KR101289220B1 - Peptide substance stimulating regeneration of central nervous system neurons, pharmaceutical composition on its base, and the method of its application - Google Patents

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Abstract

Disclosed is a method of improving the conditioned reflex habit, the muscle tonus, or the motion coordination of a patient after suffering trauma to the brain cortex that involves administering to the patient an effective amount of a composition containing peptide glutamyl-aspartyl-arginine of the formula H-Glu-Asp-Arg-OH as its active base.

Description

중추 신경계 뉴런의 재생을 자극하는 펩타이드 물질, 이를 기저로 하는 약제학적 조성물 및 이의 적용 방법{Peptide substance stimulating regeneration of central nervous system neurons, pharmaceutical composition on its base, and the method of its application}Peptide substance stimulating regeneration of central nervous system neurons, pharmaceutical composition on its base, and the method of its application

본 발명은 중추신경계의 질병, 외상 및 외상 후유증의 치료의 의학적 수단에 관한 것이고, 또한 뉴런 재생을 자극하는 수단으로도 사용될 수 있다. The present invention relates to medical means for the treatment of diseases, trauma and traumatic sequelae of the central nervous system, and may also be used as a means of stimulating neuronal regeneration.

뇌의 대사 작용과 통합 기능에 효과적인 제제들이 알려져있다: 세레브로리신(Cerebrolysine), 피라제탐(Pirazetam), 엔세파로리세이드(Encephalolysade). 또한 뇌 및 혈액 순환계를 정상화시키는 제제들도 있다: 수투게론(Stugeron), 캐비톤(Cavinton); 정신병리적 증상을 막는 제제들: 메리딘(Meridyne), 아미트리프티린(Amitriptyline); 뇌의 생체전기 활성에 효과적인 제제들: 페노발비탈(Phenobarbital), 콘부렉스(Convulex); 리큐오로다이나믹(liquorodynamic) 장애를 억제하는 제제들: 베로시피론(Veroshpiron), 푸로세미드(Furosemide)(The Comprehensive Russian Encyclopaedia of Medicinal Means, 모스크바, Remedium 출판사, V.2, 2002 (rus.)).Agents effective for the metabolic and integration functions of the brain are known: Cerebrolysine, Pirazetam, Encephalolysade. There are also agents that normalize the brain and blood circulation: Steugeron, Cavinton; Agents that block psychopathological symptoms: Meridyne, Amitriptyline; Agents effective for bioelectrical activity of the brain: Phenobarbital, Convulex; Agents that inhibit liquorodynamic disorders: Veroshpiron, Fursemide (The Comprehensive Russian Encyclopaedia of Medicinal Means, Moscow, Remedium Press, V.2, 2002 (rus.)) .

뉴런의 기능적인 활동을 자극하는 합성 펩타이드 제제들도 알려져 있다(러시 아 특허 제 2155063, 1999).Synthetic peptide agents that stimulate the functional activity of neurons are also known (Russian Patent No. 2155063, 1999).

상기 알려진 약제들은 신경계 구조에서 대사 과정의 개선 및 발병 작용에 대한 이것의 저항성 향상으로 이루어진 기능적인 효과 만을 발휘한다. The known agents exert only a functional effect consisting of an improvement in metabolic processes and their resistance to pathogenic action in the nervous system structure.

뉴런 재생의 과정에 효과적인 약제가 종래의 기술에서 발견되지 않았음을 명시할 필요가 있다. It is necessary to specify that no medicament effective in the process of neuronal regeneration has been found in the prior art.

현재, 여러 뇌질환, 외상, 뿐만 아니라 중추 신경계 외상의 후유증이 있는 환자의 수가 계속 증가하고 있어, 이로 인해 뉴런 재생 능력을 지닌 생물학적 활성 펩타이드 물질을 포함한, 새로운 제제군을 생성하는 것이 현재 상당히 중요하다. At present, the number of patients with sequelae of various brain diseases, traumas, as well as central nervous system trauma continues to increase, which is why it is now very important to create a new family of agents, including biologically active peptide substances with neuronal regeneration ability. .

본 발명에 따른 펩타이드는 종래의 기술 수준에서는 구조적 유사체를 갖지 않는다. The peptides according to the invention do not have structural analogs at the state of the art.

본 발명은 생물학적 활성을 가지는 새로운 펩타이드를 얻는 작업을 정립하고 해결해왔고, 이것은 뉴런 재생의 자극에서 명백하다. The present invention has established and solved the task of obtaining new peptides with biological activity, which is evident in the stimulation of neuronal regeneration.

본 발명의 기술적인 결과는 뉴런 재생을 자극하는 새로운 펩타이드 뿐만 아니라 활성 기저로서 새로운 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 생산으로 이루어져 있고, 이것은 조직 특이 단백질의 합성을 복구에 의해서 뿐만 아니라, 이것의 항산화 효과와 대사작용 및 뉴런의 생체 전기 활동의 정상화에 의해 뉴런 재생을 자극하는데 사용된다. The technical result of the present invention consists in the production of a pharmaceutical composition comprising a new peptide as an active basis as well as a new peptide that stimulates neuronal regeneration, which not only repairs the synthesis of tissue specific proteins, but also its antioxidant effect It is used to stimulate neuronal regeneration by metabolism and normalization of bioelectrical activity of neurons.

본 발명은 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]인 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌에 관한 것이다. The present invention relates to a peptide glutamyl-aspartyl-arginine having the general formula H-Glu-Asp-Arg-OH sequence 1 [SEQ ID NO: 1].

일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]의 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌은 뉴런의 재생을 자극하는 능력을 보유하고 있다. Peptide glutamyl-aspartyl-arginine of the general formula H-Glu-Asp-Arg-OH sequence 1 [SEQ ID NO: 1] possesses the ability to stimulate neuronal regeneration.

본 발명의 다른 면은 뉴런의 재생을 자극하는 약제학적 조성물에 관한 것이고, 이는 이것의 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]인 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌의 유효량 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition that stimulates regeneration of neurons, which is the peptide glutamyl- of formula H-Glu-Asp-Arg-OH sequence 1 [SEQ ID NO: 1] as its basis of activity. Effective amounts of aspartyl-arginine and pharmaceutically acceptable carriers.

약제학적 조성물은 비경구적 투여를 위한 형태이다. The pharmaceutical composition is in a form for parenteral administration.

본 발명의 다른 면은 뉴런의 재생을 자극하는 방법에 관한 것이고, 이는 이것의 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]인 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌의 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 0.01 - 100 μg/체중kg의 투여량으로, 치료 효과를 얻기 위해 필요한 기간 내내 적어도 하루에 한번 이상 환자에게 투여하는 것으로 이루어진다. Another aspect of the invention relates to a method for stimulating neuronal regeneration, which is the peptide glutamyl-aspartyl having the general formula H-Glu-Asp-Arg-OH sequence 1 [SEQ ID NO: 1] as the basis of its activity. -A pharmaceutical composition comprising an effective amount of arginine is administered to a patient at least once a day at a dosage of 0.01-100 μg / kg body weight for the period necessary to obtain a therapeutic effect.

이 방법에서 약제학적 조성물은 비경구적으로 투여된다. In this method the pharmaceutical composition is administered parenterally.

일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH의 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌을 용액 중에서 펩타이드 합성의 통상적인 방법에 의해 얻어진다. Peptide glutamyl-aspartyl-arginine of the formula H-Glu-Asp-Arg-OH is obtained by conventional methods of peptide synthesis in solution.

본 발명을 사용하여 기술적 결과를 달성하려는 목적의 가능성은, 이 분야에 전통적인 방법에 의해 수행된 연구로 얻어진 실험 데이타를 포함하는 실시예에 나타낸 신뢰성 있는 데이타에 의해 확인되었다. The possibility of the object of achieving the technical results using the present invention was confirmed by the reliable data shown in the examples including experimental data obtained from studies conducted by conventional methods in this field.

뉴런의 재생 및 통합 기능에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 자극 효과가 펩타이드의 실험 연구에서 밝혀졌다. 펩타이드의 생물학적 활성의 연구는 뇌 및 척수의 외상성 손상과 저산소증 실험 모델에서, 그리고 뇌 손상의 후유증이 있는 환자에서, 대뇌 피질 외식편 편에서 수행되었다.The stimulatory effect of peptide H-Glu-Asp-Arg-OH on the regeneration and integration functions of neurons has been demonstrated in experimental studies of peptides. Studies of the biological activity of peptides have been performed in traumatic and hypoxic experimental models of the brain and spinal cord, and in patients with sequelae of brain injury, in the cortical explants.

"약제학적 조성물" 이라는 개념은 상기 새로운 펩타이드를 포함한 여러 의약 형태를 의미하고, 이는 뉴런 재생 자극의 수단으로 의약에 사용될 수 있다. The term "pharmaceutical composition" refers to several pharmaceutical forms, including the new peptide, which can be used in medicine as a means of stimulating neuronal regeneration.

본 발명에 따른 약제학적 조성물을 얻기 위해, 활성 기저(활성 물질)로서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 유효량은 약학에서 일반적으로 허용되는 혼합의 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합되어야 한다. To obtain a pharmaceutical composition according to the invention, an effective amount of peptide H-Glu-Asp-Arg-OH as the active basis (active substance) is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier according to the method of mixing generally acceptable in pharmacy. Should be.

"유효량"이라는 개념은 유능한 전문가의 지식 뿐만 아니라 활성 및 독성의 양적 지표들에 따라 주어진 약제의 형태에서 유효하여야만 하는 활성 염기의 그러한 양의 사용을 의미한다. The term "effective amount" refers to the use of such an amount of active base that must be effective in a given form of medicament according to quantitative indicators of activity and toxicity as well as knowledge of competent experts.

담체는 상기 물질의 약제의 형태에 따라, 유기체에 투여하기에 바람직한 여러 형태를 가질 수 있다. The carrier may take several forms which are preferred for administration to an organism, depending on the form of the agent of the substance.

비경구적 투여를 위해, 안정성을 향상시키고 또는 살균성을 유지하는 다른 성분들 또한 첨가될 수 있지만, 담체는 보통 생리 식염수 또는 살균수에 주입된다. For parenteral administration, carriers are usually injected in physiological saline or sterile water, although other ingredients that enhance stability or maintain bactericidal properties may also be added.

본 발명의 주제가 도면 및 표에 의하여 설명된다.The subject matter of the present invention is illustrated by the figures and tables.

표 1은 독성 연구에서 기니피그 말초 혈액의 형태학상 및 생화학상의 지표에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타내었다. Table 1 shows the effect of peptide H-Glu-Asp-Arg-OH on morphological and biochemical indicators of guinea pig peripheral blood in toxicity studies.

표 2는 허혈성이 있는 랫트 대뇌 피질에 단백질의 지방질 과산화물 산화 및 과산화 과정에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타내었다. Table 2 shows the effect of peptide H-Glu-Asp-Arg-OH on lipid peroxide oxidation and peroxidation process of proteins in the ischemic rat cerebral cortex.

표 3은 분리된 하천 가재의 뉴런의 수명에 대한 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타내었다. Table 3 shows the effect of peptide H-GIu-Asp-Arg-OH on the lifespan of neurons of isolated river crayfish.

표 4는 환자의 교정 테스트 성능의 지표에 대한 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타내었다. Table 4 shows the effect of peptide H-GIu-Asp-Arg-OH on indicators of patient's calibration test performance.

표 5는 환자의 EGG 알파 지표의 동태에 대한 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타내었다. Table 5 shows the effect of peptide H-GIu-Asp-Arg-OH on the kinetics of the EGG alpha index of patients.

도면은 대뇌 피질 이식의 진행에 대한 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타내었다. The figure shows the effect of peptide H-GIu-Asp-Arg-OH on the progression of cerebral cortical transplantation.

본 발명은 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH의 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌의 합성의 실시예(실시예 1), 펩타이드의 독성 및 생화학적 활성 연구의 실시예(실시예 2, 3, 4, 5, 6, 7), 및 그 약제학적 특성을 증명하고 치료 효과를 얻을 가능성을 확인하는 펩타이드의 임상적 투여의 결과의 실시예에 의해 설명된다(실시예 8).The present invention is an embodiment of the synthesis of peptide glutamyl-aspartyl-arginine of the general formula H-Glu-Asp-Arg-OH (Example 1), an example of the toxicity and biochemical activity of the peptide (Example 2, 3, 4, 5, 6, 7) and the results of clinical administration of peptides demonstrating their pharmaceutical properties and confirming the likelihood of obtaining a therapeutic effect (Example 8).

실시예 1. 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 합성Example 1.Synthesis of Peptide H-Glu-Asp-Arg-OH

1. 생산물 명칭: 글루타밀-아스파틸-아르기닌.1.Product Name: Glutamyl-Aspartyl-Arginine.

2. 구조식:2. Structural formula:

Figure 112008079502735-pct00001
Figure 112008079502735-pct00001

3. 이온쌍을 제외한 분자식: C15H26N6O8.3. Molecular formula without ion pair: C 15 H 26 N 6 O 8 .

4. 이온쌍을 제외한 분자량: 418.40.4. Molecular weight excluding ion pairs: 418.40.

5. 이온쌍: 아세테이트.5. Ion pairs: acetate.

6. 외관: 냄새가 없는 백색의 무정형 분말.6. Appearance: white amorphous powder, odorless.

7. 합성 방법: 펩타이드는 다음의 도해에 따라 용액에서 통상적인 합성 방법에 의해 얻어진다: 7. Synthetic Methods: Peptides are obtained by conventional synthetic methods in solution according to the following diagram:

Figure 112008079502735-pct00002
Figure 112008079502735-pct00002

BOC - tert-부틸옥시카르보닐기,BOC-tert-butyloxycarbonyl group,

OSu - N-옥시숙신이미드 에스테르, OSu-N-oxysuccinimide ester,

DCC - N,N'-디시클로헥실카르보디이미드, DCC-N, N'-dicyclohexylcarbodiimide,

OBzl - 벤질 에스테르, OBzl-benzyl ester,

TFA - 트리플루오르아세트산,TFA-trifluoroacetic acid,

HOBt - N-옥시벤조트리아졸,HOBt-N-oxybenzotriazole,

Z - 벤질옥시카르보닐기.Z-benzyloxycarbonyl group.

최종 생산물의 특성:Final product characteristics:

· 기본 물질 함량: 98.01 % (HPLC로, 220 nm),Base material content: 98.01% (by HPLC, 220 nm),

· TLC- 각각, Rf=O.65 (아세토니트릴-물 1:3),TLC-, respectively, R f = O.65 (acetonitrile-water 1: 3),

· 수분 함량: 6%,Moisture content: 6%,

· 0.01 % 용액의 pH: 4.88,PH of 0.01% solution: 4.88,

· 비회전력: [α]D 22: -33°(c=l, H2O), "폴라메트 A", Carl Zeiss Jena.Non-rotating power: [α] D 22 : -33 ° (c = l, H 2 O), "Polamet A", Carl Zeiss Jena.

합성의 실시예:Examples of Synthesis:

1) BOC-GIu(OBzl)-OSu, N-tert-부틸옥시카르보닐-(γ-벤질)글루타민산 (I)의 N-옥시숙신이미드 에스테르.1) N-oxysuccinimide ester of BOC-GIu (OBzl) -OSu, N-tert-butyloxycarbonyl- (γ-benzyl) glutamic acid (I).

N-tert-부틸옥시카르보닐-(γ-벤질)글루타민산 BOC-Glu(OBzl)-OH(33.7 r, 0.1 몰)를 N,N'-디메틸포름아미드 50 ml에 용해시키고, -10℃로 냉각시켜; N,N'-디메틸포름아미드 30ml 중의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(23.0 g, 0.11 몰) 및 N,N'-디메틸포름아미드 20 ml 중의 N-하이드록시숙신이미드(13.0 g, 0.11 몰)의 냉각된(4-6℃) 용액의 혼합 과정. 반응물은 얼음으로 냉각된 상태에서, 12시간 동안 교반하였고, 그 다음 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 잔여물 N,N'-디시클로헥실우레아를 여과시키고, 활성 에테르의 얻어진 용액은 다음 단계에서 추출없이 사용된다.N-tert-butyloxycarbonyl- (γ-benzyl) glutamic acid BOC-Glu (OBzl) -OH (33.7 r, 0.1 mol) is dissolved in 50 ml of N, N'-dimethylformamide and cooled to -10 ° C. Let it; N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (23.0 g, 0.11 mol) in 30 ml of N, N'-dimethylformamide and N-hydroxysuccinimide (13.0 g in 20 ml of N, N'-dimethylformamide) , 0.11 mole) of cooled (4-6 ° C.) solution. The reaction was stirred for 12 hours while cooled on ice and then at room temperature for 24 hours. The residue N, N'-dicyclohexylurea is filtered and the resulting solution of active ether is used without extraction in the next step.

2) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH, N-tert-부틸옥시카르보닐-(γ-벤질)글루타밀-(β-벤질)아스파르테이트 (II).2) BOC-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -OH, N-tert-butyloxycarbonyl- (γ-benzyl) glutamyl- (β-benzyl) aspartate (II).

(β-벤질)아스파라긴산 H-Asp(OBzl)-OH (28.0 g, 0.12 몰) 및 트리에틸아민 36 ml (0.12 몰)을 N,N'-디메틸포름아미드 50 ml에 현탁시키고 한 시간동안 교반시킨다. 그다음 여기서 이전단계에서 얻은, 활성 에스테르 BOC-Glu(OBzl)-OSu (I)의 용액을 비율로 첨가한다. 반응물을 48시간 동안 실온에서 교반시킨다. 그 다음 pH2-3이 될 때까지 0.5N 황산으로 산성화시키고, 에틸 아세테이트 4x50 ml로 추출시킨다. 이어서 추출물을 0.5N H2SO4 3x50 ml, 물 2x50 ml, 5 % NaHCO3 용액 2x50 ml, 물 2x50 ml, 포화 NaCl 용액 2x50 ml에 세척시킨다. 유기층은 Na2SO4로 건조시키고, 용매는 진공 하에서 제거되고, 잔여물은 헥산에서 결정화된다. 생산물의 50 g이 얻어진다(92%). Rf = 0.34(벤젠-아세톤 2:1).(β-benzyl) aspartic acid H-Asp (OBzl) -OH (28.0 g, 0.12 mol) and 36 ml (0.12 mol) of triethylamine are suspended in 50 ml of N, N'-dimethylformamide and stirred for one hour. . Then a solution of the active ester BOC-Glu (OBzl) -OSu (I), obtained in the previous step, is added here in proportions. The reaction is stirred at rt for 48 h. Then acidify with 0.5N sulfuric acid until pH2-3 and extract with 4x50 ml of ethyl acetate. The extract is then washed with 3 × 50 ml of 0.5NH 2 SO 4, 2 × 50 ml of water, 2 × 50 ml of 5% NaHCO 3 solution, 2 × 50 ml of water, 2 × 50 ml of saturated NaCl solution. The organic layer is dried over Na 2 SO 4 , the solvent is removed under vacuum and the residue is crystallized in hexane. 50 g of product are obtained (92%). R f = 0.34 (benzene-acetone 2: 1).

3) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (III), N-tert-부틸옥시카르보닐-(γ-벤질)글루타밀-(β-벤질)아스파틸 아르기닌 (III).3) BOC-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -OH (III), N-tert-butyloxycarbonyl- (γ-benzyl) glutamyl- (β-benzyl) aspartyl arginine (III).

아르기닌 하이드로클로라이드 HCl H-Arg-OH 2.4 g(10 mmole)를 디메틸포름아미드 10 ml에 현탁시키고 24시간 동안 교반시킨다. 보호된 펩타이드(II) 2.4 g(4.4 mmole) 및 옥시벤조트리아졸 0.8 g(6 mmole)은 디메틸포름아미드 10 ml에 개별적으로 녹이고 -10℃까지 냉각시킨다. 그 다음 같은 온도로 냉각된 디시클로헥실카르보디이미드 1.25g(6 mmole)의 용액을 디메틸포름아미드 5ml에 첨가시킨다. 활성 에스테르가 20분 동안 얻어지고, 그 다음 아르기닌 침전물을 얻은 제제에 첨가시켜 실온에서 48시간동안 교반시킨다. 부산물 디시클로헥실우레아는 여과시켜버리고, 여과액은 pH 3이 될때까지 0.5 N 황산으로 산성화시킨다. 추출물은 물로 포화된 n-부틸 스피릿 3x20ml을 사용하여 수행된다. 추출물들을 함께 붓고 물로 세척시키고, 유기 용매는 진공에서 제거시킨다. 잔여물은 에스테르 내에서 결정화된다. 재-결정화는 이소프로필 스피릿에서부터 수행되고, 후에 혼합물은 KOH로 건조시킨다. 2.4 g (10 mmole) of arginine hydrochloride HCl H-Arg-OH are suspended in 10 ml of dimethylformamide and stirred for 24 hours. 2.4 g (4.4 mmole) of protected peptide (II) and 0.8 g (6 mmole) of oxybenzotriazole are dissolved separately in 10 ml of dimethylformamide and cooled to -10 ° C. Then a solution of 1.25 g (6 mmole) of dicyclohexylcarbodiimide cooled to the same temperature is added to 5 ml of dimethylformamide. Active esters are obtained for 20 minutes, and then arginine precipitate is added to the obtained formulation and stirred for 48 hours at room temperature. By-product dicyclohexylurea is filtered off and the filtrate is acidified with 0.5 N sulfuric acid until pH 3. The extract is performed using 3 × 20 ml of n-butyl spirit saturated with water. The extracts are poured together and washed with water and the organic solvent is removed in vacuo. The residue is crystallized in ester. Re-crystallization is carried out from isopropyl spirit, after which the mixture is dried with KOH.

생산물 800mg이 얻어진다(26%). Rf=0.87 (n-부탄올-물-아세트산, 4:1:1). 800 mg of product is obtained (26%). R f = 0.87 (n-butanol-water-acetic acid, 4: 1: 1).

4) H-Glu-Asp-Arg-OH (IV), 글루타밀-아스파틸-아르기닌.4) H-Glu-Asp-Arg-OH (IV), glutamyl-aspartyl-arginine.

보호된 트리펩타이드 BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Arg-OH(III) (0.80 g)를 메틸 스피릿-물(4:1)의 혼합물에 용해시키고 4시간 동안 촉매 Pd/C (5%)로 수화시킨다. 촉매는 여과되고, 용매는 진공 하에서 제거시키고, 잔여물은 KOH 및 P2O5로 진공에서 건조시킨다. 그다음 생산물은 아염소 메틸렌-트리플루오르아세트산(5:1) 혼합물 2ml에 용해되고 2시간 동안 실온에서 유지시킨다. 탈봉쇄 반응의 완료도는 아세토니트릴-물 시스템(1:3)에서 TLC에 의해 조절된다. 용매는 진공 하에서 제거되고, 잔여물은 진공에서 KOH로 건조시킨다. Protected tripeptide BOC-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Arg-OH (III) (0.80 g) was dissolved in a mixture of methyl spirit-water (4: 1) and catalyst Pd / C (5) for 4 hours. Hydrated with%). The catalyst is filtered off, the solvent is removed under vacuum and the residue is dried in vacuo with KOH and P 2 O 5 . The product is then dissolved in 2 ml of a chlorine methylene-trifluoroacetic acid (5: 1) mixture and kept at room temperature for 2 hours. The degree of completion of the deblocking reaction is controlled by TLC in an acetonitrile-water system (1: 3). The solvent is removed under vacuum and the residue is dried with KOH in vacuo.

제제 300 mg을 정제하기 위해 0.01% 트리플루오르아세트산 4 ml에 용해시키고 역상 칼럼 50x250 mm Diasorb-130-C16T, 7 μm상의 고생산성의 액상 크로마토크래피를 거친다. 크로마토그래피 Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. 크로마토그래피의 조건: A: 0.1% TFA; B: MeCN/0.1% TFA, 100분동안 구배 B 0 → 50%. 샘플양 5 ml, 215 nm에서 검출, 스캐닝 190-600 nm, 유량 10 ml/min. 분획은 37.0-42.0 분 동안 선택된다. 용매를 40℃ 이하 온도의 진공 하에서 제거되고, 제거는 10% 아세트산 용액 10 ml로 여러 번(5번) 반복된다. 최종적으로 잔여물을 탈이온수 20 ml에 용해시키고, 동결건조 시킨다.300 mg of the formulation is dissolved in 4 ml of 0.01% trifluoroacetic acid and subjected to a high productivity liquid chromatography with a reversed phase column of 50 × 250 mm Diasorb-130-C16T, 7 μm. Chromatography Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. Conditions of chromatography: A: 0.1% TFA; B: MeCN / 0.1% TFA, gradient B 0 → 50% for 100 min. Sample volume 5 ml, detection at 215 nm, scanning 190-600 nm, flow rate 10 ml / min. Fractions are selected for 37.0-42.0 minutes. The solvent is removed under vacuum at a temperature below 40 ° C. and removal is repeated several times (5 times) with 10 ml of 10% acetic acid solution. Finally the residue is dissolved in 20 ml of deionized water and lyophilized.

냄새가 없는 무정형 백색 분말 형태의 정제된 물질 120 mg을 얻는다. 120 mg of purified material in the form of an amorphous white powder without odor is obtained.

5) 준비된 물질의 분석5) Analysis of the prepared material

· 기본 물질 함량은 칼럼 Phenomenex C 18 LUNA 4.6x150 mm에서 HPLC에 의 해 확인된다. A: TFA 0.1 %; B: MeCN; 10분에 구배.B 0-100%. 유속은 1 ml/min이다. 220 nm에서 검출, 190-600 nm에서 스캐닝, 샘플 양은 20 μl이다. 기저 물질 함량 - 98.15 %.Base material content is confirmed by HPLC on column Phenomenex C 18 LUNA 4.6x150 mm. A: TFA 0.1%; B: MeCN; Gradient at 10 min. B 0-100%. The flow rate is 1 ml / min. Detection at 220 nm, scanning at 190-600 nm, sample volume 20 μl. Basal content-98.15%.

· TLC: 개별, Rf=O.65 (아세토니트릴/물 1:3, 소르브필(sorbfil) 플레이트, 실리카겔 8-12 μm, 염소/벤지딘에서 전개). TLC: individual, R f = O.65 (acetonitrile / water 1: 3, sorbfil plate, silica gel 8-12 μm, run on chlorine / benzidine).

· 수분 함량: 6 % (중량변화에 의해, l00°C에서 20 mg, 건조에 의한 질량 손실에 따라 판단).Moisture content: 6% (by weight change, 20 mg at l00 ° C, determined by mass loss by drying).

· 0.01 % 용액의 pH: 4.88 (전위차적으로)PH of the 0.01% solution: 4.88 (potentially)

· 비회전력: [α]D 22: -33°(c=l, H2O), "폴라메트 A", Carl Zeiss Jena.Non-rotating power: [α] D 22 : -33 ° (c = l, H 2 O), "Polamet A", Carl Zeiss Jena.

실시예 2. 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH 독성의 연구Example 2. Study of Peptide H-Glu-Asp-Arg-OH Toxicity

펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 일반적인 독성은 "새로운 약제학적 물질의 실험적(전임상)연구를 위한 방법(Manual for experimental(pre-clinical) study of new pharmacological substances)"(2000)에서 명시한 요건에 따라 연구되었다: 물질의 단일 투여 경우의 급성 독성 및 펩타이드의 장기 투여 경우의 아급성 및 만성 독성.The general toxicity of the peptide H-Glu-Asp-Arg-OH is defined in the "Manual for experimental (pre-clinical) study of new pharmacological substances" (2000). Acute toxicity in the case of a single dose of the substance and subacute and chronic toxicity in the case of long-term administration of the peptide.

급성 독성의 연구는 체중 20-22 g의 백색 잡종 수컷 마우스 72마리에 수행되었다. 동물들은 6 개의 동등한 그룹으로 무작위로 나뉘었다. 물질은 살균한 0.9% NaCl 용액 0.25 ml 중 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg의 투여량으로 동물에 한번씩, 근육 내에 투여되었다. 대조 동물들은 살균한 0.9% NaCl 용액을 같 은 양으로 투여받았다. Acute toxicity studies were conducted in 72 white hybrid male mice weighing 20-22 g. Animals were randomly divided into six equal groups. The material was administered intramuscularly once to animals at doses of 1 mg / kg, 2 mg / kg, 3 mg / kg, 4 mg / kg, 5 mg / kg in 0.25 ml of sterile 0.9% NaCl solution. Control animals received the same amount of sterile 0.9% NaCl solution.

아급성 독성의 연구는 체중 160-210 g의 백색 잡종 수컷 마우스 65마리에 수행되었다. 실험 동물들은 살균한 0.9% NaCl 용액 0.5 ml 중 1 μg/kg, 0.1 mg/kg, 1 mg/kg의 투여량을 90일 동안 매일 근육내에 투여받았다. 대조 동물들은 살균한 0.9% NaCl 용액을 같은 양으로 투여받았다. 동물들의 말초 혈액의 형태 및 특성은 물질의 투여시작 전, 그리고 투여 시작 후 30 일, 60 일, 90 일에 연구되었다. 또한 실험이 완료될 때, 혈액의 생화학 및 응고 지표도 측정되었다. The study of subacute toxicity was conducted in 65 white hybrid male mice weighing 160-210 g. Experimental animals received daily doses of 1 μg / kg, 0.1 mg / kg, 1 mg / kg intramuscularly for 90 days in 0.5 ml of sterile 0.9% NaCl solution. Control animals received the same amount of sterile 0.9% NaCl solution. The morphology and characteristics of the peripheral blood of the animals were studied before the start of the administration and 30, 60, 90 days after the start of the administration. At the end of the experiment, blood biochemistry and coagulation indices were also measured.

만성 독성의 연구는 체중 270-310 g인 84마리의 수컷 기니피그에서, 물질의 권고된 임상 투여를 기반으로 6개월 동안 수행되었다. 실험 동물들은 살균한 0.9% NaCl 용액 0.5 ml 중 펩타이드를 1 μg/kg, 0.1 mg/kg, 1 mg/kg의 투여량으로 6개월 동안 하루에 한번씩 매일 근육내에 투여받았다. 대조 동물들은 살균한 0.9% NaCl 용액을 같은 양 및 같은 일정으로 투여받았다. 동물들의 말초혈액에 대한 다음의 지표에 대한 평가에 전통적인 방법들이 사용되었다: 적혈구 수, 헤모글로빈 수, 망상 적혈구 수, 혈소판 수, 백혈구 수, 백혈구 형태, 적혈구 침강속도(ESR), 적혈구 내성의 양. 그것과 함께, 혈청 내 전체 단백질의 함량은 플라즈마 분광법을 이용한 칼륨 및 나트륨 함량 뿐 아니라, Lowry 방법을 이용하여 확인되었다. 실험이 완료되자마자 동물의 뇌, 척수, 척수 신경절, 갑상선, 부갑상선, 부신, 고환, 뇌하수체, 심장, 위, 동맥, 간, 신장, 방광, 췌장, 위, 소장, 대장, 가슴샘, 비장, 림프절 및 골수의 병리형태학적 연구가 수행되었다.The study of chronic toxicity was performed for 6 months based on the recommended clinical administration of the substance in 84 male guinea pigs weighing 270-310 g. Experimental animals received peptides intramuscularly once daily for 6 months at a dose of 1 μg / kg, 0.1 mg / kg, 1 mg / kg in 0.5 ml of sterile 0.9% NaCl solution. Control animals received sterile 0.9% NaCl solution in the same amount and on the same schedule. Traditional methods have been used to assess the following indicators of peripheral blood in animals: erythrocyte count, hemoglobin count, reticulocyte count, platelet count, leukocyte count, leukocyte morphology, erythrocyte sedimentation rate (ESR), and erythrocyte tolerance. In addition, the total protein content in serum was confirmed using the Lowry method, as well as the potassium and sodium content using plasma spectroscopy. As soon as the experiment is completed, the animal's brain, spinal cord, spinal ganglion, thyroid gland, parathyroid gland, adrenal gland, testicle, pituitary gland, heart, stomach, artery, liver, kidney, bladder, pancreas, stomach, small intestine, large intestine, thymus, spleen, lymph node and Pathological morphological studies of the bone marrow were performed.

급성 독성의 연구는 임상 투여에 권장되는 치료 투여량을 5000배 이상으로 초과하는 양으로 동물들에게 연구된 펩타이드를 단일 투여하는 것이 독성 반응을 나타내지 않는다는 것을 나타냈고, 이는 물질의 가능한 치료 투여량의 전범위를 가리킨다. Acute toxicity studies have shown that a single dose of the studied peptide to animals in an amount greater than 5000 times the recommended therapeutic dose for clinical administration does not produce a toxic response, which is a Point to the full range.

펩타이드의 아급성 및 만성 독성의 연구는 치료 투여량을 100-1000배 초과하는 양으로 물질을 장기 투여하는 경우 부작용이 없음을 나타내었다. 물질 투여 시작 후 3 및 6 개월에 기니피그 혈액 형태 및 생화학적 지표에 대한 펩타이드 효과의 연구는 연구된 지표에서 통계학적으로 유의적인 변화가 없음을 보여주었다(표 1).Studies of subacute and chronic toxicity of peptides have shown no side effects when prolonged administration of the substance in an amount that is 100-1000 times greater than the therapeutic dose. Studies of peptide effects on guinea pig blood morphology and biochemical indicators at 3 and 6 months after the start of the substance showed no statistically significant change in the indicators studied (Table 1).

동물들의 일반적인 상태의 평가, 말초 혈액의 형태학적 및 생화학적 지표의 평가, 기간의 형태학적 상태의 평가, 심혈관계 및 호흡계의 상태의 평가, 또한 간과 신장의 기능의 평가는 유기체에서 병리학적 변화를 나타내지 않았다. Assessment of the general condition of animals, assessment of the morphological and biochemical indicators of peripheral blood, assessment of the morphological state of the period, assessment of the state of the cardiovascular and respiratory systems, and assessment of the function of the liver and kidneys have also been associated with pathological changes in the organism. Not shown.

통상적 독성의 부재는 임상 연구에, 활성 기저로서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 함유하는 약제학적 조성물을 권장한다. The absence of common toxicity recommends, in clinical studies, pharmaceutical compositions containing the peptide H-Glu-Asp-Arg-OH as the active basis.

실시예 3. 대뇌 피질 이식의 발달에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과 Example 3 Effect of Peptide H-Glu-Asp-Arg-OH on the Development of Cerebral Cortical Transplantation

체중 150-200 g의 Wistar 랫트의 대뇌피질의 32개 단편으로 연구가 시행되었다. 외식편 배양을 위한 영양 배지는 글루코즈 (0.6%), 인슐린 (0.5 units/ml), 페니실린 (100 units/ml), 글루타민 (2 mM)의 첨가와 함께, 35% Eagle 용액, 25% 송아지 태아 혈청, 35% Hanx 용액, 5% 병아리 배아 추출물로 이루어졌다. 대뇌 피질 파편을 배지에 두고 48시간동안 36.7℃의 온도에서 항온기 내의 페트리 디쉬에서 배양시켰다. 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH는 1, 10, 및 100 ng/ml의 최종 농도로 배 지에 첨가시켰다. The study was conducted with 32 fragments of the cerebral cortex of Wistar rats weighing 150-200 g. The nutrient medium for explant culture was 35% Eagle solution, 25% calf fetal serum, with the addition of glucose (0.6%), insulin (0.5 units / ml), penicillin (100 units / ml), glutamine (2 mM). , 35% Hanx solution, 5% chick embryo extract. Cortical fragments were placed in media and incubated in Petri dishes in an incubator at a temperature of 36.7 ° C. for 48 hours. Peptide H-GIu-Asp-Arg-OH was added to the medium at final concentrations of 1, 10, and 100 ng / ml.

면적 지표(AI), 즉 성장 지역과 함께 전체 외식편 면적 대 대뇌피질 단편의 초기 면적의 비가 생물학적 활동의 척도로 제공되었다. 대조된 평균 AI 값 사이의 차이의 통계적인 중요성은 스튜던츠 티-기준(Student's t-criterion)법을 사용하여 평가되었다. AI 값은, 대조 AI 값을, 100%로 간주하여 백분율로 나타내었다. The area index (AI), ie the ratio of the total explant area to the initial area of the cortical fragments along with the growth area, was provided as a measure of biological activity. The statistical significance of the differences between the contrasted mean AI values was assessed using the Student's t-criterion method. AI values were expressed as percentages of the control AI value, considered 100%.

조절 피질 외식편 성장 면적은 짧은 신경돌기와 외부 신경교 세포 및 섬유아세포들로 이루어졌다. The regulatory cortical explant growth area consisted of short neurites and external glial cells and fibroblasts.

도면은 대뇌 피질 이식의 발달에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과를 나타낸다. The figure shows the effect of peptide H-Glu-Asp-Arg-OH on the development of cerebral cortical transplantation.

배양 24시간 후 외식편이 콜라겐 물질 상에 펴졌고, 증식 및 이동 세포는 외식편 면적 주위에 퍼지기 시작하는 것이 발견되었다. 10 ng/ml을 만드는 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 경우 배양 제3일 경 대조 AI 지표와 비교하여 통계적으로 유의적인 37%의 AI 성장이 관찰되었다. 배양 7일 후 대뇌 피질의 연구는 동일한 농도의 경우 신경돌기 자극 효과가 같음을 나타내었다. 때때로 이식의 AI에서 통계적으로 무의미한 감소가 발견되었고, 이는 아마도 장기 배양 기간의 경우 신경 섬유의 수축 때문이다. After 24 hours of culture, the explants spread out on the collagen material and it was found that proliferating and migrating cells began to spread around the explant area. For the peptide H-Glu-Asp-Arg-OH, which produced 10 ng / ml, a statistically significant 37% AI growth was observed compared to the control AI indicator on the third day of culture. After 7 days of culture, the study of cerebral cortex showed that neurite stimulating effects were the same at the same concentration. Occasionally a statistically insignificant decrease was found in the AI of transplantation, probably due to the contraction of nerve fibers in the long term incubation period.

얻어진 결과들은 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 신경돌기를 자극하는 활성을 확인하였다. The obtained results confirmed the activity of stimulating neurites of the peptide H-Glu-Asp-Arg-OH.

실시예 4. 두개골 외상 후 랫트의 대뇌 피질에서 회복 과정에 대한 펩타이드 H-Glu-Arg-OH의 효과Example 4 Effect of Peptide H-Glu-Arg-OH on Recovery Process in Rat Cerebral Cortex After Cranial Trauma

뇌의 회복 과정에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과는 급성 중중의 머리 외상의 패턴에서 측정되었다. 중추 신경계의 직접적인 회복 기능은 동물들의 협응 운동 및 근육 긴장도, 그리고 조건 반사 습관을 학습하고 재현하는 능력에 의해 확인되었다. The effect of peptide H-Glu-Asp-Arg-OH on the recovery process of the brain was measured in the pattern of acute severe head trauma. The direct recovery function of the central nervous system was confirmed by the ability of animals to learn and reproduce coordination and muscle tone, and conditional reflex habits.

24마리의 백색 잡종 랫트는 떨어진 납 분동에 의한 강한 압박의 두개골 외상(cranial trauma)을 입었다. 1, 12, 48 및 96시간에 15마리의 실험용 동물들은 살균한 0.9% NaCl 용액의 0.5 ml에 10 μg/kg의 투여량의 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 매일 근육내에 투여받았다. 대조 동물들은 같은 용량 및 같은 일정으로 살균한 생리적 식염수를 투여받았다. Twenty-four white hybrid rats suffered from cranial trauma of intense compression from fallen lead weights. At 1, 12, 48 and 96 hours, 15 experimental animals received daily intramuscular administration of peptide H-Glu-Asp-Arg-OH at a dose of 10 μg / kg in 0.5 ml of sterile 0.9% NaCl solution. Control animals received sterile physiological saline at the same dose and at the same schedule.

학습하고 습관을 재현하는 랫트의 능력을 조건 활성 회피 반사(CAAR)의 테스트를 사용하여 측정하였다. 근육 긴장과 협응 운동은 속도를 증가시키면서 랫트를 막대기에서 회전시키고 그들이 막대기를 잡는 시간을 측정하여 테스트되었다. Rats' ability to learn and recreate habits was measured using the test of Conditional Active Avoidance Reflection (CAAR). Muscle tension and coordination exercises were tested by rotating the rats off the rods and measuring the time they held the rods with increasing speed.

외상 후 48시간에서, 생존한 모든 동물들은 학습할 수 없었다. 외상 후 96시간에서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH로 치료받은 랫트의 그룹에서 학습할 수 있는 동물의 수는 대조군보다 2배 이상 컸다. 30일에서, 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH로 치료받은 랫트의 학습 능력의 지표 또한 대조군보다 더 높았다. At 48 hours after trauma, all surviving animals were unable to learn. At 96 hours after trauma, the number of animals that can be learned in the group of rats treated with peptide H-Glu-Asp-Arg-OH was more than twice as large as the control. At 30 days, indices of learning ability of rats treated with peptide H-Glu-Asp-Arg-OH were also higher than controls.

중증 두개골 외상은 무능력-신경증 증후군 및 협응과 근육 긴장을 현저히 감소시켰다. "회전하는 막대기" 테스트는 외상 후 48시간에서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH가 협응 운동 및 근육 긴장을 얻는 것에 기여함을 나타냈다(막대기를 잡는 시간이 대조군 보다 2배 이상 더 길었다).Severe cranial trauma significantly reduced incapacity-neuropathy syndrome and coordination and muscle tension. The "rotating stick" test showed that the peptide H-Glu-Asp-Arg-OH contributed to gaining coordination and muscle tension 48 hours after trauma (the stick holding time was more than twice as long as the control).

따라서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 투여는 동물들의 조건 반사 습관을 학습하고 재현하는 능력 뿐만 아니라 근육 긴장 및 협응 운동 정상화의 상당한 향상을 가능하게 한다. Thus administration of the peptide H-Glu-Asp-Arg-OH allows for a significant improvement in muscle tension and coordination exercise normalization as well as the ability to learn and reproduce the conditional reflex habits of animals.

뉴런 재생을 자극하는 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 능력은 외상 후 다섯 번째 날에 이미 밝혀졌고, 동물들의 학습 능력의 열네번째 날 지표는 정상 값에 가까웠다. The ability of the peptide H-Glu-Asp-Arg-OH to stimulate neuronal regeneration was already revealed on the fifth day after trauma, and the indicator on the fourteenth day of animal learning ability was close to normal.

급성 중증 두개골 외상은 뇌 회백질 뉴런 개체군의 손상과 사멸을 일으킨다. 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과 하에서 초기 외상 후의 중추 신경계 기능의 급속한 회복은 뇌에서 회복과정을 자극하는 펩타이드의 능력을 확증한다. Acute severe cranial trauma causes damage and death of the brain gray matter neuron population. Rapid recovery of central nervous system function after initial trauma under the effect of peptide H-Glu-Asp-Arg-OH corroborates the peptide's ability to stimulate the healing process in the brain.

실시예 5. 척수 외상의 경우 랫트의 중추신경계에서 형태학적 변화에 끼치는 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과Example 5 Effect of Peptide H-Glu-Asp-Arg-OH on Morphological Changes in Rat Central Nervous System in Spinal Cord Trauma

연구는 체중 180-200 g의 성숙한 Wistar 수컷 및 암컷 랫트로 수행되었다. 27마리 랫트의 실험 그룹은 척수 외상을 겪었다. The study was conducted with mature Wistar male and female rats weighing 180-200 g. The experimental group of 27 rats had spinal cord trauma.

동물들은 다음의 방법에 따라 척수의 요수분절(lumbar segment)에 손상을 입었다. 마취된 랫트의 마지막 갈비뼈의 척추의 측표면을 작업 표면에 무수 핀셋(dressing forceps)을 사용하여 15kg의 힘으로 피부를 통해 압축시켰다. 외상 후 24시간에 살아남은 동물들은 두개의 그룹으로 다시 나뉘었다. Animals were damaged in the lumbar segment of the spinal cord according to the following method. The lateral surface of the spine of the last rib of the anesthetized rat was compressed through the skin with a force of 15 kg using dry forceps on the working surface. The surviving animals 24 hours after the trauma were divided into two groups.

첫번째 그룹의 동물들은 10일 동안 살균한 0.9% NaCl 용액 0.5 ml 중 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 10 μg/kg의 투여량으로 매일 하루에 한번씩 근육내에 투여받았다. 두번째 그룹의 랫트(대조군)들은 살균한 생리 식염수를 같은 양으로 투여 받았다.The first group of animals received intramuscularly administered peptide H-Glu-Asp-Arg-OH once daily per day at a dose of 10 μg / kg in 0.5 ml of sterilized 0.9% NaCl solution for 10 days. Rats of the second group (control) received the same amount of sterile saline solution.

신경조직 연구는 실험 제30일에 두 그룹의 동물들에게 수행되었다. 이를 위해 척수 신경절을 손상 지점 및 상기 손상된 지점 뿐만 아니라 척수의 요추 및 경부와 뇌의 운동 피질 파편 및 추체로(pyramide tract)로 부터 취하였다. 신경조직 연구는 전자 및 광학(luminous) 현미경을 사용하여 수행되었다.Neural tissue studies were performed on two groups of animals on day 30 of the experiment. To this end, spinal ganglions were taken from the point of injury and the point of injury, as well as from the motor cortical fragments and pyramide tract of the lumbar spine and neck and brain of the spinal cord. Neural tissue studies were performed using electron and luminous microscopy.

광학 현미경 용 샘플을 96% 스피릿과 10% 포르말린에 고정시키고, 셀로이딘에 채우고 이어서 헤마톡실린-에오신으로 뿐만 아니라 니슬(Nissle), 반 기손(Van Gison), 웨걸트(Weigert), 스피엘메얼(Spielmeyer)로 염색하였다. 샘플들을 샘플의 조직학적 가용 및 염색의 통상적인 방법에 따라 고정하고 절단하였다. Samples for optical microscopy were fixed in 96% spirit and 10% formalin, filled with celloidine and subsequently with hematoxylin-eosin as well as Nissle, Van Gison, Weigert, Spiel Stained with Spielmeyer. Samples were fixed and cut according to conventional methods of histological solubility and staining of the samples.

전자현미경 용 샘플을 카코딜레이트 완충액과 2% 오스뮴산으로 고정시키고, 그 다음 Epon 812에 채우고 Reynolds에 의해 질산납에서 대조시켰다. 샘플의 예비 평가는 준미세 조각을 사용하여 수행되었다. 초미세 조각은 전자 현미경 UEM-IOOSKh를 사용하여 연구되었다. Samples for electron microscopy were fixed with cacodylate buffer and 2% osmic acid, then filled in Epon 812 and contrasted in lead nitrate by Reynolds. Preliminary evaluation of the samples was performed using semi-microscopic pieces. Ultrafine pieces were studied using an electron microscope UEM-IOOSKh.

척수 외상이 있는 모든 랫트들은 손상 지점의 뉴런에서 병리병태학적 변화를 나타냈다. 이러한 변화는 범위가 다양했다. 뉴런의 부분이 축삭반응을 보였다. 이런 경우에서 세포들은 부풀었고, 이들의 선은 매끄러워졌다. 니슬 종기는 주요색에 의해 창백하게 얼룩지면서 마치 분진같은 파편으로 감소되는 것처럼 보였다. 핵질은 만개되었고, 핵은 말초쪽으로 탈구되었다. 뉴런의 상당한 부분이 오그라들었다. 이런 경우 세포는 좁아지고 모난 선 모양으로 융기된다. 염색체의 덩어리들은 진하게 착색되었고, 핵 또한 그러했다. 핵은 거의 눈에 보이지 않았다. 신경 세포의 일 부는 허혈 변화를 나타내었다. 이들의 세포질에서 갑상선 물질은 상당히 방출되었고, 이러한 세포에서 핵은 과염색성에, 크기가 약간 감소하였고, 몇몇 경우에서 핵은 분리 덩어리로 붕괴되었다. 때때로 강렬한 색상의 작은 낟알의 형태에서 입자들이 덩어리 및 부가물 근처(골지 망의 세포주위 외피) 뉴런의 말초에서 발견되었다. 대부분의 경우에서 뉴런은 부종성 변화가 있었다. 이러한 뉴런의 니슬의 물질은 세포질의 말초에서 좁은 코일처럼 보였다. 세포체의 선은 분해된 것으로 보인다. 빛나는 코일의 형태의 세포질이 녹은지점이 핵 주위에서 확인되었다. 몇몇 뉴런은 심하게 변하였다. 세포체는 균일하지 않는 염색질 융해를 가지고 부푼 것으로 보였다. 뉴론 부속물의 긴 조각은 착색되었다. 몇몇 세포들은 마치 "먹히는" 것처럼 보였다. 이들은 여러 크기 및 불규칙적인 모양의 액포의 형태의 착색되지 않는 지점을 나타냈다. 덜 빈번히, 뉴론은 신경포식현상(neuronophagia)의 징후를 나타내는, 비대성 신경교 요소를 나타냈다. 핵 병변은 핵의 크기가 줄어들고, 현저한 하이퍼크로마토시스를 갖는 핵소체를 거의 식별할 수 없는 이런 유형의 변형을 특징으로 한다. 몇몇 뉴런은 심하게 부풀은 형태로 변했다. 이런 경우 세포체는 부푼 것처럼 보였다. 핵들은 확대되고 발산적으로 착색되었다. 세포질은 밝은 푸른 빛으로 균일하게 착색된 작은 낟알의 물체를 나타냈다. 병변 지점의 몇몇 지역에서 강한 파괴 과정이 신경 세포 사이의 틈에, 특히 작은 틈이 오히려 일반적인 척수의 전방 "각"에 존재하였다. 뉴런이 사라지는 몇몇 지점에서, 신경교 세포 증식이 관찰되었다. 척수의 전방 "각"의 신경세포가 더 잘 유지되었다. 신경 섬유의 분산된 탈수초의 신호가 후방 척수 대동맥의 복부 부분 및 전방-측면 척수 대동맥에서 관찰되었다. 백색 물질 부종의 형태의 해면화 초점들 또한 존재하였다. All rats with spinal cord trauma showed pathological changes in neurons at the site of injury. These changes varied in scope. A portion of the neuron showed an axon response. In this case, the cells swelled and their lines became smooth. Nisle boils seemed to be reduced to dust-like debris by pale staining by the primary color. The nucleus was in full bloom, and the nucleus dislocated distal. A significant portion of the neurons shriveled. In this case, the cells are narrowed and raised in the form of angular lines. Chunks of chromosomes are darkly colored, as are the nuclei. The nucleus was barely visible. Some of the neurons exhibited ischemic changes. In their cytoplasm, thyroid material was released significantly, in which the nuclei were overstained, slightly reduced in size, and in some cases the nuclei collapsed into isolated masses. Occasionally, in the form of small grains of intense color, particles were found in the periphery of neurons near the clumps and adducts. In most cases neurons had edema changes. The substance of these neurons' nisles looked like a narrow coil in the periphery of the cytoplasm. The gland of the cell body appears to be degraded. The melting point of the cytoplasm in the form of a glowing coil was identified around the nucleus. Some neurons have changed badly. The cell body appeared to swell with uneven chromatin fusion. Long pieces of neuron appendages were colored. Some cells seemed to be "eaten". These indicated uncolored spots in the form of vacuoles of various sizes and irregular shapes. Less frequently, neurons exhibited hypertrophic glial elements, indicating signs of neuronophagia. Nuclear lesions are characterized by this type of modification, which reduces the size of the nucleus and hardly identifies nucleolus with significant hyperchromatosis. Some neurons have turned into heavily swollen forms. In this case the cell body appeared to bulge. Nuclei were enlarged and divergently colored. The cytoplasm showed small grainy objects uniformly colored in bright blue light. In some areas of the lesion site a strong process of destruction was present in the gaps between nerve cells, especially in the small "anterior" anterior "angle" of the common spinal cord. At some points where neurons disappeared, glial cell proliferation was observed. Neurons in the anterior "angle" of the spinal cord were better maintained. Signals of dispersed demyelination of nerve fibers were observed in the ventral portion of the posterior spinal aorta and in the anterior-lateral spinal aorta. There were also spongy focuses in the form of white matter edema.

상기 형태학적 상황은 두 실험 그룹의 랫트에서 관찰되었다. 그러나, 대조군 랫트는 그들의 척수에서 주요하게 "주로 자극되는" 세포를 가지는 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH를 처리한 랫트와 비교하여, 훨씬 더 "심한" 경우 및 뇌허혈성 뉴런의 변화를 나타냈다. The morphological situation was observed in rats of both experimental groups. However, control rats showed a much more "severe" case and changes in cerebral ischemic neurons compared to rats treated with peptide H-GIu-Asp-Arg-OH, which had primarily "mainly stimulated" cells in their spinal cord. .

모든 동물들은 성상세포 신경교, 특히 섬유증 성상 세포의 활성 증식을 나타내었다. 세포는 피크노형상의 핵과 부산물이 없는 균질한 세포질의 기형이었다. 실험 동물들은 좀더 활성인 올리고덴드로글리아 과형성을 나타내었다. 복합적인 외상 형태가 그것의 세포 사이에서 발견되었다. 소교세포 요소는 신경교 부산물 분열의 징후와 함께 적당하게 증식되었다. All animals showed active proliferation of astrocytic glial, especially fibrotic astrocytic cells. The cells were homogeneous cytoplasmic malformations without peak-shaped nuclei and by-products. Experimental animals showed more active oligodendroglia hyperplasia. Complex traumatic forms were found between its cells. Microglial elements propagate moderately with signs of glial byproduct division.

액손 변성의 형태의 세포 변이가 척수의 위쪽 부분에서 및 대조 동물의 뇌에서 발견되었다. Cellular variation in the form of axon degeneration was found in the upper part of the spinal cord and in the brains of control animals.

전자 현미경은 척수 외상이 있는 랫트에서 뉴런, 그들의 부산물, 신경교 요소 및 혈관에서 라디칼 변이를 드러냈다. 뉴런의 세포질은 소포 망 통로, 부푼 골지체 저장소, 다수의 술 모양의 공동과 크고 작은 리소좀(lysosome)의 감소된 양을 나타냈다. 가시적 크리스타 없이 조밀한 매트릭스를 갖는 어두운 마이토콘드리아가 그 상황의 특징이다. 말초 신경 세포는 바람직하기는 리보솜에서 유도된 부푼 과립의 소포 망 통로에 의해, 줄무늬가 있는 크고 어두운 지질, 또한 큰 액포, 즉 다소포체(multivesicular corpuscles) 형성을 나타냈다. 조밀한 핵막 근처의 강하게 만들어진 응집이 형성된, 염색질의 분해는 몇몇 뉴런의 핵에서 확인되었다. 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH로 처리한 랫트는 뉴론 세포 세포질에서 회복되는 징후를 나타내었다. 다량의 유리 리보솜 및 폴리리보솜과, 또한 과립 소포 세포의 짧은 프로파일 저장소가 발견되었다. 팽창의 징후없이 다수의 작은 골지 저장소의 수가 증가하였다. 세포 말초는 오직 투명한 단일의 액포와 어두운 소체들(corpuscles)을 나타내었다. Electron microscopy revealed radical variation in neurons, their byproducts, glial elements, and blood vessels in rats with spinal cord trauma. The cytoplasm of neurons exhibited a reduced vesicle network pathway, swollen Golgi reservoir, multiple liquor-shaped cavities and large and small lysosomes. Dark mitochondria with dense matrices without visible crista are characteristic of the situation. Peripheral neurons preferably showed streaked large dark lipids, also large vacuoles, ie multivesicular corpuscles, formed by ribbed vesicle network passages derived from ribosomes. Degradation of chromatin, with the formation of strongly formed agglomerates near dense nuclear membranes, has been identified in the nuclei of some neurons. Rats treated with the peptide H-Glu-Asp-Arg-OH showed signs of recovery in the neuronal cytoplasm. Large amounts of free ribosomes and polyribosomes, and also short profile reservoirs of granular vesicle cells, have been found. The number of many small Golgi reservoirs increased without signs of swelling. Peripheral cells showed only transparent single vacuoles and dark corpuscles.

모든 동물들은 마엘린 분열, 회복, 내부 중추 실린더의 압축 형태의 상당히 변한 마엘린 섬유를 나타냈고, 결과적으로 크고 밝은 공간의 존재를 보였다. 실험 랫트는 특정 마엘린 섬유의 회복된 동종을 나타내었다. All animals showed significantly altered maelin fibers in the form of malin cleavage, recovery, compression of the inner central cylinder, and consequently the presence of large, bright spaces. Experimental rats showed recovered allogenes of certain maelin fibers.

시냅스의 변이는 후-시냅스 형성의 실모양의 퇴화로 나타났다. 실험 랫트는 정상 (덴드로-덴드라틱) 시냅스의 상당히 큰 영역을 나타내었다. Mutations in the synapse resulted in threaded degeneration of post-synaptic formation. Experimental rats showed a fairly large area of normal (dendro-dendratic) synapses.

실험 동물의 상위 척수 부분은 신경 세포 및 그들의 부산물에서 비슷한 변이를 나타내었다. 뉴런은 기능적 긴장의 증상을 나타내었다. 세포 세포질은 많은 수의 리소좀을 가졌지만, 몇몇 마이토콘드리아에서는 크리스타가 보이지 않았다. 골지체는 적당하게 부풀어 보였다. 핵질은 세포 핵에서 염색질의 극도로 조밀한 위치때문에 응축되었다. 신경 섬유는 적당한 마엘린 박리작용과 중추의 실린더 압축을 나타냈다. The upper spinal cord portion of the experimental animals showed similar variations in neurons and their byproducts. Neurons showed symptoms of functional tension. The cytoplasm of the cell had a large number of lysosomes, but in some mitochondria no crista was seen. Golgi had a moderate swelling. Nuclei condensed due to the extremely dense position of chromatin in the cell nucleus. Nerve fibers showed moderate maelin detachment and central cylinder compression.

상기 변이는 H-Glu-Asp-Arg-OH 펩타이드를 처리한 랫트에서 덜 심하였다. 핵질은 정상으로 보였고 더 균일한 골지 저장소를 가졌다. 소포 망 통로는 그들의 이용을 위한 폐기 기관(waste organoid)의 잔여물을 포함하는 큰 액포를 형성하였다. 그러나, 세포 세포질은 여전히 과도한 리소좀 뿐만 아니라 무작위로 위치한 크리스 타와 함께 부푼 마이토콘드리아를 나타냈다. 마엘린 섬유는 매우 많은 경우에서 정상적 외관을 가졌다. The mutation was less severe in rats treated with H-Glu-Asp-Arg-OH peptide. Nucleus appeared normal and had a more uniform Golgi reservoir. The vesicle network passages formed large vacuoles containing the residues of the waste organoids for their use. However, the cellular cytoplasm still exhibited bloated mitochondria with randomly positioned crista as well as excess lysosomes. The maelin fibers have a normal appearance in very many cases.

이와 같이, 척수 외상이 있는 동물에게 H-GIu-Asp-Arg-OH 펩타이드의 투여는 척수 뉴론 재생을 자극하는 효과를 나타내었다. As such, administration of H-GIu-Asp-Arg-OH peptide to animals with spinal cord trauma showed an effect of stimulating spinal cord neuronal regeneration.

실시예 6. 저산소의 경우에 랫트 대뇌 피질에서 자유 라디칼 산화 반응의 강도에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과Example 6 Effect of Peptide H-Glu-Asp-Arg-OH on the Intensity of Free Radical Oxidation in the Rat Cerebral Cortex in the Case of Hypoxia

18마리의 백색 잡종 랫트에서 연구가 수행되었다. 살균한 0.9% NaCl 용액 1.0 ml 중 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH를 1 μg의 투여량으로 10일 동안 하루에 한번씩 동물들의 근육내에 투여되었다. 동물에 펩타이드의 투여가 끝난 후 24시간에 저산소성 저산소증(hypoxic hypoxia)에 걸렸다. 저산소증은 상기 해발 9000m의 고도에 일치하는 0.029MPa인 흐름-배출기 유형의 감압기(altitude chamber)에서 만들어졌다. 압축과 감압률은 분당 0.005 MPa로 만들었다. 이산화탄소 및 수분 흡수제가 감압기에 존재하였다. 동물들은 자유 수행 및 지속적인 관찰 하의 조건에서 3시간 동안 챔버에서 유지되었다. The study was conducted in 18 white hybrid rats. Peptide H-GIu-Asp-Arg-OH in 1.0 ml of sterile 0.9% NaCl solution was administered intramuscularly once daily for 10 days at a dose of 1 μg. Animals developed hypoxic hypoxia 24 hours after the end of the peptide administration. Hypoxia was created in an altitude chamber of a flow-exhaust type of 0.029 MPa, corresponding to an altitude of 9000 m above sea level. Compression and decompression were made at 0.005 MPa per minute. Carbon dioxide and moisture absorbent were present in the pressure reducer. Animals were kept in the chamber for 3 hours under conditions of free performance and continuous observation.

과산화 지질 산화(POL)의 강도는 뉴론 손상에서 중요한 역할을 하고 있는, 초기 POL 생산물, 즉 디엔 접합체, 및 최종 생산물, 즉 쉬프 염기 수준을 판단함으로써 평가되었다. 단백질 과산화물의 수준은 2,4-디니트로페닐히드라신과 상호작용 후 단백질에서 카르보닐 유도체 아미노산의 수준에 의해 평가되었다. The strength of lipid peroxide oxidation (POL) was assessed by judging initial POL products, ie diene conjugates, and final products, ie, Schiff base levels, which play an important role in neuronal damage. The level of protein peroxide was assessed by the level of carbonyl derivative amino acids in the protein after interaction with 2,4-dinitrophenylhydracin.

H-GIu-Asp-Arg-OH 펩타이드가 대뇌 피질에서 POL 생산물 생성을 억제하는 것이 발견되었다. 펩타이드는 디엔 접합체의 수준의 통계적으로 상당한 감소와 쉬프 스 염기 함량의 감소를 야기했다. 펩타이드는 또한 POL(표 2)과 함께 단백질 과산화물을 억제했다. It has been found that H-GIu-Asp-Arg-OH peptides inhibit the production of POL products in the cerebral cortex. Peptides resulted in a statistically significant decrease in the level of diene conjugates and a decrease in the Schiff base content. Peptides also inhibited protein peroxides with POL (Table 2).

데이타는, 저산소의 영향을 받은 동물에게 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH의 투여가 POL 생산물의 생산 및 대뇌 피질에서 단백질 과산화를 억제한다고 나타냈다. The data indicated that administration of peptide H-GIu-Asp-Arg-OH to hypoxic affected animals inhibited the production of POL products and protein peroxidation in the cerebral cortex.

실시예 7. 가재(crayfish Astacus) 렙토닥틸루스의 분리된 뉴런의 수명에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과Example 7 Effect of Peptide H-Glu-Asp-Arg-OH on Lifespan of Isolated Neurons of Crayfish Astacus Leptodactylus

가재의 수명에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 인비트로 연구를 위해 가재 렙토닥틸루스의 분리된 뉴론을 아폽토시스에 의한 세포사멸의 모델로 여겨지는 절단(axotimia)으로 추출하였다. For in vitro studies of the peptide H-Glu-Asp-Arg-OH on the life of the crawfish, isolated neurons of lobster leptodactylus were extracted with axotimia, which is considered a model of apoptosis by apoptosis.

가재의 펴진 수용체 뉴론은 그들의 전기생리학, 생물학 및 구조적 특성에 의해 척수의 중앙 뉴론과 근접하게 닮았다. 이들은 10-15시간 동안 거의 변함없는 속도와 함께 스파이크를 만든다. 복절에서 추출한 두개의 대칭적인 뉴론(대조 및 실험)은 Harreveld 용액 2 ml로 채운 챔버에 두었다. 뉴론 전위(Neuronal potentials)는 고정된 유리 파이펫 전극봉으로 신경돌기에서 세포 밖으로 기록되었고, 그 다음 H-338 기록계를 사용하여 증폭되고 기록되었다. 동시에 활동 전위의 주파수를 두개-채널의 아날로그 주파수 측정기 및 H-339 데이타 기록계를 이용하여 기록되었다. 실험 초기에는 실험과 대조 뉴런의 자극 주파수를 근육 이완에 의해 10-15 Hz의 수준에 맞춰졌다. 일정한 속도의 안정한 스파이크 생성 1시간 후 10 μg/ml의 농도에서 펩타이드 H-GIu-Asp-Arg-OH를 실험 챔버에 첨가시켰다. 뉴론의 활성은 스파이크 생성의 자연스런 종결 전에 지속적으로 기록되었다. 뉴런의 수명은 각각의 쌍에 대해 비교하였다. 뉴런의 10쌍 모두가 사용되었다. Lobster's expanded receptor neurons resemble central neurons in the spinal cord by their electrophysiology, biology and structural properties. They create spikes with almost constant speed for 10-15 hours. Two symmetric neurons (control and experiment) extracted from the abdomen were placed in a chamber filled with 2 ml of Harreveld solution. Neuronal potentials were recorded out of cells in neurites with fixed glass pipette electrodes, and then amplified and recorded using an H-338 recorder. At the same time the frequency of the action potential was recorded using a two-channel analog frequency meter and an H-339 data recorder. At the beginning of the experiment, the stimulation frequencies of the experimental and control neurons were adjusted to levels of 10-15 Hz by muscle relaxation. Peptide H-GIu-Asp-Arg-OH was added to the experimental chamber at a concentration of 10 μg / ml after 1 hour of stable spike production at a constant rate. Neuron activity was recorded continuously before the natural end of spike formation. Neuron lifespans were compared for each pair. All 10 pairs of neurons were used.

정해진 주파수에 의해 비교적 안정한 작업 8-10시간 후 분리된 뉴런 자극의 자연스런 종결이 가는 수초길이의 주파수 변동의 형태로 일어났고, 그 후 수분의 더 느린 리듬이 나타났다. 활동 전위의 평균 주파수는 감소되었고, 그리고 나서 특정 자극이 떨어지기 시작했고, 맥동이 무질서해지고 곧 사라졌다. After 8-10 hours of relatively stable work by a given frequency, the natural termination of the isolated neuronal stimulus occurred in the form of a narrow, several-second frequency shift, followed by a slower rhythm of moisture. The average frequency of action potentials decreased, then certain stimuli began to drop, and the pulsations became disordered and soon disappeared.

본 연구는 H-GIu-Asp-Arg-OH 펩타이드가 분리된 뉴런의 수명을 15%까지, 평균 11.9 내지 13.7 시간으로 연장시키는 것을 밝혀내었다(표 3).The study found that H-GIu-Asp-Arg-OH peptide extended the lifespan of isolated neurons by 15%, on average from 11.9 to 13.7 hours (Table 3).

펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효과 하에서 뉴런의 지체된 사멸은 전기생리학적인 막 과정 및 내부세포 대사과정에 그것의 영향과 관련있는 펩타이드의 신경세포 보호효과를 확인한다. The delayed killing of neurons under the effect of peptide H-Glu-Asp-Arg-OH confirms the neuronal protective effect of peptides related to their effects on electrophysiological membrane processes and internal cell metabolic processes.

실시예 8. 두개골 외상이 있는 환자에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH의 효능Example 8 Efficacy of Peptide H-Glu-Asp-Arg-OH in Patients with Cranial Trauma

본 연구는 무작위하게 두개의 그룹으로 다시 나뉜, 두개골 외상의 후유증이 있는 31-60세의 25명 환자에게 수행되었다. 이러한 환자들은 1 내지 10년 전에 두개골 외상을 겪었다. 주요 그룹의 환자들은 두개골 외상의 심각성에 따라 3개의 그룹으로 다시 나뉘었다. 두개골 외상이 가장 심각한 후유증이 있는 환자들은 살균한 0.9% NaCl 용액 1 ml 중 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH가 포함된 약제학적 조성물을 5.0 mg의 투여량으로 10일 동안 하루에 한번씩 근육내에 투여받았다. 중간정도 심각성의 두개골 외상 후유증이 있는 주요 그룹 환자들은 살균한 0.9% NaCl 용액 1 ml 중 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH가 포함된 약제학적 조성물을 10.0 μg의 투여량 으로 10일 동안 하루에 한번씩 근육내에 투여받았다. 가벼운 심각성의 두개골 외상 후유증이 있는 주요 그룹 환자들은 살균한 0.9% NaCl 용액 1 ml 중 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH가 포함된 약제학적 조성물을 1.0 μg의 투여량으로 10일 동안 하루에 한번씩 근육내에 투여받았다. The study was performed on 25 patients aged 31-60 years with sequelae of cranial trauma, randomly divided into two groups. These patients suffered cranial trauma 1 to 10 years ago. Patients in the main group were subdivided into three groups according to the severity of cranial trauma. Patients with the most severe sequelae of cranial trauma were given intramuscularly once daily for 10 days with a 5.0 mg dose of a pharmaceutical composition containing peptide H-Glu-Asp-Arg-OH in 1 ml of sterile 0.9% NaCl solution. Received. The main group of patients with moderate to severe cranial trauma sequelae received a pharmaceutical composition containing peptide H-Glu-Asp-Arg-OH in 1 ml of sterile 0.9% NaCl solution at a dose of 10.0 μg per day for 10 days. Once intramuscularly. Patients with a major severity of cranial trauma have had a pharmaceutical composition containing peptide H-Glu-Asp-Arg-OH in 1 ml of sterile 0.9% NaCl solution once daily for 10 days at a dose of 1.0 μg. Administered intramuscularly.

대조 환자들은 살균한 0.9% NaCl 용액을 같은 양 및 같은 일정으로 투여 받았다. Control patients received sterile 0.9% NaCl solution in the same amount and on the same schedule.

펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물의 투여는 전체 환자 수의 59.4%에서 좋은 임상적 결과를, 31.9%에서 만족한 결과를, 8.7%에서 긍정적이지 않은 효과를 야기했다. 어느 환자의 상태에서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물의 부정적인 효과는 기록되지 않았다. 환자들은 기억력 증진, 두통의 강도 및 지속시간의 감소, 더 나은 기분적 안정성, 뿐만 아니라 야간 수면 후 휴식을 취한 느낌을 보고했다. Administration of the pharmaceutical composition comprising the peptide H-Glu-Asp-Arg-OH resulted in good clinical results in 59.4% of the total number of patients, satisfactory results in 31.9%, and no positive effects in 8.7%. Negative effects of pharmaceutical compositions comprising peptide H-Glu-Asp-Arg-OH in the condition of any patient were not recorded. Patients reported increased memory, decreased headache intensity and duration, better mood stability, as well as a feeling of rest after night sleep.

H-Glu-Asp-Arg-OH 펩타이드를 포함한 약제학적 조성물의 효능은 뇌의 통합 기능에서 효과, 즉 주의력, 및 정확한 테스트 및 뇌파도를 사용한 뇌의 생체전기 활성에 의해 판단하여 측정되었다. The efficacy of pharmaceutical compositions comprising H-Glu-Asp-Arg-OH peptide was determined by judging the effect on brain integration functions, namely attention, and bioelectric activity of the brain using accurate tests and electroencephalogram.

여러 투여량의 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물로 처리된 주요 그룹의 환자들은 등록된 특징의 수가 통계적으로 상당히 증가했고, 뿐만 아니라 보정 테스트에서 오류의 수도 감소됨을 나타내었다(표 4). Patients in the main group treated with pharmaceutical compositions containing multiple doses of peptide H-Glu-Asp-Arg-OH showed a statistically significant increase in the number of registered features, as well as a reduction in the number of errors in calibration tests. (Table 4).

여러 투여량의 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물로 처리된 환자들은 대조군와 비교하여 처리 전 및 후 보정 테스트 수행 역학의 분석에서 더 나은 결과를 나타내었다. 이것은 같은 기간동안 기록된 징후의 수에서 급격한 변동이 없고, 테스트의 마지막 곡선의 점진적인 감퇴와 테스트 중간까지의 "적응"기간이 있는 것으로 명백한데, 이것은 주요 그룹 환자의 주의력의 더 나은 안정성을 지적한다. Patients treated with pharmaceutical compositions containing multiple doses of peptide H-Glu-Asp-Arg-OH showed better results in the analysis of the calibration test performance kinetics before and after treatment compared to the control. It is evident that there is no drastic change in the number of signs recorded during the same period, and there is a gradual decay of the last curve of the test and a "adaptation" period to the middle of the test, indicating a better stability of the attention of the main group of patients. .

뇌의 생체전기 활성에 대한 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물의 효과의 평가는 치료 전 후 알파 지표의 산출에 의해 수행되었다. 뇌의 생체전기 활성의 가장 현저한 변화는 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물로 처리한 후 주요 그룹의 환자들에게서 발견되었다-알파 지표의 상당한 증가가 처리의 결과로 발생했다(표 5).Evaluation of the effect of the pharmaceutical composition comprising the peptide H-Glu-Asp-Arg-OH on the bioelectric activity of the brain was performed by the calculation of the alpha index before and after treatment. The most significant change in brain bioelectric activity was found in major groups of patients after treatment with pharmaceutical compositions containing peptide H-Glu-Asp-Arg-OH—a significant increase in alpha indicators occurred as a result of treatment. (Table 5).

이와같이, 데이타는 뉴론 재생 자극에 의한 두개골 외상의 후유증이 있는 환자에게서 뇌 세포의 통합 기능에 대해 이것의 활성 기저로서 펩타이드 H-Glu-Asp-Arg-OH를 포함한 약제학적 조성물의 효능을 확인한다. As such, the data confirms the efficacy of a pharmaceutical composition comprising peptide H-Glu-Asp-Arg-OH as its active basis for brain cell integration in patients with sequelae of cranial trauma by neuronal regeneration stimulation.

Figure 112008079502735-pct00003
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* 대조군과 비교하여 -P<0.05 * -P <0.05 compared to control

Figure 112008079502735-pct00004
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* 대조군와 비교하여 -P<0.01* -P <0.01 compared to control

Figure 112008079502735-pct00005
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* 대조군와 비교하여 -P<0.05       * -P <0.05 compared to control

Figure 112008079502735-pct00006
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* 치료 전 환자들의 지표와 비교하여 -P<0.05* -P <0.05 compared to the indicators of patients before treatment

# 일반적으로 사용되는 약제로 치료한 환자들의 지표와 비교하여 -P<0.05-P <0.05 compared to indicators of patients treated with commonly used drugs

Figure 112008079502735-pct00007
Figure 112008079502735-pct00007

* 치료 전 환자들의 지표와 비교하여 -P<0.01* -P <0.01 compared to the indicators of patients before treatment

# 일반적으로 사용되는 약제 치료한 환자들의 지표와 비교하여 -P<0.05-P <0.05 compared to indicators of commonly used medication

SEQUENCE LISTING <110> Obschestvo s ogranichennoi otvetstvennostyu "SIA PEPTIDES" <120> Peptide substance stimulating regeneration of central nervous system neurons, pharmaceutical composition on its base, and the method of its application <130> 24-00359RU <150> 2006118494 <151> 2006-05-30 <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide compound H-Glu-Asp-Arg-OH stimulating central nervous system neurons regeneration by means of restoring the synthesis of tissue specific proteins, antioxidant effect, normalization of metabolism and bioelectric activity of neurons. <400> 1 Glu Asp Arg 1                          SEQUENCE LISTING <110> Obschestvo s ogranichennoi otvetstvennostyu "SIA PEPTIDES"   <120> Peptide substance stimulating regeneration of central nervous        system neurons, pharmaceutical composition on its base, and the        method of its application <130> 24-00359RU <150> 2006118494 <151> 2006-05-30 <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide compound H-Glu-Asp-Arg-OH stimulating central nervous        system neurons regeneration by means of restoring the synthesis        of tissue specific proteins, antioxidant effect, normalization of        metabolism and bioelectric activity of neurons. <400> 1 Glu Asp Arg One

Claims (6)

일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌.Peptide glutamyl-aspartyl-arginine having the general formula H-Glu-Asp-Arg-OH sequence 1 [SEQ ID NO: 1]. 뉴런의 재생을 자극할 수 있는, 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌.Peptide glutamyl-aspartyl-arginine with the general formula H-Glu-Asp-Arg-OH sequence 1 [SEQ ID NO: 1], which can stimulate regeneration of neurons. 활성 기저 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 중추신경계의 질병, 외상 또는 외상 후유증의 치료를 위한 약제학적 조성물로, 상기 조성물은 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]을 갖는 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌의 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition for the treatment of diseases, trauma or traumatic sequelae of the central nervous system, comprising an active basis and a pharmaceutically acceptable carrier, the composition comprising the general formula H-Glu-Asp-Arg-OH SEQ ID NO: 1 as the active basis. A pharmaceutical composition, characterized in that it comprises an effective amount of peptide glutamyl-aspartyl-arginine with [SEQ ID NO: 1]. 제3항에 있어서, 비경구적 투여를 위한 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.4. A pharmaceutical composition according to claim 3, which is present in the form for parenteral administration. 중추 신경 시스템 뉴런 재생의 자극 방법으로, 활성 기저로서 일반식 H-Glu-Asp-Arg-OH 서열 1 [SEQ ID NO:1]인 펩타이드 글루타밀-아스파틸-아르기닌을 포함하는 조성물을 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 기간동안 하루에 한번 이상 0.01-100 μg/체중kg의 투여량으로 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것으로 이루어지는 방법. As a method of stimulating regeneration of central nervous system neurons, a composition comprising peptide glutamyl-aspartyl-arginine having the general formula H-Glu-Asp-Arg-OH sequence 1 [SEQ ID NO: 1] as an active basis for therapeutic effects A method comprising administering to a non-human animal at a dosage of 0.01-100 μg / kg body weight at least once a day for the period necessary to achieve. 제5항에 있어서, 상기 투여가 비경구적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 5, wherein said administration is carried out parenterally.
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