KR101273264B1 - 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프 및 이를 이용한 재조합 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 어류 노다바이러스 단백질의 단배질의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 및 이를 이용한 백신, 항체, 어류를 면역시키는 방법, 어류 노다바이러스 질병의 진당방법을 제공한다.
Description
본 발명은 어류 노다바이러스 단백질들 중에서 항원성을 제공하는 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 및 이를 이용한 백신, 항체, 어류를 면역시키는 방법, 어류 노다바이러스 질병의 진단방법에 대한 것이다.
어류 노다바이러스는 양성 센스방향 단일 가닥 RNA(positive-sense single-stranded RNA)를 유전자(genome)로 지니고 있으며, 외막이 없는 25-30 nm 크기의 이십면체(icosahedron) 모양을 갖는 바이러스이다. 이렇게 어류에 질병을 일으키는 바이러스는 베타나노바이러스 속(genus betanodavirus)으로 분류하고 있다.
어류 노다바이러스는 바이러스성 뇌질환 및 망막 질환(viral encephalopathy and retinopathy, VER)과 바이러스성 신경괴사증(viral nervous necrosis, VNN)을 유발하는 병원체로서, 전 세계적으로 많은 양식 어류의 자어 및 치어기에 대량 폐사를 유발하는 것으로 알려져 있다.
이런 어류 노다바이러스에 감염된 자어 및 치어의 경우 폐사율이 100%에 이른다. 이는 우리나라의 대표적 양식 어류인 넙치에 빈번하게 발생하며, 양식 환경 내에 유기물이 많거나 다른 질병과 복합감염이 일어날 경우의 폐사율도 높다.
그리하여 어류 노다바이러스에 의한 피해를 막기 위해 백신의 개발이 요구되고 있다. 특히, 어류에서 발생하는 질병을 치료하기 위해 사용되는 화학 약품이 사용되고 있는데, 화학 약품을 섭취한 어류를 인간이 식량으로 이용하였을 때 인체에 해를 끼칠 염려가 있다. 따라서 어류 스스로의 면역체계를 이용한 백신의 개발과 사용에 대한 필요성이 커지고 있다.
이에 본 발명자들은 경제적이고 효과적인 어류 노다바이러스 예방 방법에 대하여 연구를 하던 중, 어류 노다바이러스의 단백질의 에피토프를 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 숙주세포에 의해 생산된 재조합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프를 포함하는 백신 조성물, 상기 에피토프에 대한 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 이용하여 어류를 면역시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 이용하여 어류 노다바이러스 질병의 진단 방법 및 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신을 포함하는 사료 조성물 및 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는, 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
상기 어류 노다바이러스는 넙치에서 분리될 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 어류 노다바이러스의 캡시드 단백질(capsid protein), B1 및 는 B2 단백질 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포에 의해 생산된 재조합 단백질을 제공한다.
상기 재조합 발현 벡터, 숙주세포 및 재조합 단백질은 이 기술분야에서 널리 알려진 방법에 의해 만들 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
상기 백신은 생백신, 약독화 백신 또는 사 백신일 수 있으며, 백신을 사료 또는 사료 첨가제로도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 백신에는 보조제(adjuvant)를 더 첨가할 수 있다. 상기 보조제는 이 기술분야에 알려진 것은 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 안정화제로서 당류나 아미노산류, 또한 보조제로서 광물유,식물유, 백반, 인산알루미늄, 벤토나이트, 실리카, 무라밀디펩타이드(muramyl dipeptide) 유도체, 사이모신, 인터류킨 등을 이용할 수 있다.
상기 백신은 어류의 복강 내에 투여할 수 있으며, 산란전, 산란 중에 1회 또는 반복하여 접종할 수 있다. 접종량은 통상의 어류 바이러스 백신 투여량과 동일하다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 백신 조성물을 어류에 투여하여 어류를 면역시키는 방법을 제공한다. 상기 백신 조성물에 세균 불활화 백신을 혼합하여 어류에 투여할 수 있으며, 상기 세균 불활화 백신은 연쇄구균 불활화 백신일 수 있다. 이 기술분야에서 일반적으로 사용하는 혼합 비율대로 상기 백신 조성물과 세균 불활화 백신을 혼합할 수 있으며, 1:1로 혼합하는 것이 바람직하다. 세균바이러스 혼합 백신의 경우 한 번에 여러 가지 질병을 예방할 수 있기 때문에, 경제적, 시간적으로도 단독 백신에 비해 유리하다.
상기 면역의 대상이 되는 어류에는 제한이 없으며, 노다바이러스 감염 우려가 높은 넙치가 포함될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프를, 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다.
상기 항체는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 항원으로 하여 제조되며, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 인식하는 항체일 수 있다.
상기 항체는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 항원으로 하여 제조되며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 인식하는 항체일 수 있다.
상기 항체는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 항원으로 하여 제조되며, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 인식하는 항체일 수 있다.
상기 항체는 단클론 또는 다클론 항체일 수 있으며, 넙치 등 어류의 어류노다바이러스에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 어류 노다바이러스를 포함하는 시료에 반응시키고, 상기 항체에 대한 양성반응을 나타내는 시료를 어류노다바이러스에 감염된 것으로 판단하는 것을 포함하는 어류 노다바이러스 질병의 진단방법을 제공한다.
상기 양성반응 확인은 통상의 항체-항원 반응을 탐지하는 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 또는 항체의 단편에 방사선동위원소, 형광물질, 발광물질, 효소, 크로모젠(chromogen), 및 염색물질로 이루어진 군에서 선택된 표지물질을 표지하고하고, 상기 표지물질에 의한 반응결과를 검출하여 수행할 수 있다. 구체적인 방법으로 ELISA 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 에피토프를 인식하는 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 어류 노다바이러스 질병 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는, 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 3의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 프로브로 사용하는 것을 제외하고는 통상의 핵산 키트와 동일하다.
본 발명에 따른 어류 노다바이러스의 에피토프를 이용하면 어류 노다바이러스에 효과적인 백신 및 항체를 개발할 수 있고, 어류 노다바이러스 질병을 신속하게 진단할 수 있다.
도 1은 어류 노다바이러스의 유전자 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 E.coli에서 발현된 재조합 단백질을 니켈 컬럼을 사용하여 순수 분리하여 SDS-PAGE 전기연동시켜 얻은 결과이다.
도 3은 JFNVV-감염 넙치로부터 얻은 5개의 혈청 샘플에 대하여 항JFNVV-WD 중화 활성과 바이러스 단백질의 반응성을 조사하여 나타낸 것이다.
도 4는 노다바이러스를 주사한 넙치에서 얻은 항혈청을 가지고 수행한 웨스턴 블럿 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 단백질인 캡시드, B1 및 B2 단백질을 넙치에 주입하여 얻은 항체(항-재조합 단백질)에 대한 웨스턴 블럿 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 ELISA 및 중화 테스트에 의한 어류 노다바이러스에 대한 항체 역가를 나타낸 그래프이다.
도 7은 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 단백질 백신과 연쇄구균 불활화 백신 처리 후의 넙치의 상대적인 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 단백질 백신에 대한 넙치의 ELISA 항체가를 나타낸 것이다.
도 9는 순수 분리한 노다바이러스에 대한, 재조합 단백질을 주사한 넙치 혈청의 ELISA 항체가를 나타낸 것이다(재조합 단백질에 대한 감염 넙치의 항혈청가).
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 백신을 주입한 돌돔(A)와 넙치(B)의 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 11 내지 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신을 넙치에 처리한 2주 후의 넙치의 조직 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 E.coli에서 발현된 재조합 단백질을 니켈 컬럼을 사용하여 순수 분리하여 SDS-PAGE 전기연동시켜 얻은 결과이다.
도 3은 JFNVV-감염 넙치로부터 얻은 5개의 혈청 샘플에 대하여 항JFNVV-WD 중화 활성과 바이러스 단백질의 반응성을 조사하여 나타낸 것이다.
도 4는 노다바이러스를 주사한 넙치에서 얻은 항혈청을 가지고 수행한 웨스턴 블럿 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 단백질인 캡시드, B1 및 B2 단백질을 넙치에 주입하여 얻은 항체(항-재조합 단백질)에 대한 웨스턴 블럿 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 ELISA 및 중화 테스트에 의한 어류 노다바이러스에 대한 항체 역가를 나타낸 그래프이다.
도 7은 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 단백질 백신과 연쇄구균 불활화 백신 처리 후의 넙치의 상대적인 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 단백질 백신에 대한 넙치의 ELISA 항체가를 나타낸 것이다.
도 9는 순수 분리한 노다바이러스에 대한, 재조합 단백질을 주사한 넙치 혈청의 ELISA 항체가를 나타낸 것이다(재조합 단백질에 대한 감염 넙치의 항혈청가).
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 백신을 주입한 돌돔(A)와 넙치(B)의 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 11 내지 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신을 넙치에 처리한 2주 후의 넙치의 조직 변화를 나타낸 것이다.
이하에서는, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 재료 및 방법
1-1: 세포 및 바이러스
GF-1 세포(ATCC에서 구입)는, 5% FBS(GibcoBRL, Carlsbad, USA) 및 100 ㎍의 페니실린-스트렙토마이신/ml을 첨가한 L-15 배지(GibcoBRL, Carlsbad, USA)를 이용하여 28℃로 유지하였다. 한국의 양식 넙치로부터 분리한 베타노다바이러스 JFNNV-WD를 사용하였다(Acession No. FJ748760).(Cha 등, Phylogenic analysis of betanovirus isolated from cultured fish in Korea, Dis Aquat . Organ, 77:181-189, 2007).
1-2: 어류
평균 체중이 20 g인 양식 넙치(Paralichthys olivaceus)를 이용하여 면역 혈청을 준비하였다. 넙치는 약 25℃, 물이 흐르는 환경 조건(flow through system) 하에서 1 m3 탱크 내에서 배양되었다. 본격적인 실험에 앞서, 어류 저장고에서 무작위로 선택한 10개의 넙치로부터 뇌와 망막을 수집하여 RT-PCR을 수행한 결과, 노노다바이러스에 음성이 나타남을 확인하였다.
1-3: 바이러스(Virus inoculum)
감염된 넙치로부터 바이러스를 준비하였다(Cha 등, Dis Aquat. Organ, 77:181-189, 2007). 감염된 뇌와 눈을, 이것과 동일한 부피의 MEM(minimum essential medium) Leibovitz L-15 미디엄(Gibco BRL, USA)-SSN-1 세포 배지(SSN-1 세포는 유럽 셀 뱅크에서 구입)를 이용하여 균질화시켰고 1500 g로 15분 동안 원심분리하였다. 상등액을 0.45 ㎛ 막 필터를 통과시켜서 얻은 후 이를 -80℃에서 보관하였다. 이 바이러스 스톡을 "JFNNV-WD"라 명명하였으며, 그 역가는 107 TCID50(median tissue culture infective dose)/ml 임을 확인하였다.
1-4: cDNA 클로닝
cDNAs는 JFNNV-WD에 감염된 GF-1 세포의 총 RNA로부터 합성하였다. JFNNV-WD의 캡시드, B1 및 B2 단백질에 대응하는 전장 cDNA를 증폭시키기 위해서 GenBank/EMBL 데이터베이스(GenBank accession no. FJ748760 및 DQ864760)를 이용하여 PCR 프라이머를 제작하였다. 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
| 프라이머 | 서열 | 서열번호 |
| Noda-Capsid-F | 5'-AAGCTTGCATGGTACGCAAGGGTGAGAA-3' | 4 |
| Noda-Capsid-R | 5'-CTCGAGGTTTTCCGAGTCAACCCTGGT-3' | 5 |
| Noda-B1-F | 5'-GGATCCATGTCTGTCGCATTGACGGG-3' | 6 |
| Noda-B1-R | 5'-GTCGACCACTTGAGTGCGACGTCGCCG-3' | 7 |
| Noda-B2-F | 5'-GGATCCATGGAACAAATCCAACAAGCG-3' | 8 |
| Noda-B2-R | 5'-GTCGACGTCCGTCTCCATCGGTTCCTC-3' | 9 |
*F는, 정방향 프라이머, R은 역방향 프라이머, 이탤릭체 글자는 제한 효소 위치를 나타낸다.
PCR은 바이러스에 감염된 GF-1 세포를 주형으로 사용하여, 이의 cDNA를 가지고 수행하였다. 유전자 증폭 조건은 다음과 같다: 94℃에서 5분 동안 1 사이클; 92℃ 30초, 50℃ 1분 및 72℃ 1분에서 30 사이클; 그리고 72℃ 5분에서 1 사이클. 증폭된 PCR 산물은 제한효소(캡시드의 경우는, Sal I (Hind III) 및 Xho I; B1 및 B2는, BamH I, Hind III(Sal I))를 이용하여 분해한 후 pET28a 벡터(Novagen, Darmstadt, Germany)에 삽입하여 플라스미드를 생산하였다. 이 플라스미드를 "pET-B1-JFNNV", "pET-B2-JFNVV" 및 "pET-capsid-JFNVV"라고 명명하였다. 상기 DNA 삽입물의 서열은, 한국 울산 소재의 면역제어연구센터(IRC, Immunomodulation Research Center)에서 자동 DNA 서열분석기(Applied Biosystems, Inc., USA)를 이용하여 측정하였다.
1-5: 재조합 단백질의 발현 및 정제
JFNNV-WD의 재조합 단백질를 발현시키기 위해서, E.coli BL21(DE3) 세포를 pET-B1-JFNNV, pET-B2-JFNVV 및 pET-capsid-JFNVV로 형질전환시켰다. His-태그된 단백질을 이용하여 E.coli 에서 재조합 단백질을 발현시켰고, Ni-NTA His-결합 수지에서 정제하였다. 이는 제조사(Novagen)의 매뉴얼에 따라 수행하였다.
1-6: 면역화 및 항혈청
넙치 무게 1g 당 100 ng의 정제된 상기 재조합 단백질들을 넙치(20 g) 복강 내에 두 번 투여하였다. 보조제로 미네랄 오일을 사용하였다. 마지막 면역화 이후 4주가 지났을 때에 넙치의 미동맥에서 출혈이 일어났고, 혈청을 원심분리틀 통해 수득하여 -20℃에서 저장하였다.
1-7: 생존 어류로부터 혈청 수집
20 마리의 넙치(20 g/fish)에 바이러스 여과물(virus filtrate)을 1055 TCID50/fish 도스의 비율로 복강 내에 투여하였다. 투여일로부터 15일이 지난 후에 이들 어류로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 4℃에서 밤새 보관한 후, 5분 동안 1500 g로 원심분리를 하여 혈청을 수득하였고, 80℃에서 보관하였다. 아무 처리도 하지 않은 넙치 5마리에서 대조군으로 사용할 혈청을 수집하였다.
1-8: ELISA
면역화된 넙치로부터 얻은 항혈청을 가지고, ELISA를 이용하여, 캡시드, B1 및 B2 단백질에 대한 항체 분석을 수행하였다. 마이크로타이터 플레이트(Nune, Roskilde, Denmark)가 코팅 버퍼(0.5 M carbonate-bicarbonate, pH 9.6)에서 4℃, 16 시간 동안 2 ㎍ 재조합 단백질/ml로 코팅되었다. 0.05% 트윈 20이 포함된 PBS 에서 두배단계 희석법으로 연속적으로 희석된 항혈청이 첨가되었고, PBS-트윈 20(0.05%)로 세번 세척되었다. 어류 혈청이 없는 4개의 웰(well)이 음성 대조군으로 사용되었다. 래빗 항-넙치 이뮤노글로불린이 공지 문헌에 기재된 방법에 따라 준비되었고(Bang J. D. 등, Dis Aquat. Organ., 26:197-203, 1996), 2차 항체로 사용되었다. 효소가 결합된 항체로 알칼린-포스페이트-컨쥬게이티드 고트 항-래빗 IgG(Sigma, St. Louis, USA)가 첨가되었고, 알칼린 포스파테이즈 기질인, p-니트로페닐 포스페이트(1 mg/ml in 0.1 M NaHCO3 및 1.0 mM MgCl2, pH 9.8)을 첨가하여 이를 감지하였다. 405 nm에서 흡광도를 읽었다. 항체 역가(titer)는, 음성 대조군보다 OD405 값이 두 배 큰 값을 가지는 혈청 희석 종말점(endpoint)의 역수로 나타내었다.
1-9: SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅
재조합 단백질은 환원 조건하에서 10% 세퍼레이팅 겔로 전기영동하였다. 표준 분자량(GIBCO-BRL)과 비교하여 분자량을 측정하였다. 아크릴아마이드 상의 상기 단백질들은 Hybond-P 멤브레인(Amersham Bioscience, Inc., Buckinghamshire, UK)으로 옮겨졌고, 감염 비리온(infectious virion)인 JFNNV-WD의 캡시드, B1 및 B2가 투여된 넙치로부터 얻은 항혈청을 이용하여 찾아냈다. 래빗 항-넙치 이뮤노글로불린(Ig)과 호스래디쉬 퍼옥시다아제 컨쥬게이티드 고트 항-래빗 IgG(Sigma)가 첨가되었고, 면역반응은 ECL 감지 시스템(Amersham Bioscience, Inc.)로 감지되었다.
1-10: 바이러스 중화 테스트
항혈청은 96-멀티웰 플레이트에서 EMEM으로 두배단계 희석법으로 연속적으로 희석되었다. 100 TCID50/50 ㎕의 새 바이러스가 각각의 웰에 첨가되었다. 플레이트들은 실온에서 1 시간 동안 계속 쉐이킹되면서 인큐베이션되었다. 각각의 웰에, 1 X 105 cells/㎖의 GF-1 세포 100 ㎕가 첨가되었고, 각각의 플레이트들은 28℃에서 7일 동안 더 인큐베이션되었다. 항혈청의 중화항체 역가는 접종 세포의 50%를 보호하는 항혈청의 가장 높은 희석값의 역수로 나타내었다.
실시예
2: 백신 제조
2-1: 백신 대상 유전자의 선별
노다바이러스 백신을 개발하기 위해서는, 노다바이러스 단백질들 중 면역성 단백질(immunogenic protein)을 확인하고 이들 중 어느 단백질에 중화 에피토프(epitope)가 존재하는지를 확인하여야 한다. 이를 위해 넙치에서 노다바이러스를 분리한 다음 넙치에 주사하여 항혈청을 얻어서 면역반응을 알아보았다.
도 1은 노다바이러스 유전자의 모식도를 나타낸 것이다. 실시예 1에서 설명한 것과 같이, JFNNV-WD의 캡시드, B1 및 B2에 대응하는 전장 cDNA를 PCR를 이용하여 증폭시켰다. 도 1에 나타난 것과 같이, 전장 B1은 단백질 A(aa 872-982)의 C-터미널에 대응함을 알 수 있다.
넙치에서 분리한 노다바이러스의 캡시드, B1 및 B2 단백질의 유전자들을 pET28a 발현 벡터에 서브 클로닝(subcloning)한 다음, 이를 E.coli BL21에서 발현시켰음은, 앞선 실시예 1에서 이미 설명하였다. E.coli에서 발현된 재조합 단백질들을 니켈 컬럼(nickel column)을 사용하여 분리하였다. His-태그된 단백질을 이용하여 재조합 단백질을 정제하고 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 아미노산 서열 분석기에 기초하여 예상한 캡시드, B1 및 B2 단백질의 분자량은 각각, 차례대로, 37.0 KDa, 11.9 KDa 및 8.5 KDa이었다. 도 2에 나타난 실제 결과는, His-태그 때문에, 각각의 분자량이 이것보다 약간 높게 나타났다.
어류 노다바이러스 감염에 대한 넙치의 면역 반응을 알아보기 위해, JFNVV-감염 넙치로부터 얻은 5개의 혈청 샘플에 대하여 항JFNVV-WD 중화 활성과 바이러스 단백질의 반응성을 조사하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 것과 같이, JFNVV-감염 넙치는 대조군과 비교하였을 때, 높은 중화 활성을 나타내었다.
또한, 혈청 속에 존재하는 항체가 노다바이러스의 어느 단백질을 인지하는지를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 수행하였다. 상기 웨스턴 블랏 분석 결과, 노다바이러스를 주사한 넙치의 혈청에는 캡시드, B1 및 B2에 대한 항체가 존재함을 도 4에 나타낸 밴드를 통해 확인할 수 있다.
캡시드, B1 및 B2 단백질의 아미노산 서열 분석 결과, 캡시드, B1 및 B2 단백질의 서열은 각각 서열번호 1, 2 및 3으로 나타났다.
2-2: 백신의 제조
노다바이러스의 캡시드, B1 및 B2의 재조합 단백질을 발현시키기 위해서 제작한 각각의 프라이머를 사용하여 획득한 PCR 산물을 용출시켜서 pGEM-T 이지 벡터에 클로닝하여 콜로니 PCR를 통해 각각의 재조합 유전자가 존재함을 확인하였다.
JFNNV-WD의 재조합 단백질를 발현시키기 위해서, E.coli BL21(DE3) 세포를 pET-B1-JFNNV, pET-B2-JFNVV 및 pET-capsid-JFNVV로 형질전환시켰다. 이렇게 하여 재조합 단백질을 합성하는 E. coli 균주를 제조하였다.
이렇게 제조한 E. coli pET-B1-JFNNV, pET-B2-JFNVV 및 pET-capsid-JFNVV 균주를 카나마이신(Kanamycin)이 첨가된 LB 배지에서 37℃로 4 시간 배양 후, IPTG(Isopropyl-β-D-thio-galactoside)를 0.1 mg/mL되게 첨가하여 6 시간 동안 배양하고 재조합 단백질이 발현되도록 하였다.
이렇게 발현된 재조합 단백질을 확인하기 위하여, 박테리아 용해물(bacteria lysate)을 SDS-PAGE 전기영동으로 확인하였다. 그리고 단백질 농도를 200 ug/kg (어체중)/0.1 mL 되게 희석하여 백신으로 사용하였다. 대량으로 발현된 단백질들을 니켈 어피너티 컬럼을 사용하여 분리하였다.
2-3: 재조합 단백질의 항혈청 제작 및 중화 실험
다음으로 3 종류의 재조합 단백질들 중 어느 단백질에 중화 에피토프가 존재하는지 확인하기 위하여 3 종류의 재조합 단백질 각각을 넙치에 주사하여 항혈청을 추출함으로써 3종류 각각에 대한 한 항체를 만들었다. 이들 항체가 실제 각각의 단백질을 인지하는 지를 확인하기 위하여, 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 그 결과 도 5와 같이, 캡시드, B1 및 B2 단백질에 대한 항체가 만들어졌음을 확인하였다.
상기 제조된 항체가 노다바이러스의 감염을 중화시키는지를 확인하기 위해, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 통하여 노다바이러스의 캡시드, B1 및 B2 단백질 등에 대한 항체 역가 및 중화 역가를 구하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 것과 같이, 3 종류의 단백질에 대한 항체 역가는 27 내지 28의 값을 나타냄을 알 수 있다.
다음으로, 이들 항체가 노다바이러스를 중화시킬 수 있는지를 중화 실험을 통해 분석하였다. 넙치에서 분리된 노다바이러스를 사용한 중화 실험 결과, 도 6에 나타난 것과 같이, B1 및 B2 단백질에 대한 항체의 경우 중화 역가가 각각 28.4와 24.9인데 반해, 캡시드 단백질에 대한 항체의 경우 중화 역가가 215.3으로서 높은 수치를 보였다. 이 결과로부터 노다바이러스에서 분리된 3 종류의 단백질 중 캡시드 단백질이 상대적으로 강력한 중화 에피토프(epitope)가 존재함을 확인할 수 있었다. 이는 캡시드 단백질이 노다바이러스의 백신의 항원으로 좀 더 적합함을 말해 준다.
이상의 결과로부터, 노다바이러스의 캡시드, B1 및 B2 단백질은 중화 에피토프를 지니는 단백질로서 노다바이러스 백신 대상으로 적합함을 알 수 있다.
실시예
3: 백신 효능 검증 실험
3-1: 면역원성 재조합 단백질 백신 및 세균 백신과 혼합에 따른 효능시험
실시예 2에서 제조한 재조합 단백질 백신(캡시드 포함-Rep 1, B1 포함-Rep 2)을 단독으로, 또는 3 개의 재조합 단백질 중 2개(캡시드 및 B1를 1: 1의 비율로 포함)를 혼합해서(Rep 1 + Rep 2), 또는 재조합 단백질(캡시드 및 B1를 1: 1의 비율로 포함) 및 연쇄구균 불활화 백신을 1:1로 혼합한 혼합 백신(Streptococcus + Rep 1,2)을 처리한 넙치에, 연쇄구균 streptococcus iniae(JSL0208)과 노다바이러스(JFNNV-WD(FJ748760))를 혼합하여 공격하는 시험을 하였다.
도 7에 나타난 것과 같이, 재조합 단백질이 포함된 백신과 연쇄구균(streptococcus) 불활화 백신을 혼합한 경우, 각각의 백신을 처리한 것보다 상대적으로 넙치의 생존율이 높았음을 알 수 있다. 그리고 2개의 대조군인 재조합단백질 백신 무처리구와 PBS만을 처리한 구에서도 비특이적 면역이 나타남을 확인하였다. 또한, 재조합단백질도 단독으로 사용한 경우 보다는 2가지 이상의 재조합 단백질 백신을 혼합한 것을 사용한 시험구에서 약 2~3배 정도의 노다바이러스 예방 효과가 높음을 확인할 수 있었다.
3-2: 재조합단백질 백신의 효능 분석
재조합 단백질 백신 0.1 ml씩을 넙치(체중 20 ㅁ 1g) 복강 및 근육에 주사하고 2주가 경과한 후, GF 세포에서 배양한 어류 노다바이러스를 105 TCID50 농도로 감염시켜 바이러스에 대한 넙치의 생존율, 항체가 및 안전성을 조사하였다.
재조합 캡시드 단백질, B1 단백질 및 B2 단백질에 대한 ELISA 항체가를 측정하여 그 결과를 도 8 및 표 2에 나타내었다. 캡시드 단백질, 단백질 B1 및 B2 항체가가 각각 57, 58, 57임을 확인할 수 있다. 그리고 재조합 단백질 백신으로 면역시킨 넙치 혈청을 이용하여 정제된 노다바이러스에 대항 항체가를 조사하였는데, 항체가가 57으로 나타났다.
| 단백질 | 항체 역가 |
| 캡시드 단백질 | 57 |
| B1 단백질 | 58 |
| B2 단백질 | 57 |
| 노다바이러스 ORF(cDNA) | 57 |
또한 노다바이러스의 중화 역가를 시험한 결과, 도 9에 나타난 것과 같이, 노다바이러스의 캡시드, B1 및 B2 단백질의 넙치 혈청에 대해서는, 중화 역가가 각각, 0.48×105 및 0.35×103, 0.3×102 으로 나타났다. 또한, 아래 표 3에 나타난 것과 같이 항체 역가는 세 단백질 모두 57이었다.
| 단백질 | 항체 역가 |
| 캡시드 단백질 | 57 |
| B1 단백질 | 57 |
| B2 단백질 | 57 |
3-3: 대상 어종 확인
재조합 단백질 백신에 대한 항체가는 어종에 따라 차이가 있음을 확인하였는데, 이는 도 10에 나타내었다. 이를 통해, 어류 노다바이러스는 넙치에서 높은 항체가를 가짐을 알 수 있다. 그리고 돌돔에서 이리도바이러스(iridovirus)에 대한 항체가는 높지만, 노다바이러스에 대한 항체가는 높지 않음을 알 수 있다.
실시예
4: 백신 투여에 따른 안전성 조사
본 발명에 따른 백신 처리의 안전성 조사를 위하여 병리조직학적 검사를 실시하였다. 넙치에 본 발명에 따른 재조합 단백질 백신, PBS, E. coli를 처리한 2주 후에, 각 시험구의 어류의 각 조직을 10% 중성 포르말린에 고정 후 상법에 따라 H&E염색을 실시 후 검경하였다. 도 11 및 12에 나타난 것과 같이, 간, 비장, 신장, 심장, 뇌 조직에 특별한 변성 변화는 없으며, 단지 오랜 절식으로 인하여 비장, 신장 내 세로이드 침착이 눈이 띄었다. 즉, 본 발명에 따른 백신의 독성이 없음을 확인하였다.
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- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프를 포함하는 백신 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 백신은 생백신, 약독화 백신 또는 사 백신인 백신 조성물.
- 제5항 또는 제6항의 백신 조성물을 어류에 투여하는 것을 포함하는, 어류를 면역시키는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 백신 조성물에 세균 불활화 백신을 혼합하여 어류에 투여하는 것을 특징으로 하는 어류를 면역시키는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 세균 불활화 백신은 연쇄구균 불활화 백신인 것을 특징으로 하는 어류를 면역시키는 방법.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체.
- 제10항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프 및 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 어류 노다바이러스 단백질의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 항원으로 하여 제조되며, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 또는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 인식하는 항체.
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- 제10항에 있어서, 상기 항체는 단클론 또는 다클론 항체인 항체.
- 제10항, 제11항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체를 어류 노다바이러스를 포함하는 시료와 반응시키고 , 상기 항체에 대한 양성 반응을 나타내는 시료를 어류 노다바이러스에 감염된 것으로 판단하는 것을 포함하는, 어류 노다바이러스 질병의 진단 방법.
- 제10항, 제11항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 어류 노다바이러스 질병 진단용 키트.
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