KR101157376B1 - 글리세롤디하이드라타제 및 3-하이드록시프로피온알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법 - Google Patents

글리세롤디하이드라타제 및 3-하이드록시프로피온알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리세롤디하이드라타제 및 3-하이드록시프로피온알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 글리세롤디하이드라타제를 코딩하는 dhaB 유전자; 글리세롤디하이드라타제 재활성화인자를 코딩하는 gdrAB 유전자; 및 알데히드디하이드로게나제를 코딩하는 aldH 유전자로 구성되는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 이용하여 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 제조할 수 있다.

Description

글리세롤디하이드라타제 및 3-하이드록시프로피온알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법{Recombinant microorganism transformed with genes encoding glycerol dehydratase and 3-hydroxypropionaldehyde dehydrogenase and preparation method of 3-hydroxypropionic acid therewith}
본 발명은 글리세롤디하이드라타제 및 3-하이드록시프로피온알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법에 관한 것이다.
최근, 석유 가격의 급격한 상승과 심각한 환경 문제가 야기되면서 바이오 기반 연료의 생산이 각광을 받고 있다. 바이오 기반 연료 중의 하나인 바이오디젤은 식물성 기름이나 동물성 지방으로부터 트리글리세리드의 에스테르 교환 반응에 의해 생산된다.
바이오디젤의 대량 생산으로 인해 부산물인 글리세롤 생산이 급증하였으며, 바이오디젤 10억 갤런 당 77억 파운드의 글리세롤이 생산되고 있다. 글리세롤 생산이 급증함에 따라 미국은 연간 32억 파운드, 세계적으로는 80억 파운드가 생산되고 있다. 이에 따라 최근 2년간 글리세롤의 가격은 10배 정도 감소하였다. 정제되지 않은 글리세롤의 시장가격은 2004년에는 파운드당 5-15 센트이며, 현재는 2.5 센트 수준으로 알려져 있다.
이와 비교하여, 현재 글루코오즈(포도당)의 가격은 5 센트 수준으로 알려져 있으며 점차적으로 증가할 것으로 보인다. 현재의 추세를 감안할 때 글리세롤 가격의 지속적 감소는 불가피한 것으로 판단된다.
미생물은 탄소원으로 글리세롤을 사용할 수 있으며, 이를 이용하여 다양한 발효 생산물을 만들 수 있다. 3-하이드록시프로피온산(3-HP; C3H6O3 - MW 90.08)은 화학공정에서 다양한 응용분야를 가지는 화합물로써, 글리세롤과 같은 재생 가능한 자원으로부터 생산할 수 있다.
3-HP는 25℃에서 pKa 4.51인 약산으로서, 구조적으로 탄소 3개를 가지는 비카이랄 유기산으로 젖산(2-하이드록시프로피온산)과 이성질체이다. 또한 비결정질이고, 시럽과 같은 연한 노란색을 띠며, 비중은 1.25, 굴절률은 1.45이다.
3-HP는 여러 화학공정에 사용되는 중요한 합성 중간체로, 1,3-프로판디올 (C3H8O2 - MW 76.09), 아크릴산 (C3H4O2 - MW 72.06), 메틸 아크릴에이트 (C4H6O2 - MW 86.09), 아크릴아미드 (C3H5NO - MW 71.08), 에틸 3-하이드록시프로피온산 (C5H10O3 - MW 118.13), 말로닉산 (C3H4O4 - MW 104.06), 프로피온락톤 (C3H4O2 - MW 72.06), 아크로니트릴 (C3H4N - MW 53.06) 등을 생산할 수 있는 원료로 사용된다. 3-HP 관련 제품의 세계 시장규모는 360만톤이며 현재 수요와 가격에서 매년 5%씩 상승할 것으로 전망된다.
3-HP는 에틸렌 사이아노하이드린, 베타-아이도프로피온산, 베타-브로모프로피온산, 베타-클로로프로피온산, 베타-프로피오락톤, 아크릴산 등을 중간체로 하여 화학적 공정으로 생산될 수 있다. 그러나 이러한 화학물질 대부분이 유독하며 발암성을 띤다. 또한 높은 온도와 압력의 조건으로 대량의 에너지를 소모하며 다량으로 공해물질을 배출하는 단점을 가진다.
생물학적 3-HP 생산은 광종속영양성 미생물인 클로로플렉서스 오란티아커스(Chloroflexus aurantiacus)에 의해 이루어진다. 이 미생물은 독립영양적, 광종속영양적으로 자라면서 중간체로 3-HP를 생산한다. 글리세롤로부터 3-HP를 생산하는 또 다른 미생물로는 디설포바이브리오 카비놀리커스(Desulfovibrio carbinolicus), 디설포바이브리오 프럭토소보란스(Desulfovibrio fructosovorans), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 펠로박터 베네티아누스(Pelobacter venetianus), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus) 등이 알려져 있다.
그러나 대사경로가 복잡하기 때문에 공정의 효율적인 조절이 어려워 생산 수율 및 생산성의 저하가 예상되므로 생체 내에 존재하지 않는 합성 경로의 설계가 필수적으로 요구된다.
도 1에 도시된 바와 같이, 생물학적으로 두 종의 효소가 촉매하는 탈수 및 산화 공정을 통하여 글리세롤로부터 3-HP를 생산할 수 있다. 첫 번째 효소인 글리세롤디하이드라타제는 글리세롤을 탈수화시켜 중간물질인 3-하이드록시프로피온알데히드 생산 반응을 촉매시키며 이 단백질의 유전자 및 단백질 특성에 대해서는 이미 많은 보고가 되어있다.
두 번째 단계는 3-하이드록시프로피온알데히드의 탈수소화 반응이다. 이 경로의 주요 문제점을 요약하면 다음과 같다: 즉, (i) 3-하이드록시프로피온알데히드에 특이적인 알데히드디하이드로게나제(ALDHs)에 대한 보고가 미비하며, (ⅱ) 비특이적 알데히드하이드로게나제의 활성이 매우 낮다. (ⅲ) 알데히드하이드로게나제의 활성에 비해 글리세롤디하이드라타제의 활성이 높을 경우 독성을 띠는 3-하이드록시프로피온알데히드가 축적되어 세포의 전체적 대사작용을 심각하게 저해할 수 있다.
본 발명의 목적은 글리세롤디하이드라타제를 코딩하는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 dhaB1, dhaB2, dhaB3 유전자; 글리세롤디하이드라타제의 재활성화인자를 코딩하는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 gdrA 및 gdrB 유전자; 그리고 3-하이드록시프로피온알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 대장균(Escherichia coli) K-12 유래의 aldH 유전자로 구성되는 재조합 벡터를 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 3-HP의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글리세롤디하이드라타제를 코딩하는 dhaB 유전자; 글리세롤디하이드라타제 재활성화인자를 코딩하는 gdrAB 유전자; 및 알데히드디하이드로게나제를 코딩하는 aldH 유전자로 구성되는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터에 있어서, 글리세롤디하이드라타제는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에서 유래한 효소로, 글리세롤을 3-하이드록시프로피온알데히드로 전환하며, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 dhaB1 유전자가 코딩하는 단백질인 대단위체(Large submit 또는 α submit라 불리며 서열번호 2의 아미노산 서열을 가짐), 서열번호 3의 염기서열을 갖는 dhaB2 유전자가 코딩하는 단백질인 중단위체(Medium submit 또는 β submit라 불리며 서열번호 4의 아미노산 서열을 가짐), 서열번호 5의 염기서열을 갖는 dhaB3 유전자가 코딩하는 단백질인 소단위체(Small submit 또는 γ submit라 불리며 서열번호 6의 아미노산 서열을 가짐) 등 세 가지 단백질로 구성되어 있다.
따라서, 상기 dhaB 유전자는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 dhaB1 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 dhaB2 유전자 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 dhaB3 유전자로 구성된다.
또한, 글리세롤디하이드라타제 재활성화인자도 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에서 유래한 단백질로, 글리세롤디하이드라타제의 촉매 반응시 상기 촉매의 활성을 유지시키는 작용을 하며, 서열번호 7의 염기서열을 갖는 gdrA 유전자가 코딩하는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 GdrA 단백질 및 서열번호 9의 염기서열을 갖는 gdrB 유전자가 코딩하는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 GdrB 단백질로 구성되어 있다.
따라서, 상기 gdrAB 유전자는 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 갖는 gdrA 유전자 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 갖는 gdrB 유전자로 구성된다.
또한, 3-하이드록시프로피온알데히드 디하이드로게나제는 대장균(Escherichia coli) K-12에서 유래한 효소로, 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키며 서열번호 11의 염기서열을 갖는 aldH 유전자가 코딩하는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 AldH 단백질이다.
따라서, 상기 aldH 유전자는 서열번호 11로 표시되는 염기서열을 갖는다.
또한, α-케토글루타레이트세미알데히드 디하이드로게나제는 아조스피릴리움 브라질렌스(Azospirillum brasilense)에서 유래한 효소로, 상기 AldH와 동일한 기능을 가지며 서열번호 13의 염기서열을 갖는 kgsadh -I 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 14번의 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.
따라서, 상기 kgsadh -I 유전자는 서열번호 13으로 표시되는 염기서열을 갖는다.
또한, 본 발명은 글리세롤디하이드라타제를 코딩하는 dhaB 유전자; 글리세롤디하이드라타제 재활성화인자를 코딩하는 gdrAB 유전자; 및 알데히드디하이드로게나제를 코딩하는 aldH 유전자로 구성되는 재조합 벡터로 형질전환되는 재조합 미생물을 제공한다.
상기 재조합 미생물은 대장균 BL21-SH-BGA1 재조합 균주(KFCC11420P)일 수 있다.
또한, 상기 재조합 미생물은 젖산을 생산하도록 하는 ldhA 유전자 또는 아세트산을 생산하도록 하는 pta-ack 유전자 중 어느 하나 또는 둘 이상의 유전자를 제거할 수 있다.
상기 재조합 미생물은 대장균 BL21-SH-BGA2ΔldhA 재조합 균주(KFCC11421P)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 글리세롤을 유일한 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양하고, 상기 배양액으로부터 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산(3-HP)의 제조방법을 제공한다.
도 1에 도시된 3-하이드록시프로피온산의 합성경로와 같이 DhaB는 GdrA 및 GdrB의 존재 하에 안정적으로 글리세롤을 3-하이드록시프로피온알데히드로 전환시키고, 또한 AldH나 KGSAGH -I은 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-HP로 전환시킨다.
이에, 본 발명은 재조합 미생물을 글리세롤 배지에서 배양한 다음, 상기 재조합 미생물의 배양액으로부터 3-HP를 회수함으로써 3-HP을 제조하는데, 이때 재조합 미생물의 배양 및 3-HP의 수득과정은 종래 발효공업에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 3-HP 분리정제방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 3-하이드록시프로피온알데히드에 높은 활성을 갖는 상기 AldH를 첨가하여 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-HP로 전환시킬 수 있다.
앞서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제작한 글리세롤디하이드라타제, 글리세롤디하이드라타제 재활성화인자 및 알데히드 디하이드로게나제를 갖는 유전자 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물은 글리세롤을 유일한 탄소원으로 이용하여 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 균주로서 매우 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 AldH는 3-하이드록시프로피온알데히드를 빠른 속도로 3-하이드록시프로피온산으로 전환하는데 유용하다.
따라서, 본 발명에 따른 유전자 재조합 미생물은 탄소의 중앙대사회로(Central metabolic pathways)의 추가 조작에 의한 적절한 대사경로 조합 및 발효공정 최적화에 의해 3-하이드록시프로피온산의 생산성을 증진시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 글리세롤에서 3-하이드록시프로피온산이 생합성되는 경로 및 이에 관여하는 효소를 나타낸 모식도이고,
도 2는 5L 바이오리액터 배양에서 시간에 따른 3-하이드록시프로피온산의 생산, 세포성장, 글리세롤 소모를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 발현시키기 위하여 특정 발현벡터와 대장균(Escherichia coli) 숙주세포만을 예시하였으나, 다른 종류의 발현벡터와 숙주세포를 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1. 클렙시엘라 뉴모니아 DSM 2026으로부터 dhaB 유전자의 증폭
클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) DSM 2026 균주로부터 게놈 DNA를 정방향 프라이머(서열번호: 15)와 역방향 프라이머(서열번호: 16)를 사용하여 표 1 과 같은 조건으로 PCR을 수행하여 dhaB1, dhaB2, dhaB3, dhaB4 (gdrA) 유전자를 증폭하여 제한효소 EcoRⅠ과 HindⅢ로 절단하였다.
조성 농도
주형 DNA 20 ng
정방향 프라이머 100 pmol
역방향 프라이머 100 pmol
dNTP mix 400 pmol
Ultra pfu 1 Unit
Ultra pfu buffer 1X
전체 반응 용량 50 μl
이때, PCR은 Cycle Ⅰ (95℃, 5min), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 95 ℃, 1 min / 56 ℃, 1 min / 72 ℃, 4 min), Cycle Ⅲ (72 ℃, 10 min)의 과정으로 수행되었다.
dhaB 유전자를 증폭하기 위한 내부 프라이머로는 IspdK1(서열번호: 17); IspdK2(서열번호: 18); IspdK3(서열번호: 19); IspdK 4(서열번호: 20); IspdK5(서열번호: 21); IspdK6(서열번호: 22); IspdK7(서열번호: 23); IspdK8(서열번호: 24); IspdK9(서열번호: 25); IspdK10(서열번호: 26); 및 IspdK11(서열번호: 27)을 사용하였다.
실시예 2. 클렙시엘라 뉴모니아 DSM 2026으로부터 gdrB 의 증폭
클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) DSM 2026 균주로부터 게놈 DNA를 정방향 프라이머(서열번호: 28)와 역방향 프라이머(서열번호: 29)를 사용하여 표 1과 같은 조건으로 PCR을 수행하여 gdrB 유전자를 증폭하여 제한효소 HindⅢ과 AflⅡ로 절단하였다.
이때, PCR은 Cycle Ⅰ (95℃, 5min), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 95 ℃, 1 min / 61 ℃, 1 min / 72 ℃, 4 min), Cycle Ⅲ (72 ℃, 5 min)의 과정으로 수행되었다.
실시예 3. 대장균 K-12로부터 aldH 의 증폭
대장균(E. coli) K-12 균주로부터 게놈 DNA를 정방향 프라이머(서열번호: 30)와 역방향 프라이머(서열번호: 31)를 사용하여 표 1과 같은 조건으로 PCR을 수행하여 aldH 유전자를 증폭하여 제한효소 BamHⅠ과 HindⅢ로 절단하였다.
이때, PCR은 Cycle Ⅰ (95℃, 4min), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 95 ℃, 30 sec / 58 ℃, 1 min / 72 ℃, 2 min), Cycle Ⅲ (72 ℃, 10 min)의 과정으로 수행되었다.
aldH 유전자를 증폭하기 위한 내부 프라이머로는 IspaE(서열번호: 32)를 사용하였다.
실시예 4. 아조스피릴리움 브라질렌스로부터 kgsadh -Ⅰ의 증폭
아조스피릴리움 브라질렌스(Azospirillum brasilense) 균주로부터 genomic DNA를 정방향 프라이머(서열번호: 33)와 역방향 프라이머(서열번호: 34)를 사용하여 표 1과 같은 조건으로 PCR을 수행하여 kgsadh-Ⅰ유전자를 증폭하여 제한효소 BamHI과 PstⅠ로 절단하였다.
이때, PCR은 Cycle Ⅰ (98℃, 10 sec), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 98 ℃, 10 sec / 50 ℃, 30 sec / 72 ℃, 2 min), Cycle Ⅲ (72 ℃, 2 min)의 과정으로 수행되었다.
실시예 5. 3- 하이드록시프로피온산 생산용 유전자 재조합 균주 제작
(1) 대장균 SH-BGA1의 제작
실시예 1 내지 실시예 3에서 증폭한 dhaB(dhaB1 , dhaB2 , dhaB3 , dhaB4 , gdrB)와 aldH PCR 단편을 pGEM-T 벡터에 각각 접합하였다. 그리고 제작된 플라즈미드를 E. coli XL1-blue에 각각 도입하였다.
pTBGA(pGEM-T/dhaB) 플라즈미드는 제한효소 EcoRⅠ 과 HindⅢ로 절단하였고, pTGB(pGEM-T/gdrB) 플라즈미드는 제한효소 HindⅢ과 AflⅡ로 절단하였다.
두 개의 DNA 단편을 접합하여 제작된 플라즈미드, pTBGAB(pGEM-T/dhaB1234과 gdrB)를 발현 벡터인 pCDFDuet 벡터에 클로닝하였다(pCBGAB). pTAD2(pGEM-T/aldH) 플라즈미드는 BamHⅠ과 HindⅢ 제한효소로 절단하여 발현 벡터인 pQE-80L에 클로닝하였다(pQAD2).
상기 제작된 재조합 플라즈미드(pCBGAB와 pQAD2)를 E. coli BL21(DE3)에 도입함으로써 최종 E. coli BL21-SH-BGA1 재조합 균주(KFCC11420P)를 구축하였다.
(2) 대장균(E. coli) SH-BGKA1의 제작
실시예 1 내지 실시예 4에서 증폭한 dhaB(dhaB1 , dhaB2 , dhaB3 , dhaB4 , gdrB) 와 kgsadh -Ⅰ PCR 단편을 pGEM-T 벡터에 각각 접합하였다. 그리고 제작된 플라즈미드를 E. coli XL1-blue에 각각 도입하였다.
pTBGA(pGEM-T/dhaB) 플라즈미드는 제한효소 EcoRⅠ과 HindⅢ로 절단하였고, pTGB(pGEM-T/gdrB) 플라즈미드는 제한효소 HindⅢ과 AflⅡ로 절단하였다.
두 개의 DNA 단편을 접합하여 제작된 플라즈미드, pTBGAB(pGEMT/dhaB1234과 gdrB)를 발현 벡터인 pCDFDuet 벡터에 클로닝하였다(pCBGAB). pTKD2(pGEMT/kgsadh -Ⅰ) 플라즈미드는 BamHI 및 PstⅠ 제한효소로 절단하여 발현 벡터인 pRSFDuet에 클로닝하였다(pRKD).
상기 제작된 재조합 플라즈미드(pCBGAB와 pRKD)를 E. coli BL21(DE3)에 도입함으로써 최종 E. coli BL21-SH-BGKA1 재조합 균주(KFCC11419P)를 구축하였다.
실시예 6. 글리세롤디하이드라타제 및 알데히드디하이드로게나제 활성 측정
실시예 5에서 제조된 재조합 균주 E. coli SH-BGA1을 M9배지에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 이때, 표 2에 나타난 바와 같이 단백질 발현 유도물질인 IPTG 농도(0.1 mM, 0.5 mM, 1.0 mM)를 달리하여 각각에 대한 활성을 측정하였다.
배양된 세포의 O.D600 = 2.5에 이르렀을 때 원심분리하여 침전된 세포를 인산화 칼륨 완충 용액(100 mM, pH 8.0)을 이용하여 2번 세척한 후, 도일한 버퍼로 현탁하여 프렌치프레스(FA-078A, Thermo Electron Corp.; Waltham, MA, U.S.A)를 사용하여 1,250 psi의 압력으로 파쇄한 후, 원심분리기를 이용하여 세포 잔해를 제거하고 세포추출 상등액은 효소 활성 측정에 이용하였다.
(1) 글리세롤 디하이드라타제의 활성 측정
Crude cell에서의 글리세롤 디하이드라타제의 활성은 다음의 방법을 통해 측정하였다. 적당한 양의 crude cell 추출물을 50 mM의 염화칼륨을 포함하는 인산화 칼륨 반응용액(35 mM, pH 8.0)에 첨가하여 37℃에서 5분간 전배양한 뒤, 50 mM의 글리세롤과 15 μM의 코엔자임B12를 첨가하여 최종 부피가 0.5 ㎖가 되도록 하여 1분간 반응시켰다.
반응을 종결시키기 위하여 동일한 부피의 구연산(citric acid, 100 mM)을 첨가하였다. 생성된 3-하이드록시프로피온알데히드를 아크롤레인으로 탈수시킨 뒤, 자주색 복합체를 형성시키기 위해 트립토판과 반응시켰다.
자주색 복합체는 560 nm에서 색깔 분석을 통해 측정하였다. 3-하이드록시프로피온알데히드 1 몰(mol)이 아크롤레인 1몰(mol)로 탈수화되기 때문에 흡광도 데이터는 3-하이드록시프로피온알데히드의 농도로 나타내었다.
글리세롤 디하이드라타제의 효소 활성 단위 1.0 U은 1분 동안 1 μmol의 3-하이드록시프로피온알데히드를 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.
(2) 알데히드디하이드로게나제의 활성 측정
알데히드디하이드로게나제의 활성은 다음의 방법을 통해 측정하였다. 적당한 양의 crude cell 추출물을 인산화 칼륨 반응용액 (50 mM, pH 7.0 또는 8.0)에 첨가하여 37℃에서 5분간 전배양한 뒤, 2 mM의 알데히드와 4 mM의 NAD(P)+를 최종 부피가 0.5 ㎖가 되도록 하여 반응을 개시하였다.
효소의 활성은 340 nm에서 NAD(P)+가 NAD(P)H로 환원되는 것을 측정하여 검토하였다. 생성된 NAD(P)H의 양은 몰랄(molar) 흡광계수 (extinction coefficient; △ε340) 6.22 × 103 M-1 cm-1을 사용하여 결정하였다.
알데히드디하이드로게나제의 활성 단위 1.0 U은 1분 동안 1 μmol의 NAD(P)+가 NAD(P)H로 환원되는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.
유도물질 SH-BGA1 SH-BGKA1
IPTG (mM) DhaB 활성a
(U mg-1
protein)		 AldH 활성a
(U mg-1
protein)		 DhaB 활성a
(U mg-1
protein)		 Kgsadh-I 활성a
(U mg-1
protein)
Un-induced 0 0 0 0
0.1 28.0 1.7 27.0 1.1
0.5 14.0 1.8 16.0 1.4
1.0 12.0 1.9 19.0 1.6
a E . coli BL21 숙주 세포에는 활성이 없음.
알데히드디하이드로게나제의 기질특이성은 조효소 NAD+ 또는 NADP+ 존재 하에 다양한 종류의 알데히드를 사용하여 37℃, pH 8.0에서 측정하였다. 본 발명에서 사용된 알데히드는 다음과 같다: 포름알데히드(HCHO, MW 30.03), 아세트알데히드(CH3CHO, MW 44.05), 3-하이드록시프로피온알데히드(CH2(OH)CH2CHO, MW 74.2), 프로피온알데히드(CH3CH2CHO, MW 58.09), 부틸알데히드(CH3(CH2)2CHO, MW 72.11), 발르알데히드(CH3(CH2)3CHO, MW 86.13), 이소발르알데히드((CH3)2CHCH2CHO, MW 86.13), 2-퓨르알데히드(C4H3OCHO, MW 96.1), 벤즈알데히드(C6H5CHO, MW 106.13).
본 발명에 따른 알데히드디하이드로게나제의 기질특이성은 표 3에 나타낸 바와 같이, 3-하이드록시프로피온알데히드에 대해 가장 높은 특이성을 나타내었다. 그 다음으로 이소발르알데히드, 프로피온알데히드, 부틸알데히드, 발르알데히드 순으로 높은 특이성을 나타내었다.
또한, 두 종류의 조효소에 대해서는 벤즈알데히드와 2-퓨르알데히드를 제외한 나머지 알데히드는 모두 NAD+에 높은 특이성을 가지는 것으로 나타났다. 특히, 3-하이드록시프로피온알데히드는 NADP+를 사용했을 때 활성이 73% 떨어졌다.

기질		 NAD+ NADP+
총 활성
(μmol NADH ㎖-1min-1)		 특이성
(U mg-1
protein)		 총 활성
(μmol NADH ㎖-1min-1)		 특이성
(U mg-1
protein)
3-하이드록시
프로피온알데히드		 82.05 38.07 22.84 10.60
포름알데히드(C1) 0.25 0.12 0.000 0.000
아세트알데히드(C2) 23.36 10.84 18.34 8.51
프로피온알데히드(C3) 71.64 33.25 45.68 21.2
부틸알데히드(C4) 65.25 30.28 46.09 21.39
발르알데히드(C5) 63.52 29.47 17.78 8.25
이소발르알데히드 78.81 36.57 65.73 30.50
2-퓨르알데히드 27.72 12.86 29.99 13.92
벤즈알데히드 38.53 17.88 58.26 27.04
정제한 알데히드디하이드로게나제의 반응속도론적 특성은 표 4에 나타낸 바와 같이 3-하이드록시프로피온알데히드의 산화반응과 3-하이드록시피로피온산의 환원반응에 대해 모두 조사하였다.
3-하이드록시프로피온알데히드 산화반응의 최대반응속도(Vmax)는 NAD+에 대해서는 32.1 U mg-1 protein이었고, NADP+에 대해서는 5.5 U mg-1 protein으로 NAD+의 최대반응속도가 NADP+와 비교하여 6배정도 높았다.
그러나 포화기질 제한 농도 상수(Km)는 NAD+를 조효소로 사용했을 때 NADP+ 보다 1.7배 낮았다. NAD+와 NADP+에 대한 3-하이드록시프로피온알데히드 산화반응의 촉매효율(kcat/Km)은 58.6 X 103M-1s-1 와 16.9 X 103M-1s-1으로 나타났다.
기질a 조효소 Vmax
(U mg-1
protein)		 Km
(mM)		 kcat
(s-1)		 kcat/Km
103(M-1s-1)
3-HPA NAD+ 32.1 ± 5.14 0.49 ± 0.015 28.54 ± 4.6 58.57 ± 9.37
NADP+ 5.5 ± 0.88 0.29 ± 0.009 4.91 ± 0.79 16.92 ± 2.71
3-HP NADH 0.3 ± 0.05 0.12 ± 0.004 0.26 ± 0.04 2.20 ± 0.348
NADPH 0 0 0 0
3-HPAb NAD+ 30.1 ± 4.81 0.06 ± 0.002 26.79 ± 4.3 468.6 ± 74.9
a Varied between 0.062 mM and 6 mM.
b 3-HPA was constant at 2 mM, and NAD+ was varied between 0.006 mM and 6 mM.
실시예 7. 탄소대사경로 변형 대장균 숙주세포 제작 및 3- 하이드록시프로피온산 생산 유전자 재조합 균주의 제작
대장균 내의 ldhA 유전자의 제거를 위해 염색체 상의 ldhA 유전자와 플라스미드 pKD4 상의 항생제 단위(FRT-kan-FRT)와 각각 상보적인 혼합 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머의 염기서열은 각각 ldhAf-p1(서열번호: 35, ldhA 결실용), ldhAr-p2(서열번호: 36, ldhA 결실용), ackf-p1(서열번호: 37, pta-ack 결실용) 및 ackr-p2(서열번호: 38, pta-ack 결실용)를 사용하였고, 표 5와 같은 조건에서 PCR을 수행하였다.
PCR의 산물(1.733kb)은 정제된 후에 DpnI 제한효소로 처리한 후 다시 정제되었다. 이 최종 산물은 미리 플라스미드 pKD46을 도입시켜 놓은 BL21(DE3)에 2.5kV, 25mF, 2000Ω 조건에서 전기천공법을 이용하여 세포 안으로 도입되었고 즉시 LB배지 1㎖에서 2시간 동안 회복되었다.
회복하는 과정이 끝난 후 약 1/3에 해당하는 양을 30 μg/㎖ 농도의 카나마이신이 포함되어 있는 고형 LB 배지에 도말하였다. 항생제 내성을 가지고 있는 균주를 선발하여 ldhA가 결실된 위치를 포함하도록 다시 PCR을 수행하여 크기가 2.221kb로 변한 것을 확인하였다.
이런 확인 작업을 거친 후에 카나마이신 유전자는 온도에 민감한 플라스미드 pCP20을 사용하여 제거되었다. 이렇게 제작된 균주는 카나미이신과 암피실린에 대한 저항성을 상실하였다. 카나마이신 제거는 동일한 프라이머를 사용하여 ldhA 부근의 크기가 0.845kb 줄어든 것으로 확인되었다.
따라서, 최종 E. coli BL21-SH-BGA2ΔldhA 재조합 균주(KFCC11421P)를 구축하였다.
유사한 방법으로 pta - ack 유전자를 제거하였다. 즉, 사용된 프라이머와 PCR 조건은 앞선 ldhA 유전자 제거의 경우와 동일하며, 탄소 대사경로를 변경한 후 앞서 기술한 전기천공법에 따라 각 숙주세포에 필요한 플라스미드를 넣어주었다. 따라서, 최종 E. coli BL21-SH-BGA3ΔldhAΔpta-ack 재조합 균주(KFCC11422P)를 구축하였다.
조성 농도
주형 DNA 10 ng
정방향 프라이머 10 pmol
역방향 프라이머 10 pmol
dNTP mix 100 pmol
Taq polymerase 0.5 Unit
Taq buffer 1X
총 반응 용량 50 μl
실시예 8. 형질전환된 대장균을 이용한 플라스크 배양에서의 3- 하이드록시프로피온산의 생산
상기 실시예 5 및 실시예 7에서 제작한 재조합 균주를 글리세롤 46 g/ℓ, MgSO4ㅇ7H2O 0.25 g/ℓ, NaCl 1.0 g/ℓ, NH4Cl 1.0 g/ℓ, 효모추출물 0.5 g/ℓ 그리고 적절한 항생제 첨가한 M9 배지(pH 8.0)에서 배양하였다.
이때 배양액이 pH를 유지시키기 위하여 100 mM의 인산화 칼륨 완충 용액을 사용하였다. 세포의 배양은 100 ㎖의 배지를 포함하는 500 ㎖ Erlenmeyer 플라스크를 사용하여 온도 37℃, 교반속도 200 rpm으로 배양하였다.
이후 O.D가 0.5에 이르렀을 때 IPTG를 0.1mM 농도를 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 생산에 관련된 유전자를 발현시키고 코엔자임A를 3시간에 4 mM, 5시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간 그리고 54시간 각각 8 mM씩 첨가(총 52 mM)해 주었다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 구축한 재조합 균주를 이용한 플라스크 배양에서의 3-HP의 수율은 다음과 같다.
균주명 숙주세포 플라즈미드 발효시간 세포농도 3-HP 농도
SH-BGA1 E. coli BL21 pCBGAB
pQAD2		 72 hr 1.6 g/ℓ 0.90 g/ℓ
SH-BGKA1 E. coli BL21 pCGBAB
pRKD		 72 hr 1.5 g/ℓ 0.78 g/ℓ
SH-BGA2 E. coli BL21
ΔldhA		 pCBGAB
pQAD2		 72 hr 1.5 g/ℓ 0.51 g/ℓ
SH-BGA3 E. coli BL21
ΔldhAΔpta-ack		 pCGBAB
pRKD		 72 hr 1.4 g/ℓ 0.49 g/ℓ
실시예 9. 형질 전환된 대장균을 이용한 바이오리액터에서의 3- 하이드록시프로피온산 생산
상기 실시예 8에서 사용한 재조합 균주 SH-BGA1을 5L 원통형 바이오리액터에서 2L 배양액을 사용하여 배양하면서 3-하이드록시프로피온산의 생산을 조사하였다.
상기 균주를 글리세롤 200 mM을 포함하는 M9 배지에서 12시간 전배양한 후, 다시 글리세롤 500 mM을 포함하는 M9 배지에서 24시간 전배양하였다.
이후 인산염 완충액 농도 100 mM, NaCl 1.0 g/ℓ, NH4Cl 1.0 g/ℓ, MgSO4 0.25 g/ℓ, 효모추출물 0.5 g/ℓ, 그리고 글리세롤 500 mM이 포함된 2L 배양액에 전배양된 세포를 O.D = 0.19로 접종하고 pH 7.0, 통기량 2.5 vvm, 온도 37℃, 교반속도 500rpm으로 배양하였다.
항생제인 스트렙토마이신과 암피실린을 각각 50㎎/ℓ 및 100㎎/ℓ로 첨가하였다. 이후 O.D가 1.03에 이르렀을 때(약 3시간 배양 후) IPTG를 0.1mM 농도를 첨가하여 3-하이드록시프로피온산 생산에 관련된 유전자를 발현시키고 코엔자임A를 3시간에 4μM, 5시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 그리고 54시간에 각각 8μM씩 첨가(총 52μM)해 주었다.
또한 27시간과 52시간에 인산염을 제외한 모든 배지성분(글리세롤 포함)을 초기 양과 동일한 양으로 첨가해 주었다. 배양액의 pH는 1M NaOH 용액을 이용하여 pH 6.8~7.2 수준으로 유지시켜 주었다.
상기 재조합 미생물 SH-BGA1의 발효 중 시료를 채취하여 세포농도를 측정하였으며 또한 13,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액의 3-하이드록시프로피온산, 글리세롤 및 대사산물의 농도를 액체크로마토그라피로 분석하였다.
그 결과 도 2에 도시된 바와 같이 48시간 배양시간에 최대 23g/ℓ의 3-하이드록시프로피온산이 얻어졌으며 이때 미생물의 농도는 2.47g/ℓ이었고 또한 사용된 글리세롤 대비 생산된 3-하이드록시프로피온산의 비는 약 0.37(수율 37%)이었다.
이는 동일한 균주의 플라스크 배양에서 얻어진 3-하이드록시프로피온산 최대 농도 0.9g/ℓ보다 26배 높은 농도로 상기 균주가 발효조건 최적화에 따라 더욱 높은 생산성을 나타낼 수 있음을 의미한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백한 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
한국미생물보존센터 KFCC11419P,KFCC11420P,KFCC11421P,KFCC11422P 20080528
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Claims (9)

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  5. 글리세롤디하이드라타제를 코딩하는 dhaB 유전자; 글리세롤디하이드라타제 재활성화인자를 코딩하는 gdrAB 유전자; 및 알데히드디하이드로게나제를 코딩하는 aldH 유전자로 구성되는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 있어서,
    상기 dhaB 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 dhaB1 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 dhaB2 유전자 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 dhaB3 유전자로 구성되고,
    상기 gdrAB 유전자는 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 갖는 gdrA 유전자 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 갖는 gdrB 유전자로 구성되며,
    상기 aldH 유전자는 서열번호 11로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산 제조용 재조합 미생물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 기탁번호가 KFCC11420P인 대장균 BL21-SH-BGA1 재조합 균주인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 젖산을 생산하도록 하는 ldhA 유전자 또는 아세트산을 생산하도록 하는 pta - ack 유전자 중 어느 하나 또는 둘 이상의 유전자를 제거한 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 기탁번호가 KFCC11421P인 대장균 BL21-SH-BGA2ΔldhA 재조합 균주인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 제 5항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 글리세롤 배지에서 배양하고, 상기 배양액으로부터 3-하이드록시프로피온산을 회수하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 제조방법.
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