KR101308087B1 - 항-ｇｍ-ｃｓｆ 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다양한 질환 또는 질병에서 중요한 역할을 하는 GM-CSF 특이적 재조합 항원-결합 부위, 항체 및 이의 작용 단편을 제공한다. 이들 항체는 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 진단 분야뿐만 아니라 다양한 질환의 진행 중에 GM-CSF의 기능을 검증하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 인코딩하는 핵산 서열, 이를 포함하는 벡터, 약제학적 조성물 및 사용 설명서가 첨부된 킷트를 제공한다.
[대표도]
도 6
[도면]
[도 1a]
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[도 2b]
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[도 6]

Description

항-ＧＭ-ＣＳＦ 항체 및 이의 용도{Anti-GM-CSF Antibodies and Uses Therefor}
본 발명은 항-GM-CSF 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulation factor), GM-CSF는 원래 조혈 성장 인자로 구분되었다. 이는 림프구, 단핵구, 내피세포, 섬유아세포 및 일부 악성 세포를 포함하는 세포 타입 중의 하나에 의해 생산된다(Metcalf et al., 1986; Clark and Kamen, 1987; Hart et al., 1988; Metcalf et al., 1986). 조혈 전구 세포의 성장 촉진 및 분화의 기능을 가지는 것에 추가로 GM-CSF는 GM-CSF 수용체를 발현하는 면역 시스템의 세포에서 다양한 역할을 하는 것으로 확인되었다(참조: Hamilton, 2002; de Groot et al., 1998). 이러한 기능 중에서 가장 중요한 것은 몇 가지 면역 과정 및 염증 과정에서 단핵구, 대식세포 및 과립구가 활성화되는 것이다(Gasson et al., 1990b; Gasson et al., 1990a; Hart et al., 1988; Rapoport et al., 1992).
성숙 GM-CSF는 2개의 글리코실화 위치를 가진 127개 아미노산으로 이루어진 단량체 단백질이다. 다양한 글리코실화의 결과는 14kDa 내지 35kDa 범위의 분자량이다. 비-글리코실화 및 글리코실화 GM-CSF는 시험관 내에서 유사한 활성을 보인다(Cebon et al., 1990). GM-CSF의 결정학적 분석에서는 4개의 짧은 알파 헬릭스로 구성된 통모양 구조를 보여주었다(Diederichs et al., 1991). 전체적인 접힘은 성장 호르몬, 인터루킨-2 및 인터루킨-4와 같은 다른 성장 인자와 유사하다.
GM-CSF는 이의 수용체에 결합함으로써 이의 생물학적 활성을 나타낸다(Kastelein and Shanafelt, 1992; Sisson and Dinarello, 1988). GM-CSF 수용체 (GM-CSF-R) 발현의 가장 중요한 부위는 골수 세포 및 내피 세포의 세포 표면에 있으나, 림프구는 GM-CSF-R 음성이다. 원래 수용체는 최소 2개의 서브유니트, 알파 및 베타로 구성된다. 알파 서브유니트는 리간드 특이성을 부여하며 나노몰 농도의 친화도로 GM-CSF에 결합한다(Gearing et al., 1989; Gasson et al., 1986). 또한, 베타 서브유니트는 인터루킨-3과 인터루킨-5 수용체 복합체의 일부이며, GM-CSF 수용체 알파 서브유니트 및 GM-CSF와 결합하여, 피코몰 농도의 결합 친화도를 가진 복합체의 형성을 유도한다(Hayashida et al., 1990). 수용체에 대한 GM-CSF 상의 결합 도메인이 매핑되었다: GM-CSF는 GM-CSF의 첫번째 알파 헬릭스에 있는 매우 제한된 부위를 통해 이의 수용체의 베타 서브유니트와 작용한다(Shanafelt et al., 1991b; Shanafelt et al., 1991a; Lopez et al., 1991). 알파 서브유니트에 대한 결합은 3번째 알파 헬릭스, 헬릭스 C, 헬릭스 C 및 D와 결합한 루프의 시작 부위 및 GM-CSF의 카르복시 말단에 대해 매핑될 수 있다(Brown et al., 1994).
GM-CSF 삼량체(trimer) 수용체 복합체의 형성은 JAK/STAT 패밀리, Shc, Ras, Raf, MAP 키나아제, 포스파티딜이노시톨-3-키나아제 및 NFkB 분자와 관계된 복합체 신호 전달의 활성화를 유도하며, 결국에는 c-myc, c-fos 및 c-jun의 전사를 유도한다. 활성화는 수용체의 베타 서브유니트에 의해 주로 유도된다(Hayashida et al., 1990; Kitamura et al., 1991; Sato et al., 1993). 또한, 공유된 베타 서브유니트는 IL-3, IL-5 및 GM-CSF에 의해 유발되는 오버래핑 기능에 필요하다(참조: de Groot et al., 1998).
이의 조혈세포 성장 및 분화 촉진 활성을 차치하더라도 GM-CSF는 특히 전염증성 사이토카인으로서 기능을 한다. 대식세포 및 단핵구 뿐만 아니라 호중구 (neutrophils) 및 호산구 (eosinophils)는 GM-CSF에 의해 활성화되며, 그 결과 다른 사이토카인 및 케모카인, 매트릭스 분해 프로테아제를 분비하고, HLA 발현 및 CC-케모카인에 대한 세포 부착 분자 또는 수용체의 발현을 증가시킨다. 상기 후자는 염증이 일어난 조직으로의 염증성 세포의 증가된 화학주성을 유도한다(Chantry et al., 1990; Hamilton, 2002; Sisson and Dinarello, 1988; Zhang et al., 1998; Hamilton et al., 1993; Lopez et al., 1986; Cheng et al., 2001; Gomez-Cambronero et al., 2003). 종종, GM-CSF는 다른 사이토카인 또는 LPS와 같은 다른 염증 자극 인자와 함께 상승적인 작용을 하며, 즉, GM-CSF 처리된 호중구와 LPS를 혼합하면 증가된 산화적 버스트(burst)를 보일 것이다(Kaufman et al., 1989; Rapoport et al., 1992).
항-염증 치료를 위한 타겟으로서의 GM-CSF:
면역 시스템에서의 다양한 활성화 기능으로 인해, GM-CSF는 항-염증 치료를 위한 타겟으로 간주될 수 있다. 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 크론씨 병(Crohn's disease), 건선, 천식, 아토피 피부염 또는 쇼크와 같은 만성 및 급성 염증성 질환은 GM-CSF 활성을 차단하고 GM-CSF 반응 세포의 위험한 활성을 실질적으로 감소시킴으로써 좋은 이점을 얻을 수 있을 것이다(Hamilton, 1993; Zhang et al., 1998; Hamilton, 2002).
관절염(Arthritis):
몇몇 그룹에서는 GM-CSF 뿐만 아니라 이의 수용체가 관절염 환자의 윤활 관절에 존재하는 것으로 나타났다(Alvaro-Gracia et al., 1991; Xu et al., 1989; Haworth et al., 1991). 추가로, GM-CSF는 펠티 증후군(Felty's syndrome)에서 나타나는 호중성백혈구감소증 (neutrophenia)을 치료하기 위해 GM-CSF로 처치하거나(Hazenberg et al., 1989) 화학치료법을 수행하고 난 뒤(de Vries et al., 1991)의 환자에서 류마티스 관절염의 발적을 유발하는 것으로 나타났다.
관절염을 치료하기 위한 GM-CSF 블로킹 항체의 유용성에 대한 첫번째 힌트는 생쥐 생체 내 실험으로부터 얻을 수 있다(Campbell et al., 1997; Campbell et al., 1998; Cook et al., 2001). 특히, 쿡 등의 문헌에서는 GM-CSF에 대한 중화 항체가 콜라겐-유도 관절염 모델에서 효과를 나타냄을 보여주었다. GM-CSF 블로킹은 심각한 염증 관련 질환, 연골 파괴 및 초기에 영향을 받은 팔다리에서의 질병의 진행 또는 다른 팔다리로의 진행의 감소를 유도한다.
류마티스 관절염 또는 다른 염증성 질환을 가진 환자에서 얻을 수 있는 항-GM-CSF 치료법의 몇가지 효과는 장점이 될 것이다.
GM-CSF 블로킹은 다음을 억제 또는 감소시키는 것으로 예측된다:
a) 성숙 단핵구, 대식세포 및 호중구의 활성 및 개수. 특히, 호중구 및 대식세포는 윤활액 및 윤활막에 풍부하다. 윤활막 내의 대식세포의 수는 RA 관절에 있는 진무름의 정도와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(Mulherin et al., 1996; Burmester et al., 1997). 대식세포는 다양한 다른 전염증성 사이토카인 및 매트릭스 분해 프로테아제의 근원이다. 호중구에 의한 H2O2의 생산은 류마티스성 관절에서 일어나는 파괴적 과정의 일부이다(Babior, 2000).
b) 골수 수지상 세포(DCs)의 분화 및 윤활 DCs(=synoviocytes)의 활성화. GM-CSF는 DCs 및 RA 윤활세포 상의 HLA 클래스 II 발현을 유지하고 상향 조절한다(Alvaro-Gracia JM et al., 1991). DCs는 염증성 T-세포의 선택적 활성화와 연관된 기능을 얻기 위해 관절 내에서 생산된다. 특정 HLA-DR 대립형질은 RA에 감염되기 쉽도록 링크되었으며, DC의 항원 전달을 통한 T 세포의 활성화는 이런 타입의 면역 질환에서 중요한 역할을 할 것이다(Santiago-Schwarz et al., 2001).
다발성 경화증 (Multiple Sclerosis):
다발성 경화증에서, GM-CSF의 증가된 레벨은 MS의 활성기와 관련이 있으며(Carrieri et al., 1998; McQualter et al., 2001) GM-CSF-/- 생쥐는 MS, 실험 뇌척수염, EAE에 대한 모델 시스템에서 질병으로 발전하는데 실패한다(McQualter et al., 2001).
천식 (Asthma):
천식에서, 폐에는 GM-CSF의 양이 증가한 것으로 보고되었다(Broide and Firestein, 1991). 동시에, 호산구가 증가되어 있으며, 여기서 GM-CSF는 인터루킨-5와 함께 다음의 3가지 방식으로 상승적인 작용을 한다: i) 원종 세포로부터 호산구로의 분화를 촉진, ii) 이들의 기능적 활성화를 촉진, iii) 폐에 있는 호산구의 생존을 연장(Broide et al., 1992; Yamashita et al., 2002). 따라서, GM-CSF를 블로킹시킴으로서 천식 기도에 있는 호산구의 생존을 감소시키는 것은 질병을 개선시키는 것과도 같다. 항-GM-CSF 중화 항체의 용도는 생쥐 천식 모델에서 추가로 확인되었으며, 여기서 이러한 항체의 투여는 기도 과민반응 및 기도 염증의 유의적인 감소를 유발하였다(Yamashita et al., 2002).
다른 생쥐 모델에서, 폐의 LPS-의존성 염증은 항-GM-CSF 항체 22E9를 생쥐에 적용시킴으로써 감소될 수 있다(Bozinovski et al., 2003)
독성 효과:
파괴된 GM-CSF 유전자에 대한 생쥐 동형접합체는 정상적으로 발생하며, 12주령까지는 주요한 조혈 동요를 보이지 않는다. 대부분의 GM-CSF-결함 생쥐는 외견상 건강하고 생식능력이 있으나, 모두는 콜라겐 번들이 파괴 및 감소되어 파괴된 혈관 세포외 매트릭스로 진행되고, 폐 표면활성제 제거가 손상되고 미생물 병원균에 대한 저항성이 감소되어 비정상적인 폐로 진행된다. 뒤에 기술된 병리증상은 인간의 폐포 단백증(PAP, pulmonary alveolar proteinosis) 질환과 비슷하다. GM-CSF는 성숙 조혈 세포 및 혈액, 골수 및 비장에 있는 이의 전구체의 주요한 타입의 정상적인 레벨을 유지시키기 위해 필수적인 것으로 보이지는 않는다. 그러나, 이들 은 정상 혈관 발생, 폐 기능 및 국소 감염에 대한 저항을 위해서 필수적인 GM-CSF를 포함한다(Stanley et al., 1994; Dranoff et al., 1994; Plenz et al., 2003; Shibata et al., 2001). 최근에, GM-CSF에 대한 자가 항체와 PAP의 강한 결합은 인간의 PAP 발병에서의 GM-CSF 신호 비정상을 추가로 함축한다. 이와 함께, 이러한 관찰은 GM-CSF가 인간의 표면활성 항상성 및 폐포 대식세포 선천성 면역 기능의 조절에 있어서 결정적인 역할을 함을 증명해준다(Bonfield et al., 2002; Trapnell and Whitsett, 2002; Uchida et al., 2004; Kitamura et al., 1999).
GM-CSF에 대한 블로킹 활성을 가진 자가항체의 높은 역가는 중증 근육무력증 환자에서 확인되었다. 이 환자들은 어떠한 다른 자가면역 증상 또는 조혈적 결함 또는 "다른 명백한 임상적 관련성"도 보이지 않았다(Meager et al., 1999).
GM-CSF의 변형된 형태로서 GM-CSF의 기능을 중화하는 화합물 E21R은 임상 1기 안전성 실험에서 평가되었으며, 암 환자에서 우수한 안전성 프로파일을 가지는 것으로 확인되었다(Olver et al., 2002).
따라서, 긴밀하게 모니터 되어야 하는 폐 기능은 별도로 하더라도, 항-GM-CSF 치료법을 적용할 때에 다른 부작용이 예측되지 않는다.
여태까지는, GM-CSF 중화 기능을 가진 비-인간 종으로부터 유도된 항체만이 생산되었다. 예를 들어, EP 0499161 A1에서는 GM-CSF로부터 유도된 서열인 올리고펩타이드를 이용하여 생쥐를 면역유도시킴으로써 항체가 생성된다고 기술한다. 더불어, 상기 특허 문헌에서는 GM-CSF의 바람직하지 않은 영향을 받고 있는 동물의 증상을 완화시키는 방법을 기술하며, 이 방법은 GM-CSF-억제량의 면역글로불린을 상기 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 그러나, 상기 항체는 생쥐 항체이기 때문에 인간에 투여하기에는 적합하지 않은 것으로 간주된다.
추가로, WO 03/068920에서는 억제성 키메라 생쥐/인간 IgG1 항체에 대해 기술한다. 비-인간 서열을 포함하는 항체는 인간 환자에서 면역 반응을 유도하기 쉬우며, 치료적 투여를 위해서는 적합하지 않다. 예를 들어, 장기간의 치료가 필요한 질환에서 (즉, 류마티스 관절염, 천식 및 다발성 경화증과 같은 만성 염증성 질환), 비-인간 치료제의 지속적 투여는 심각한 염증 반응을 증가시키며, 인간 항체의 생산은 치료제를 중화시킬 수 있다.
유사하게는, 항-GM-CSF 항체 치료법에 대한 우수한 잠재성의 관점에서, GM-CSF/GM-CSF 수용체 작용을 효율적으로 블로킹하여 높은 친화도를 가진 인간 항- GM-CSF 항체에 대한 높은 요구가 있다. 추가로, 동물-기반의 생체내 모델에서 효능을 테스트하기 위해서는 1 이상의 비-인간 종의 GM-CSF와 교차-반응할 수 있는 1 이상의 항체를 갖는 것이 이점이 있을 것이다.
본 발명은 하기에 기재된 매우 높은 효능이 있는 항- GM-CSF 항체를 제공함으로써 이러한 요구를 만족시킨다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 GM-CSF/GM-CSF 수용체 결합을 효과적으로 차단할 수 있는 인간 및 인간화(humanized) 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인간을 치료하기에 안전한 항체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 하나 이상의 본 발명의 항체를 이용하여 GM-CSF의 존재와 연관된 질환 또는 및/또는 상태를 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 본원에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 인간 GM-CSF에 특이적인 항원-결합 부위를 제공하며, 여기서 분리된 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편은, (i) 약 2x105 CHO-K1 세포 상에 발현된 인간 GM-CSF 수용체의 알파 체인과 0.5 ㎍/㎖ 인간 GM-CSF의 결합을, (a) 상기 CHO-K1 세포 상에 발현된 상기 인간 GM-CSF 수용체 알파 체인의 농도가 약 2x105 CHO-GMRa#11 세포 상에 발현된 인간 GM-CSF 수용체 알파 체인의 농도와 유사한 조건 및 (b) 분리된 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편의 농도가 약 5 ㎍/㎖인 조건 하에서, 최소 50% 차단할 수 있고; (ii) 참조 항체 BVD2-21C11 및/또는 참조 항체 MAB215 보다 최소 5배 낮은 IC50 값으로 TF-1 증식 분석 상에서 0.25 ng/㎖ 인간 GM-CSF를 중화할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "TF-1 증식 분석(proliferation assay)"은 실시예 5B에 기술된 바와 같은 분석으로 정의된다. 당업자라면 본 명세서에 제시된 기술에 따라 약 2x105 CHO-GMRa#11 세포상에 발현된 것과 동일한 농도에서 인간 GM-CSF 수용체 알파 체인을 발현하는 CHO-K1 세포를 얻을 수 있다.
본 발명은 추가적으로 본원에 기술된 바와 같은 항원-결합 부위를 포함하는 분리된 인간 또는 인간화 항체 또는 작용 단편 항체를 제공한다. 이러한 항체 또 는 이의 작용 단편은 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 또는 52로 표시되는 H-CDR3 부위를 포함하는 항원-결합 부위를 포함할 수 있으며; 상기 항원-결합 부위는 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 또는 52로 표시되는 H-CDR2 부위를 추가로 포함할 수 있을 것이며; 상기 항원-결합 부위는 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 또는 52로 표시되는 H-CDR1 부위도 포함할 수 있을 것이다. 이러한 항체 또는 이의 작용 단편은 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 또는 52로 표시되는 다양한 중쇄(heavy chain)를 포함하는 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 본 발명의 GM-CSF-특이 항체는 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 또는 61로 표시되는 L-CDR3 부위를 포함하는 항원-결합 부위를 포함할 수 있으며; 상기 항원-결합 부위는 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 또는 61로 표시되는 L-CDR2 부위를 추가로 포함할 수 있으며; 상기 항원-결합 부위는 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 또는 61로 표시되는 L-CDR1 부위도 포함할 수 있을 것이다. 이러한 항체 또는 이의 작용 단편은 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 또는 61로 표시되는 다양한 경쇄(light chain)를 포함하는 항원-결합 부위를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 서열의 펩타이드 변이체는 본 발명에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 또는 52로 표시되는 CDR 부위를 가진 CDR 부위에서 최소 60 퍼센트의 서열 동일성 을 갖고; 및/또는 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 또는 52로 표시되는 CDR 부위를 가진 CDR 부위에서 최소 80 퍼센트 서열 상동성을 갖는다. 추가로 포함되는 것은 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 또는 61로 표시되는 CDR 부위를 가진 CDR 부위에서 최소 60 퍼센트의 서열 동일성을 갖고; 및 또는 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 또는 61로 표시되는 CDR 부위를 가진 CDR 부위에서 최소 80 퍼센트의 서열 상동성을 가진 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-GM-CSF 항체이다.
본 발명의 항체는 IgG(예, IgG1)일 수 있으며, 항체 단편은 예를 들어 Fab 또는 scFv일 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 단편은 본원에 기술된 하나 이상의 방법에서 작용하는 항원-결합 부위이거나 이를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 분리된 핵산 서열에 관한 것이며, 이들 각각은 GM-CSF 특이적인 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편을 인코딩할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 44, 45, 46, 47 또는 48을 포함하는 분리된 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편의 다양한 중쇄, 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 44, 45, 46, 47 또는 48의 상보 서열에 대해 높은 가혹한 조건하에서 혼성화하는 핵산을 인코딩할 수 있다. 상기 핵산은 서열번호 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 53, 54, 55, 56 또는 57을 포함하는 분리된 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편의 다양한 중쇄, 또는 서열번호 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 53, 54, 55, 56 또는 57의 상 보 서열에 대해 높은 가혹한 조건하에서 혼성화하는 핵산을 인코딩할 수 있다.
상기 핵산 서열은 인간 GM-CSF에 특이적인 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편을 인코딩할 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 작용 단편은 (i) 약 2x105 CHO-K1 세포 상에 발현된 인간 GM-CSF 수용체의 알파 체인과 0.5 ㎍/㎖ 인간 GM-CSF의 결합을, (a) 상기 CHO-K1 세포 상에 발현된 상기 인간 GM-CSF 수용체 알파 체인의 농도가 약 2x105 CHO-GMRa#11 세포 상에 발현된 인간 GM-CSF 수용체 알파 체인의 농도와 유사한 조건 및 (b) 상기 분리된 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편의 농도가 약 5 ㎍/㎖인 조건 하에서 최소 50% 차단할 수 있고; (ii) 참조 항체 BVD2-21C11 및/또는 참조 항체 MAB215 보다 최소 5배 낮은 IC50 값으로 TF-1 증식 분석 상에서 0.25 ng/㎖ 인간 GM-CSF를 중화할 수 있다.
본 발명의 핵산은 재조합체 생산에 적당하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 이러한 숙주 세포는 박테리아 세포 또는 진핵세포일 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료학적 또는 예방적 적용에 사용될 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체(또는 항체의 작용 단편) 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 관련된 맥락에서, 본 발명은 바람직하지 않은 GM-CSF 또는 GM-CSF 발현 세포의 존재와 관련된 질환 또는 질병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 치료를 필요로 하는 환자에게, 본원에 기술되거나 의도된 본 발명의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 치료학적 용량으로 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 질환 또는 질병은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론씨 병, 건선, 천식, 아토피 피부염 및 쇼크와 같은 염증성 질환이 될 수 있다.
본 발명의 인간 또는 인간화 항체(및 이의 작용 단편)는 용액 평형 역가분석(SET, solution equilibrium titration), 및/또는 TF1 증식 분석에 의해 결정된 바와 같이, 쥐 및/또는 붉은털원숭이(rhesus, macaca) GM-CSF와 교차-반응성이 있을 수 있다.
도 1a는 다양한 신규 항체 변이 중쇄 부위의 핵산 서열을 제공한다.
도 1b는 다양한 신규 항체 변이 중쇄 부위의 아미노산 서열을 제공한다. CDR 부위 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 N-말단으로부터 C-말단쪽으로 굵게 표시되어 있다.
도 2a는 다양한 신규 항체 변이 경쇄 부위의 핵산 서열을 제공한다.
도 2b는 다양한 신규 항체 변이 경쇄 부위의 아미노산 서열을 제공한다. CDR 부위 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 N-말단으로부터 C-말단쪽으로 굵게 표시되어 있다.
도 3은 HuCAL® 항체 마스터 유전자 서열과 일치되는 변이 중쇄 부위의 아미노산 서열을 제공한다. CDR 부위 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 N-말단으로부터 C-말단 쪽으로 굵게 표시되어 있다(서열번호 41).
도 4는 HuCAL® 항체 마스터 유전자 서열과 일치되는 변이 경쇄 부위의 아미노산 서열을 제공한다. CDR 부위 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 N-말단으로부터 C-말단쪽으로 굵게 표시되어 있다(서열번호 42).
도 5는 pMORPH®X9_MOR03929_FH 발현 벡터의 DNA 서열의 예를 제공한다(서열번호 43).
도 6은 GM-CSF 수용체 알파 특이적 항체 MAB1006을 이용한 FACS 분석에 의해 확인된, GM-CSF 수용체 알파의 발현 레벨을 제공한다. CHO-GMRa#11(굵은 선)은 CHO-K1(점선)과 비교 표시되어 있다. x-축은 FL2 채널에서 측정된 비교 형광 값(RFL, relative fluorescence value)를 표시하고; y-축은 세포 카운트를 표시한다.
본 발명은 GM-CSF에 특이적이거나 높은 친화도를 가지며 1가지 이상의 다른 신규 특징을 가진 신규 항체의 발견을 기본으로 한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 환자에게 치료학적 이점을 제공할 수 있다. 본 발명의 항체는 인간 또는 인간화된 것이며, 많은 문맥에서 사용될 수 있고 본 명세서에 보다 자세하게 기술되어 있다.
"인간" 항체 또는 인간 항체의 작용 단편은 본 명세서에서 키메라가 아니고(예, "인간화"가 아닌), 비-인간 종 유래가 아닌(전체 혹은 일부도 아닌) 것으로 정의된다. 인간 항체 또는 항체의 작용 단편은 인간으로부터 유래될 수 있으며, 합성 인간 항체일 수 있다. "합성 인간 항체"는 전체 또는 일부가, 공지된 인간 항체 서열의 분석을 기준으로 하여 합성 서열로부터 인실리코(in silico)로 유도된 서열을 갖는 항체로 정의된다. 인간 항체 서열 또는 이의 단편의 인실리코 디자인은 예를 들어 인간 항체 또는 항체 단편 서열의 데이터베이스를 분석하고 이로부터 얻어진 데이터를 이용하여 폴리펩타이드 서열을 고안함으로써 실현될 수 있다. 인간 항체 또는 항체의 작용 단편의 다른 예는 인간 기원의 항체 서열 라이브러리(즉, 인간 본래 기원으로부터 얻어진 항체를 기본으로 하는 라이브러리)로부터 분리된 핵산에 의해 인코딩되는 것이다.
"인간화 항체" 또는 인간화 항체의 작용 단편은 본원에서 (i) 비-인간 기원(예, 이종 면역 시스템을 가진 형질전환 생쥐)으로부터 유도된 것, 여기서 항체는 인간 생식계열 (germ line) 서열을 기본으로 함; 또는 (ii) 키메라, 여기서 변이 도메인은 비-인간 기원으로부터 유도되며 불변 도메인은 인간 기원으로부터 유도됨 또는 (iii) CDR-이식된 것, 여기서 변이 도메인의 CDR은 비-인간 기원으로부터의 것이며, 변이 도메인의 1개 이상의 프레임워크는 인간 기원이고 불변 도메인(가능하다면)은 인간 기원이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "~에 특이적으로 결합하는" 항체는, 만약 이러한 항체가 이러한 항원 및 1개 이상의 참조 항체들 사이를 구분할 수 있다면, 항원(여기서는 GM-CSF)에 "특이적"이거나 항체를 "특이적으로 인식하는" 것인데, 이는 결합 특이성이 절대적이지는 않고 상대적인 것이기 때문이다. 가장 일반적인 형태에서(그리고 정의되지 않은 참조가 언급될 때), "특이 결합"은 관심 항원 및 관계없는 항원 사이를 구분하는 항체의 능력을 말하며, 하기 방법 중의 하나에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 웨스턴 블랏, ELISA-, RIA-, ECL- IRMA-테스트 및 펩타이드 스캔을 포함한다. 예를 들어, 표준 ELISA 분석이 수행될 수 있다. 점수평가는 표준 색깔 발색(예, 호스라디쉬 퍼옥사이드를 가진 2차 항체와 하이드로젠퍼옥사이드를 가진 테트라메틸 벤지딘)에 의해 수행될 수 있다. 특정 웰 내에서의 반응은 흡광도, 예를 들어 450nm에서 평가된다. 전형적인 배경(=음성 반응)은 0.1 OD이고; 전형적인 양성 반응은 1 OD일 수 있다. 이는 양성/음성 차이가 10배 이상일 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 결합 특이성의 확인은 1개의 참조 항원을 사용하는 것이 아니라, 분유, BSA, 트랜스페린 등과 같은 약 3 내지 5개의 관계없는 항원 세트를 이용해 수행된다.
그러나, "특이적 결합"은 표적 항원 및 1개 이상의 밀접하게 관련된 항원(들)-이는 참조 포인트로써 사용- 사이를 구분하는 항체의 능력을 일컫을 수 있으며, 예를 들면 GM-CSF와 IL-3, IL-5, IL-4, IL-13 또는 M-CSF 간을 구분하는 것이다. 추가로, "특이적 결합"은 항체의 표적 항원의 다른 부분간을 구분하는 항체의 능력을 일컫으며, 예를 들어 GM-CSF의 다른 도메인 또는 부위, 또는 1 이상의 핵심 아미노산 잔기 또는 GM-CSF의 아미노산 잔기의 스트레치 간을 구분하는 것이다.
또한, 본원에 사용된 바와 같이, "면역글로불린(immunoglobulin)"(Ig)은 본원에서 클래스 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD(또는 이의 모든 서브클래스)에 속하며 모든 통상적으로 공지된 항체 및 이의 작용 단편을 포함하는 단백질로 정의될 수 있다. 본원에서 사용된 항체/면역글로불린의 "작용 단편(functional fragment)"은 항원-결합 부위를 포함하는 항체/면역글로불린의 단편(예, IgG의 변이 부위)으로 정의된다. 일반적으로 항체의 "항원-결합 부위"는 항체의 1 이상의 과다변이 부위(들), 즉 CDR-1, -2 및/또는 -3 부위에서 발견되지만; 변이 "프레임워크" 부위는 CDRs에 대한 골격을 제공하는 것과 같이, 항원 결합에서 중요한 역할을 할 수 있다. 바람직하게는, "항원-결합 부위"는 최소한 변이 경쇄(variable light, VL)의 4 내지 103개 아미노산 잔기와 변이 중쇄(VH)의 5 내지 109개 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 VL의 3 내지 107개 아미노산 잔기와 VH의 4 내지 111개 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 완전한 VL 체인과 VH 체인(VL의 아미노산 위치 1 내지 109 및 VH의 1 내지 113; WO 97/08320에 따라 번호매김) 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 면역글로불린 클래스는 IgG이다.
본 발명의 "작용 단편"은 F(ab')2 단편, Fab 단편, scFv의 도메인 또는 단일 면역글로불린 변이 도메인 또는 단일 도메인 항체 폴리펩타이드-예를 들어 단일 중쇄 변이 도메인 또는 단일 경쇄 변이 도메인-를 포함하는 컨스트럭트 (construct)를 포함한다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1 및 CL 도메인 사이에서 발생하는 분자내 디설파이드 반응을 최소화하거나 완전히 제거하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 항체는 인실리코 디자인되고, 합성적으로 만들어진 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 기준으로 하는 재조합 항체 라이블러리로부터 유도될 수 있다. 항체 서열의 인실리코 디자인은, 예를 들어 인간 서열 데이터베이스를 분석하고 이로부터 얻어진 데이터를 이용하여 폴리펩타이드 서열을 고안해 냄으로써 수행될 수 있다. 인실리코-고안 서열을 디자인하고 얻는 방법은 예를 들어 다음의 문헌에 기술되어 있다: Knappik et al., J. Mol. Biol.(2000) 296:57; Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67; 및 Knappik 등에 의해 등록된 U.S. 특허번호 6,300,064- 이 문헌은 참고문헌으로써 전체 내용이 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 항체
본 명세서를 통틀어, 다음에 표시된 본 발명의 항체는 참조 항체이다: "항체 번호" 또는 "MOR" 03684, 04251, 03929, 04252, 04287, 04290, 04302, 04350, 04354, 04357, 03682, 04283, 04297 및 04342. MOR03684는 서열번호 1(DNA)/서열번호 11(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 21(DNA)/서열번호 31(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다. MOR04251은 서열번호 2(DNA)/서열번호 12(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 22(DNA)/서열번호 32(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다. MOR03929는 서열번호 3(DNA)/서열번호 13(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 23(DNA)/서열번호 33(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다. MOR04252는 서열번호 4(DNA)/서열번호 14(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 24(DNA)/서열번호 34(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다. MOR04287은 서열번호 5(DNA)/서열번호 15(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 25(DNA)/서열번호 35(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다. MOR04290은 서열번호 6(DNA)/서열번호 16(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 26(DNA)/서열번호 36(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다. MOR04302는 서열번호 7(DNA)/서열번호 17(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 27(DNA)/서열번호 37(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다. MOR04350은 서열번호 8(DNA)/서열번호 18(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 28(DNA)/서열번호 38(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다. MOR04354는 서열번호 9(DNA)/서열번호 19(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 29(DNA)/서열번호 39(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다. MOR04357은 서열번호 10 또는 48(DNA)/서열번호 20(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 30 또는 57(DNA)/서열번호 40(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다. MOR03682는 서열번호 44(DNA)/서열번호 49(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 53(DNA)/서열번호 58(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다. MOR04283은 서열번호 45(DNA)/서열번호 50(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 54(DNA)/서열번호 59(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다. MOR04297은 서열번호 46(DNA)/서열번호 51(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 55(DNA)/서열번호 60(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다. MOR04342는 서열번호 47(DNA)/서열번호 52(단백질)에 대응하는 변이 중쇄 부위 및 서열번호 56(DNA)/서열번호 61(단백질)에 대응하는 변이 경쇄 부위를 갖는 항체를 나타낸다.
일 측면에서, 본 발명은 GM-CSF에 특이적으로 결합하거나 높은 친화도를 가진 항원-결합 부위를 가진 항체를 제공한다. 항체는 친화도 측정값이 최소 100 nM일 경우(Fab 단편의 1가 친화도), 항체에 대해 "높은 친화도"를 가지는 것으로 불려진다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부위는 바람직하게는 약 100 nM 이하, 더욱 바람직하게는 약 60 nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 약 30 nM 이하의 친화도로 GM-CSF에 결합할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 항체는 약 10 nM 이하, 더욱 바람직하게는 약 3 nM 이하의 친화도를 갖고 GM-CSF에 결합한다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 GM-CSF에 대한 친화도는 약 10.0 nM 또는 1 pM(Fab 단편의 1가 친화도)일 것이다.
표 1은 표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance, Biacore) 및 용액 평형 역가분석(SET)에 의해 확인된, 본 발명의 참조 항체의 친화도를 요약한 것이다:
[표 1]
항체 친화도
Figure 112007089750246-pct00001
"nd": 확인되지 않음
표 1과 관련하여, MOR03684, 04251, 03929, 04252, 04357, 04290, 04302, 04350 및 04354의 친화도는 고정 재조합 GM-CSF 상에서 표면 플라즈몬 공명(Biacore)을 수행함으로써 측정하였다. MOR03684, 04251, 03929, 04252, 04357, 04290, 04302, 04350 및 04354의 Fab 포맷은 약 6420 내지 7 pM 범위의 일가 친화도 범위를 나타낸다.
또한, Fab 포맷은 용액 평형 역가분석(SET)에 의해 친화도를 확인하는데 사용되었다. 표 1의 오른쪽 컬럼은 이 방법에서의 MORs의 약 16000 내지 0.4 pM 결합 장력을 나타낸다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 인간 및 최소 하나의 다른 종과 교차-반응하는 종이며, 이는 설치류 종 또는 비-인간 영장류일 수 있다. 비-인간 영장류는 붉은털 원숭이가 될 수 있다. 설치류 종은 쥐가 될 수 있다. 최소 1개의 설치류 종과 교차 반응하는 항체는, 예를 들어 유사한 항체를 가진 복합 종에서 생체내 실험을 수행하기 위한 목적에서 공지된 항-GM-CSF 항체에 대해 훨씬 큰 유연성과 이점을 가진다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 GM-CSF에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 GM-CSF와 CHO-K1 세포상에서 발현된 인간 GM-CSF 수용체의 알파체인과의 결합을 최소 25%, 바람직하게는 최소 50%, 더욱 바람직하게는 최소 60%, 더욱 더 바람직하게는 최소 70%, 아주 더 바람직하게는 최소 85%, 가장 바람직하게는 최소 100% 차단할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 0.5 ㎍/㎖ 인간 GM-CSF와 약 2x105 CHO-K1 세포상에서 발현된 인간 GM-CSF 수용체의 알파체인과의 결합을 다음의 조건하에서 차단할 수 있다: CHO-K1 세포 상에 발현된 인간 GM-CSF 수용체 알파 체인의 농도가 2x105 CHO-GMRa#11 세포 상에 발현된 인간 GM-CSF 수용체 알파 체인의 농도와 유사한 조건, 및 본 발명의 항체의 농도가 약 5 ㎍/㎖ 인 조건.
이점에서, 당업자라면 인간 GM-CSF 수용체 알파를 발현하는 CHO-K1 세포를, 약 2x105 CHO-GMRa#11 세포 상에 발현되었을 때와 유사한 농도에서 수득할 수 있으며, 예를 들면 GM-CSF 수용체 알파를 인코딩하는 적당한 발현 벡터로 CHO-K1 세포 집단을 형질감염시킴으로써 제한된 레벨의 GM-CSF 수용체 알파를 발현하는 다른 안정 세포주를 생산하고; 그리고 난 뒤 상기 안정 세포주를 FACS 분석하여 실시예 3C에 기술된 바와 같은 프로토콜에 따라 GM-CSF 수용체 알파 발현 레벨을 확인하며; 약 2x105 CHO-GMRa#11 세포 상에 발현된 것과 유사한 농도로 인간 GM-CSF 수용체 알파를 발현하는 세포주를, 감염된 세포의 평균 형광 값(MFL, median fluorescence value)을 실시예 3C에 기술된 MFL 값과 비교함으로써 확인한다. 본원에 사용된, 세포주는 감염된 세포주의 MFL 값이 실시예 3C에 기술된 바와 같은 CHO-GMRa#11 세포에 대한 MFL 값으로부터 2배 이상의 값으로 벗어나지는 않는 경우, "약 2x105 CHO-GMRa#11 세포" 상에 발현된 것과 "유사한" 농도에서 GM-CSF 수용체 알파를 발현하는 것으로 정의된다.
더불어, 본 발명의 항체는 TF-1 증식 분석에서, 참조 항체 BVD2-21C11 및/또는 MAB215 보다 낮은 IC50 값으로, 바람직하게는 최소 5배 낮은 IC50 값, 더욱 바람직하게는 최소 10배 낮은 IC50 값, 더욱 더 바람직하게는 최소 15배 낮은 IC50 값, 아주 더 바람직하게는 최소 20배 낮은 IC50 값, 매우 더 바람직하게는 최소 30배 더 낮은 IC50 값, 훨씬 더 바람직하게는 최소 50배 더 낮은 IC50 값, 훨씬 더욱 더 바람직하게는 최소 100배 더 낮은 IC50 값, 가장 바람직하게는 최소 120배 더 낮은 IC50 값으로 인간 GM-CSF를 중화할 수 있다.
펩타이드 변이체
본 발명의 항체는 본원에 제공된 특정 펩타이드 서열에만 제한되는 것은 아니다. 오히려, 본 발명은 이러한 폴리펩타이드들의 변이체를 포함한다. 본 명세서 및 통상적으로 이용가능한 기술 및 참조문헌을 참고함으로써, 당업자는 본원에 기술된 항체의 기능적 변이체를 제조하고, 테스트하며 이용할 수 있을 것이며,GM-CSF 수용체의 알파 체인에 대한 GM-CSF의 결합을 차단하는 능력을 가진 변이체는 본 발명의 범위 내에 속하는 것이 바람직하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "GM-CSF 수용체의 알파 체인에 대한 GM-CSF의 결합을 차단하는 능력"은 본 발명의 항-GM-CSF 항체에 속하는 기능적 특성을 의미한다.
변이체는 예를 들어 최소 1개의 변화된 상보적 결정 부위(CDR, complementarity determining region)(과-변이성) 및/또는 프레임워크(FR)(변이성) 도메인/위치를, 본원에 기술된 서로 마주 향하는 펩타이드 서열로서 가지는 항체를 포함한다. 이 의미를 더 자세히 말하며, 항체 구조의 자세한 설명이 하기에 기술되어 있다.
항체는 2개의 펩타이드 체인으로 구성되는데, 각각은 1개(경쇄) 또는 3개(중쇄)의 고정 도메인 및 변이 부위(VL, VH)를 포함하며, 상기에서 후자는 4개의 FR 부위 및 3개의 사이공간 CDRs로 이루어진 각 경우에 포함된다. 항원 결합 위치는 1 이상의 CDRs에 의해 형성되지만, 여전히 FR 부위는 CDRs에 대한 구조적 프레임워크를 제공하며 항원 결합에서 중요한 역할을 한다. CDR 또는 FR 부위에 있는 1 이상의 아미노산 잔기를 변화시킴으로써, 당업자는 예를 들어 신규하거나 향상된 특징을 위해, 항원에 대해 스크리닝될 수 있는 돌연변이되거나 다양화된 항체 서열을 제조할 수 있다.
표 2a(VH) 및 표 2b(VL)는 본 발명의 특정 항체에 대한 CDR 및 FR 부위를 묘사하며, 아미노산을 각각 및 상보적 컨센서스 또는 "마스터 유전자" 서열(미국 특허 6,300,064에 기술된 바와 같음)에 대해 지정된 위치에서 비교한다.
[표 2a]
VH 서열
Figure 112007089750246-pct00002
Figure 112007089750246-pct00003
[표 2b]
VL 서열
Figure 112007089750246-pct00004
Figure 112007089750246-pct00005
오리지날 HuCAL® 마스터 유전자는 이의 원래 N-말단에, 예를 들어 위치 1 및 2에 아미노산 "SY"를 포함하는 VL 람다 3; 및 위치 1에 아미노산 "E"를 포함하는 VH3에 컨스트럭트되었다. HuCAL GOLD® 라이브러리를 포함하는 HuCAL® Fab 라이브러리를 컨스트럭트하는 동안, 첫번째 2개의 아미노산은 VL 람다 3 체인에서 "DI"로 바뀌었고; 첫번째 아미노산은 VH3 체인에서 "Q"로 바뀌었다.
당업자라면 표 2a 및 2b에 있는 데이터를 이용하여 본 발명의 범위 내에 있는 펩타이드 변이체를 디자인 할 수 있다. 바람직하게는 변이체는 1 이상의 CDR 부위 내에서 아미노산을 변형시킴으로써 컨스트럭트되며; 변이체는 1 이상의 변화된 프레임워크 부위를 포함할 수 도 있다. 신규 항체를 서로서로 비교하기 위한 참조로서, 후보 잔기는 예를 들어 MOR04251의 변이 경쇄의 잔기 27 또는 51 및 변이 중쇄의 잔기 32 또는 56을 포함하는 잔기로 변형될 수 있는데, 그 이유는 이 변이체들의 위치가 서로 마주향하기 때문이다. 또한, 변형은 프레임워크 부위에서 이루어질 수도 있다. 예를 들어, 펩타이드 FR 도메인은 생식계열 서열과 비교하여 잔기에서 편차가 있는 위치에서 변형될 수 있다.
상보적인 컨센서스 또는 "마스터 유전자" 서열에 대해 신규 항체를 비교하기 위한 참조로서, 후보 잔기는 예를 들어 VLλ3와 비교했을 때 MOR04251의 변이 경쇄의 잔기 27, 50 또는 90, 그리고 VH3와 비교했을 때 변이 중쇄의 잔기 33, 52 또는 96을 포함하는 잔기로 변형될 수 있다. 선택적으로, 당업자라면 예를 들어 Knappik et al.,(2000) 및 Knappik 등에 의해 등록된 미국 특허 제6,300,064호에 기술된 방법을 이용하여, 본원에 기술된 아미노산 서열을 유사한 클래스의 항체의 공지된 서열과 비교함으로써 유사하게 분석할 수 있다.
더불어, 변이체는 MOR에 있는 1 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 이상의 CDRs에 있는 아미노산 잔기를 변화시킴으로써 최적화를 위한 스타팅 포인트로써 1개의 MOR을 사용함으로써 얻을 수 있으며, 향상된 특성을 갖는 변이체에 대한 항체 변이체를 수집한 결과를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 특히 바람직한 것은 VL의 CDR-3, VH의 CDR-3, VL의 CDR-1 및/또는 VH의 CDR-2에 있는 1 이상의 아미노산 잔기를 변형시키는 것이다. 변형은 트리뉴클레오타이드 돌연변이(TRIM, trinucleotide mutagenesis) 기술(Virnekas et al., 1994)을 이용하여 DNA 분자 컬렉션을 합성함으로써 수행될 수 있다.
보존 아미노산 변이체
펩타이드 변이체는 본원에 기술된 항체 펩타이드 서열의 전체 분자 구조를 보존함으로써 제조될 수 있다. 각 아미노산의 주어진 특성, 일부 이론적 치환은 당업자에 의해 인식될 수 있을 것이다. 아미노산 치환, 즉 "보존적 치환"은 예를 들어 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 포함된 잔기의 양친매성 특성의 유사도를 기준으로 하여 만들어질 수 있을 것이다.
예를 들어, (a) 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하는 비극성(소수성) 아미노산; (b)글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하는 극성 천연 아미노산; (c) 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함하는 양전하(염기성) 아미노산; 및 (d) 아스파틱산 및 글루타믹산을 포함하는 음전하(산성) 아미노산이다. 일반적으로 치환은 그룹 (a)-(d) 내에서 이루어진다. 더불어, 글라이신 및 프롤린은 α-헬릭스를 파괴하는 그들의 능력을 기초로 하여 다른 하나로 치환될 수 있다. 유사하게, 알라닌, 시스테인, 루신, 메티오닌, 글루타믹산, 글루타민, 히스티딘 및 리신과 같은 일부 아미노산은 α-헬릭스에서 더 일반적으로 발견되지만, 발린, 이소발린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 트레오닌은 β-플레이트 쉬트에서 더 일반적으로 발견된다. 글리신, 세릴, 아스파틱산, 아스파라긴 및 프롤린은 회전 구조(turn)에서 일반적으로 발견된다. 일부 바람지간 치환은 하기 그룹 중에서 이루어 질 수 있다: (i) S 및 T; (ii) P 및 G; (iii) A, V, L 및 I. 공지된 유전자 코드, 재조합 및 합성 DNA 기술이 주어지면, 당업계의 과학자라면 보존적 아미노산 변이체를 인코딩하는 DNA를 손쉽게 컨스트럭트할 수 있다.
본 명세서에 사용된 두 폴리펩타이드 서열 간의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 아미노산의 퍼센트를 표시한다. "서열 상동성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 퍼센트를 표시한다. 본 발명의 바람직한 폴리펩타이드 서열은 CDR 부위에서 최소 60%, 바람직하게는 최소 70% 또는 80%, 더 바람직하게는 최소 90%, 가장 바람직하게는 최소 95%의 서열 동일성을 갖는다. 또한, 바람직한 항체는 CDR 부위에서 최소 80%, 더 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%의 서열 성동성을 갖는다.
본 발명의 DNA 분자
또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 인코딩하는 DNA 분자에 관한 것이다. 이러한 서열은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 도 1a 및 도 2a에 표시된 DNA 분자를 포함한다.
본 발명의 DNA 분자는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 본원에 기술된 서열 뿐만 아니라 이의 변이체도 포함한다. 본 발명의 범위내의 DNA 변이체는 혼성화에서의 그들의 물리적 특성을 참조로 하여 기술될 수 있다. 당업자라면 DNA가 그의 상보 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있고-왜냐하면 DNA는 이중 가닥이기 때문-, 그리고 핵산 혼성화 기술을 이용함으로써 그의 등가물 또는 호몰로그 (homolog)를 확인하기 위해 사용될 수 있다는 사실을 인식할 수 있을 것이다. 또한, 혼성화가 100% 미만의 상보성으로 일어날 수 있다는 사실도 인식할 수 있다. 그러나, 주어진 조건의 적절한 선택, 혼성화 기술은 각각의 프로브에 대한 그의 구조적 연관성에 기초하여 DNA 서열 사이에서 차별화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 조건과 관련된 가이드는 다음을 참조하라: Sambrook et al., 1989(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Haror Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA) 및 Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons).
2개의 폴리뉴클레오타이드 서열 간의 구조적 유사성은 두 서열이 다른 하나와 혼성화 할 것이라는 조건 하의 "가혹성(stringency)"의 기능으로 표현될 수 있다. 본 명세서에 사용된, 용어 "가혹성"은 불리한 혼성화 조건의 한도를 일컫는다. 혼성화에 강하게 불리한 가혹한 조건, 및 가장 구조적으로 연관된 분자만이 이러한 조건 하에서 다른 하나와 혼성화할 것이다. 반대로, 분자의 혼성화가 유리한 가혹하지 않은 조건은 더 낮은 구조적 연관성을 보여준다. 따라서, 혼성화 가혹성은 2개의 핵산 서열의 구조적 연관성과 직접적으로 관련이 있다. 하기의 관계는 혼성화와 연관성을 연결시키는데 유용하다(여기서 Tm은 핵산 듀플렉스의 녹는점이다).
a. Tm = 69.3 + 0.41(G+C)%
b. 듀플렉스 DNA의 Tm은 미스매치된 염기쌍의 수가 1% 증가할때 마다 1℃씩 감소한다.
c. (Tm)μ2 - (Tm)μ1 = 18.5 log10μ 2/㎕
여기서, μ1 및 μ2는 두 용액의 이온화 강도이다.
혼성화 가혹성은 전체 DNA 농도, 이온화 강도, 온도, 프로브 크기 및 수소 결합을 파괴하는 시약의 존재를 포함하는 많은 인자들의 작용이다. 혼성화를 촉진시키는 인자는 높은 DNA 농도, 높은 이온화 강도, 낮은 온도, 긴 프로브 길이 및 수소 결합을 파괴하는 시약의 부재를 포함한다. 일반적으로 혼성화는 "결합" 단계 및 "세척" 단계의 두 가지 단계에서 수행된다.
첫째, 결합 단계에서, 프로브는 유리한 혼성화 조건 하에서 표적에 결합된다. 일반적으로, 가혹성은 이 단계에서 온도를 변화시킴으로써 조절된다. 높은 가혹성을 위해, 일반적으로 온도는 짧은 (<20 nt) 올리고뉴클레오타이드 프로브가 사용되지 않는다면, 65℃ 내지 70℃이다. 바람직한 혼성화 용액은 6X SSC, 0.5% SDS, 5X 덴하츠 용액 및 100 ㎍의 비특이적 담체 DNA를 포함한다 ( Ausubel et al., section 2.9, supplement 27(1994) 참고). 물론, 많은 다른, 아직까지는 기능적으로 동일한, 완충 조건은 공지되어 있다. 연관도의 정도가 낮을 때, 낮은 온도가 선택될 것이다. 낮은 가혹성의 결합 온도는 약 25℃ 내지 40℃이다. 중간정도의 가혹성은 최소 약 40℃ 내지 약 65℃이다. 높은 가혹성은 최소 약 65℃이다.
둘째, 과량의 프로브가 세척에 의해 제거된다. 이는 훨씬 가혹한 조건이 적용되는 단계이다. 따라서, "세척" 단계는 혼성화에 대한 연관성을 결정하는 가장 중요한 단계이다. 일반적으로 세척 용액은 낮은 농도의 염을 포함한다. 예를 들어 보통의 가혹성의 용액은 2X SSC 및 0.1% SDS를 포함한다. 높은 가혹성의 세척 용액은 약 0.1X SSC를 포함하는 바람직한 가혹성의 용액과 함께 약 0.2X SSC 보다 낮은 등가물(이온화 강도에 있어서)을 포함한다. 다양한 가혹성과 관련된 온도는 "결합"에 대해 상기에서 언급된 바와 동일하다. 또한, 세척 용액은 일반적으로 세척하는 동안 횟수로 교체된다. 예를 들어, 전형적인 높은 가혹성의 세척 조건은 55℃에서 30분 동안 2회, 60℃에서 15분 동안 3회 세척하는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명은 높은 가혹성의 결합 및 세척 조건하에서 도 1a 및 2a에 표시된 분자에 혼성화하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 이러한 핵산 분자는 본원에 기술된 특성을 가진 항체 또는 이의 작용 단편을 인코딩한다. 바람직한 분자(mRNA 투시로부터)는 최소 75% 또는 80%(바람직하게는 최소 85%, 더욱 바람직하게는 최소 90%, 가장 바람직하게는 최소 95%)의 상동성을 갖거나 또는 본원에 기술된 DNA 분자 중의 하나와 서열 동일성을 가진 것이다.
기능적 등가물 변이체
본원에 제공된 DNA 분자의 변이체는 여러가지 다른 방법으로 컨스트럭트될 수 있는 것으로 인식된다. 예를 들어, 이들은 완전한 합성 DNA로서 컨스트럭트될 수 있다. 20 내지 약 150개 범위의 뉴클레오타이드를 효과적으로 합성하는 방법은 광범위하게 이용가능하다 ( Ausubel et al., section 2.11, supplement 21 (1993) 참고). 오버랩 올리고뉴클레오타이드는 Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217(1971); Ausubel et al., supra, section 8.2에 의해 맨 처음으로 공개된 방법으로 합성되고 조립될 수 있다. 바람직하게는, 합성 DNA는 적당한 벡터에 클로닝시키기 위해 유전자의 5' 및 3' 말단에 있는 간편한 제한 위치를 이용해 디자인된다.
표시된 바와 같이, 변이체 제조 방법은 본원에 기술된 DNA 중의 하나로 시작한 뒤, 지정부위 돌연변이 (site-directed mutagenesis)를 수행하는 것이다 ( Susubel et al., supra, chapter 8, Supplement 37(1997) 참고). 일반적인 방법에서, 표적 DNA는 단일-가닥 DNA 박테리오파지 매개체로 클로닝된다. 단일-가닥 DNA는 분리되며, 요구되는 뉴클레오타이드 변형을 포함하는 올리고뉴클레오타이드로 혼성화된다. 상보 가닥이 합성되며 이중 가닥 파지가 숙주 내로 삽입된다. 제조된 후손 중 일부는 원하는 돌연변이를 포함할 것이며, 이는 DNA 서열분석을 이용해 확인될 수 있다. 또한, 후손 파지가 요구되는 돌연변이일 것이라는 가능성을 증가시키는 데 다양한 방법이 이용가능하다. 이러한 방법들은 당업계에 공지되어 있으며 킷트는 이러한 돌연변이를 제조하기 위해 상업적으로 이용가능하다.
재조합 DNA 컨스트럭트 및 발현
본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 1 이상 포함하는 재조합 DNA 컨스트럭트를 추가로 제공한다. 본 발명의 재조합 컨스트럭트는 플라스미드, 파지미드(phagemid), 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터와 연결시켜 본 발명의 항체를 인코딩하는 DNA 분자를 삽입하는 데 사용된다.
인코딩된 유전자는 Sambrook et al., 1989, 및 Ausubel et al., 1989에 기재된 기술에 의해 제조될 수 있다. 선택적으로, DNA 서열은 예를 들어 합성기를 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(1984, Gait, ed., IRL Press, Oxford)에 기술된 기술을 참고, 이 문헌은 전체로써 본원에 참조문헌으로 포함된다. 본 발명의 재조합 컨스트럭트는 인코딩된 DNA(s)의 RNA 및/또는 단백질 산물을 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다. 이 벡터는 개방 판독 프레임(ORF, open reading frame)에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이 벡터는 선별가능 마커 서열을 추가로 포함할 수 있다. 특정 개시 신호 및 박테리아 분비 신호도 삽입된 표적 유전자 코딩 서열의 효과적인 번역을 위해 요구될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 DNA를 최소 1개 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 실질적으로 발현 벡터가 이용가능한 모든 세포일 수 있다. 예를 들어 포유동물 세포와 같은 고등 진핵 숙주 세포, 효모 세포와 같은 하등 진핵 숙주 세포 또는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포가 될 수 있다. 숙주세포로의 재조합 컨스트럭트의 삽입은 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE, 덱스트란 매개 형질감염, 전기천공법 또는 파지 감염에 의해 영향을 받을 수 있다.
박테리아 발현
박테리아에 사용하기에 유용한 발현 벡터는 바람직한 단백질을 인코딩하는 구조적 DNA 서열과 함께 적당한 번역 개시 및 중단 신호를, 기능적 프로모터를 가진 조절가능 판독 페이스에 삽입함으로써 컨스트럭트될 수 있다. 상기 벡터는 1 이상의 표현형 선별 마커 및 벡터의 유지를 가능하게 하는 복제 기원-바람직하게는 숙주 내에서의 증폭을 제공하기 위해-을 포함할 것이다. 형질전환하기에 적합한 원핵 숙주는 E. coli, 바실러스 서브틸리스, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 및 슈도모나스, 스트렙토코커스 및 스타필로코커스 종에 속하는 다양한 종을 포함한다.
예를 들어, 박테리아 벡터는 박테리오파지-, 플라스미드- 또는 파지미드-기반이 될 수 있다. 이러한 벡터들은 선별가능 마커 및 박테라아 복제 기원-공지된 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 구성성분을 포함하는 상업적으로 이용가능한 플라스미드로부터 유도된-을 포함할 수 있다. 적합한 숙주 균주를 형질전환시키고, 적절한 세포 농도까지 숙주 균주를 성장시키고 난 뒤, 선별된 프로모터는 적절한 수단(예, 온도 증가 또는 화학 유도)에 의해 탈억제/유도되고, 세포는 추가 기간 동안 배양된다. 일반적으로 세포는 원심분리에 의해 수득되고 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴되며, 이에 의해 제조된 조추출물은 추가 정제를 위해 유지된다.
박테리아 시스템에서, 발현벡터의 수는 발현되는 단백질에 사용하는 의도에 의존하여 선별되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 이런 단백질이 항체를 생산하고 펩타이드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 과량으로 생산될 때, 벡터는 손쉽게 정제된 높은 레벨의 융합 단백질 산물을 직접 발현하는 벡터가 바람직할 것이다.
치료 방법
치료 방법은 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명에 의해 고안된 항체를 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 본원에서 "치료학적으로 유효한" 양은 환자의 치료 부위에서-일회 투여량 또는 복수회 투여량의 투여에 따라, 단독으로 또는 부작용을 완화시키도록 유도하는 다른 제제와 혼합하여- GM-CSF와 이의 수용체 간의 결합을 효과적으로 차단하기에 충분한 양의 항체 량으로 정의되지만, 아직까지는 그 양은 독성학적으로 허용가능한 것이다. 환자는 인간 또는 비-인간 동물(예, 쥐 또는 붉은털 원숭이)일 수 있다.
본 발명의 항체는 공지된 약제와 함께 동시-투여될 수 있으며, 어떤 경우 항체는 그 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 항체는 추가로 효과를 증가시키기 위해 잠재적으로 면역독소 또는 방사선동위원소에 결합될 수 있다.
본 발명의 항체는 GM-CSF가 원하지 않게 발현되거나 발견되는 다양한 상황에서 치료학적 또는 진단적 수단으로 사용될 수 있다. 본 발명의 항체로 치료하기에 특히 적합한 질환 및 상태는 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증, 크론씨 병, 건선, 천식, 아토피 피부염 또는 쇼크와 같은 염증성 질환이다.
상기 질환중 어느 것이라도 치료하기 위해, 본 발명과 관련하여 사용하기 위한 약학적 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 이용하여 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 항체는 적합한 수단에 의해 투여될 수 있으며, 이는 치료하고자 하는 질환의 타입에 따라 달라질 수 있다. 가능한 투여 경로는 비경구(예, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하내), 허파내 및 비강내를 포함하며, 국소 면역억제적 치료를 위해서라면 손상부위내 투여를 포함한다. 게다가, 본 발명의 항체는 예를 들어 감소량의 항체로 파동 주입(pulse infusion)하여 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여량은 주입에 의해, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하내 주입에 의해 결정되며, 투여가 잠깐 또는 만성이냐에 따라 의존한다. 투여되어야 하는 양은 임상적 징후, 환자의 몸무게, 다른 약물이 투여되었느냐의 여부와 같은 다양한 인자에 의존할 것이다. 당업자라면 투여경로가 치료되어야 하는 질환 또는 상태에 따라 다양해 질 수 있다는 사실을 인식할 수 있을 것이다.
본 발명에 따라, 신규 폴리펩타이드의 치료학적 유효량을 결정하는 것은 각 개인의 특성, 투여 경로 및 치료되어야 하는 질환의 특징에 의존할 것이다. 일반적인 가이드는 예를 들어 다음에서 찾을 수 있다: 하모니세이션(Harmonisation)에서의 국제 컨퍼러스에서의 발표자료 및 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, chapters 27 and 28, pp 484-528(18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). 더 구체적으로는 치료학적 유효량을 결정하는 것은 약제의 독성 및 효능과 같은 인자에 의존할 것이다. 독성은 당업계에 공지되고 상기에 기술된 참조문헌에서 확인되는 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 효능은 하기 실시예에 기술된 방법과 연결한 유사한 가이드라인을 이용하여 결정될 수 있다.
진단 방법
GM-CSF는 림프구, 단핵구, 내피세포, 섬유아세포 및 일부 악성 세포를 포함하는 다양한 세포 타입에 의해 발현되므로; 본 발명의 항-GM-CSF 항체는 환자의 다양한 부위에 있는 GM-CSF의 가능한 축적 부위를 이미지화 하고 시각화하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 관점에서, 항체는 방사성동위원소, 친화 표지(바이오틴, 아비딘 등과 같은), 형광 표지, 상자성(paramagnetic) 원소 등을 이용하여 검출가능하게 표지될 수 있다. 이러한 표지를 실행하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 진단학적 이미지화에서 항체를 임상적으로 적용하는 것은 하기 문헌에서 검토되었다: Grossman, H. B., Urol. Clin. North Amer. 13:465-474 (1986), Unger, E. C. et al., Invest. Radiol. 20:693-700(1985), 및 Khaw, B. A. et al., Science 209:295-297(1980).
이러한 검출가능하게 표지된 항체의 위치를 검출하는 것은 예를 들어 염증 부위의 검출이 될 수 있다. 일 실시예에서, 이 실험은 조직 또는 혈액 샘플을 적출한 뒤, 이 샘플을 검출가능하게 표지된 항체의 존재하에서 반응시킴으로써 수행된다. 바람직한 구현예에서, 이 기술은 자성 이미지, 형광그래피, 등을 이용함으로써 비침투적 방법으로 수행된다. 이러한 진단 테스트는 질환 치료의 성공을 모니터링하는 데 이용될 수 있는데, 여기서 GM-CSF의 존재 또는 부재가 상대적인 표지자가 된다. 또한, 본 발명은 생체외 세팅에서 진단하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 항-GM-CSF 항체의 사용도 포함한다.
치료 및 진단 조성물
본 발명의 항체는 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위해 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있으며, 여기서 본 발명의 항체(이의 작용 단편도 포함)는 약제학적으로 허용가능한 담체 매개체와 혼합물로서 조합된다. 적합한 매개체 및 이의 제형은 예를 들어 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990)에 기술되어 있다. 효과적으로 투여하기에 적합한 약제학적으로 허용가능한 조성물을 제조하기 위해, 이 조성물은 적당량의 담체 매개체와 함께 본 발명의 1 이상의 항체를 유효량으로 포함할 것이다.
제제는 활성 물질의 서방형 (controlled-release) 전달을 적당하게 제형화될 수 있다. 서방형 제제는 복합체에 대한 폴리머 또는 흡착 항-GM-CSF 항체를 통해 실현될 수 있다. 조절된 전달은 적당한 거대분자(예, 폴리에스터, 폴리아미노산, 폴리비닐, 피롤리돈, 에틸렌비닐-아세테이트, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 또는 프로타민, 설페이트) 및 거대분자의 농도 뿐만 아니라 방출을 조절하기 위해 결합된 방법을 선별함으로써 실행가능할 수 있다. 서방형 제제에 의한 지속시간을 조절하기 위한 다른 가능한 방법은 폴리에스테르, 폴리아미노산, 하이드로겔, 폴리(락틱산) 또는 에틸렌 비닐아세테이트 코폴리머와 같은 폴리머 물질의 입자에 항-GM-CSF 항체를 결합시키는 것이다. 선택적으로는, 이들 제제를 폴리머성 입자에 결합시키는 대신에, 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 폴리머화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 하이드로메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸케타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 이들 제제를 삽입시키거나, 또는 예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐 또는 마크로에멀션과 같은 콜로이드성 약물 전달 시스템 내에 이들 제제를 삽입시키는 것도 가능하다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)에 기술되어 있다.
상기 물질은 주입, 예를 들어 덩어리(bolus) 주입 또는 계속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주입하기 위한 제형은 단위 용량 형태, 예를 들어 앰플로 또는 보존제가 첨가된 복합-용량 용기로 존재할 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 매개체 내에서 현탁, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제 등의 제형제 (formulatory agent)를 포함할 수 있다. 선택적으로, 활성 성분은 적합한 매개체, 예를 들어 사용하기 바로 직전에 멸균된 무-병원균 물과 함께 혼합하기 위해 파우더 형태가 될 수도 있다.
조성물은, 필요하다면, 활성 성분을 포함하는 1 이상의 단위 용량 형태를 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서 용기에 존재할 수도 있다. 예를 들어 팩은 금속 또는 블리스터 팩과 같은 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 용기는 투여하기 위한 지시법을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참조로 함으로써 이해될 수 있으나, 하기 실시예는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: HuCAL GOLD ® 라이브러리로부터 인간 GM-CSF 특이 항체의 생산
A. 파지미드 획득( rescue ), 파지 증폭 및 정제
HuCAL GOLD® 라이브러리를 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜 및 1% 글루코스를 포함하는 2X YT 배지(2X YT-CG)에서 증폭시켰다. 0.5의 OD600에서 헬퍼 파지 감염 후 (VCSM13)(혼합하지 않고 37℃에서 30분; 250 rpm으로 혼합하면서 37℃에서 30분), 세포를 원심분리하고(4120 g; 5분; 4℃), 2X YT/34㎍/㎖ 클로람페니콜/ 50 ㎍/㎖ 카나마이신/ 0.25 mM IPTG에 현탁한 뒤 22℃에서 밤새 배양하였다. 상등액으로부터 파지를 PEG-침전시켜, PBS/20% 글리세롤에 재현탁하고 -80℃에 보관하였다. 2개의 패닝(panning) 원 사이에서의 파지 증폭은 다음과 같이 수행하였다: 미드-로 그 단계 E. coli TG1 세포를 용출된 파지로 감염시킨 뒤, 1% 글루코스 및 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜이 첨가된 LB-아가에 플레이트시켰다. 30℃에서 밤새 배양하고 난 뒤, 콜로니를 긁어내어 2X YT-CG에 접종해 OD600에서 0.5가 될때까지 배양한 후 하기에 기술된 바와 같이 헬퍼 파지를 첨가하였다.
B. HuCAL GOLD ? 과 패닝
인간 GM-SF를 인식하는 항체를 선별하기 위해 여러 개의 패닝 방법을 적용하였다. 요약하자면, HuCAL GOLD® 항체-파지를 다른 VH 마스터 유전자를 포함하는 3개의 풀(pool)로 나누었다. 이 풀을 각각 다음 중의 하나에 주입하였다: a) 3개의 원에 대한 고체 지지체로서 뉴트라비딘(neutravidin) 코팅된 96웰 플레이트(Pierce, Rockford, IL)에 직접적으로 코팅된 바이오티닐화된 인간 GM-CSF 단백질(R&D Systems, Minneapolis, MN에 의해 제조된 것) 상의 고체상 패닝, b) 3개의 원에 대해 스트렙타비딘 코팅된 다이나비드(Dynal, Oslo, Norway) 상에 캡춰된 바이오티닐화된 인간 GM-CSF 단백질 상의 용액 패닝.
자세히 말하면, 고정된 바이오티닐화 GM-CSF 상에 패닝시키기 위해, 뉴트라비딘 플레이트의 웰을 300 ㎕ PBS로 3회 세척하였다. 항체를 PBS에 3 ㎍/㎖(200 nM) 농도로 희석하고, 0.1 ㎖을 각 웰에 넣어 실온에서 2시간 동안 코팅시켰다. 300 ㎕ PBS로 2번 세척하고 난 뒤, 웰을 2X 케미블로커(Chemiblocker)(Chemicon, Temecula, CA)를 PBS에 1:1로 희석한 것을 포함하는 블로킹 버퍼로 반응시켰다.
선별하기 전에, HuCAL GOLD® 파지 100 ㎕를 0.4 ㎕ 25% Tween20 포함 블로킹 버퍼 100 ㎕에 넣어 실온에서 0.5시간 동안 전-흡착시켰다. 블로킹된 파지를 100 ㎕씩 뉴트라비딘 플레이트의 웰에 첨가하여 0.5시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이 단계를 전-흡착 동안 2회 반복하였다.
코팅되고 블로킹된 뉴트라비딘 마이크로타이터 플레이트를 세척(2X 300 ㎕ PBS)한 뒤, 전-흡착된 파지 0.1 ㎖을 코팅된 웰에 첨가하여 실온에서 부드럽게 쉐이킹하여 1.5시간 동안 반응시켰다. 이 반응물을 PBS/0.05% Tween20을 이용해 실온에서 10회 순환 세척하였다.
10 mM Tris pH 8.0에 녹아있는 20 mM DTT 120 ㎕를 각 웰에 첨가하여 실온에서 10분 동안 반응시킴으로써 결합된 파지를 용출시켰다. 용출물을 제거한 뒤 OD600에서 0.6-0.8로 자란 E. coli TG1 14 ㎖에 첨가하였다. 웰을 200 ㎕의 PBS로 추가로 세척한 뒤, 이 용액을 TG1 세포에 첨가하였다. E. coli의 파지 감염물을 쉐이킹하지 않으면서 37℃에서 45분 동안 놓아 두었다. 추가로 200 ㎕의 TG1 세포를 OD600이 0.6-0.8이 될 때까지 성장시킨 뒤, 선별 웰에 넣어 쉐이킹하지 않으면서 37℃에서 45분 동안 놓아 두었다. 상기 첫번째 용출 단계로부터의 파지를 이미 포함하고 있는 14 ㎖ 배양물에 이 TG-1 세포를 첨가하였다. 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 난뒤, 이 박테리아 펠렛을 각각 2X YT 배지 500 ㎕에 재현탁하여, 2X YT-CG 아가 플레이트에 플레이팅한 뒤 30℃에서 밤새 배양하였다. 그리고 난 뒤 플레이트로부터 콜로니를 긁어내어, 파지를 획득한 뒤 하기에 기술된 바에 따라 증 폭시켰다.
두번째 및 세번째 라운드 선별은, 파지를 결합시키고 난 뒤의 세척 조건을 훨씬 강력하게 하는 것만 다르고, 첫번째 라운드 선별과 동일한 방법으로 수행하였다. 추가로 세번째 라운드 선별에서, 파지는 스트렙타비딘-코팅된 비드(Dynabeads M-280; Dynal) 상에서 추가적인 전흡착 단계를 수행한다. 에펜도르프 튜브를 케미블로커 용액으로 실온에서 30분 동안 반응시켜 블로킹시켰다. 각 파지 풀 중에 0.3 ㎖을 0.05% Tween20을 포함하는 2X케미블로커 용액과 1:1로 혼합하여 상기 블로킹된 에펜도르프 튜브에서 회전시켜 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그리고 난 뒤, 블로킹된 파지를 새로운 블로킹된 에펜도르프 튜브에 넣어, Dynabead M-280 50 ㎕를 첨가해 30분 동안 더 반응시켜 전흡착시켰다. 자석 장치(Dynal MPC-E)를 이용해 비드를 제거하였다. 그리고 난 뒤 파지를 150 ㎕씩 나누어서 뉴트라비딘 플레이트에 넣어 라운드 1 및 2와 같이(상기 참조) 추가로 전흡착시켰다.
다이나비드에 결합된 바이오티닐화된 GM-CSF를 이용한 용액 패닝을 위해, 하기 프로토콜을 적용하였다: 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브를, PBS로 1:1로 희석한 2X케미블로커 1.5 ㎖로 4℃에서 밤새 블로킹시켰다. 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드(Dynabeads M-280; Dynal) 200 ㎕를 PBS 200 ㎕로 1회 세척하고 1X케미블로커(1X PBS에 희석된) 200 ㎕에 재현탁하였다. 비드의 블로킹은 4℃에서 밤새 수행하였다. 각 패닝 조건에 대해 500 ㎕의 PBS에 희석한 파지를 500 ㎕의 2X케미블로커/0.1% Tween과 혼합하여 실온에서(회전기에서) 1시간 동안 혼합하였다. 파지의 전흡착은 2회 수행하였다:블로킹된 스트렙타비딘 마그네틱 비드 50 ㎕를 블로킹된 파 지에 첨가하여 회전기에서 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 마그네틱 장치(Dynal MPC-E)를 이용해 비드를 분리하고 난 뒤, 파지 상등액(~ 1㎖)을 새로운 블로킹 튜브에 넣어 50 ㎕의 블로킹된 비드 상에서 30분 동안 전흡착을 반복하였다. 그리고 난 뒤, 200 nM의 바이오티닐화된 hGM-CSF를 새로운 블로킹된 1.5 ㎖ 튜브에 들어있는 블로킹된 파지에 넣어 회전기에서 실온으로 1시간 동안 반응시켰다. 100 ㎕의 블로킹된 스트렙타비딘 마그네틱 비드를 각 패닝 파지 풀에 넣어 회전기에서 실온으로 10분 동안 반응시켰다. 바이오티닐화된 GM-CSF에 파지가 결합되었으며, 따라서 마그네틱 비드에 고정된 것을 마그네틱 입자 분리기(Dynal MPC-E)를 이용해 분리하였다. 그리고 난 뒤 비드를 회전기를 사용해 PBS/0.05% Tween로 7회 세척하였으며, PBS로 추가로 3회 세척하였다. 다이나비드로부터의 파지 용출은 각 튜브에 10 mM Tris/HCl pH8에 들어있는 20 mm DTT를 300 ㎕ 첨가하여 10분 동안 수행하였다. 마그네틱 입자 분리기로 다이나비드를 제거한 뒤, 상등액을 OD600이 0.6-0.8이 될 때까지 배양한 E.coli TG-1 세포 14 ㎖에 첨가하였다. 그리고 난 뒤 PBS 200 ㎕로 비드를 1회 세척한 뒤, PBS를 포함하는 추가의 제거된 파지를 E. coli TG-1 배양물 14 ㎖에 첨가하였다.
5000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 난 뒤, 박테리아 펠렛을 2X YT 배지 500 ㎕에 각각 재현탁하여, 2X YT-CG 아가 플레이트에 플레이팅하고 30℃에서 밤새 배양하였다. 그리고 난 뒤 플레이트로부터 콜로니를 긁어내어 파지를 획득하고 하기에 기술된 바와 같이 증폭시켰다.
바이오티닐화된 GM-CSF 상에서의 두번째 및 세번째 라운드 용액 패닝은 세척 단계의 가혹성을 증가시키는 것을 제외하고는 첫번째 라운드의 프로토콜에 따라 수행하였다.
C. 선별된 Fab 단편의 서브클로닝 및 수용성 Fab 단편의 발현
선별된 HuCAL GOLD? 파지미드의 인서트를 인코딩하는 Fab를 발현 벡터 pMORPH?X9_Fab_FH(도 5)에 서브클로닝하여 수용성 Fab의 빠른 발현을 유도시켰다. 선별된 클론의 DNA를 XbaI 및 EcoRI으로 절단하여, Fab 인코딩 인서트(ompA-VLCL 및 phoA-Fd)를 잘라내, XbaI/EcoRI 절단된 벡터 pMORPH?X9_Fab_FH에 클로닝하였다. 이들 벡터에서 발현된 Fab는 검출 및 정제를 위해 2개의 C-말단 태그(FLAGTM 및 6xHis, 각각)를 갖고 있다.
D. HuCAL GOLD ? Fab 항체의 E.coli 에서의 마이크로발현
pMORPH®X9_Fab_FH에 서브클로닝하고 난 뒤에 얻은 단일 콜로니를 2xYT/Cm/1% Glu 배지를 각 웰에 100 ㎕ 포함하는 멸균된 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 접종하는데 사용하였으며 37℃에서 밤새 배양하였다. 각 TG-1 E.coli 배양물 5 ㎕를 2xYT/Cm/1% Glu 배지를 각 웰에 100 ㎕ 포함하는 새로운 멸균된 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 넣었다. 상기 마이크로타이터 플레이트는 세포 배양물이 OD600nm가 0.5로서 매우 혼탁할 때까지(~ 2 내지 4시간) 마이크로플레이트 쉐이커에서 400 rpm으로 쉐이킹하여 30℃에서 반응시켰다. 이 발현 플레이트에 2xYT/Cm/3mM IPTG 20 ㎕를 각 웰에 첨가하고(최종 농도 0.5 mM IPTG), 가스-투과성 테이프로 밀봉하여 400 rpm으로 30℃에서 밤새 반응시켰다
전세포 용해물의 제조(BEL 추출물)
발현 플레이트 각 웰에, 2.5 ㎎/㎖ 라이소자임을 포함하는 40 ㎕의 BEL 버퍼(2xBBS/EDTA: 24.7 g/l 보릭산, 18.7 g NaCL/l, 1.49 g EDTA/l, pH 8)을 첨가하여 마이크로타이터 플레이트 쉐이커(400 rpm) 상에서 22℃로 1시간 동안 반응시켰다. BEL 추출물은 ELISA 또는 BioVeris® M-series 384 분석기(실시예 2 참조)를 이용한 결합 분석에 사용하였다.
E. HuCAL GOLD ? Fab 항체의 E.coli 에서의 발현 및 정제
pMORPH?X9_Fab_FH에 의해 인코딩되는 Fab 단편의 TG-1 세포에서의 발현은 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜이 첨가된 2xYT 배지 1 l가 들어 있는 쉐이커 플라스크 배양에서 수행하였다. 0.5 mM IPTG로 배양하고 난 뒤, 세포를 22℃에서 16시간 동안 배양하였다. 세포 펠렛의 전체 세포 추출물은 French Press에 따라 제조하였으며, Fab 단편은 니켈/NTA 크로마토그래피(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용해 분리하였 다. UV-흡광기를 사용해 농도를 측정하였다(Kreb et al., 2001).
실시예 2: hGM-CSF 특이 항체의 확인
상기에 언급된 패닝 전략에 의해 선별된 각 E.coli 클론의 BEL 추출물을 ELISA 또는 BioVeris (BioVeris M-series® 384 analyzer)로 분석하여 hGM-CSF 특이적 Fabs를 인코딩하는 클론을 확인하였다.
A. 효소 면역 분석 (ELISA) 기술
인간 재조합 바이오티닐화된 GM-CSF(R&D Systems)를 PBS에 1.5㎍/㎖ 농도로 넣어 뉴트라비딘 마이크로타이터 플레이트상에서 2시간 동안 실온에서 코팅시켰다.
항원을 코팅하고 난 뒤, 웰을 1% BSA를 포함하는 PBS/0.05% Tween(PBS-T)로 실온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 상기 웰을 PBS-T로 세척하고 난 뒤, BEL-추출물, 정제된 Hu-CAL®Fab 또는 대조군 IgG를 PBS에 희석하여, 상기 웰에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 일차 항체를 검출하기 위해, 이차 항체인, 알칼라인 포스파타제(AP)-결합된 아피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편, 염소 항-인간, -항-생쥐 또는 -항-쥐 IgG(Jackson Immuno Research)를 적용하였다. AP-결합물을 검출하기 위해 AttoPhos(Roche)와 같은 플루오로제닉 기질을 제조사의 지침에 따라 사용하였다. 모든 반응 단계 중간에, 마이크로타이터 플레이트의 웰들을 PBS-T로 3회 세척하고 이차 항체로 최종 반응시키고 난 뒤 3회 세척하였다. 형광은 TECAN 스펙트라플루오르 플레이트 판독기로 측정하였다.
B. 분해물 내의 GM-CSF 결합 Fab 의 검출을 위한 전기화학발광( electrochemiluminescene , BioVeris) 기초 결합 분석
E. coli 분해물(BEL 추출물)에 있는 GM-CSF 결합 Fab 항체를 검출하기 위한 ELISA 실험에 대한 대안으로, BioVeris M-SERIES®384 분석기(BioVeris, Europe, Witney, Oxforfshire, UK)를 사용해 결합을 분석하였다.
이 때문에, BEL 추출물을 BioVeris 스크리닝에 사용하기 위해 분석 버퍼(PBS/0.05%Tween20/0.5%BSA)에 최소 1:50, 최대 1:1000으로 희석하였다. 바이오티닐화된 GM-CSF(R&D System)를 스트렙타비딘 코팅된 파라마그네틱 비드인 다이나비드(Dynal)에 0.1㎍/㎖ 농도로 결합시켰다. 96웰 또는 384웰의 각 웰당 25 또는 15 ㎕의 1:25 희석된 다이나비드-농축 용액을 사용하였다. 바이오티닐화된 GM-CSF를 첨가하기 전에 분석 버퍼를 사용해 비드를 쉐이커상에서 실온으로 30분 동안 3회 세척하였다. 그리고 난 뒤 비드를 분석 버퍼로 3회 세척하고, 마지막으로 새로운 분석 버퍼에 재현탁하였다. BV-tagTM(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)를 사용해 항-인간(Fab)'2(Dianova)를 루테늄(ruthenium) 표지시켰다. 이 이차항체를 사용하기 바로 직전에 6㎍/㎖ 농도로 GM-CSF 결합된 비드에 첨가하였다. Fab 항체를 포함하는 E.coli 발현 배양액의 희석 BEL 추출물(상기를 참고) 100 ㎕ 또는 60 ㎕를 96웰 또는 384웰 플레이트의 웰에 각각 넣고 GM-CSF 결합된 비드와 항-Fab-BV-tagTM 이차항체 혼합물 25 또는 15 ㎕를 각 웰에 넣어 플레이트 쉐이킹 기기 상에서 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이 플레이트를 BioVeris M-SERIES?384 분석기에서 분석하였다.
서열분석하고 난 뒤 74개의 독특한 클론은 충분히 강하게 결합(신호:잡읍 비율이 ELISA에서 10:1 이상이거나 BioVeris에서 50:1 이상)하는 것으로 확인되었다.
C. 선별된 항- hGM-CSF Fabs 의 분자 특이성 및 종 교차반응성의 확인
항-hGM-CSF 항체의 교차반응성은 다음의 분석물로 확인하였다: 쥐 및 생쥐 GM-CSF, 인간 IL-3, 인간 IL-4, 인간 IL-5, 인간 IL-13, 인간 M-CSF(모두는 Peprotech사의 것, London, UK). 이는 표면 플라스몬 공명(Biacore 3000, Uppsala, Sweden)에 의해 셋업된 캡처에서 수행하였다.
표준 EDC-NHS 아민 커플링 케미스트리를 사용하여 CM5 칩(Biacore, Sweden)을 5000-6000RU 항-F(ab)2(Dianova, Affinipure F(ab)2 단편 염소 항-인간 IgG, F(ab)2 단편 특이적); 80 ㎍/㎖ 10mM 아세테이트 버퍼, pH4로 모든 4개의 플로우 셀(flow cell) 상에 코팅시켰다. 플로우 셀 상에 2-4개의 특이 GM-CSF Fabs(500nM Fab 20㎕의 흐름속도는 5㎕/㎖, 300-400RU)가 캡쳐되었다. 특이 GM-CSF를 캡춰하고 난 뒤, 버퍼를 주입하여, 항-Fab/Fab 결합의 분해를 확인하였다. 다음의 사이클에서, 분석물 성장 인자를 15 내지 2000nM 농도로 주입하여(20㎕, 흐름속도 20㎕/분 ), 특이적 신호를 확인하였다. 그리고 난 뒤, 수득된 버퍼 센소그램(sensogram)을 특이적인 것으로부터 주기적으로 추출하였다. 각 사이클 후에, 플로우 셀을 100 mM HCl(5㎕)로 재생시켰다.
MOR03684 및 MOR03682를 포함하는 7개의 HuCAL® 항-hGM-CSF 항체가 테스트되었으며, 이는 인간 GM-CSF에 특이적이고, 모든 다른 사이토카인 또는 생쥐 또는 쥐 GM-CSF에도 결합하지 않는다. 반대로 Fab MOR03929는 쥐 GM-CSF에 대해 유의적인 교차 반응성을 보여주었다.
실시예 3: GM-CSF 및 GM-CSF 수용체 알파 사이의 상호작용을 저해하는 항-인간 GM-CSF Fab 후보자의 동정
HuCAL GOLD? 라이브러리로부터 선별된 74개의 다른 hGM-CSF 특이적 항체를, hGM-CSF 및 이의 수용체 간의 상호작용을 저해하는 잠재성에 대해 테스트하였다. 이 상호작용은 다음의 2가지 방법으로 테스트하였다, (i) 하나는 GM-CSF 의존성 TF-1 세포주를 이용한 증식 분석(Kitamura et al., 1989) 및 (ii) 다른 하나는 GM-CSF 수용체의 알파 체인을 발현하는 재조합 CHO 세포주를 이용한 FACS 분석. TF-1 증식 분석에서, 알파 체인 및 베타 체인으로 구성되는 내인성 GM-CSF 수용체와 항-GM-CSF 항체의 상호작용을 차단하는 항-GM-CSF 항체의 능력은 세포 증식에서 감소를 유도하는 것으로 분석되었다. FACS 분석에서, GM-CSF 및 GM-CSF 수용체의 알파 체인 간의 상호작용이 확인되었다.
A. 붉은털 원숭이( macaca mulata ) 및 인간 GM-CSF의 클로닝 및 발현
붉은털 원숭이 GM-CSF 전장 cDNA(유전자은행 참조 번호:AY007376)는 유전자 합성(geneART GmbH, Regensburg, Germany)으로 분석하고 pCR-Script-Amp 벡터(Stratagene, LaJolla, CA, USA)에 클로닝하였다. 그 다음으로, cDNA를 진핵세포 발현 벡터 pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Paisley, UK) yielding pcDNA-macGM-CSF에 클로닝하였다. Qiagen사(Hilden, Germany)의 RNeasy 킷트를 사용하여 1x10e7 TF-1 세포로부터 분리한 RNA로부터 RT-PCR 기술을 사용해 인간 GM-CSF의 cDNA(유전자은행 참조번호 NP_000749)를 클로닝하였다. 역전사는 랜덤 헥사머(Gibco)를 이용한 SuperscriptII 킷트를 이용한 뒤 PCR로 GM-CSF cDNA를 증폭함으로써 수행되었다. 획득된 PCR-산물을 발현 벡터 pcDNA3.1(+) yielding pcDNA-huGM-CSF에 클로닝하였다.
리포펙타민(Stratagene, LaJolla, USA)을 이용해 이들 발현 벡터 각각을 HEK293 세포에 일시적 형질감염시켰다. 분비된 재조합 붉은털원숭이 또는 인간 GM-CSF를 포함하는 배지를 형질감염 후 4일째에 수득하였다.
B. 인간 또는 붉은털원숭이 GM-CSF 를 이용한, 항- hGM-CSF Fabs 에 의한 TF- 1 세포의 GM-CSF 의존성 증식의 저해
TF-1 세포(Kitamura et al., 1989)를 공급자의 프로토콜(DSMZ, Braunschweig, Germany; DSMZ No. ACC 334)에 따라 배양하였다. TF-1 세포를 RPMI1640 배지(10% FCS)로 2회 세척한 뒤, 편평 바닥 96웰 배양 디쉬의 각 웰 50 ㎕에 2x105 세포/㎖ 농도로 접종하였다. 0.5 ng/㎖ 인간 재조합 GM-CSF("Leucomax", ESSEX Pharma, Munchen) 및 HuCAL®Fab 항체(RPMI1640 배지에 200 ng/㎖ - 200 ㎍/㎖로 희석, 10% FCS)를 30분 동안 혼합하고, 혼합액 50 ㎕를 TF-1 세포에 첨가하여, GM-CSF의 최종농도는 0.25 ng/㎖이 되었다. 최대 세포 증식(0% 저해)은 항체를 첨가하지 않고, 최종 GM-CSF의 농도가 0.25 ng/㎖로 TF-1 세포를 배양할 때 측정되었다. TF-1 증식의 100% 저해는 분석할 때 GM-CSF를 제거하고 RPMI1640 배지(10% FCS)에서만 세포를 배양했을때 확인되었다. 그리고 난 뒤, TF-1 세포를 5% CO2가 유지되는 습윤 챔버에서 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 세포 생존도는 MTT 또는 XTT 시약(Roche, Mannheim, Germany)을 첨가하여 제조사의 방침에 따라 측정하였다. 19개의 Fab 모두는 TF-1 증식을 유의적으로 저해하는 것으로 확인되었다. 결합제 MOR06382, MOR03684 및 MOR03929는 2 μM 농도에서 TF1 세포 증식을 꾸준하게 50% 이상 저해하는 것으로 확인되었다. 이들 비-최적화된 Fabs의 저해 활성은 IC50 용량을 결정하기에는 충분히 강하지 않았는데, 그 이유는 완벽한 저해가 수행될 수 없기 때문이다. 이와 대조적으로, 모노클로날 항체 BVD2-21C11(BD Bioscience Pharmingen; Cat#554503) 및 MAB215(R&D Systems; Cat#MAB215)는 TF-1 증식을 완전히 저해할 수 있었다.
추가로, 천연 인간 GM-CSF에 대한 MOR06382 및 MOR03684의 결합은 TF-1 증식 분석에서 테스트하였다. TF-1 세포에 정제된 인간 재조합 GM-CSF를 첨가하는 대신에 천연 인간 GM-CSF를 분비하는 5637 세포(DSMZ No. ACC35)의 상등액을 배양액에 넣은 것을 사용하였다. 재조합 인간 GM-CSF의 효과를 다르게 희석한 5637 상등액과 비교하는 용량 반응 곡선으로부터, 상기 배지가 천연 인간 GM-CSF를 약 5 ng/㎖ 포함하는 것으로 확인되었다. 5637 상등액을 항-인간 GM-CSF Fab MOR03682 또는 MOR03684로 전-배양함으로써, TF-1 세포에 대한 천연 인간 GM-CSF의 결합이 차단되었으며, 이로 인해 세포의 생존도는 재조합 인간 GM-CSF로 실험했을 때와 비교했을 때 감소하였다. 따라서 MOR03682 및 MOR03684는 천연 인간 GM-CSF에 결합한다. Fab MOR03929는 이 분석에서 테스트되지 않았다.
추가로, 붉은털원숭이 GM-CSF에 대한 교차 반응성은 TF-1 증식 분석에서 테스트하였다. 정제된 인간 GM-CSF를 TF-1 세포에 첨가하는 대신에, 재조합 붉은털원숭이 GM-CSF를 분비하는 형질감염된 HEK293 세포의 상등액을 배지에 넣은 것을 사용하였다.
TF-1 세포는 상등액을 포함하는 붉은털원숭이 GM-CSF의 존재하에서는 증식하지만, 형질감염되지 않은 HEK293 세포의 상등액의 존재하에서는 증식하지 않는다. 재조합 인간 GM-CSF의 효과를 다르게 희석한 HEK-293 배지와 비교하는 용량 반응 곡선으로로부터, 형질감염된 세포의 배지가 붉은털원숭이 GM-CSF를 약 2 ㎍/㎖ 포함하는 것으로 확인되었다. 붉은털원숭이 GM-CSF 상등액을 항-인간 GM-CSF Fab MOR03682 또는 MOR03684로 전-배양함으로써, TF-1 세포에 대한 붉은털원숭이 GM-CSF의 결합이 차단되었으며, 이로 인해 세포의 생존도가 유의적으로 감소하였다. 따라서 MOR03682 및 MOR03684는 붉은털원숭이 GM-CSF와 교차-반응성이 있다. Fab MOR03929는 이 분석에서 테스트되지 않았다.
C. 항- hGM-CSF Fabs 를 이용한, GM-CSF 수용체 알파에 대한 GM-CSF 결합의 차단
세포 표면 발현된 GM-CSF 수용체 알파 체인에 대한 GM-CSF의 결합을 테스트하기 위해 cDNA를 발현 벡터에 클로닝하고 CHO-K1 세포(DSMZ ACC 110)에 안정하게 형질감염시켰다.
GM-CSF 수용체의 알파 체인을 발현하는 안정한 CHO-K1 세포주의 클로닝
Qiagen사(Hilden, Germany)의 RNeasy 킷트를 사용하여 1x10e7 TF-1 세포로부터 분리한 RNA로부터 RT-PCR 기술을 사용해 인간 GM-CSF 수용체 알파 체인의 cDNA(유전자은행 참조번호 M64445)를 클로닝하였다. 역전사는 랜덤 헥사머(Gibco)를 사용해 SuperscriptII 킷트를 이용하여 수행하였다. 그리고 난 뒤 하기 프라이머를 사용하여 GM-CSF-수용체 알파 체인 cDNA를 증폭하였다.
5': N-GCRa-plusSS: TTCTCTGGATCCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACAAGCC 및
3': C-flGCRa: ACCCTCCAATTGTCAGGTAATTTCCTTCACGGTC.
PCR 반응에서 약 1250bp의 산물을 얻었으며 이를 EcoRI 및 BamHI(New England BioLabs)으로 절단하였다. 발현 벡터 pcDNA3.1(+)(Invitrogen, Paisley, UK)를 동일한 효소로 절단하였다. 절단된 벡터와 PCR 산물을 정제하고 난 뒤, 그 단편을 라이게이션하고 전기천공법으로 E.coli DH10B 세포에 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 제조하고 서열분석을 하고 난 뒤에 정확한 클론을 동정하였다. 정확한 클론(pcDNA3.1(+)-GM-CSFRalpha)은 전장 인간 GM-CSF 수용체 알파 cDNA를 포함한다.
공급사의 프로토콜(DSZM, Braunschweig, Germany; DSMZ No. ACC 110)에 따라 CHO-K1 세포를 배양하였다. 형질감염시키기 위해, 세포를 6웰 플레이트에서 80%의 밀집도가 될 때까지 배양한 뒤 pcDNA3.1(+)-GM-CSFRalpha DNA 5㎍과 리포펙타민 2000 시약(Invitrogen) 10 ㎕ 혼합액으로 배양시켰다. 48시간 뒤에, 세포에 1 ㎎/㎖ G418(Gibco)을 첨가하고, 추가로 24시간 뒤에 2 ㎎/㎖ G418을 포함하는 배지로 교체하였다. 2주 뒤에, 단일 세포를 96웰 배양 디쉬의 웰에 접종하였다. 단일 클론을 배양한 뒤 각 클론의 5x105 세포를, 일차 항체로서 생쥐 IgG MAB1006(Chemicon International, Temecula, CA)을 1㎍/㎖ 농도로 사용하고, 이차 항체로서 (R-PE-AffiniPure(Fab')2 염소-항-생쥐-IgG(Diavona)를 1:200 비율로 희석해 사용하여 FACS 분석함으로써 GM-CSFR-alpha 발현에 대해 분석하였다. 일차 및 이차 항체를 1시간 동안 순차적으로 세포와 반응시키고, 그 동안 각 단계 중에 FACS 버퍼(PBS, 3% FCS)에서 세포를 세척하였다. 염색된 세포의 형광은 FACSCalibur 시스템(Becton Dickinson)을 사용하여 FL2 채널에서 정량화하였다.
분석된 클론 중에서 CHO-GMRa#11 클론은 가장 높은 평균 형광 강도를 보여주었다. 157의 평균 형광 값(MFL 값)을 CHO-GMRa#11에 대해 평가하였다(도 6).
CHO- GMRa#11 상에 발현된 GM-CSF 수용체 알파에 결합한 GM-CSF의 FACS 분석:
세포에 첨가하기 전에, 증가 농도의(0.1 에서부터 100 ㎍/㎖) 항체를 FACS 버퍼(PBS/3%FBS/NaN30.05%)에서 바이오티닐화된 GM-CSF(0.5㎍/㎖)와 함께 실온에서 30분 동안 반응시켰다.
각 웰 당 5x105 세포가 들어있는 둥근바닥 96웰 배양 플레이트(Nalge Nunc)에서 모든 염색을 수행하였다. 2x10E5 CHO-GMRa#11 세포를 항체/GM-CSF 포함 FACS 버퍼 50㎕에 넣은 뒤 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 난 뒤, 세포를 150 ㎕ FACS 버퍼/웰로 한번 세척한 뒤, 피코에리트린-표지된 스트렙타비딘(BD Biosciences Pharmingen)을 FACS 버퍼에 1:400 비율로 희석한 용액 100 ㎕에 넣었다. 4℃에서 1시간 동안 배양하고난 뒤, 세포를 FACS 버퍼로 2번 세척하고, 100 ㎕의 FACS 버퍼에 재현탁하여, 바이오티닐화된 GM-CSF의 결합을 FACScalibur(Becton Dickinson)에서의 세포의 FL2 형광 강도로서 측정하였다. GraphPad Prism v3.03 소프트웨어를 이용하고 비-선형 회귀 커브 핏트 (fit)를 적용하여 얻은 용량 반응 곡선으로부터 IC50 값을 확인하였다.
Fab 항체 MOR03682, MOR03684 및 MOR03929는 세포 표면 발현된 GM-CSF 수용체 알파에 대한 GM-CSF의 결합을 유의적으로 저해하는 것으로 나타났다.
실시예 4: 단계별 CDR 카세트 교환을 통한 선별된 Fab 의 친화 성숙( maturation )
A. 친화 성숙 Fab 라이브러리의 생산 및 패닝
항-GM-CSF Fab 단편의 친화도 및 저해 활성을 증가시키기 위해, 클론 MOR03682, MOR03684 및 MOR03929를 친화 성숙에 주입시켰다. 이러한 관점에서, CDR 부위를 트리뉴클레오타이드 유도 돌연변이 생성을 이용한 카세트 돌연변이 유도로 최적화시켰다(Virnekas et al., 1994; Nagy et al., 2002). 서열분석에서는 분석된 3개의 부모(parent) 클론의 CDRs 간에 서열 상동성을 보이지 않았다. 표 2a 및 2b에서는 부모 클론 MOR03682, MOR03684 및 MOR03929에 대해 6개의 CDR 펩타이드 서열을 제공한다.
하기에서는 Fab 최적화를 위해 사용되는 프로토콜을 상세하게 설명한다. 발현 벡터 pMORPH®X9Fab_FH로부터 Fab 단편을 파지미드 벡터에 클로닝하였다(US 6,753,136). 그리고 난 뒤, 부모 Fabs의 친화도 및 효율성을 최적화하기 위해 2개의 다른 전략을 적용하였다.
첫번째로, 각 부모의 L-CDR3가 개별 람다 경쇄 CDR3 서열의 반복 부위로 치환된 부위에 1개의 파지 항체 Fab 라이브러리를 생성하였다. 2번째 라이브러리에는, 개별 중쇄 CDR2 서열의 반복 부위에 H-CDR2 부위를 치환하였다.
친화 성숙 라이브러리는 다양한 클론을 E. coli TOP10F'(Invitrogen)에 형질전환시킴으로써 얻었다. 파지는 실시예 1A에 기술된 바와 같이 제조하였다. MOR03684 및 MOR03682의 L-CDR3 라이브러리 모두를 모으고, MOR03684 및 MOR03682로부터 유도된 H-CDR2 라이브러리 모두를 모았으나, MOR03929로부터 유도된 L-CDR3 및 H-CDR2 라이브러리는 선별 과정 동안 분리하여 보관하였다. 패닝은 바이오티닐화된 GM-CSF가 포함된 용액에서 실질적으로는 실시예 1B에 기술된 바와 같이 실시하고 훨씬 강력한 선별 조건으로 3회 실시하였다.
B. 분해물 내의 향상된 GM-CSF 결합 Fab 검출을 위한 전기화학발광( BioVeris ) 기초 결합 분석
E.coli 분해물(BEL 추출물)에 있는 GM-CSF 결합 Fab 항체를 검출하기 위해, 실시예 2B에 기술된 바에 따라 BioVeris M-384 SERIES®Workstation(BioVeris Europe, Witney, Oxforfshire, UK)에서 결합을 분석하였다.
가장높은 ECL 값을 가진 Fab를 정제하였으며, 이를 용액 평형 역가분석(SET; Haenel et al, 2005) 및 표면 플라즈몬 공명(Biacore)를 사용해 친화도 측정하였다(참조, 실시예 4D).
C. 향상된 VH (H- CDR2 )를 이용한 향상된 VL (L- CDR3 )의 X- 클로닝
친화도를 추가로 더 향상시키기 위해, 동일한 부모 클론으로부터 유도된 성숙된 Fabs로부터 독립적으로 최적화된 H-CDR2 및 L-CDR3를 조합하였는데, 그 이유는 이러한 조합이 추가적인 친화도를 얻을 수 있게 할 높은 가능성이 있기 때문이 다(Yang et al., 1995; Schier et al., 1996; Chen et al., 1999). X-클로닝이라 불리는 이 방법을, H-CDR2 및 L-CDR3 라이브러리 모두로부터 확인된 향상된 친화도를 갖는 Fabs로서 부모 클론 MOR03929로부터 유도된 결합제에 적용하였다. 이는 모든 경쇄 (XbaI/SphI 단편)를 L-CDR3-최적화 공여자 클론으로부터 H-CDR2-최적화 수용체 클론으로 전달시킴으로써 수행하였다.
[표 3]
X-클로닝 조합
부모 VH 공여자 VL 공여자 X-클로닝 후 친화도 향상된 Fab
MOR03929 MOR04287
MOR04290
MOR04252		 x MOR04302 MOR04350
MOR04354
MOR04357
MOR03682 MOR04283 x MOR04297 MOR04342
제조된 4개의 Fabs에 대해, VL 및 VH를 서열분석하여 H-CDR2 향상된 벡터 기본구조에 VL이 정확하게 전달되었는지 확인하였다. 표 2a 및 2b에서는 MOR03929 및 3682의 모든 유도체의 VH 및 VH 단백질 서열을 보여주며, 이는 표 3에 리스트되어 있다.
D. 용액 평형 역가분석 ( SET ) 및 표면 플라즈몬 공명( Biacore )을 이용한 피코몰 농도 친화도의 측정
KD를 측정하기 위해, Fab의 모노머 분획(분석용 SEC(Superdex75, Amersham Pharmacia)로 분석했을 때 최소 90% 함량의 모노머)을 사용하였다. 용액내에서의 전기화학발광(ECL) 기초 친화도 측정 및 결과 분석은 기본적으로 Haenel et al., 2005에 기술된 방법-일정량의 Fab를 용액내의 다양한 농도의(순차적 5n 희석) 인간 GM-CSF(Leucomax)로 평형화-으로 수행하였다. 파라마그네틱 비드(M-280 스트렙타비딘, Dynal)에 결합된 바이오티닐화된 인간 GM-CSF(R&D Systems) 및 BV-tagTM(BioVeris Europe, Witney, Oxforfshire, UK) 표지된 항-인간(Fab)'2(Dianova)를 첨가한 뒤 15-30분 동안 반응시켰다. 그리고 난 뒤, M-SERIES?384 분석기(BioVeris Europe)를 사용하여 결합하지 않은 Fab의 농도를 ECL 검출법으로 정량화하였다.
Friguet et al., 1985의 문헌에 따라, 검출하는 동안 유의적인 평형상태가 고체 상으로 이동하는 것을 피하게 하였다.
상기에 기술된 분석 조건을 이용해, Fab에 대한 친화도를 측정하였으며 이는 표 4에 표시되어 있다.
추가로, 표준 EDC-NHS 아민 결합 화학을 이용하여, 10 mM Na-아세테이트 pH4.5에 포함된 약 100 RU의 재조합 인간 GM-CSF(Peprotech)로 코팅되어 있는 F1 칩(Biacore, Sweden) 상에서 동역학 SPR 분석을 수행하였다. 개별량의 HAS를 참조 플로우 셀에 고정시켰다. PBS(136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4 pH7.4)+0.005% Tween 20을 러닝버퍼로 사용하였다. 6.3 - 200 nM 농도로 20 ㎕/분 플로우 속도로 Fab를 적용하였다. 결합 상(association phase)을 60초로 세팅하고, 분해 상(dissociation phase)을 120초(부모) 또는 600초(최적화된 친화도) 로 세팅하였다. 장기간 동안 분해 상을 모니터하기 위해, 다음의 조건에 따라, 기본적으로는 Drade et al., (2004)의 문헌에 따라 수행하였다: Fab를 단일 농도 200 nM로 적용하고; 흐름속도는 100 ㎕/분으로 세팅하고 분해상은 6000-10,000초로 세팅한다. 이러한 분석하에서 평가된 오프-레이트(off-rate)를 기준으로 하여 Fab에 대한 친화 조건이 예측되었고, 이는 표 4에 표시되어 있다.
[표 4]
Biacore 및 용액 평형 역가분석(SET)에 의해 측정된 항-hGM-CSF Fab의 친화도
Figure 112007089750246-pct00006
E. 용액 평형 역가분석(SET)을 이용한 쥐 GM-CSF 에 대한 친화도 측정
쥐 GM-CSF에 대한 친화도 측정은 실질적으로는 실시예 4D에 기술된 방법을 사용하고 인간 GM-CSF 대신에 용액내에 분석물로서 포함된 쥐-GM-CSF(Peprotech)를 이용하여 수행하였다. 친화도는 Haenel et al (2005)의 문헌에 따라 계산하였다. 이 분석에서, 쥐 GM-CSF에 대한 Fab MOR04357의 친화도는 KD=1.0nM로 측정되었다.
실시예 5: GM-CSF 및 GM-CSF 수용체 알파 체인 간의 결합을 저해하는 최적화 항-인간 GM-CSF Fabs의 특징 분석
A. GM-CSF 수용체 알파 결합 분석
GM-CSF 수용체 결합 분석은 바이오티닐화된 GM-CSF 0.5 ㎍/㎖(35nM)을 사용하여 상기에 기술된 바와 같이(실시예 3C) 수행하였다. CHO-GMRa#11 세포에 대한 GM-CSF의 최대 결합(0% 저해)은 항체를 첨가하지 않고, 최종 GM-CSF 농도 0.5 ㎍/㎖로 바이오티닐화된 GM-CSF로 세포를 배양함으로써 측정하였다. GM-CSF 결합의 100% 저해는 분석에서 GM-CSF를 제거함으로써 측정하였다. IC50 값은 GraphPad Prism v3.03 소프트웨어를 적용한 비-선형 감소 커브 피트를 사용하여 용량 의존 커브로부터 평가하였다.
향상된 친화도를 가진 Fabs, 부모 Fabs 및 모노클로날 참조 IgG를 분석하였다. 표 5는 이 방법에서 얻은 IC50 값을 요약한 것이다. 5 ㎍/㎖ 농도의 항체에서 얻은 % 저해도도 표 5에 표시되어 있다.
[표 5]
수용체 저해 분석에서의 항-hGM-CSF Fabs의 IC50 값
Figure 112007089750246-pct00007
* 이 경우 어떠한 S자 모양 용량 반응 곡선도 맞지 않음.
이 분석에서는 친화 성숙으로부터 얻은 Fabs를 정량적으로 보여주며, X-클로닝이 GM-CSF 수용체 알파 체인에 GM-CSF이 결합하는 것을 억제하고, 그로 인해 이의 부모 Fab의 블로킹 메커니즘을 유지함을 보여준다. 이 분석은 FACS에서 유의적인 신호를 얻기 위해 35 nM(0.5 ㎍/㎖) 농도의 바이오티닐화 GM-CSF로 수행할 필요가 있다. 따라서, GM-CSF를 50% 차단하기 위해 이론적으로는 17.5 nM Fab(또는 8.75 nM IgG)가 필요하며, IC50 값을 측정하기 위한 한계가 세팅된다.
B. 인간 GM-CSF를 이용한 항-hGM-CSF Fab에 의한 TF-1의 GM-CSF 의존 증식의 저해
TF-1 증식 분석은 실시예 3B에 기술된 방법대로 수행하였다. 향상된 친화도를 갖는 Fab 및 부모 Fab 뿐만 아니라 모노클로날 참조 IgG를 분석하였다. IC50 값은 GraphPad Prism v3.03 소프트웨어를 적용한 비-선형 감소 커브 피트를 사용하여 용량 의존 커브로부터 평가하였다. 표 6은 이 방법에서 얻은 IC50 값을 요약한 것이다.
[표 6]
TF-1 증식 분석에서의 항-hGM-CSF Fabs 및 대조군 IgGs의 IC50 값
Figure 112007089750246-pct00008
다른 세트 실험에서, TF-1 증식 분석에서의 IC50 값은 부모 Fab MOR03682, 이의 친화도 성숙된 치환체 MOR04283, MOR04297 및 x-클론된 변이체 MOR04342에 대해 측정하였다. 표 7은 이 방법에서 얻은 IC50 값을 요약한 것이다.
[표 7]
TF-1 증식 분석에서의 항-hGM-CSF Fabs의 IC50 값
Figure 112007089750246-pct00009
이 실험에서는 친화 성숙 및 X-클로닝 후에 IC50 값에서 큰 향상이 있음을 보여준다. 예를 들어, MOR04357, MOR04350, MOR04354는 이들의 부모 MOR03929에 비해 >2000배 향상된 IC50 값을 보여주며, BVD2-21C11 및 Mab215의 효능은 초과한다.
실시예 6: MOR04357 의 인간 IgG1 포맷으로의 전환
A. 포유동물 발현 시스템에서 발현하기 위한 Fab DNA 서열의 유전자 최적화
포유동물 유전자 발현용으로(예, 코돈 사용의 변화, GC 함량, 등) MOR04357의 VH 및 VL의 DNA를 최적화하기 위해, 이런 최적화된 VH 및 VL DNA 서열-이는 Geneart(Gegensburg, Germany)에서 유전자 합성되고 055906pPCR-Script 및 055907pPCR-Script를 생산하는 pPCR-Script 벡터로 클로닝됨-을 확인하기 위해 Geneart사의 GeneOptimizerTM 소프트웨어(Regensburg, Germany)를 사용하였다. 서열번호 48은 각각의 VH 서열을 보여주며, 서열버호 57은 각각의 VL 서열을 보여준다.
B. Fab MOR04357의 인간 IgG1 포맷으로의 클로닝 및 IgG1 발현
전장 면역글로불린(Ig)을 발현하기 위해, 최적화된 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 유전자의 변이 도메인 단편을 pPCR-Script 벡터(실시예 5a)로부터 인간 IgG1용 pMORPH®2_h_Ig 벡터 시리즈에 서브클로닝하였다. MOR04357의 코돈-최적화된 VH는 055906pPCR-Script를 NheI/BlpI 절단하여 분리하였으며, 이를 상기와 동일한 제한 효소로 절단한 pMorph2_h_IgG1F 마스터 벡터에 삽입하였다. 이 벡터는 이미 인간 감마 1 고정(constant) 부위를 포함하고 있었다. 이렇게 제조된 발현 플라스미드를 pMorph2_h_IgG1F_MOR04357_co라 명명하였다. MOR04357의 코돈-최적화 VL은 055907pPCR-Script를 NheI/HpaI으로 절단하여 분리하였으며, 이를 상기와 동일한 제한 효소로 절단한 pMorph2_h_Iglambda2 마스터 벡터에 삽입하였다. 이 벡터는 이미 인간 람다 고정 부위를 포함하고 있었다. 이렇게 제조된 발현 플라스미드를 pM2_h_Iglambda2_MOR04357_co라 명명하였다.
C. 인간 IgG 의 일시적 발현 및 정제
진핵세포 HKB11 세포를 동일 농도의 IgG 중쇄 및 경쇄 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 세포 배양 상등액을 감염 후 3 내지 7일에 수득하였다. 상등액의 pH를 8.0으로 맞추고 멸균 여과한 뒤, 이 용액을 표준 단백질 A 친화 크로마토그래피(rProteinA FF 또는 MabSelect SURE, GE Healthcare)에 주입하였다. 1x Dulbecco's PBS(pH 7.2, Invitrogen)로 버퍼를 교환하고 샘플을 멸균 여과(0.2 ㎛)하였다. MOR04357 IgG1은 1x Dulbecco's PBS(pH 6.5, Invitrogen)로 투석하였다. IgG의 정제물을 변성, 환원 조건으로 SDS-PAGE에서 분석하거나, 또는 SEHPLC에 의한 자연 상태에서 Agilent BioAnalyzer를 사용하고 분석하였다.
D. 용액 평형 역가분석(SET)를 이용한 피코몰 농도 친화도의 측정
KD를 측정하기 위해, IgG1의 모노머 분획(분석용 SEC(Superdex75, Amersham Pharmacia)로 분석했을 때 최소 90% 함량의 모노머)을 사용하였다. 용액내에서의 전기화학발광(ECL) 기초 친화도 측정 및 결과 분석은 기본적으로 Haenel et al., 2005에 기술된 방법과 실시예 4B에 기술된 방법으로 수행하였다. 인간 재조합 GM-CSF에 대한 MOR04357 IgG1의 KD 값은 1.1 pM로 측정되었다.
E. 용액 평형 역가분석(SET)를 이용한 쥐 GM-CSF 에 대한 친화도의 측정
쥐 GM-CSF에 대한 친화도 측정은 실질적으로는 실시예 4D의 방법으로 수행하고, 인간 GM-CSF 대신에 용액내에 포함된 분석물로서 쥐-GM-CSF(Peprotech)를 사용하여 수행하였다. Haenel et al (2005)의 문헌에 따라 친화도를 측정하였다. 쥐 재조합 GM-CSF에 대한 MOR04357 IgG1의 KD 값은 130 pM로 측정되었다.
실시예 7: 최적화 항-인간 GM-CSF Fab 로부터 유도된 MOR04357 IgG1 의 특성 분석
A. 인간 및 붉은털 원숭이 GM-CSF 를 이용한, 항- hGM-CSF 에 의한 TF- 1의 GM-CSF 의존성 증식의 저해
TF-1 증식 분석은 실시예 3B에 기재된 바와 같이 수행하였다. MOR04357은 IgG1 포맷에서 분석하였으며, 대조군으로서 모노클로날 참조 IgG를 분석하였다. IC50 값은 GraphPad Prism v3.03 소프트웨어를 적용한 비-선형 감소 커브 피트를 사용하여 용량 의존 커브로부터 평가하였다. 표 8은 이 방법에서 얻은 IC50 값을 요약한 것이다. 3개의 다른 GM-CSF 변이체를 이 분석에 사용하였다: 첫번째로 E.coli에서 생산된 0.25 ng/㎖ 농도의 재조합 인간 GM-CSF, 두번째로, 재조합 인간 GM-CSF를 포함하는 pcDNA-huGM-CSF(참조 실시예 1A)로 일시적 형질전환된 HEK293의 배양 상등액, 세번째로, 재조합 붉은털 원숭이 GM-CSF를 포함하는 pcDNA-macGM-CSF(참조, 실시예 3A)로 일시적 형질전환된 HEK293 세포의 세포 상등액. TF-1 증식 분석을 하기 위해, HEK293 배양 상등액을 관심 GM-CSF 소스로서 사용하였으며, 이는 TF-1 세포가 E.coli에서 생산된 정제된 재조합 인간 GM-CSF의 한정된 농도 0.25 ng/㎖에서의 증식과 비교하여 유사한 증식을 보이는 정도로 희석하여 사용하였다.
[표 8]
TF-1 증식 분석에서의 MOR04357 IgG 및 대조군 IgG의 IC50 값
Figure 112007089750246-pct00010
이 실험에서는 친화 성숙 및 X-클로닝 후에 IC50 값에서 큰 향상이 있으며, 이는 Fab로부터 IgG1 포맷으로 전환되고 난 뒤에 유지됨을 보여준다. MOR04357은 Fab MOR03929에 비해 >2000배 향상된 IC50 값을 보여주며, BVD2-21C11 및 Mab215의 효능을 초과한다.
참조문헌:
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SEQUENCE LISTING <110> MorphoSys AG Steidl, Stefan Thomassen-Wolf, Elisabeth <120> Anti-GM-CSF Antibodies and Uses Therefor <130> N1479 PCT S3 <140> PCT/EP2006/004696 <141> 2006-05-17 <150> US 60/682,009 <151> 2005-05-18 <160> 61 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> Source <223> /note = "Description of artificial sequence: Synthetic construct" <400> 1 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taccttttct tctcattgga tgtcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcaat ggtatctttt ctgatggtag cgctacctat 180 tatgcggata gcgtgaaagg ccgttttacc atttcacgtg ataattcgaa aaacaccctg 240 tatctgcaaa tgaacagcct gcgtgcggaa gatacggccg tgtattattg cgcgcgtttt 300 cagggttatg gtggtggttt tgattattgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360 <210> 2 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> Source <223> /note = "Description of artificial sequence: Synthetic construct" <400> 2 caggtgcaat 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gtttaattaa 1560 aggggggggg gggccggcct gggggggggt gtacatgaaa ttgtaaacgt taatattttg 1620 ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc 1680 ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt 1740 tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc 1800 tatcagggcg atggcccact acgagaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg 1860 tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga 1920 aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg 1980 ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg 2040 ctacagggcg cgtgctagac tagtgtttaa accggaccgg gggggggctt aagtgggctg 2100 caaaacaaaa cggcctcctg tcaggaagcc gcttttatcg ggtagcctca ctgcccgctt 2160 tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc atcagtgaat cggccaacgc gcggggagag 2220 gcggtttgcg tattgggagc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 2280 tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 2340 cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gtcagcggcg ggatataaca 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gggatggtgt tactggttat 180 gctcagaagt ttcagggtcg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtaagttt 300 atttctgatt cttggggcca aggcaccctg gtgacggtta gctca 345 <210> 46 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> Source <223> /note = "Description of artificial sequence: Synthetic construct" <400> 46 caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cacttttaat tcttttctta tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggt atcattccga tttttggcac tgcgaattac 180 gcgcagaagt ttcagggccg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtaagttt 300 atttctgatt cttggggcca aggcaccctg gtgacggtta gctca 345 <210> 47 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> Source <223> /note = "Description of artificial sequence: Synthetic construct" <400> 47 caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cacttttaat tcttttctta tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcgct atttctcctt gggatggtgt tactggttat 180 gctcagaagt ttcagggtcg ggtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtaagttt 300 atttctgatt cttggggcca aggcaccctg gtgacggtta gctca 345 <210> 48 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> Source <223> /note = "Description of artificial sequence: Synthetic construct" <400> 48 caggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctactgga tgaactgggt gaggcaggcc 120 cctggcaagg gcctggagtg ggtgtccggc atcgagaaca agtatgccgg cggagccacc 180 tactacgccg ccagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacaacag caagaacacc 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgtgccagg 300 ggcttcggca ccgatttctg gggccagggc accctggtga cagtcagctc a 351 <210> 49 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> Source <223> /note = 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gcttctaatt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tattctggtt ctcctatgac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa acgtacg 327 <210> 54 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> Source <223> /note = "Description of artificial sequence: Synthetic construct" <400> 54 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gactattaat aattatctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatact gcttctaatt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tattctggtt ctcctatgac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa acgtacg 327 <210> 55 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> Source <223> /note = "Description of artificial sequence: Synthetic construct" <400> 55 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca 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Claims (52)

  1. 서열번호 20으로 표시되는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 부위 및 서열번호 40으로 표시되는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 부위를 포함하는, GM-CSF에 특이적인 분리된 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 작용 단편.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열번호 20으로 표시되는 변이 중쇄(variable heavy chain) 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 작용 단편.
  3. 제 1 항에 있어서,
    서열번호 40으로 표시되는 변이 경쇄(variable light chain) 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 작용 단편.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 20으로 표시되는 변이 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 40으로 표시되는 변이 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 작용 단편.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분리된 작용 단편은 Fab 또는 scFv 항체 단편인, 분리된 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 작용 단편.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분리된 인간 또는 인간화된 항체는 IgG인, 분리된 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 작용 단편.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 항체는 합성 인간 항체인, 분리된 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 작용 단편.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 인간 또는 인간화된 항체 또는 작용 항체 단편을 인코딩하는 분리된 핵산.
  9. 제 8 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  10. 제 9 항에 따른 벡터를 포함하는 분리된 세포.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포는 박테리아인 분리된 세포.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 세포는 진핵세포인 분리된 세포.
  13. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 작용 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 이의 부형제를 포함하는, GM-CSF와 관련된 염증성 질환 치료용 약학적 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론씨 병, 건선, 천식, 아토피 피부염 및 쇼크로부터 선택되는 약학적 조성물.
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