KR101306892B1 - 유전자 전달 효율이 향상된 신규의 합성 펩타이드 및 이를 이용한 유전자 전달방법 - Google Patents
유전자 전달 효율이 향상된 신규의 합성 펩타이드 및 이를 이용한 유전자 전달방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101306892B1 KR101306892B1 KR1020110033419A KR20110033419A KR101306892B1 KR 101306892 B1 KR101306892 B1 KR 101306892B1 KR 1020110033419 A KR1020110033419 A KR 1020110033419A KR 20110033419 A KR20110033419 A KR 20110033419A KR 101306892 B1 KR101306892 B1 KR 101306892B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gene
- peptide
- gene transfer
- arg
- lys
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
- A61K47/6455—Polycationic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. for complexing nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 HIV(human immunodeficiency virus)의 Tat 또는 NLS(nuclear localization sequence)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 신규의 유전자 전달 펩타이드, 이를 포함한 유전자 전달 복합체 및 이를 이용한 유전자 전달 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 합성된 신규의 유전자 전달 펩타이드는 세포투과 단백질의 특정 서열을 포함하여 세포 또는 조직 내로의 유전자 전달 능력을 높일 수 있는 바, 유전자 전달체로서 널리 활용될 수 있다.
본 발명에서 합성된 신규의 유전자 전달 펩타이드는 세포투과 단백질의 특정 서열을 포함하여 세포 또는 조직 내로의 유전자 전달 능력을 높일 수 있는 바, 유전자 전달체로서 널리 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 HIV(human immunodeficiency virus)의 Tat 또는 NLS(nuclear localization sequence)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 신규의 유전자 전달 펩타이드, 이를 포함한 유전자 전달 복합체 및 이를 이용한 유전자 전달 방법에 관한 것이다.
1990년대 초반부터 포스트게놈(post-genome) 시대를 맞아 질병의 원인 및 기전에 대한 연구를 비롯하여 유전자 치료제에 대한 연구가 활발히 진행되면서, 유전자들을 세포 또는 조직 내로 전달하는 전달체에 대한 개발이 절실히 요구되고 있다. 유전자 전달체는 치료용 유전자를 원하는 세포 또는 조직 내로 효율적으로 전달해야 하고, 독성이 없어야 하고, 면역반응을 유발하지 아니하면서도 임상적 적용을 위한 대량생산이 가능해야 한다.
일반적으로 유전자 전달체는 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터로 나누어진다. 바이러스성 벡터로는 레트로 바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), AAV(adeno-associated virus), 렌티바이러스(lentivirus), 백시나바이러스(vaccina virus) 등이 있는데 이들은 유전자 전달 효율은 높으나, 전달 가능한 유전자 크기가 제한적이고 대량생산이 어려우며, 무엇보다도 숙주의 염색체 내에 삽입시 돌연변이 가능성 및 염증 유발 가능성이 높아 사용이 매우 제한 적이다(Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49, 807-838, 1995; Yibin Wang et al., Adenovirus technology for gene manipulation anf functional studies. DDT. 5(1), 2000; Kremer et al., Br. Med. Bull. 51, 31-44, 1995).
바이러스성 벡터의 단점을 극복하기 위해 양이온성 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자 물질 또는 양이온성 펩타이드를 이용한 비바이러스성 벡터들이 많이 개발되고 있다. 이러한 비바이러스성 벡터들은 특별한 면역반응이 없어 안전성이 뛰어나고, DNA 크기에 제한 받지 않으며, 대량생산이 가능하다는 장점이 있다(Eur.J.Pharm.Biopharm.50, 101-119, 2000 ; Ch.Garcia-Chaumont et al., Pharmacol. Ther. 76, 151-1601, 2000; Colin W Pouton et al., Adv.Drug Deliv.Rev.46, 187-203, 2001). 전체적으로 양이온을 띠는 비바이러스성 벡터는 DNA의 음이온과 결합하여 비바이러스 벡터와 DNA 분자 복합체를 이룬다. 바이러스 벡터와 DNA 분자 복합체는 여전히 전체적인 양이온을 띠고 있어 음이온계 세포막에 접근하여 지질로 구성된 막의 구조를 불안정하게 하면서 융합되어 세포안으로 들어감으로써 유전자 전달을 일으키게 된다. 그러나 이러한 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 비해 전달효율이 낮고, 세포주 종류에 따라 세포 내 전달효율이 일정하지 않으며, 세포막에 손상을 입혀 독성을 나타내는 문제점이 있다( Amarnath Sharma et al., International journal of pharmaceutics, 154, 123-140, 1997 ; Saghir Akhtar et al., Adv.Drug Deliv.Rev. 44, 3-21, 2000). 따라서 비바이러스성 벡터의 이와 같은 문제점을 보완 및 개선하여 유전자 전달 효율을 높인 비바이러스성 벡터 개발이 요구되며, 이러한 비바이러스성 벡터가 개발되는 경우 임상적 유용성이 매우 커 유전자 치료제 개발을 한층 앞당길 수 있게 될 것이다.
이러한 요구에 따라 비바이러스 벡터의 전달효율을 높이고자 단백질 전달체를 이용하는 연구가 활발하게 진행 중이다. 단백질 전달체는 세포투과능이 우수한 단백질 도입부위(Protein Transduction Domain, PTD)를 이용하는 것인데, 현재까지 알려진 단백질 도입부위는 초파리(Drosophila)기원의 Antp, HIV(human immunodeficiency virus)기원의 Tat, HSV(herpes simplex virus)기원의 VP22등이 있다. 작은 단백질 부분인 PTD는 세포 외부의 특별한 수용체와의 상호작용 없이 세포막을 통과하여 핵까지 단백질 또는 펩타이드를 운반할 수 있는 물질로 보고되고 있으며(Ford, K.G. et al., Gene Ther. 8, 1-4, 2001), 최근에는 양이온을 띠는 PTD가 음이온의 DNA와 상호작용 하여 비바이러스성 벡터의 세포내 이입을 촉진하고 DNA를 세포내 핵으로 전달 함으로써 유전자 전달효율을 높이는 것으로 알려져 있다(Gratton J.P.et al., Nature Medicine. 9(3), 357-362, 2003 ; Ignatovich IA et al., J.Biol Chem. 278(43), 42625-36, 2003). 이러한 PTD 의 유용성에 기반하여 DNA 음이온과 잘 결합할 수 있는 양이온성 합성 펩타이드에 대한 연구도 진행되고 있다.
그러나 아직까지 다양한 세포주에 광범위한 전달 효율을 주는 단백질 전달체는 개발되지 아니하였으며, 보다 효율적인 세포투과 단백질을 찾아내 인공적으로 합성한 단백질 전달체를 개발하여 전달 효율을 높일 수 있는 방법에 대한 연구가 요구되는 실정이다.
이에 본 발명자들은 유전자 전달 효율을 높일 수 있는 신규 펩타이드를 개발하기 위하여 연구 노력한 결과 기존에 알려진 세포 투과 펩타이드인 HIV(human immunodeficiency virus)의 Tat 또는 NLS(nuclear localization sequence)로부터 유래된 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하여 인위적으로 합성한 고리형 또는 사슬형의 신규 펩타이드가 우수한 유전자 전달 효율을 나타내는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 유전자를 세포 또는 조직 내로 효율적으로 전달할 수 있는 신규의 합성 펩타이드 및 이를 포함하는 유전자 전달 복합체를 제공하는 데 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 상기 펩타이드를 이용하여 세포 또는 조직 내로 유전자를 전달하는 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HIV(human immunodeficiency virus)의 Tat 또는 NLS(nuclear localization sequence)로부터 유래된 하기 표 1에 나타난 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 유전자 전달 펩타이드를 제공한다.
서열번호 | 서열 |
1 | Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln |
2 | Gly-Tyr-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gly-Gly |
또한, 본 발명은 상기 유전자 전달 펩타이드에 전달하고자 하는 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 전달 펩타이드를 이용하여 세포 또는 조직 내로 유전자를 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 합성된 신규의 유전자 전달 펩타이드는 세포투과 단백질의 특정 서열을 포함하여 세포 또는 조직 내로의 유전자 전달 능력을 높일 수 있는 바, 유전자 전달체로서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 DNA : 펩타이드(Tat, NLS, ATP-PEP2, ATP-PEP3, ATP-PEP5 또는 ATP-PEP7) : 리포좀의 전하비가 1 : 3 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 루시퍼라제 활성을 비교한 그래프이다.
도 2는 DNA : 펩타이드(Tat, NLS, ATP-PEP2, ATP-PEP3, ATP-PEP5 또는 ATP-PEP7) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 루시퍼라제 활성을 비교한 그래프이다.
도 3은 DNA와 리포좀의 전하비가 1 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체와 DNA : 펩타이드(Tat) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다.
도 4는 DNA : 펩타이드(NLS 또는 ATP-PEP2) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다.
도 5는 DNA : 펩타이드(ATP-PEP3 또는 ATP-PEP5) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다.
도 6은 DNA : 펩타이드(ATP-PEP7) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다.
도 2는 DNA : 펩타이드(Tat, NLS, ATP-PEP2, ATP-PEP3, ATP-PEP5 또는 ATP-PEP7) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 루시퍼라제 활성을 비교한 그래프이다.
도 3은 DNA와 리포좀의 전하비가 1 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체와 DNA : 펩타이드(Tat) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다.
도 4는 DNA : 펩타이드(NLS 또는 ATP-PEP2) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다.
도 5는 DNA : 펩타이드(ATP-PEP3 또는 ATP-PEP5) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다.
도 6은 DNA : 펩타이드(ATP-PEP7) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 HIV(human immunodeficiency virus)의 Tat 또는 NLS(nuclear localization sequence)에서 유래된 아미노산 서열을 기본 서열로 하여 N- 또는 C- 말단에 특정 아미노산 서열을 부가함으로써 고리형 또는 사슬형의 신규 펩타이드를 합성하고 이를 세포 또는 조직 내의 유전자의 전달에 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 유전자 전달 펩타이드는 86개의 아미노산을 가지고 있는 HIV의 Tat 단백질에서 2개의 라이신(Lysine)과 6개의 아르기닌(Arginine)을 포함하는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 핵 내로의 이동을 촉진하는 12개의 아미노산으로 이루어진 NLS 서열인 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 유전자 전달 펩타이드는 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 기본 서열로 하여, N-말단과 C-말단에 몇몇 다른 특성의 아미노산을 부가하여 고리형 또는 사슬형의 구조를 가지게 된다.
구체적으로 상기 유전자 전달 펩타이드는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
Ya-Xb-Cys-Cys-Xc-Yd
상기 화학식에서,
X는 서열번호 1의 아미노산 서열을 나타내고,
Y는 서열번호 2의 아미노산 서열을 나타내며,
n, m, a, b, c 및 d는 각각 0 ~ 2의 정수이나, n 및 m은 동시에 0이 아니며, a, b, c 및 d는 동시에 0이 아니다.
이때, 상기 X 또는 Y의 아미노산 서열은 그 말단의 위치에 따라 정방향 또는 역방향으로 연결될 수 있다.
보다 구체적으로 상기 유전자 전달 펩타이드는 하기 표 2와 같은 서열로 나타날 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
서열번호 | 명칭 | 서열 |
3 | APT-PEP1 | |
4 | APT-PEP2 | Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln-Cys-Cys-Gln-Pro-Pro-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg |
5 | APT-PEP3 | Gln-Pro-Pro-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln |
6 | APT-PEP4 | |
7 | APT-PEP5 | Gly-Tyr-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gly-Gly-Cys-Cys-Gly-Gly-Val-Lys-Arg-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Tyr-Gly |
8 | APT-PEP6 | Gly-Gly-Val-Lys-Arg-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Tyr-Gly-Cys-Cys-Gly-Tyr-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gly-Gly |
9 | APT-PEP7 | Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln-Cys-Cys-Gly-Tyr-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gly-Gly |
10 | APT-PEP8 | Gly-Tyr-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gly-Gly-Cys-Cys-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln |
또한 본 발명은 상기 유전자 전달 펩타이드에 전달하고자 하는 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를 제공하는데 특징이 있다.
상기 유전자 전달 펩타이드에 DNA 또는 RNA와 결합시켜 유전자 전달 복합체를 제조할 경우, 세포막 투과와 엔도좀 탈출 및 핵내 이동을 촉진하는 특성을 가지므로 우수한 유전자 전달 효과를 나타낸다.
또한 상기 유전자 전달 복합체는 양이온 리포좀을 더 포함하여 삼중 복합체의 형태로 나타날 수 있다. 상기 양이온 리포좀은 당업계에서 통상적으로 사용되는 리포펙타민(Lipofectamine), 리포펙타민2000(Lipofectamine2000), DOTAP : DOPE(1:1) 혼성체, 리포펙틴(Lipofectin), 올리고펙틴(Oligofectin)등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 리포펙타민을 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 펩타이드를 이용한 세포 또는 조직 내로의 유전자 전달은 상기 신규한 펩타이드에 전달하고자 하는 DNA 또는 RNA를 혼합하여 복합체를 제조한 후, 상기 복합체를 DNA 또는 RNA를 전달하고자 하는 세포와 혼합하여 함께 배양하거나, 조직에 주입함으로써 이루어질 수 있으며, 보다 바람직하게는 양이온 리포좀을 혼합함으로써 삼중 복합체를 제조하여 배양 또는 주입하는 것이 좋다. 상기 펩타이드, DNA 또는 RNA, 및 양이온 리포좀의 혼합순서는 필요에 따라 변경될 수 있다.
또한 상기 유전자 전달 복합체에서 펩타이드, DNA 또는 RNA와 같은 핵산체 및 양이온 리포좀의 혼합 비율은 효과적으로 유전자를 전달하기 위한 목적을 고려하여, 상기 핵산체, 펩타이드 및 리포좀이 1 : 2 ~ 8 : 3 ~ 10의 전하비로 혼합되는 것이 가장 바람직하다.
또한 본 발명에서 전달 대상이 되는 유전자는 그 크기(size)와 형태에 상관없이 사용될 수 있으나, 올리고뉴클레오타이드 형태의 DNA 인 경우에는 15 ~ 120 bases 크기의 핵산체를 사용하는 것이 바람직하고, 플라스미드 벡터 형태의 DNA인 경우에는 3 ~ 8 kb 크기인 것이 바람직하다.
본 발명의 하기 실시예에서는 루시퍼라제(Luciferase) 또는 GFP(green fluorecence protein) 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 사용하여 MCF-7 세포에서 유전자의 발현량을 측정함으로써 펩타이드의 세포 내 전달 효율의 향상을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 신규한 펩타이드의 제작
HIV(human immunodeficiency virus)의 Tat 또는 NLS(nuclear localization sequence)로부터 유래된 아미노산 서열을 기본 서열(서열번호 1 및 2)로 하여 N 또는 C 말단에 특정 아미노산 서열을 부가함으로써 서열번호 3 내지 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 신규 펩타이드를 합성하였다. 이 때 상기 펩타이드는 당업계에 알려진 유기합성법에 따라 합성하였다.
이 후 C18 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 후, HPLC(Shimadzu Prominence) 또는 LC/MSD(HP 1100)을 이용하여 순도 및 분자량을 측정하였으며, 하기 표 3과 같이 90% 이상의 순도 및 분자량을 나타내는 것을 확인하였다.
서열번호 | 이름 | HPLC 순도(%) | MS |
3 | APT-PEP1 | 99.8 | 1865.03 |
4 | APT-PEP2 | 95.4 | 3526.08 |
5 | APT-PEP3 | 95.6 | 3526.08 |
6 | APT-PEP4 | 95.1 | 1477.76 |
7 | APT-PEP5 | 99.9 | 2751.54 |
8 | APT-PEP6 | 99.8 | 2751.54 |
9 | APT-PEP7 | 90.8 | 3122.80 |
10 | APT-PEP8 | 91.0 | 3122.80 |
실시예 2 : 유전자 전달 복합체 제작 및 DNA 전달 효율
2-1 : 세포 및 세포배양
본 실시예에서는 MCF-7(breast cancer cell line)를 사용하였다. 세포주의 배양액은 RPMI 1640 (Welgene, Korea)이며, 배양액에 10% heat-inactivated FBS (Welgene)와 2 mM L-글루타민e, 100 units/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신streptomycin (Welgene)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂세포 배양기에서 배양하였다. 실험에 사용된 모든 세포는 배양 과정에서 적정한 세포 농도를 유지하도록 유의하였으며, 실험에 사용될 세포는 전날 신선한 배양액으로 교체한 후 사용하였다.
2-2 : 리포터 플라스미드 벡터 (Reporter plasmid vector)의 제작
루시퍼라제(Luciferase) 또는 GFP(green fluorecence protein) 유전자를 각각 포함하는 재조합 플라스미드(pcDNA-Luc, pCMVTnT-CFP)를 XL1-Blue E. Coli 를 사용하여 증식시킨 후 maxi-kit(Qiagen Inc., USA)으로 분리하여 사용하였다(문헌; J. Microbiol. Biotechnol. (2011), 21(1), 93-99 Synthesis and Optimization of Cholesterol-Based Diquaternary Ammonium Gemini Surfactant (Chol-GS) as a New Gene Delivery Vector).
2-3 : 핵산체, 펩타이드 및 양이온 리포좀 복합체의 형성
핵산체로서 상기 리포터 플라스미드 pcDNA3 벡터와 상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드(Tat, NLS 포함), 그리고 양이온 리포좀으로서 리포펙타민(Lipofectamine)을 사용하여 유전자 전달 복합체를 제조하였다. 상기 유전자 전달 복합체는 혈청이 없는 TOM 배지(Welgene)에서 제작하였으며, 이 때 0.3 ㎍/well (48-well plate) DNA를 다양한 양의 펩타이드 및 리포좀과 혼합하였다.
혼합 시, 먼저 리포터 플라스미드 pcDNA3 벡터와 펩타이드를 혼합하여 상온에서 10분간 방치한 후, 양이온 리포좀과 혼합하여 상온에서 15분간 더 반응시켜 최종적으로 유전자 전달 복합체를 얻었으며, DNA : 펩타이드 : 리포좀의 전하비가 1 : 3 : 5 및 1 : 5 : 5가 되도록 조절하였다.
한편 대조구로는 상기 펩타이드를 혼합하지 아니하고, 리포터 플라스미드와 양이온 리포좀만을 혼합한 복합체를 제조하여 비교 실험을 진행하였다.
2-4 : 유전자 전달 복합체의 트랜스펙션(Transfection)
실험 하루 전날 배양된 MCF-7 세포주를 세포수가 월(well) 당 3 x 104 cells이 되도록 48-웰 플레이트에 분주하였다. 세척과정을 거친 세포에 TOM media로 치환한 후, 상기 유전자 전달 복합체를 처리하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰으며, 그 다음 20% FBS가 첨가된 배지를 첨가하여 20시간 동안 추가 배양하였다.
2-5 : 유전자 전달 복합체의 전달 효율
루시퍼라제(Luciferase) 활성은 하기와 같이 측정되었다. 상기 트랜스팩션된 세포들을 PBS 완충액으로 2번 세척하고, 100 ㎕의 1ㅧ CCLR (cell culture lysis reagent, 25 mM Tris-phosphate (pH 7.8), 2 mM DTT, 2 mM 1,2- diaminocyclohexane-N'N'N'-tetraacetic acid, 10% glycerol, 1% Triton X-100) 용액으로 용해시켰다. 이를 통하여 얻은 세포 용해액을 12,000 g에서 1분간 원심분리한 후, BCATM Protein Assay (PIERCE, USA)로 단백질 정량하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 상기 세포 용해액에 루시퍼라제 분석 버퍼(25 mM Glycylglycine pH7.8, 15 mM Potassium Phosphate pH7.8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 2 mM ATP, 1 mM DTT)를 100 ㎕ 가한 후, 20 ㎕의 루시퍼린(luciferin)을 첨가하였다. 루시퍼라제 활성은 형광 루미노메터(Luminometer, Berthold Detection Systems, Germany)로 10초간 측정하였으며, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
한편, GFP의 검출은 세포주룰 PBS 완충액으로 2번 세척한 후, 형광 도립현미경으로 세포 내 GFP 유전자 발현 양상을 확인함으로써 이루어졌다. 형광 도립현미경을 통한 유전자 발현 양상을 도 3 내지 6에 나타내었다.
상기 도 1 내지 6에서 보는 바와 같이, 각 성분의 혼합 비율에 따라 루시퍼라제 활성이나, GFP 유전자 발현 양상의 미미한 차이가 있으나, 모두 펩타이드가 포함되지 아니한 대조군에 비하여 현저하게 우수한 활성을 나타내었다. 결국 상기 실험 결과를 통하여 상기 유전자 전달 복합체가 우수한 세포 내로의 DNA 전달 능력이 있음을 확인할 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (8)
- HIV(human immunodeficiency virus)의 NLS(nuclear localization sequence)로부터 유래된 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 펩타이드.
- 제 1 항에 있어서, 서열번호 6 내지 10 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 나타나는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 펩타이드.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중에서 선택된 어느 한 항의 펩타이드에 전달하고자 하는 유전자가 결합된 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
- 제 4 항에 있어서, 상기 유전자는 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
- 제 4 항에 있어서, 상기 복합체는 양이온 리포좀을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
- 제 6 항에 있어서, 상기 유전자의 핵산체, 펩타이드 및 리포좀이 1 : 2 ~ 8 : 3 ~ 10 의 전하비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 복합체.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중에서 선택된 어느 한 항의 펩타이드에 전달하고자 하는 유전자를 결합하여 유전자 전달 복합체를 제조하는 단계; 및
상기 유전자 전달 복합체를 세포 또는 조직 내로 주입하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물에 유전자를 전달하는 방법.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020110033419A KR101306892B1 (ko) | 2011-04-11 | 2011-04-11 | 유전자 전달 효율이 향상된 신규의 합성 펩타이드 및 이를 이용한 유전자 전달방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020110033419A KR101306892B1 (ko) | 2011-04-11 | 2011-04-11 | 유전자 전달 효율이 향상된 신규의 합성 펩타이드 및 이를 이용한 유전자 전달방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20120115850A KR20120115850A (ko) | 2012-10-19 |
KR101306892B1 true KR101306892B1 (ko) | 2013-09-10 |
Family
ID=47284394
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020110033419A KR101306892B1 (ko) | 2011-04-11 | 2011-04-11 | 유전자 전달 효율이 향상된 신규의 합성 펩타이드 및 이를 이용한 유전자 전달방법 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101306892B1 (ko) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100468316B1 (ko) * | 2002-01-29 | 2005-01-27 | 주식회사 웰진 | Dna의 세포 또는 조직 내 전달 효율을 높이는 펩타이드 |
-
2011
- 2011-04-11 KR KR1020110033419A patent/KR101306892B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100468316B1 (ko) * | 2002-01-29 | 2005-01-27 | 주식회사 웰진 | Dna의 세포 또는 조직 내 전달 효율을 높이는 펩타이드 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Eric Viv?s 등. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 272, No. 25, 페이지 16010-16017 (1997.) |
Eric Vives 등. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 272, No. 25, 페이지 16010-16017 (1997.) * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20120115850A (ko) | 2012-10-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8569065B2 (en) | Compositions and methods for the delivery of biologically active RNAs | |
Dohmen et al. | Nanosized multifunctional polyplexes for receptor-mediated siRNA delivery | |
EP1991560B1 (en) | Peptide having cell membrane penetrating activity | |
Li et al. | Delivery of intracellular-acting biologics in pro-apoptotic therapies | |
Gagat et al. | Cell-penetrating peptides and their utility in genome function modifications | |
KR20140137455A (ko) | 인공 핵산 분자 | |
US20130123199A1 (en) | Protein complex for intracellular delivery and uses thereof | |
US20220040329A1 (en) | Inducible expression cassette, and uses thereof | |
EP2916874A1 (en) | Nanocomplex containing cationic peptide for biomolecule delivery | |
KR20140123054A (ko) | 생물학적 활성 rna의 전달을 위한 조성물 및 방법 | |
US10799542B2 (en) | Tetrafunctional bacteriophage | |
KR101306892B1 (ko) | 유전자 전달 효율이 향상된 신규의 합성 펩타이드 및 이를 이용한 유전자 전달방법 | |
ES2526109A2 (es) | Péptido y composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer | |
JP5738862B2 (ja) | 細胞への核酸導入方法および核酸複合体 | |
US20180127776A1 (en) | Ligand Matched Transcription Control, Control Devices, and Solute Carriers | |
KR101448800B1 (ko) | 핵산 전달 복합체 | |
KR102421608B1 (ko) | 유전자 전달을 위한 신규의 융합 펩타이드 | |
KR102603739B1 (ko) | 암 특이적 핵산 분자 전달용 조성물 및 그 용도 | |
Maity et al. | Intrinsically Disordered Ku Protein-Derived Cell-Penetrating Peptides | |
KR101595152B1 (ko) | Tctp-ptd를 포함하는 유전자 전달체 | |
Upadhya et al. | A Cell Penetrating Peptide, MTS-AR8, for Transfection of 4T1 Murine Breast Cancer Cells | |
Zinovyeva et al. | Recombinant Histones as an Instrument for the Delivery of Nucleic Acids into Eukaryotic Cells | |
US20220073587A1 (en) | Recombinant human 2ig-b7-h3 protein coding gene, recombinant vector, host cell comprising the same, pharmaceutical composition and use thereof | |
US8216843B2 (en) | Artificially synthesized peptide | |
KR100631488B1 (ko) | 단백질 도입부위 및 막활성화 부위가 함유된 새로운 합성펩타이드 및 이를 이용한 유전자 전달 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170831 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180828 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190905 Year of fee payment: 7 |