KR101306892B1 - Novel synthetic peptides improving efficiency of gene delivery and method for delivering gene using them - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HIV(human immunodeficiency virus)의 Tat 또는 NLS(nuclear localization sequence)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 신규의 유전자 전달 펩타이드, 이를 포함한 유전자 전달 복합체 및 이를 이용한 유전자 전달 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 합성된 신규의 유전자 전달 펩타이드는 세포투과 단백질의 특정 서열을 포함하여 세포 또는 조직 내로의 유전자 전달 능력을 높일 수 있는 바, 유전자 전달체로서 널리 활용될 수 있다.The present invention relates to a novel gene transfer peptide comprising an amino acid sequence derived from Tat or NLS (nuclear localization sequence) of human immunodeficiency virus (HIV), a gene transfer complex including the same, and a gene transfer method using the same.
The novel gene transfer peptide synthesized in the present invention can increase the gene transfer ability into cells or tissues, including specific sequences of cell permeation proteins, and can be widely used as gene carriers.
Description
본 발명은 HIV(human immunodeficiency virus)의 Tat 또는 NLS(nuclear localization sequence)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 신규의 유전자 전달 펩타이드, 이를 포함한 유전자 전달 복합체 및 이를 이용한 유전자 전달 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel gene transfer peptide comprising an amino acid sequence derived from Tat or NLS (nuclear localization sequence) of human immunodeficiency virus (HIV), a gene transfer complex including the same, and a gene transfer method using the same.
1990년대 초반부터 포스트게놈(post-genome) 시대를 맞아 질병의 원인 및 기전에 대한 연구를 비롯하여 유전자 치료제에 대한 연구가 활발히 진행되면서, 유전자들을 세포 또는 조직 내로 전달하는 전달체에 대한 개발이 절실히 요구되고 있다. 유전자 전달체는 치료용 유전자를 원하는 세포 또는 조직 내로 효율적으로 전달해야 하고, 독성이 없어야 하고, 면역반응을 유발하지 아니하면서도 임상적 적용을 위한 대량생산이 가능해야 한다. In the post-genome era since the early 1990s, research into gene therapy products, including the causes and mechanisms of diseases, has been actively conducted, and there is an urgent need for the development of transporters that transfer genes into cells or tissues. have. Gene carriers must efficiently deliver therapeutic genes into desired cells or tissues, must be non-toxic and capable of mass production for clinical applications without inducing an immune response.
일반적으로 유전자 전달체는 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터로 나누어진다. 바이러스성 벡터로는 레트로 바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), AAV(adeno-associated virus), 렌티바이러스(lentivirus), 백시나바이러스(vaccina virus) 등이 있는데 이들은 유전자 전달 효율은 높으나, 전달 가능한 유전자 크기가 제한적이고 대량생산이 어려우며, 무엇보다도 숙주의 염색체 내에 삽입시 돌연변이 가능성 및 염증 유발 가능성이 높아 사용이 매우 제한 적이다(Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49, 807-838, 1995; Yibin Wang et al., Adenovirus technology for gene manipulation anf functional studies. DDT. 5(1), 2000; Kremer et al., Br. Med. Bull. 51, 31-44, 1995).Genetic carriers are generally divided into viral and nonviral vectors. Viral vectors include retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, lentiviruses, and vaccina viruses. The genes are limited in size and difficult to mass-produce, and above all, their use is very limited due to the high possibility of mutation and inflammation when inserted into the chromosome of the host (Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49, 807-838, 1995; Yibin Wang et al., Adenovirus technology for gene manipulation anf functional studies.DDT. 5 (1), 2000; Kremer et al., Br. Med. Bull. 51, 31-44, 1995).
바이러스성 벡터의 단점을 극복하기 위해 양이온성 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자 물질 또는 양이온성 펩타이드를 이용한 비바이러스성 벡터들이 많이 개발되고 있다. 이러한 비바이러스성 벡터들은 특별한 면역반응이 없어 안전성이 뛰어나고, DNA 크기에 제한 받지 않으며, 대량생산이 가능하다는 장점이 있다(Eur.J.Pharm.Biopharm.50, 101-119, 2000 ; Ch.Garcia-Chaumont et al., Pharmacol. Ther. 76, 151-1601, 2000; Colin W Pouton et al., Adv.Drug Deliv.Rev.46, 187-203, 2001). 전체적으로 양이온을 띠는 비바이러스성 벡터는 DNA의 음이온과 결합하여 비바이러스 벡터와 DNA 분자 복합체를 이룬다. 바이러스 벡터와 DNA 분자 복합체는 여전히 전체적인 양이온을 띠고 있어 음이온계 세포막에 접근하여 지질로 구성된 막의 구조를 불안정하게 하면서 융합되어 세포안으로 들어감으로써 유전자 전달을 일으키게 된다. 그러나 이러한 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 비해 전달효율이 낮고, 세포주 종류에 따라 세포 내 전달효율이 일정하지 않으며, 세포막에 손상을 입혀 독성을 나타내는 문제점이 있다( Amarnath Sharma et al., International journal of pharmaceutics, 154, 123-140, 1997 ; Saghir Akhtar et al., Adv.Drug Deliv.Rev. 44, 3-21, 2000). 따라서 비바이러스성 벡터의 이와 같은 문제점을 보완 및 개선하여 유전자 전달 효율을 높인 비바이러스성 벡터 개발이 요구되며, 이러한 비바이러스성 벡터가 개발되는 경우 임상적 유용성이 매우 커 유전자 치료제 개발을 한층 앞당길 수 있게 될 것이다.In order to overcome the disadvantages of viral vectors, many non-viral vectors using cationic liposomes, cationic polymers or cationic peptides have been developed. These non-viral vectors have no special immune response, which is excellent in safety, unrestricted in DNA size, and capable of mass production (Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 101-119, 2000; Ch. Garcia Chaumont et al., Pharmacol. Ther. 76, 151-1601, 2000; Colin W Pouton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 46, 187-203, 2001). Totally cationic nonviral vectors bind to the anions of the DNA to form a DNA molecule complex with the nonviral vector. The viral vector and the DNA molecule complex still carry a whole cation, which approaches the anionic cell membrane and destabilizes the membrane's structure of lipids, fused into the cell, causing gene delivery. However, these non-viral vectors have lower delivery efficiency than viral vectors, and the intracellular delivery efficiency is not constant according to the cell line type, and there is a problem of damaging the cell membrane and showing toxicity (Amarnath Sharma et al., International journal of pharmaceutics, 154, 123-140, 1997; Saghir Akhtar et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 44, 3-21, 2000). Therefore, it is necessary to develop non-viral vectors that improve gene transfer efficiency by supplementing and improving these problems of non-viral vectors, and if such non-viral vectors are developed, the clinical usefulness is very high, which can accelerate the development of gene therapeutics. Will be.
이러한 요구에 따라 비바이러스 벡터의 전달효율을 높이고자 단백질 전달체를 이용하는 연구가 활발하게 진행 중이다. 단백질 전달체는 세포투과능이 우수한 단백질 도입부위(Protein Transduction Domain, PTD)를 이용하는 것인데, 현재까지 알려진 단백질 도입부위는 초파리(Drosophila)기원의 Antp, HIV(human immunodeficiency virus)기원의 Tat, HSV(herpes simplex virus)기원의 VP22등이 있다. 작은 단백질 부분인 PTD는 세포 외부의 특별한 수용체와의 상호작용 없이 세포막을 통과하여 핵까지 단백질 또는 펩타이드를 운반할 수 있는 물질로 보고되고 있으며(Ford, K.G. et al., Gene Ther. 8, 1-4, 2001), 최근에는 양이온을 띠는 PTD가 음이온의 DNA와 상호작용 하여 비바이러스성 벡터의 세포내 이입을 촉진하고 DNA를 세포내 핵으로 전달 함으로써 유전자 전달효율을 높이는 것으로 알려져 있다(Gratton J.P.et al., Nature Medicine. 9(3), 357-362, 2003 ; Ignatovich IA et al., J.Biol Chem. 278(43), 42625-36, 2003). 이러한 PTD 의 유용성에 기반하여 DNA 음이온과 잘 결합할 수 있는 양이온성 합성 펩타이드에 대한 연구도 진행되고 있다. In response to these demands, studies using protein carriers are being actively conducted to increase the delivery efficiency of nonviral vectors. Protein transporter uses protein transduction domain (PTD) with excellent cell permeability, and currently known protein transduction sites include Antp from Drosophila origin, Tat from HIV (human immunodeficiency virus) origin, and herpes simplex (HSV). virus) originated from VP22. A small protein part, PTD, has been reported as a substance that can transport proteins or peptides through the cell membrane to the nucleus without interaction with special receptors outside the cell (Ford, KG et al., Gene Ther. 8, 1- 4, 2001) Recently, cationized PTDs have been known to enhance the gene transfer efficiency by interacting with the anionic DNA to promote the endocytosis of nonviral vectors and transfer the DNA into the intracellular nucleus (Gratton JP). et al., Nature Medicine. 9 (3), 357-362, 2003; Ignatovich IA et al., J. Biol Chem. 278 (43), 42625-36, 2003). Based on the usefulness of PTD, studies on cationic synthetic peptides that can bind well with DNA anions are also underway.
그러나 아직까지 다양한 세포주에 광범위한 전달 효율을 주는 단백질 전달체는 개발되지 아니하였으며, 보다 효율적인 세포투과 단백질을 찾아내 인공적으로 합성한 단백질 전달체를 개발하여 전달 효율을 높일 수 있는 방법에 대한 연구가 요구되는 실정이다.
However, protein carriers that give a wide range of delivery efficiencies to various cell lines have not yet been developed.However, studies on methods for improving the delivery efficiency by developing more efficient cell permeation proteins and developing artificially synthesized protein carriers are required. to be.
이에 본 발명자들은 유전자 전달 효율을 높일 수 있는 신규 펩타이드를 개발하기 위하여 연구 노력한 결과 기존에 알려진 세포 투과 펩타이드인 HIV(human immunodeficiency virus)의 Tat 또는 NLS(nuclear localization sequence)로부터 유래된 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하여 인위적으로 합성한 고리형 또는 사슬형의 신규 펩타이드가 우수한 유전자 전달 효율을 나타내는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. Therefore, the present inventors have made efforts to develop a novel peptide that can improve gene transfer efficiency, and as a result, SEQ ID NO: 1 or 2 derived from Tat or NLS (human clear localization sequence) of HIV (human immunodeficiency virus), a known cell-penetrating peptide The present invention has been completed by discovering that artificially synthesized cyclic or chain-type novel peptides, including the sequence of, exhibit excellent gene transfer efficiency.
따라서 본 발명은 유전자를 세포 또는 조직 내로 효율적으로 전달할 수 있는 신규의 합성 펩타이드 및 이를 포함하는 유전자 전달 복합체를 제공하는 데 그 목적이 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel synthetic peptide and a gene delivery complex comprising the same that can efficiently transfer genes into cells or tissues.
또한 본 발명은 상기 펩타이드를 이용하여 세포 또는 조직 내로 유전자를 전달하는 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
In another aspect, the present invention is to provide a method for delivering a gene into a cell or tissue using the peptide.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HIV(human immunodeficiency virus)의 Tat 또는 NLS(nuclear localization sequence)로부터 유래된 하기 표 1에 나타난 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 유전자 전달 펩타이드를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a gene transfer peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 shown in Table 1 derived from Tat or NLS (nuclear localization sequence) of human immunodeficiency virus (HIV). .
또한, 본 발명은 상기 유전자 전달 펩타이드에 전달하고자 하는 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를 제공한다. The present invention also provides a gene delivery complex in which a gene to be delivered to the gene delivery peptide is bound.
또한, 본 발명은 상기 유전자 전달 펩타이드를 이용하여 세포 또는 조직 내로 유전자를 전달하는 방법을 제공한다.
The present invention also provides a method of delivering a gene into a cell or tissue using the gene transfer peptide.
본 발명에서 합성된 신규의 유전자 전달 펩타이드는 세포투과 단백질의 특정 서열을 포함하여 세포 또는 조직 내로의 유전자 전달 능력을 높일 수 있는 바, 유전자 전달체로서 널리 활용될 수 있다.
The novel gene transfer peptide synthesized in the present invention can increase the gene transfer ability into cells or tissues, including specific sequences of cell permeation proteins, and can be widely used as gene carriers.
도 1은 DNA : 펩타이드(Tat, NLS, ATP-PEP2, ATP-PEP3, ATP-PEP5 또는 ATP-PEP7) : 리포좀의 전하비가 1 : 3 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 루시퍼라제 활성을 비교한 그래프이다.
도 2는 DNA : 펩타이드(Tat, NLS, ATP-PEP2, ATP-PEP3, ATP-PEP5 또는 ATP-PEP7) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 루시퍼라제 활성을 비교한 그래프이다.
도 3은 DNA와 리포좀의 전하비가 1 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체와 DNA : 펩타이드(Tat) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다.
도 4는 DNA : 펩타이드(NLS 또는 ATP-PEP2) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다.
도 5는 DNA : 펩타이드(ATP-PEP3 또는 ATP-PEP5) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다.
도 6은 DNA : 펩타이드(ATP-PEP7) : 리포좀의 전하비가 1 : 5 : 5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다. 1 is a DNA: peptide (Tat, NLS, ATP-PEP2, ATP-PEP3, ATP-PEP5 or ATP-PEP7): transfected with a gene delivery complex prepared by mixing the charge ratio of liposomes 1: 3: 5 It is a graph comparing luciferase activity in MCF-7 cells.
Figure 2 is a DNA: peptide (Tat, NLS, ATP-PEP2, ATP-PEP3, ATP-PEP5 or ATP-PEP7): transfected with a gene delivery complex prepared by mixing the charge ratio of liposomes 1: 5: 5 It is a graph comparing luciferase activity in MCF-7 cells.
3 is a gene delivery complex prepared by mixing the charge ratio of DNA and liposomes 1: 5 and transfected with the gene delivery complex prepared by mixing the charge ratio of DNA: peptide (Tat): liposomes 1: 5: 5. It is a photograph confirming the expression level of GFP (Green Fluorescent Protein) fluorescence in MCF-7 cells.
FIG. 4 shows GFP (Green Fluorescent Protein) fluorescence expression in MCF-7 cells transfected with a gene transfer complex prepared by mixing DNA: peptide (NLS or ATP-PEP2): liposomes with a charge ratio of 1: 5: 5. It is a photograph confirming the degree.
FIG. 5 shows GFP (Green Fluorescent Protein) in MCF-7 cells transfected with a gene transfer complex prepared by mixing DNA: peptide (ATP-PEP3 or ATP-PEP5): liposomes with a charge ratio of 1: 5: 5. It is a photograph confirming the degree of fluorescence expression.
6 shows the degree of GFP (Green Fluorescent Protein) fluorescence expression in MCF-7 cells transfected with a gene delivery complex prepared by mixing DNA: peptide (ATP-PEP7): liposome with a 1: 5: 5 charge ratio. This is a confirmed picture.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 HIV(human immunodeficiency virus)의 Tat 또는 NLS(nuclear localization sequence)에서 유래된 아미노산 서열을 기본 서열로 하여 N- 또는 C- 말단에 특정 아미노산 서열을 부가함으로써 고리형 또는 사슬형의 신규 펩타이드를 합성하고 이를 세포 또는 조직 내의 유전자의 전달에 사용하는 방법에 관한 것이다. The present invention provides a cyclic or chained novel peptide by adding a specific amino acid sequence to the N- or C-terminus based on an amino acid sequence derived from Tat or NLS (nuclear localization sequence) of human immunodeficiency virus (HIV). A method for synthesizing and using this for the delivery of genes in a cell or tissue.
본 발명의 유전자 전달 펩타이드는 86개의 아미노산을 가지고 있는 HIV의 Tat 단백질에서 2개의 라이신(Lysine)과 6개의 아르기닌(Arginine)을 포함하는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 핵 내로의 이동을 촉진하는 12개의 아미노산으로 이루어진 NLS 서열인 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 유전자 전달 펩타이드는 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 기본 서열로 하여, N-말단과 C-말단에 몇몇 다른 특성의 아미노산을 부가하여 고리형 또는 사슬형의 구조를 가지게 된다. The gene transfer peptide of the present invention is an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 including two lysines and 6 arginine in a Tat protein of HIV having 86 amino acids or 12 to facilitate migration into the nucleus. Characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 which is an NLS sequence consisting of amino acids. The gene transfer peptide has a cyclic or chain structure by adding amino acids having several different properties to the N-terminus and the C-terminus based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
구체적으로 상기 유전자 전달 펩타이드는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다. Specifically, the gene transfer peptide is characterized in that represented by the following formula (1).
[화학식 1][Formula 1]
[화학식 2](2)
Ya-Xb-Cys-Cys-Xc-Yd Y a -X b -Cys-Cys-X c -Y d
상기 화학식에서, In the above formulas,
X는 서열번호 1의 아미노산 서열을 나타내고,X represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
Y는 서열번호 2의 아미노산 서열을 나타내며,Y represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
n, m, a, b, c 및 d는 각각 0 ~ 2의 정수이나, n 및 m은 동시에 0이 아니며, a, b, c 및 d는 동시에 0이 아니다. n, m, a, b, c and d are each an integer of 0 to 2, but n and m are not 0 at the same time, and a, b, c and d are not 0 at the same time.
이때, 상기 X 또는 Y의 아미노산 서열은 그 말단의 위치에 따라 정방향 또는 역방향으로 연결될 수 있다. At this time, the amino acid sequence of X or Y may be linked in the forward or reverse direction depending on the position of the terminal.
보다 구체적으로 상기 유전자 전달 펩타이드는 하기 표 2와 같은 서열로 나타날 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. More specifically, the gene transfer peptide may be represented by the sequence shown in Table 2 below, but is not limited thereto.
또한 본 발명은 상기 유전자 전달 펩타이드에 전달하고자 하는 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를 제공하는데 특징이 있다. In another aspect, the present invention is characterized in providing a gene delivery complex in which the gene to be delivered to the gene delivery peptide is bound.
상기 유전자 전달 펩타이드에 DNA 또는 RNA와 결합시켜 유전자 전달 복합체를 제조할 경우, 세포막 투과와 엔도좀 탈출 및 핵내 이동을 촉진하는 특성을 가지므로 우수한 유전자 전달 효과를 나타낸다. When a gene transfer complex is prepared by combining the gene transfer peptide with DNA or RNA, the gene transfer peptide exhibits excellent gene transfer effect since it has properties that promote cell membrane permeation, endosomal escape, and nuclear transfer.
또한 상기 유전자 전달 복합체는 양이온 리포좀을 더 포함하여 삼중 복합체의 형태로 나타날 수 있다. 상기 양이온 리포좀은 당업계에서 통상적으로 사용되는 리포펙타민(Lipofectamine), 리포펙타민2000(Lipofectamine2000), DOTAP : DOPE(1:1) 혼성체, 리포펙틴(Lipofectin), 올리고펙틴(Oligofectin)등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 리포펙타민을 사용하는 것이 좋다.In addition, the gene delivery complex may further include a cationic liposome, which may be in the form of a triple complex. The cationic liposome is a lipofectamine (Lipofectamine), Lipofectamine 2000 (Lipofectamine 2000), DOTAP: DOPE (1: 1) hybrid, Lipofectin, Oligofectin (Oligofectin) and the like commonly used in the art It may be used, but is not limited to this, it is preferable to use lipofectamine.
본 발명의 펩타이드를 이용한 세포 또는 조직 내로의 유전자 전달은 상기 신규한 펩타이드에 전달하고자 하는 DNA 또는 RNA를 혼합하여 복합체를 제조한 후, 상기 복합체를 DNA 또는 RNA를 전달하고자 하는 세포와 혼합하여 함께 배양하거나, 조직에 주입함으로써 이루어질 수 있으며, 보다 바람직하게는 양이온 리포좀을 혼합함으로써 삼중 복합체를 제조하여 배양 또는 주입하는 것이 좋다. 상기 펩타이드, DNA 또는 RNA, 및 양이온 리포좀의 혼합순서는 필요에 따라 변경될 수 있다.Gene transfer into cells or tissues using the peptide of the present invention is to prepare a complex by mixing the DNA or RNA to be delivered to the novel peptide, and then the complex is mixed with the cells to deliver the DNA or RNA and cultured together Or, it may be made by injecting into the tissue, more preferably, it is preferable to prepare a triple complex to culture or inject by mixing the cationic liposomes. The mixing order of the peptide, DNA or RNA, and cationic liposomes can be changed as necessary.
또한 상기 유전자 전달 복합체에서 펩타이드, DNA 또는 RNA와 같은 핵산체 및 양이온 리포좀의 혼합 비율은 효과적으로 유전자를 전달하기 위한 목적을 고려하여, 상기 핵산체, 펩타이드 및 리포좀이 1 : 2 ~ 8 : 3 ~ 10의 전하비로 혼합되는 것이 가장 바람직하다. In addition, the mixing ratio of the nucleic acid body such as peptide, DNA or RNA and the cationic liposome in the gene delivery complex, the nucleic acid body, peptide and liposome is 1: 2 ~ 8: 3 ~ 10 in consideration of the purpose for effective gene transfer Most preferably, they are mixed at a charge ratio of.
또한 본 발명에서 전달 대상이 되는 유전자는 그 크기(size)와 형태에 상관없이 사용될 수 있으나, 올리고뉴클레오타이드 형태의 DNA 인 경우에는 15 ~ 120 bases 크기의 핵산체를 사용하는 것이 바람직하고, 플라스미드 벡터 형태의 DNA인 경우에는 3 ~ 8 kb 크기인 것이 바람직하다. In addition, the gene to be delivered in the present invention can be used irrespective of the size (size) and shape, but in the case of the oligonucleotide DNA, it is preferable to use a nucleic acid of 15 ~ 120 bases size, plasmid vector form In the case of DNA, the size is preferably 3 to 8 kb.
본 발명의 하기 실시예에서는 루시퍼라제(Luciferase) 또는 GFP(green fluorecence protein) 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 사용하여 MCF-7 세포에서 유전자의 발현량을 측정함으로써 펩타이드의 세포 내 전달 효율의 향상을 확인할 수 있었다. In the following examples of the present invention, by using a plasmid vector containing luciferase or GFP (green fluorecence protein) gene, the expression level of the gene in MCF-7 cells is measured to confirm the improvement of intracellular delivery efficiency of the peptide. Could.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto.
실시예 1 : 신규한 펩타이드의 제작Example 1 Preparation of New Peptides
HIV(human immunodeficiency virus)의 Tat 또는 NLS(nuclear localization sequence)로부터 유래된 아미노산 서열을 기본 서열(서열번호 1 및 2)로 하여 N 또는 C 말단에 특정 아미노산 서열을 부가함으로써 서열번호 3 내지 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 신규 펩타이드를 합성하였다. 이 때 상기 펩타이드는 당업계에 알려진 유기합성법에 따라 합성하였다.The amino acid sequence derived from Tat or NLS (nuclear localization sequence) of human immunodeficiency virus (HIV) is represented by SEQ ID NOs: 3 to 10 by adding a specific amino acid sequence to the N or C terminus as the base sequence (SEQ ID NOs: 1 and 2). Novel peptides with amino acid sequences were synthesized. At this time, the peptide was synthesized according to the organic synthesis method known in the art.
이 후 C18 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 후, HPLC(Shimadzu Prominence) 또는 LC/MSD(HP 1100)을 이용하여 순도 및 분자량을 측정하였으며, 하기 표 3과 같이 90% 이상의 순도 및 분자량을 나타내는 것을 확인하였다.After purification using C18 column chromatography, the purity and molecular weight were measured by HPLC (Shimadzu Prominence) or LC / MSD (HP 1100), which shows a purity and molecular weight of 90% or more as shown in Table 3 below. Confirmed.
실시예 2 : 유전자 전달 복합체 제작 및 DNA 전달 효율Example 2 Gene Delivery Complex and DNA Delivery Efficiency
2-1 : 세포 및 세포배양2-1: Cells and Cell Culture
본 실시예에서는 MCF-7(breast cancer cell line)를 사용하였다. 세포주의 배양액은 RPMI 1640 (Welgene, Korea)이며, 배양액에 10% heat-inactivated FBS (Welgene)와 2 mM L-글루타민e, 100 units/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신streptomycin (Welgene)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂세포 배양기에서 배양하였다. 실험에 사용된 모든 세포는 배양 과정에서 적정한 세포 농도를 유지하도록 유의하였으며, 실험에 사용될 세포는 전날 신선한 배양액으로 교체한 후 사용하였다.
In this embodiment, a breast cancer cell line (MCF-7) was used. The culture medium of the cell line was RPMI 1640 (Welgene, Korea), and 10% heat-inactivated FBS (Welgene), 2 mM L-glutaminee, 100 units / ml penicillin, and 100 μg / ml streptomycin (Welgene) were added to the culture medium. And cultured in a 37 ℃, 5% CO₂ cell incubator. All the cells used in the experiment were kept at the proper cell concentration during the culturing. Cells to be used in the experiments were replaced with fresh culture medium the day before.
2-2 : 리포터 플라스미드 벡터 (Reporter plasmid vector)의 제작2-2: Construction of Reporter Plasmid Vector
루시퍼라제(Luciferase) 또는 GFP(green fluorecence protein) 유전자를 각각 포함하는 재조합 플라스미드(pcDNA-Luc, pCMVTnT-CFP)를 XL1-Blue E. Coli 를 사용하여 증식시킨 후 maxi-kit(Qiagen Inc., USA)으로 분리하여 사용하였다(문헌; J. Microbiol. Biotechnol. (2011), 21(1), 93-99 Synthesis and Optimization of Cholesterol-Based Diquaternary Ammonium Gemini Surfactant (Chol-GS) as a New Gene Delivery Vector).
Recombinant plasmids containing luciferase or green fluorecence protein (GFP) genes (pcDNA-Luc, pCMVTnT-CFP) were grown using XL1-Blue E. Coli and then maxi-kit (Qiagen Inc., USA (J. Microbiol. Biotechnol. (2011), 21 (1), 93-99 Synthesis and Optimization of Cholesterol-Based Diquaternary Ammonium Gemini Surfactant (Chol-GS) as a New Gene Delivery Vector) .
2-3 : 핵산체, 펩타이드 및 양이온 리포좀 복합체의 형성2-3: formation of nucleic acid, peptide and cationic liposome complexes
핵산체로서 상기 리포터 플라스미드 pcDNA3 벡터와 상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드(Tat, NLS 포함), 그리고 양이온 리포좀으로서 리포펙타민(Lipofectamine)을 사용하여 유전자 전달 복합체를 제조하였다. 상기 유전자 전달 복합체는 혈청이 없는 TOM 배지(Welgene)에서 제작하였으며, 이 때 0.3 ㎍/well (48-well plate) DNA를 다양한 양의 펩타이드 및 리포좀과 혼합하였다.Gene delivery complexes were prepared using the reporter plasmid pcDNA3 vector as a nucleic acid, the peptide prepared in Example 1 (including Tat and NLS), and lipofectamine as a cationic liposome. The gene transfer complex was prepared in serum-free TOM medium (Welgene), where 0.3 μg / well (48-well plate) DNA was mixed with various amounts of peptides and liposomes.
혼합 시, 먼저 리포터 플라스미드 pcDNA3 벡터와 펩타이드를 혼합하여 상온에서 10분간 방치한 후, 양이온 리포좀과 혼합하여 상온에서 15분간 더 반응시켜 최종적으로 유전자 전달 복합체를 얻었으며, DNA : 펩타이드 : 리포좀의 전하비가 1 : 3 : 5 및 1 : 5 : 5가 되도록 조절하였다. At the time of mixing, the reporter plasmid pcDNA3 vector and peptide were mixed and left at room temperature for 10 minutes, and then mixed with cationic liposomes for 15 minutes at room temperature to finally obtain a gene transfer complex. It was adjusted to be 1: 3: 5 and 1: 5: 5.
한편 대조구로는 상기 펩타이드를 혼합하지 아니하고, 리포터 플라스미드와 양이온 리포좀만을 혼합한 복합체를 제조하여 비교 실험을 진행하였다.
On the other hand, as a control, the peptide was not mixed, and a comparison experiment was performed by preparing a complex in which only a reporter plasmid and a cationic liposome were mixed.
2-4 : 유전자 전달 복합체의 트랜스펙션(Transfection)2-4: Transfection of Gene Delivery Complex
실험 하루 전날 배양된 MCF-7 세포주를 세포수가 월(well) 당 3 x 104 cells이 되도록 48-웰 플레이트에 분주하였다. 세척과정을 거친 세포에 TOM media로 치환한 후, 상기 유전자 전달 복합체를 처리하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰으며, 그 다음 20% FBS가 첨가된 배지를 첨가하여 20시간 동안 추가 배양하였다.
MCF-7 cell lines cultured the day before the experiment were dispensed into 48-well plates so that the cell count was 3 × 10 4 cells per month. After the cells were washed with the TOM media, the cells were treated with the gene transfer complex and reacted at 37 ° C. for 4 hours, followed by further culture for 20 hours by adding a medium to which 20% FBS was added.
2-5 : 유전자 전달 복합체의 전달 효율2-5: Delivery efficiency of gene delivery complex
루시퍼라제(Luciferase) 활성은 하기와 같이 측정되었다. 상기 트랜스팩션된 세포들을 PBS 완충액으로 2번 세척하고, 100 ㎕의 1ㅧ CCLR (cell culture lysis reagent, 25 mM Tris-phosphate (pH 7.8), 2 mM DTT, 2 mM 1,2- diaminocyclohexane-N'N'N'-tetraacetic acid, 10% glycerol, 1% Triton X-100) 용액으로 용해시켰다. 이를 통하여 얻은 세포 용해액을 12,000 g에서 1분간 원심분리한 후, BCATM Protein Assay (PIERCE, USA)로 단백질 정량하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 상기 세포 용해액에 루시퍼라제 분석 버퍼(25 mM Glycylglycine pH7.8, 15 mM Potassium Phosphate pH7.8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 2 mM ATP, 1 mM DTT)를 100 ㎕ 가한 후, 20 ㎕의 루시퍼린(luciferin)을 첨가하였다. 루시퍼라제 활성은 형광 루미노메터(Luminometer, Berthold Detection Systems, Germany)로 10초간 측정하였으며, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다. The luciferase activity was measured as follows. The transfected cells were washed twice with PBS buffer, and 100 μl of 1 ㅧ CCLR (cell culture lysis reagent, 25 mM Tris-phosphate (pH 7.8), 2 mM DTT, 2
한편, GFP의 검출은 세포주룰 PBS 완충액으로 2번 세척한 후, 형광 도립현미경으로 세포 내 GFP 유전자 발현 양상을 확인함으로써 이루어졌다. 형광 도립현미경을 통한 유전자 발현 양상을 도 3 내지 6에 나타내었다. On the other hand, detection of GFP was performed by washing the cell line twice with PBS buffer, and then confirming the expression pattern of intracellular GFP gene using a fluorescence inversion microscope. Gene expression patterns through fluorescence inverted microscope are shown in FIGS. 3 to 6.
상기 도 1 내지 6에서 보는 바와 같이, 각 성분의 혼합 비율에 따라 루시퍼라제 활성이나, GFP 유전자 발현 양상의 미미한 차이가 있으나, 모두 펩타이드가 포함되지 아니한 대조군에 비하여 현저하게 우수한 활성을 나타내었다. 결국 상기 실험 결과를 통하여 상기 유전자 전달 복합체가 우수한 세포 내로의 DNA 전달 능력이 있음을 확인할 수 있었다.
1 to 6, there is a slight difference in the luciferase activity or GFP gene expression pattern according to the mixing ratio of each component, but all showed a remarkably superior activity compared to the control group does not contain a peptide. As a result, it was confirmed that the gene transfer complex had an ability to transfer DNA into a superior cell.
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Claims (8)
A gene transfer peptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 derived from a nuclear localization sequence (NLS) of human immunodeficiency virus (HIV).
[화학식 1]
[화학식 2]
Ya-Xb-Cys-Cys-Xc-Yd
상기 화학식에서,
X는 서열번호 1의 아미노산 서열을 나타내고,
Y는 서열번호 2의 아미노산 서열을 나타내며,
n1, n2, m, a, b, c 및 d는 각각 0 ~ 2의 정수이나, n1 및 n2는 동시에 0이 아니며, a 및 d는 동시에 0이 아니다.
The gene transfer peptide according to claim 1, which is represented by the following Chemical Formula 1 or 2.
[Formula 1]
(2)
Y a -X b -Cys-Cys-X c -Y d
In the above formulas,
X represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
Y represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
n 1 , n 2 , m, a, b, c and d are each an integer of 0 to 2, but n 1 and n 2 are not 0 at the same time, and a and d are not 0 at the same time.
The gene transfer peptide according to claim 1, wherein the gene transfer peptide is represented by any one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 6-10.
Gene delivery complex characterized in that the gene to be delivered to the peptide of any one of claims 1 to 3 coupled.
5. The gene delivery complex according to claim 4, wherein said gene is DNA or RNA.
5. The gene delivery complex according to claim 4, wherein the complex further comprises a cationic liposome.
The gene delivery complex according to claim 6, wherein the nucleic acid bodies, peptides and liposomes of the gene are mixed at a charge ratio of 1: 2 to 8: 3 to 10.
상기 유전자 전달 복합체를 세포 또는 조직 내로 주입하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물에 유전자를 전달하는 방법.
Preparing a gene delivery complex by binding a gene to be delivered to the peptide of any one of claims 1 to 3; And
Injecting the gene transfer complex into cells or tissues
Method for delivering a gene to animals other than humans, characterized in that it comprises a.
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Eric Viv?s 등. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 272, No. 25, 페이지 16010-16017 (1997.) |
| Eric Vives 등. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 272, No. 25, 페이지 16010-16017 (1997.) * |
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