ES2918209T3 - Anticuerpos anti-GM-CSF y usos a partir de los mismos - Google Patents

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Abstract

La presente invención proporciona regiones de unión a antígeno recombinantes, anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos que son específicos para GM-CSF, lo que juega un papel integral en varios trastornos o condiciones. Estos anticuerpos, en consecuencia, pueden usarse para tratar, por ejemplo, enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide. Los anticuerpos de la invención también pueden usarse en el campo de diagnóstico, así como para investigar más a fondo el papel de GM-CSF en la progresión de varios trastornos. La invención también proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos anteriores, vectores que contienen las mismas composiciones farmacéuticas y kits con instrucciones de uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-GM-CSF y usos a partir de los mismos
Antecedentes de la invención
El factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, GM-CSF, se identificó originalmente como un factor de crecimiento hemopoyético. Se produce por varios tipos de células incluyendo linfocitos, monocitos, células endoteliales, fibroblastos y algunas células malignas (Metcalf et al., 1986; Clark y Kamen, 1987; Hart et al., 1988; Metcalf et al., 1986). Además de tener una función de estimulación del crecimiento y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas, también se descubrió que GM-CSF tiene una diversidad de efectos sobre las células del sistema inmunitario que expresan el receptor GM-CSF (para una revisión, véase: Hamilton, 2002; de Groot et al., 1998). La más importante de estas funciones es la activación de los monocitos, macrófagos y granulocitos en varios procesos inmunitarios e inflamatorios (Gasson et al., 1990b; Gasson et al., 1990a; Hart et al., 1988; Rapoport et al., 1992).
El GM-CSF maduro es una proteína monomérica de 127 aminoácidos con dos sitios de glucosilación. El grado variable de glucosilación da como resultado un intervalo de peso molecular entre 14 kDa y 35 kDa. El GM-CSF no glucosilado y glucosilado muestra una actividad similar in vitro (Cebon et al., 1990). El análisis cristalográfico de GM-CSF reveló una estructura en forma de barril compuesta por cuatro hélices alfa cortas (Diederichs et al., 1991). El plegamiento general es similar a otros factores de crecimiento como la hormona del crecimiento, interleucina-2 e interleucina-4.
GM-CSF ejerce su actividad biológica al unirse a su receptor (Kastelein y Shanafelt, 1993; Sisson y Dinarello, 1988). Los sitios más importantes de expresión del receptor GM-CSF (GM-CSF-R) están en la superficie celular de las células mieloides y las células endoteliales, mientras que los linfocitos son GM-CSF-R negativos. El receptor nativo está compuesto por al menos dos subunidades, alfa y beta. La subunidad alfa imparte especificidad de ligando y se une a GM-CSF con afinidad nanomolar (Gearing et al., 1989; Gasson et al., 1986). La subunidad beta también es parte de los complejos receptores de interleucina-3 e interleucina-5 y, en asociación con la subunidad alfa del receptor GM-CSF y GM-CSF, conduce a la formación de un complejo con afinidad de unión picomolar (Hayashida et al., 1990). Se han mapeado los dominios de unión en GM-CSF para el receptor: GM-CSF interactúa con la subunidad beta de su receptor a través de una región muy restringida en la primera hélice alfa de GM-CSF (Shanafelt et al., 1991b; Shanafelt et al., 1991a; Lopez et al., 1991). La unión a la subunidad alfa podría mapearse a la tercera hélice alfa, la hélice C, los restos iniciales del bucle que une las hélices C y D y la cola carboxiterminal de GM-CSF (Brown et al., 1994).
La formación del complejo receptor trimérico GM-CSF conduce a la activación de cascadas de señalización complejas que implican moléculas de las familias JAK/STAT, Shc, Ras, Raf, las MAP quinasas, fosfatidilinositol-3-quinasa y NFkB, conduciendo finalmente a la transcripción de c-myc, c-fos y c-jun. La activación se induce principalmente por la subunidad beta del receptor (Hayashida et al., 1990; Kitamura et al., 1991; Sato et al., 1993). La subunidad beta compartida también es responsable de las funciones superpuestas ejercidas por IL-3, IL-5 y GM-CSF (para revisión véase: de Groot et al., 1998).
Aparte de su actividad estimulante del crecimiento y la diferenciación hematopoyética, GM-CSF funciona especialmente como una citocina proinflamatoria. Los macrófagos y monocitos, así como los neutrófilos y los eosinófilos, son activados por GM-CSF, dando como resultado la liberación de otras citocinas y quimiocinas, proteasas que degradan la matriz, expresión de HLA aumentada y expresión aumentada de moléculas de adhesión celular o receptores para quimiocinas CC. Lo último, a su vez, conduce a una mayor quimiotaxis de las células inflamatorias en el tejido inflamado (Chantry et al., 1990; Hamilton, 2002; Sisson y Dinarello, 1988; Zhang et al., 1998; Hamilton et al., 1993; Lopez et al., 1986; Cheng et al., 2001; Gomez-Cambronero et al., 2003). A menudo, GM-CSF ejerce su actividad en sinergia con otros factores estimulantes de la inflamación como otras citocinas o LPS, por ejemplo, neutrófilos tratados con GM-CSF en combinación con, por ejemplo, el LPS mostrará un aumento en el estallido oxidativo (Kaufman et al., 1989; Rapoport et al., 1992).
GM-CSF como diana para la terapia antiinflamatoria:
Debido a sus diversas funciones activadoras del sistema inmunitario, GM-CSF puede considerarse una diana para la terapia antiinflamatoria. Las enfermedades inflamatorias crónicas y agudas como la artritis reumatoide (AR), esclerosis múltiple (EM), enfermedad de Crohn, psoriasis, asma, dermatitis atópica o choque pueden beneficiarse del bloqueo de la actividad de GM-CSF y la posterior reducción de las actividades dañinas de las células sensibles a GM-CSF (Hamilton, 1993; Zhang et al., 1998; Hamilton, 2002).
Artritis:
Varios grupos demostraron que GM-CSF, así como su receptor, están presentes en la articulación sinovial de los pacientes con artritis (Alvaro
Gracia et al., 1991; Xu et al., 1989; Haworth et al., 1991). Adicionalmente, Se demostró que GM-CSF provoca brotes de artritis reumatoide en pacientes tratados con GM-CSF por neutropenia en el síndrome de Felty (Hazenberg et al., 1989) o después de quimioterapia (de Vries et al., 1991).
Los primeros indicios sobre la utilidad de los anticuerpos que bloquean GM-CSF para el tratamiento de la artritis provienen de estudios de ratones in vivo (Campbell et al., 1997; Campbell et al., 1998; Cook et al., 2001). Específicamente, Cook et al. mostró que los anticuerpos neutralizantes contra GM-CSF mostraron efectividad en un modelo de artritis inducida por colágeno. El bloqueo de GM-CSF condujo a una reducción de la gravedad de la enfermedad relacionada con la inflamación, la destrucción del cartílago y la progresión de la enfermedad en las extremidades inicialmente afectadas o progresión a otras extremidades.
Hay varios efectos de una terapia anti-GM-CSF de los que podrían beneficiarse los pacientes con artritis reumatoide o con otras enfermedades inflamatorias.
Se espera que el bloqueo de GM-CSF inhiba o reduzca:
a) la activación y el número de monocitos, macrófagos y neutrófilos maduros. Especialmente los neutrófilos y los macrófagos son abundantes en el líquido sinovial y la membrana. Se ha demostrado que el número de macrófagos en la membrana sinovial se correlaciona con el grado de erosión en las articulaciones de la AR (Mulherin et al., 1996; Burmester et al., 1997). Los macrófagos son la fuente de una diversidad de otras citocinas proinflamatorias y proteasas que degradan la matriz. La producción de H2O2 por los neutrófilos es parte de los procesos destructivos que tienen lugar en las articulaciones artríticas (Babior, 2000).
b) la diferenciación de las células dendríticas (DC) mieloides y la activación de las DC sinoviales (= sinoviocitos). GM-CSF regula positivamente y mantiene la expresión de HLA clase II en DC y sinoviocitos de RA (Alvaro-Gracia JM et al., 1991). Las DC reciben instrucciones dentro de la articulación para que adquieran funciones asociadas con la activación selectiva de las células T inflamatorias. Los alelos HLA-DR específicos se han relacionado con la susceptibilidad a la AR y la activación de las células T a través de la presentación de antígenos de las DC puede desempeñar un papel crucial en este tipo de enfermedad inmunitaria (Santiago-Schwarz et al., 2001).
Esclerosis múltiple:
En la esclerosis múltiple, los niveles elevados de GM-CSF se correlacionan con la fase activa de la EM (Carrieri et al., 1998; McQualter et al., 2001) y los ratones GM-CSF-/- no desarrollan la enfermedad en el sistema modelo para la EM, encefalomielitis experimental, EAE (McQualter et al., 2001).
Asma:
En el asma, se han informado cantidades aumentadas de GM-CSF en el pulmón (Broide y Firestein, 1991). Al mismo tiempo, los eosinófilos están elevados, sobre los que el GM-CSF en sinergia con la interleucina-5 actúa de tres formas: i) estimula la diferenciación de células progenitoras a eosinófilos, ii) estimula su activación funcional y iii) prolonga la supervivencia de los eosinófilos en el pulmón (Broide et al., 1992; Yamashita et al., 2002). Por lo tanto, es probable que la reducción de la supervivencia de los eosinófilos en las vías respiratorias de los asmáticos mediante el bloqueo de GM-CSF mejore la enfermedad. La utilidad de los anticuerpos neutralizantes anti-GM-CSF se demostró además en un modelo para el asma murino donde la administración de tales anticuerpos condujo a una reducción significativa de la hiperreactividad de las vías respiratorias y la inflamación de las vías respiratorias (Yamashita et al., 2002).
En un modelo de ratón diferente, La inflamación del pulmón dependiente de LPS podría reducirse mediante la aplicación del anticuerpo anti-GM-CSF 22E9 en el ratón (Bozinovski et al., 2003).
Efectos tóxicos:
Los ratones homocigotos para un gen alterado del factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) se desarrollan normalmente y no muestran perturbaciones importantes de la hematopoyesis hasta las 12 semanas de edad. Mientras que la mayoría de los ratones deficientes en GM-CSF son superficialmente sanos y fértiles, todos desarrollan una matriz extracelular vascular desorganizada con haces de colágeno interrumpidos y reducidos y pulmones anormales con eliminación alterada del tensioactivo pulmonar y resistencia reducida a patógenos microbianos en el pulmón. Las características de esta última patología se asemejan al trastorno humano proteinosis alveolar pulmonar (PAP). El GM-CSF no parece ser esencial para el mantenimiento de los niveles normales de los principales tipos de células hematopoyéticas maduras y sus precursores en la sangre, médula y bazo. Sin embargo, implican que el GM-CSF es esencial para el desarrollo vascular normal, la fisiología pulmonar y la resistencia a la infección local (Stanley et al., 1994; Dranoff et al., 1994; Plenz et al., 2003; Shibata et al., 2001). Recientemente, una fuerte asociación de autoanticuerpos contra GM-CSF con PAP ha implicado además anomalías de señalización de GM-CSF en la patogenia de PAP en humanos. En conjunto, estas observaciones demuestran que GM-CSF tiene un papel crítico en la regulación de la homeostasis del tensioactivo y las funciones inmunitarias innatas de los macrófagos alveolares en el pulmón (Bonfield et al., 2002; Trapnell y Whitsett, 2002; Uchida et al., 2004; Kitamura et al., 1999).
Se han descrito títulos elevados de autoanticuerpos con actividad bloqueante frente a GM-CSF en pacientes con miastenia grave. Estos pacientes no mostraron ningún otro fenómeno autoinmunitario o deficiencias hemopoyéticas u "otros correlatos clínicos obvios" (Meager et al., 1999).
El compuesto E21R, una forma modificada de GM-CSF que antagoniza la función de GM-CSF, se había evaluado en un ensayo de seguridad de fase I y se descubrió que tenía un buen perfil de seguridad en pacientes con cáncer (Olver et al., 2002).
Por lo tanto, además de la función pulmonar, que debe monitorizarse de cerca, no se esperan otros efectos secundarios cuando se aplica una terapia anti-GM-CSF.
Hasta ahora, solo se han generado anticuerpos derivados de especies no humanas con función neutralizante de GM-CSF. Por ejemplo, el documento EP 0499161 A1 describe un anticuerpo generado por la inmunización de ratones con oligopéptidos, cuya secuencia deriva de un GM-CSF. Adicionalmente, la solicitud desvela un método para aliviar en un mamífero que lo necesita un efecto indeseable de GM-CSF, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad inhibidora de GM-CSF de una inmunoglobulina. Sin embargo, ese anticuerpo es un anticuerpo murino, haciéndolo inadecuado para la administración humana.
Adicionalmente, el documento WO 03/068920 describe un anticuerpo IgG1 quimérico de ratón/humano, denominado en el mismo quimérico 19/2, que se informa que demuestra la actividad neutralizante del crecimiento celular estimulado por GM-CSF. Es probable que los anticuerpos que contienen secuencias no humanas provoquen una respuesta inmunitaria en el paciente humano y no sean apropiados para la administración terapéutica. Por ejemplo, en enfermedades que requieren un tratamiento a largo plazo (por ejemplo, enfermedades inflamatorias crónicas como la artritis reumatoide, asma y esclerosis múltiple), la administración continua de un agente terapéutico no humano aumenta la probabilidad de una reacción inflamatoria grave y la producción de anticuerpos humanos que pueden neutralizar el agente terapéutico.
De manera correspondiente, a la luz del gran potencial de la terapia con anticuerpos anti-GM-CSF, existe una gran necesidad de anticuerpos anti-GM-CSF humanos con alta afinidad que bloqueen eficazmente la interacción GM-CSF/receptor GM-CSF. Adicionalmente, sería ventajoso tener uno o más anticuerpos que puedan reaccionar de forma cruzada con GM-CSF de una o más especies no humanas para probar su efectividad en modelos animales in vivo.
La presente invención satisface estas y otras necesidades proporcionando anticuerpos completamente anti-GM-CSF altamente eficaces, que se describen a continuación.
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
Sumario de la invención
Es un objeto de la invención proporcionar anticuerpos humanos que puedan bloquear eficazmente la interacción del receptor GM-CSF/GM-CSF. La invención proporciona un anticuerpo IgG 1 humano aislado que comprende una región de unión a antígeno que es específica para GM-CSF que comprende
(i) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 20; y
(ii) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable correspondiente a SEQ ID NO: 40.
Es otro objeto de la invención proporcionar anticuerpos que sean seguros para la administración humana.
Las composiciones de la invención pueden usarse para aplicaciones terapéuticas o profilácticas. La invención, por lo tanto, proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo IgG1 humano que comprende una región de unión a antígeno que es específica para GM-CSF que comprende
(i) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 20; y
(ii) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable correspondiente a SEQ ID NO: 40 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para la misma.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo IgG1 humano aislado que comprende una región de unión a antígeno que es específica para GM-CSF que comprende
(i) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 20; y
(ii) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable correspondiente a SEQ ID NO: 40 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para la misma, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo IgG1 humano aislado que comprende una región de unión a antígeno que es específica para GM-CSF que comprende
(i) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 20; y
(ii) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable correspondiente a SEQ ID NO: 40,
para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.
En una realización, la enfermedad inflamatoria se toma de la lista de artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, psoriasis, asma, dermatitis atópica y choque. En otra realización, la enfermedad inflamatoria es artritis reumatoide.
Los anticuerpos humanos de la presente invención pueden tener reactividad cruzada con GM-CSF de rata y/o rhesus (macaco), como se determina por la titulación de equilibrio de la solución (SET) y/o el ensayo de proliferación de TF1.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1a proporciona secuencias de ácido nucleico de diversas regiones de cadena pesada variable de anticuerpo novedosas.
La Figura 1b proporciona secuencias de aminoácidos de diversas regiones de cadena pesada variable de anticuerpo novedosas. Las regiones CDR HCDR1, HCDR2 y HCDR3 se designan desde el extremo N hasta el extremo C en negrita.
La Figura 2a proporciona secuencias de ácido nucleico de diversas regiones de cadena ligera variable de anticuerpo novedosas.
La Figura 2b proporciona secuencias de aminoácidos de diversas regiones de cadena ligera variable de anticuerpo novedosas. Las regiones CDR LCDR1, LCDR2 y LCDR3 se designan desde el extremo N hasta el extremo C en negrita.
La Figura 3 proporciona secuencias de aminoácidos de regiones variables de cadena pesada de secuencias génicas maestras de anticuerpo HuCAL® basadas en el consenso. Las regiones CDR HCDR1, HCDR2 y HCDR3 se designan desde el extremo N hasta el extremo C en negrita.
La Figura 4 proporciona secuencias de aminoácidos de regiones variables de cadena ligera de secuencias génicas maestras de anticuerpo HuCAL® basadas en el consenso. Las regiones CDR LCDR1, LCDR2 y LCDR3 se designan desde el extremo N hasta el extremo C en negrita.
La Figura 5 proporciona un ejemplo de una secuencia de ADN del vector de expresión pMORPH®X9_MOR03929_FH (SEQ ID NO: 43).
La Figura 6 proporciona el nivel de expresión del receptor alfa de GM-CSF, como se determina por análisis FACS usando el anticuerpo MAB1006 específico del receptor alfa de GM-CSF. Se muestra CHO-GMRa#11 (línea continua) en comparación con CHO-K1 (línea discontinua). El eje x representa el valor relativo de fluorescencia (RFL), medido en canal FL2; el eje y representa el recuento de células.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en el descubrimiento de novedosos anticuerpos que son específicos o tienen una alta afinidad por GM-CSF y poseen una o más propiedades novedosas. Preferentemente, un anticuerpo de la invención puede proporcionar un beneficio terapéutico a un sujeto. Los anticuerpos de la invención, que son humanos, pueden usarse en muchos contextos, que se describen más completamente en el presente documento.
Un anticuerpo "humano" o un fragmento de anticuerpo humano funcional se define de esta manera como uno que no es quimérico (por ejemplo, no "humanizado") y no procede (en su totalidad o en parte) de una especie no humana. Un anticuerpo humano o un fragmento de anticuerpo funcional puede derivar de un ser humano o puede ser un anticuerpo humano sintético. Un "anticuerpo humano sintético" se define en el presente documento como un anticuerpo que tiene una secuencia derivada, en su totalidad o en parte, por ordenador de secuencias sintéticas que se basan en el análisis de secuencias conocidas de anticuerpos humanos. El diseño por ordenador de una secuencia de anticuerpo humano o fragmento del mismo puede lograrse, por ejemplo, analizando una base de datos de secuencias de un anticuerpo humano o fragmentos de anticuerpo y concibiendo una secuencia de polipéptidos utilizando los datos obtenidos de la misma. Otro ejemplo de un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo funcional es uno que está codificado por un ácido nucleico aislado de una biblioteca de secuencias de anticuerpos de origen humano (es decir, estando basada dicha biblioteca en anticuerpos tomados de una fuente natural humana).
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo "se une específicamente a", es "específico para/para" o "reconoce específicamente" un antígeno (aquí, GM-CSF) si dicho anticuerpo es capaz de discriminar entre dicho antígeno y uno o más antígeno o antígenos de referencia, ya que la especificidad de unión no es una propiedad absoluta, sino relativa. En su forma más general (y cuando no se menciona ninguna referencia definida), "unión específica" se refiere a la capacidad del anticuerpo para discriminar entre el antígeno de interés y un antígeno no relacionado, como se determina, por ejemplo, de acuerdo con uno de los siguientes métodos. Dichos métodos comprenden, pero no se limitan a transferencia Western, pruebas ELISA, RIA, ECL, IRMA y exploraciones de péptidos. Por ejemplo, puede llevarse a cabo un ensayo ELISA convencional. La puntuación puede llevarse a cabo mediante desarrollo de color convencional (por ejemplo, anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano picante y tetrametil bencidina con peróxido de hidrógeno). La reacción en determinados pocillos se puntúa por la densidad óptica, por ejemplo, a 450 nm. El fondo típico (=reacción negativa) puede ser de 0,1 DO; la reacción positiva típica puede ser de I DO. Esto significa que la diferencia positiva/negativa puede ser de más de 10 veces. Normalmente, la determinación de la especificidad de unión se realiza usando no solo un único antígeno de referencia, sino un conjunto de entre tres y cinco antígenos no relacionados, tales como leche en polvo, BSA, transferrina o similares.
Sin embargo, "unión específica" también puede referirse a la capacidad de un anticuerpo para discriminar entre el antígeno diana y uno o más antígenos estrechamente relacionados, que se usan como puntos de referencia, por ejemplo, entre GM-CSF e IL3, IL5, IL-4, IL13 o M-CSF. Adicionalmente, "unión específica" puede referirse a la capacidad de un anticuerpo para discriminar entre diferentes partes de su antígeno diana, por ejemplo, diferentes dominios o regiones de GM-CSF, o entre uno o más restos de aminoácidos clave o tramos de restos de aminoácidos de GM-CSF.
También, como se usa en el presente documento, una "inmunoglobulina" (Ig) se define de esta manera como una proteína que pertenece a la clase IgG, IgM, IgE, IgA o IgD (o cualquier subclase de las mismas) e incluye todos los anticuerpos y fragmentos de los mismos conocidos convencionalmente. Un "fragmento funcional" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define de esta manera como un fragmento de un anticuerpo/inmunoglobulina (por ejemplo, una región variable de una IgG) que retiene la región de unión al antígeno. Una "región de unión al antígeno" de un anticuerpo se encuentra normalmente en una o más región o regiones hipervariables de un anticuerpo, es decir, las regiones CDR-1, 2 y/o 3; sin embargo, las regiones "marco" variables también pueden desempeñar un papel importante en la unión de antígeno, tal como proporcionando un andamio para las CDR. Preferentemente, la "región de unión a antígeno" comprende al menos los restos de aminoácidos 4 a 103 de la cadena ligera variable (VL) y 5 a 109 de la cadena pesada variable (VH), más preferentemente los restos de aminoácidos 3 a 107 de VL y 4 a 111 de VH y se prefieren particularmente las cadenas VL y VH completas (posiciones de aminoácidos 1 a 109 de VL y 1 a 113 de VH; numeración de acuerdo con el documento WO 97/08320). Los "fragmentos funcionales" incluyen el dominio de un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, scFv o construcciones que comprenden dominios variables de inmunoglobulina individuales o polipéptidos de anticuerpos de dominio único, por ejemplo, dominios variables de la cadena pesada única o dominios variables de la cadena ligera única. El F(ab')2 o Fab puede modificarse por ingeniería genética para minimizar o eliminar por completo las interacciones intermoleculares de disulfuro que existen entre los dominios Ch1 y Cl.
Un anticuerpo de la invención puede derivar de una biblioteca de anticuerpos recombinantes que se basa en secuencias de aminoácidos que se han diseñado por ordenador y codificado por ácidos nucleicos que se crean sintéticamente. El diseño por ordenador de una secuencia de anticuerpo se logra, por ejemplo, analizando una base de datos de secuencias humanas y concibiendo una secuencia de polipéptidos utilizando los datos obtenidos de la misma. Los métodos para diseñar y obtener las secuencias creadas por ordenador se describen, por ejemplo, en Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67; y en la Patente de Ee .UU. N.° 6.300.064 concedida a Knappik et al.
Anticuerpos
A lo largo de este documento, se hace referencia a los siguientes anticuerpos: "n.° de anticuerpo" o "MOR" 03684, 04251, 03929, 04252, 04287, 04290, 04302, 04350, 04354, 04357, 03682, 04283, 04297 y 04342. MOR03684 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 1 (ADN)/SEQ ID NO: I I (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ ID NO: 21 (ADN)/SEQ ID NO: 31 (proteína). MOR04251 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 2 (ADN)/SEQ ID NO: 12 (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ ID No : 22 (ADN)/SEQ ID NO: 32 (proteína). MOR03929 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 3 (ADN)/SEQ ID NO: 13 (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ ID nO: 23 (ADN)/SEQ ID NO: 33 (proteína). MOR04252 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 4 (ADN)/SEQ ID NO: 14 (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ ID n O: 24 (ADN)/SEQ ID NO: 34 (proteína). MOR04287 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 5 (ADN)/SEQ ID NO: 15 (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ ID n O: 25 (ADN)/SEQ ID NO: 35 (proteína). MOR04290 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 6 (ADN)/SEQ ID NO: 16 (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ ID NO: 26 (ADN)/SEQ ID NO: 36 (proteína). MOR04302 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 7 (ADN)/SEQ ID NO: 17 (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ ID NO: 27 (ADN)/SEQ ID NO: 37 (proteína). MOR04350 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 8 (ADN)/SEQ ID NO: 18 (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ ID NO: 28 (ADN)/SEQ ID NO: 38 (proteína). MOR04354 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 9 (ADN)/SEQ ID NO: 19 (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ ID NO: 29 (ADN)/SEQ ID NO: 39 (proteína). MOR04357 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 10 o 48 (ADN)/SEQ ID NO: 20 (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ ID NO: 30 o 57 (ADN)/SEQ ID NO: 40 (proteína). MOR03682 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 44 (ADN)/SEQ ID NO: 49 (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ ID NO: 53 (ADN)/SEQ ID NO: 58 (proteína). MOR04283 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 45 (ADN)/SEQ ID NO: 50 (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ iD NO: 54 (ADN)/SEQ ID NO: 59 (proteína). MOR04297 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 46 (ADN)/SEQ ID NO: 51 (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ ID NO: 55 (ADN)/SEQ ID nO: 60 (proteína). MOR04342 representa un anticuerpo que tiene una región pesada variable correspondiente a SEQ ID NO: 47 (ADN)/SEQ ID NO: 52 (proteína) y una región ligera variable correspondiente a SEQ ID NO: 56 (ADN)/SEQ ID NO: 61 (proteína).
En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que tienen una región de unión a antígeno que puede unirse específicamente o tiene una alta afinidad por GM-CSF. Se dice que un anticuerpo tiene una "alta afinidad" por un antígeno si la medida de la afinidad es de al menos 100 nM (afinidad monovalente del fragmento Fab). Un anticuerpo inventivo o una región de unión a antígeno preferentemente puede unirse a GM-CSF con una afinidad de aproximadamente menos de 100 nM, más preferentemente menos de aproximadamente 60 nM y, lo más preferentemente, menos de aproximadamente 30 nM. Se prefieren además los anticuerpos que se unen a GM-CSF con una afinidad de menos de aproximadamente 10 nM y más preferentemente menos de aproximadamente 3 nM. Por ejemplo, la afinidad de un anticuerpo de la invención contra GM-CSF puede ser de aproximadamente 10,0 nM o 1 pM (afinidad monovalente del fragmento Fab).
La Tabla 1 proporciona un resumen de las afinidades de los anticuerpos representativos, como se determina por resonancia de plasmón superficial (Biacore) y análisis de titulación de equilibrio de solución (SET):
Afinidades de los anticuerpos
Tabla 1:
Biacore SET
MOR0 K d (pM) K K d (pM)
3684 6420 16000
4251 70 7,4
3929 4260 2000
4302 174 63,5
4287 nd 17,9
4252 55 6
4290 122 11,1
4350 19 1,1
4354 21 2,8
4357 7 0,4
3682 nd 11406
4283 nd 113
4297 nd 49,2
4342 nd 4,9
"nd": no determinado
Con referencia a la Tabla 1, la afinidad de MOR03684, 04251,03929, 04252, 04357, 04290, 04302, 04350 y 04354 se midió mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore) en GM-CSF recombinante inmovilizado. El formato Fab de MOR03684, 04251, 03929, 04252, 04357, 04290, 04302, 04350 y 04354 exhibe un intervalo de afinidad monovalente entre aproximadamente 6420 y 7 pM.
El formato Fab también se usó para la determinación de las afinidades por titulación de equilibrio de solución (SET). La columna de la derecha de la Tabla 1 indica la fuerza de unión de entre aproximadamente 16000 y 0,4 pM de los MOR en este método.
Un anticuerpo de la invención es preferentemente una especie de reacción cruzada con humanos y al menos otra especie, que puede ser una especie de roedor o un primate no humano. El primate no humano puede ser macaco. La especie de roedor puede ser rata. Un anticuerpo que presenta reactividad cruzada con al menos una especie de roedor, por ejemplo, puede proporcionar una mayor flexibilidad y beneficios sobre los anticuerpos anti-GM-CSF conocidos, con los fines de realizar estudios in vivo en múltiples especies con el mismo anticuerpo.
Preferentemente, un anticuerpo de la invención no solo es capaz de unirse a GM-CSF, sino que también es capaz de bloquear la interacción de GM-CSF humano con la cadena alfa del receptor de GM-CSF humano expresado en células CHO-K1 en al menos un 25 %, preferentemente en al menos un 50 %, más preferentemente en al menos un 60 %, más preferentemente en al menos un 70 %, más preferentemente en al menos un 85 % y lo más preferentemente en al menos un 100 %. En una realización preferida, un anticuerpo de la invención es capaz de bloquear la interacción de 0,5 mg/ml de GM-CSF humano con la cadena alfa del receptor de GM-CSF humano expresado en aproximadamente 23105 células CHO-K1 en al menos un 50 % en las siguientes condiciones: la concentración de la cadena alfa del receptor GM-CSF humano expresada en las células CHO-K1 es similar a la concentración de la cadena alfa del receptor GM-CSF humano expresada en aproximadamente 23105 células CHO-GMRa#11 y la concentración del anticuerpo de la invención es de aproximadamente 5 mg/ml.
En este sentido, el trabajador experto puede obtener células CHO-K1 que expresan el receptor alfa de GM-CSF humano a una concentración similar a la que se expresa en aproximadamente 23105 células CHO-GMRa#11, por ejemplo, mediante la transfección de una población de células CHO-K1 con un vector de expresión adecuado que codifica el receptor alfa de GM-CSF para generar diferentes líneas celulares estables que expresan niveles definidos del receptor alfa de GM-CSF; entonces, las líneas celulares estables se analizan en análisis FACS para determinar los niveles de expresión del receptor alfa de GM-CSF de acuerdo con el protocolo esencialmente como se describe en el Ejemplo 3C; una línea celular que expresa el receptor alfa de GM-CSf humano a una concentración similar a la que se expresa en aproximadamente 23105 células CHO-GMRa#11 se identifican comparando el valor medio de fluorescencia (MFL) de dichas células transfectadas con el valor de MFL establecido en el Ejemplo 3C. Como se usa en el presente documento, una línea celular se define como la expresión del receptor alfa de GM-CSF en una concentración "similar" a la que se expresa en aproximadamente 23105 células CHO-GMRa#11" si el valor MFL de la línea celular transfectada no se desvía en más de un factor doble del valor MFL para la célula CHO-GMRa#11 como se establece en el Ejemplo 3C.
Adicionalmente, un anticuerpo de la invención es capaz de neutralizar el GM-CSF humano en un ensayo de proliferación de TF-1 con un valor de CI50 más bajo que el anticuerpo de referencia BVD2-21C11 y/o MAB215, preferentemente un valor de CI50 al menos cinco veces menor, más preferentemente con un valor de CI50 al menos 10 veces menor que el anticuerpo de referencia BVD2-21C11 y/o MAB215, más preferentemente con un valor de CI50 al menos 15 veces menor que el anticuerpo de referencia BVD2-21C11 y/o MAB215, más preferentemente con un valor de CI50 al menos 20 veces menor que el anticuerpo de referencia BVD2-21C11 y/o MAB215, más preferentemente con un valor de CI50 al menos 30 veces menor que el anticuerpo de referencia BVD2-21C11 y/o MAB215, más preferentemente con un valor de CI50 al menos 50 veces menor que el anticuerpo de referencia BVD2-21C11 y/o MAB215, más preferentemente con un valor de CI50 al menos 100 veces menor que el anticuerpo de referencia BVD2-21C11 y/o MAB215 y lo más preferentemente con un valor de CI50 al menos 120 veces menor que el anticuerpo de referencia BVD2-21C11 y/o m Ab 215.
Moléculas de ADN
En el presente documento se describen moléculas de ADN que codifican un anticuerpo de la invención. Estas secuencias incluyen, pero no se limitan a, aquellas moléculas de ADN expuestas en las Figuras 1a y 2a.
El trabajador calificado reconocerá que el ADN puede usarse para identificar su complemento y, ya que el ADN es bicatenario, su equivalente u homólogo, usando técnicas de hibridación de ácidos nucleicos. También se reconocerá que la hibridación puede producirse con menos del 100 % de complementariedad. Sin embargo, dada la elección adecuada de las condiciones, pueden usarse técnicas de hibridación para diferenciar entre secuencias de ADN basándose en su relación estructural con una sonda particular. Para obtener orientación sobre tales condiciones, véanse, Sambrook et al., 1989 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EE.UU.) y Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. Nueva York: John Wiley and Sons).
La similitud estructural entre dos secuencias de polinucleótidos puede expresarse como una función de "rigurosidad" de las condiciones bajo las cuales las dos secuencias se hibridarán entre sí. Como se usa en el presente documento, el término "rigurosidad" se refiere al grado en que las condiciones desfavorecen la hibridación. Las condiciones estrictas desfavorecen fuertemente la hibridación y solo las moléculas más estructuralmente relacionadas se hibridan entre sí en tales condiciones. Por el contrario, las condiciones no estrictas favorecen la hibridación de moléculas que muestran un menor grado de relación estructural. La rigurosidad de hibridación, por lo tanto, se correlaciona directamente con las relaciones estructurales de dos secuencias de ácido nucleico. Las siguientes relaciones son útiles para correlacionar la hibridación y la relación (donde Tm es la temperatura de fusión de un dúplex de ácido nucleico):
a.
Tm = 69,3 0,41 (G+C) %
b. La Tm de un dúplex de ADN disminuye en 1 °C con cada aumento del 1 % en el número de pares de bases emparejadas de forma errónea.
c.
(Tm)|j2" (Tm)|ji = 18,5 Iogi0|a2/|u1
donde q1 y q2 son las fuerzas iónicas de dos soluciones.
La rigurosidad de la hibridación es una función de muchos factores, incluyendo la concentración total de ADN, la fuerza iónica, la temperatura, el tamaño de la sonda y la presencia de agentes que interrumpen los enlaces de hidrógeno. Los factores que promueven la hibridación incluyen altas concentraciones de ADN, altas fuerzas iónicas, temperaturas bajas, tamaño de sonda más largo y la ausencia de agentes que interrumpen los enlaces de hidrógeno. La hibridación normalmente se realiza en dos fases: la fase de "unión" y la fase de "lavado".
En primer lugar, en la fase de unión, la sonda se une a la diana en condiciones que favorecen la hibridación. La rigurosidad generalmente se controla en esta etapa alterando la temperatura. Para alta rigurosidad, la temperatura está habitualmente entre 65 °C y 70 °C, a menos que se usen sondas de oligonucleótidos cortas (< 20 nt). Una solución de hibridación representativa comprende 6X SSC, SDS al 0,5 %, solución de Denhardt 5X y 100 mg de ADN vehículo no específico. Véase Ausubel et al., sección 2.9, suplemento 27 (1994). Por supuesto, se conocen muchas condiciones tamponantes diferentes, aunque funcionalmente equivalente. Cuando el grado de parentesco es menor, puede elegirse una temperatura más baja. Las temperaturas de unión de baja rigurosidad están entre aproximadamente 25 °C y 40 °C. La rigurosidad media es entre al menos aproximadamente 40 °C y menos de aproximadamente 65 °C. La alta rigurosidad es de al menos aproximadamente 65 °C.
Segundo, el exceso de sonda se retira mediante lavado. Es en esta fase cuando normalmente se aplican condiciones más rigurosas. Por lo tanto, es esta fase de "lavado" la más importante para determinar la relación a través de la hibridación. Las soluciones de lavado suelen contener concentraciones de sal más bajas. Una solución ilustrativa de rigurosidad media contiene 2X SSC y SDS al 0,1 %. Una solución de lavado de alta rigurosidad contiene el equivalente (en fuerza iónica) de menos de aproximadamente 0,2X SSC, con una solución astringente preferida que contiene aproximadamente 0,1X SSC. Las temperaturas asociadas a diversas varias rigurosidades son las mismas que se analizaron anteriormente para "unión". La solución de lavado también se reemplaza normalmente varias veces durante el lavado. Por ejemplo, las condiciones típicas de lavado de alta rigurosidad comprenden lavar dos veces durante 30 minutos a 55 °C y tres veces durante 15 minutos a 60 °C.
Variantes funcionalmente equivalentes
Se reconoce que las variantes de las moléculas de ADN proporcionadas en el presente documento pueden construirse de varias formas diferentes. Por ejemplo, pueden construirse como ADN completamente sintéticos. Los métodos de síntesis eficiente de oligonucleótidos en el intervalo de 20 a aproximadamente 150 nucleótidos están ampliamente disponibles. Véase Ausubel et al., sección 2.11, Suplemento 21 (1993). Los oligonucleótidos superpuestos pueden sintetizarse y ensamblarse de una manera descrita por primera vez por Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971); véase también Ausubel et al., citado anteriormente, Sección 8.2. Los ADN sintéticos preferentemente se diseñan con sitios de restricción convenientes diseñados en los extremos 5' y 3' del gen para facilitar la clonación en un vector apropiado.
Como se ha indicado, un método para generar variantes es comenzar con uno de los ADN descritos en el presente documento y después realizar una mutagénesis dirigida al sitio. Véase Ausubel et al., citado anteriormente, capítulo 8, Suplemento 37 (1997). En un método normal, un ADN diana se clona en un vehículo de bacteriófago de ADN monocatenario. El ADN monocatenario se aísla y se hibrida con un oligonucleótido que contiene la alteración o alteraciones de nucleótido deseadas. La cadena complementaria se sintetiza y el fago bicatenario se introduce en un hospedador. Algo de la progenie resultante contendrá el mutante deseado, que puede confirmarse mediante secuenciación de ADN. Además, hay diversos métodos disponibles que aumentan la probabilidad de que el fago de la progenie sea el mutante deseado. Estos métodos son bien conocidos por aquellos en el campo y los kits están disponibles en el mercado para generar dichos mutantes.
Construcciones y expresión de ADN recombinante
La presente divulgación proporciona además construcciones de ADN recombinante que comprenden una o más de las secuencias de nucleótidos de la divulgación. Las construcciones recombinantes se usan en conexión con un vector, tal como un plásmido, fagémido, fago o vector vírico, en el cual se inserta una molécula de ADN que codifica un anticuerpo de la invención.
El gen codificado puede producirse mediante técnicas descritas en Sambrook et a l, 1989 y Ausubel et al., 1989. Alternativamente, las secuencias de ADN pueden sintetizarse químicamente usando, por ejemplo, sintetizadores. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (1984, Gait, ed., IRL Press, Oxford). Las construcciones recombinantes de la divulgación están compuestas por vectores de expresión que son capaces de expresar el ARN y/o los productos proteicos del ADN codificado. El vector puede comprender además secuencias reguladoras, incluyendo un promotor ligado operativamente al marco de lectura abierto (ORF). El vector puede comprender además una secuencia marcadora seleccionable. También pueden requerirse señales de secreción bacteriana y de iniciación específicas para la traducción eficaz de las secuencias codificantes del gen diana insertado.
La presente divulgación proporciona además células hospedadoras que contienen al menos uno de los ADN de la presente divulgación. La célula hospedadora puede ser prácticamente cualquier célula para la que estén disponibles los vectores de expresión. Puede ser, por ejemplo, una célula hospedadora eucariota superior, tal como una célula de mamífero, una célula hospedadora eucariota inferior, tal como una célula de levadura o una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción recombinante en la célula hospedadora puede efectuarse mediante transfección con fosfato cálcico, DEAE, transfección mediada por dextrano, electroporación o infección por fagos.
Expresión Bacteriana
Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con señales adecuadas de inicio y terminación de la traducción en la fase de lectura operativa con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y, si es deseable, para proporcionar amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.
Los vectores bacterianos pueden estar, por ejemplo, basados en bacteriófagos, plásmidos o fagémidos. Estos vectores pueden contener un marcador seleccionable y un origen bacteriano de replicación derivado de plásmidos disponibles en el mercado que normalmente contienen elementos del vector de clonación pBR322 (ATCC 37017) conocido. Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y el crecimiento de la cepa hospedadora a una densidad celular adecuada, el promotor seleccionado se desreprime/induce por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un período adicional. Las células normalmente se recogen por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el extracto bruto resultante retenido para su posterior purificación.
En sistemas bacterianos, varios vectores de expresión pueden seleccionarse ventajosamente dependiendo del uso pretendido para la proteína que se expresa. Por ejemplo, cuando va a producirse una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de anticuerpos o para cribar bibliotecas de péptidos, por ejemplo, pueden desearse vectores que dirijan la expresión de elevados niveles de productos de proteínas de fusión que se purifiquen fácilmente.
Métodos terapéuticos
Los métodos terapéuticos implican administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo contemplado por la invención. Una cantidad "terapéuticamente eficaz" se define en el presente documento como la cantidad de un anticuerpo que es suficiente para bloquear eficazmente la interacción entre GM-CSF y su receptor en un área tratada de un sujeto, ya sea como una dosis única o de acuerdo con un régimen de dosis múltiples, solo o en combinación con otros agentes, que conduce al alivio de una condición adversa, aunque cuya cantidad es toxicológicamente tolerable. El sujeto puede ser un animal humano o no humano (por ejemplo, rata o macaco).
Un anticuerpo de la invención podría coadministrarse con medicamentos conocidos y, en algunos casos, el propio anticuerpo podría modificarse. Por ejemplo, un anticuerpo podría conjugarse con una inmunotoxina o un radioisótopo para aumentar potencialmente aún más la efectividad.
Los anticuerpos inventivos pueden usarse como una herramienta terapéutica o de diagnóstico en una diversidad de situaciones en las que se expresa o se encuentra GM-CSF de forma indeseable. Los trastornos y condiciones particularmente adecuados para el tratamiento con un anticuerpo de la invención son enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide (AR), esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, psoriasis, asma, dermatitis atópica o choque.
Para tratar cualquiera de los trastornos anteriores, las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente divulgación pueden formularse de manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Un anticuerpo de la invención puede administrarse por cualquier medio adecuado, que puede variar, dependiendo del tipo de trastorno a tratar. Las posibles vías de administración incluyen parenteral (por ejemplo, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea), intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional. Además, un anticuerpo de la invención podría administrarse mediante infusión de pulsos, con, por ejemplo, dosis decrecientes del anticuerpo. Preferentemente, la dosificación se da mediante inyecciones, lo más preferentemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es corta o crónica. La cantidad a administrar dependerá de una diversidad de factores tales como los síntomas clínicos, el peso del individuo, si se administran otros fármacos. El experto en la materia reconocerá que la vía de administración variará dependiendo del trastorno o afección a tratar.
Determinar una cantidad terapéuticamente eficaz del novedoso polipéptido, de acuerdo con esta invención, dependerá en gran medida de las características particulares del paciente, la vía de administración y la naturaleza del trastorno que se esté tratando. Pueden encontrarse directrices generales, por ejemplo, en las publicaciones de la International Conference on Harmonisation y en REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, capítulos 27 y 28, pp. 484-528 (18a ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Más específicamente, la determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz dependerá de factores tales como la toxicidad y la efectividad del medicamento. La toxicidad puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica y encontrados en las referencias anteriores. La efectividad puede determinarse utilizando las mismas directrices junto con los métodos descritos a continuación en los Ejemplos.
Métodos de diagnóstico
GM-CSF se expresa por diversos tipos de células incluyendo linfocitos, monocitos, células endoteliales, fibroblastos y algunas células malignas; por lo tanto, puede emplearse un anticuerpo anti-GM-CSF de la invención para generar imágenes o visualizar un sitio de posible acumulación de GM-CSF en diferentes tejidos en un paciente. En este sentido, un anticuerpo puede marcarse de manera detectable, a través del uso de radioisótopos, marcadores de afinidad (tales como biotina, avidina, etc.) marcadores fluorescentes, átomos paramagnéticos, etc. Los procedimientos para lograr tal marcaje son bien conocidos en la técnica. La aplicación clínica de los anticuerpos en el diagnóstico por imágenes se revisa por Grossman, H. B., Urol. Clin. North Amer. 13:465-474 (1986)), Unger, E. C. et al., Invest. Radiol. 20:693-700 (1985)) y Khaw, B. A. et al., Science 209:295-297 (1980)).
La detección de focos de tales anticuerpos marcados de forma detectable podría ser indicativo de un sitio de inflamación, por ejemplo. En una realización, este examen se realiza extrayendo muestras de tejido o sangre e incubando dichas muestras en presencia de anticuerpos marcados de forma detectable. En una realización preferida, esta técnica se realiza de manera no invasiva mediante el uso de imágenes magnéticas, fluorografía, etc. Una prueba diagnóstica tal puede emplearse para monitorizar el éxito del tratamiento de enfermedades, donde la presencia o ausencia de GM-CSF es un indicador relevante.
Composiciones terapéuticas y diagnósticas
Los anticuerpos de la presente invención pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, en donde un anticuerpo de la invención se combina en una mezcla con un vehículo de transporte farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados y su formulación se describen, por ejemplo, en REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18a ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Con el fin de formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para una administración eficaz, tales composiciones contendrán una cantidad eficaz de uno o más de los anticuerpos de la presente invención, junto con una cantidad adecuada de vehículo de transporte.
Las preparaciones pueden formularse adecuadamente para dar la liberación controlada del compuesto activo. Las preparaciones de liberación controlada pueden lograrse mediante el uso de polímeros para complejar o absorber el anticuerpo anti-GM-CSF. El suministro controlado puede ejercitarse seleccionando macromoléculas adecuadas (por ejemplo, poliésteres, poliaminoácidos, polivinilo, pirrolidona, etilenvinil-acetato, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o protamina, sulfato) y la concentración de macromoléculas así como los métodos de incorporación para controlar la liberación. Otro posible método para controlar la duración de la acción mediante preparaciones de liberación controlada es incorporar el anticuerpo anti-GM-CSF en partículas de un material polimérico tales como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico) o copolímeros de vinilacetato de etileno. Alternativamente, en lugar de incorporar estos agentes en partículas poliméricas, es posible atrapar estos materiales en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, o en un sistema coloidal de suministro de fármacos, por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas o en macroemulsiones. Dichas técnicas se desvelan en Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980).
Los compuestos pueden formularse para la administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección intravenosa rápida o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en una forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleaginosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril sin pirógenos, antes de su uso.
Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dosificador, que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el principio activo. El envase puede comprender, por ejemplo, papel metalizado o de plástico, tal como un envase de tipo blíster. El envase o dispositivo dosificador puede estar acompañado de instrucciones para la administración.
La invención se entiende además por referencia a los siguientes ejemplos de trabajo.
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos humanos específicos contra GM-CSF a partir de la biblioteca HuCAL GOLD®
A. Rescate de fagémidos, amplificación y purificación de fagos
La biblioteca HuCAL GOLD® se amplificó en medio 2xYT que contenía 34 mg/ml de cloranfenicol y glucosa al 1 % (2xYT-CG). Después de la infección por fagos auxiliares (VCSM13) a una DO600 de 0,5 (30 min a 37 °C sin agitación; 30 min a 37 °C con agitación a 250 rpm), las células se centrifugaron (4120 g; 5 min; 4 °C), se resuspendieron en 23YT/34 mg/ml de cloranfenicol/50 mg/ml de kanamicina/IPTG 0,25 mM y se cultivó durante la noche a 22 °C. Los fagos se precipitaron con PEG del sobrenadante, se resuspendieron en PBS/glicerol al 20 % y se almacenaron a -80 °C. La amplificación de fagos entre dos rondas de selección se realizó como sigue: las células E. co liTG1 en fase semilogarítmica se infectaron con fagos eluidos y se sembraron en agar LB suplementado con glucosa al 1 % y 34 mg/ml de cloranfenicol. Después de la incubación durante la noche a 30 °C, las colonias se rasparon y se usaron para inocular 2xYT-CG hasta una DO600nm de 0,5 y se añadió el fago auxiliar como se ha descrito anteriormente.
B. Selección con HuCAL GOLD®
Para la selección de anticuerpos que reconocen GM-CSF humano, se aplicaron varias estrategias de selección. Resumiendo, los fagos con anticuerpo HuCAL GOLD® se dividieron en tres grupos que comprendían diferentes genes maestros de VH. Estos grupos se sometieron individualmente a a) una fase sólida de la proteína GM-CSF humana biotinilada (hecha a medida por R&D Systems, Minneapolis, MN) directamente recubiertas en placas de 96 pocillos recubiertas con neutravidina (Pierce, Rockford, IL) como soporte sólido para tres rondas o b) una solución que se selecciona sobre la proteína GM-CSF humana biotinilada capturada en Dynabeads recubiertas con estreptavidina (Dynal, Oslo, Noruega) durante tres rondas.
En detalle, para la selección en GM-CSF biotinilado inmovilizado, los pocillos de la placa de neutravidina se lavaron tres veces con 300 ml de PBS. El antígeno se diluyó a una concentración de 3 mg/ml (200 nM) en PBS y se recubrieron 0,1 ml por pocillo durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de dos etapas de lavado con 300 ml de PBS, los pocillos se incubaron con tampón de bloqueo que contenía 2x Chemiblocker (Chemicon, Temecula, CA) diluido 1:1 en PBS.
Antes de las selecciones, 100 ml de los fagos HuCAL GOLD® se adsorbieron previamente en 100 ml de tampón de bloqueo que contenía 0,4 ml de Tween20 al 25 % durante 0,5 h a TA. Los fagos bloqueados se transfirieron en alícuotas de 100 ml a pocillos de una placa de neutravidina durante 0,5 h a TA. Esta etapa se repitió dos veces para la preabsorción.
Después de lavar (23300 ml PBS) de la placa de microtitulación de neutravidina recubierta y bloqueada, se añadieron 0,1 ml de los fagos preadsorbidos a los pocillos revestidos y se incubaron durante 1,5 h a TA agitando suavemente. Esta incubación fue seguida de 10 ciclos de lavado con PBS/Tween20 al 0,05 % a TA.
Los fagos unidos se eluyeron añadiendo 120 ml de DTT 20 mM en Tris 10 mM pH 8,0 por pocillo durante 10 min a temperatura ambiente. El eluido se retiró y se añadió a 14 ml E. coli TG1 crecidas a una DO600nm de 0,6-0,8. Los pocilios se lavaron adicionalmente con 200 ml de PBS y esta solución también se añadió a las células TG1. La infección por fagos de E. coli se permitió durante 45 min a 37 °C sin agitación. Adicionalmente, se añadieron 200 ml de células TG1 cultivadas hasta una DO600nm de 0,6-0,8 a los pocillos de selección durante 45 minutos a 37 °C sin agitación. Estas células TG-1 se añadieron al cultivo de 14 ml que ya contenía los fagos de la primera etapa de elución. Después de centrifugar durante 10 min a 5000 rpm, cada uno de los sedimentos bacterianos se resuspendió en 500 ml de medio 2xYT, se colocaron en placas de agar 2xYT-CG y se incubaron durante la noche a 30 °C. A continuación, se rasparon las colonias de las placas y se rescataron y se amplificaron los fagos como se ha descrito anteriormente.
La segunda y tercera rondas de selección se realizaron de manera idéntica a la primera ronda de selección con la única diferencia de que las condiciones de lavado después de la unión del fago fueron más rigurosas. Adicionalmente, en la tercera ronda de selección, los fagos se sometieron a una etapa adicional de preadsorción en perlas recubiertas de estreptavidina (Dynabeads M-280; Dynal). Los tubos Eppendorf se bloquearon con solución Chemiblocker mediante incubación durante 30 min a TA. De cada grupo de fagos, se mezclaron 0,3 ml 1:1 con solución 2xChemiblocker que contenía Tween20 al 0,05 % y se incubaron durante 1 h a TA en los tubos Eppendorf bloqueados en un rotador. A continuación, los fagos bloqueados se transfirieron a tubos Eppendorf recién bloqueados y se añadieron 50 ml de Dynabeads M-280 durante otros 30 min para la preadsorción. Las perlas se retiraron usando un dispositivo magnético (Dynal MPC-E). Después se transfirieron alícuotas de 150 ml de fagos a placas de neutravidina para una preadsorción adicional como en las rondas 1 y 2 (véase anteriormente).
Para la selección de la solución usando GM-CSF biotinilado acoplado a Dynabeads se aplicó el siguiente protocolo: Se bloquearon tubos Eppendorf de 1,5 ml con 1,5 ml de Chemiblocker 2x diluido 1:1 con PBS durante la noche a 4 °C. Perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina de 200 ml (Dynabeads M-280; Dynal) se lavaron 1X con 200 ml de PBS y se resuspendieron en 200 ml de 1XChemiblocker (diluido en 1x PBS). El bloqueo de las perlas se realizó en tubos prebloqueados durante la noche a 4 °C. Los fagos diluidos en 500 ml de PBS para cada condición de selección se mezclaron con 500 ml de 2xChemiblocker/Tween al 0,1 % durante 1 h a TA (rotador). La preadsorción de fagos se realizó dos veces: se añadieron 50 ml de perlas magnéticas de estreptavidina bloqueadas a los fagos bloqueados y se incubaron durante 30 min a TA en un rotador. Después de la separación de las perlas a través de un dispositivo magnético (Dynal MPC-E), el sobrenadante del fago (~1 ml) se transfirió a un nuevo tubo bloqueado y la preadsorción se repitió en 50 ml de perlas bloqueadas durante 30 min. Después, se añadió hGM-CSF biotinilado 200 nM a los fagos bloqueados en un nuevo tubo bloqueado de 1,5 ml y se incubó durante 1 h a TA en un rotador. Se añadieron 100 ml de perlas magnéticas de estreptavidina bloqueadas a cada conjunto de fagos de selección y se incubaron 10 min a TA en un rotador. Los fagos unidos a GM-CSF biotinilado y por lo tanto inmovilizados a las perlas magnéticas se recogieron con un separador de partículas magnéticas (Dynal MPC-E). Las perlas se lavaron después 7 veces en PBS/Tween al 0,05 % usando un rotador, seguido de lavado otras tres veces con PBS. La elución del fago de las Dynabeads se realizó añadiendo 300 ml de DTT 20 mM en Tris/HCl 10 mM pH 8 a cada tubo durante 10 min. Las Dynabeads se retiraron con el separador de partículas magnéticas y el sobrenadante se añadió a 14 ml de un cultivo de E. coli TG-1 crecido hasta DO600nm de 0,6-0,8. Las perlas se lavaron después una vez con 200 ml de PBS y se añadió PBS que contenía más fagos retirados a los 14 ml de cultivo de E. coli TG-1.
Después de centrifugar durante 10 min a 5000 rpm, cada uno de los sedimentos bacterianos se resuspendió en 500 ml de medio 2xYT, se colocaron en placas de agar 2xYT-CG y se incubaron durante la noche a 30 °C. A continuación, se rasparon las colonias de las placas y se rescataron y se amplificaron los fagos como se ha descrito anteriormente.
La segunda y la tercera rondas de la solución de cribado en GM-CSF biotinilado se realizaron de acuerdo con el protocolo de la primera ronda excepto por el aumento de la rigurosidad del procedimiento de lavado.
C. Subclonación de fragmentos Fab seleccionados y expresión de fragmentos Fab solubles
Los insertos que codifican Fab de los fagémidos HuCAL GOLD® seleccionados se subclonaron en el vector de expresión pMORPH®X9_Fab_FH (Figura 5) para facilitar la expresión rápida de Fab soluble. El ADN de los clones seleccionados se digirió con Xbal y EcoRI, cortando de esta manera el inserto que codifica Fab (ompA-VLCL y phoA-Fd) y se clonó en el vector pMORPH®X9_Fab_FH digerido con Xbal / EcoRI. Los Fab expresados en estos vectores llevan dos etiquetas C-terminales (FLAG™ y 6xHis, respectivamente) para detección y purificación.
D. Microexpresión de anticuerpos Fab HuCAL GOLD® en E. coli
Las colonias individuales obtenidas después de la subclonación en pMORPH®X9_Fab_FH se usaron para inocular pocillos de una placa de microtitulación estéril de 96 pocillos que contenía 100 ml de medio 23TY/Cm/1 % Glu por pocillo y se cultivaron durante la noche a 37 °C. 5 ml de cada cultivo de E. coli TG-1 se transfirió a una nueva placa de microtitulación estéril de 96 pocillos que contenía 100 ml de medio 23TY/Cm/Glu al 0,1 % por pocillo. Las placas de microtitulación se incubaron a 30 °C con agitación a 400 rpm en un agitador de microplacas hasta que los cultivos estuvieron ligeramente turbios (~2-4 horas) con una DO600nm de 0,5. A estas placas de expresión, se añadieron 20 ml de 2xYT/Cm/IPTG 3 mM por pocillo (concentración final de IPTG 0,5 mM), se sellaron con una cinta permeable a los gases y se incubaron durante la noche a 30 °C con agitación a 400 rpm.
Generación de lisados de células completas (extractos BEL)
A cada pocillo de las placas de expresión, se añadieron 40 ml de tampón BEL (2xBBS/EDTA: ácido bórico 24,7 g/l, 18,7 g de NaCl/l, 1,49 g de EDTA/I, pH 8) que contenía 2,5 mg/ml de lisozima y se incubaron durante 1 h a 22 °C en un agitador de placas de microtitulación (400 rpm). Los extractos de BEL se usaron para el análisis de unión mediante ELISA o un analizador BioVeris serie M® 384 (véase el Ejemplo 2).
E. Expresión de anticuerpos Fab HuCAL® GOLD en E. coli y purificación
La expresión de fragmentos Fab codificados por pMORPH®X9_Fab_FH en células TG-1 se llevó a cabo en cultivos en matraces agitadores con 1 l de medio 23YT suplementado con 34 mg/ml de cloranfenicol. Después de la inducción con IPTG 0,5 mM, las células se cultivaron a 22 °C durante 16 h. Los extractos de células enteras de los sedimentos celulares se prepararon mediante French Press y los fragmentos Fab se aislaron mediante cromatografía de níquel/NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). Las concentraciones se determinaron por espectrofotometría UV (Krebs et al., 2001).
Ejemplo 2: Identificación de anticuerpos específicos de hGM-CSF
Los extractos BEL de clones de E. coli individuales seleccionados por las estrategias de selección mencionadas anteriormente se analizaron mediante ELISA o BioVeris (analizador BioVeris serie M® 384) para identificar clones que codifican Fab específicos de hGM-CSF.
A. Técnicas de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Se recubrieron placas de microtitulación de neutravidina con GM-CSF biotinilado recombinante humano (R&D Systems) a 1,5 mg/ml en PBS durante 2 h a TA.
Después de recubrir con el antígeno, los pocillos se bloquearon con PBS/Tween al 0,05 % (PBS-T) con BSA al 1 % durante 1 h a TA. Después de lavar los pocillos con extracto de PBS-T BEL, Fab HuCAL® purificados o IgG control se diluyeron en PBS, se añadieron a los pocillos y se incubaron durante 1 h a TA. Para la detección de los anticuerpos primarios, se aplicaron los siguientes anticuerpos secundarios: fragmento F(ab’)2 AffiniPure conjugado con fosfatasa alcalina (AP), IgG cabra antihumana, anti-ratón o anti-rata (Jackson Immuno Research). Para la detección de AP-conjugados se usaron sustratos fluorogénicos como AttoPhos (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Entre todas las etapas de incubación, los pocillos de la placa de microtitulación se lavaron con PBS-T tres veces y tres veces después de la incubación final con el anticuerpo secundario. La fluorescencia se midió en un lector de placas TECAN Spectrafluor.
B. Análisis de unión basado en electroquimioluminiscencia (BioVeris) para la detección de Fab de unión a GM-CSF en lisados
Alternativa a los experimentos ELISA para la detección de anticuerpos Fab de unión a GM-CSF en lisados de E. coli (extractos BEL), la unión se analizó en Analizador BioVeris SERIE M® 384 BioVeris, Europa, Witney, Oxfordshire, RU).
Con este fin, el extracto de BEL se diluyó al menos 1:50 y como máximo a 1:1000 en tampón de ensayo (PBS/Tween20 al 0,05 %/BSA al 0,5 %) para su uso en la detección de BioVeris. Se acopló GM-CSF biotinilado (R&D Systems) a perlas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina, Dynabeads (Dynal), a una concentración de 0,1 mg/ml. Por pocillo de una placa de 96 o 384 pocillos se usaron 25 o 15 ml de una dilución 1:25 de la solución madre de Dynabead. Las perlas se lavaron tres veces con tampón de ensayo antes de agregar GM-CSF biotinilado durante 30 min a TA en un agitador. Las perlas después se lavaron tres veces con tampón de ensayo y finalmente se resuspendieron en tampón de ensayo nuevo. (Fab)'2 anti-humano (Dianova) se marcó con rutenio usando la etiqueta BV™ (BioVeris Europa, Witney, Oxfordshire, RU). Este anticuerpo secundario se añadió a las perlas acopladas de GM-CSF a una concentración de 6 mg/ml inmediatamente antes de su uso. 100 ml o 60 ml de extracto de BEL diluido (véase anteriormente) de cultivos de expresión de E. coli que contienen anticuerpos Fab se cargaron en pocillos de una placa de 96 o 384 pocillos y, respectivamente, se añadieron 25 o 15 ml de perlas acopladas GM-CSF más mezcla de anticuerpo secundario anti-Fab-BV-tag™ a cada pocillo y se incubó durante 2 h a TA en un dispositivo de agitación de placas. Las placas se analizaron en un Analizador BioVeris SERIE M® 384.
Después del análisis de secuencias, se identificaron setenta y cuatro (74) clones únicos que mostraron una unión suficientemente fuerte (proporción señal:ruido superior a 10:1 en ELISA o 50:1 en BioVeris). Estos clones se expresaron, se purificaron y se probaron en ensayos funcionales.
C. Determinación de la especificidad molecular y la reactividad cruzada entre especies de Fab anti-hGM-CSF seleccionados.
Se determinó la reactividad cruzada de los anticuerpos anti-hGM-CSF con los siguientes analitos: GM-CSF de rata y ratón, IL-3 humana, IL-4 humana, , IL-5 humana, , IL-13 humana, , M-CSF humano (todos de Peprotech, Londres, RU). Esto se realizó en un montaje de captura por resonancia de plasmón superficial (Biacore 3000, Uppsala, Suecia).
Los chips CM5 (Biacore, Suecia) se recubrieron con 5000-6000RU anti-F(ab)2 (Dianova, Affinipure Fragmento F(ab)2 Cabra Anti-IgG Humana, Fragmento F(ab)2 específico); 80 mg/ml tampón de acetato 10 mM, pH 4 en las 4 células de flujo, usando la química de acoplamiento de amina EDC-NHS convencional. En las células de flujo, se capturaron 2­ 4 Fab de GM-CSF específicos (20 ml de Fab 500 nM a un caudal de 5 ml/ml, 300-400RU). Después de capturar el Fab específico, se inyectó tampón, para determinar la disociación de la interacción anti-Fab/Fab. En un ciclo siguiente, el factor de crecimiento del analito se inyectó (20 ml, caudal 20 ml/min) en un intervalo de concentración entre 15 y 2000 nM para la determinación de la señal específica. En lo sucesivo el sensograma del tampón obtenido se sustrajo manualmente del específico. Después de cada ciclo, las células de flujo se regeneraron con HCl 100 mM (5 ml).
Se probaron siete anticuerpos HuCAL® anti-hGM-CSF incluyendo MOR03684 y MOR03682, y fueron específicos para GM-CSF humano y no se unieron a ninguna de las otras citocinas o GM-CSF de ratón o rata. Por el contrario, Fab MOR03929 mostró una reactividad cruzada significativa con GM-CSF de rata.
Ejemplo 3: Identificación de candidatos Fab anti-GM-CSF humanos que inhiben la interacción entre GM-CSF y el receptor alfa de GM-CSF
74 anticuerpos específicos de hGM-CSF diferentes que se seleccionaron de la biblioteca HuCAL GOLD® se ensayaron en cuanto a la potencia para inhibir la interacción entre hGM-CSF y su receptor. La interacción se probó de dos maneras, (i) siendo uno un ensayo de proliferación utilizando la línea celular TF-1 dependiente de GM-CSF (Kitamura et al., 1989) y (ii) siendo el otro un análisis FACS con una línea celular CHO recombinante que expresa la cadena alfa del GM -Receptor de LCR. En el ensayo de proliferación de TF-1, se probó la capacidad de los anticuerpos anti-GM-CSF para bloquear la interacción de GM-CSF con el receptor endógeno de GM-CSF que consiste en la cadena alfa y beta, lo que conduce a una reducción de la proliferación celular. En el ensayo FACS se determinó la inhibición específica de la interacción entre GM-CSF y la cadena alfa del receptor de GM-CSF.
A. Clonación y expresión de GM-CSF de Macaca mulata y humano
El ADNc de longitud completa de GM-CSF de Macaca mulatta (n.° de registro de GenBank: AY007376) se sintetizó por síntesis génica (geneART GmbH, Regensburg, Alemania) y se clonó en el vector pCR-Script-Amp (Stratagene, LaJolla, CA, EE.UU.). Posteriormente, el ADNc se clonó en el vector de expresión eucariota pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Paisley, RU) que produce pcDNA-macGM-CSF. El ADNc de GM-CSF humano (número de registro de Genbank NP_000749) se clonó mediante la técnica de RT-PCR a partir de ARN aislado de células 1310e7 TF-1 usando el kit RNeasy de Qiagen (Hilden, Alemania). La transcripción inversa se realizó con el kit SuperscriptlI usando hexámeros aleatorios (Gibco) seguido de la amplificación del ADNc de GM-CSF por PCR. El producto de PCR obtenido se clonó en el vector de expresión pcDNA3.1(+) produciendo pcDNA-huGM-CSF.
Las células HEK293 se transfectaron transitoriamente con estos vectores de expresión respectivamente usando lipofectamina (Stratagene, LaJolla, EE.UU.). El medio que contenía el GM-CSF de macaco o de humano recombinante secretado se recogió 4 días después de la transfección.
B. Inhibición de la proliferación dependiente de GM-CSF de células TF-1 por Fab anti-hGM-CSF usando GM-CSF humano o de macaco
Las células TF-1 (Kitamura et al., 1989) se cultivaron de acuerdo con el protocolo del proveedor (DSMZ, Braunschweig, Alemania; N.° de DSMZ ACC 334). Las células TF-1 se lavaron dos veces con medio RPMI1640 (FCS al 10 %) y después se sembraron a una concentración de 2 x 105 células/ml en 50 ml por pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo plano. GM-CSF recombinante humano ("Leucomax", ESSEX Pharma, München) a 0,5 ng/ml y anticuerpos Fab HuCAL® (200 ng/ml - 200 gg/ml diluidos en medio RPMI1640, FCS al 10 %) se mezclaron durante 30 min y se añadieron 50 ml de la mezcla a las células TF-1, de tal manera que la concentración final de GM-CSF fue 0. 25 ng/ml. La proliferación celular máxima (0 % de inhibición) se midió incubando células TF-1 a una concentración final de GM-CSF de 0,25 ng/ml, sin la adición de anticuerpos. Se midió el 100 % de inhibición de la proliferación de TF-1 omitiendo GM-CSF del ensayo y manteniendo las células en medio RPMI1640 (FCS al 10 %) únicamente. Las células TF1 se incubaron después durante 72 horas a 37 °C con CO2 al 5 % en una cámara humidificada. La vitalidad celular se midió añadiendo reactivo MTT o XTT (Roche, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En general, se identificaron 19 Fab que mostraron una inhibición significativa de la proliferación de TF-1. Las proteínas de unión MOR03682, MOR03684 y MOR03929 mostraron una inhibición constante de la proliferación de células TF1 de más del 50 % a una concentración de 2 mM. La actividad inhibitoria de estos Fab no optimizados no fue lo suficientemente fuerte para determinar una dosis CI50, porque no se pudo lograr la inhibición total. En comparación, los anticuerpos monoclonales BVD2-21C11 (BD Biosciences Pharmingen; N.° de cat. 554503) y MAB215 (R&D Systems; N.° de cat. MAB215) fueron capaces de inhibir completamente la proliferación de TF-1.
Adicionalmente, la unión de MOR03682 y MOR03684 a GM-CSF humano nativo se probó en el ensayo de proliferación de TF-1. En lugar de añadir GM-CSF recombinante humano purificado a las células TF-1, se usó un sobrenadante de células 5637 (DSMZ No. ACC 35) que secretan GM-CSF humano nativo en el medio. A partir de una curva de respuesta a la dosis que comparaba el efecto del GM-CSF humano recombinante con diferentes diluciones del sobrenadante 5637, se determinó que el medio contenía ~ 5 ng/ml de GM-CSF humano nativo. Mediante la preincubación del sobrenadante 5637 con Fab MOR03682 o MOR03684 anti-GM-CSF humano, se bloqueó la unión del GM-CSF humano nativo a las células TF-1, de modo que la viabilidad de las células se redujo de manera comparable al experimento con GM-CSF humano recombinante. MOR03684 y MOR03682 se unen así al GM-CSF humano nativo. Fab MOR03929 no se probó en este ensayo.
Adicionalmente, la reactividad cruzada con GM-CSF de macaco se probó en el ensayo de proliferación TF-1. En lugar de añadir GM-CSF humano purificado a las células TF-1, se usó un sobrenadante de células HEK293 transfectadas que secretan GM-CSF de macaco recombinante en el medio.
Las células TF-1 proliferaron en presencia de sobrenadante que contenía GM-CSF de macaco, pero no en presencia de sobrenadante de células HEK293 no transfectadas. A partir de una curva de respuesta a la dosis que comparaba el efecto del GM-CSF humano recombinante con diferentes diluciones del medio HEK-293, se determinó que el medio de las células transfectadas contenía ~2 mg/ml de GM-CSF de macaco. Mediante la preincubación del sobrenadante de GM-CSF de macaco con Fab MOR03682 o MOR03684 de GM-CSF antihumano, se bloqueó la unión de GM-CSF de macaco a las células TF-1 de modo que la viabilidad de las células se redujo significativamente. MOR03682 y MOR03684_ tienen por lo tanto reactividad cruzada con GM-CSF de macaco. Fab MOR03929 no se probó en este ensayo.
C. Bloqueo de la unión de GM-CSF al receptor alfa de GM-CSF por Fab anti-hGM-CSF
Para probar la unión de GM-CSF a una cadena alfa del receptor de GM-CSF expresada en la superficie celular, se clonó el ADNc en un vector de expresión y se transfectó de forma estable en células CHO-K1 (DSMZ ACC 110).
Clonación de una línea celular estable CHO-K1 que expresa la cadena alfa del receptor GM-CSF El ADNc de la cadena alfa del receptor GM-CSF humano (número de registro de Genbank M64445) se clonó mediante la técnica de RT-PCR a partir de ARN aislado de células 1x10e7 TF-1 usando el kit RNeasy de Qiagen (Hilden, Alemania). La transcripción inversa se realizó con el kit SuperscriptII usando hexámeros aleatorios (Gibco). A continuación, se amplificó el ADNc de la cadena alfa del receptor de GM-CSF usando los siguientes cebadores:
5': N-GCRa-plusSS: TTCTCTGGATCCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACAAGCC y
3': C-fIGCRa: ACCCTCCAATTGTCAGGTAATTTCCTTCACGGTC.
La reacción de PCR arrojó un producto de ~1250 pb que se digirió con EcoRI y BamHI (New England BioLabs). El vector de expresión pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Paisley, RU) se digirió con las mismas enzimas. Después de la purificación del vector digerido y el producto de PCR, los fragmentos se ligaron y se transformaron por electroporación en células E. coli DH10B. Los clones correctos se identificaron después de la preparación del ADN plasmídico y la secuenciación. Los clones correctos (pcDNA3.1(+)-GM-CSFRalfa) contenían el ADNc alfa del receptor GM-CSF humano de longitud completa.
Las células CHO-K1 se cultivaron de acuerdo con el protocolo del proveedor (DSZM, Braunschweig, Alemania; N.° de DSMZ ACC 110). Para la transfección, las células se cultivaron hasta una confluencia del 80 % en una placa de 6 pocillos y se incubaron con 5 mg de ADN de pcDNA3.1(+)-GM-CSFRalfa mezclado con 10 ml del reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Después de 48 h las células se alimentaron con 1 mg/ml de G418 (Gibco) y, después de 24 h, se reemplazó otro medio con uno que contenía 2 mg/ml de G418. Después de dos semanas, se sembraron células individuales en pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillos. Se cultivaron clones individuales y 53105 células de cada clon se analizaron para determinar la expresión de GM-CSFR-alfa mediante análisis FACS usando IgG MAB1006 murina (Chemicon International, Temecula, CA) como anticuerpo primario a una concentración de 1 mg/ml y (R-PE-AffiniPure (Fab')2 cabra-anti-ratón-IgG (Dianova) como anticuerpo secundario a una dilución 1:200. Los anticuerpos primarios y secundarios se incubaron con las células durante 1 h secuencialmente, mientras que las células se lavaron en tampón FACS (PBS, FCS al 3 %) entre estas etapas. La fluorescencia de las células teñidas se cuantificó en el canal FL2 usando un sistema FACSCalibur (Becton Dickinson).
Entre los clones analizados, el clon CHO-GMRa#11 mostró la mediana de intensidad de fluorescencia más alta. Se determinó un valor de mediana de fluorescencia (valor MFL) de 157 para CHO-GMRa#11 (Figura 6)
Análisis FACS de la unión de GM-CSF al receptor alfa de GM-CSF expresado en CHO-GMRa#11:
Antes de añadir a las células, los anticuerpos a concentraciones crecientes (0,1 a 100 mg/ml) se coincubaron con GM-CSF biotinilado (0,5 mg/ml) en tampón FACS (PBS/FBS al 3 %/NaN3 al 0,05 %) durante 30 min a temperatura ambiente.
Todas las tinciones se realizaron en placas de cultivo de 96 pocillos de fondo redondo (Nalge Nunc) con 1-5 x 105 células por pocillo. Se recogieron 2x10E5 CHO-GMRa#11 en 50 ql del tampón FACS que contenía anticuerpo/GM-CSF y se incubaron a 4 °C durante 1 h. A continuación, las células se lavaron una vez con 150 ql de tampón FACS/pocillo y se recogieron en 100 ql de estreptavidina marcada con ficoeritrina (BD Biosciences Pharmingen) que se había diluido 1:400 en tampón FACS. Después de 1 h de incubación a 4 °C, las células se lavaron dos veces con tampón FACS, se resuspendió en 100 ql de tampón FACS y se midió la unión de GM - CSF biotinilado mediante la intensidad de fluorescencia FL2 de las células en FACScalibur (Becton Dickinson). Los valores de CI50 se determinaron a partir de las curvas de respuesta a la dosis obtenidas usando el software GraphPad Prism v3.03 aplicando un ajuste de curva de regresión no lineal.
Los anticuerpos Fab MOR03682, MOR03684 y MOR03929 mostraron una inhibición significativa de la unión de GM-CSF al receptor alfa de GM-CSF expresado en la superficie celular.
Ejemplo 4: Maduración por afinidad de Fab seleccionado mediante intercambio gradual de casetes de CDR
A. Generación de selecciones y bibliotecas Fab de maduración por afinidad
Para aumentar la afinidad y la actividad inhibidora de los fragmentos Fab anti-GM-CSF los clones MOR03682, MOR03684 y MOR03929 se sometieron a maduración por afinidad. En este sentido, las regiones CDR se optimizaron mediante mutagénesis de casete usando mutagénesis dirigida por trinucleótidos (Virnekás et a l, 1994; Nagy et al., 2002). El análisis de secuencia no reveló homología de secuencia entre las CDR de los tres clones parentales analizados. Las Tablas 2a y 2b proporcionan las seis secuencias peptídicas de CDR para los clones parentales MOR03682, MOR03684 y MOR03929.
A continuación se describe brevemente el protocolo usado para la optimización de Fab. Los fragmentos Fab del vector de expresión pMORPH®X9Fab_FH se clonaron en un vector fagémido (documento US 6.753.136). Después, se aplicaron dos estrategias diferentes para optimizar la afinidad y la eficacia de los Fab parentales.
En primer lugar, se generó una biblioteca Fab de anticuerpo de fago donde la L-CDR3 de cada parental se reemplazó por un repertorio de secuencias de CDR3 de cadena ligera lambda individuales. En una segunda biblioteca, la región H-CDR2 se reemplazó por un repertorio de secuencias individuales de CDR2 de cadena pesada.
Se generaron bibliotecas de maduración por afinidad transformando los clones diversificados en E. coli TOP10F' (Invitrogen). Los fagos se prepararon como se describe en el Ejemplo 1A. Se combinaron ambas bibliotecas L-CDR3 de MOR03684 y MOR03682 y se combinaron ambas bibliotecas H-CDR2 derivadas de MOR03684 y MOR03682, mientras que las bibliotecas L-CDR3 y H-CDR2 derivadas de MOR03929 se mantuvieron por separado durante el procedimiento de selección. Se realizaron cribados en GM-CSF biotinilado en solución durante tres rondas esencialmente como se describe en el Ejemplo 1B y aplicando condiciones de selección más rigurosas.
B. Análisis de unión basado en electroquimioluminiscencia (BioVeris) para la detección de Fab de unión a GM-CSF mejorada en lisados
Para la detección de anticuerpos Fab de unión a GM-CSF en lisados de E. coli (extractos BEL), la unión se analizó en una Estación de trabajo BioVeris SERIE M-384® (BioVeris Europe, Witney, Oxforfshire, RU) esencialmente como se describe en el Ejemplo 2B.
Los Fab con los valores de ECL más altos se purificaron y se sometieron a medición de afinidad mediante titulación de equilibrio de solución (SET; Haenel et al, 2005) y resonancia de plasmón superficial (Biacore) (véase el Ejemplo 4D)
C. Clonación X de VL mejorada (L-CDR3) con VH mejorada (H-CDR2)
Para una mejora adicional de la afinidad, se combinaron las H-CDR2 y L-CDR3 optimizadas de forma independiente de Fab madurados que se derivaron del mismo clon parental, porque había una alta probabilidad de que esta combinación condujera a una mayor ganancia de afinidad (Yang et al., 1995; Schier et al., 1996; Chen et al., 1999). Este procedimiento, llamado clonación X, se aplicó para aglutinantes que se derivaron del clon parental MOR03929 a medida que se identificaron Fab con afinidades mejoradas tanto de la biblioteca H-CDR2 como de la L-CDR3. Esto se logró mediante la transferencia de cadenas ligeras completas (fragmento Xbal/Sphl) del clon donante optimizado para L-CDR3 al clon aceptor optimizado para H-CDR2.
Tabla 3: Combinaciones de clonación X
Figure imgf000018_0001
Para los 4 Fab resultantes, se secuenció la VL y la VH para confirmar la transferencia de la VL correcta a la estructura principal del vector mejorado H-CDR2 respectivo. Las tablas 2a y 2b muestran las secuencias de proteínas VH y VL de todos los derivados de MOR03929 y 3682, que se enumeran en la tabla 3.
D. Determinación de las afinidades picomolares usando la titulación de equilibrio de la solución (SET) y la resonancia de plasmón superficial (Biacore)
Para la determinación de Kd, se usaron las fracciones de monómero (al menos el 90 % de contenido de monómero, analizado por SEC analítica; Superdex75, Amersham Pharmacia) de Fab. La determinación de afinidad basada en electroquimioluminiscencia (ECL) en solución y la evaluación de datos se realizaron básicamente como se describe por Haenel et al., 2005: Se equilibró una cantidad constante de Fab con diferentes concentraciones (diluciones en serie 5n) de GM-CSF humano (Leucomax) en solución. Se añadió GM-CSF humano biotinilado (R&D Systems) acoplado a perlas paramagnéticas (M-280 Streptavidin, Dynal) y (Fab)'2 antihumano (Dianova) marcado con etiqueta BV™ (BioVeris Europa, Witney, Oxforfshire, RU) y se incubó durante 15 - 30 min. Después, la concentración de Fab no unido se cuantificó mediante detección ECL usando un analizador serie M® 384 (BioVeris Europa).
De acuerdo con Friguet et al., 1985, se tuvo cuidado de evitar un cambio significativo del equilibrio a la fase sólida durante la detección.
Usando las condiciones de ensayo descritas anteriormente, se determinaron las afinidades por los Fab, que se muestran en la tabla 4.
Adicionalmente se realizó un análisis cinético de SPR en un chip F1 (Biacore, Suecia) que se recubrió con una densidad de -100 RU de GM-CSF humano recombinante (Peprotech) en acetato de Na 10 mM, pH 4,5, usando química convencional de acoplamiento de amina EDC-NHS. Se inmovilizó una cantidad respectiva de HSA en la célula de flujo de referencia. PBS (NaCl 136 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO410 mM, KH2PO4 1,76 mM pH 7,4) Tween 20 al 0,005 % se usó como tampón de ejecución. Fab se aplicó en series de concentración de 6,3 - 200 nM a un caudal de 20 ml/min. La fase de asociación se fijó en 60 s y la fase de disociación en 120 s (parental) o hasta 600 s (optimizada por afinidad). Para monitorizar la fase de disociación durante un período más largo, se usaron las siguientes condiciones, básicamente de acuerdo con Drake et al., (2004): Fab se aplicó en una única concentración de 200 nM; el caudal se fijó en 100 ml/min y la fase de disociación en 6000 - 18.000 s. Basándose de las tasas de disociación determinadas en estas condiciones de ensayo, se estimaron las afinidades por los Fab, que se muestran en la tabla 4.
Tabla 4: Afinidades de Fab anti-hGM-CSF determinadas por Biacore y titulación de equilibrio de la solución
(SET)
Biacore SET
MOR0 K d (pM) K d (pM)
3684 6420 16000
4251 70 7,4
3929 4260 2000
4302 174 63,5
4287 nd 17,9
4252 55 6
4290 122 11,1
4350 19 1,1
4354 21 2,8
4357 7 0,4
3682 nd 11406 4283 nd 113
4297 nd 49,2 4342 nd 4,9 E. Determinación de las afinidades con GM-CSF de rata usando la titulación de equilibrio de la solución (SET) La determinación de la afinidad con GM-CSF de rata se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 4D usando GM-CSF de rata (Peprotech) como analito en solución en lugar de GM-CSF humano. Las afinidades se calcularon de acuerdo con Haenel et al (2005). En este ensayo se determinó que la afinidad de Fab MOR04357 por GM-CSF de rata era Kd = 1,0 nM.
Ejemplo 5: Caracterización de Fab anti-GM-CSF humanos optimizados que inhiben la interacción entre GM-CSF y la cadena alfa del receptor de GM-CSF
A. Ensayo de unión al receptor alfa de GM-CSF
El ensayo de unión al receptor de GM-CSF se realizó como se describe anteriormente (Ejemplo 3C) usando 0,5 pg/ml (35 nM) de GM-CSF biotinilado. La unión máxima de GM-CSF a las células CHO-GMRa#11 (0 % de inhibición) se midió incubando las células a una concentración final de GM-CSF de 05 pg/ml de GM-CSF biotinilado, sin la adición de anticuerpos. Se midió el 100 % de inhibición de la unión de GM-CSF omitiendo GM-CSF del ensayo. Los valores de CI50 se determinaron a partir de las curvas de respuesta a la dosis obtenidas usando el software GraphPad Prism v3.03 aplicando un ajuste de curva de regresión no lineal.
Se analizaron los Fab con afinidades mejoradas, los Fab originales y las IgG monoclonales de referencia. La Tabla 5 resume los valores de CI50 obtenidos en estos ensayos. El % de inhibición logrado a una concentración de anticuerpos de 5 pg/ml también se proporciona en la tabla 5.
Ċ
Figure imgf000020_0001
20 Este ensayo mostró cualitativamente que los Fab obtenidos a partir de la maduración por afinidad y la clonación X evitan que GM-CSF se una a la cadena alfa del receptor de GM-CSF y, por lo tanto, retienen el mecanismo de bloqueo de sus Fab originales. El ensayo debía realizarse con una concentración de GM-CSF biotinilado 35 nM (0,5 pg/ml) para obtener una señal significativa en FACS. Por lo tanto, teóricamente se necesita 17,5 nM de Fab (u 8,75 nM de IgG) para bloquear el 50 % del GM-CSF, estableciendo así un límite para la determinación de los valores de CI50.
B. Inhibición de la proliferación dependiente de GM-CSF de TF-1 por Fab anti-hGM-CSF usando GM-CSF humano
El ensayo de proliferación de TF-1 se realizó como se describe en el Ejemplo 3B. Se analizaron los Fab con afinidades mejoradas y los Fab originales así como las IgG monoclonales de referencia. Los valores de CI50 se determinaron a partir de las curvas de respuesta a la dosis obtenidas usando el software GraphPad Prism v3.03 aplicando un ajuste de curva de regresión no lineal. La Tabla 6 resume los valores de CI50 obtenidos en estos ensayos.
Figure imgf000022_0001
En otro conjunto de experimentos los valores de CI50 en el ensayo de proliferación de TF-1 se determinaron para el Fab MOR03682 parental, sus derivados madurados por afinidad MOR04283, MOR04297 y la variante x-clonada MOR04342. La Tabla 7 resume los valores de CI50 obtenidos en estos ensayos.
Tabla 7: V l r I F ni-h M- F n l n r lif r i n e TF-1
Figure imgf000023_0001
Estos experimentos demostraron las grandes mejoras logradas en valores CI50 después de la maduración por afinidad y la clonación X. Por ejemplo, MOR04357, MOR04350, MOR04354 muestran valores de CI50 mejorados > 2000 veces en comparación con su MOR03929 original y superan la potencia de BVD2-21C11 y Mab215
Ejemplo 6: Conversión de MOR04357 a formato IgG1 humana
A. Optimización de genes de secuencias de ADN Fab para la expresión en sistemas de expresión de mamíferos.
Para optimizar el ADN de VH y VL de MOR04357 para la expresión génica de mamíferos (por ejemplo, cambio del uso de codones, contenido de Gc , etc.) se usó el software GeneOptimizer™ de Geneart (Regensburg, Alemania) para definir tales secuencias de ADN VH y VL optimizadas, cuyo gen se sintetizó en Geneart (Regensburg, Alemania) y se clonó en vectores pPCR-Script que produjeron 055906pPCR-Script y 055907pPCR-Script. SEQ ID n O: 48 muestra la secuencia VH respectiva, mientras que SEQ ID NO: 57 muestra la secuencia VL respectiva.
B. Clonación de Fab MOR04357 en formato IgG1 humano y expresión de IgG1
Para expresar inmunoglobulina (Ig) de longitud completa, los fragmentos de dominio variable de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) optimizadas para el gen se subclonaron de los vectores pPCR-Script (Ejemplo 5a) en la serie de vectores pMORPH®2_h_Ig para IgG 1 humana. La VH con codones optimizados de MOR04357 se aisló de 055906pPCR-Script a través de digestión Nhd/BIfi y se insertó en el vector maestro pMorph2_h_IgG1f cortado con las mismas enzimas de restricción. Este vector ya contenía una región constante gamma 1 humana. El plásmido de expresión resultante se denominó pMorph2_h_IgG1f_MOR04357_co. La VL con codones optimizados de MOR04357 se aisló de 055907pPCR-Script a través de digestión Nhel/BIp y se insertó en el vector maestro pMorph2_h_Iglambda2 cortado con las mismas enzimas de restricción. Este vector ya contenía una región constante lambda humana. El plásmido de expresión resultante se denominó pM2_h_Iglambda2_MOR04357_co.
C. Expresión transitoria y purificación de IgG humana
Las células eucariotas HKB11 se transfectaron con una cantidad equimolar de ADN del vector de expresión de cadena ligera y pesada de IgG. El sobrenadante del cultivo celular se recogió de 3 a 7 días después de la transfección. Después de ajustar el pH del sobrenadante a 8,0 y filtración estéril, la solución se sometió a cromatografía de afinidad con proteína A convencional (rProteinA FF o MabSelect SURE, GE Healthcare). El intercambio de tampón se realizó a 1 x PBS de Dulbcecco (pH 7,2, Invitrogen) y las muestras se esterilizaron por filtración (0,2 pm). MOR04357 IgG1 se dializó contra 1 x PBS de Dulbcecco (pH 6,5, Invitrogen). La pureza de IgG se analizó en condiciones desnaturalizantes, reductoras en SDS-PAGE o usando Agilent BioAnalyzer y en estado nativo por SE-HPLC.
D. Determinación de las afinidades picomolares usando la titulación de equilibrio de la solución (SET)
Para la determinación de Kd, se usaron las fracciones de monómero (al menos el 90 % de contenido de monómero, analizado por SEC analítica; Superdex75, Amersham Pharmacia) de IgG1. La determinación de afinidad basada en electroquimioluminiscencia (ECL) en solución y la evaluación de datos se realizaron básicamente como se describe por Haenel et al., 2005 y como se describe en el Ejemplo 4B. Se determinó que los valores de Kd para MOR04357 IgG1 contra GM-CSF recombinante humano eran 1,1 pM.
E. Determinación de las afinidades con GM-CSF de rata usando la titulación de equilibrio de la solución (SET)
La determinación de la afinidad con GM-CSF de rata se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 4D usando GM-CSF de rata (Peprotech) como analito en solución en lugar de GM-CSF humano. Las afinidades se calcularon de acuerdo con Haenel et al (2005). Se determinó que el valor de Kd para el MOR04357 IgG 1 contra GM-CSF recombinante de rata eran 130 pM.
Ejemplo 7: Caracterización de MOR04357 IgG1 derivada de Fab GM-CSF antihumanos optimizados
A. Inhibición de la proliferación dependiente de GM-CSF de TF-1 por IgG anti-hGM-CSF usando GM-CSF humano y de macaco
El ensayo de proliferación de TF-1 se realizó como se describe en el Ejemplo 3B. Se analizó MOR04357 en formato IgG1 y como control se analizaron IgG monoclonales de referencia. Los valores de CI50 se determinaron a partir de las curvas de respuesta a la dosis obtenidas usando el software GraphPad Prism v3.03 aplicando un ajuste de curva de regresión no lineal. La Tabla 8 resume los valores de CI50 obtenidos en estos ensayos. En este ensayo se usaron tres variantes diferentes de GM-CSF: En primer lugar, GM-CSF humano recombinante a una concentración de 0,25 ng/ml, producido en E. coli, en segundo lugar, sobrenadante de cultivo de HEK293 que se transfectó transitoriamente con pcDNA-huGM-CSF (véase el Ejemplo 3A), que contiene GM-CSF humano recombinante y, en tercer lugar, sobrenadante de cultivo de células HEK293 que se han transfectado transitoriamente con pcDNA-macGM-CSF (véase el Ejemplo 3A), que contiene GM-CSF recombinante de Macaca mulata (macaco). Para los ensayos de proliferación de TF-1, los sobrenadantes del cultivo HEK293 se usaron como fuente del GM-CSF respectivo en diluciones tales que las células TF-1 mostraron una proliferación similar en comparación con la proliferación administrada a la concentración definida de 0,25 ng/ml de GM-CSF recombinante humano purificado producido en E. coli.
Tabla 8: Valores de CI50 de MOR04357 IgG e IgG de control en el ensayo de proliferación TF-1 CI50 (pm) GM-CSF humano (E.coli) GM-CSF humano (HEK293) GM-CSF de macaco (HEK293) MOR04357 IgG 1 48 11 15 21C11 1668 144 128 Mab215 625 54 190 Este experimento demostró las grandes mejoras logradas en los valores de CI50 después de la maduración por afinidad y la clonación X se conservaron después de la conversión del formato Fab a IgG1. IgG1 MOR04357 muestra valores de CI50 mejorados > 2000 veces en comparación con Fab MOR03929 y superan la potencia de BVD2-21C11 y Mab215.
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Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo IgG1 humano aislado que comprende una región de unión a antígeno que es específica para GM-CSF que comprende
(i) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable de
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVS
GlENKYAGGATYYAASVKGRFTlSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARG
FGTD F WGQ GTLVT VSS;
y
(ii) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable de
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGKKYAYWYQQKPGQAPVLVIYKKRPS
GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCSAWGDKGMVFGGGTKLTV
LGQ.
2. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo como se define en la reivindicación 1 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo.
3. La composición farmacéutica como se define en la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.
4. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha enfermedad inflamatoria se toma de la lista de artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, psoriasis, asma y dermatitis atópica.
5. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en donde dicha enfermedad inflamatoria es artritis reumatoide.
6. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en donde dicha enfermedad inflamatoria es dermatitis atópica.
7. Un anticuerpo como se define en la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.
8. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha enfermedad inflamatoria se toma de la lista de artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, psoriasis, asma y dermatitis atópica.
9. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde la enfermedad inflamatoria es artritis reumatoide.
10. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde la enfermedad inflamatoria es dermatitis atópica.
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