing no cells with stirring to 65% saturation. The solution was allowed to stand at 4 ° C. overnight, and the precipitated protein was collected by centrifugation, resuspended in 80 ml of distilled water, and dialyzed against 0.01 M acetate buffer at pH 5. After removing insolubles by centrifugation, the solution was adjusted to 200 ml with 0.01M acetate buffer at pH 5. This crude enzyme solution can be used for ginsenoside hydrolysis or enzyme purification.
1.2 ジンセノサイドの加水分解
ジンセノサイド Rb1、Rb2、Rc及びRdそれぞれ100mg並びにジンセノサイド Rg310mgを、pH5の0.01M酢酸緩衝液10mlが入っている分離管内で溶解させた。1.1において得られた粗酵素溶液10mlを各分離管に加え、30℃で18時間反応させた。次いで、ｎ−ブタノール10mlを加えて反応を停止した。生成物は、薄層クロマトグラフィー（TLC）（Silica gel 60-F254, Merck；クロロホルム：メタノール：水 70：30：5）により測定した。島津製作所製TLC Scanner CS-930による検出結果を表１に示す。
1.2 Hydrolysis of ginsenoside 100 mg of ginsenoside Rb 1 , Rb 2 , Rc and Rd and 10 mg of ginsenoside Rg 3 were dissolved in a separation tube containing 10 ml of 0.01M acetate buffer at pH 5. 10 ml of the crude enzyme solution obtained in 1.1 was added to each separation tube and reacted at 30 ° C. for 18 hours. Subsequently, 10 ml of n-butanol was added to stop the reaction. The product was measured by thin layer chromatography (TLC) (Silica gel 60-F254, Merck; chloroform: methanol: water 70: 30: 5). Table 1 shows the detection results of Shimadzu TLC Scanner CS-930.
表１から明らかなように、アスペルギルス ニガーからの酵素は、プロトパナキサジオール系ジンセノサイドの糖基を、90％以上の変換率で加水分解することができる。Rg3からRh2への変換率は50％を超えている。酵素反応の主生成物は、ジンセノサイドF2、C-K、Rh2及びアグリコンであった。アスペルギルス ニガーからの酵素によるジンセノサイド Ra1, Ra2及びRa3の加水分解は、Rb1の加水分解に類似していた。 As is apparent from Table 1, the enzyme from Aspergillus niger can hydrolyze the sugar group of protopanaxadiol ginsenoside with a conversion rate of 90% or more. The conversion rate from Rg 3 to Rh 2 is over 50%. The main products of the enzymatic reaction were ginsenoside F 2 , CK, Rh 2 and aglycone. The hydrolysis of ginsenoside Ra 1 , Ra 2 and Ra 3 by the enzyme from Aspergillus niger was similar to the hydrolysis of Rb 1 .
上述した実験結果から、アスペルギルス ニガーからのジンセノサイド グルコシダーゼは、少なくとも、C-3のβ-(1→2)-D-グルコシド、C-20のβ-(1→6)-D-グルコシド、C-20のα-(1→6)-L-アラビノシド、及びC-20のβ-(1→6)-D-キシロシドを加水分解する活性を有すると言える。 From the above experimental results, ginsenoside glucosidase from Aspergillus niger is at least C-3 β- (1 → 2) -D-glucoside, C-20 β- (1 → 6) -D-glucoside, C- It can be said that it has activity to hydrolyze 20 α- (1 → 6) -L-arabinoside and C-20 β- (1 → 6) -D-xyloside.
ジンセノサイド グルコシダーゼの製造は、薬用人参抽出物又はジンセノサイドの添加により誘導作用を受ける。即ち、酵素の収量は、薬用人参抽出物又はジンセノサイドを培地に添加すると増加し、これらの誘導物を添加しないと減少する。 The production of ginsenoside glucosidase is induced by the addition of ginseng extract or ginsenoside. That is, the yield of the enzyme increases when medicinal ginseng extract or ginsenoside is added to the medium, and decreases when these derivatives are not added.
1.3 アスペルギルス ニガーからのジンセノサイド グルコシダーゼの特性
酵素についてさらなる特性評価を行なうため、実験を行なって、温度、pH、金属イオン及び反応時間が酵素反応に対して与える影響を調べた。
1.3 Properties of ginsenoside glucosidase from Aspergillus niger To further characterize the enzyme, experiments were conducted to investigate the effects of temperature, pH, metal ions and reaction time on the enzyme reaction.
酵素反応に対する温度の影響：
100mgのジンセノサイド Rb1を、1.2と同様の条件下での反応において用いた。温度の影響を表２に示す。
Effect of temperature on enzyme reaction:
100 mg of ginsenoside Rb 1 was used in the reaction under the same conditions as 1.2. The effect of temperature is shown in Table 2.
表２に示されるように、Rb1は30〜60℃の温度範囲において、より良好に加水分解される。ジンセノサイド F2及びC-Kの収量は、20〜50℃の温度範囲において高い。20〜50℃においては、ジンセノサイド C-Kの収量は、温度が上昇するのに伴って高くなる。表２から、多量のジンセノサイド F2が要求される場合は、温度を好ましくは30〜40℃に保ち、多量のジンセノサイド C-Kが要求される場合は、温度を好ましくは40〜50℃の範囲に保つ。反応が20℃又は60℃で行なわれると、多量のジンセノサイド Rdが得られる。ジンセノサイド Rg3及びRh2並びにアグリコンの収量は、相対的に低い。Ra、Rb2、Rc及びRdの加水分解に対する温度の影響は、Rb1に対する影響と類似する。 As shown in Table 2, Rb 1 is better hydrolyzed in the temperature range of 30-60 ° C. The yields of ginsenoside F 2 and CK are high in the temperature range of 20-50 ° C. At 20-50 ° C., the yield of ginsenoside CK increases with increasing temperature. From Table 2, when a large amount of ginsenoside F 2 is required, the temperature is preferably kept at 30-40 ° C, and when a large amount of ginsenoside CK is required, the temperature is preferably kept in the range of 40-50 ° C. . If the reaction is carried out at 20 ° C. or 60 ° C., a large amount of ginsenoside Rd is obtained. The yields of ginsenoside Rg 3 and Rh 2 and aglycone are relatively low. Ra, the influence of temperature on the hydrolysis of Rb 2, Rc and Rd are similar to effects on Rb 1.
酵素反応に対するpHの影響：
酵素反応に対する様々なpHの影響を表３に示した。
Effect of pH on enzyme reaction:
The effect of various pH on the enzyme reaction is shown in Table 3.
表３に示されるように、ジンセノサイド F2の収量は、pH4〜7で高く、ジンセノサイド C-K及びRh2並びにアグリコンの収量は、pHの上昇に伴って高くなる。Ra、Rb2、Rc及びRdの加水分解に対するpHの影響は、Rb1に対する影響と類似する。 As shown in Table 3, the yield of ginsenoside F 2 is high at pH 4-7, and the yields of ginsenoside CK and Rh 2 and aglycone increase with increasing pH. Ra, pH influences the relative hydrolysis of Rb 2, Rc and Rd are similar to effects on Rb 1.
酵素反応に対する反応時間の影響：
酵素反応に対する様々な反応時間の影響を表４に示した。
Effect of reaction time on enzyme reaction:
The effect of various reaction times on the enzyme reaction is shown in Table 4.
表４に示されるように、先ずジンセノサイド Rb1のC-20におけるグリコシドが加水分解されてRdが得られる。Rdの収量は、反応時間に伴って減少するのに対して、ジンセノサイド F2及びC-Kの含量は増加する。F2の収量は、反応が12〜24時間継続されたときに最も高くなる。ジンセノサイド C-K及びRh2並びにアグリコンの収量は、反応時間に伴って増加する。Ra、Rb2、Rc及びRdの加水分解に対する反応時間の影響は、Rb1に対する影響と類似する。 As shown in Table 4, the glycoside at C-20 of ginsenoside Rb 1 is first hydrolyzed to obtain Rd. The yield of Rd is that the decreases with reaction time, the content of ginsenoside F 2 and CK increases. The yield of F2 is highest when the reaction is continued for 12-24 hours. The yields of ginsenoside CK and Rh 2 and aglycone increase with reaction time. Ra, the influence of the reaction time for hydrolysis of the Rb 2, Rc and Rd are similar to effects on Rb 1.
酵素反応に対する金属イオンの影響：
酵素反応に対する金属イオンの影響を表５に示した。
Effects of metal ions on enzymatic reactions:
The influence of metal ions on the enzyme reaction is shown in Table 5.
表５に示されるように、Ca++及びMg++は、変換速度を僅かに加速することができるのに対して、Cu++及びPb++は、反応を阻害する。Ra、Rb2、Rc及びRdの加水分解に対する反応時間の影響は、Rb1に対する影響と類似する。 As shown in Table 5, Ca ++ and Mg ++ can slightly accelerate the conversion rate, whereas Cu ++ and Pb ++ inhibit the reaction. Ra, the influence of the reaction time for hydrolysis of the Rb 2, Rc and Rd are similar to effects on Rb 1.
1.4 アスペルギルス ニガーからのジンセノサイド グルコシダーゼの精製
1.1において得られた酵素溶液10mlをDEAE-セルロース DE-52カラム（Pharamcia製、1.5×6.7cm）で処理して酵素蛋白質を吸着させた。次いで、該カラムをNaCl勾配（0.06, 0.12, 0.18, 0.24, 0.3, 0,4, 0.5及び0.6M）で溶出した。
DEAE-セルロースからのフラクション36及び54は、SDS-ポリアクリルアミドゲルにおいて単一の点として現れ、このことは精製された酵素であることを表す。この精製された酵素によるジンセノサイドの加水分解を表６に示した。
1.4 Purification of ginsenoside glucosidase from Aspergillus niger
10 ml of the enzyme solution obtained in 1.1 was treated with a DEAE-cellulose DE-52 column (Pharamcia, 1.5 × 6.7 cm) to adsorb the enzyme protein. The column was then eluted with a NaCl gradient (0.06, 0.12, 0.18, 0.24, 0.3, 0, 4, 0.5 and 0.6M).
Fractions 36 and 54 from DEAE-cellulose appear as a single spot in the SDS-polyacrylamide gel, indicating that this is a purified enzyme. The hydrolysis of ginsenoside by this purified enzyme is shown in Table 6.
DEAE-セルロースカラムから0.12M NaClで溶出されたフラクション36は、凍結乾燥され、SDS-ポリアクリルアミドゲルで泳動したとき、分子量51000ダルトンの単一の点として現れた。従って、これは精製された酵素であることを示し、ジンセノサイド グルコシダーゼＩと命名し、その特性は表６に示す通りである。 Fraction 36 eluted from the DEAE-cellulose column with 0.12M NaCl appeared as a single spot with a molecular weight of 51000 Dalton when lyophilized and run on an SDS-polyacrylamide gel. Therefore, this indicates that it is a purified enzyme, named Ginsenoside Glucosidase I, and its properties are as shown in Table 6.
表６から明らかなように、フラクション36（ジンセノサイド グルコシダーゼＩ）は、Rb1のC-20におけるβ-(1→6)-D-グルコシド、Rc及びRb2のC-20におけるα-(1→6)-L-アラビノシド、ジンセノサイドRaのC-20におけるβ-(1→6)-キシロシドを加水分解することができる。フラクション36はまた、Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3等のプロトパナキサジオール系ジンセノサイドのC-3におけるβ-(1→2)-グルコシドを加水分解することができ、アグリコンのC-3におけるβ-D-グルコシル及びC-20におけるβ-グルコシルも僅かに加水分解することができる。ジンセノサイド グルコシダーゼＩによる加水分解機構を図１に示す。ジンセノサイド グルコシダーゼＩはまた、β−グルコシド、β−キシロシド、α−アラビノシド及びβ−ガラクトシドを加水分解するが、ｐ−ニトロフェニル−α−ラムノシドは加水分解しない。 Table 6 As is apparent, fraction 36 (ginsenoside glucosidase I) is, beta-in C-20 of Rb 1 (1 → 6) -D- glucoside, alpha-in C-20 of Rc and Rb 2 (1 → 6) β- (1 → 6) -xyloside at C-20 of -L-arabinoside and ginsenoside Ra can be hydrolyzed. Fraction 36 can also hydrolyze β- (1 → 2) -glucoside in C-3 of protopanaxadiol ginsenosides such as Ra, Rb 1 , Rb 2 , Rc, Rd, Rg 3 etc. Β-D-glucosyl in C-3 and β-glucosyl in C-20 can also be slightly hydrolyzed. The hydrolysis mechanism by ginsenoside glucosidase I is shown in FIG. Ginsenoside glucosidase I also hydrolyzes β-glucoside, β-xyloside, α-arabinoside and β-galactoside but not p-nitrophenyl-α-rhamnoside.
ジンセノサイド グルコシダーゼ II
DEAE-セルロースカラムから0.18M NaClで溶出されたフラクション54は、凍結乾燥され、SDS-ポリアクリルアミドゲルで泳動したとき、分子量90000ダルトンで単一の点として現れた。従って、これは精製された酵素であることを示し、ジンセノサイド グルコシダーゼ IIと命名した。この酵素は、Rb1のC-20におけるβ-(1→6)-D-グルコシド、ジンセノサイドRaのβ-(1→6)-キシロシド並びにRc及びRb2のC-20におけるα-(1→6)-L-アラビノシドを加水分解してRdを与え、Rdを僅かに加水分解してRg3を与えるが、プロトパナキサジオール系ジンセノサイドのC-3におけるβ-(1→2)-グルコシドは加水分解しない。ジンセノサイド グルコシダーゼ IIによる加水分解機構を図２に示す。
Ginsenoside glucosidase II
Fraction 54 eluted from the DEAE-cellulose column with 0.18M NaCl appeared as a single spot with a molecular weight of 90000 daltons when lyophilized and run on an SDS-polyacrylamide gel. Therefore, it was shown to be a purified enzyme and was named ginsenoside glucosidase II. This enzyme contains β- (1 → 6) -D-glucoside at C-20 of Rb 1 , β- (1 → 6) -xyloside of ginsenoside Ra and α- (1 → at C-20 of Rc and Rb 2 6) -L-arabinoside is hydrolyzed to give Rd, Rd is slightly hydrolyzed to give Rg 3 , but β- (1 → 2) -glucoside in C-3 of protopanaxadiol ginsenoside is Does not hydrolyze. The hydrolysis mechanism by ginsenoside glucosidase II is shown in FIG.
ジンセノサイド グルコシダーゼ IIIは、1.1において得られた粗酵素溶液からHPLC分離カラム：Bio-Scale Q (BioRad), 2ml/tubeで精製された。粗酵素溶液1mlを上記カラムに注入し、溶液Ａ（pH7.4の25ｍM Tris-HCl緩衝液）及び溶液Ｂ（pH7.4の0.5M NaCl（溶媒：20ｍM Tris-HCl緩衝液））で溶出した。フラクション18は、SDS-ポリアクリルアミドゲルで泳動したとき、単一の点として現れ、従って精製された酵素であることを示した。この酵素をジンセノサイド グルコシダーゼ IIIと命名した。この酵素は、アグリコンのC-3におけるジグルコシル基を加水分解して、Rd及びRg3をC-K及びアグリコンに変換する。ジンセノサイド グルコシダーゼ IIIによる加水分解の機構を図３に示す。
Ginsenoside glucosidase III was purified from the crude enzyme solution obtained in 1.1 with an HPLC separation column: Bio-Scale Q (BioRad), 2 ml / tube. 1 ml of the crude enzyme solution was injected into the above column and eluted with solution A (25 mM Tris-HCl buffer at pH 7.4) and solution B (0.5 M NaCl at pH 7.4 (solvent: 20 mM Tris-HCl buffer)). .
上述したアスペルギルス ニガーからの３種類のジンセノサイド グルコシダーゼの特性を表７にまとめて示す。 The characteristics of the three types of ginsenoside glucosidase from Aspergillus niger described above are summarized in Table 7.
1.5 ジンセノサイド グルコシダーゼとセルロースβ−グルコシダーゼとの違い
本発明のジンセノサイド グルコシダーゼと既知のexo−セルラーゼとの違いを観察するため、本発明のジンセノサイド グルコシダーゼを、セルロースβグルコシダーゼ（EC3.2.1.21）と、0.5％ジンセノサイドRb1又はRdを基質とした２つの反応において比較した。反応はｐH5.0、30℃で18時間行った。結果を表８に示す。
1.5 Difference between ginsenoside glucosidase and cellulose β-glucosidase In order to observe the difference between the ginsenoside glucosidase of the present invention and a known exo-cellulase, the ginsenoside glucosidase of the present invention was converted to cellulose β glucosidase (EC 3.2.1.21), 0.5 Comparison was made in two reactions using% ginsenoside Rb 1 or Rd as a substrate. The reaction was carried out at pH 5.0 and 30 ° C. for 18 hours. The results are shown in Table 8.
クロストリディウム サーモコプリー（Chlostridium thermocopriae）及びバチルス（Bacillus）属AXからのセルロースβ−グルコシダーゼ（EC3.2.1.21）は、ジンセノサイドのいずれのグリコシドをも加水分解することができない。アーモンドからのセルロースβ−グルコシダーゼは、Rb1、Rb2及びRcのC-20グリコシドを僅かに加水分解してジンセノサイドRdを与えるが、C-3におけるグリコシドを加水分解することはできない。ジンセノサイド グルコシダーゼIIは、アーモンドからのセルロースβ−グルコシダーゼに類似しているが、Rdを僅かに加水分解するのみである。ジンセノサイド グルコシダーゼIIIの特性は、セルロースβ−グルコシダーゼの特性とは全く異なる。 Cellulose β-glucosidase (EC 3.2.1.21) from Chlostridium thermocopriae and Bacillus genus AX cannot hydrolyze any glycosides of ginsenoside. Cellulose β-glucosidase from almonds slightly hydrolyzes the C-20 glycosides of Rb 1 , Rb 2 and Rc to give ginsenoside Rd, but cannot hydrolyze the glycosides at C-3. Ginsenoside glucosidase II is similar to cellulose β-glucosidase from almonds, but only slightly hydrolyzes Rd. The properties of ginsenoside glucosidase III are quite different from those of cellulose β-glucosidase.
クロストリディウム サーモコプリーからのexo-セルラーゼ（セロビオース生成酵素）は、セロデキストリンを切断してセロビオースを与えるが、ジンセノサイドRdのC-3におけるジグルコシド結合を加水分解することはできない。そのため、上記exo-セルラーゼは、ジンセノサイド グルコシダーゼIIIとは全く異なる。従って、本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、既知のセルロースβ−グルコシダーゼ及びセロビオース生成酵素とは異なる。 An exo-cellulase (cellobiose-generating enzyme) from Clostridium thermocopley cleaves cellodextrin to give cellobiose but cannot hydrolyze the diglucoside bond at C-3 of ginsenoside Rd. Therefore, the exo-cellulase is completely different from ginsenoside glucosidase III. Therefore, the ginsenoside glucosidase of the present invention is different from the known cellulose β-glucosidase and cellobiose producing enzyme.
2. アスペルギルス オリゼー（Aspegillus oryzae）からのジンセノサイド グルコシダーゼ
2.1 酵素の製造
アスペルギルス オリゼーFFCCDL-39g（大連軽工業学院菌種保存所から入手。アスペルギルス オリゼーFFCCDL-39gは、大連軽工業学院が、中国普通微生物菌種保蔵中心、中国科学院微生物研究所（中国科学院微生物研究所、中国普通微生物菌種保蔵中心編輯：菌種目録、科学出版社、1982年出版）から入手した菌（Aspergillus oryzae AS3.951菌）である。）は、1％の薬用人参抽出物及び3％の小麦のフスマ抽出物を含有する培地中で、30℃にて64時間攪拌しながら培養された。遠心分離により細胞を除去した後、細胞を含有しない上澄み液2000mlに、(NH4)2SO4粉末を65％飽和度まで攪拌しながら加えた。この溶液を4℃で一晩放置した後、沈殿した蛋白質を遠心分離により採取し、80mlの蒸留水に再び懸濁させ、pH5の0.01M酢酸緩衝液に対して透析した。不溶物を遠心分離により除去した後、この溶液をpH5の0.01M酢酸緩衝液を用いて200mlに調整した。この粗酵素液は、ジンセノサイドの加水分解又は酵素の精製に用いることができる。
2. Ginsenoside glucosidase from Aspegillus oryzae
2.1 Enzyme production Aspergillus oryzae FFCCDL-39g (obtained from the Dalian Light Industry Gakuin Bacteria Preservation Center . Aspergillus oryzae FFCCDL-39g was acquired by the Chinese Academy of Microbiology Research Institute (Aspergillus oryzae AS3.951) obtained from the Chinese Common Microbial Species Preservation Center: Bacteria Species List, Scientific Publishing Co., Ltd., published in 1982. ) 1% Ginseng extract and 3 It was cultured in a medium containing 1% wheat bran extract with stirring at 30 ° C. for 64 hours. After removing the cells by centrifugation, (NH 4 ) 2 SO 4 powder was added to 2000 ml of the supernatant containing no cells with stirring to 65% saturation. The solution was allowed to stand at 4 ° C. overnight, and the precipitated protein was collected by centrifugation, resuspended in 80 ml of distilled water, and dialyzed against 0.01 M acetate buffer at pH 5. After removing insolubles by centrifugation, the solution was adjusted to 200 ml with 0.01M acetate buffer at pH 5. This crude enzyme solution can be used for hydrolysis of ginsenoside or purification of the enzyme.
ジンセノサイド Rb1、Rb2、Rc、Re及びRdそれぞれ100mg並びにジンセノサイド Rg3及びRg2それぞれ10mgを、pH5.0の0.01M酢酸緩衝液10mlが入っている分離管内で溶解させた。上述のようにして得られた粗酵素溶液10mlを上記分離管それぞれに加え、30℃で18時間反応させた。次いで、ｎ−ブタノール10mlを加えて反応を停止した。生成物は、薄層クロマトグラフィー（TLC）（Silica gel 60-F254, Merck；クロロホルム：メタノール：水 70：30：5）により測定した。島津製作所製TLC Scanner CS-930による検出結果を表９に示す。 100 mg each of ginsenoside Rb 1 , Rb 2 , Rc, Re and Rd and 10 mg each of ginsenoside Rg 3 and Rg 2 were dissolved in a separation tube containing 10 ml of 0.01 M acetate buffer at pH 5.0. 10 ml of the crude enzyme solution obtained as described above was added to each of the above separation tubes and reacted at 30 ° C. for 18 hours. Subsequently, 10 ml of n-butanol was added to stop the reaction. The product was measured by thin layer chromatography (TLC) (Silica gel 60-F254, Merck; chloroform: methanol: water 70: 30: 5). Table 9 shows the detection results of Shimadzu Corporation TLC Scanner CS-930.
表９から明らかなように、プロトパナキサジオール系ジンセノサイドの加水分解におけるアスペルギルス オリゼーからのジンセノサイド グルコシダーゼのpH、温度、反応時間の影響等の特徴は、アスペルギルス ニガーからのジンセノサイド グルコシダーゼの特徴と全て類似している。唯一の違いは、アスペルギルス ニガーからの酵素はジンセノサイドRe及びRg2のC-6におけるα-(1→2)-L-ラムノシド結合を加水分解できないが、アスペルギルス オリゼーからのジンセノサイド グルコシダーゼは該結合を加水分解して、Rg1及びRh1を与えることができる点にある。このことは、アスペルギルス オリゼーからのジンセノサイド グルコシダーゼは、ジンセノサイド グルコシダーゼＩ、II及びIIIの活性に加えて、ジンセノサイド-α-(1→2)-L-ラムノシダーゼ（即ちジンセノサイド−α−ラムノシダーゼ）活性も有していることを示している。 As is clear from Table 9, the effects of pH, temperature, reaction time, etc. of ginsenoside glucosidase from Aspergillus oryzae in hydrolysis of protopanaxadiol ginsenoside are all similar to those of ginsenoside glucosidase from Aspergillus niger. ing. The only difference is that the enzyme from Aspergillus niger cannot hydrolyze the α- (1 → 2) -L-rhamnoside bond at C-6 of ginsenoside Re and Rg 2 , whereas ginsenoside glucosidase from Aspergillus oryzae hydrolyzes the bond. It can be decomposed to give Rg 1 and Rh 1 . This means that ginsenoside glucosidase from Aspergillus oryzae has ginsenoside-α- (1 → 2) -L-rhamnosidase (ie ginsenoside-α-rhamnosidase) activity in addition to the activities of ginsenoside glucosidases I, II and III. It shows that.
2.2 ジンセノサイド−α−ラムノシダーゼの精製及び特性評価
アスペルギルス オリゼーからのジンセノサイド−α−ラムノシダーゼの特性を検討するため、この酵素をバイオロジカル ミディアム プレッシャー クロマトグラフィー（BioRad）によって精製した。パラメータは以下の通りである：カラム Bio-Scale Q2 (BioRad)；粗酵素 1ml；流速 1ml／分；移動相 pH8.2の20ｍM Tris-HCl及び0.5M NaCl（溶媒：pH8.2の20ｍM Tris-HCl）；2ml／tube
2.2 Purification and characterization of ginsenoside-α-rhamnosidase To investigate the properties of ginsenoside-α-rhamnosidase from Aspergillus oryzae, the enzyme was purified by biological medium pressure chromatography (BioRad). The parameters are as follows: Column Bio-Scale Q2 (BioRad);
各フラクションの活性が試験され、フラクション16がジンセノサイド−α−ラムノシダーゼ活性を有することが見出された。ジンセノサイド−α−ラムノシダーゼは、SDS-ポリアクリルアミドゲルで泳動したとき、分子量53000の単一の点として現れた。このことは、フラクション16の酵素は精製された酵素であることを示している。
The activity of each fraction was tested and
精製されたジンセノサイド−α−ラムノシダーゼは、ジンセノサイドRe及びRg2それぞれのC-6におけるα−Ｌ−ラムノシドを加水分解して、Rg1及びRh1それぞれを製造することができる。この酵素は、pH4〜7（最適pHは5）、30〜50℃（最適温度は40℃）でさらに活性である。精製されたジンセノサイド−α−ラムノシダーゼは、プロトパナキサトリオール系ジンセノサイドのC-6におけるα−Ｌ−ラムノシドを加水分解するのみで、ジンセノサイドの他のグリコシド結合は加水分解しない。ジンセノサイド−α−ラムノシダーゼによるRe及びRg2の加水分解機構を図４に示す。 The purified ginsenoside-α-rhamnosidase can hydrolyze α-L-rhamnoside at C-6 of ginsenoside Re and Rg 2 respectively to produce Rg 1 and Rh 1 respectively. This enzyme is more active at pH 4-7 (optimal pH is 5) and 30-50 ° C (optimal temperature is 40 ° C). Purified ginsenoside-α-rhamnosidase only hydrolyzes α-L-rhamnoside at C-6 of the protopanaxatriol-based ginsenoside and does not hydrolyze other glycoside bonds of ginsenoside. The mechanism of hydrolysis of Re and Rg 2 by ginsenoside-α-rhamnosidase is shown in FIG.
3. 細菌からのジンセノサイド グルコシダーゼ
好熱性・好気性バチルス属JF（Fengxie. Jin et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 36, 415-434, 1990）は、薬用人参抽出物0.5重量％、小麦のフスマ抽出物1重量％及びトリプトン0.3重量％を含有する培地で、pH7.2、60℃にて36時間通気し、攪拌しながら培養された。遠心分離により細胞を除去した後、細胞を含有しない上澄み液1000mlに、95％エタノール3000mlを加えた。この溶液を4℃で一晩放置した後、遠心分離してペレットを採取した。この酵素蛋白質ペレットを、pH5の0.01M酢酸緩衝液50mlに溶解した。不溶物を遠心分離により除去し、粗酵素溶液を得た。
3. Ginsenoside glucosidase from bacteria Thermophilic and aerobic Bacillus genus JF (Fengxie. Jin et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 36, 415-434, 1990) is 0.5% by weight of ginseng extract, The culture medium containing 1% by weight of wheat bran extract and 0.3% by weight of tryptone was cultured with aeration at pH 7.2 and 60 ° C. for 36 hours with stirring. After removing the cells by centrifugation, 3000 ml of 95% ethanol was added to 1000 ml of the supernatant containing no cells. The solution was left overnight at 4 ° C. and then centrifuged to collect a pellet. This enzyme protein pellet was dissolved in 50 ml of 0.01 M acetate buffer at pH 5. Insoluble matter was removed by centrifugation to obtain a crude enzyme solution.
この酵素溶液10mlを、0.5％Rd含有酢酸緩衝液（エタノールを20％含有）10mlと70℃で16時間反応させた。TLC分析により、60％のRdがジンセノサイドF2に変換されていることが明らかになった。このことは、微生物ジンセノサイド グルコシダーゼが、Rdの第３炭素原子におけるβ−（１→２）−グルコシドを加水分解できることを示している。この酵素は、Rg3のβ−（１→２）−グルコシドを加水分解してRh2を与えることもできる。
この酵素の最適反応温度は70℃で、最適pHは6.0である。
10 ml of this enzyme solution was reacted with 10 ml of 0.5% Rd-containing acetate buffer (containing 20% ethanol) at 70 ° C. for 16 hours. TLC analysis 60% of the Rd is found to have been converted to ginsenoside F 2. This indicates that the microbial ginsenoside glucosidase can hydrolyze β- (1 → 2) -glucoside at the third carbon atom of Rd. This enzyme can also hydrolyze the β- (1 → 2) -glucoside of Rg 3 to give Rh 2 .
The optimum reaction temperature for this enzyme is 70 ° C. and the optimum pH is 6.0.
4. 酵母からのジンセノサイド グルコシダーゼ
カンジダ（Candida）属 FFCCDL-2g（大連軽工業学院菌種保存所から入手。カンジダ（Candida)属FFCCDL-2ｇは、大連軽工業学院が、中国普通微生物菌種保蔵中心、中国科学院微生物研究所（中国科学院微生物研究所、中国普通微生物菌種保蔵中心編輯：菌種目録、科学出版社、1982年出版）から入手した菌（Candida sp AS2.565菌）である。）は、薬用人参抽出物2重量％及び麦芽抽出物8重量％を含有する培地中で、30℃にて56時間振とう培養された。遠心分離により細胞を除去した後、細胞を含有しない上澄み液500mlに、(NH4)2SO4粉末を65％飽和度まで加えた。この溶液をpH5の0.01M酢酸緩衝液に対して透析した。不溶物を遠心分離により除去し、25mlの粗酵素溶液を得た。
4. Ginsenoside glucosidase from yeast Candida genus FFCCDL-2g (obtained from the Dalian Light Industry Gakuin Fungus Preservation Center . Candida genus FFCCDL-2g was acquired by the Dalian Light Industry Gakuin, China's Common Microbial Species Preservation Center , China Bacteria (Candida sp AS2.565) obtained from the Institute of Microbiology of the Academy of Sciences (Chinese Academy of Sciences, Institute of Microbiology, Chinese Common Microbial Species Preservation Center: Bacterial Inventory, Science Publishers, published in 1982 ) The mixture was cultured with shaking at 30 ° C. for 56 hours in a medium containing 2% by weight of ginseng extract and 8% by weight of malt extract. After removing the cells by centrifugation, (NH 4 ) 2 SO 4 powder was added to 500 ml of the supernatant containing no cells to 65% saturation. This solution was dialyzed against 0.01M acetate buffer at pH 5. Insoluble matter was removed by centrifugation to obtain 25 ml of a crude enzyme solution.
この酵素溶液10mlを、0.5％Rd含有酢酸緩衝液10mlと60℃で12時間反応させた。TLC分析により、Rdの73％がジンセノサイドF2に変換されていることが明らかになった。このことは、上記酵素は、Rdの第３炭素原子におけるβ−（１→２）−グルコシドを加水分解できることを示している。この酵素は、Rg3のβ−（１→２）−グルコシドを加水分解してRh2を与えることもできる。
この酵素の最適反応温度は45℃で、最適pHは5.5である。
10 ml of this enzyme solution was reacted with 10 ml of an acetic acid buffer containing 0.5% Rd at 60 ° C. for 12 hours. TLC analysis, 73% of the Rd is found to have been converted to ginsenoside F 2. This indicates that the enzyme can hydrolyze β- (1 → 2) -glucoside at the third carbon atom of Rd. This enzyme can also hydrolyze the β- (1 → 2) -glucoside of Rg 3 to give Rh 2 .
The optimum reaction temperature for this enzyme is 45 ° C. and the optimum pH is 5.5.
5. ストレプトマイセス（Streptomyces）からのジンセノサイド グルコシダーゼ
ストレプトマイセス属 FFCCDL-2g（大連軽工業学院菌種保存所から入手。ストレプトマイセス属 FFCCDL-2gは、大連軽工業学院が、中国普通微生物菌種保蔵中心、中国科学院微生物研究所（中国科学院微生物研究所、中国普通微生物菌種保蔵中心編輯：菌種目録、科学出版社、1982年出版）から入手した菌（Streptomyces属のAS4.260菌）である。）は、薬用人参抽出物1重量％及び小麦のフスマ抽出物3重量％を含有する培地で、30℃にて48時間培養された。遠心分離により細胞を除去した後、細胞を含有しない上澄み液300mlに、(NH4)2SO4粉末を70％飽和度まで加えて、酵素を沈殿させた。この溶液を4℃で一晩保存し、遠心分離してペレットを採取した。該ペレットを懸濁させ、この懸濁液をpH5の0.01M酢酸緩衝液に対して透析した。不純物を遠心分離により除去し、15mlの粗酵素溶液を得た。
5. Ginsenoside glucosidase from Streptomyces genus Streptomyces FFCCDL-2g (obtained from the Dalian Light Industry Gakuin Preservation Center . The Streptomyces FFCCDL-2g is stored by the Dalian Light Industry Academy in China. It is a bacterium (Streptomyces genus AS4.260) obtained from the Institute for Microbiology of the Chinese Academy of Sciences (Chinese Academy of Microbiology Research Institute, Chinese Common Microbial Species Preservation Center, edited by Bacteria Catalog, Scientific Publishing Co., Ltd., published in 1982) .) is a medium containing
この酵素溶液10mlを、1％Rd含有酢酸緩衝液（エタノールを20％含有）10mlと50℃で20時間反応させた。TLC分析により、Rdの50％がジンセノサイドF2に変換されていることが明らかになった。このことは、ストレプトマイセスからのジンセノサイド グルコシダーゼは、Rdの第３炭素原子におけるβ−（１→２）−グルコシドを加水分解することを示している。
この酵素の最適反応温度は50℃で、最適pHは5.5である。
10 ml of this enzyme solution was reacted with 10 ml of 1% Rd-containing acetate buffer (containing 20% ethanol) at 50 ° C. for 20 hours. TLC analysis, 50% of the Rd is found to have been converted to ginsenoside F 2. This indicates that ginsenoside glucosidase from Streptomyces hydrolyzes β- (1 → 2) -glucoside at the third carbon atom of Rd.
The optimum reaction temperature for this enzyme is 50 ° C. and the optimum pH is 5.5.
5. 担子菌からのジンセノサイド グルコシダーゼ
トレメラ（Tremella）属 FFCCDL-12g（大連軽工業学院菌種保存所から入手。トレメラ（Tremella）属 FFCCDL-12gは、大連軽工業学院が、中国普通微生物菌種保蔵中心、中国科学院微生物研究所（中国科学院微生物研究所、中国普通微生物菌種保蔵中心編輯：菌種目録、科学出版社、1982年出版）から入手した菌（Tremella属のAS5.167菌）である。）は、薬用人参粉末125g、小麦のフスマ374g及び水500mlを含有する固体培地上で、5〜7日間培養された。次いで、pH5の0.01M酢酸緩衝液2500mlを上記固体培地に加え、2時間放置した。遠心分離により不溶物を除去し、約2000mlの液体を得た。該液体に、(NH4)2SO4粉末を70％飽和度まで攪拌しながら加えた。この溶液を4℃で一晩放置し、遠心分離してペレットを採取した。該ペレットを懸濁させ、この懸濁液をpH5の0.01M酢酸緩衝液に対して透析した。次いで、この溶液を0.01M酢酸緩衝液を用いて150mlまで希釈した。不純物を遠心分離により除去し、粗酵素溶液を得た。
5. obtained from Jinseno side glucosidase <br/> Toremera (Tremella) genus FFCCDL-12g (Dalian Light Industry Institute species preservation office from Basidiomycetes. Toremera (Tremella) genus FFCCDL-12g is, Dalian light industry Institute, China usually Bacteria obtained from the Microbial Species Preservation Center, Chinese Academy of Sciences Microbiology Research Institute (Chinese Academy of Sciences Microbiology Research Institute, China Common Microorganism Species Preservation Center Compilation: Bacterial Species List, Scientific Publishing Co., Ltd., published in 1982) is a bacterium).), the ginseng powder 125 g, on a solid medium containing bran 374g and water 500ml of wheat, were cultured for 5-7 days. Next, 2500 ml of 0.01 M acetate buffer solution at pH 5 was added to the solid medium and left for 2 hours. Insoluble matter was removed by centrifugation, and about 2000 ml of liquid was obtained. To the liquid, (NH 4 ) 2 SO 4 powder was added with stirring to 70% saturation. The solution was left at 4 ° C. overnight and centrifuged to collect the pellet. The pellet was suspended and the suspension was dialyzed against 0.01M acetate buffer at pH 5. The solution was then diluted to 150 ml with 0.01M acetate buffer. Impurities were removed by centrifugation to obtain a crude enzyme solution.
この酵素溶液10mlを、1％Rb1含有酢酸緩衝液（エタノールを20％含有）10mlと40℃で20時間反応させた。TLC分析により、Rb1は、Rd25％、F240％及びC-K35％の混合物に変換されていることが明らかになった。この結果は、トレメラからのジンセノサイド グルコシダーゼは、第3炭素原子におけるβ−グルコシド及び第20炭素原子におけるグルコシドを加水分解できることを示している。この酵素の最適反応温度は50℃で、最適pHは5.5である。
10 ml of this enzyme solution was reacted with 10 ml of 1% Rb 1- containing acetate buffer (containing 20% ethanol) at 40 ° C. for 20 hours. TLC analysis revealed that Rb 1 was converted to a mixture of
上述した実験から、細菌、ストレプトマイセス、酵母、カビ、及び担子菌等の微生物は、ジンセノサイド グルコシダーゼを産出することができ、この酵素の収量は、これらの微生物が薬用人参抽出物を含有する培地で培養されると、増加し得ると結論付けることができる。本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、従来のセルラーゼ（例えば、セルロースβ−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.21）及びセロビオース生成酵素）とは、反応特性が異なる。本発明のジンセノサイド グルコシダーゼは、ジンセノサイド加水分解能力によって、４種類、即ち、ジンセノサイド グルコシダーゼＩ、ジンセノサイド グルコシダーゼII、ジンセノサイド グルコシダーゼIII及びジンセノサイド−α−ラムノシダーゼに分類することができる。 From the experiments described above, microorganisms such as bacteria, Streptomyces, yeast, mold, and basidiomycete can produce ginsenoside glucosidase, and the yield of this enzyme is determined by the medium in which these microorganisms contain ginseng extract It can be concluded that it can be increased when cultured in The ginsenoside glucosidase of the present invention is different from conventional cellulases (for example, cellulose β-glucosidase (EC 3.2.1.21) and cellobiose-producing enzyme) in reaction characteristics. The ginsenoside glucosidase of the present invention can be classified into four types, namely ginsenoside glucosidase I, ginsenoside glucosidase II, ginsenoside glucosidase III, and ginsenoside-α-rhamnosidase, depending on the ability to hydrolyze ginsenoside.
薬用人参植物からのジンセノサイド グルコシダーゼ
2.1 酵素の抽出及び精製
新鮮な薬用人参根200gを、小片に裁断し、PH5の0.02M酢酸緩衝液600mlに加えた。この混合物を40℃で2時間放置した後、濾過により上澄み液を得た。該上澄み液に、(NH4)2SO4を70％飽和度まで徐々に加え、この混合物を40℃で一晩放置した。次いで、蛋白質ペレットを、遠心分離により採取し、15mlの蒸留水に再び溶解した。この溶液をpH7.4の0.02M Tris-HClに透析した。不溶物を遠心分離により除去し、上澄み液の体積を20mlに調整した。
Ginsenoside glucosidase from ginseng plant
2.1 Enzyme extraction and purification 200 g of fresh ginseng root was cut into small pieces and added to 600 ml of PH5 0.02M acetate buffer. The mixture was allowed to stand at 40 ° C. for 2 hours, and then a supernatant was obtained by filtration. To the supernatant, (NH 4 ) 2 SO 4 was gradually added to 70% saturation and the mixture was left at 40 ° C. overnight. The protein pellet was then collected by centrifugation and redissolved in 15 ml distilled water. This solution was dialyzed against 0.02M Tris-HCl at pH 7.4. Insoluble matter was removed by centrifugation, and the volume of the supernatant was adjusted to 20 ml.
この酵素溶液5mlをDEAE-セルロース DE-25カラム（Whatman, 1.4×6.7cm）で処理した。該カラムをKCl勾配（0.06, 0.12, 0.18及び0.24M）で溶出した。溶出後、各フラクションをジンセノサイド加水分解活性について試験した。フラクション37は、C-3におけるジグルコースとアグリコンとの間のグリコシド結合を加水分解して、RdをC-Kに変換することが見出された。フラクション52は、Rdの第3炭素原子におけるβ−（１→２）−グルコシドを加水分解してF2を与えることが見出された。フラクション52はまた、Rb及びRcの第20炭素原子におけるグルコシド結合を加水分解して、ジンセノサイドF2を与えることができる。結果を表10に示す。 5 ml of this enzyme solution was treated with a DEAE-cellulose DE-25 column (Whatman, 1.4 × 6.7 cm). The column was eluted with a KCl gradient (0.06, 0.12, 0.18 and 0.24M). After elution, each fraction was tested for ginsenoside hydrolysis activity. Fraction 37 was found to hydrolyze the glycosidic bond between diglucose and aglycone at C-3, converting Rd to CK. Fraction 52 was found to hydrolyze β- (1 → 2) -glucoside at the third carbon atom of Rd to give F 2 . Fraction 52 also hydrolyzes glucosidic bonds in the 20 carbon atoms of Rb and Rc, may give ginsenoside F 2. The results are shown in Table 10.
表10から明らかなように、DEAE-セルロースカラムから溶出されたフラクション52は、ジンセノサイドRb1、Rb2及びRcの第20炭素原子におけるグルコシド結合及び第3炭素原子におけるβ−（１→２）−グルコシドを加水分解することができる。フラクション52は、SDS-ポリアクリルアミドゲルで泳動したときに単一の点として表れ、この酵素の分子量は59000と算出された。従って、フラクション52中の酵素はジンセノサイド グルコシダーゼＩである。しかしながら、アスペルギルス ニガーからのジンセノサイド グルコシダーゼＩと比較すると、薬用人参植物からのジンセノサイド グルコシダーゼＩは、分子量が僅かに大きく、アグリコンと直接連結するグリコシド結合を加水分解することができない。フラクション37から精製された酵素は、第3炭素原子におけるジグルコースとアグリコンとの間のグリコシド結合を加水分解して、ジンセノサイドC-Kを与えることができ、このため、この酵素はジンセノサイド グルコシダーゼIIIと分類された。
カルシウムイオンは、これらの両方の酵素の増強作用を有するのに対して、銅イオンは阻害作用を有する。これらの精製された酵素の特性を表11にまとめる。
As is apparent from Table 10, the fraction 52 eluted from the DEAE-cellulose column is composed of glucoside bonds at the 20th carbon atom of ginsenoside Rb 1 , Rb 2 and Rc and β- (1 → 2) − at the 3rd carbon atom. Glucosides can be hydrolyzed. Fraction 52 appeared as a single point when run on SDS-polyacrylamide gel and the molecular weight of this enzyme was calculated to be 59000. Thus, the enzyme in fraction 52 is ginsenoside glucosidase I. However, compared to ginsenoside glucosidase I from Aspergillus niger, ginsenoside glucosidase I from ginseng plants is slightly larger in molecular weight and cannot hydrolyze the glycosidic bond directly linked to aglycone. The enzyme purified from fraction 37 can hydrolyze the glycosidic bond between diglucose and aglycone at the third carbon atom to give ginsenoside CK, which is therefore classified as ginsenoside glucosidase III. It was.
Calcium ions have an enhancing action on both of these enzymes, whereas copper ions have an inhibitory action. The properties of these purified enzymes are summarized in Table 11.
小麦のフスマからのジンセノサイド グルコシダーゼ
3.1 酵素の抽出
小麦のフスマ500gを、pH5の0.02M酢酸緩衝液2500mlに加え、40℃で2時間抽出した。濾過により2000mlの上澄み液を得た後、該上澄み液に(NH4)2SO4を70％飽和度まで攪拌しながら徐々に加えた。この混合物を4℃で一晩放置した。次いで、蛋白質ペレットを、遠心分離により採取し、80mlの蒸留水に再び溶解した後、pH5.0の0.02M酢酸緩衝液に透析した。不溶物を遠心分離により除去し、上澄み液の体積を200mlに調整して粗酵素溶液を得た。
Ginsenoside glucosidase from wheat bran
3.1 Extraction of enzyme 500 g of wheat bran was added to 2500 ml of 0.02 M acetate buffer at pH 5 and extracted at 40 ° C. for 2 hours. After obtaining 2000 ml of supernatant by filtration, (NH 4 ) 2 SO 4 was gradually added to the supernatant with stirring to 70% saturation. The mixture was left at 4 ° C. overnight. The protein pellet was then collected by centrifugation, redissolved in 80 ml distilled water and dialyzed against 0.02 M acetate buffer at pH 5.0. Insoluble matter was removed by centrifugation, and the volume of the supernatant was adjusted to 200 ml to obtain a crude enzyme solution.
3.2 酵素の性質
上記酵素溶液10mlを1％ジンセノサイド基質10mlと40℃で20時間反応させた。生成物をTLCで検出した。その結果を表１２に示す。
3.2 Properties of
表12から明らかなように、小麦のフスマからの酵素は、Rdの第3炭素原子におけるグルコシドを加水分解して、F2を与えることができ、Rb1、Rb2及びRcの第20及び第3炭素原子におけるグルコシドを加水分解して、F2を与えることができる。
この酵素の最適pHは5.0で、最適温度は40℃である。Fe++及びMg++は酵素の活性を高めることができ、これに対して、Cu++は阻害効果を有する。
As is apparent from Table 12, the enzyme from wheat bran can hydrolyze the glucoside at the 3rd carbon atom of Rd to give F 2 , and the 20th and 1st of Rb 1 , Rb 2 and Rc. glucoside in 3 carbon atoms can be hydrolyzed to give F 2.
The optimum pH of this enzyme is 5.0 and the optimum temperature is 40 ° C. Fe ++ and Mg ++ can increase the activity of the enzyme, whereas Cu ++ has an inhibitory effect.
その他の起源からのジンセノサイド グルコシダーゼ
4.1 麦芽からの酵素
麦芽200gを粉砕し、pH5の0.01M酢酸緩衝液1000mlを加え、室温で2時間抽出した。この混合物を濾過した。この上澄み液に3体積倍のエタノールを加え、一晩放置した。沈殿物を採取し、該沈殿物にpH5の0.01M酢酸緩衝液50mlを加えた。不溶物を除去して酵素溶液を得た。該酵素溶液10mlを、1％Rb1含有0.01M酢酸緩衝液（pH5、エタノールを20％含有）10mlと、40℃で20時間反応させた。反応生成物をTLCにより検出した。その結果、Rb1の95％以上が、Rd、F2、C-K、Rg3等に変換されていた。これらのデータは、上記酵素ジンセノサイドの第3炭素原子におけるβ−グルコシドを、第20炭素原子におけるグリコシドと同様に加水分解することができることを示している。
Ginsenoside glucosidase from other sources
4.1 Enzymes from malt 200 g of malt was pulverized, 1000 ml of 0.01 M acetate buffer at pH 5 was added, and the mixture was extracted at room temperature for 2 hours. This mixture was filtered. Three volumes of ethanol was added to the supernatant and left overnight. The precipitate was collected and 50 ml of 0.01M acetate buffer pH 5 was added to the precipitate. Insoluble matter was removed to obtain an enzyme solution. 10 ml of the enzyme solution was reacted with 10 ml of 0.01 M acetate buffer (pH 5, containing 20% ethanol) containing 1% Rb 1 at 40 ° C. for 20 hours. The reaction product was detected by TLC. As a result, 95% or more of Rb 1 was converted to Rd, F 2 , CK, Rg 3 and the like. These data indicate that β-glucoside at the third carbon atom of the enzyme ginsenoside can be hydrolyzed in the same manner as the glycoside at the 20th carbon atom.
4.2 動物の肝臓からの酵素
牛の肝臓100gを細かく刻み、pH5の0.01M酢酸緩衝液300mlに加え、室温で2時間抽出した。この混合物を遠心分離し、(NH4)2SO4を上澄み液に70％飽和度まで加えて、酵素を沈殿させた。この混合物を4℃で一晩放置した。遠心分離により沈殿物を採取し、pH5の0.01M酢酸緩衝液に対して透析した。不純物を除去し、酵素溶液15mlを得た。酵素溶液10mlを、1％Rb1含有0.01M酢酸緩衝液（pH5、エタノールを20％含有）10mlと、40℃で20時間反応させた。TLC分析は、Rb1の50％が、糖含量が低いジンセノサイドに変換されたことを示し、このことは、動物の肝臓中にジンセノサイド グルコシダーゼが存在することを意味している。
4.2 Enzyme from animal liver 100 g of cattle liver was minced and added to 300 ml of 0.01 M acetate buffer at pH 5 and extracted at room temperature for 2 hours. The mixture was centrifuged and (NH 4 ) 2 SO 4 was added to the supernatant to 70% saturation to precipitate the enzyme. The mixture was left at 4 ° C. overnight. The precipitate was collected by centrifugation and dialyzed against 0.01M acetate buffer at pH 5. Impurities were removed to obtain 15 ml of enzyme solution. 10 ml of the enzyme solution was reacted with 10 ml of 0.01 M acetate buffer (pH 5, containing 20% ethanol) containing 1% Rb 1 at 40 ° C. for 20 hours. TLC analysis showed that 50% of Rb 1 was converted to ginsenoside with a low sugar content, which means that ginsenoside glucosidase is present in the liver of the animal.
4.3 植物の種子（アーモンド）からの酵素
アーモンド100gを粉砕し、pH5の0.01M酢酸緩衝液の300mlを加え、室温で2時間抽出した。この混合物を遠心分離した。(NH4)2SO4を上澄み液に60％飽和度まで加えて、酵素を沈殿させた。この混合物を4℃で一晩放置した。遠心分離により沈殿物を採取し、pH5の0.01M酢酸緩衝液に対して透析した。不純物を除去し、酵素溶液30mlを得た。酵素溶液10mlを、1％Rb1含有0.01M酢酸緩衝液（pH5、エタノールを20％含有）10mlと、50℃で14時間反応させた。TLC分析は、Rb1の40％が、糖含量が低いジンセノサイドに変換されたことを示し、このことは、アーモンド中にジンセノサイド グルコシダーゼが存在することを意味している。
4.3 Enzymes from plant seeds (almonds) 100 g of almonds were pulverized, added with 300 ml of 0.01 M acetate buffer at pH 5 and extracted at room temperature for 2 hours. This mixture was centrifuged. (NH 4 ) 2 SO 4 was added to the supernatant to 60% saturation to precipitate the enzyme. The mixture was left at 4 ° C. overnight. The precipitate was collected by centrifugation and dialyzed against 0.01M acetate buffer at pH 5. Impurities were removed to obtain 30 ml of enzyme solution. 10 ml of the enzyme solution was reacted with 10 ml of 0.01 M acetate buffer (pH 5, containing 20% ethanol) containing 1% Rb 1 at 50 ° C. for 14 hours. TLC analysis showed that 40% of Rb 1 was converted to ginsenoside with a low sugar content, which means that ginsenoside glucosidase is present in almonds.
ジンセノサイド グルコシダーゼによる、稀有ジンセノサイド含有量が高い混合ジンセノサイド及び薬用人参製品の製造
5.1 稀有ジンセノサイド含有量が高い混合ジンセノサイドの製造
薬用人参の葉からの混合ジンセノサイド4ｇを、pH5の0.01M酢酸緩衝液100mlに溶解し、実施例1の1.2の項において得られたアスペルギルス オリゼーからの酵素溶液100mlを添加した。反応を30℃にて4時間行なった後、水飽和ブタノール100mlで2回抽出を行なった。これらのブタノール層を合わせて、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。3.3ｇのジンセノサイドが得られた。TLC分析は、稀有ジンセノサイドRg3、Rg2、Rh2及びRh1の含有量が数十倍上昇していることを示した。
Production of mixed ginsenoside and medicinal carrot products with high content of rare ginsenoside by ginsenoside glucosidase
5.1 Production of mixed ginsenoside with high content of rare ginsenoside Enzyme from Aspergillus oryzae obtained in section 1.2 of Example 1 by dissolving 4 g of mixed ginsenoside from ginseng leaves in 100 ml of 0.01 M acetate buffer at pH 5 100 ml of solution was added. The reaction was performed at 30 ° C. for 4 hours, and then extracted twice with 100 ml of water-saturated butanol. These butanol layers were combined and evaporated to dryness under reduced pressure. 3.3 g of ginsenoside was obtained. TLC analysis showed that the contents of rare ginsenosides Rg 3 , Rg 2 , Rh 2 and Rh 1 were increased tens of times.
5.2 稀有ジンセノサイド含量が高い薬用人参製品の製造
薬用人参粉末4ｇに、20％エタノール4ml、及び実施例1の1.2の項において得られたアスペルギルス オリゼーからの酵素溶液4mlを添加した。反応を30℃にて12時間行なった後、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。稀有ジンセノサイド含量が高い薬用人参製品が得られた。TLC分析は、稀有ジンセノサイドRg3、Rg2、Rh2及びRh1の含有量が数十倍上昇していることを示した。
5.2 Manufacture of Ginseng Products with High Rare Ginsenoside Content To 4 g of ginseng powder, 4 ml of 20% ethanol and 4 ml of the enzyme solution from Aspergillus oryzae obtained in section 1.2 of Example 1 were added. The reaction was carried out at 30 ° C. for 12 hours and then evaporated to dryness under reduced pressure. A ginseng product with a high content of rare ginsenoside was obtained. TLC analysis showed that the contents of rare ginsenosides Rg 3 , Rg 2 , Rh 2 and Rh 1 were increased tens of times.
5.3 酵素反応から得られたジンセノサイドの化学構造
プロトパナキサジオール系ジンセノサイドの酵素変換から得られたジンセノサイドRd、Rg3、F2、Rh2、C-K及びアグリコン、並びにプロトパナキサトリオール系ジンセノサイドから得られたジンセノサイドRg1、Rg2、Rh1及びアグリコンを、中国人参、張書臣主編、上海科技教育出版社、1992、p108-110（China Ginseng, Zhang Shunchen (ed.), Shanghai Educational Press, 1992, p108-110）に記載されたように、シリカゲルカラムで処理し、様々な比のクロロホルム及びメタノールで溶出させて、再結晶により精製された各種の単一ジンセノサイドを単離した。
5.3 Chemical structure of ginsenoside obtained from enzymatic reaction Ginsenoside obtained from enzymatic conversion of protopanaxadiol ginsenoside Rd, Rg 3 , F 2 , Rh 2 , CK and aglycone, and protopanaxatriol ginsenoside Ginsenoside Rg 1 , Rg 2 , Rh 1 and Aglycon were converted into Chinese ginseng, Zhang Shoji, edited by Shanghai Science and Technology Publishing Company, 1992, p108-110 (China Ginseng, Zhang Shunchen (ed.), Shanghai Educational Press, 1992, p108- 110), and treated with a silica gel column and eluted with various ratios of chloroform and methanol to isolate various single ginsenosides purified by recrystallization.
ジンセノサイドRg3、Rg2、Rh2及びRh1の20(S)-型及び20(R)-型が、検出器 Waters Programmable Multiwavelength、波長203nm、C-18カラムの Waters Model-520を用いたHCLPにより分離された。移動層はアセトニトリル：メタノール（６：４）である。 Ginsenoside Rg 3 , Rg 2 , Rh 2 and Rh 1 20 (S) -type and 20 (R) -type are detectors Waters Programmable Multiwavelength, wavelength 203nm, HCLP using C-18 column Waters Model-520 Separated by. The moving bed is acetonitrile: methanol (6: 4).
酵素反応から精製された各ジンセノサイドの構造は、d5−ピリジンを溶媒とし、Bruker DR X 400を用いた核磁気共鳴（NMR）と、JOEL DX X 400を用い、試料に衝撃を与える高速原子衝撃質量分析（FAB-MS）での質量分析によって分析した。 The structure of each ginsenoside purified from the enzymatic reaction is nuclear magnetic resonance (NMR) using Bruker DR X 400 with d 5 -pyridine as solvent, and fast atom bombardment that gives impact to the sample using JOEL DX X 400 Analysis was performed by mass spectrometry with mass spectrometry (FAB-MS).
上記酵素反応から得られたジンセノサイドRd、Rg3、F2、Rh2、C-K、Rg1、Rg2、Rh1及びアグリコンの質量スペクトルデータ並びに1H-NMR及び13C-NMRのスペクトルデータは、従来技術（例えば、J.H. Park et al., A new processed ginseng with fortified activity in Advances in Ginseng Reseach-Proceedings of 7th International Symposium on Ginseng, Sep 22-25, 1998, p146-159; Tanak O., Kasai R.: (1984), Saponins of ginseng and related plants in Progress in the Chemistry of Organic Natural Products (HerzW., Grisebach H., Kirby G.W., Tamm Ch., eds), Vol.46, p1-65）に開示されているものと一致した。13C-NMRのスペクトルデータを表13に示す。表13に示されるように、上記酵素反応により産出されたジンセノサイドRd、F2、C-K及びRg1は、20(S)-型のジンセノサイドであるのに対して、酵素反応により得られたジンセノサイドRg3、Rg2、Rh2及びRh1は、20(S)-型及び20(R)-型の両方だった。これらのデータは、酵素反応によって産出されるジンセノサイドRd、F2、C-K及びRg1は、主に20(S)-型であるのに対して、酵素反応によって産出されるジンセノサイドRg3、Rg2、Rh2及びRh1は、20(S)-型及び20(R)-型の混合物であることを意味している。20(S)-ジンセノサイド及び20(R)-ジンセノサイドの構造を図５に示す。 Mass spectral data of ginsenoside Rd, Rg 3 , F 2 , Rh 2 , CK, Rg 1 , Rg 2 , Rh 1 and aglycone obtained from the above enzyme reaction, and spectral data of 1 H-NMR and 13 C-NMR are as follows: Conventional technology (e.g. JH Park et al., A new processed ginseng with fortified activity in Advances in Ginseng Reseach-Proceedings of 7 th International Symposium on Ginseng, Sep 22-25, 1998, p146-159; Tanak O., Kasai R .: (1984), Saponins of ginseng and related plants in Progress in the Chemistry of Organic Natural Products (HerzW., Grisebach H., Kirby GW, Tamm Ch., Eds), Vol. 46, p1-65) Matched what you have. The spectral data of 13 C-NMR are shown in Table 13 . As shown in Table 13 , ginsenoside Rd, F 2 , CK and Rg 1 produced by the above enzyme reaction are 20 (S) -type ginsenoside, whereas ginsenoside Rg obtained by the enzyme reaction 3 , Rg 2 , Rh 2 and Rh 1 were both 20 (S) -type and 20 (R) -type. These data show that ginsenoside Rd, F 2 , CK and Rg 1 produced by enzymatic reaction are mainly 20 (S) -type, whereas ginsenoside Rg 3 , Rg 2 produced by enzymatic reaction , Rh 2 and Rh 1 mean a mixture of 20 (S) -type and 20 (R) -type. The structures of 20 (S) -ginsenoside and 20 (R) -ginsenoside are shown in FIG.
Claims (5)
ジンセノサイドRa、Rb1、Rb2、Rc、Rd及びRg3の第3炭素原子（C-3）及び第20炭素原子（C-20）におけるβ-グルコシド、β-キシロシド及びα-アラビノシド結合を加水分解するジンセノサイド グルコシダーゼであって、ジンセノサイドRa、Rb1、Rb2及びRcを加水分解してジンセノサイドRdを与え、更にジンセノサイドRdを加水分解してジンセノサイドＦ2を与え、更にジンセノサイドF2を加水分解してジンセノサイドC-K及びRh2並びにアグリコンを与えるジンセノサイド グルコシダーゼＩ
ジンセノサイドRa、Rb1、Rb2、Rc及びRdの第20炭素原子（C-20）におけるβ-グルコシド、β-キシロシド及びα-アラビノシド結合を加水分解するジンセノサイド グルコシダーゼであって、ジンセノサイドRa、Rb1、Rb2及びRcを加水分解してジンセノサイドRdを与え、更にジンセノサイドRdを加水分解してジンセノサイドRg3を与えるジンセノサイド グルコシダーゼII
ジンセノサイドRdの第3炭素原子（C-3）におけるアグリコンと糖基との間のグルコシド結合を加水分解して、ジンセノサイドC-Kを与えるジンセノサイド グルコシダーゼIII
ジンセノサイドRe及びRg2それぞれの第6炭素原子（C-6）におけるα-ラムノシド結合を加水分解して、ジンセノサイドRg1及びRh1それぞれを与えるジンセノサイド-α-ラムノシダーゼ
上記４種類の酵素の由来、最適温度、最適ｐＨ及び分子量は、それぞれ以下の通りであり、
ジンセノサイド グルコシダーゼＩ；
アスペルギルス ニガーを由来とし、最適温度が３０〜４０℃であり、最適ｐＨが４〜６であり、分子量が５１０００である
薬用人参植物を由来とし、最適温度が６０℃であり、最適ｐＨが４〜６であり、分子量が５９０００である
ジンセノサイド グルコシダーゼII；
アスペルギルス ニガーを由来とし、最適温度が３０〜４０℃であり、最適ｐＨが５〜７であり、分子量が９００００である
ジンセノサイド グルコシダーゼIII；
アスペルギルス ニガーを由来とし、最適温度が３０〜４５℃であり、最適ｐＨが４〜５であり、分子量が３４０００である
薬用人参植物を由来とし、最適温度が４５〜５５℃であり、最適ｐＨが４〜５であり、分子量が３６０００である
ジンセノサイド-α-ラムノシダーゼ；
アスペルギルス オリゼーを由来とし、最適温度が４０℃であり、最適ｐＨが５であり、５３０００である
上記４種類の酵素は、アスペルギルス ニガー又はアスペルギルス オリゼーから得られたジンセノサイド グルコシダーゼ又はジンセノサイド ラムノシダーゼ。The substrates are protopanaxadiol-based ginsenoside and protopanaxatriol-based ginsenoside, and the reaction products are ginsenoside Rh 1 , Rh 2 , CK, Rg 2 , Rg 3 , Fg generated after hydrolysis of the sugar group of ginsenoside 2 , ginsenoside glucosidase or ginsenoside rhamnosidase containing Rg 1 and Rd and aglycone, which is one of the following four enzymes :
Ginsenoside Ra, Rb 1, Rb 2, Rc, third carbon atoms of Rd and Rg 3 (C-3) and the 20 beta-glucoside at the carbon atom (C-20), β- xyloside and α- arabinoside bond hydrolysis A ginsenoside glucosidase that degrades ginsenoside Ra, Rb 1 , Rb 2 and Rc to give ginsenoside Rd, then hydrolyzes ginsenoside Rd to give ginsenoside F 2 and further hydrolyzes ginsenoside F 2 ginsenosides CK and Rh 2 and given the aglycone El ginsenosides glucosidase I Te
A ginsenoside glucosidase that hydrolyzes β-glucoside, β-xyloside, and α-arabinoside bonds at the 20th carbon atom (C-20) of ginsenoside Ra, Rb 1 , Rb 2 , Rc, and Rd, including ginsenoside Ra, Rb 1 Ginsenoside glucosidase II which hydrolyzes Rb 2 and Rc to give ginsenoside Rd, and further hydrolyzes ginsenoside Rd to give ginsenoside Rg 3
Ginsenoside glucosidase III which hydrolyzes the glucoside bond between the aglycone and sugar group at the third carbon atom (C-3) of ginsenoside Rd to give ginsenoside CK
The α- rhamnoside bond in ginsenosides Re and Rg 2 Each of the 6 carbon atom (C-6) is hydrolyzed, from ginsenoside -α- rhamnosidase above 4 types of enzymes which gives each ginsenoside Rg 1 and Rh 1, optimum The temperature, optimum pH and molecular weight are respectively as follows :
Ginsenoside glucosidase I;
It is derived from Aspergillus niger, the optimum temperature is 30-40 ° C., the optimum pH is 4-6, and the molecular weight is 51000.
It is derived from a medicinal carrot plant, the optimum temperature is 60 ° C., the optimum pH is 4-6, and the molecular weight is 59000.
Ginsenoside glucosidase II;
It is derived from Aspergillus niger, the optimum temperature is 30-40 ° C., the optimum pH is 5-7, and the molecular weight is 90000.
Ginsenoside glucosidase III;
It is derived from Aspergillus niger, the optimum temperature is 30-45 ° C., the optimum pH is 4-5, and the molecular weight is 34,000.
It is derived from a medicinal carrot plant, the optimum temperature is 45 to 55 ° C., the optimum pH is 4 to 5, and the molecular weight is 36000.
Ginsenoside-α-rhamnosidase;
Aspergillus oryzae and from optimum temperature is 40 ° C., the optimum pH of 5, the four types of enzymes is 53000, the Aspergillus niger or Aspergillus oryzae or we obtained ginsenoside glucosidase or ginsenoside rhamnosidase.
（１）ジンセノサイドRa、Rb(1) Ginsenoside Ra, Rb 11 、Rb, Rb 22 、Rc、Rd及びRg, Rc, Rd and Rg 3Three の第3炭素原子（C-3）及び第20炭素原子（C-20）におけるβ-グルコシド、β-キシロシド及びα-アラビノシド結合を加水分解し、ジンセノサイドRa、RbHydrolyzes β-glucoside, β-xyloside and α-arabinoside bonds at the 3rd carbon atom (C-3) and 20th carbon atom (C-20) of Ginsenoside Ra, Rb 11 、Rb, Rb 22 及びRcを加水分解してジンセノサイドRdを与え、更にジンセノサイドRdを加水分解してジンセノサイドＦAnd Rc are hydrolyzed to give ginsenoside Rd, and ginsenoside Rd is further hydrolyzed to give ginsenoside Fd. 22 を与え、更にジンセノサイドFAnd ginsenoside F 22 を加水分解してジンセノサイドC-K及びRhHydrolysis of ginsenoside C-K and Rh 22 並びにアグリコンを与えるAs well as give aglycon
（２）ジンセノサイドRa、Rb(2) Ginsenoside Ra, Rb 11 、Rb, Rb 22 、Rc及びRdの第20炭素原子（C-20）におけるβ-グルコシド、β-キシロシド及びα-アラビノシド結合を加水分解し、ジンセノサイドRa、Rb, Hydrolyze β-glucoside, β-xyloside and α-arabinoside bond at 20th carbon atom (C-20) of Rc and Rd, and ginsenoside Ra, Rb 11 、Rb, Rb 22 及びRcを加水分解してジンセノサイドRdを与え、更にジンセノサイドRdを加水分解してジンセノサイドRgAnd Rc are hydrolyzed to give ginsenoside Rd, and then ginsenoside Rd is hydrolyzed to give ginsenoside Rg. 3Three を与えるgive
（３）ジンセノサイドRdの第3炭素原子（C-3）におけるアグリコンと糖基との間のグルコシド結合を加水分解して、ジンセノサイドC-Kを与える(3) Hydrolysis of the glucoside bond between the aglycone and sugar group at the third carbon atom (C-3) of ginsenoside Rd gives ginsenoside C-K.
（４）ジンセノサイドRe及びRg(4) Ginsenoside Re and Rg 22 それぞれの第6炭素原子（C-6）におけるα-ラムノシド結合を加水分解して、ジンセノサイドRgHydrolysis of α-rhamnoside bond at each 6th carbon atom (C-6) yields ginsenoside Rg 11 及びRhAnd Rh 11 それぞれを与えるGive each
上記酵素溶液は、下記（ａ）〜（ｇ）の何れかの方法により製造されたものである酵素溶液。 The enzyme solution is an enzyme solution produced by any one of the following methods (a) to (g).
（ａ）アスペルギルス ニガー、アスペルス オリぜー又はストレプトマイセスを、薬用人参抽出物及び小麦のフスマ抽出物を含有する培地中で培養した後、培養物を遠心分離して得られる上澄み液に、（NH(A) After culturing Aspergillus niger, Aspergillus oryzae or Streptomyces in a medium containing a ginseng extract and wheat bran extract, the supernatant is obtained by centrifuging the culture ( NH 4Four ）) 22 SOSO 4Four を加えて酵素蛋白質を沈殿させた後、沈殿させた該酵素蛋白質を酢酸緩衝液に溶解し、次いで不純物を除去して、酵素溶液を得る方法To precipitate enzyme protein and then dissolve the precipitated enzyme protein in acetic acid buffer, and then remove impurities to obtain enzyme solution
（ｂ）好熱性・好気性バチルス属の細菌を、薬用人参抽出物、小麦のフスマ抽出物及びトリプトンを含有する培地中で培養した後、培養物を遠心分離して得られる上澄み液に、エタノールを加えて酵素蛋白質を沈殿させた後、沈殿させた該酵素蛋白質を酢酸緩衝液に溶解し、次いで不純物を除去して、酵素溶液を得る方法(B) After culturing the thermophilic and aerobic Bacillus bacteria in a medium containing medicinal ginseng extract, wheat bran extract and tryptone, the culture is centrifuged and ethanol is added to the supernatant. To precipitate enzyme protein and then dissolve the precipitated enzyme protein in acetic acid buffer, and then remove impurities to obtain enzyme solution
（ｃ）カンジダ属の酵母を、薬用人参抽出物及び麦芽抽出物を含有する培地中で培養した後、培養物を遠心分離して得られる上澄み液に、（NH(C) After culturing Candida yeast in a medium containing a ginseng extract and a malt extract, the supernatant is obtained by centrifuging the culture (NH 4Four ）) 22 SOSO 4Four を加えて酵素蛋白質を沈殿させた後、沈殿させた該酵素蛋白質を酢酸緩衝液に溶解し、次いで不純物を除去して、酵素溶液を得る方法To precipitate enzyme protein and then dissolve the precipitated enzyme protein in acetic acid buffer, and then remove impurities to obtain enzyme solution
（ｄ）トレメラ属の担子菌を、薬用人参粉末、小麦のフスマ及び水を含有する固体培地中で培養した後、酢酸緩衝液を、上記固体倍地に加えて得られる液体を、遠心分離し、不溶物を除去して得られる液体に、（NH(D) Tremella basidiomycetes are cultured in a solid medium containing ginseng powder, wheat bran and water, and then the liquid obtained by adding an acetate buffer to the solid medium is centrifuged. Into the liquid obtained by removing insoluble matter, (NH 4Four ）) 22 SOSO 4Four を加えて酵素蛋白質を沈殿させた後、沈殿させた該酵素蛋白質を酢酸緩衝液に溶解し、次いで不純物を除去して、酵素溶液を得る方法To precipitate enzyme protein and then dissolve the precipitated enzyme protein in acetic acid buffer, and then remove impurities to obtain enzyme solution
（ｅ）小麦のフスマを酢酸緩衝液で抽出した上澄み液に、（NH(E) The supernatant of wheat bran extracted with acetate buffer is added to (NH 4Four ）) 22 SOSO 4Four を加えて酵素蛋白質を沈殿させた後、沈殿させた該酵素蛋白質を酢酸緩衝液に溶解し、次いで不純物を除去して、酵素溶液を得る方法To precipitate enzyme protein and then dissolve the precipitated enzyme protein in acetic acid buffer, and then remove impurities to obtain enzyme solution
（ｆ）麦芽を酢酸緩衝液で抽出した上澄み液に、エタノールを加えて酵素蛋白質を沈殿させた後、沈殿させた該酵素蛋白質を酢酸緩衝液に溶解し、次いで不純物を除去して、酵素溶液を得る方法(F) After adding ethanol to the supernatant obtained by extracting malt with an acetate buffer to precipitate the enzyme protein, the precipitated enzyme protein is dissolved in the acetate buffer, then impurities are removed, and the enzyme solution How to get
（ｇ）牛の肝臓を酢酸緩衝液で抽出した上澄み液に、（NH(G) The supernatant of bovine liver extracted with acetate buffer is added to (NH 4Four ）) 22 SOSO 4Four を加えて酵素蛋白質を沈殿させた後、沈殿させた該酵素蛋白質を酢酸緩衝液に溶解し、次いで不純物を除去して、酵素溶液を得る方法To precipitate enzyme protein and then dissolve the precipitated enzyme protein in acetic acid buffer, and then remove impurities to obtain enzyme solution
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