KR101312835B1 - 알데히드 디하이드로지네이즈를 코딩하는 ｐｕｕＣ 유전자가 형질도입된 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산 단독 혹은 １，３―프로판디올 및 ３―하이드록시프로피온산의 동시 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알데히드 디하이드로지네이즈(aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 puuC 유전자로 구성된 재조합 벡터를 형질 도입함으로써 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산 단독, 또는 3-하이드록시프로피온산과 1,3-프로판디올을 동시에 생산하는 재조합 미생물에 관한 것으로, 상기 재조합 미생물은 현재 화학공정으로 생산하기 어려운 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산을 생산효율이 우수하면서 환경친화적인 생물공정을 통해 생산할 수 있게 한다. 더욱이 본 발명에 따른 재조합 미생물은 종래 기술에서는 고가의 원료인 비타민 B-12를 사용해야 하는 것과 달리, 비타민 B-12의 사용 없이도 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산을 생산할 수 있게 하는 장점이 있다.

Description

알데히드 디하이드로지네이즈를 코딩하는 ｐｕｕＣ 유전자가 형질도입된 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산 단독 혹은 １，３―프로판디올 및 ３―하이드록시프로피온산의 동시 제조방법{Recombinant microorganism transformed with puuC gene encoding 3-hydroxypropionaldehyde dehydrogenase and method of preparing 3-hydroxypropionic acid or co-preparing 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid therewith}

본 발명은 알데히드 디하이드로지네이즈(aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 puuC 유전자가 형질도입된 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산 단독 혹은 1,3-프로판디올 및 3-하이드록시프로피온산의 동시 제조방법에 관한 것이다.

최근, 석유 가격의 급격한 상승과 심각한 환경 문제가 야기되면서 바이오 기반 연료의 생산이 각광을 받고 있다. 바이오 기반 연료 중의 하나인 바이오디젤은 식물성 기름이나 동물성 지방으로부터 트리글리세라이드의 에스테르 교환 반응에 의해 생산된다.

바이오디젤의 대량 생산으로 인해 부산물인 글리세롤 생산이 급증하였으며, 바이오디젤 10억 갤런 당 약 1억 갤런의 글리세롤이 생산되고 있다. 글리세롤 생산이 급증함에 따라 세계적으로는 10억 톤(ton)의 글리세롤이 생산되고 있다. 이에 따라 최근 2년간 글리세롤의 가격은 10배 정도 감소하였다. 정제되지 않은 글리세롤의 시장가격은 2004년에는 톤(ton)당 350달러이며, 현재는 톤(ton)당 200달러 수준으로 알려져 있다.

이와 비교하여, 현재 글루코오즈(포도당)의 가격은 톤(ton)당 500달러 수준으로 알려져 있으며 점차적으로 증가할 것으로 보인다. 현재의 추세를 감안할 때 글리세롤 가격의 지속적 감소는 불가피한 것으로 판단된다.

미생물은 탄소원으로 글리세롤을 사용할 수 있으며, 이를 이용하여 다양한 발효 생산물을 만들 수 있다. 3-하이드록시프로피온산(3-HP; C₃H₆O₃ - MW 90.08)은 화학공정에서 다양한 응용분야를 가지는 화합물로써, 글리세롤과 같은 재생 가능한 자원으로부터 생산할 수 있다.

3-HP는 25℃에서 pKa 4.51인 약산으로서, 구조적으로 탄소 3개를 가지는 비카이랄 유기산으로 젖산(2-하이드록시프로피온산)과 이성질체이다. 또한 비결정질이고, 시럽과 같은 연한 노란색을 띠며, 비중은 1.25, 굴절률은 1.45이다.

3-HP는 여러 화학공정에 사용되는 중요한 합성 중간체로, 1,3-프로판디올(C₃H₈O₂ - MW 76.09), 아크릴산(C₃H₄O₂ - MW 72.06), 메틸 아크릴에이트(C₄H₆O₂ - MW 86.09), 아크릴아마이드(C₃H₅NO - MW 71.08), 에틸 3-하이드록시프로피온산 C₅H₁₀O₃ - MW 118.13), 말로닉산(C₃H₄O₄ - MW 104.06), 프로피온락톤(C₃H₄O₂ - MW 72.06), 아크로니트릴(C₃H₄N - MW 53.06) 등을 생산할 수 있는 원료로 사용된다. 3-HP 관련 제품의 세계 시장규모는 360만톤이며 현재 수요와 가격에서 매년 5%씩 상승할 것으로 전망된다.

3-HP는 에틸렌 사이아노하이드린, 베타-아이도프로피온산, 베타-브로모프로피온산, 베타-클로로프로피온산, 베타-프로피오락톤, 아크릴산 등을 중간체로 하여 화학적 공정으로 생산될 수 있다. 그러나 이러한 화학물질 대부분이 유독하며 발암성을 띤다. 또한 높은 온도와 압력의 조건으로 대량의 에너지를 소모하며 다량으로 공해물질을 배출하는 단점을 가진다.

또한, 생물학적 3-HP 생산은 광종속영양성 미생물인 클로로플렉서스 오란티아커스(Chloroflexus aurantiacus)에 의해 이루어진다. 이 미생물은 독립영양적, 광종속영양적으로 자라면서 중간체로 3-HP를 생산한다. 글리세롤로부터 3-HP를 생산하는 또 다른 미생물로는 디설포바이브리오 카비놀리커스(Desulfovibrio carbinolicus), 디설포바이브리오 프럭토소보란스(Desulfovibrio fructosovorans), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 펠로박터 베네티아누스(Pelobacter venetianus), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus) 등이 알려져 있다.

그러나 대사경로가 복잡하기 때문에 공정의 효율적인 조절이 어려워 생산 수율 및 생산성의 저하가 예상되므로 생체 내에 존재하지 않는 합성 경로의 설계가 필수적으로 요구된다.

하기 반응식 1과 같이, 생물학적으로 두 종의 효소가 촉매하는 탈수 및 산화 공정을 통하여 글리세롤로부터 3-HP를 생산할 수 있다. 첫 번째 효소인 글리세롤 디하이드라테이즈는 글리세롤을 탈수화시켜 중간물질인 3-하이드록시프로피온알데히드(3-HPA) 생산 반응을 촉매시킨다. 한편 두 번째 효소인 알데히드 디하이드로지네이즈는 중간물질인 3-HPA를 산화시켜 최종산물인 3-HP를 생산한다.

[반응식 1]

반응식 1의 공정에 필요한 첫 번째 효소인 글리세롤 디하이드라테이즈는 글리세롤에서 1,3-프로판디올(1,3-PDO)을 생산하는 능력이 탁월한 클렙시엘라 뉴모니애에서 이미 잘 알려져 있다(Mu Y et al., Biotechnol. Letters. 28:1755-1759 (2006). 이 효소는 반응을 위해 보조효소인 비타민 B-12를 필요로 한다.

그러나, 3-HPA에 특이성이 높은 효소는 지금까지 밝혀지지 않았다. 최근에야 대장균(Escherichia coli) K-12의 AldH 단백질(S. M. Raj et al., Process Biochemastry, 43: 1440-1446,2008), 아조스피릴룸 브라실렌즈(Azospirillum brasilense)의 Kgsadh-I 단백질(Seiya Watanabe et al., The Journal of Biological chemistry Vol. 282, NO. 9, pp. 6685-6695, March 2, 2007) 그리고 클렙시엘라 뉴모니애 DSM 2026의 Puuc 단백질 (Subramanian Mohan Raj et al., Biotechnology and Bioprocess Engineering, 15: 1-1, 2010) 등이 3-HPA에 높은 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌고, 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)유래 DhaB와 AldH 또는 DhaB와 Kgsadh-I은 대장균에서 발현시킴으로써 고농도인 38.7 g/L의 3-HP 생산이 가능하였다(Chelladurai Rathnasingh et al., Biotechnol. Bioeng., 104(4):729, 2009).

그러나 클렙시엘라 뉴모니애 유래로 3-HPA 에 대해 활성이 높은 알데히드 디하이드로지네이즈는 아직까지 보고되지 않았다. 만일 클렙시엘라 뉴모니애 유래의 적절한 알데히드 디하이드로지네이즈가 얻어진다면 DhaB의 활성이 높은 클렙시엘라 뉴모니애 내에 단순히 이 효소만을 과발현 시킴으로써 3-HP의 생산이 가능하게 된다.

한편, 이러한 유전자 발현을 위해 대장균을 사용하는 경우 가장 큰 문제는 값비싼 보조 기질인 비타민 B-12를 사용한다는 데 있다. 첫 번째 효소, 즉 글리세롤을 탈수화시켜 3-HPA를 생성하는 클렙시엘라 뉴모니애 유래 글리세롤 디하이드라테이즈는 반드시 비타민 B-12를 필요로 하는데, 대장균은 이러한 비타민 B-12를 생산하는 능력을 자체적으로 보유하고 있지 못하기 때문이다.

값비싼 비타민 B-12 문제를 해결하는 방법은 대장균 외에 비타민 B-12를 자체적으로 생산하는 능력을 가진 균주를 숙주로 사용하는 것이다. 현재까지 자체적으로 비타민 B-12를 생산한다고 알려진 미생물은 슈도모나스 디니트리피칸스, 클렙시엘라 뉴모니애 등이다. 그러나 슈도모나스 디니트리피칸스는 글리세롤 대사능력이 전혀 없고, 유전자 조작 기술이 제대로 개발되어 있지 않다. 한편 클렙시엘라 뉴모니애는 자체적으로 비타민 B-12를 생산하는 능력이 있고 고활성의 글리세롤 디하이드라테이즈도 가지고 있지만 3-HPA에 특이적으로 작용하여 3-HP를 생산하는 디하이드로지네이즈에 대해서는 아직 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 글리세롤 대사능력이 탁월하고 비타민 B-12를 자체적으로 생산할 수 있는 미생물인 클렙시엘라 뉴모니애를 통하여 외부에서 비타민 B-12를 공급하지 않고 글리세롤로부터 3-HP를 생산하고자 노력한 결과, 클렙시엘라 뉴모니애 내에 3-HPA를 고효율로 3-HP로 전환하는 능력이 탁월한 효소를 코딩하는 유전자인 puuC를 찾아서 특성을 파악하고 클렙시엘라 뉴모니애 내에 과발현하게 되었다. 또한 중간 산물인 3-HPA를 1,3-PDO로 환원하는 DhaT 유전자를 클렙시엘라 뉴모니애 내에서 결실시킴으로써 글리세롤로부터 3-HPA를 단독으로 혹은 3-HPA 와 1,3-PDO를 동시에 생산할 수 있는 균주를 제작하게 되었다. 더 나아가 상기 puuC 유전자를 DhaB와 GdrAB 활성을 갖는 유전자 재조합 대장균 내에서 aldH 또는 kgsadh-I 대신 발현시킴으로써 고효율로 3-HP를 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 여러 종류의 박테리아가 글리세롤로부터 3-HP를 단독으로 혹은 3-HP와 동시에 1,3-PDO를 생산할 수 있도록 형질전환 하는데 필요한 유전자, 즉 3-하이드록시프로피온 알데히드 디하이드로지네이즈를 코딩하는 puuC 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 3-하이드록시프로피온 알데히드 디하이드로지네이즈를 코딩하는 puuC 유전자와, 추가적으로 글리세롤 디하이드라테이즈를 코딩하는 유전자 및 글리세롤 디하이드라테이즈 재활성화 효소를 코딩하는 유전자로 포함하여 구성되는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용하여 값비싼 기질인 비타민 B-12의 사용 없이도 글리세롤로부터 3-HP를 단독으로 혹은 3-HP와 1,3-PDO를 동시 생산하는 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알데히드 디하이드로지네이즈(aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 puuC 유전자로 구성된 재조합 벡터를 형질 도입함으로써 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산 단독, 또는 3-하이드록시프로피온산과 1,3-프로판디올을 동시에 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물을 제공한다.

상기 재조합 벡터는 글리세롤 디하이드라테이즈(glycerol dehydratase)를 코딩하는 dhaB 유전자 및 글리세롤 디하이드라테이즈 재활성화인자(glycerol dehydratase reactivase)를 코딩하는 gdrAB 유전자를 추가로 포함하여 구성될 수 있다.

본 발명에서 숙주로서 사용되는 미생물은 비타민 B-12 생성능을 갖거나 갖지 않는 어떠한 미생물이라 사용 가능하며, 예를들어 에스케리키아 속(genus Escherichia), 클렙시엘라 속(genus Klebsiella), 슈도모나스 속(genus Pseudomonas), 프로피오닉박테리움 속(genus Propionibacterium), 로도슈도모나스 속(genus Rhodopseudomonas) 및 리조비움 속(genus Rhizobium)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 미생물일 수 있다.

보다 상세하게는, 상기 미생물은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli BL21), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모니애 △dhaT(Klebsiella pneumoniae △dhaT), 슈도모나스 디니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans), 프로피오닉박테리움 스헤르만니이(Propionibacterium shermanii), 로도슈도모나스 프로타미쿠스(Rhodopseudomonas protamicus) 및 리조비움 발라미노지놈(Rhizobium cobalaminogenum)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 미생물일 수 있다.

상기 알데히드 디하이드로지네이즈를 코딩하는 puuC 유전자, 상기 글리세롤 디하이드라테이즈를 코딩하는 dhaB 유전자 및 상기 글리세롤 디하이드라테이즈 재활성화효소를 코딩하는 gdrAB 유전자는 각각 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) DSM 2026의 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다.

또한, 상기 재조합 미생물은 Escherichia coli/pCDFDuet_dhaB_gdrAB_pQE80L_puuC; GSB0181 (KCTC 11674BP), Klebsiella pneumoniae/pUC19_puuC; GSB0098 (KCTC 11671BP) 및 Klebsiella pneumoniae△dhaT/pUC19_puuC; GSB0163 (KCTC 11673BP)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

이하, 하기에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상기 재조합 미생물에 있어서, 글리세롤 디하이드라테이즈는 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)에서 유래한 효소로, 글리세롤을 3-HPA로 전환하며, dhaB1 유전자(KPN_03489)가 코딩하는 단백질인 대단위체(Large subunit 또는 α subunit라 불림), dhaB2 유전자(KPN_03488)가 코딩하는 단백질인 중단위체(Medium subunit 또는 β subunit라 불림), dhaB3 유전자(KPN_03487)가 코딩하는 단백질인 소단위체(Small subunit 또는 γ subunit라 불림) 등 세 가지 단백질로 구성되어 있다.

또한, 글리세롤 디하이드라테이즈 재활성화인자는 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)에서 유래한 단백질로, 글리세롤 디하이드라테이즈의 촉매 반응 시 상기 촉매의 활성을 유지시키는 작용을 하며, gdrA 유전자(KPN_03486)가 코딩하는 GdrA 단백질 및 gdrB 유전자가 코딩하는 GdrB 단백질로 구성되어 있다.

또한, 알데히드 디하이드로지네이즈도 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)에서 유래한 효소로, 3-HPA를 3-HP로 전환시키며 puuC 유전자(KPN_01018)가 코딩하는 PuuC 단백질로 구성되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배양배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 3-HP를 생산하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 3-HP의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배양배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 3-HP와 1,3-PDO를 동시에 생산하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 3-HP와 1,3-PDO의 동시 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 미생물을 숙주로 사용하고, 글리세롤을 탄소원으로 이용하여 3-HP를 단독으로 생산할지, 아니면 3-HP와 1,3-PDO를 동시에 생산할지 여부는 배양 단계에서 산소 공급에 따라 조절될 수 있다.

즉, 상기 배양단계가 호기 조건에서 수행되면 3-HP를 단독 생산할 수 있고, 특히 3-HPA를 1,3-PDO로 환원시키는 dhaT 유전자를 결실시킴으로써 3-HP를 단독 생산할 수 있는 반면, 상기 배양단계가 혐기 조건 또는 부분 호기 조건에서 수행되면 3-HP와 1,3-PDO를 동시에 생산할 수 있다. 예를 들어, 3-HP 단독 생산을 위해서는 산소 농도를 20% 이상으로 유지하고, 3-HP와 1,3-PDO의 동시 생산을 위해서는 산소 농도를 20% 이하로 유지할 수 있다.

상기 글리세롤로부터 3-HP 단독 생산 단계 또는 3-HP와 1,3-PDO 동시 생산 단계에서 비타민 B-12를 첨가할 수 있다.

또한, 상기 재조합 미생물의 배양 및 3-HP와 1,3-PDO의 수득과정은 종래 발효공업에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 분리정제방법을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 미생물은 고가의 비타민 B-12의 첨가없이 저가의 글리세롤로부터 효율적으로 3-HP 또는 1,3-PDO를 생산할 수 있으므로, 3-HP 또는 1,3-PDO와 같은 목적 대사산물의 생산가격을 절감하면서 3-HP 또는 1,3-PDO를 생산하는 균주로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 재조합 벡터 pUC19_puuC의 개열 지도이다.
도 2는 Escherichia coli BL21/pCDFDuet_dhaB_gdrAB_pQE80L_puuC의 호기 조건에서 실시된 회분식 발효 결과이다.
도 3a 내지 도 3c는 Klebsiella pneumoniae/pUC19_puuC의 회분식 발효 결과이다(a: 혐기조건, b: 부분호기조건, c: 호기조건).
도 4a 내지 도 4d는 Klebsiella pneumoniae △dhaT/pUC19_puuC의 회분식 발효(a, b, c) 및 유가식 발효(d) 결과이다(a: 혐기조건, b: 부분호기조건, c: 호기조건, d: 호기조건으로 배양 후 부분 호기조건으로 발효).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

특히, 하기 실시예에서는 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) 및 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)를 숙주세포로 사용하여 글리세롤로부터 3-HP 또는 1,3-PDO를 생산하는 방법을 개시하였지만, 비타민 B-12 생성능을 갖는 다른 미생물들, 즉 슈도모나스 디니트리피컨스(Pseudomonas denitrificans), 프로피오닉박테리움 스헤르만니이(Propionibacterium shermanii), 로도수도모나스 프로타미쿠스(Rhodopseudomonas protamicus), 리조비움 발라미노지놈(Rhizobium cobalaminogenum) 등의 균주를 숙주세포로 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

실시예 1. 글리세롤을 3-HP로 전환하는 유전자의 분리

1-1. 클렙시엘라 뉴모니애 DSM 2026로부터 dhaB 유전자의 증폭

클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) DSM 2026 균주로부터 게놈 DNA를 정방향 프라이머(서열번호: 1)와 역방향 프라이머(서열번호: 2)를 사용하여 PCR을 수행하여 dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 dhaB4 (gdrA) 유전자를 증폭하여 제한효소 EcoRI 과 HindⅢ로 절단하였다.

1-2. 클렙시엘라 뉴모니애 DSM 2026로부터 gdrB 유전자의 증폭

클렙시엘라 뉴모니애 DSM 2026 균주로부터 게놈 DNA를 정방향 프라이머(서열번호: 3)와 역방향 프라이머(서열번호: 4)를 사용하여 PCR을 수행하여 gdrB 유전자를 증폭하여 제한효소 HindⅢ 과 AfIⅡ로 절단하였다.

1-3. 클렙시엘라 뉴모니애 DSM 2026로부터 puuC 유전자의 증폭

클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) DSM 2026 균주로부터 게놈 DNA를 정방향 프라이머(서열번호: 5)와 역방향 프라이머(서열번호: 6)를 사용하여 PCR을 수행하여 puuC 유전자를 증폭하여 제한효소 BamHI 과 HindⅢ로 절단하였다.

1-4. 클렙시엘라 뉴모니애 DSM 2026으로부터 puuC 유전자의 증폭과 pUC19 벡터로부터 lac 프로모터 유전자의 증폭

lac 프로모터 유전자를 포함한 puuC 유전자를 증폭하기 위하여 오버래핑 (Overlapping) PCR 을 수행하였다.

pUC19 vector(New england biolabs #3041L)로부터 정방향 프라이머(서열번호: 7)와 puuC 유전자의 일부를 포함한 역방향 프라이머(서열번호: 8)를 사용하여 PCR을 수행하여 lac 프로모터 유전자를 증폭하였다.

그 후 클렙시엘라 뉴모니애 DSM 2026 균주로부터 게놈 DNA를 lac 프로모터 유전자의 3` 프라임 일부를 포함한 정방향 프라이머(서열번호: 9)와 HindⅢ site를 포함한 역방향 프라이머(서열번호: 10)를 사용하여 PCR을 수행하여 puuC 유전자를 증폭하였다.

상기에서 증폭된 두 PCR 산물 lac 프로모터 유전자와 puuC 유전자를 정방향 프라이머(서열번호: 7)와 HindⅢ site를 포함한 역방향 프라이머(서열번호: 10)를 사용하여 PCR을 수행하였다.

그 후 PCR 산물의 5` 프라임 끝에 인산기를 더하기 위하여 포스포 뉴클레오카이네이즈(phospho nucleokinase)를 처리하였다.

1-5. pKD4 플라스미드로부터 카나마이신 저항 유전자의 증폭

pKD4 벡터(Kirill et., Proceedings of the National Academy of Sciences, 97, (2000), 12)로부터 카나마이신 저항성 유전자를 정방향 프라이머(서열번호: 11)와 역방향 프라이머(서열번호: 12)를 사용하여 PCR을 수행하여 카나마이신 저항성 유전자를 증폭하여 제한효소 HindⅢ 와 NdeI 으로 절단하였다.

실시예 2. 3-HP 생산용 유전자 재조합 벡터의 제작

2-1. 재조합 벡터 pLB0024(pCDFDuet_ dhaB_gdrAB )의 제작

실시예 1-1과 1-2에서 증폭한 dhaB(dhaB1, dhaB2, dhaB3, dhaB4(gdrA))와 gdrB PCR 단편을 pGEM-T 벡터에 각각 접합하였다. 그리고 제작된 플라즈미드를 E. coli XL1-blue에 각각 도입하였다.

pLB0006(pGEM-T_dhaB) 플라즈미드는 제한효소 EcoRI 과 HindⅢ로 절단하였고, pLB0023(pGEM-T_gdrB) 플라즈미드는 제한효소 HindⅢ 과 AfIⅡ로 절단하였다.

두 개의 DNA 단편을 접합하여 제작된 플라즈미드를 발현 벡터인 pCDFDuet 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pLB0024 를 얻었다.

2-2. 재조합 벡터 pLB0037(pQE80L_puuC)의 제작

실시예 1-3에서 증폭한 puuC 유전자 PCR 단편을 pGEM-T 벡터에 접합하였다. 그리고 제작된 플라즈미드를 E.coli XL1-blue에 도입하였다.

pLB0107(pGEM-T_puuC) 플라즈미드는 BamHI 과 HindⅢ 제한효소로 절단하여 재조합 발현 벡터인 pQE80L 벡터에 클로닝하여 재조합 플라즈미드 pLB0037를 얻었다.

2-3. 재조합 벡터 pLB0066(pUC19_puuC)의 제작

실시예 1-4에서 증폭한 lac 프로모터를 포함한 pucC PCR 단편을 pUC19 벡터에 접합하였다. 그리고 제작된 플라즈미드를 E.coli DH5α에 도입하였다.

플라즈미드는 HindⅢ 과 NdeI 제한효소로 절단하여 실시예 1-5 에서 증폭한 카나마이신 카세트 와 접합하였다.

그 후 제작된 플라즈미드를 재조합 발현 벡터인 pUC19 벡터에 클로닝하여 재조합 플라즈미드 pLB0066를 얻었다(도 1 참조).

실시예 3. Klebsiella pneumoniae DdhaT 변이주의 제작

클렙시엘라 뉴모니애 DSM 2026 균주 게놈 DNA 중에서 dhaT 유전자를 넉아웃(knock-out) 하기 위하여 오버래핑(Overlapping) PCR을 수행하였다.

게놈 DNA 중에서 dhaT 유전자 Upstream 으로 부터 BamHI site를 포함한 정방향 프라이머(서열번호: 13)와 dhaT 유전자 Downstream 의 5` 프라임일부를 포함한 역방향 프라이머(서열번호: 14)를 사용해 PCR 을 수행하였다.

다음으로 dhaT Upstream 의 3` 프라임 일부를 포함한 정방향 프라이머(서열번호: 15)와 dhaT 유전자 Downstream 으로 부터 NotI site를 포함한 역방향 프라이머(서열번호: 16)를 사용해 PCR 을 수행하였다.

상기에서 증폭된 두 단편을 정방향 프라이머(서열번호: 13)와 역방향 프라이머(서열번호: 16)를 사용해 PCR 을 수행하여 dhaT 유전자를 제외한 dhaT 유전자의 Upstream 방향과 Downstream 방향의 유전자 단편을 확보 하였다.

dhaT 유전자 양쪽의 단편을 접합하여 BamHI 과 NotI 제한효소로 절단하여 pGEMT-vector에 다시 접합하고 2.5 kV, 25 μF, 400 ohms의 조건으로 전기천공법(electroporation)을 수행하여 E.coli_DH5α에 도입한 후 X-gal/IPTG 엠피실린 고체 배지에 도말하여 접합을 확인한 후 다시 knock-out에 유용한 pKOV 벡터 (A.J., Phillips et., J. Bacteriology (1997) 179: 6228-6237)에 접합하였다.

그 후 상기 접합된 벡터를 클렙시엘라 뉴모니애 DSM 2026 균주에 전기천공법(electroporation)으로 도입하여 LB 액체배지 1 mL을 가하여 200 rpm, 30 ℃ 진탕 배양기에서 1시간 동안 배양하였다.

배양하는 동안 클렙시엘라 뉴모니애 DSM 2026 균주 게놈 DNA의 dhaT를 포함한 양쪽의 유전자와 상보성이 있는 pKOV 벡터의 단편이 접합되면서 치환되었다. 그 후 클로람페니콜 (25 ㎍/ml) LB 고체배지에 42 ℃로 24시간 배양하였다. 42 ℃에서는 pKOV 벡터가 pSC101 유전자에 의해 복제되지 않기 때문이다.

배양한 고체 배지의 콜로니를 200 uL LB 액체배지에 접종하고 곧 클로람페니콜(25 ㎍/ml) LB 고체배지와 5% 슈크로오즈 LB 고체배지에 각각 스태핑하였다.

그 후 42 ℃에서 16시간 배양 하여 5% 슈크로오즈 LB 고체배지에서는 배양되지 않고 클로람페니콜 (25 ㎍/ml) LB 고체배지에서만 배양된 콜로니를 확보하여 정방향 프라이머(서열번호: 17)와 역방향 프라이머(서열번호: 18)를 사용하여 PCR을 수행하였다.

pKOV 벡터에 접합된 dhaT 유전자 양쪽 단편의 길이와 같은 콜로니를 선택하여 클로람페니콜 (25 ㎍/ml) LB 고체배지와 5% 슈크로오즈 LB 고체배지에 각각 스태핑하여 클로람페니콜 (25 ㎍/ml) LB 고체배지에서는 배양되고 5% 슈크로오즈 LB 고체배지에서는 배양되지 않는 콜로니를 선택하여 Klebsiella pneumoniae DdhaT 를 준비하였고 이를 GSB0162 균주라고 명명하였다.

실시예 4. 3-하이드록시프로피온산 생산용 유전자 재조합 균주의 제작

4-1. GSB0181 ( Escherichia coli BL21/pLB0011_pLB0037) 균주의 제작( E.Coli BL21 /pCDFDuet_dhaB_gdrAB_pQE80L_puuC)

E.coli BL21를 LB 고체배지에 도말하여 14시간 동안 37 ℃에서 배양한 후, 콜로니를 LB 액체배지 10 mL에 접종하여 12시간 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 LB 액체배지 100 mL에 1% 접종하여 200 rpm, 37 ℃ 진탕 배양기에서 배양하였다. 4~5시간 후, OD600가 0.3 ~ 0.4 정도가 되면 4 ℃, 4,500 rpm, 20 분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득한 다음, 4 ℃ 상태의 10% 글리세롤 용액 200 mL로 세포를 재현탁하였다. 그리고 4 ℃, 4,500 rpm, 20분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득하였다. 재현탁시 사용되는 글리세롤 용액을 반으로 줄여가며 이를 두 번 연속 실행한 후, 세포와 글리세롤 용액 부피비가 1:1 이 되도록 재현탁하여 세포 농축액을 수득하였다. 상기 수득된 세포 농축액과 상기 실시예 2-1 과 2-2에서 제작된 pLB0024와 pLB0037을 혼합한 다음, 2.5 kV, 25 μF, 400 ohms의 조건으로 전기천공법(electroporation)을 수행함으로써, 상기 발현 벡터를 배양된 E.coli BL21에 도입시켰다.

전기충격 후, LB 액체배지 1 mL을 가하여 200 rpm, 37 ℃ 진탕 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 배양액을 항생제 암피실린 (최종농도 100 ㎍/L) 과 스트립토마이신 (최종농도 50㎍/L) 를 함유한 LB 고체 배지에 도말하여, 37 ℃에서 12시간 이상 배양하였다. 형성된 콜로니를 암피실린 과 스트립토마이신 항생제가 함유된 LB 액체배지에서 12 시간 이상 배양하여, E.coli BL21/pLB0024_pLB0037 를 준비하였고, 이를 GSB0181 균주라고 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행에 2010년 3월 26일자에 기탁번호 KCTC 11674BP로 기탁하였다.

4-2. GSB0098 ( Klebsiella pneumoniae /pLB0066) 균주의 제작 ( K.pneumoniae /pUC19_lac_promoter_puuC_HindⅢ_Kana_NdeI)

클렙시엘라 뉴모니애를 LB 고체배지에 도말하여 14시간 동안 37 ℃에서 배양한 후, 콜로니를 0.7 mM EDTA 가 포함된 LB 액체배지 10 mL 과 접종하여 12시간 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 0.7 mM EDTA가 포함된 LB 액체배지 100 mL에 1% 접종하여 200 rpm, 37 ℃ 진탕 배양기에서 배양하였다. 4~5시간 후, OD600가 0.3 ~ 0.4 정도가 되면 4 ℃, 4,500 rpm, 20분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득한 다음, 4 ℃ 상태의 10% 글리세롤 용액 200 mL로 세포를 재현탁하였다. 그리고 4 ℃, 4,500 rpm, 20분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득하였다. 재현탁시 사용되는 글리세롤 용액을 반으로 줄여가며 이를 두 번 연속 실행한 후, 세포와 글리세롤 용액 부피비가 1:1이 되도록 재현탁하여 세포 농축액을 수득하였다. 상기 수득된 세포 농축액과 상기 실시예 2-3에서 제작된 pLB0066 벡터를 혼합한 다음, 2.5 kV, 25 μF, 400 ohms의 조건으로 전기천공법(electroporation)을 수행함으로써, 상기 발현 벡터를 배양된 클렙시엘라 뉴모니애에 도입시켰다.

전기충격 후, LB 액체배지 1 mL을 가하여 200 rpm, 37 ℃ 진탕 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 배양액을 항생제 암피실린 (최종농도 100 ㎍/L) 과 카나마이신 (최종농도 50 ㎍/L) 를 함유한 LB 고체 배지에 도말하여, 37 ℃에서 12시간 이상 배양하였다. 형성된 콜로니를 암피실린 과 카나마이신 항생제가 함유된 LB 액체배지에서 12시간 이상 배양하여, Klebsiella pneumoniae /pLB0066 를 준비하였고, 이를 GSB0098 균주라고 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행에 2010년 3월 26일자에 기탁번호 KCTC 11671BP로 기탁하였다.

4-3. GSB0163 ( Klebsiella pneumoniae _△dhaT/pLB0066) 균주의 제작( K.pneumoniae △dhaT/puuC_HindⅢ_Kana_NdeI)

상기 실시예 4-2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 상기 실시예 2-3의 pLB0066 재조합 벡터를 Klebsiella pneumoniae_△dhaT 균주에 형질전환 하여 Klebsiella pneumoniae_△dhaT/pLB0066를 준비하였고, 이를 GSB0163 균주라고 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행에 2010년 3월 26일자에 기탁번호 KCTC 11673BP로 기탁하였다.

실시예 5. 글리세롤 디하이드라테이즈 및 알데히드 디하이드로지네이즈 활성 측정

실시예 4에서 제조된 재조합 균주를 LB 액체배지에 접종하여 37 ℃에서 배양하였다. 배양된 세포의 O.D₆₀₀ = 2.5 에 이르렀을 때 원심분리하여 침전된 세포를 인산화 칼륨 완충 용액(50 mM, pH 7.0)을 이용하여 2 번 세척한 후, 동일한 완충액으로 현탁하여 프렌치프레스(FA-078A, Thermo Electron Corp.; Waltham, MA, U.S.A)를 사용하여 1,250 psi의 압력으로 파쇄한 후, 원심분리기를 이용하여 세포 잔해를 제거하고 세포추출 상등액은 효소 활성 측정에 이용하였다.

5-1. 글리세롤 디하이드라테이즈의 활성 측정

세포추출물에서의 글리세롤 디하이드라테이즈의 활성은 HPLC (HPLC, Agilent 1100 series; CA, USA)로 측정하였다. 적당한 양의 세포추출물을 35 mM의 염화칼륨을 포함하는 인산화 칼륨 반응용액(50 mM, pH 8.0)에 첨가하여 37 ℃에서 5분간 전배양한 뒤, 50 mM 의 글리세롤과 15 μM의 비타민 B-12 를 첨가하여 최종 부피가 0.5 ml가 되도록 하여 1분간 반응시켰다.

반응을 종결시키기 위하여 동일한 부피의 구연산(citric acid, 100 mM)을 첨가하였다. 생성된 3-HPA는 HPLC (Agilent 1100 series, USA)로 측정하였다.

글리세롤 디하이드라테이즈의 효소 활성 단위 1.0 U은 1 분 동안 1 μmol의 3-HPA를 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

재조합 미생물	dhaB 활성 unit (μmol 3-HPA/mg protein /min)
E.coli BL21/pCDFDuet_dhaB_gdrAB_pQE80L_puuC	1.07±0.3
Klebsiella pneumoniae (Wild type)	6.79±0.5
Klebsiella pneumoniae/pUC19_puuC	20.8±1.2
Klebsiella pneumoniae△dhaT	8.7±0.6
Klebsiella pneumoniae△dhaT/pUC19_puuC	10.2±0.9

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, E.coli BL21 에 pCDFDuet_dhaB_gdrAB_pQE80L_puuC 를 도입해 과발현 시킨 재조합 균주의 글리세롤 디하이드라테이즈 활성은 1.07±0.3 μmol/mg이었고 Klebsiella pneumoniae (Wild type)의 경우는 6.79±0.5 μmol/mg 를 나타내었다.

Klebsiella pneumoniae (야생형)에 pUC19_puuC 를 도입한 재조합 균주는 20.8±1.2 μmol/mg 를 Klebsiella pneumoniae (야생형)에서 dhaT 유전자를 제거한 균주는 8.7±0.6 μmol/mg 의 활성을 Klebsiella pneumoniae (야생형)에서 dhaT 유전자를 제거한 균주에 pUC19_puuC를 도입한 재조합 균주는 10.2±0.9 μmol/mg 의 글리세롤 디하이드라테이즈 활성을 나타내었다.

5-2. 알데히드 디하이드로지네이즈의 활성 측정

알데히드 디하이드로지네이즈의 활성은 다음의 방법을 통해 측정하였다. 적당한 양의 세포추출물을 인산화 칼륨 반응용액 (50 mM, pH 7.0 또는 8.0)에 첨가하여 45 ℃에서 5분간 전배양한 뒤, 1.8 mM의 알데히드와 0.76 mM의 NAD(P)⁺를 최종 부피가 0.5 ml가 되도록 하여 반응을 개시하였다.

효소의 활성은 340 nm에서 NAD(P)⁺가 NAD(P)H로 환원되는 속도를 측정하여 결정 하였다. 생성된 NAD(P)H의 양은 몰랄(molar) 흡광계수 (extinction coefficient; △ε₃₄₀) 6.22 × 10³ M^-1 cm^-1을 사용하여 결정하였다.

알데히드 디하이드로지네이즈의 활성 단위 1.0 U은 1 분 동안 1 μmol의 NAD(P)⁺가 NAD(P)H로 환원되는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

효소원a	총 활성 (μmolNADH/ml/min)	단백질 (mg/ml)	특이성 (U/mg)	정제 (fold)
세포추출물	19.374±1.55	6.19±0.49	3.13±0.25	1.00
정제 PuuC	264.26±21.14	9.53±0.76	27.73±2.21	8.86

^a E. coli BL21 숙주 세포에는 활성이 없음.

알데히드 디하이드로지네이즈의 기질특이성은 조효소 NAD⁺ 또는 NADP⁺ 존재 하에 다양한 종류의 알데히드를 사용하여 45 ℃, pH 8.0에서 측정하였다. 본 발명에서 사용된 알데히드는 다음과 같다: 포름알데히드(HCHO, MW 30.03), 아세트알데히드(CH₃CHO, MW 44.05), 3-하이드록시프로피온 알데히드(CH₂(OH)CH₂CHO, MW 74.2), 프로피온알데히드(CH₃CH₂CHO, MW 58.09), 부틸알데히드(CH₃(CH₂)₂CHO, MW 72.11), 발르알데히드(CH₃(CH₂)₃CHO, MW 86.13), 이소발르알데히드((CH₃)₂CHCH₂CHO, MW 86.13), 2-퓨르알데히드(C₄H₃OCHO, MW 96.1), 벤즈알데히드(C₆H₅CHO, MW 106.13).

본 발명에 따른 알데히드 디하이드로지네이즈의 기질특이성은 표 3에 나타낸 바와 같이, 대부분의 알데하이드는 조효소 NADP⁺ 보다 NAD⁺ 를 사용 하였을 때 높은 특이성을 나타내었고 발르알데하이드, 부틸알데하이드, 이소발르알데하이드, 3-하이드록시프로피온 알데하이드 순으로 조효소 NAD⁺ 를 사용 하였을 때 높은 특이성을 나타내었다. 특히, 3-하이드록시프로피온 알데히드는 NADP⁺를 사용했을 때 활성이 약 90% 떨어졌다. 이는 클랩시엘라 뉴모니애 PuuC 는 NAD⁺ 에 높은 특이성을 가진다 할 수 있을 것이다.

기 질	특 이 성(U/mg)
	NAD+	NADP+
3-하이드록시프로피온알데하이드	22.75±1.34	2.37±0.19
포름알데하이드(C1)	0.55±0.02	1.75±0.14
아세트알데하이드(C2)	16.84±1.16	1.97±0.17
프로피온알데하이드(C3)	18.53±1.59	1.89±0.15
부틸알데하이드(C4)	31.92±2.31	2.02±0.16
발르알데하이드(C5)	33.58±2.66	1.99±0.16
이소발르알데하이드	27.32±1.74	1.81±0.12
2-퓨르알데하이드	5.19±0.97	1.45±0.11
벤즈알데하이드	7.24±1.05	1.61±0.14

정제한 알데히드 디하이드로지네이즈의 반응속도론적 특성은 표 4에 나타낸 바와 같이 3-하이드록시프로피온 알데히드의 산화반응에 대해 조사하였다.

부틸알데하이드 산화반응의 최대반응속도(V_max)는 34.08 Umg^-1 protein 이었고, 3-하이드록시프로피온 알데히드 산화반응의 최대반응속도(V_max)는 22.25 Umg^-1 protein 이었다.

그리고 NAD⁺ 대한 3-하이드록시프로피온 알데히드와 부틸알데하이드산화반응의 촉매효율(k_cat/K_m)은 41.44 X 10³ M^-1s^-1 와 117.15 X 10³ M^-1s^-1 으로 나타났다.

기 질a	조효소	V max (Umg-1 protein)	K m (mM)	k cat (s-1)	k cat/K m ×103(M-1 s-1)
3-하이드록시프로피온알데하이드	NAD+	22.25±1.78	0.48±0.04	19.81±1.58	41.44±3.32
부틸알데하이드	NAD+	34.08±2.73	0.26±0.02	30.34±2.43	117.15±9.37
발르알데하이드	NAD+	33.26±2.66	0.14±0.01	29.61±2.37	207.07±16.6
이소발르 알데하이드	NAD+	28.61±2.29	0.21±0.02	25.47±2.04	121.87±9.75
3-하이드록시프로피온알데하이드b	NAD+	25.46±2.04	0.09±0.01	22.67±1.81	254.69±20.40

^a기질은 0.1 mM 내지 2 mM 사이에서 변함

^b3-HPA는 1.8 mM, NAD⁺는 0.025 mM 내지 0.8 mM 사이에서 변함

실시예 6. 형질전환된 GSB0181 배양에서의 3-하이드록시프로피온산의 생산

실시예 4-1에서 제조된 재조합 균주 E. coli BL21/pCDFDuet_dhaB_gdrAB_pQE80L_puuC 를 M9 액상배지 10 mL에 예비 접종하여 37 ℃에서 12시간 예비배양 하였다. 충분히 자란 배양액을 글리세롤 100 mM, 효모추출물 0.2 g/L를 첨가한 M9 액상배지(pH 7.0)에서 배양하였다.

이때 배양액의 pH를 유지시키기 위하여 100 mM의 인산화 칼륨 완충 용액을 사용하였다. 세포의 배양은 50 mL의 배지를 포함하는 250 mM Erlenmeyer 플라스크를 사용하여 37 ℃에서 200 rpm으로 배양하였다.

이 후 O.D₆₀₀ 가 0.6 에 이르렀을 때 IPTG 100 uM 을 첨가하였고, 2시간 주기로 5 회에 걸쳐 4 μM의 비타민 B-12를 첨가하여 30시간 배양하였다.

그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이 30시간 배양에 최대 52.77 mmol/L의 3-HP가 얻어졌다. 또한 사용된 글리세롤 대비 생산된 3-HP의 비는 약 0.62 (수율 62%)이였고 전체 배양은 호기적인 조건에서 이루어졌다.

이러한 결과는 PuuC가 3-HPA에 대하여 높은 알데히드 디하이드로지네이즈 활성을 가지고 있고, 그 활성이 제작된 GSB0181 재조합 균주에서 잘 발현되고 있음을 보여주는 것이다.

실시예 7. 형질전환된 GSB0098 과 GSB0163 배양에서의 3-하이드록시프로피온산 또는 3-하이드록시프로피온산과 1,3-프로판디올의 동시 생산

실시예 4-2 와 4-3에서 제조된 재조합 균주를 LB 액상배지 10 mL에 예비 접종하여 37 ℃에서 12시간 예비배양 하였다. 충분히 자란 배양액을 글리세롤 100 mM, 효모추출물 0.2 g/L를 첨가한 M9 액상배지(pH 7.0)에서 배양하였다.

이때 배양액의 pH를 유지시키기 위하여 100 mM의 인산화 칼륨 완충 용액을 사용하였다. 세포의 배양은 50 mL의 배지를 포함하는 250 mM Erlenmeyer 플라스크를 사용하여 온도 37 ℃에서 200 rpm (호기성), 30 rpm (부분 호기성), 100 rpm (혐기성)으로 배양하였다. 호기성과 부분 호기성의 경우에는 스폰지 마개를 이용하여 배양기간 동안 지속적으로 외부 공기가 플라스크 내로 전달되도록 하였고 이에 비해 혐기성의 경우에는 나사 마개를 이용하여 외계 공기와 플라스크를 완전히 차단한 상태에서 배양이 진행되도록 하였다.

이 후 O.D₆₀₀가 0.6 에 이르렀을 때 1 mM의 IPTG를 첨가하였고 전체 배양 시간은 33시간이었다.

7-1. GSB0098( Klebsiella pneumoniae /pUC19_puuC)를 이용한 3-HP 단독 생산 또는 3-HP 및 1,3-PDO의 동시 생산

도 3a는 혐기성으로 배양한 Klebsiella pneumoniae/pUC19_puuC 의 회분식 발효 결과로서, 1,3-PDO는 최고 29.07±3.1 mmol/L, 3-HP는 1.86±0.2 mmol/L를 얻을 수 있었다. 도 3b는 부분 호기성으로 배양한 Klebsiella pneumoniae /pUC19_puuC 의 회분식 발효 결과로서, 1,3-PDO는 21.61±2.5 mmol/L, 3-HP는 3.38±0.4 mmol/L를 얻을 수 있었다. 즉, 두 경우 모두 1,3-PDO가 다량 얻어졌고 3-HP의 생산은 미미하였다. 혐기성 상태나 부분 호기성 상태에서 세포 내 NADH의 농도가 매우 높으며 따라서 DhaB에 의해 생성된 3-HPA가 대부분 3-HP 보다는 1,3-PDO로 전환되고 있음을 보여 주는 것이다. 따라서 이 조건에서는 재조합 균주인 Klebsiella pneumoniae/pUC19_puuC 내 PuuC의 존재가 전체 글리세롤 대사에 미치는 영향이 매우 제한적임을 알 수 있다.

도 3c는 호기성으로 배양한 Klebsiella pneumoniae /pUC19_puuC의 회분식 발효 결과로서, 5.1±0.2 mmol/L의 1,3-PDO와 4.5±0.3 mmol/L의 3-HP를 얻을 수 있었다. 같은 조건에서 PuuC가 클로닝 되지 않은 Klebsiella pneumoniae(WT)은 5.4±0.4 mmol/L 의 1,3-PDO 와 2.4±0.2 mmol/L 의 3-HP를 생산하였다. 혐기성이나 부분 호기성에 비하여 1,3-PDO의 생산은 줄었고 이에 비해 3-HP의 생산은 증가되었다. 그러나 사용된 글리세롤에 비해 3-HP의 수율은 매우 낮으며 이는 호기적인 조건에서는 대부분의 글리세롤이 글리세롤 디하이드라테이즈(DhaB) 경로보다는 글리세롤 카네이즈 경로를 통해 균체 성장에 이용되고 있음을 의미한다(Appl. Microbiol. Biotechnol. 50:24-29, 1998).

Klebsiella pneumoniae에 puuC를 과발현 시킨 유전자 재조합 균주 Klebsiella pneumoniae/pUC19_puuC 의 경우 모든 조건에서 1,3-PDO 와 3-HP의 동시 생산이 가능하였다. 또한 그 비율이나 양은 산소 공급 양에 따라 변하였다. 비록 수율에 있어서, 특히 3-HP의 생산 수율은 만족스럽지 않았지만 비타민 B-12를 전혀 첨가하지 않고도 Klebsiella pneumoniae /pUC19_puuC에서 1,3-PDO 와 3-HP를 동시에 생산할 수 있음이 증명되었다. 이는 플라스미드로 도입된 PuuC가 코딩하는 알데하이드 디하이드로제네이즈 효소의 작용으로 판단되었다.

7-2. GSB0163( Klebsiella pneumoniae △DhaT/pUC19_puuC)를 이용한 3-HP 단독 생산 또는 3-HP 및 1,3-PDO의 동시 생산

앞서 제작한 Klebsiella pneumoniae GSB0098, 즉 Klebsiella pneumoniae/pUC19_puuC의 경우 3-HP의 생산이 1,3-PDO에 비해 낮아 글리세르알데히드 옥시도리덕데이즈(glyceraldehyde oxidoreductase; DhaT)의 활성이 지나치게 높은 것이 그 원인으로 추정되었다.

따라서 dhaT를 제거하여 그 활성을 낮추고자 GSB0163, 즉 Klebsiella pneumoniae△DhaT /pUC19_puuC를 제작하고 이를 이용하여 발효를 수행하였다.

도 4a는 혐기성으로 배양한 Klebsiella pneumoniae△DhaT /pUC19_puuC 의 회분식 발효 결과로서, 3-HP는 27.19±2.9 mmol/L, 1,3-PDO는 23.72±2.1 mmol/L를 얻을 수 있었다.

한편, PuuC를 과발현 시키지 않은 Klebsiella pneumoniae△DhaT의 경우 1.9±0.2 mmol/L의 3-HP 와 17.61±0.8 mmol/L의 1,3-PDO 를 얻을 수가 있었다.

이는 비타민 B-12를 전혀 첨가하지 않고도 플라스미드로 도입된 알데하이드 디하이드로지네이즈 효소의 작용으로 인해 3-HP는 약 15 배, 1,3-PDO 는 약 1.3 배 증가한 것을 확인할 수 있었다.

도 4b는 부분 호기성으로 배양한 Klebsiella pneumoniae△DhaT /pUC19_puuC 의 회분식 발효 결과로서, 17.62±1.5 mmol/L의 3-HP와 18.44±1.8 mmol/L의 1,3-PDO를 얻었다. 이에 비해 같은 조건의 Klebsiella pneumoniae△DhaT 의 3-HP 생산량은 2.58±0.4 mmol/L, 1,3-PDO 는 22.83±2.0 mmol/L 를 나타내었다.

도 4c는 호기성으로 배양한 Klebsiella pneumoniae△DhaT /pUC19_puuC 의 회분식 발효 결과로서, 7.17±0.9 mmol/L 의 3-HP 와 4.12±0.7 mmol/L의 1,3-PDO 생산량을 얻을 수 있었다.

도 4d는 호기성으로 1.0 O.D600 까지 배양 한 후 부분 호기성으로 발효한 Klebsiella pneumoniae△DhaT/pUC19_puuC 의 유가식 발효 결과로서, 24시간 발효를 통해 177.6 mM 의 3-HP와 220.8 mM 1,3-PDO를 얻을 수 있었다.

이때 5 L 바이오리액터를 사용하였고, working volume은 1 L, 초기 글리세롤 농도는 100 mM 이였고 pH 는 7.0 으로 유지하였다. 초기 호기성 조건에서 균체 성장을 위해 공기 유입속도를 1.0 VVM 으로, 그리고 1mM IPTG induction 후 부분 호기성 유지를 위해 공기 유입속도를 0.1 VVM 으로 유지하였다. 24시간 동안 소모된 글리세롤 대비 산물 생산 수율(3-HP 및 1,3-PDO 의 합)은 51% 이었다.

이로써 상기에서 제조 배양한 재조합 균주들은 비타민 B-12를 첨가하지 않는 유가식 발효 결과에서 최고 177.6 mM 3-HP 와 220.8 mM 의 1,3-PDO 를 생산하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백한 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC11671BP,KCTC11673BP,KCTC11674BP 20100326

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Claims (14)

1. 클렙시엘라 뉴모니애 △dhaT(Klebsiella pneumoniae △dhaT)에 알데히드 디하이드로지네이즈(aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 puuC 유전자로 구성된 재조합 벡터를 형질 도입함으로써 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산과 1,3-프로판디올을 동시에 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 벡터는 글리세롤 디하이드라테이즈(glycerol dehydratase)를 코딩하는 dhaB 유전자 및 글리세롤 디하이드라테이즈 재활성화인자(glycerol dehydratase reactivase)를 코딩하는 gdrAB 유전자를 추가로 포함한 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
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5. 청구항 1에 있어서, 상기 알데히드 디하이드로지네이즈를 코딩하는 puuC 유전자는 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) DSM 2026의 게놈 DNA로부터 유래된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
6. 청구항 2에 있어서, 상기 글리세롤 디하이드라테이즈를 코딩하는 dhaB 유전자는 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) DSM 2026의 게놈 DNA로부터 유래된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
7. 청구항 2에 있어서, 상기 글리세롤 디하이드라테이즈 재활성화효소를 코딩하는 gdrAB 유전자는 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) DSM 2026의 게놈 DNA로부터 유래된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 미생물은 Klebsiella pneumoniae△dhaT/pUC19_puuC; GSB0163 (KCTC 11673BP)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
   
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12. 청구항 1 내지 청구항 2 및 청구항 5 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배양배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양액으로부터 3-하이드록시프로피온산과 1,3-프로판디올을 동시에 생산하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산과 1,3-프로판디올의 동시 제조방법.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 배양하는 단계는 혐기 조건 또는 부분 호기 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산과 1,3-프로판디올의 동시 제조방법.
14. 청구항 12에 있어서, 상기 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산과 1,3-프로판디올을 동시에 생산하는 단계에서 비타민 B-12를 첨가하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산과 1,3-프로판디올의 동시 제조방법.

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