KR20230123463A - 재조합 고전적 돼지 열 바이러스 e2 단백질 - Google Patents

재조합 고전적 돼지 열 바이러스 e2 단백질 Download PDF

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KR20230123463A
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Abstract

본 발명은 동물 건강 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 에피토프에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 재조합 고전적 돼지 열 바이러스 E2 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 E2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물 및 동물에서 CSFV 관련 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 면역원성 조성물의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물로 백신접종된 동물로부터 CSFV에 감염된 동물을 구별하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 추가로, 본 발명은 E2 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

Description

재조합 고전적 돼지 열 바이러스 E2 단백질
본 발명은 동물 건강 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 에피토프에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 재조합 고전적 돼지 열 바이러스 E2 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 E2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물 및 동물에서 CSFV 관련 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 면역원성 조성물의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물로 백신접종된 동물로부터 CSFV에 감염된 동물을 구별하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 추가로, 본 발명은 E2 단백질을 생성하는 방법을 제공한다.
고전적 돼지 열 (CSF)은 상당한 경제적 손실을 유발하는 돼지 및 야생 멧돼지의 고도의 전염성 질환이다. 질환의 원인 병원체는 고전적 돼지 열 바이러스(CSFV)이다. 중국에서는 CSF 발병을 제어하기 위해 예방적 백신 접종과 근절 전략을 함께 시행하고 있다. 그러나 산발적인 CSF 발병과 지속적인 감염은 여전히 중국 대부분 지역에서 보고되고 있다.
안전하고 효과적인 새로운 CSFV 백신 및 이에 의해 백신접종되어 야생형 균주에 의해 감염된 것들과 구별될 수 있는 동물이 당업계에서 여전히 필요하다.
발명의 개요
하나의 양상에서, 본 발명은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 재조합 CSFV(고전적 돼지 열 바이러스) E2 단백질을 제공하고, 여기서 (변형되지 않은) 6B8 에피토프는 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 CSFV E2 단백질을 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 각각 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질, 재조합 CSFV E2 단백질을 암호화하는 핵산, 또는 이러한 핵산을 암호화하는 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 a) 동물로부터의 샘플을 수득하는 단계; 및 b) 면역 시험에서 상기 샘플을 분석하는 단계를 포함하는, 본 발명의 면역원성 조성물로 백신접종된 동물과 CSFV로 감염된 동물을 구별하는 방법을 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물로 백신접종된 동물과 CSFV로 감염된 동물을 구별하기 위한 키트를 제공한다.
도 1: CSFV E2 구조 및 6B8 에피토프에 대해 중요한 아미노산.
도 2: 야생형 CSFV E2, 및 6B8 에피토프에서 다양하게 치환된 돌연변이된 CSFV E2의 작제.
도 3: mAb 6B8은 대부분의 CSFV 균주를 인지하지만 이는 BVDV 바이러스와는 반응하지 않는다.
도 4: CSFV 단리물, BVDV 균주 및 일부 기타 페스티바이러스의 서열 정렬.
도 5: 위치 14, 22 또는 24/25에서 아미노산 잔기가 mAb 6B8 결합에 중요하다는 것을 보여주는 IFA 결과(도 5a-5c).
도 6: A) - SDS PAGE 및 웨스턴 블롯팅 둘다에 의해 확인된, wt-E2 및 E2-KARD 또는 E2-KRD의 정제 결과(도 6a; 및 b) - 정제된 E2-KARD 또는 E2-KRD는 6B8 염색을 사용한 음성 결과를 보여주었다(도 6b).
도 7: SDS PAGE 및 웨스턴 블롯팅 둘다에 의해 확인된, QZ07-E2-Fc-WT의 정제 결과.
도 8: 효능 연구에서 챌린지 후 체온.
도 9: 효능 연구에서 챌린지 후 백혈구 수.
도 10: 효능 연구에서 챌린지 후 사망률.
도 11: 효능 연구에서 챌린지 후 임상적 스코어.
도 12: 효능 연구 동안에 혈청학적 반응.
도 13: CHO 시스템에서 발현된 E2 단백질의 고수율.
도 14: CHO 시스템에서 발현된 E2 단백질의 면역원성.
도 15: E2에서 6B8 결합을 위한 추가의 중요한 잔기의 동정. CHO 세포 발현 시스템에서 E2 단백질의 돌연변이 형태의 IFA 검출은 위치 10, 41 또는 64에서 아미노산 잔기가 mAb 6B8 결합에 중요하다는 것을 보여준다.
도 16: CHO 세포 발현 시스템에서 E2 단백질의 돌연변이 형태의 웨스턴 블롯 검출.
도 17: E2에서 6B8 결합을 억제하기 위한 위치 22에서 추가 아미노산의 동정.
도 18: E2에서 6B8 결합을 억제하기 위한 위치 24에서 추가 아미노산의 동정.
도 19: E2에서 6B8 결합을 억제하기 위한 위치 25에서 추가 아미노산의 동정.
도 20: E2에서 6B8 결합을 억제하기 위한 위치 64에서 추가 아미노산의 동정.
본 발명의 양상을 기재하기 전에, 본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수형에 대한 언급도 포함하는 것으로 주지되어야 한다. 따라서, 예를 들어, 에피토프 (“a 또는 an epitope”)에 대한 언급은 복수의 에피토프를 포함하고, “바이러스”에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 바이러스 및 이의 등가물 등에 대한 언급이다. "및/또는"이라는 용어는 상기 용어로 연결된 항목의 임의의 조합을 포함하도록 의도되고 모든 조합을 개별적으로 열거하는 것과 동일하다. 예를 들어, “A, B 및/또는 C”는 “A”, “B”, “C”, “A 및 B”, “A 및 C”, “B 및 C”, 및 “A 및 B 및 C”를 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 출원이 속한 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 균등한 임의의 방법과 물질들을 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용할 수 있지만, 바람직인 방법, 장치 및 물질들을 이제 기재한다. 본원에 언급된 모든 간행물들은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 간행물에 보고된 바이러스 균주, 세포주, 및 방법들을 기재 및 개시할 목적을 위하여 참조로 본원에 인용된다. 본원에서 그 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 개시내용보다 앞서지 않는다는 것을 허용하는 것으로 이해되어서는 안된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 E2 단백질의 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 재조합 CSFV(고전적 돼지 열 바이러스) E2 단백질을 제공하고, 여기서 (변형되지 않은) 6B8 에피토프는 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지된다.
본원에서 사용되는 용어 "CSFV"는 플라비비리대(Flavaviridae) 과 내의 페스티바이러스(Pestivirus) 속에 속하는 고전적 돼지 열 바이러스(CSFV) 종에 속하는 모든 바이러스를 언급한다.
"재조합"이라는 용어는 유전자 공학에 의해 변경, 재배열 또는 변형된 단백질 또는 핵산을 언급한다. 그러나, 상기 용어는 자발적인 돌연변이와 같이 천연적으로 존재하는 이벤트로부터 비롯된 폴리뉴클레오타이드, 아미노산 서열, 뉴클레오타이드 서열의 변경을 언급하지 않는다.
하나의 양상에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 단리된다.
핵산 또는 폴리펩타이드 분자는 - 예를 들어, 이의 본래의 생물학적 공급원 및/또는 수득되는 반응 매질 또는 배양 배지와 비교할 때 - 상기 공급원 또는 배지 중에서 통상적으로 결합되는 적어도 하나의 다른 성분, 예를 들어, 또 다른 단백질/폴리펩타이드, 또는 핵산, 또 다른 생물학적 성분 또는 거대 분자 또는 적어도 하나의 오염물, 불순물 또는 최소 성분으로부터 분리될 때 "단리된"인 것으로 고려된다. 특히, 폴리펩타이드 또는 핵산 분자는 적어도 2배, 특히 적어도 10배, 보다 특히 적어도 100배, 및 최대 1000배 이상으로 정제될 때 "단리된"것으로 고려된다. “단리된 형태"인 폴리펩타이드 또는 핵산 분자는 바람직하게는 적합한 기술, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 적합한 크로마토그래피 기술을 사용한 측정시 본질적으로 균질하다.
본원에 “E2 단백질의 6B8 에피토프”는 또한 본원에 기재된 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 E2 단백질의 에피토프를 언급한다. 6B8 에피토프는 형태 에피토프일 수 있다. 6B8 에피토프는 E2 단백질의 위치 24, 25, 14, 22, 10, 41 및/또는 64에 정의된 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 6B8 에피토프는 E2 단백질의 위치 14에 S, 위치 22에 G, 위치 24에 E 또는 G, 위치 25에 G, 위치 10에 Y, 위치 41에 D, 및/또는 위치 64에 R을 포함할 수 있다.
용어 "6B8 모노클로날 항체"는 6B8 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭하고, 여기서 6B8 모노클로날 항체는 특이적으로 6B8 에피토프, 특히 위치 14에서 적어도 아미노산 S, 위치 22에서 G, 위치 24에서 E 또는 G, 위치 25에서 G, 위치 10에서 Y, 위치 41에서 D, 및/또는 위치 64에서 R을 포함하는 6B8 에피토프를 인지한다. 바람직하게는, 용어 6B8 모노클로날 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120 하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체의 CDR을 포함하는 모노클로날 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 용어 6B8 모노클로날 항체는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 모노클로날 항체를 지칭한다. 보다 바람직하게, 용어 6B8 모노클로날 항체는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 모노클로날 항체를 지칭한다. 보다 바람직하게는 용어 6B8 모노클로날 항체는 수탁 번호 CCTCC C2018120하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "항체"는 전장 면역글로불린의 결합 특이성 능력을 유지하는 면역글로불린 분자의 가변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이의 임의의 단편을 포함하여, 천연이든 부분적이든 또는 전체적으로 합성이든, 예를 들어 재조합적으로 생성된 면역글로불린 및 면역글로불린 및 면역글로불린 단편을 지칭한다. 따라서, 항체는 면역글로불린 항원 결합 도메인(항체 결합 부위)과 상동성이거나 실질적으로 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 항체는 항체 단편을 포함한다. 따라서 본원에서 사용되는 용어 항체는 합성 항체, 재조합 생성 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이특이성 항체), 사람 항체, 비-사람 항체, 사람화된 항체, 키메라 항체, 인트라바디 및 항체 단편을 포함한다. 본원에 제공된 항체는 임의의 면역글로불린 유형의 구성원(예를 들어, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY), 임의의 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브부류(예를 들어, IgG2a 및 IgG2b)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "가변 영역"이란, 당해 분야 및 이하에서 지칭되는 "골격 영역 1" 또는 "FR1"로서; "골격 영역 2" 또는 "FR2"로서, "골격 영역 3" 또는 "FR3"으로서; 및 "골격 영역 4" 또는 "FR4"로서 각각 언급되는 4개의 "골격 영역"으로 본질적으로 이루어지는 면역글로불린 도메인을 의미하고; 상기 골격 영역은 당해 분야 및 이하에서 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"로서, "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"로서 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"으로서 각각 언급되는 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"에 의해 차단되어 있다. 따라서, 면역글로불린 가변 영역의 일반 구조 또는 서열은 하기된 바와 같이 지적될 수 있다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. VH 또는 VH는 중쇄 가변 영역을 지칭하고, VL 또는 VL은 경쇄 가변 영역을 지칭한다. 유사하게, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 각각 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 지칭한다. VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체의 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은 전체 길이보다 작지만 항원에 결합하는 가변 영역의 적어도 일부(예를 들어, 하나 이상의 CDR 및/또는 하나 이상의 항체 결합 부위)에 결합함에 따라서 결합 특이성을 보유하는 전장 항체의 임의의 일부 및 전장 항체의 특이적 결합 능력의 적어도 일부를 지칭한다. 따라서, 항원-결합 단편은 항체 단편이 유래된 항체와 동일한 항원에 결합하는 항원-결합 부분을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 항체 단편은 전장 항체의 효소적 처리에 의해 생성된 항체 유도체 및 합성적으로 예를 들어, 재조합으로 생성된 유도체를 포함한다. 항체 단편은 항체 중에 포함된다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 Fv (scFv), Fv, dsFv, 디아바디, Fd 및 Fd' 단편 및 변형된 단편을 포함하는 기타 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(문헌참조: 예를 들어, Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov). 단편은 예를 들어 디설파이드 브릿지에 의해 및/또는 펩타이드 링커에 의해 함께 연결된 다중 쇄를 포함할 수 있다. 항원-결합 단편은 항체 프레임워크에 삽입될 때(예를 들어 상응하는 영역을 대체함으로써) 면역특이적으로 결합하는(즉, 적어도 또는 적어도 약 107-108 M-1의 Ka를 나타냄) 항체를 생성하는 임의의 항체 단편을 포함한다.
용어 "6B8 모노클로날 항체의 항원 결합 단편"은 6B8 모노클로날 항체의 단편을 지칭하거나, 적어도, 특이적으로 6B8 에피토프, 특히 E2 단백질의 위치 14에서 적어도 아미노산 S, 위치 22에서 G, 위치 24에서 E 또는 G, 위치 25에서 G, 위치 10에서 Y, 위치 41에서 D, 및/또는 위치 64에서 R을 포함하는 6B8 에피토프를 인지하는 아미노산 서열을 갖고 있다. 상기 용어는 추가로 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 및/또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 갖는 아미노산 단편을 포함한다. 더욱이, 상기 용어는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 아미노산 단편을 포함한다. 보다 바람직하게는 상기 용어는 수탁 번호 CCTCC C2018120 하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체가 갖는 아미노산 단편을 포함하고, 상기 아미노산 단편은 6B8 에피토프에 특이적으로 결합한다.
용어 “돌연변이”는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 포함한다. 돌연변이라는 용어는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 당업자는 더 이상 고민하지 않고 돌연변이를 생성할 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명의 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 적어도 하나의 돌연변이는 이러한 돌연변이된 6B8 에피토프에 대한 6B8 모노클로날 항체의 결합의 특이적 억제를 유도한다.
용어 "특이적으로 억제한다 또는 특이적 억제"는 6B8 항체가 변형되지 않은 6B8 에피토프, 특히 E2 단백질의 위치 14에 아미노산 S, 위치 22에 G, 위치 24에 E 또는 G, 위치 25에 G, 위치 10에 Y, 위치 41에 D, 위치 64에 R, 또는 이들의 조합에 비해 돌연변이된 6B8 에피토프에 적어도 2배, 바람직하게는 5배, 보다 바람직하게는 10배, 보다 더 바람직하게는 50배 더 낮은 친화성으로 결합한다는 것을 의미한다. “친화성”은 항체 분자 및 단일 에피토프 상의 단일 항원 결합 부위 간의 상호작용이다. 이것은 결합 상수 KA = kass/kdiss, 또는 해리 상수 KD = kdiss/kass로 표현된다. 보다 바람직하게는, 용어 "특이적으로 억제한다 또는 특이적 억제"는 6B8 모노클로날 항체, 특히 수탁 번호 CCTCC C2018120 하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체가 특이적 면역형광 검정에서, 바람직하게 실시예 5에 기재된 바와 같은 특이적 면역형광 검정, 또는 특이적 도트 블롯 검정, 바람직하게는 실시예 6에 기재된 바와 같은 특이적 도트 블롯 검정에서 본 발명에 따른 돌연변이된 6B8 에피토프에 검출가능하게 결합하지 않는다는 것을 의미한다. 특이적 면역형광 검정과 특이적 도트 블롯 검정 둘 다는 특이적 억제를 결정하는 데 사용될 수 있지만, 2개 검정에서 상반된 결과가 얻어지는 경우 도트 블롯 분석의 결과가 우선한다.
"치환"이라는 용어는 아미노산이 동일한 위치에서 다른 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다. 따라서 용어 치환은 아미노산의 제거/결실에 이어서 동일한 위치에 다른 아미노산의 삽입을 포함한다.
용어 “E2 단백질”은 최종 절단 생성물로서 CSFV의 폴리단백질 (Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)로부터 비롯되는 가공된 E2 단백질을 지칭한다. 당업자는 CSFV의 임의의 E2 단백질이 본 발명에서 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 E2 단백질은 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 6B8 에피토프를 갖는 야생형 E2 단백질로부터 유래한다. 예를 들어, E2 단백질은 C-균주와 같은 공지된 CSFV 균주 또는 본원에 정의된 QZ07 또는 GD18과 같은 새로운 분리주로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 필드 균주 QZ07의 E2 단백질은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 필드 균주 GD18의 E2 단백질은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 필드 균주 GD191의 E2 단백질은 서열번호 34에 제시된 아미노산 서열을 갖고, C-균주의 E2 단백질은 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 E2 단백질은 서열번호 9, 10, 34 및 21 중 어느 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93 %, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하지만 본원에 기재된 바와 같은 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
2개의 폴리펩타이드 서열 간의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 아미노산의 퍼센트를 지적한다. 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열간의 서열 동일성 수준을 평가하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 서열 분석 소프트웨어는 종종 아미노산 서열의 동일성을 결정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 동일성은 NCBI 데이터베이스에서 BLAST 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 서열 동일성 결정을 위해, 예를 들어, 문헌(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987 and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991)을 참조한다.
본 발명의 바람직한 양상에서, 본원에 기재된 바와 같은 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 재조합 E2 단백질은 면역원성이고 바람직하게는 CSFV에 대한 보호 면역을 부여한다. E2 단백질은 4개의 항원성 도메인 A, B, C 및 D 도메인을 포함하고 모든 이들 도메인은 E2 단백질의 N-말단에 위치한다. 4개의 도메인은 2개의 독립적인 항원 유닛을 구성하고, 하나는 B/C 도메인의 유닛이고 다른 하나는 A/D 도메인의 유닛을 포함한다. B/C 도메인은 아미노산 위치 1 내지 위치 84/111로부터 유래하고, D/A 도메인은 아미노산 위치 77 내지 위치 111/177에 위치한다. 또한, B/C 도메인은 아미노산 4C와 48C 사이의 추정된 디설파이드 결합에 의해 연결되는 반면, 유닛 D/A는 2개의 디설파이드 결합으로 형성되는데, 하나는 아미노산 103C와 167C 사이에, 다른 하나는 아미노산 129C와 139C 사이에 형성된다. 이들 시스테인 잔기는 E2 단백질의 형태 항원성 구조에 중요하다. 항원성 모티프(82-85LLFD)는 회복기 혈청 결합을 위한 E2 단백질의 항원 구조에 중요하다. 또 다른 모티프(RYLASLHKKALPT, 아미노산 위치 64 내지 76)는 또한 E2 단백질의 형태 에피토프 인지의 구조적 온전성에 중요한 것으로 동정된다. 또한 위에서 언급한 항원 도메인 중 하나만 포함하는 E2 단백질은 면역원성을 유지하고 감염성 CSFV 챌린지로부터 돼지를 보호할 수 있는 것으로 보고되었다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양상에서, 본원에 기재된 바와 같은 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 변형을 갖는 재조합 E2 단백질은 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 하나의 상기된 항원성 도메인을 보유한다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 E2 단백질은 CSFV에 대한 보호 면역을 부여할 수 있다. 하나의 양상에서, 본원에 정의된 바와 같은 6B8 에피토프 내의 적어도 하나의 돌연변이는 CSFV에 대한 재조합 E2 단백질의 보호 면역원성에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 도입될 수 있다.
본 발명의 하나의 양상에서, 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 E2 단백질의 6B8 에피토프는 적어도 E2 단백질의 위치 14, 위치 22, 위치 24, 위치 24 및 25("24/25" ), 위치 10, 위치 41 및/또는 위치 64에서 아미노산 잔기에 의해 정의된다.
본 발명의 하나의 양상에서, 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 E2 단백질의 6B8 에피토프는 적어도, 단리물 QZ07, GD18 또는 GD191에 대한 것과 같은 E2 단백질의 아미노산 잔기 S14, G22, E24, E24/G25, Y10, D41 및/또는 R64에 의해 정의된다. 본 발명의 하나의 양상에서, 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 E2 단백질의 6B8 에피토프는 적어도, C-균주에 대한 것과 같은 E2 단백질의 아미노산 잔기 S14, G22, G24, G24/G25, Y10, D41 및/또는 R64에 의해 정의된다.
아미노산 잔기의 넘버링은 N-말단으로부터 가공된 E2 단백질의 아미노산 위치, 예를 들어, 예시적인 방식으로 서열번호 9 또는 10에 제공된 아미노산 위치를 지칭한다. 그러나, 아미노산 위치는 폴리단백질 (Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B를 포함)과 관련하여, 예를 들어, 예시적 방식으로 서열번호 11 또는 12에 제공된 바와 같은 아미노산 위치와 관련하여 추가로 정의될 수 있다. 예를 들어, E2 단백질의 위치 14, 위치 22, 위치 24, 위치 25, 위치 10, 위치 41 및 위치 64에서 아미노산 잔기는 폴리단백질의 위치 703, 위치 711, 위치 713, 위치 714, 위치 699, 위치 730 및 위치 753에서의 아미노산 잔기에 상응한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질은 E2 단백질의 아미노산 위치 24에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 24/25에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 14에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 10에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환을 포함하고, 아미노산 위치 64에서의 치환이 바람직하다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질은 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환을 포함하고, 아미노산 위치 64에서의 치환이 바람직하다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질은 E2 단백질의 아미노산 위치 24에서의 치환, 및 E2 단백질의 아미노산 위치 25에서의 치환, 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함하고, 아미노산 위치 64에서의 치환이 바람직하다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질은 E2 단백질의 아미노산 위치 24에서의 치환 및 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 10에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함하고, 아미노산 위치 64에서의 치환이 바람직하다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질은 E2 단백질의 아미노산 위치 24에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 25에서의 치환 및 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서의 치환, 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함하고, 아미노산 위치 64에서의 치환이 바람직하다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질은 E2 단백질의 아미노산 위치 24에서의 치환, 및 E2 단백질의 아미노산 위치 22에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 10에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함하고, 아미노산 위치 64에서의 치환이 바람직하다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질은 E2 단백질의 아미노산 위치 24에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 25에서의 치환 및 E2 단백질의 아미노산 위치 22에서의 치환, 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함하고, 아미노산 위치 64에서의 치환이 바람직하다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV는 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서의 치환, 및 E2 단백질의 아미노산 위치 22에서의 치환, 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함하고, 아미노산 위치 64에서의 치환이 바람직하다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질은 E2 단백질의 아미노산 위치 24에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 14에서의 치환 및 E2 단백질의 아미노산 위치 22에서의 치환, 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함하고, 아미노산 위치 64에서의 치환이 바람직하다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질은 E2 단백질의 아미노산 위치 24에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 25에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 14에서의 치환, 및 E22 단백질의 아미노산 위치 22에서의 치환, 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함하고, 아미노산 위치 64에서의 치환이 바람직하다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질은 E2 단백질의 아미노산 위치 24에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 25에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 14에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서의 치환 및 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질은 하기 표 1 내지 7에 정의된 바와 같이 E2 단백질의 아미노산 위치에서 치환을 포함한다. 예를 들어, 표 1의 두 번째 줄은 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질이 E2 단백질의 아미노산 위치 10("위치 10")에서의 치환을 포함한다는 것을 의미하고, 표 1의 세 번째 줄은 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질은 E2 단백질의 아미노산 위치 10 및 14 등에서의 치환을 포함한다.
표 1
표 2
표 3
표 4
표 5
표 6
표 7a
표 7b
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질에서 E2 단백질의 위치 10에 있는 아미노산은 A 또는 P로 치환되고, E2 단백질의 위치 14에 있는 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환되고, E2 단백질의 위치 22에 있는 아미노산은 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로 치환되고, A, Q, D, E, N 및 S가 바람직하고, E2 단백질의 위치 24에 있는 아미노산은 R, D 또는 I로 치환되고, R이 바람직하고, E2 단백질의 위치 25에 있는 아미노산은 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로 치환되고, D, E, K, L, N, R, T 및 V가 바람직하고, E2 단백질의 위치 41에 있는 아미노산은 A, N 또는 E로 치환되고/되거나, E2 단백질의 위치 64에 있는 아미노산은 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로 치환되고, A, K 및 W가 바람직하다.
본 발명의 하나의 양상에서, 표 1 내지 7에 기재된 바와 같은 아미노산 치환은 상기 단락에 기재된 바와 같은 특정 치환인 것으로 이해된다. 예를 들어, 표 1 내지 7에 기재된 바와 같은 E2 단백질의 위치 10에 있는 아미노산은 A 또는 P로 치환될 수 있고, 표 1 내지 7에 기재된 바와 같은 E2 단백질의 위치 14에 있는 아미노산은 K, Q 또는 R로 치환될 수 있고, 표 1 내지 7에 기재된 바와 같은 E2 단백질의 위치 22에 있는 아미노산은 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로 치환될 수 있고, A, Q, D, E, N 및 S가 바람직하고, 표 1 내지 7에 기재된 바와 같은 E2 단백질의 위치 24에 있는 아미노산은 R, D 또는 I로 치환되고, R이 바람직하고, 표 1 내지 7에 기재된 바와 같은 E2 단백질의 위치 25에 있는 아미노산은 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로 치환되고, D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직하고, 표 1 내지 7에 기재된 바와 같은 E2 단백질의 위치 41에 있는 아미노산은 A, N 또는 E로 치환될 수 있고/있거나, 표 1 내지 7에 기재된 바와 같은 E2 단백질의 위치 64에 있는 아미노산은 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로 치환되고, A, K 및 W가 바람직하다. 표 1 내지 7 내에서 모든 가능한 치환(permutation)을 수행하고, 예를 들어 돌연변이 10A를 돌연변이 14K, 14Q 또는 14R과 조합하거나, 돌연변이 10P를 돌연변이와 14K, 14Q 또는 14R 등을 조합하는 것은 당업자의 지식 내에 있다
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환은 E2 단백질의 위치 10에서 아미노산 A 또는 P, E2 단백질의 위치 14에서 아미노산 K, Q 또는 R, E2 단백질의 위치 22에서 아미노산 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S, E2 단백질의 위치 24에서 아미노산 R, D 또는 I, E2 단백질의 위치 25에서 아미노산 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P, E2 단백질의 위치 41에서 아미노산 A, N 또는 E, 및/또는 E2 단백질의 위치 64에서 아미노산 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W를 포함하는 돌연변이된 6B8 에피토프를 초래하고, 아미노산 위치 22에서 A, Q, D, E, N 및 S가 바람직하고, 아미노산 위치 24에서 R이 바람직하고, 아미노산 위치 25에서 D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직하고 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 A, K 및 W가 바람직하다.
당업자는 6B8 에피토프가 상이한 CSFV 균주 사이에서 진화적으로 보존되기 때문에 본 발명의 재조합 CSFV E2 단백질이 다양한 CSFV 단리물로부터 유래될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 재조합 CSFV E2 단백질은 유전자 그룹 2.1의 단리물로부터 유래한다. 본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 예를 들어 필드 균주 GD18 또는 QZ07로부터 유래한다. 필드 균주 QZ07은 서열번호 13에 제시된 전장 뉴클레오타이드 서열을 갖거나 SEQ ID NO: 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리단백질을 포함하거나 발현한다. 필드 균주 GD18은 서열번호 14에 제시된 전장 뉴클레오타이드 서열을 갖거나 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리단백질을 포함하거나 발현한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 재조합 CSFV E2 단백질은 유전자 그룹 1의 단리물로부터 유래한다. 본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 당업계에 널리 공지된 C 균주로부터 유래한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 예를 들어, 필드 균주 QZ07로부터 유래하고, E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 24에서 E의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, E, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K 및 W가 바람직함)을 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 예를 들어, 필드 균주 QZ07로부터 유래하고, 아미노산 위치 24에서 E의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함)을 포함하고, 임의로 추가로 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, 또는 E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K, 및 W가 바람직함)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 예를 들어, 필드 균주 QZ07로부터 유래하고, 아미노산 위치 24에서 E의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q 또는 E로의 치환(A 및 R이 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환 (A, K, 및 W가 바람직함)을 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 예를 들어, 필드 균주 GD18로부터 유래하고, E2 단백질의 아미노산 위치 24에서 E의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함)을 포함하고, 임의로 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K 및 W가 바람직함)을 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 예를 들어, 필드 균주 GD18로부터 유래하고, 아미노산 위치 24에서 E의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함)을 포함하고, 임의로 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, 또는 E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K, 및 W가 바람직함)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 예를 들어, 필드 균주 GD18로부터 유래하고, 아미노산 위치 24에서 E의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환 (A, K, 및 W가 바람직함)을 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 예를 들어, C-균주로부터 유래하고, E2 단백질의 아미노산 위치 24에서 G의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함)을 포함하고, 임의로 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K 및 W가 바람직함)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 예를 들어, C-균주로부터 유래하고, 아미노산 위치 24에서 G의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함)을 포함하고, 임의로 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, 또는 E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K, 및 W가 바람직함)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 예를 들어, C-균주로부터 유래하고, 아미노산 위치 24에서 G의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환 (A, K, 및 W가 바람직함)을 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 가용성 E2 단백질을 수득하기 위해, 본 발명에 따른 재조합 E2 단백질을 절단하여 막관통 도메인을 제거할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 온전한 E2 단백질의 C-말단의 마지막 약 40개 아미노산(예를 들어, 42개 또는 43개 아미노산)이 결실될 수 있다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 E2 단백질의 분비된 형태를 수득하기 위해, 신호 펩타이드는 E2 단백질의 N-말단에 첨가될 수 있다. 예를 들어, E1 단백질로부터의 마지막 약 20개 아미노산, 특히 마지막 16개 아미노산(예를 들어, C-균주) 또는 21-23개 아미노산(예를 들어, GD18 또는 QZ07에 대해)이 본 발명에 따른 재조합 E2 단백질의 N-말단에 첨가될 수 있다. 하나의 양상에서, 신호 펩타이드는 서열번호 41-43으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 당업자는 분비 발현을 허용하는 다른 신호 펩타이드가 또한 본 발명에 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 하나의 양상에서, E2 단백질은 막관통 도메인을 제거하기 위해 절단될 수 있고 신호 펩타이드가 E2 단백질의 N-말단에 첨가되어 가용성 및 분비성 E2 단백질을 수득할 수 있고, 예를 들어, 온전한 E2 단백질의 마지막 43개 아미노산이 결실될 수 있고 E1 단백질로부터의 마지막 16개 아미노산 또는 21-23개 아미노산이 E2 단백질의 N-말단에 첨가될 수 있다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 E2 단백질은 또한 동정 및/또는 정제를 위한 융합 태그를 포함할 수 있다. 상기 태그, 예를 들어, His-태그 또는 FLAG-태그는 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 하나의 양상에서, 면역글로불린 Fc 단편은 E2 단백질에 연결될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역글로불린 Fc 단편"은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2)와 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하고, 보다 특히 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역과 경쇄 불변 영역 1(CL1)을 포함하지 않는 단백질을 지칭한다. 이는 면역글로불린의 힌지 영역 또는 힌지 영역의 일부(즉, 중쇄 불변 영역의 힌지 영역)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 면역글로불린 Fc 단편은 중쇄 불변 영역 1(CH1)의 일부를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린 Fc 단편"은 "Fc 단편"과 동등한 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 "에 연결된"이라는 용어는 특히 폴리펩타이드 내에서 면역글로불린 Fc 단편을 E2 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 연결하기 위한 임의의 수단을 지칭한다. 연결 수단의 예는 공유 결합에 의한 면역글로불린 Fc 단편의 E2 단백질로의 직접적인 연결을 포함할 수 있다. 하나의 양상에서, Fc 단편은 E2 단백질의 C 말단에 연결될 수 있다.
하나의 양상에서, 면역글로불린 Fc 단편은 펩타이드 링커를 통해 E2 단백질에 연결될 수 있다. 본원에 사용된 용어 “펩타이드 링커”는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드를 지칭한다. 보다 특히, 본원에 사용된 용어 “펩타이드 링커”는 2개의 가변 단백질 및/또는 도메인, 예를 들어, E2 단백질 및 면역글로불린 Fc 단편을 연결할 수 있는 펩타이드를 지칭한다. 본원에서 언급된 펩타이드 링커는 바람직하게는 길이가 3 내지 20개의 아미노산 잔기인 아미노산 서열이다. 예를 들어, 링커 모이어티는 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산인 펩타이드 링커일 수 있다. 펩타이드 링커의 예시적인 서열은 GGS, GSGGSG, GGGGS, GGGGSGGGGS일 수 있다. 하나의 양상에서, 펩타이드 링커의 아미노산 서열은 GGS (서열번호 91)이다.
하나의 양상에서, 면역글로불린 Fc 단편은 돼지(swine) IgG Fc 단편이다. 하나의 양상에서, Fc 단편은 E2 단백질의 C 말단에 연결될 수 있다. 하나의 양상에서, Fc 단편은 펩타이드 링커를 통해 E2 단백질의 C 말단에 연결될 수 있다. 하나의 양상에서, 돼지 Fc 단편의 펩타이드 서열은 아미노산 서열은 GGS (서열번호 95)로 나타낸다. Fc 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 96으로 나타낸다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 서열번호 15-20, 22-33, 35-40, 49-72 및 74-81로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 하나를 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 재조합 E2 단백질은 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 서열번호 15-20, 22-33, 35-40 및 74-81 중 어느 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 E2 단백질을 포함하는 재조합 CSFV(고전적인 돼지 열병 바이러스)를 제공한다. 본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV는 약독화된다.
당업자는 6B8 에피토프가 상이한 CSFV 균주 사이에서 진화적으로 보존되기 때문에 본 발명의 재조합 CSFV가 다양한 CSFV 단리물로부터 유래될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 재조합 CSFV는 유전자 그룹 2.1의 단리물로부터 유래한다. 본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV는 예를 들어 필드 균주 GD18 또는 QZ07로부터 유래한다. 본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 재조합 CSFV는 유전자 그룹 1의 단리물로부터 유래한다. 본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 CSFV는 당업계에 널리 공지된 C 균주로부터 유래한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질 및/또는 본 발명의 재조합 CSFV를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원성 조성물"은 면역원성 조성물이 투여되는 숙주에서 면역학적 반응을 유발하는 적어도 하나의 항원을 포함하는 조성물을 지칭한다. 이러한 면역학적 반응은 본 발명의 면역원성 조성물에 대한 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응일 수 있다. 숙주는 또한 “대상체”로서 기재된다. 바람직하게는, 본원에 기재되거나 언급된 임의의 숙주 또는 대상체는 동물이다.
일반적으로, "면역학적 반응"은 다음 효과 중 하나 이상을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다: 본 발명의 면역원성 조성물에 포함된 항원 또는 항원들에 특이적으로 지시된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 서프레서 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 감마-델타 T 세포의 생성 또는 활성화. 바람직하게 숙주는 보호 면역학적 반응 또는 치료학적 반응을 나타낼 것이다.
“보호 면역학적 반응"은 감염된 숙주에 의해 일반적으로 나타나는 임상 증상의 감소 또는 결여, 신속한 회복 시간 및/또는 감염력의 감소된 지속시간, 또는 감염된 숙주의 조직 또는 체액 또는 분비물에서의 감소된 병원체 역가에 의해 입증될 것이다.
본원에 사용된 "항원"은 이러한 항원 또는 이의 면역학적 활성 성분을 포함하는 관심 대상의 면역원성 조성물 또는 백신에 대해 숙주에서 면역학적 반응을 유발하는 성분을 지칭하지만, 이에 제한되지 않는다.
숙주가 보호 면역 반응을 나타내어 신규한 감염에 대한 내성이 향상될 것이고/것이거나 질환의 임상적 중증도가 감소될 것인 경우에, 상기 면역원성 조성물을 "백신"으로 기재한다.
하나의 양상에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 백신이다.
본원에서 이해되는 용어 백신"은 항원 물질을 포함하는 수의학적 용도를 위한 백신을 지칭하고, CSFV 감염에 의해 유발되는 질환에 대한 특이적 및 능동 면역을 유도하기 위해 투여된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 백신은 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 CSFV E2 단백질을 포함하여 숙주 동물에서 보호 면역 반응을 유발하는 서브유닛 CSFV 백신이다.
백신은 약제학적 조성물에 전형적인 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
면역 반응을 증진시키기 위한 추가 성분 일반적으로 "보조제"라고 지칭되는 구성 요소 또는 백신에 추가되거나 인터페론, 인터류킨 또는 성장 인자와 같으나 이에 제한되지 않는 추가 성분에 의해 각각 유도된 후 신체에서 생성되는 보조 분자이다. 본원에 사용된 바와 같은 "보조제"로는 수산화 알루미늄 및 인산 알루미늄, 사포닌,, 예를 들어, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), 유중수형 유화액, 수중유형 유화액, 수중유중수형 유화액이 포함될 수 있다. 유화액은 특히 경질 액체 파라핀 오일 (유럽 약전 타입); 스쿠알란 또는 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 알켄, 특히 이소부텐 또는 데센의 올리고머화에 의해 생성되는 오일; 선형 알킬기를 함유하는 산 또는 알코올의 에스테르, 보다 특히, 식물 오일, 에틸 올리에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올리에이트; 분지형 지방산 또는 알코올의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르를 기본으로 할 수 있다. 오일은 유화제와 함께 사용되어 유화액을 형성한다. 유화제는 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 특히, 소르비탄의 에스테르, 만나이드의 에스테르 (예를 들어, 안하이드로만니톨 올리에이트), 글리콜의 에스테르, 폴리글리세롤의 에스테르, 프로필렌 글리콜의 에스테르 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르 (이들은 임의로 에톡시화된다), 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히, 플루로닉 (Pluronic) 제품, 특히, L121이다. 문헌 [Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995)] 및 [Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)]을 참조한다. 예시적인 보조제는 문헌 ["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995]의 147 페이지에 기재된 SPT 유화액 및 동 문헌의 183 페이지에 기재된 유화액 MF59이다.
보조제의 추가 예로는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택되는 화합물이 있다. 유리한 보조제 화합물은 특히 당류 또는 다가 알코올의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 이들 화합물은 카보머라는 용어로 공지되어 있다 (문헌 [Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996]). 당해 분야의 통상의 기술자는 또한 적어도 3개, 바람직하게는 8개 이하의 하이드록실기를 가지며 적어도 3개의 하이드록실기의 수소 원자가 적어도 2개의 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 대체되어 있는 폴리하이드록실화 화합물과 가교된 이러한 아크릴계 중합체를 기술하는 미국 특허 2,909,462를 참조할 수 있다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 것들, 예를 들어, 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화기이다. 불포화 라디칼은 자체에 메틸과 같은 다른 치환체를 함유할 수 있다. CARBOPOL; (BF Goodrich, Ohio, USA)의 명칭으로 시판되는 제품이 특히 적절하다. 이들은 알릴 슈크로스 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교되어 있다. 이들 중에서, Carbopol 974P, 934P 및 971P가 언급될 수 있다. CARBOPOL 971P의 사용이 가장 바람직하다. 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중에서도, 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체인 공중합체 EMA (Monsanto)가 있다. 이들 중합체가 물에 용해되면, 면역원성 조성물, 면역학적 조성물 또는 백신 조성물 자체가 혼입될 보조제 용액을 수득하기 위해서는 바람직하게는 생리학적 pH로 중화될 산 용액이 생성된다.
또 다른 적절한 보조제는 다수의 다른 것들 중에서도 RIBI 보조제 시스템 (Ribi Inc.), 블록 공중합체 (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), 모노포스포릴 지질 A, 아비리딘 지질-아민 보조제, 이. 콜라이 (재조합체 또는 기타)로부터 유래된 열-불안정성 장독소, 콜레라 독소, IMS 1314 또는 뮤라밀 디펩타이드, 또는 자연 발생 또는 재조합 사이토카인 또는 이의 유사체 또는 내인성 사이토카인 방출 자극제가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
하나의 양상에서, 면역원성 조성물은 적합한 보조제와 함께 유중수 에멀젼으로 제형화된다. 보조제는 오일 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 하나의 양상에서, 보조제는 MONTANIDETM ISA 71R VG (Seppic Inc에 의해 제조된, Cat no: 365187)이다. 하나의 양상에서, 보조제는 Seppic ISA 206이다. 보조제는 용량 당 약 100 μg 내지 약 10 mg의 양으로 첨가될 수 있다. 보다 더 바람직한 보조제는 용량 당 약 100 μg 내지 약 10 mg의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직한 보조제는 용량 당 약 500 μg 내지 약 5 mg의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직한 보조제는 용량 당 약 750 μg 내지 2.5 mg의 양으로 첨가된다. 가장 바람직한 보조제는 용량 당 약 1mg의 양으로 첨가된다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 보조제를 함유하는 오일 상 약 7부 및 용량 당 본 발명의 E2 단백질을 함유하는 수성 상의 약 3부를 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 상기 정의된 바와 같이 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 E2 단백질의 6B8 에피토프 내 적어도 하나의 돌연변이, 예를 들어, E2 단백질의 아미노산 위치 24에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 24/25에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 14에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 10에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환은 마커로서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “마커”는 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프를 지칭한다. 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프는 야생형 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프 서열(유전학적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)과 상이하다. 따라서, 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프는 예시적인 면역 시험 및/또는 게놈 분석학적 시험에 의해 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프를 갖는 백신접종된 동물로부터의 돌연변이되지 않은 6B8 에피토프를 갖는 천연적으로 감염된 동물을 구별할 수 있게 한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 마커 백신 또는 DIVA(감염된 동물과 백신접종된 동물 간의 구별) 백신이다.
용어 “마커 백신” 또는 “DIVA (감염된 동물과 백신접종된 동물 간의 구별)”는 상기 제시된 마커를 갖는 백신을 지칭한다. 따라서, 마커 백신은 천연적으로 감염된 동물로부터 백신접종된 동물을 구별하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물은 야생형 CSFV 감염과 대조적으로 본 발명의 백신으로 백신접종된 동물에서 본 발명에 따른 치환된 6B8 에피토프가 검출될 수 있기 때문에 마커 백신으로서 작용한다. 예시적인 면역 시험 및/또는 게놈 분석학적 시험에 의해 본 발명에 따른 치환된 6B8 에피토프는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 서열(유전학적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)과 구별될 수 있다. 마지막으로, 마커 에피토프는 가축에 나타날 수 있는 다른 유기체에 의해 유도되는 위양성(false-positive) 혈청학적 결과를 회피하기 위해 병원체에 대해 특이적이어야 한다. 그러나 6B8 에피토프는 (서열 정렬에 의해) 진화적으로 보존되고 CSFV에 특이적이다(6B8 mAb는 BVDV에 결합하지 않는다). 따라서, 본 발명에 따른 치환된 6B8 에피토프는 마커 백신에 사용하기에 매우 적합하다.
효과적인 마커 백신의 주요 이점은, 백신접종된 돼지 집단에서 샘플을 채취하기 전에 급성 감염되거나 일정 기간 (예를 들어, 적어도 약 3주) 감염된 돼지를 감지해낼 수 있고, 돼지 집단에서 CSFV의 확산 또는 재도입을 모니터링하기 위한 가능성을 제공한다. 따라서, 실험실 시험 결과를 기초로 백신접종된 돼지 집단에 CSFV가 없음을 특정 수준의 신뢰도함께 공표것이 가능하다.
본 발명의 마커 백신은 돼지 열병이 검출되거나 발생하는 경우 긴급 백신접종에 이상적으로 적합하다. 마커 백신은 신속하고 효과적인 투여를 용이하게 하고, 야생형 바이러스로 감염된 (질병과 연관된) 동물과 백신접종된 동물 간의 구별을 가능하게 한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 면역원성 조성물로 처리된 동물은 면역 시험 및/또는 게놈 분석 시험을 사용하여 상기 동물로부터 얻은 샘플의 분석을 통해 천연적으로 존재하는 돼지 열병 바이러스에 감염된 동물과 구별될 수 있다.
"샘플"이라는 용어는 체액의 샘플, 분리된 세포의 샘플 또는 조직 또는 장기의 샘플을 가리킨다. 체액의 샘플은 널리 공지된 기법들에 의해 수득될 수 있으며, 바람직하게는, 혈액, 혈장, 혈청 또는 뇨 샘플, 보다 바람직하게는, 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플을 포함한다. 조직 또는 장기 샘플은 예를 들어 생검에 의해 임의의 조직 또는 장기로부터 수득될 수 있다. 분리된 세포는 분리 기법, 예를 들어 원심분리법 또는 세포 분류법에 의해 체액 또는 조직 또는 장기로부터 수득될 수 있다.
“수득된"이라는 용어는 바람직하게는 침전, 컬럼 등을 사용하여 당업계의 숙련자에게 공지된 분리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다.
"면역 시험" 및 "게놈 분석 시험"이라는 용어는 아래에 명시되어 있다. 그러나 “면역 시험" 및 "게놈 분석 시험” 각각의 분석은 본 발명에 따른 면역원성 조성물로 백신접종된 동물과 (질병과 연관된) 천연적으로 존재하는 돼지 열병 바이러스로 감염된 동물을 구별하기 위한 토대이다.
본 발명의 하나의 양상에서, 상기 면역원성 조성물 단일 용량 투여용으로 제형화된다.
유리하게는, 본 발명에 의해 제공된 실험 데이터는 본 발명의 면역원성 조성물의 단일 용량 투여가 확실하고 효과적으로 보호 면역 반응을 자극하였음을 기재한다. 따라서, 본 발명의 하나의 양상에서, 상기 면역원성 조성물은 단일 용량 투여용으로 제형화되고 효과적이다.
또한, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 양상에서, CSFV와 관련된 질환은 CSF이다.
본 발명은 또한 동물에게 본 발명에 따른 임의의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물을 면역화시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 동물에게 본 발명에 따른 임의의 면역원성 조성물을 단일 투여하는 것을 포함하는, 동물을 면역화시키기 위한 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 동물을 면역화하는 방법은 동물에게 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 단일 투여함으로써 효과적이다.
“면역화시키는"이라는 용어는 면역화시킬 식용 동물에게 면역원성 조성물을 투여함으로써 이러한 면역원성 조성물에 포함되어 있는 항원에 대한 면역학적 반응을 유발시키는 능동 면역화에 관한 것이다.
면역화는 하나의 집단에서 특정 CSFV 감염의 발생률을 감소시키거나, 또는 특정 CSFV 감염에 의해 야기되거나 이와 관련된 임상 징후의 중증도를 감소시킨다. 바람직하게, 면역화는 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 단일 투여에 의해 한 집단에 있어서 특정 CSFV 감염의 발생률을 감소시키거나, 또는 특정 CSFV 감염에 의해 야기되거나 이와 관련된 임상 징후의 중증도를 감소시킨다.
본 발명의 하나의 양상에 따르면, 여기에 제공된 면역원성 조성물로 필요한 동물을 면역화하면, 바람직하게는 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 단일 투여에 의해 CSFV 감염에 의한 대상체의 감염을 예방한다. 보다 더 바람직하게는, 면역화는 CSFV 감염에 대해 효과적이고, 장기간 지속되는 면역학적 반응을 유도한다. 상기 기간은 2개월 이상, 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 5개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상 지속될 것이라는 점을 이해해야 할 것이다. 상기 면역화는 면역화된 모든 동물에서 효과적이지 않을 수 있다는 점도 이해되어야 한다 그러나, 상기 용어는 한 집단의 동물들 중 상당 부분이 효과적으로 면역화되어야 함을 필요로 한다.
바람직하게는, 이러한 맥락에서 동물 집단이 고려되고, 이러한 집단은 통상적으로, 즉 면역화 없이, CSFV 감염에 의해 통상 야기되거나 또는 이와 관련된 임상 증상을 발병할 것이다. 집단의 동물이 효과적으로 면역화되는지의 여부는 추가의 노력 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 면역화는, 소정의 집단의 동물들 중 적어도 33%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%에서 임상적 징후가 본 발명 전에 가용했던 면역원성 조성물로 면역화되지 않았거나 면역화되었지만 후속적으로 CSFV에 의해 감염된 동물과 비교했을 때, 발병율 또는 중증도가 적어도 10%까지, 보다 바람직하게는 적어도 20%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 30%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 40%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 60%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 70%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 80%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%까지 감소되는 경우에 효과적일 것이다.
본 발명의 하나의 양상에서, 상기 동물은 돼지이다. 하나의 양상에서, 동물은 새끼 돼지이다. 새끼 돼지는 통상적으로 3 내지 4주령 미만이다. 하나의 양상에서 새끼 돼지는 1 내지 4주령에서 백신 접종된다. 하나의 양상에서 동물은 암퇘지(sow)이다. 하나의 양상에서 동물은 임신한 암퇘지이다.
본 발명의 하나의 양상에서, 면역원성 조성물은 피내, 기관내, 질내, 근육내, 비강내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 경구, 척수강내, 피하, 피내, 심장내, 전엽내, 골수내, 폐내 및 이들의 조합으로 투여된다. 그러나, 화합물의 성질과 작용 방식에 의존하여, 상기 면역원성 조성물은 또한 다른 경로로도 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 CSF와 관련된 하나 이상의 임상 징후의 동물에서 발생률 또는 중증도를 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 하나 이상의 임상 징후의 발생률 또는 중증도의 감소는 면역원성 조성물을 투여받지 않은 동물에 상대적이다. 바람직하게는, 상기 방법은 단일 용량의 면역원성 조성물의 투여를 포함하고 이러한 면역원성 조성물의 단일 투여에 의한 하나 이상의 임상 징후의 발생률 또는 중증도의 감소에 효과적이다.
본원에 사용된 "임상적 징후"라는 용어는 CSFV로 인한 동물의 감염 징후를 지칭한다. 임상적 징후는 추가로 하기에 정의된다. 그러나, 상기 임상 증상은 살아있는 동물로부터 직접적으로 관찰가능한 임상 증상을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 생존 동물로부터 직접적으로 관찰가능한 임상 징후의 예는 콧물 및 눈 분비물, 기면, 기침, 천명, 텀핑(thumping), 상승된 열, 체중 증가 또는 감소, 탈수, 설사, 관절 종창, 파행, 쇠약, 창백한 피부, 수척 등을 포함한다. 미텔홀처 등(Mittelholzer et al.) (문헌참조: Vet.Microbiol., 2000. 74(4): p. 293-308)은 CSF 동물 실험에서 임상적 스코어의 결정을 위한 조사목록을 개발하였다. 상기 조사목록은 활력, 신체 긴장, 체형, 호흡, 걷기, 피부, 눈/결막, 식욕, 배변 및 먹다 남은 음식을 포함한다.
바람직하게는, 임상적 징후는 본 발명 전에 가용했던 면역원성 조성물로 치료받지 않았거나 치료았지만 후속적으로 CSFV에 의해 감염된 대상체와 비교했을 때, 발병율 또는 중증도가 적어도 10%까지, 보다 바람직하게는 적어도 20%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 30%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 40%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%까지, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 60%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 70%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 80%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%까지, 가장 바람직하게는 적어도 95%까지 감소된다.
본 발명의 하나의 양상에서, 면역원성 조성물은 1회 투여되고 상기 단일 퉁에 의해 효과적이다.
그러나, 단일 용량 투여가 바람직하지만, 면역원성 조성물은 또한 2회 또는 수회 투여될 수 있고, 제1 용량은 제2(부스터) 용량의 투여 전에 투여된다. 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 15일째에 투여된다. 보다 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 15일 내지 40일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 17일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 17일 내지 30일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 19일째에 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 19일 내지 25일째에 투여된다. 가장 바람직하게는, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 21일째에 투여된다. 2회 투여 처방계획의 바람직한 양태에서, 상기 면역원성 조성물의 제1 용량과 제2 용량은 모두 동일한 양으로 투여된다. 제1 용량과 제2 용량 처방계획 이외에, 대안적인 실시양태는 추가의 후속 용량을 포함한다. 예를 들어, 제3, 제4, 또는 제5 용량이 상기 양태에서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 후속 제3, 제4 및 제5 용량 용법은 제1 용량과 동일한 양으로 투여되고, 상기 용량 간의 시간표는 상기 언급한 제1 및 제2 용량 간의 시기와 일치한다.
본 발명의 하나의 양상에 있어서, 하나 이상의 임상적 징후는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 호흡곤란, 호흡 힘듬, 기침, 재채기, 비염, 빈호흡, 호흡장애, 폐렴, 귀와 외음부의 적색/청색 변색, 황달, 림프구 침윤, 림프절병증, 간염, 신염, 식욕부진, 발열, 혼수, 아갈라티아, 설사, 비강 삼출물, 결막염, 진행성 체중 감소, 체중 증가 감소, 피부 창백함, 위궤양, 기관 및 조직의 거시적 및 현미경 병변, 림프성 병변, 사망, 바이러스 유도된 낙태, 사산, 새끼 돼지의 기형, 미라화 및 이들의 조합.
하나의 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 면역원성 조성물로 백신접종된 동물과 CSFV로 감염된 동물을 구별하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다.
a) 샘플을 수득하는 단계 및
b) 면역 시험에서 상기 샘플을 시험하는 단계.
용어 "면역 시험"은 CSFV의 E2 단백질의 6B8 에피토프에 특이적인 항체를 포함하는 시험을 지칭한다. 상기 항체는 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프 또는 야생형 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프(유전학적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 특이적일 수 있다. 그러나, 용어 "면역 시험"은 또한 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프 펩타이드 또는 야생형 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프 펩타이드(유전학적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)를 포함하는 시험을 지칭한다. 면역 시험의 예는 임의의 효소 면역학적 또는 면역화학적 검출 방법, 예를 들어, ELISA (효소 결합 면역흡착 검정), EIA (효소 면역검정), RIA (방사능면역검정), 샌드위치 효소 면역 시험, 형광성 항체 시험 (FAT), 전기화학발광 샌드위치 면역검정 (ECLIA), 해리증진된 란탄계열 플루오로 면역 검정(dissociation-enhanced lanthanide fluoro immuno assay, DELFIA) 또는 고체상 면역 시험, 면역형광 시험 (IFT), 면역조직학적 염색, 웨스턴 블롯 분석 또는 당업계의 숙련된 기술자가 이용할 수 있는 임의의 다른 적합한 방법을 포함한다. 사용된 분석법에 따라, 상기 항원 또는 항체는 효소, 형광단 또는 방사성동위원소로 표지될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. (1994)]; 및 [Frye et al., Oncogen 4: 1153-1157, 1987]을 참조한다.
바람직하게는, 야생형 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프에 특이적인 항체는 야생형 CSFV로 감염된 것으로 의심되거나 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 포함하는 백신으로 백신접종된 동물(예를 들어, 돼지)로부터의 혈청 세포(예를 들어, 백혈구) 또는 단리된 기관(예를 들어, 편도선, 비장, 콩팥, 림프절, 회장의 원위부)에서 CSFV 항원을 검출하기 위해 사용된다. 그러한 경우, 야생형 CSFV로 감염된 동물의 샘플만이 상기 6B8 에피토프 특이적 항체에 의해 양성 결과를 보여준다. 대조적으로, 본 발명의 재조합 CSFV E2 단백질을 포함하는 백신으로 백신접종된 동물의 샘플은 본 발명에 따른 6B8 에피토프 내의 돌연변이로 인해 상기 6B8 에피토프 특이적 항체에 의한 결과를 보여주지 않는다. 대안적 시험에서, CSFV는 예를 들어 감염된 기관(예를 들어, 동물의 편도선) 또는 혈청 세포(예를 들어, 백혈구), 야생형 CSFV에 감염된 것으로 의심되거나 백신 접종된 동물로부터 단리되고 바이러스를 사용한 세포의 감염을 위해 적합한 세포주(예를 들어, SK-6 세포 또는 PK-15 세포)와 함께 배양한다. 이어서 복제된 바이러스는 본 발명에 따른 필드(야생형, 질환 관련) CSFV와 재조합 CSFV를 구별하는 6B8 에피토프 특이적 항체를 사용하여 세포에서 검출된다. 추가로, 펩타이드는 비특이적 교차 반응성을 차단하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 야생형 CSFV의 다른 에피토프에 특이적인 항체를 양성 대조군으로서 사용될 수 있다.
보다 바람직하게는, ELISA가 사용되고, 여기서 야생형 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프(유전학적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 특이적인 항체는 본 발명에 따른 백신으로 백신 접종된 돼지로부터 감염된 돼지를 구별하기 위한 마이크로-웰 검정 플레이트에 가교 결합된다. 상기 가교결합은 바람직하게는 예를 들어, 폴리-L-리신과 같은 앵커 단백질을 통해 수행된다. 상기 가교 결합을 사용하는 ELISA는 일반적으로 수동으로 코팅된 기술을 사용하는 ELISA와 비교하는 경우 보다 민감성이다. 야생형(질환 관련된) CSFV는 야생형 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프(유전학적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 특이적인 항체에 결합한다. 야생형 CSFV 바이러스의 야생형 CSFV의 6B8 에피토프에 특이적인 항체로의 결합 검출은 CSFV에 특이적인 추가 항체에 의해 수행될 수 있다. 상기 경우에, 감염된 돼지의 샘플만은 상기 6B8 에피토프 특이적 항체에 의한 양성 결과를 보여준다. 추가로, 펩타이드는 비특이적 교차 반응성을 차단하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 야생형 CSFV의 다른 에피토프에 특이적인 항체를 양성 대조군으로서 사용될 수 있다.
대안적으로, 마이크로-웰 검정 플레이트는 야생형 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프(유전학적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 특이적인 항체 이외의 CSFV에 특이적인 항체와 가교 결합될 수 있다. 야생형(질환 관련) CSFV는 가교 결합된 항체에 결합한다. 야생형 CSFV의 가교 결합된 항체에 대한 결합의 검출은 야생형 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프(유전학적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 특이적인 항체에 의해 수행될 수 있다.
상기 이미 제시된 바와 같이 6B8 에피토프는 진화적으로 보존되어 있고 야생형 CSFV에 특이적이다.
따라서, 보다 바람직하게 ELISA는 상기 샘플에서 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프 또는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프(유전학적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 대해 지시된 항체를 검출하기 위해 사용된다. 상기 시험은 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프 펩타이드 또는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프 펩타이드(유전학적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)를 포함한다.
이러한 시험은 예를 들어 마이크로-웰 검정 플레이트에 가교 결합된 본 발명에 따른 치환된 6B8 에피토프 또는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프(유전학적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)를 갖는 웰을 포함한다. 상기 가교결합은 바람직하게는 예를 들어, 폴리-L-리신과 같은 앵커 단백질을 통해 수행된다. 돌연변이체 또는 야생형 6B8 에피토프를 수득하기 위한 발현 시스템은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 대안적으로, 상기 6B8 에피토프는 화학적으로 합성될 수 있다. 돌연변이체 또는 야생형 6B8 에피토프 그 자체가 본 발명에 따른 시험에 사용될 수 있지만, 상대적으로 짧은 에피토프 그 자체 대신에 상기 6B8 에피토프를 포함하는 완전한 E2 단백질 또는 E2 단백질의 단편을 포함하는 단백질을 사용하는 것이 편리할 수 있음을 이해해야 한다. 특히, 에피토프가 예를 들어 표준 ELISA 시험에서 웰의 코팅에 사용되는 경우 코팅 단계를 위해, 에피토프를 포함하는 보다 큰 단백질을 사용하는 것이 더 효율적일 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 포함하는 백신으로 백신접종된 동물은 야생형 6B8 에피토프에 대한 항체를 생성하지 않았다. 그러나, 상기 동물은 본 발명에 따른 치환된 6B8 에피토프에 대한 항체를 생성하였다. 결과로서, 야생형 6B8 에피토프로 코팅된 웰에 어떠한 항체도 결합하지 않는다. 대조적으로, 웰이 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프로 코팅된 경우, 항체는 상기 돌연변이체 6B8 에피토프에 결합한다.
그러나 야생형 CSFV에 감염된 동물은 CSFV의 야생형 에피토프에 대한 항체를 생성하였다. 그러나, 상기 동물은 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프에 대한 항체를 생성하지 않았다. 결과로서, 본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프로 코팅된 웰에 어떠한 항체도 결합하지 않는다. 대조적으로, 웰이 본 발명에 따른 야생형 6B8 에피토프로 코팅된 경우, 항체는 야생형 6B8 에피토프에 결합한다.
본 발명에 따른 돌연변이체 6B8 에피토프 또는 야생형 CSFV의 6B8 에피토프(유전학적으로 변형되지 않은 6B8 에피토프)에 대한 항체의 결합은 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게, ELISA는 샌드위치형 ELISA이다. 보다 바람직하게, ELISA는 경쟁 ELISA이다. 가장 바람직하게, ELISA는 이중 경쟁 ELISA이다. 그러나, 상기 서로 다른 ELISA 기법들은 당업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. ELlSA는 예시적으로 벤스부르트(Wensvoort) G. 등 (Vet. Microbiol. 17(2): 129-140, 1988), 로비올로(Robiolo) B. 등 (J. Virol. Methods. 166(1-2): 21-27, 2010) 및 콜리즌(Colijn), E.O. 등 (Vet. Microbiology 59: 15-25, 1997)에 의해 기재되었다.
본 발명의 하나의 양상에서 면역 시험은 CSFV E2 단백질의 온전한 6B8 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체가 샘플에서 CSFV E2 단백질에 결합하는지의 여부를 시험함을 포함한다. 본 발명의 하나의 양상에서 면역 시험은 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체가 샘플에 존재하는지의 여부를 시험하고/하거나 CSFV E2 단백질의 돌연변이된 6B8 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체가 샘플에 존재하는지의 여부를 시험하는 것을 포함한다. 상기 돌연변이된 6B8 에피토프는 본원에 정의된 바와 같은 6B8 에피토프에서의 돌연변이(들)를 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서 면역학적 시험은 EIA(효소 면역검정) 또는 ELISA(효소 결합 면역흡착 검정)이다. 본 발명의 하나의 양상에서, 상기 ELISA는 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA, 경쟁 ELISA 또는 이중 경쟁 ELISA, 바람직하게 이중 경쟁 ELISA이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다.
용어 “핵산”은 DNA 분자, RNA 분자, cDNA 분자 또는 유도체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 용어는 단일가닥 및 이중가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 핵산은 재조합 폴리뉴클레오타이드(즉, 천연 맥락으로부터 재조합) 및 유전학적으로 변형된 형태를 포함한다. 더욱이, 글리코실화 또는 메틸화 폴리뉴클레오타이드와 같은 천연적으로 존재하는 변형된 폴리뉴클레오타이드 또는 비오티닐화된 폴리뉴클레오타이드와 같은 인공 변형된 것을 포함하는 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오타이드도 포함된다. 추가로, 본 발명의 재조합 CSFV E2 단백질은 축퇴성 유전학적 코드로 인해 다수의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 암호화하는 핵산은 핵산이 도입될 숙주 세포에 따라 코돈-최적화된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 하나의 양상에서, 벡터는 발현 벡터이다.
용어 "벡터"는 세균 또는 효모 인공 염색체와 같은 인공 염색체뿐만 아니라 파아지, 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 더욱이, 상기 용어는 게놈 DNA로의 표적화 작제물의 무작위 또는 부위 지시된 통합을 가능하게 하는 표적화 작제물에 관한 것이다. 상기 표적 작제물은 바람직하게 하기에 상세히 기재된 바와 같이 상동성 또는 이종성 재조합을 위해 충분한 길이의 DNA를 포함한다. 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터는 바람직하게 숙주에서 증식 및/또는 선택을 위한 선택가능한 마커를 추가로 포함한다. 벡터는 당업계에 널리 공지된 다양한 기술에 의해 숙주에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 벡터는 인산칼슘 침전물 또는 염화루비듐 침전물과 같은 침전물, 또는 하전된 지질과의 복합체로 또는 풀러렌과 같은 탄소 기반 클러스터에 도입될 수 있다. 대안적으로, 플라스미드 벡터는 열 쇼크 또는 전기천공 기술에 의해 도입될 수 있다. 벡터가 바이러스인 경우 숙주 세포에 적용하기 전에 적절한 팩키징 세포주를 사용하여 시험관 내에서 팩키징될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제 적격 또는 복제 결함일 수 있다. 후자 경우에, 바이러스 증식은 일반적으로 상보적 숙주/세포에서만 일어난다. 보다 바람직하게, 폴리뉴클레오타이드는 원핵 또는 진핵 세포 또는 이의 단리된 분획에서 발현을 허용하는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현은 바람직하게 해독가능한 mRNA로의 폴리뉴클레오타이드의 전사를 포함한다. 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서의 발현을 보장하는 조절 요소는 당업계에 널리 공지되어 있다. 이들은 바람직하게 전사의 개시를 보장하는 조절 서열 및 임의로, 전사의 종결 및 전사체의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가의 조절 요소들은 전사 및 해독 인핸서를 포함할 수 있다. 원핵 숙주 세포에서 발현을 허용하는 가능한 조절 요소는 예를 들어 이. 콜리의 lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하고 진핵 숙주 세포에서 발현을 허용하는 조절 요소의 예는 효모 에서 AOX1 또는 GAL1 프로모터 또는 포유동물 및 기타 동물에서 CMV-, Sv40-, RSV-프로모터(라우스 육종 바이러스), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론을 포함한다. 더욱이, 유도성 발현 제어 서열은 본 발명에 포함되는 발현 벡터에 사용될 수 있다. 상기 유도성 벡터는 tet 또는 lac 오퍼레이터 서열 또는 열 쇼크 또는 기타 환경 인자들에 의해 유도될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 제어 서열은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 기술은 문헌(참조: Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994))에 기재된다. 바람직하게, 본 발명의 벡터는 바쿨로바이러스 벡터이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포에서의 발현을 위한 포유동물 발현 벡터이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 이. 콜리와 같은 원핵 세포, 또는 예를 들어 곤충 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 바람직하게 숙주 세포는 SF9 세포이다. 보다 바람직하게, 숙주 세포는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 또한 재조합 CSFV E2 단백질, 바람직하게 표 1 내지 7에 정의되거나 하기의 본원의 기타 기재된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 CSFV E2 단백질을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(i) CSFV E2 단백질의 발현을 위해 적합한 조건하에서 숙주 세포, 바람직하게 본원에 정의된 CHO 세포를 배양하는 단계, 및
(ii) CSFV E2 단백질을 단리하고 임의로 정제하는 단계.
CSFV E2 단백질의 정제는 예를 들어 CSFV E2 단백질에 부착된 융합 태그 또는 융합 펩타이드를 통해, 예를 들어, 존재하는 경우 His-태그, FLAG-태그 또는 Fc-단편을 통해 수행될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 또한 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은: (i) E2 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터를 함유하는 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) E2 단백질 또는 E2 단백질을 포함하는 전체 세포 배양물을 수확하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 E2 단백질은 상기 본원에 정의된 바와 같은 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 E2 단백질의 6B8 에피토프 내 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 발현 벡터는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 포유동물 발현 벡터이다. 하나의 양상에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 상업적 제품으로부터 유래된다. 하나의 양상에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 pcDNA3.4(Invitrogen)으로부터 유래된다. 하나의 양상에서, 세포는 포유동물 세포이다. 하나의 양상에서, 포유동물 세포는 CHO 세포이다.
하나의 양상에서, 방법은 사용자 매뉴얼(Revision D.0, May 25, 2018, Thermo Fisher Scientific Inc)에 따라 ExpiCHO™ 발현 시스템(Gibico, Cat# A29133)을 사용함에 의해 수행된다. 하나의 양상에서, CHO 세포는 제조사(Gibco)에 의해 Cat# A29127하에 시판되는 ExpiCHO-S™ 세포이다. 하나의 구현예에서, 방법은 예를 들어, ExpiFectamine™ CHO 형질감염 키트 (Gibico, Cat# A29129)를 사용하여 본 발명의 재조합 포유동물 발현 벡터로 포유동물 세포를 감염시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 발현 벡터는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 바쿨로바이러스이다. 하나의 양상에서, 재조합 바쿨로바이러스는 상업적 제품으로부터 유래한다. 하나의 양상에서, 재조합 바쿨로바이러스는 상표명 SapphireTM 바쿨로바이러스 (Allele Biotechnology)하에 시판되는 상업적 제품으로부터 유래한다. 하나의 양상에서, 세포는 곤충 세포이다. 하나의 양상에서, 곤충 세포는 SF+ 세포이다. 하나의 구현예에서, SF+ 세포는 제조원 (Protein Sciences Corporation (Meriden, CT))에 의해 시판되는 상업적 제품이다.
본 발명의 하나의 양상에서, 상기 방법은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 바쿨로바이러스를 제조하는 단계를 포함한다. 하나의 양상에서, 재조합 바쿨로바이러스는 상업적 제품으로부터 유래한다. 하나의 양상에서, 재조합 바쿨로바이러스는 상표명 SapphireTM 바쿨로바이러스 (Allele Biotechnology)하에 시판되는 상업적 제품으로부터 유래한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 상기 방법은 본 발명의 재조합 바쿨로바이러스를 사용하여 세포를 감염시키는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 세포는 곤충 세포이다. 하나의 구현예에서, 곤충 세포는 SF+ 세포이다. 하나의 구현예에서, SF+ 세포는 제조원 (Protein Sciences Corporation (Meriden, Ct))에 의해 시판되는 상업적 제품이다.
본 발명의 방법의 하나의 양상에서, 상기 방법은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 바쿨로바이러스를 제조하는 단계, 및 곤충 세포를 재조합 바쿨로바이러스로 감염시키는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 재조합 바쿨로바이러스는 상표명 SapphireTM 바쿨로바이러스 (Allele Biotechnology)하에 시판되는 상업적 제품으로부터 유래한다. 하나의 구현예에서, 곤충 세포는 SF+ 세포이다. 하나의 구현예에서, SF+ 세포는 제조원 (Protein Sciences Corporation (Meriden, CT))에 의해 시판되는 상업적 제품이다.
본 발명의 하나의 양상에서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: (i) 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 바쿨로바이러스를 제조하는 단계; (ii) 곤충 세포를 상기 재조합 바쿨로바이러스로 감염시키는 단계; (iii) 상기 곤충 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (iv) 본 발명의 E2 단백질 또는 본 발명의 E2 단백질을 포함하는 전체 세포 배양물을 수거하는 단계. 하나의 양상에서, 재조합 바쿨로바이러스는 상표명 SapphireTM 바쿨로바이러스 (Allele Biotechnology)하에 시판되는 상업적 제품으로부터 유래한다. 하나의 구현예에서, 곤충 세포는 SF+ 세포이다. 하나의 구현예에서, SF+ 세포는 제조원 (Protein Sciences Corporation (Meriden, Ct))에 의해 시판되는 상업적 제품이다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 세포를 배양하기 위한 배양 배지는 당업자에 의해 결정된다. 하나의 양상에서, 배양 배지는 무혈청 곤충 세포 배지이다. 하나의 양상에서, 배양 배지는 Ex-CELL 420 (곤충 세포에 대한 Ex-CELL® 420 무혈청 배지, Sigma-Aldrich, Cat. 14420C)이다.
본 발명의 하나의 양상에서, 곤충 세포는 E2 단백질의 발현을 위해 적합한 조건하에서 배양된다. 하나의 양상에서, 곤충 세포는 최대 10일, 바람직하게 약 2일 내지 약 10일, 보다 바람직하게 약 4일 내지 약 9일 및 심지어 보다 바람직하게 약 5일 내지 약 8일의 기간 동안 배양한다. 하나의 양상에서, 곤충 세포를 배양하기 위해 적합한 조건은 약 22 - 32°C, 바람직하게 약 24 - 30°C, 보다 바람직하게 약 25 - 29°C, 보다 더 바람직하게 약 26 - 28°C, 및 가장 바람직하게 약 27°C의 온도를 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 상기 방법은 추가로 본 발명의 세포 배양물을 불활성화시키는 단계를 포함한다. 임의의 통상적인 불활성화 방법은 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있고, 이는 화학적 및/또는 물리적 처리를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양상에서, 불활성화 단계는 바람직하게 약 1 내지 약 20 mM, 바람직하게 약 2 내지 약 10 mM, 보다 바람직하게 약 5 mM 또는 10 mM의 농도로 폐환된 이원(binary) 에틸렌이민 (BEI)의 첨가를 포함한다. 하나의 구현예에서, 불활성화 단계는 폐환되어 NaOH 중에서 BEI를 형성하는 2-브로모에틸렌아민 하이드로브로마이드 용액의 첨가를 포함한다.
하나의 양상에서, 불활성화 단계는 25 - 40°C, 바람직하게 28 - 39°C, 보다 바람직하게 30 - 39°C, 보다 바람직하게 35 - 39°C에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 불활성화 단계는 24 - 72 h, 바람직하게 30 - 72 h, 보다 바람직하게 48 - 72 h 동안 수행된다. 일반적으로, 불활성화 단계는 바이러스 벡터의 어떠한 복제가 검출될 수 없을 때까지 수행한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 상기 방법은 추가로 불활성화 단계 후 중화 단계를 포함한다. 중화 단계는 용액 내 불활성화제를 중화시키는 균등량의 제제의 첨가를 포함한다. 하나의 구현에에서, 불활성화제는 BEI이다. 하나의 양상에서, 중화제는 나트륨 티오설페이트이다. 하나의 양상에서, 불활성화제가 BEI인 경우, 균등량의 나트륨 티오설페이트가 첨가된다. 예를 들어, BEI가 최종 5mM의 농도로 첨가되는 경우에, 1.0M 나트륨 티오설페이트 용액을 첨가하여 임의의 잔여 BEI를 중화시키기 위해 5mM의 최종 최소 농도가 되게 한다. 하나의 양상에서, 중화 단계는 불활성화제가 BEI인 경우, 1 내지 20 mM, 바람직하게 2 내지 10 mM, 보다 바람직하게 5 mM 또는 10 mM의 최종 농도로 나트륨 티오설페이트 용액의 첨가를 포함한다. 하나의 양상에서, 중화제는 바이러스 벡터 복제가 검출될 수 없음을 의미하는, 불활성화 단계가 완료된 후 첨가된다. 하나의 양상에서, 중화제는 불활성화 단계가 24시간 동안 수행된 후 첨가된다. 하나의 양상에서, 중화제는 불활성화 단계가 30시간 동안 수행된 후 첨가된다. 하나의 양상에서, 중화제는 불활성화 단계가 48시간 동안 수행된 후 첨가된다. 하나의 양상에서, 중화제는 불활성화 단계가 72시간 동안 수행된 후 첨가된다.
본 발명의 하나의 양상에서, CSFV E2 단백질은 추가로 정제한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 CSFV E2 단백질은 CSFV E2 단백질에 부착된 예를 들어 His-태그, FLAG-태그 또는 Fc-단편과 같은 융합 펩타이드를 포함할 수 있다. His-태그가 있는 CSFV E2 단백질은 예를 들어 Ni-NTA 친화성(니트릴로트리아세트산에 커플링된 니켈2+-이온)에 의해 정제될 수 있다. FLAG-태그(DYKDDDDK)를 갖는 CSFV E2 단백질은 예를 들어 FLAG-태그에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체에 의해 정제될 수 있다(예를 들어 상업적 키트는 Sigma-Aldrich(Anti-FLAG® M1 아가로스 친화성 겔)로부터 입수 가능함). Fc-단편에 연결된 CSFV E2 단백질은 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성에 의해 정제될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 또한 CHO 세포에서 재조합 CSFV E2 단백질, 바람직하게 표 1 내지 7에 정의되거나 하기의 본원의 기타 기재된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 CSFV E2 단백질을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) CHO 세포를 배지에서 고밀도 현탁액 배양에 적응시키는 단계;
b) 재조합 CSFV E2 단백질, 바람직하게는 표 1 내지 7에 정의되거나 하기의 본원의 기타 기재된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 CSFV E2 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 포유동물 발현 벡터를 사용하여 단계 a)로부터의 적응된 CHO 세포를 형질감염시키는 단계,
c) 재조합 CSFV E2 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 단계 b)로부터 형질감염된 CHO 세포를 배양하는 단계;
d) 재조합 CSFV E2 단백질을 수거하고 임의로 정제하는 단계.
하나의 양상에서, 본 발명은 또한 CHO 세포에서 재조합 CSFV E2 단백질, 바람직하게 표 1 내지 7에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 CSFV E2 단백질 또는 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 배지에서 고밀도 현탁액 배양에 적응된 CHO 세포를 성장시키는 단계;
b) 재조합 CSFV E2 단백질, 바람직하게는 표 1 내지 7에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 CSFV E2 단백질 또는 본 발명에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 단계 a)로부터의 CHO 세포를 형질감염시키는 단계,
c) 재조합 CSFV E2 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 단계 b)로부터 형질감염된 CHO 세포를 배양하는 단계;
d) 재조합 CSFV E2 단백질을 수거하고 임의로 정제하는 단계.
하나의 구현예에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 pcDNA3.4(Invitrogen)로부터 유래된다.
하나의 양상에서, CHO 세포는 제조사(Gibco)에 의해 Cat# A29127하에 시판되는 ExpiCHO-S™ 세포이다.
하나의 구현예에서, 방법에 사용된 바와 같은 배지는 제조원(Gibico)에 의해 Cat# A29100하에 시판되는 ExpiCHO™ 발현 배지이다.
하나의 구현예에서, 적응된 CHO 세포는 ExpiFectamine™ CHO 형질감염 키트(Gibico, Cat# A29129)를 사용함에 의해 형질감염시킨다.
하나의 구현예에서, 단계 c)에서, 형질감염된 CHO 세포는 약 32-37℃, 바람직하게는 약 32℃에서 배양된다.
하나의 구현예에서, 단계 c)에서, 형질감염된 CHO 세포는 약 5-8% CO2의 습화된 대기와 함께 배양한다.
하나의 구현예에서, ExpiFectamine™ CHO 인핸서 및 ExpiCHO™ 공급물을 단계 c)에서 첨가한다.
하나의 구현예에서, 재조합 CSFV E2 단백질은 형질감염 후 약 2-14일, 예를 들어 형질감염 후 약 4-12일 또는 형질감염 후 약 8-10일에 수거한다.
본 발명의 하나의 양상에서, CSFV E2 단백질은 추가로 정제한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 CSFV E2 단백질은 CSFV E2 단백질에 부착된 예를 들어 His-태그, FLAG-태그 또는 Fc-단편과 같은 융합 펩타이드를 포함할 수 있다. His-태그가 있는 CSFV E2 단백질은 예를 들어 Ni-NTA 친화성(니트릴로트리아세트산에 커플링된 니켈2+-이온)에 의해 정제될 수 있다. FLAG-태그(DYKDDDDK)를 갖는 CSFV E2 단백질은 예를 들어 FLAG-태그에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체에 의해 정제될 수 있다(예를 들어 상업적 키트는 Sigma-Aldrich(Anti-FLAG® M1 아가로스 친화성 겔)로부터 입수 가능함). Fc-단편에 연결된 CSFV E2 단백질은 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성에 의해 정제될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물로 백신접종된 동물과 CSFV로 감염된 동물을 구별하기 위한 키트를 제공한다. 하나의 양상에서, 키트는 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 6B8 에피토프에서 돌연변이(들)를 갖는 본 발명의 재조합 E2 단백질, 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 6B8 에피토프를 포함하는 CSFV의 야생형 E2 단백질을 포함한다. 키트는 또한 사용 지침서를 포함할 수 있다.
하기의 항목은 또한 본원에 기재되고 본 발명의 개시내용의 일부이다:
1. 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 재조합 CSFV(고전적 돼지 열 바이러스) E2 단백질로서, 여기서 변형되지 않은 6B8 에피토프는 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는, 재조합 CSFV E2 단백질.
2. 항목 1에 있어서, E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 적어도 하나의 돌연변이가 이러한 돌연변이된 6B8 에피토프에 대한 6B8 모노클로날 항체의 결합의 특이적 억제를 유도하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 6B8 모노클로날 항체
(i)가 수탁번호 CCTCC C2018120하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되거나,
(ii)가 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나,
(iii)가 수탁 번호 CCTCC C2018120하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체의 CDR을 포함하거나,
(iv)가 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 E2 단백질의 위치 10, 위치 14, 위치 22, 위치 24, 위치 24/25, 위치 41 및/또는 위치 64에서 아미노산 잔기에 의해 정의되는, 재조합 CSFV E2 단백질.
5. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 E2 단백질의 아미노산 잔기 S14, G22, E24, E24/G25, Y10, D41 및/또는 R64에 의해 정의되거나, 적어도 E2 단백질의 아미노산 잔기 S14, G22, G24, G24/G25, Y10, D41 및/또는 R64에 의해 정의되는, 재조합 CSFV E2 단백질.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, E2 단백질의 아미노산 위치 24에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 24/25에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 14에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 10에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, E2 단백질의 위치 24에 있는 아미노산이 R로 치환되고, E2 단백질의 위치 24 및 25에 있는 아미노산이 각각 R 및 D로 치환되고, E2 단백질의 위치 14에 있는 아미노산이 K, Q 또는 R로 치환되고, E2 단백질의 위치 22에 있는 아미노산이 A, R, Q 또는 E로 치환되고, A 및 R이 바람직하고, E2 단백질의 위치 10에 있는 아미노산이 A 또는 P로 치환되고, E2 단백질의 위치 41에 있는 아미노산이 A, N 또는 E로 치환되고/되거나, E2 단백질의 위치 64에 있는 아미노산이 A, S 또는 E로 치환되고, A 및 S가 바람직한, 재조합 CSFV E2 단백질.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, E2 단백질의 아미노산 위치 24에서 E 또는 G의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 24에서 E 또는 G의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함) 및 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K, 및 W가 바람직함)을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 6B8 에피토프 내의 아미노산 치환이 E2 단백질의 위치 24에 아미노산 R, D 또는 I, E2 단백질의 위치 25에 아미노산 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P, E2 단백질의 위치 14에 아미노산 K, Q 또는 R, E2 단백질의 위치 22에 아미노산 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S, E2 단백질의 위치 10에 아미노산 A 또는 P, E2 단백질의 위치 41에 아미노산 A, N 또는 E, 및/또는 E2 단백질의 위치 64에 아미노산 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W를 포함하는 돌연변이된 6B8 에피토프를 유도하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 재조합 CSFV E2 단백질이 C-균주 또는 필드 균주 QZ07 또는 GD18로부터 유래하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
11. 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 재조합 CSFV E2 단백질이 필드 균주 QZ07로부터 유래하고, E2 단백질 아미노산 위치 24에서 E의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), 또는 E2 단백질의 아미노산 위치 24에서 E의 R로의 치환 및 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함)을 포함하고, 임의로 추가로 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, 또는 E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K, 및 W가 바람직함)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
12. 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 재조합 CSFV E2 단백질이 필드 균주 GD18로부터 유래하고, E2 단백질 아미노산 위치 24에서 E의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), 또는 E2 단백질의 아미노산 위치 24에서 E의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함) 및 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함)을 포함하고, 임의로 추가로 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, 또는 E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K, 및 W가 바람직함)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
13. 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 재조합 CSFV E2 단백질이 C-균주로부터 유래하고, E2 단백질 아미노산 위치 24에서 G의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함)을 포함하고, 임의로 추가로 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K로의 치환, 또는 E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K, 및 W가 바람직함)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
14. 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 재조합 CSFV E2 단백질이 표 1 내지 7에 정의된 바와 같은 E2 단백질의 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
15. 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 재조합 CSFV E2 단백질이 서열번호 15-20, 22-33, 35-40, 49-72 및 74-81로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 하나를 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
16. 항목 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 돼지 Fc 단편과 같은 Fc 단편이 재조합 CSFV E2 단백질에 연결되고; 바람직하게는 돼지 Fc 단편과 같은 Fc 단편이 바람직하게는 펩타이드 링커를 통해 E2 단백질의 C 말단에 연결되는, 재조합 CSFV E2 단백질.
17. 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 암호화하는 재조합 핵산.
18. 항목 17의 핵산을 포함하고, 포유동물 발현 벡터인, 벡터.
19. 항목 17의 핵산 또는 항목 18의 벡터를 포함하고, CHO 세포인, 숙주 세포.
20. 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 포함하는 재조합 CSFV.
21. 항목 20에 있어서, 재조합 CSFV가 약독화된, 재조합 CSFV.
22. 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 재조합 CSFV E2 단백질, 항목 17에 따른 재조합 핵산, 항목 18에 따른 벡터, 항목 19의 숙주 세포, 및/또는 항목 20 또는 21의 재조합 CSFV를 포함하는 면역원성 조성물.
23. 항목 22에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 백신, 바람직하게는 마커 백신 또는 DIVA(감염된 동물과 백신접종된 동물 사이의 구별) 백신인, 면역원성 조성물.
24. 항목 22 또는 23에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 방법이 항목 22 또는 23에 따른 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물.
25. 항목 22 또는 23에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 동물이 돼지인, 면역원성 조성물.
26. 항목 22 또는 23에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 동물이 새끼 돼지인, 면역원성 조성물.
27. 항목 22 또는 23에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 동물이 1 내지 4주령의 새끼 돼지인, 면역원성 조성물.
28. 항목 22 또는 23에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 동물이 암퇘지인, 면역원성 조성물.
29. 항목 22 또는 23에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 동물이 임신한 암퇘지인, 면역원성 조성물.
30. 항목 22 또는 23에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 면역원성 조성물이 단지 1회 투여되는, 면역원성 조성물.
31. 항목 22 또는 23에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 면역원성 조성물이 동물에게 단지 1회 투여되고 면역원성 조성물의 상기 단일 투여 후 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하는데 효과적인, 면역원성 조성물.
32. 항목 22 또는 23에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 면역원성 조성물이 1회 또는 수회 투여되는, 면역원성 조성물.
33. 항목 22 또는 23에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 면역원성 조성물이 동물에게 1회 또는 수회 투여되고 면역원성 조성물의 상기 단일 또는 다중 투여 후 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하는데 효과적인, 면역원성 조성물.
34. 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 항목 22 또는 23에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
35. 항목 22 또는 23의 면역원성 조성물로 백신접종된 동물과 CSF로 감염된 동물을 구별하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는, 방법:
a) 샘플을 수득하는 단계 및
b) 면역 시험에서 상기 샘플을 시험하는 단계.
36. 항목 35에 있어서, 상기 면역 시험이 CSFV E2 단백질 또는 이의 항원 결합 단편의 6B8 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체가 샘플에서 CSFV E2 단백질에 결합할 수 있는지의 여부를 시험함을 포함하는, 방법.
37. 항목 35 또는 36에 있어서, 면역 시험이 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체가 샘플에 존재하는지의 여부를 시험하고/하거나 재조합 CSFV E2 단백질의 돌연변이된 6B8 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체가 샘플에 존재하는지의 여부를 시험하는 것을 포함하는, 방법.
38. 항목 35 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 면역 시험이 EIA(효소 면역검정) 또는 ELISA (효소 결합 면역흡착 검정), 바람직하게 이중 경쟁 ELISA인, 방법.
39. 항목 36 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 6B8 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체
(i)가 수탁번호 CCTCC C2018120하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되거나,
(ii)가 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나,
(iii)가 수탁 번호 CCTCC C2018120하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체의 CDR을 포함하거나,
(iv) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 방법.
40. CSFV E2 단백질 또는 이의 항원 결합 단편의 6B8 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체를 포함하는, 항목 22 또는 23의 면역원성 조성물로 백신접종된 동물과 CSFV로 감염된 동물을 구별하기 위한 키트.
41. 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 생성하기 위한 방법으로서,
(i) CSFV E2 단백질의 발현을 위해 적합한 조건하에서 항목 19의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
(ii) CSFV E2 단백질을 단리하고 임의로 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
42. 재조합 CSFV E2 단백질, 바람직하게 표 1 내지 7에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 CSFV E2 단백질 또는 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 CHO 세포에서 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는, 방법:
a) CHO 세포를 배지에서 고밀도 현탁액 배양에 적응시키는 단계;
b) 재조합 CSFV E2 단백질, 바람직하게는 표 1 내지 7에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 CSFV E2 단백질 또는 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 단계 a)로부터의 적응된 CHO 세포를 형질감염시키는 단계,
c) 재조합 CSFV E2 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 단계 b)로부터 형질감염된 CHO 세포를 배양하는 단계;
d) 재조합 CSFV E2 단백질을 수거하고 임의로 정제하는 단계.
43. 재조합 CSFV E2 단백질, 바람직하게 표 1 내지 7에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 CSFV E2 단백질 또는 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 CHO 세포에서 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는, 방법:
a) 배지에서 고밀도 현탁액 배양에 적응된 CHO 세포를 성장시키는 단계;
b) 재조합 CSFV E2 단백질, 바람직하게는 표 1 내지 7에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 CSFV E2 단백질 또는 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 단계 a)로부터의 CHO 세포를 형질감염시키는 단계,
c) 재조합 CSFV E2 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 단계 b)로부터 형질감염된 CHO 세포를 배양하는 단계;
d) 재조합 CSFV E2 단백질을 수거하고 임의로 정제하는 단계.
44. 항목 42 또는 43에 있어서, 단계 c)에서, 형질감염된 CHO 세포가 약 32-37℃, 바람직하게는 약 32℃에서 배양되는, 방법.
45. 항목 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 단계 c)에서, 형질감염된 CHO 세포가 약 5-8% CO2의 습화된 대기와 함께 배양되는, 방법.
46. 항목 42 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 재조합 CSFV E2 단백질이 형질감염 후 약 2-14일, 예를 들어 형질감염 후 약 4-12일 또는 형질감염 후 약 8-10일에 수거되는, 방법.
47. 항목 42 내지 46 중 어느 하나에 있어서, CHO 세포가 제조사(Gibco)에 의해 Cat# A29127하에 시판되는 ExpiCHO-S™ 세포인, 방법.
48. 항목 44 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 방법에 사용된 바와 같은 배지가 제조원(Gibico)에 의해 Cat# A29100하에 시판되는 ExpiCHO™ 발현 배지인, 방법.
49. 항목 44 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 적응된 CHO 세포가 ExpiFectamine™ CHO 형질감염 키트(Gibico, Cat# A29129)를 사용함에 의해 형질감염되는, 방법.
50. 항목 42 내지 49 중 어느 하나에 있어서, ExpiFectamine™ CHO 인핸서 및 ExpiCHO™ 공급물이 단계 c)에서 첨가되는, 방법.
51. 항목 42 내지 50 중 어느 하나에 있어서, CSFV E2 단백질이 추가로 정제되는, 방법.
52. 항목 42 내지 51 중 어느 하나에 있어서, CSFV E2 단백질이 융합 펩타이드를 포함하고, CSFV E2 단백질의 정제가 융합 펩타이드에 특이적으로 결합하는 매트릭스에 대한 친화성에 의해 수행되는, 방법.
53. 항목 42 내지 52 중 어느 하나에 있어서, CSFV E2 단백질이 융합 펩타이드로서 His-태그를 포함하고, CSFV E2 단백질이 His-태그를 통해 CSFV E2 단백질을 Ni-NTA에 결합시키고 Ni-NTA로부터 CSFV E2 단백질을 방출시킴으로써 정제되는, 방법.
54. 항목 42 내지 52 중 어느 하나에 있어서, CSFV E2 단백질이 융합 펩타이드로서 FLAG-태그를 포함하고, CSFV E2 단백질이 FLAG 태그를 통해 CSFV E2 단백질을 FLAG 태그에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체에 결합시키고, 상기 모노클로날 항체로부터 CSFV E2 단백질을 방출시킴으로써 정제되는, 방법.
55. 항목 42-52 중 어느 하나에 있어서, CSFV E2 단백질이 Fc 단편에 연결되고, CSFV E2 단백질이 Fc 단편을 통해 CSFV E2 단백질을 단백질 A 또는 단백질 G에 결합시키고 단백질 A 또는 단백질 G로부터 CSFV E2 단백질을 방출시킴으로써 정제되는, 방법.
실시예
후속 실시예는 예시된 방식으로 본 발명을 추가로 설명한다. 본 발명은 하기된 바와 같은 임의의 예에 제한되지 않는 것으로 이해된다. 당업자는 이들 실시예의 수행, 결과 및 발견이 본 발명의 일반적인 설명의 관점에서 보다 넓은 의미로 적응되고 적용될 수 있음을 이해한다.
재료 및 방법
1. 세포 배양물.
sf9 세포주는 5% 태아 소 혈청(FBS)이 포함된 Excell 420에서 배양하였고 CO2 없이 27°C에서 항온처리하였다.
sf+ 세포주는 Excell 420에서 배양하였고, 120rpm의 속도로 27℃ 진탕기에서 항온처리하였다.
PK/WRL 세포주는 10% 태아 소 혈청(FBS)과 함께 배양하였고, 5% CO2와 함께 37°C에서 항온처리하였다.
2. QZ07-E2 및 QZ07-E2-돌연변이에 대한 pV1393 기반 셔틀 플라스미드의 작제
QZ07-E2 서열, QZ07-E2-KRD 및 QZ07-E2-KARD 서열은 각각 코돈 최적화(각각 서열번호 44-46)하고 곤충 발현 시스템에 따라 합성하였다. 가용성 및 분비형 E2 단백질을 수득하기 위해 최종 최적화된 서열에서 E2의 마지막 43개 아미노산(aa)을 결실시키고 E1 단백질의 마지막 21개 aa를 신호 펩타이드로서 추가하였다. 발현될 E2 구조의 도식적 존재를 도 1에 나타내었다. 각각 합성된 서열을 BamH I 및 EcoR I에 의해 pVL1393 셔틀 플라스미드에 클로닝하여 추가적인 공동 형질감염을 위한 pVL1393-셔틀 플라스미드를 완성하였다. CSFV E2 및 6B8 에피토프 돌연변이를 갖는 CSFV E2의 전체 작제 과정은 도 2를 참조한다. KARD는 S14K, G22A, 및 E24R/G25D 돌연변이를 의미하고, 아미노산의 넘버링은 서열번호 9와 같은 E2 단백질을 참조한다. KRD (S14K, 및 E24R/G25D)와 같은 돌연변이의 다른 조합은 또한 각각 E2 단백질에 도입하였다.
C-E2 서열 및 C-E2-KARD 서열 (각각 서열번호 47 및 48)을 각각 합성하였다. 가용성 및 분비형 E2 단백질을 수득하기 위해 최종 서열에서 E2의 마지막 42개 아미노산(aa)을 결실시키고 E1 단백질의 마지막 16개 aa를 신호 펩타이드로서 추가하였다. 발현될 E2 구조의 도식적 존재는 도 1에 나타낸 바와 같다. 각각 합성된 서열을 BamH I 및 EcoR I에 의해 pVL1393 셔틀 플라스미드에 클로닝하여 추가적인 공동 형질감염을 위한 pVL1393-셔틀 플라스미드를 완성하였다. CSFV E2 및 6B8 에피토프 돌연변이를 갖는 CSFV E2의 전체 작제 과정은 도 2를 참조한다. KARD는 S14K, G22A, 및 G24R/G25D 돌연변이를 의미하고, 아미노산의 넘버링은 서열번호 21와 같은 E2 단백질을 참조한다.
3. E2 발현 카세트를 갖는 재조합 바쿨로바이러스의 작제,
SF9 세포(1.0 X106)의 하나의 웰은 형질감염을 위해 6-웰 플레이트에 준비되었고 다른 웰은 세포 대조군으로서 사용되었다. 세포는 1시간 항온처리 후 표면 상에 균질하게 분포하였다. DNA 리포플렉스 형질감염 혼합물은 다음과 같이 제조하였다: 하나의 튜브에 0.5ml 무혈청 Grace's 곤충 배지(비-보충)와 3μl DNA 셔틀 형질감염 시약의 혼합물을 첨가하고; 다른 튜브에는 사파이어 바쿨로바이러스 DNA 1μl, 전달 플라스미드 1μg 및 무혈청 Grace 곤충 배지(비-보충) 0.5ml을 첨가하고; 2개 튜브의 내용물을 하나로 배합하고 부드럽게 혼합하고 실온에 20분 동안 두었다. 배지는 세포로부터 제거하고 단일층은 매번 1ml 무혈청 Grace 곤충 배지 (비-보충)로 2회 세정하고, 이어서 배지를 세포로부터 제거하고 DNA/형질감염 시약 혼합물을 첨가하였다. 세포 단일층을 27℃에서 4-5시간 동안 항온처리하고 형질감염 혼합물을 5% FBS를 함유한 2ml의 Excell 420으로 대체하였다. 항온처리는 5 내지 6일 동안 27 °C에서 계속하였다. 세포 및 세포 배양 배지는 4 °C에서 10분동안 3000 rpm에서 원심분리하여 수거하였다.
4 재조합 바쿨로바이러스에 대한 플라크 정제 공정
sf9 세포를 갖는 6-웰 플레이트 (1.5 X 106 세포/웰)를 준비하고 1시간동안 실온에서 방치하였다. 10-1에서 10-6으로 희석된 각 바이러스의 10배 연속 희석액(바이러스 50μL 및 배지 450μL)을 제조하였다. 세포 배양 배지를 플레이트로부터 제거하고 희석액 10-3 내지 10-6에서 웰당 100μL의 바이러스를 각 디쉬의 중앙에 적하 방식으로 첨가하였다(희석액당 2개의 웰을 감염시켰다). 이어서 플레이트를 1시간동안 실온에서 항온처리하였다. 항온처리 기간 동안에, 1% (w/v) LGT 아가로스 배지를 37°C 수욕조에서 제조하였다. 바이러스 접종물을 각 웰로부터 제거하고 2ml의 1%(w/v) LGT 아가로스 배지를 피펫팅하고 각 웰에 오버레이하였다. 플레이트를 고화될때까지 약 15분동안 실온에서 항온처리하였다. 이어서, 1ml의 곤충 세포 배양 배지를 아가로스 오버레이 상에 웰당 첨가하고 27°C에서 5일 동안 항온처리하였다. 마지막으로 액체 오버레이를 제거하고 1ml의 뉴트럴 레드(Neutral Red)(배지와 1:20)를 각 웰에 첨가하고 27°C에서 2 내지 4시간 동안 항온처리하였다. 플라크를 제거하기 위해 디쉬를 4시간 동안 뒤집어진 상태로 암실에 방치하였다. 플라크를 계수하고 바이러스 역가를 계산하였다. 개별 플라크를 피펫 팁으로 픽업하고 200 μL의 배지에 용해하여 증식할 때까지 4°C에서 저장하였다.
5. E2 단백질 정제
300 ml의 배양 상등액을 원심분리하고 이어서 여과하였다. 여과된 상등액을 2시간동안 Ni 세파로스 excel 비드로 항온처리하여 표적 단백질을 포획하였다. 비드를 완충액 PBS, pH7.4로 세척하고, 이어서 각각 20mM, 50mM, 80mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 세척하고, 최종적으로 200mM 이미다졸 및 500mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 용출시켰다. SDS PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 수행하여 표적 단백질의 순도 및 농도를 조사하였다.
6. QZ07-E2-Fc-WT 및 QZ07-E2-Fc-돌연변이 및 CHO 세포에서의 발현을 위한 E2 발현 카세트를 갖는 재조합 플라스미드의 작제
QZ07-E2-Fc-WT 서열(CSFV E2-Fc 융합 단백질) 및 6B8 에피토프 돌연변이를 갖는 CSFV E2-Fc 융합 단백질을 코돈 최적화하고 CHO 발현 시스템(ExpiCHO™ Expression System, Thermo Fisher)의 지시에 따라 합성하였다. 가용성 및 분비형 E2 단백질을 수득하기 위해, 최종 최적화된 서열에서 E2의 마지막 43개 아미노산(aa)을 결실시키고 E1 단백질의 마지막 21개 aa를 신호 펩타이드로서 추가하였다. 펩타이드 링커는 또한 E2 단백질과 Fc 단편 사이에 첨가하였다. QZ07-E2-Fc-WT 서열의 아미노산 서열(또한 “QZ07-E2-WT-FL-Fc”로서 호칭되는)은 서열번호 97로 나타내었다. 각각의 합성된 서열은 pCDNA3.4 플라스미드에 클로닝하였다. CSFV E2-Fc 융합 단백질 및 6B8 에피토프 돌연변이(예를 들어, 위치 64에 돌연변이)가 있는 CSFV E2-Fc 융합 단백질의 전체 작제 과정은 도 2를 참조할 수 있다.
형질감염 및 배양은 또한 제조사(Thermo Fisher)로부터의 ExpiCHO™ 발현 시스템 가이드의 지침에 따라 수행하였다.
형질감염 하루 전에(-1일에), ExpiCHO-S™ 배양물을 3 × 106 -4 × 106 생존 세포/mL의 최종 밀도로 나누고, 세포가 밤새 성장하도록 하였다. 형질감염 날(0일)에, 생존 세포 밀도 및 생존률 퍼센트를 결정하였다. 세포가 95-99%의 생존율로 대략 7 × 106 -10 × 106 생존 세포/mL의 밀도에 도달했을 때, 세포를 신선한 ExpiCHO™ 발현 배지를 사용하여 6 × 106 생존 세포/mL의 최종 밀도로 희석하였다. 플라스크를 부드럽게 와동시켜 세포를 혼합하였다. ExpiFectamine™ CHO/플라스미드 DNA 복합체는 냉각 시약 (4°C)을 사용하여 제조하였다. 냉장으로부터 시약을 간단히 제거하고 DNA 복합체화를 개시하였다. 하기의 단계를 포함하였다: a) ExpiFectamine™ CHO 시약 병을 4-5회 약하게 뒤집으면서 혼합하고, b) 플라스미드 DNA를 냉각 OptiPRO™ 배지로 희석하고, 튜브를 와동시키고/시키거나 뒤집어서 혼합하고, c) ExpiFectamine™ CHO 시약을 OptiPRO™ 배지로 희석하고, 튜브를 와동시키고/시키거나 뒤집거나 약하에 2-3회 피펫팅함에 의해 혼합하고, 튜브를 와동시키거나 뒤집어서 혼합하고, ExpiFectamine™ CHO/플라스미드 DNA 복합체(단계 d로부터)를 1-5분동안 실온에서 항온처리하고 이어서 용액을 진탕기 플라스크로 서서히 이동시키고, 첨가동안에 플라스크를 약하게 와동시킨다. 형질감염 후 1일째에(1일째, 형질감염 후 18-22 시간), ExpiFectamine™ CHO 인핸서 및 ExpiCHO™ 공급물을 플라스크에 첨가하고 (가이드에 따라 용적을 첨가하면서), 이어서 첨가 동안에 플라스크를 약하게 와동시킨다. 플라스크를 진탕하면서 공기 중 5% CO2의 습화된 대기를 갖는 32℃ 항온처리기로 이동시키고 6-10일 동안 배양하였다. 세포 배양 배지를 4000 rpm에서 15분 동안 4℃에서 원심분리기로 수거하고 상등액을 수거하였다.
7. E2-Fc 융합 단백질 및 6B8 에피토프 돌연변이를 갖는 E2-Fc 융합 단백질의 정제
E2-Fc 융합 단백질 및 6B8 에피토프 돌연변이를 갖는 E2-Fc 융합 단백질의 정제는 각각 제조사(Thermo)의 단백질 A 아가로스를 사용하여 수행하였다. 정제 용액은 1 M Tris 완충액(pH 9.0)을 포함한다. 정제 공정은 단백질 아가로스와 모든 완충액을 실온으로 평형화하는 단계; 컬럼과 함께 제공된 지침에 따라 수지 슬러리 0.5ml(QZ07-E2-Fc-WT 및 QZ07-E2-Fc 돌연변이, 예를 들어, 위치 64에서의 돌연변이)로 컬럼을 조심스럽게 팩킹하는 단계; 결합 완충액 5ml를 첨가하고, 용액이 컬럼을 통해 배출되도록 하여 컬럼을 평형화하는 단계; 최적의 결합을 위해 적절한 이온 강도와 pH를 유지하기 위해 단백질 A 컬럼에 적용하기 전에 결합 완충액으로 샘플을 1:2로 희석하는 단계; 희석된 샘플을 컬럼에 적용하고 수지에 완전히 흐르도록 하는 단계; 결합 완충액 10ml로 단백질 A 컬럼을 세척하는 단계; 5ml의 용출 완충액으로 항체를 용출하고 분획을 수거하는 단계; 100ul의 중화 완충액 1ml의 용출액을 첨가하여 용출된 분획을 생리학적 pH로 즉시 조정하는 단계; 용출물을 원심 필터로 이동시키고, PBS 6ml를 첨가하는 단계; 튜브를 15분 동안 4000rpm의 원심분리기에 위치시키는 단계; 10ml의 PBS를 사용하여 튜브를 세척하는 단계; 샘플을 1-2ml로 농축하기 위해 원심분리 단계를 반복하는 단계; Qubit 키트를 사용하여 정제된 완충액 교환 샘플을 측정하는 단계; 및 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석으로 생성물을 확인하는 단계를 포함한다.
실시예 1: DIVA 부위의 동정 및 혼입
목적하는 새로운 백신의 주요 특성은 백신 접종된 동물을 감염된 동물(DIVA)과 구별하는 능력이다. DIVA 특성은 기존의 CSFV E2 서브유닛 백신에서 필수적인 개선이 될 것이며 중요한 기술적 이점을 갖는다. DIVA 특성을 도입하는 전략은 면역 우성 E2 단백질 표면에서 하나 이상의 중요한 에피토프를 변경하고 ELISA를 사용하여 백신 접종의 지표로서 야생형 에피토프를 인지하는 항체의 부재를 입증하는 것이다(음성 DIVA).
상기 전략을 수행하기 위해, 본원 발명자들은 강력한 중화 마우스 mAb 6B8을 선택하였다. 모노클로날 항체 6B8을 생성하는 하이브리도마는 제조사(Zhejiang University)로부터 수득하였고, 2018년 6월 13일자로 CCTCC (CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION), Wuhan University, Wuhan 430072, P.R. China)에 수탁번호 CCTCC C2018120하에 기탁되었다. 모노클로날 항체 6B8는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 상기 항체의 CDR은 캐뱃 방법과 같은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, mAb 6B8은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 VH CDR1, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 VH CDR2, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열의 VH CDR3, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열의 VL CDR1, 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열의 VL CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열의 VL CDR3을 포함한다.
1. 6B8 mAb의 특징 분석
mAb 6B8이 대부분의 CSFV에 사용될 수 있는지의 여부를 조사하기 위해, 본원 발명자들은 그룹 1(Shimen 균주 및 C-균주 포함) 및 그룹 2(QZ07 및 GD18 포함)으로부터의 CSFV와 같은 다양한 CSF 바이러스와 mAb 6B8의 결합을 시험하였고 2개의 BVDV를 대조군으로서 사용하였다. 결과는 도 3에 나타내었다. 유전자형 그룹 2의 추가 8 필드 CSFV 단리물도 6B8 mAb에 대해 양성으로서 시험되었다(데이터는 나타내지 않음). 이들 데이터는 6B8이 대부분의 CSF 바이러스에 존재하는 보존된 에피토프를 인지하지만 BVDV 바이러스와는 반응하지 않음을 지적하였다.
2. 6B8 결합을 위해 중요한 아미노산의 동정
mAb 6B8의 존재 하에 PK/WRL 세포 배양에서 C-균주 바이러스의 연속 계대 후, 이탈 돌연변이체가 나타나고 중화 농도의 6B8 항체의 존재하에서 성장할 수 있다. 상기 이탈 돌연변이체의 4개의 클론을 수득하고 이들은 모두 6B8 결합을 회피하였다. 이들의 E2 유전자는 서열분석하고 서열분석 결과는 2개의 뉴클레오타이드 돌연변이(GGAGGT가 AGAGAT로)가 2개의 코돈에 있음을 지적하였다. 이들 변화는 연속 위치 24 및 25에서 2개의 아미노산 돌연변이(Gly-Gly에서 Arg-Asp로, 또는 GG에서 RD로)로 나타났다.
이어서, BVDV 및 기타 페스티바이러스 E2로 E2 서열 정렬(QZ07, GD18, GD191 및 C-균주)을 수행하여 6B8 결합에 대한 다른 잠재적인 중요 아미노산을 동정하였다(도 4). 이러한 접근법에 의해, 추가의 잠재적으로 중요한 아미노산, 예를 들어, 위치 14 및 위치 22에서의 아미노산을 동정하였다.
모든 이들 잠재적 돌연변이 (S14K, G22A, E24R/G25D)는 개별적으로 E2 발현 벡터에 도입하여 6B8 결합에 대한 이의 효과를 시험하였다. E2 유전자는 pCI-neo-태그 벡터 (Promega, cat#E1841)에 클로닝하여 발현 벡터를 생성하였다. E2 단백질의 올바른 발현의 확인 후, 모든 돌연변이는 E2 발현 벡터에 도입하였다. 이어서 이들 벡터를 24-웰 플레이트에서 Lipofectamine3000(Invitrogen, cat#L3000015)을 사용하여 PK/WRL 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간에, 세포를 4% 포름알데하이드로 고정시키고 이어서 0.1% Triton X-100으로 처리하였다. 세포를 이어서 IFA (면역형광성 검정) 시험에서 CSFV에 대한mAb 6B8 또는 토끼-폴리클로날 항체 (변형된 6B8 에피토프를 사용하여 CSFV를 검출하기 위한 양성 대조군으로서 사용되는), 및 상응하는 Alexa Fluor®488 접합된 제2 항체(Invitrogen cat#21206)로 염색하였다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, 현미경 조사는 S14K, G22A, E24R/G25D 돌연변이가 6B8 결합을 폐지시키기 위해 중요함을 밝혔다.
본 발명자들은 또한 6B8 항체와의 결합에 대해 개별적으로 위치 14, 22, 24 및 25에서의 다른 돌연변이의 효과를 시험하였다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 돌연변이 S14Q, S14R 및 G22R은 6B8의 결합을 완전히 폐지한 반면, G22E, G22Q는 6B8의 결합에 부분적으로 영향을 미치며, 추가로 이것은 위치 14 및 22가 6B8 결합에 중요하다는 것을 지적한다. 도 5c에 나타낸 바와 같이, 단일 돌연변이 G24K(C 균주에 대한)는 6B8의 결합을 완전히 폐지시켰고, 이것은 또한 위치 24가 6B8 결합에 중요하다는 것을 뒷받침한다. 단독의 G25S는 6B8의 결합을 폐지시킬 수 없다. 그러나 위치 25에서 Gly에서 Asp로의 돌연변이는 위치 24에서의 돌연변이와 함께 나타나므로 2개의 돌연변이는 하나의 돌연변이(24/25 돌연변이)로 간주될 수 있다.
상기 결과는 위치 14, 22, 24 및/또는 24/25에서의 돌연변이가 DIVA에 대해 사용될 수 있음을 시사한다. 결과는 또한 6B8 에피토프의 돌연변이가 E2 단백질의 전반적인 면역원성을 실질적으로 변경하지 않는다는 것을 시사하는데, 이는 돌연변이된 E2 단백질이 여전히 CSFV에 대한 폴리클로날 항체에 의해 인지될 수 있기 때문이다.
실시예 2: 바쿨로바이러스 발현 시스템 작제
각각의 작제물의 바쿨로바이러스 발현 시스템은 상업적 키트 (Sapphire 바쿨로바이러스 DNA 및 형질감염 키트: Allele Biotech Cat# ABP-BVD-100029)에 의해 바쿨로바이러스 게놈 DNA와 pVl1393-QZ07-E2 ,QZ07-E2-KARD, QZ07-E2-KRD, C-E2 및 C-E2-KARD의 sf9 세포로의 공동 형질감염에 의해 셋업되었고 각각의 E2 발현 카세트를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스는 Sf9 세포주 상의 플라크 정제에 의해 정제하였다. 형질감염된 세포는 6웰 플레이트에서 배양하였고, 5일동안 27°C에서 항온처리하였다. 형질감염된 각 샘플의 상등액을 수거하고 추가 플라크 정제를 위해 4°C에 저장한다.
플라크 정제 검정은 이어서 상기 방법에 기재된 바와 같은 각각의 작제물에 대해 수거된 상등액에 대해 수행하였다. 2라운드의 정제 후에, 각각의 E2 발현 카세트를 갖는 최종 재조합 바쿨로바이러스는 성공적으로 작제하였다.
실시예 3: E2 및 E2-KARD 또는 E2-KRD의 발현 및 정제의 스케일 업
QZ07-E2, QZ07-E2-KARD, QZ07-E2-KRD, C-E2 및 C-E2-KARD 발현 카세트를 갖는 재조합 바쿨로바이러스를 MOI 5에서 SF+ 세포주의 감염에 의해 증폭시켰다. 각 감염된 SF+ 세포로부터 수거한 300ml의 상등액을 방법에 기재된 대로 정제를 위해 사용하였다.
최종 생성물은 SDS PAGE 및 웨스턴 블롯팅 검정으로 검증되었다. 정제된 E2는 110 kDa의 이량체 형태와 55 kDa의 단일 형태에서 정확한 분자량을 보여주었다(도 6a).
추가 도트 블롯 검정은 정제된 QZ07-E2-KARD, QZ07-E2-KRD 및 C-E2-KARD와 6B8 mAb의 반응을 나타내지 않았고(도 6b), E2의 각 DIVA 형태가 성공적으로 정제되었고, 서브유닛 백신으로서 추가로 적용될 수 있음을 지적한다. 결과는 또한 6B8 에피토프의 돌연변이가 E2 단백질의 전체 면역원성을 실질적으로 변경하지 않는다는 것을 시사하는데, 이는 돌연변이된 E2 단백질이 여전히 다중 회복기 돼지 혈청 및 C-균주 백신접종된 혈청에 의해 인지될 수 있기 때문이다.
실시예 4: 재조합 플라스미드-CHO 발현 시스템 작제 및 정제
QZ07-E2-Fc-WT 서열 및 위치 64에서 QZ07-E2-Fc-돌연변이는 코돈 최적화하였고 CHO 발현 시스템(ExpiCHO™ Expression System, Thermo Fisher)의 지침에 따라 합성하였다. 가용성 및 분비형 E2 단백질을 수득하기 위해 최종 최적화된 서열에서 E2의 마지막 43개 아미노산(aa)을 결실시키고 E1 단백질의 마지막 21개 aa를 신호 펩타이드로서 추가하였다. 펩타이드 링커는 또한 E2 단백질과 Fc 단편 사이에 첨가하였다. 각각의 합성된 돌연변이 서열은 pCDNA3.4 플라스미드에 클로닝하였다. 각각의 작제물에 대한 형질감염 및 배양물은 이어서 상기 방법에 기재된 바와 같이 수행하였다. 최종적으로, 각각의 작제물을 함유하는 상등액은 성공적으로 수거하였다.
E2-Fc 융합 단백질 및 위치 64에 6B8 에피토프 돌연변이를 갖는 E2-Fc 융합 단백질의 정제는 각각 제조사(Thermo)의 단백질 A 아가로스를 사용함에 의해 수행하였다. 정제 공정은 이어서 상기 방법에 기재된 바와 같이 수행하였다. E2-Fc 융합 단백질의 정제 생성물은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다(도 7). 위치 64에 6B8 에피토프 돌연변이가 있는 E2-Fc 융합 단백질의 정제 생성물도 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였고, 이것은 E2-Fc 융합 단백질과, WH303 염색에 대해 유사한 결과 및 SDS-PAGE에 대해 유사한 결과를 보여주고, 반면 6B8 염색에서는 음성 결과를 보여준다.
실시예 5: E2 및 E2-KARD의 효능 평가
본 실시예의 목적은 3주령 새끼 돼지에서 후보 서브유닛 백신의 효능을 평가하는 것이다.
실시예 2에 표현된 바와 같이 보조제화된 C-E2 및 C-E2-KARD인 2개의 IVP(수의학 연구 제품)는 효능 평가에 적용된다.
간략하게, 총 20마리의 새끼 돼지(3주령)를 4개의 그룹(그룹 1, 2, 3 및 4)으로 할당하고, 그룹 1(C-E2) 및 그룹 2(C-E2-KARD)에 각각 5마리의 새끼 돼지를 IVP 시험을 위해 사용하였고, 그룹 3의 또 다른 5마리 새끼 돼지를 챌린지 대조군으로서 사용하였다. 그룹 4의 나머지 5마리 새끼 돼지는 엄격한(음성) 대조군으로서 사용하였다. 0일째에, 그룹 1 및 2의 동물에 새끼 돼지당 각각 2mL Seppic ISA 206 보조제화된 C-E2(54.2㎍/ml) 또는 C-E2-KARD(55.2㎍/ml)를 접종(IM)하였다. 그룹 3에는 0일째에 2mL PBS + 보조제(Seppic ISA 206)를 접종(IM)하였고, 챌린지 대조군으로서 사용하였다. 그룹 1, 2 및 3의 동물에는 21일째에 ≥ 105 MLD/mL 용량의 CSFV Shimen 균주를 접종(IM)하였다. 모든 새끼 돼지는 임상적으로 건강하였고 CSFV 및 PRRSV 항체가 없었으며 0일에 BVDV, PRV를 포함한 항원이 없었다. 모든 동물은 면역화시에 건강하였다.
직장 온도 및 임상 관찰은 D21에서 D37까지 매일 수집하였다. 혈청 샘플은 -7일부터 시작하여 7일 마다 수거하였다. 21, 24, 28, 31 및 37일째 (DPC 0, 3, 7, 10, 16)에, 전혈 샘플 및 비강 면봉 샘플을 수거하였다.
체온
도 8에 나타낸 바와 같이, 챌린지 대조군 그룹(그룹 3)의 평균 체온은 챌린지 후 급격하게 변동하였고, 돼지가 빈사 상태에 되는 경우 체온이 감소하였다. 그룹 1과 그룹 2의 체온은 챌린지 후 수일(D2-D4) 내에 보다 높이 상승하였지만, 곧 엄격한 대조군과 유사한 수준으로 떨어졌다.
백혈구 수
도 9에 나타낸 바와 같이, 챌린지 대조군 그룹의 백혈구 수는 챌린지 후 급격히 감소하였지만, 백신접종된 그룹에서 동물의 백혈구 수는 챌린지 후 약간 감소하고 이어서 상승하였다.
사망률
도 10에 나타낸 바와 같이, 새끼 돼지는 챌린지 대조군(그룹 3)에서 모두 죽었고; 다른 그룹에서는 새끼 돼지가 죽지 않았다.
임상적 관찰
임상적 관찰은 활력, 신체 긴장(뻣뻣함, 경련), 체형(신체 상태, 가늘어진 근육 조직), 호흡, 걷기, 피부, 결막의 모양, 식욕 및 배변의 평가로 이루어지고 표 8에 나타낸 바와 같다. 제로는 어떠한 임상적 징후를 나타내지 않고, 증가된 임상적 스코어는 임상적 징후의 중증도의 증가를 지적한다. 개별 동물이 3개의 연속적인 관찰 포인트와 함께 2 초과의 총 임상적 스코어를 나타내는 경우 CSF 관련 임상적 징후로 간주되어야 한다.
표 8 임상적 스코어 지침
도 11에 나타낸 바와 같이, 챌린지 대조군(그룹 3)의 평균 임상적 스코어는 챌린지 후 점점 더 상승하였고; 연구 기간 동안 그룹 1, 그룹 2 및 그룹 4의 평균 임상적 스코어는 모두 0이었다.
바이러스 단리
전혈, 비강 면봉 및 편도선 샘플에서 바이러스 단리는 당업계의 표준 방법에 의해 결정되었다. 결과는 하기의 표 9에 나타낸다. 그룹 1 및 그룹 2로부터의 모든 샘플은 모든 수거된 샘플로부터 VI (바이러스 단리) 음성이었다.
표 9
WB: 전혈; NS: 비강 면봉; *: 그룹 3의 새끼 돼지는 모두 DPC16 전에 죽었다.
혈청학적 반응
샘플의 항체 역가는 IDEXX ELISA (카탈로그 번호. 99-43220)을 사용하여 시험하였다. 도 12에서 나타낼 수 있는 바와 같이, 2개의 IVP 그룹의 항체 역가는 D21에 양성이었다(>40%).
결론
돼지는 2개의 IVP로 백신접종한 후 보호되었고, 사망률 및 이환율은 모두 0%였다. 바이러스 혈증이나 차폐는 IVP 그룹에서 검출될 수 없고, 편도선 조직도 CSFV 양성으로 발견되지 않았다. D21에 혈청은 모두 2개의 IVP 그룹에 대해 양성이었다. DIVA 돌연변이 (6B8 에피토프에서)의 도입은 효율에 어떠한 영향믈 미치지 않는다.
실시예 7: 돌연변이된 6B8 에피토프에 대한 6B8 mAb의 결합을 결정하기 위한 면역형광 검정(IFA).
6B8 mAb의 돌연변이된 6B8 에피토프 (시험 샘플)로의 결합은 하기의 단게에 따라 면역형광 검정(IFA)에 의해 결정한다:
1. 96-웰 미세역가 플레이트에 1.0 X106 SF9 세포/웰을 씨딩한 후 MOI 0.01에서 하기의 재조합 배큘로바이러스로 감염시켰고, 각각은 2중으로 수행하였다.
(i) 시험 샘플: 변형된 6B8 에피토프를 갖는 E2 단배질을 발현하는 재조합 바쿨로바이러스;
(ii) 양성 대조군: 야생형 6B8 에피토프를 갖는 E2 단백질을 발현하는 재조합 바쿨로바이러스;
(iii) 음성 대조군: 본원에 기재된 바와 같은 6B8 에피토프 내 KARD 돌연변이를 갖는 E2 단백질을 발현하는 재조합 바쿨로바이러스.
바쿨로바이러스 감염된 세포는 5일동안 약 27°C에서 항온처리기에 유지한다.
2. 배양 배지는 버리고, 세포는 1xPBS (200 내지 250μL/웰)로 1회 세정한다.
3. 냉각 메탄올/아세톤(50:50) 100μl를 웰당 첨가하고 실온에서 10분 동안 항온처리한다.
4. 정착액(fixative)은 정의된 폐기물 컨테이너에 폐기되고, 플레이트는 연기 후드에서 15-30분 동안 건조시킨다.
5. 6B8 특이적 mAb (예를 들어, 수탁 번호 CCTCC C2018120하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성돤 항체)는 5% BSA를 함유하는 PBS로 1:500 내지 1:1000로 희석함에 이어서 50μL/웰로 검정 플레이트에 첨가한다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고 37°C에서 1-2시간 동안 항온처리한다.
6. 검정 플레이트는 1x PBS (250μL/웰)로 3회 세정한다.
7. 6B8 항체(Invitrogen, cat#21202)에 특이적으로 결합하는 2차 항체인 Alexa Fluor®488 접합된 당나귀 항-마우스 항체를 5% BSA를 함유하는 PBS로 400배 희석하고, 분석 플레이트에 50μL/웰로 첨가하였다. 플레이트는 뚜껑으로 덮고 1시간동안 37°C에서 항온처리하였다.
8. 검정 플레이트는 1xPBS (250μL/웰)로 3회 세정한다. 마지막으로, 1xPBS를 100μL/웰로 첨가한다. 최종 형광성 신호는 역위 형광성 현미경으로 판독한다.
상기 IFA에서 (레플리케이트 둘다에서) 시험 샘플의 음성 결과는 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 하나 이상의 돌연변이가 이러한 돌연변이된 6B8 에피토프에 대한 6B8 모노클로날 항체의 결합의 특이적 억제를 유도함을 지적한다.
실시예 8: 돌연변이된 6B8 에피토프에 대한 6B8 mAb의 결합을 결정하기 위한 도트 블롯 검정.
돌연변이된 6B8 에피토프(시험 샘플)에 대한 6B8 mAb의 결합은 다음 단계에 따라 도트 블롯 검정에 의해 결정된다.
1. PBS에 희석된 각각의 정제된 단백질 1-5ug을 NC 막(Pall, cat#66485)에 스팟팅하고 연기 후드에서 30분 이상 공기 건조시켰다.
(i) 시험 샘플: 변형된 6B8 에피토프를 갖는 E2 단배질을 발현하는 재조합 바쿨로바이러스;
(ii) 양성 대조군: 야생형 6B8 에피토프를 갖는 E2 단백질을 발현하는 재조합 바쿨로바이러스;
2. 막은 RT에서 1시간 동안 차단 용액(PBST 중 5% 탈지유)으로 차단한다.
3. 6B8 특이적 mAb (예를 들어, 수탁 번호 CCTCC C2018120하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성돤 항체)는 5% 탈지유를 함유하는 PBS로 1:800 내지 1:1000으로 희석함에 이어서 10ml/막으로 각각의 도트 막에 첨가한다. 막은 뚜껑으로 밀봉시키고 37°C에서 1-2시간 동안 항온처리한다.
4. 1차 항체는 버리고 각각의 막을 3회 동안 3*PBST로 세척한다.
5. 6B8 항체에 특이적으로 결합하는 2차 항체인 HRP-접합된 항-마우스 항체(Bio-Rad, STAR117P)를 5% 탈지유가 함유된 PBST로 2000배 희석하여 각각의 도트 막에 10ml/막으로 첨가한다. 막은 뚜껑으로 밀봉시키고 1시간동안 37°C에서 항온처리한다.
6. 2차 항체는 버리고 각각의 막을 3회 동안 3*PBST로 세척한다.
7 각각의 막의 블롯 신호는 실온에서 1-5mL 슈퍼 신호 키트 (Thermo, cat#34080)로 발생시킨다.
8. 발생 시간은 1-10s이고, chemdoc (Bio-Rad)으로 사진을 촬영한다.
상기 도트 블롯에서 시험 샘플의 음성 결과는 E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 하나 이상의 돌연변이가 이러한 돌연변이된 6B8 에피토프에 대한 6B8 모노클로날 항체의 결합의 특이적 억제를 유도함을 지적한다.
실시예 9: CHO 시스템 및 바쿨로바이러스 시스템에서 E2 단백질의 발현 비교
QZ07-E2는 코돈 최적화하였고(OptimumGeneTM 알고리즘을 사용하여) (QZ07-E2의 코돈 최적화된 서열은 서열번호 82에 나타낸다) 발현 시스템 (ExpiCHO™ 발현 시스템, Gibico, Cat# A29133)을 발현하는 CHO 세포에 따라 합성하였다. 가용성 및 분비형 E2 단백질을 수득하기 위해 최종 최적화된 서열에서 E2의 마지막 43개 아미노산(aa)을 결실시키고 E1 단백질의 마지막 21개 aa를 신호 펩타이드로서 추가하였다. 합성된 서열은 pcDNA3.4 플라스미드에 클로닝하였다.
ExpiCHO-S™ 세포(Gibico, Cat# A29127, 이는 CHO-S 세포주의 클론 유도체임)를 ExpiCHO™ 발현 배지(Gibico, Cat# A2910001)에서 고밀도 현탁 배양에 적응시켰다. 재조합 pcDNA3.4 플라스미드의 형질감염은 ExpiFectamine™ CHO 형질감염 키트 (Gibico, Cat# A29129)의 지침에 따라 수행하였다. 발현은 ExpiCHO™ 공급(고역가) 방법을 사용하여 ExpiCHO™ 발현 시스템(개장판 D.0, May 25, 2018, Thermo Fisher Scientific Inc)의 사용자 가이드에 따라 수행하였다.
구체적으로, ExpiCHO-S™ 세포는 37°C로 예비 가온된 새로운 ExpiCHO 발현 배지가 있는 플라스크에서 6×106 생존 세포/ml의 최종 밀도로 접종하였다. 플라스크를 부드럽게 와동시켜 세포를 혼합하였다. 플라스미드 DNA는 냉각 OptiPRO 배지로 희석시키고 ExpiCHO 펙타민 CHO 시약은 냉각 OptiPRO 배지로 희석시켰다. 이어서 상기 2개를 함께 혼합하고 ExpiFectamine CHO 시약/플라스미드 DNA 복합체를 실온에서 2분 동안 항온처리하였다. 그 후, 용액을 첨가하는 동안 플라스크를 와동시키면서 진탕 플라스크로 천천히 이동시켰다. 형질감염 후 다음날 ExpiFectamine CHO 인핸서 및 ExpiCHO 공급물을 첨가하는 동안 플라스크를 부드럽게 와동시키면서 첨가하였다. 플라스크를 회전 진탕기(125 ± 5 rpm)상에서 공기 중 5% CO2의 습화된 대기와 함께 32°C 항온처리기에 위치시켰다. 상등액 및 세포는 원심분리에 의해 분리하고 형질감염 후 D4-D10에 수거하였다.
BEVS (바쿨로바이러스발현 벡터 시스템, 상기 참조)에서의 발현과 비교하여 CHO 세포에서 QZ07-E2의 발현 결과는 도 13에 나타낸다. CHO 발현 시스템에서 E2의 수율은 BEVS 시스템(약 10㎍/ml)과 비교하여 보다 높다(약 1mg/ml).
CHO 세포에서 및 BEVS에서 발현되는 E2 단백질의 효능을 시험하였다. 구체적으로, 50 μg의 비-정제된 CHO-발현된 E2 및 50 μg의 정제된 BEVS-발현된 E2는 돼지(n=10마리의 돼지/그룹 당)에게 1회 투여 (IM)하였다. 백신접종 후 21일째에 혈청 중 CSF 항체를 시험하였다. 결과는 도 14에 도시되어 있다. E2 발현 CHO가 돼지에서 이의 면역원성을 유지함을 알 수 있다.
실시예 10: E2 단백질에서 6B8 결합을 위한 추가의 중요한 잔기의 동정
본 실시예에서, E2의 아미노산 위치 10, 41 및 64는 6B8 mAb 결합에 대한 추가적인 중요한 잔기로서 동정되었다.
Y10A, Y10P, D41A, D41N, D41E, R64A, R64S 또는 R64E(각각 서열번호 74-81에 나타낸 아미노산 서열; 각각 서열번호 83-90에 나타낸 코돈 최적화 암호화 서열)를 포함하는 돌연변이체 QZ07-E2 단백질 각각을 CHO 세포에서 발현시키고(이전 실시예에 기재된 방법에 따라) IFA(면역 형광 검정) 시험(이전 실시예에 기재된 방법에 따름)에 적용하였다 상기 결과는 도 15에 나타낸다. 치환 Y10A, Y10P, D41A, D41N, D41E, R64A, R64S, 및 R64E는 각각 6B8 mAb 결합을 억제할 수 있고, 이는 이들 돌연변이가 또한 DIVA에 사용될 수 있음을 지적한다.
Y10A, Y10P, D41A, D41N, D41E, R64A, R64S, 또는 R64E를 함유하는 돌연변이체 QZ07-E2 단백질의 발현은 웨스턴 블롯팅에 의해 검출하였다. 상기 결과는 도 16에 나타낸다. 돌연변이 R64A 및 R64S는 CHO 세포 시스템에서 단백질 발현 분비에 단지 약간 영향을 미쳤다. 잔기 64 상의 추가의 돌연변이는 따라서 발현 및 효능 평가를 위해 KARD와 조합된다.
실시예 11: E2 단백질에서 6B8 결합을 억제하기 위한을 위한 추가의 중요한 아미노산의 동정
본 실시예에서, E2의 아미노산 위치 22, 24, 25 및 64에서 보다 많은 돌연변이가 6B8 mAb 결합을 억제하기 위해 추가로 중요한 것으로서 동정되었다.
각각 위치 22, 24, 25 및 64에 다양한 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 QZ07-E2 단백질을 CHO 세포에서 발현시키고(이전 실시예에 기재된 방법에 따름) IFA(면역 형광 검정) 시험(이전 실시예에 기재된 방법에 따름)에 적용하였다. 위치 22, 24, 25 및 64에 각각 다양한 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 QZ07-E2 단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅에 의해 검출하였다. 돌연변이체 QZ07-E2-Fc-R64D, 돌연변이체 QZ07-E2-Fc-R64H, 돌연변이체 QZ07-E2-Fc-R64T, 돌연변이체 QZ07-E2-Fc-R64G, 및 돌연변이체 QZ07-E2-Fc-R64K를 포함하는 일부 돌연변이체는 단백질 발현을 증진시키기 위해 돌연변이체 E2의 C 말단을 Fc 단편에 추가로 연결시킴에 의해 제조하였다. 돌연변이체 QZ07-E2-Fc 단백질을 제조하는 방법은 상기 실시예에 참조될 수 있다. 결과는 도 17-20에 나타낸다.
아미노산 위치 22의 경우, G22A, G22Q, G22D, G22E, G22N 및 G22S는 mAb 6B8과의 수율 및 반응성 둘다의 측면에서 후보 치환일 수 있다.
아미노산 위치 24의 경우, G24R은 여전히 mAb 6B8과 약한 반응성을 갖는다. G24D 및 G24I 돌연변이체는 mAb 6B8과 반응할 수 없지만, 수율은 낮다.
아미노산 위치 25의 경우, G25D, G25K, G25L, G25N, G25R, G25T 및 G25V는 mAb 6B8과의 수율 및 반응성 둘다의 측면에서 후보 치환일 수 있다.
아미노산 위치 26의 경우, R64A, R64K, 및 R64W는 mAb 6B8과의 수율 및 반응성의 측면에서 후보 돌연변이체이다.
실시예 12: 돌연변이체 E2 단백질의 효능 평가
위치 10, 14, 22, 24, 24/25, 41 또는 64에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 E2 단백질은 이전 실시예에서 사용된 방법에 따라 CHO 세포에서 발현된다. 간략하게, 돌연변이체 E2 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 서열은 pcDNA3.4 벡터에 클로닝하고; 수득된 작제물을 각각 ExpiCHO™ 발현 배지(Gibico, Cat# A2910001)에서 고밀도 현탁 배양에 적응된 ExpiCHO-S™ 세포(Gibico, Cat# A29127)로 형질감염시키고; 형질감염 후 약 2-14일에 단백질을 수거한다.
발현된 돌연변이체 E2 단백질의 효능은 이전 실시예에 기재된 방법에 따라 평가된다. 간략하게, 새끼 돼지(3주령)를 다양한 IVP 시험 그룹(시험할 돌연변이체 E2 단백질에 따라), 챌린지 대조군 및 엄격한(음성) 대조군으로 할당한다. 0일째에, IVP 시험 그룹 내 동물에 각각 2mL의 보조제화된(Seppic ISA 206) 돌연변이체 E2 단백질(약 50㎍/ml)을 접종(IM)한다. 챌린지 대조군의 동물을 0일에 PBS + 보조제(Seppic ISA 206)로 접종(IM)한다. IVP 시험 그룹의 동물에는 21일째에 ≥ 105 MLD/mL 용량의 CSFV Shimen 균주를 접종(IM)하였다. 직장 온도 및 임상 관찰은 D21에서 D37까지 매일 수집한다. 혈청 샘플은 -7일 부터 개시하여 7일 마다 수거한다. 21, 24, 28, 31 및 37일(DPC 0, 3, 7, 10, 16)에, 모든 동물의 전혈 샘플 및 비강 면봉 샘플을 수거한다. 표 8에 열거된 바와 같은 체온, 백혈구 수, 사망률, 임상적 스코어, 및 바이러스 단리 및 혈청학적 반응은 효능 평가를 위해 분석한다.
CHO 세포에서의 발현 및 6B8 에피토프 내 추가의 돌연변이(들)의 도입은 효능에 어떠한 부작용의 영향을 갖지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Boehringer Ingelheim Vetmedica (China) Co. Ltd. <120> Recombinant classical swine fever virus E2 protein <130> P20216217 <160> 97 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 Ser Phe Gly Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Phe Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Met Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 Gly Asp Leu Pro Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 Lys Ala Ser Gln Ala Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 His Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val 115 120 125 Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro 130 135 140 Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Lys Arg Glu Lys Pro 145 150 155 160 Phe Pro His Arg Val Gly Cys Val Thr Thr Val Val Glu Lys Glu Asp 165 170 175 Leu Phe Tyr Cys Lys Trp Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Asn 180 185 190 Pro Val Thr Tyr Met Gly Gly Gln Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys Gly 195 200 205 Phe Asp Phe Lys Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys 210 215 220 Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Val Val Asp Ser Thr Asp 225 230 235 240 Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly Glu His Glu Cys 245 250 255 Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Leu Asp Gly Arg Leu 260 265 270 Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro 275 280 285 Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Arg Asn 290 295 300 Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys 305 310 315 320 Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp 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accgagggcg agcacgagtg cctgatcggc 840 aatacaacag tgaaggtgca cgccctggat ggcaggctgg gacccatgcc atgtcggcct 900 aaggagatcg tgtcctctgc tggcccagtg agaaagacct cttgtacctt caattataca 960 aagaccctga gaaacaagta ttacgagcca cgggactctt atttccagca gtatatgctg 1020 aagggggagt atcagtattg gtttgacctg gat 1053 <210> 85 <211> 1053 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> codon-optimized QZ07-E2-D41A <400> 85 attctgaggg ggcaggtcgt ccagggcatt atttggctgc tgctggtcac aggggcacag 60 gggagactga gttgtaaaga ggattatcgc tatgctatct ccagcaccaa cgagatcggc 120 cctctgggcg ccgagggcct gaccacaaca tggaaggagt acaatcacgg cctgcaactg 180 gacgccggca ccgtgagggc tatctgtacc gctggctcct ttaaggtaat cgctctgaac 240 gtggtgtctc ggaggtatct ggcttccctg cataagagag ccctgccaac atctgtgacc 300 ttcgagctgc tgttcgatgg cacctcccct gccatcgagg agatgggcga cgattttggc 360 ttcggcctgt gccccttcga caccacacca gtggtgaagg gcaagtataa caccacactg 420 ctgaatggct ccgctttcta cctggtgtgc cctatcggct ggacaggcgt gatcgagtgt 480 acagccgtgt ctccaaccac actgagaacc gaggtggtga aaaccttcaa gagggagaag 540 ccatttcccc atagggtggg ctgcgtgacc acagtggtgg agaaggagga tctgttctac 600 tgcaagtggg gcggcaattg gacctgcgtg aagggcaatc ctgtgaccta catgggcggc 660 caggtgaagc agtgtcggtg gtgcggcttc gactttaagg agcctgatgg cctgccacac 720 taccccatcg gcaagtgcat cctggccaat gagacaggct atagagtggt ggattccaca 780 gactgcaata gagacggcgt ggtaatctct accgagggcg agcacgagtg cctgatcggc 840 aatacaacag tgaaggtgca cgccctggat ggcaggctgg gacccatgcc atgtcggcct 900 aaggagatcg tgtcctctgc tggcccagtg agaaagacct cttgtacctt caattataca 960 aagaccctga gaaacaagta ttacgagcca cgggactctt atttccagca gtatatgctg 1020 aagggggagt atcagtattg gtttgacctg gat 1053 <210> 86 <211> 1053 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> codon-optimized QZ07-E2-D41N <400> 86 attctgaggg ggcaggtcgt ccagggcatt atttggctgc tgctggtcac aggggcacag 60 gggagactga gttgtaaaga ggattatcgc tatgctatct ccagcaccaa cgagatcggc 120 cctctgggcg ccgagggcct gaccacaaca tggaaggagt acaatcacgg cctgcaactg 180 gacaacggca ccgtgagggc tatctgtacc gctggctcct ttaaggtaat cgctctgaac 240 gtggtgtctc ggaggtatct ggcttccctg cataagagag ccctgccaac atctgtgacc 300 ttcgagctgc tgttcgatgg cacctcccct gccatcgagg agatgggcga cgattttggc 360 ttcggcctgt gccccttcga caccacacca gtggtgaagg gcaagtataa caccacactg 420 ctgaatggct ccgctttcta cctggtgtgc cctatcggct ggacaggcgt gatcgagtgt 480 acagccgtgt ctccaaccac actgagaacc gaggtggtga aaaccttcaa gagggagaag 540 ccatttcccc atagggtggg ctgcgtgacc acagtggtgg agaaggagga tctgttctac 600 tgcaagtggg gcggcaattg gacctgcgtg aagggcaatc ctgtgaccta catgggcggc 660 caggtgaagc agtgtcggtg gtgcggcttc gactttaagg agcctgatgg cctgccacac 720 taccccatcg gcaagtgcat cctggccaat gagacaggct atagagtggt ggattccaca 780 gactgcaata gagacggcgt ggtaatctct accgagggcg agcacgagtg cctgatcggc 840 aatacaacag tgaaggtgca cgccctggat ggcaggctgg gacccatgcc atgtcggcct 900 aaggagatcg tgtcctctgc tggcccagtg agaaagacct cttgtacctt caattataca 960 aagaccctga gaaacaagta ttacgagcca cgggactctt atttccagca gtatatgctg 1020 aagggggagt atcagtattg gtttgacctg gat 1053 <210> 87 <211> 1053 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> codon-optimized QZ07-E2-D41E <400> 87 attctgaggg ggcaggtcgt ccagggcatt atttggctgc tgctggtcac aggggcacag 60 gggagactga gttgtaaaga ggattatcgc tatgctatct ccagcaccaa cgagatcggc 120 cctctgggcg ccgagggcct gaccacaaca tggaaggagt acaatcacgg cctgcaactg 180 gacgagggca ccgtgagggc tatctgtacc gctggctcct ttaaggtaat cgctctgaac 240 gtggtgtctc ggaggtatct ggcttccctg cataagagag ccctgccaac atctgtgacc 300 ttcgagctgc tgttcgatgg cacctcccct gccatcgagg agatgggcga cgattttggc 360 ttcggcctgt gccccttcga caccacacca gtggtgaagg gcaagtataa caccacactg 420 ctgaatggct ccgctttcta cctggtgtgc cctatcggct ggacaggcgt gatcgagtgt 480 acagccgtgt ctccaaccac actgagaacc gaggtggtga aaaccttcaa gagggagaag 540 ccatttcccc atagggtggg ctgcgtgacc acagtggtgg agaaggagga tctgttctac 600 tgcaagtggg gcggcaattg gacctgcgtg aagggcaatc ctgtgaccta catgggcggc 660 caggtgaagc agtgtcggtg gtgcggcttc gactttaagg agcctgatgg cctgccacac 720 taccccatcg gcaagtgcat cctggccaat gagacaggct atagagtggt ggattccaca 780 gactgcaata gagacggcgt ggtaatctct accgagggcg agcacgagtg cctgatcggc 840 aatacaacag tgaaggtgca cgccctggat ggcaggctgg gacccatgcc atgtcggcct 900 aaggagatcg tgtcctctgc tggcccagtg agaaagacct cttgtacctt caattataca 960 aagaccctga gaaacaagta ttacgagcca cgggactctt atttccagca gtatatgctg 1020 aagggggagt atcagtattg gtttgacctg gat 1053 <210> 88 <211> 1053 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> codon-optimized QZ07-E2-R64A <400> 88 attctgaggg ggcaggtcgt ccagggcatt atttggctgc tgctggtcac aggggcacag 60 gggagactga gttgtaaaga ggattatcgc tatgctatct ccagcaccaa cgagatcggc 120 cctctgggcg ccgagggcct gaccacaaca tggaaggagt acaatcacgg cctgcaactg 180 gacgatggca ccgtgagggc tatctgtacc gctggctcct ttaaggtaat cgctctgaac 240 gtggtgtctc gggcctatct ggcttccctg cataagagag ccctgccaac atctgtgacc 300 ttcgagctgc tgttcgatgg cacctcccct gccatcgagg agatgggcga cgattttggc 360 ttcggcctgt gccccttcga caccacacca gtggtgaagg gcaagtataa caccacactg 420 ctgaatggct ccgctttcta cctggtgtgc cctatcggct ggacaggcgt gatcgagtgt 480 acagccgtgt ctccaaccac actgagaacc gaggtggtga aaaccttcaa gagggagaag 540 ccatttcccc atagggtggg ctgcgtgacc acagtggtgg agaaggagga tctgttctac 600 tgcaagtggg gcggcaattg gacctgcgtg aagggcaatc ctgtgaccta catgggcggc 660 caggtgaagc agtgtcggtg gtgcggcttc gactttaagg agcctgatgg cctgccacac 720 taccccatcg gcaagtgcat cctggccaat gagacaggct atagagtggt ggattccaca 780 gactgcaata gagacggcgt ggtaatctct accgagggcg agcacgagtg cctgatcggc 840 aatacaacag tgaaggtgca cgccctggat ggcaggctgg gacccatgcc atgtcggcct 900 aaggagatcg tgtcctctgc tggcccagtg agaaagacct cttgtacctt caattataca 960 aagaccctga gaaacaagta ttacgagcca cgggactctt atttccagca gtatatgctg 1020 aagggggagt atcagtattg gtttgacctg gat 1053 <210> 89 <211> 1053 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> codon-optimized QZ07-E2-R64S <400> 89 attctgaggg ggcaggtcgt ccagggcatt atttggctgc tgctggtcac aggggcacag 60 gggagactga gttgtaaaga ggattatcgc tatgctatct ccagcaccaa cgagatcggc 120 cctctgggcg ccgagggcct gaccacaaca tggaaggagt acaatcacgg cctgcaactg 180 gacgatggca ccgtgagggc tatctgtacc gctggctcct ttaaggtaat cgctctgaac 240 gtggtgtctc ggtcctatct ggcttccctg cataagagag ccctgccaac atctgtgacc 300 ttcgagctgc tgttcgatgg cacctcccct gccatcgagg agatgggcga cgattttggc 360 ttcggcctgt gccccttcga caccacacca gtggtgaagg gcaagtataa caccacactg 420 ctgaatggct ccgctttcta cctggtgtgc cctatcggct ggacaggcgt gatcgagtgt 480 acagccgtgt ctccaaccac actgagaacc gaggtggtga aaaccttcaa gagggagaag 540 ccatttcccc atagggtggg ctgcgtgacc acagtggtgg agaaggagga tctgttctac 600 tgcaagtggg gcggcaattg gacctgcgtg aagggcaatc ctgtgaccta catgggcggc 660 caggtgaagc agtgtcggtg gtgcggcttc gactttaagg agcctgatgg cctgccacac 720 taccccatcg gcaagtgcat cctggccaat gagacaggct atagagtggt ggattccaca 780 gactgcaata gagacggcgt ggtaatctct accgagggcg agcacgagtg cctgatcggc 840 aatacaacag tgaaggtgca cgccctggat ggcaggctgg gacccatgcc atgtcggcct 900 aaggagatcg tgtcctctgc tggcccagtg agaaagacct cttgtacctt caattataca 960 aagaccctga gaaacaagta ttacgagcca cgggactctt atttccagca gtatatgctg 1020 aagggggagt atcagtattg gtttgacctg gat 1053 <210> 90 <211> 1053 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> codon-optimized QZ07-E2-R64E <400> 90 attctgaggg ggcaggtcgt ccagggcatt atttggctgc tgctggtcac aggggcacag 60 gggagactga gttgtaaaga ggattatcgc tatgctatct ccagcaccaa cgagatcggc 120 cctctgggcg ccgagggcct gaccacaaca tggaaggagt acaatcacgg cctgcaactg 180 gacgatggca ccgtgagggc tatctgtacc gctggctcct ttaaggtaat cgctctgaac 240 gtggtgtctc gggagtatct ggcttccctg cataagagag ccctgccaac atctgtgacc 300 ttcgagctgc tgttcgatgg cacctcccct gccatcgagg agatgggcga cgattttggc 360 ttcggcctgt gccccttcga caccacacca gtggtgaagg gcaagtataa caccacactg 420 ctgaatggct ccgctttcta cctggtgtgc cctatcggct ggacaggcgt gatcgagtgt 480 acagccgtgt ctccaaccac actgagaacc gaggtggtga aaaccttcaa gagggagaag 540 ccatttcccc atagggtggg ctgcgtgacc acagtggtgg agaaggagga tctgttctac 600 tgcaagtggg gcggcaattg gacctgcgtg aagggcaatc ctgtgaccta catgggcggc 660 caggtgaagc agtgtcggtg gtgcggcttc gactttaagg agcctgatgg cctgccacac 720 taccccatcg gcaagtgcat cctggccaat gagacaggct atagagtggt ggattccaca 780 gactgcaata gagacggcgt ggtaatctct accgagggcg agcacgagtg cctgatcggc 840 aatacaacag tgaaggtgca cgccctggat ggcaggctgg gacccatgcc atgtcggcct 900 aaggagatcg tgtcctctgc tggcccagtg agaaagacct cttgtacctt caattataca 960 aagaccctga gaaacaagta ttacgagcca cgggactctt atttccagca gtatatgctg 1020 aagggggagt atcagtattg gtttgacctg gat 1053 <210> 91 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> linker <400> 91 Gly Gly Ser 1 <210> 92 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> linker <400> 92 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 93 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> linker <400> 93 Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 94 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> linker <400> 94 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 95 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fc amino acid sequence <400> 95 Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Ser Pro 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 35 40 45 Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser 130 135 140 Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu 145 150 155 160 Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe 180 185 190 Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser 210 215 220 Lys Thr Pro Gly Lys 225 <210> 96 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Fc encoding sequence <400> 96 accaaaacta aaccaccctg ccctatctgc cctgcctgcg agtctcccgg accttcagtc 60 ttcattttcc cccctaagcc caaggacacc ctgatgatca gcagaacccc tcaggtgaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggagaac cctgaggtgc agttcagctg gtacgtggat 180 ggcgtggagg tgcacaccgc ccagacaaga ccaaaggagg agcagtttaa cagcacatat 240 cgcgtggtgt ctgtgctgcc catccagcat caggactggc tgaatggcaa ggagttcaag 300 tgcaaggtga acaataagga tctgccagcc cccatcacca ggatcatctc taaggctaag 360 ggccagaccc gggagccaca ggtgtacaca ctgccaccac acgctgagga gctgtcccgc 420 agcaaggtgt ccatcacatg tctggtcatc ggcttttacc ctccagacat cgatgtggag 480 tggcagagga acggccagcc tgagccagag ggcaattatc ggaccacacc ccctcagcag 540 gacgtggatg gcacctactt cctgtattct aagttttccg tggataaggc ctcttggcag 600 ggcggcggca tcttccagtg tgctgtgatg cacgaagcac tgcacaacca ttacactcag 660 aaaagtatct ctaagacccc aggaaaa 687 <210> 97 <211> 584 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> QZ07-E2-Fc-WT with signal peptide <400> 97 Met Ile Leu Arg Gly Gln Val Val Gln Gly Ile Ile Trp Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Thr Gly Ala Gln Gly Arg Leu Ser Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Glu Gly Leu 35 40 45 Thr Thr Thr Trp Lys Glu Tyr Asn His Gly Leu Gln Leu Asp Asp Gly 50 55 60 Thr Val Arg Ala Ile Cys Thr Ala Gly Ser Phe Lys Val Ile Ala Leu 65 70 75 80 Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Arg Ala Leu 85 90 95 Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Ser Pro Ala 100 105 110 Ile Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp 115 120 125 Thr Thr Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly 130 135 140 Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu 145 150 155 160 Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr 165 170 175 Phe Lys Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Val Gly Cys Val Thr Thr 180 185 190 Val Val Glu Lys Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Trp Gly Gly Asn Trp 195 200 205 Thr Cys Val Lys Gly Asn Pro Val Thr Tyr Met Gly Gly Gln Val Lys 210 215 220 Gln Cys Arg Trp Cys Gly Phe Asp Phe Lys Glu Pro Asp Gly Leu Pro 225 230 235 240 His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg 245 250 255 Val Val Asp Ser Thr Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr 260 265 270 Glu Gly Glu His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His 275 280 285 Ala Leu Asp Gly Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile 290 295 300 Val Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr 305 310 315 320 Thr Lys Thr Leu Arg Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe 325 330 335 Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp 340 345 350 Gly Gly Ser Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys 355 360 365 Glu Ser Pro Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 370 375 380 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp 385 390 395 400 Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly 405 410 415 Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn 420 425 430 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp 435 440 445 Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro 450 455 460 Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu 465 470 475 480 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser 485 490 495 Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile 500 505 510 Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr 515 520 525 Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr 530 535 540 Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe 545 550 555 560 Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 565 570 575 Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys 580

Claims (35)

  1. 6B8 에피토프 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 재조합 CSFV(고전적 돼지 열 바이러스(classical swine fever virus)) E2 단백질로서, 여기서 변형되지 않은 6B8 에피토프가 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  2. 제1항에 있어서, E2 단백질의 6B8 에피토프 내의 적어도 하나의 돌연변이가 이러한 돌연변이된 6B8 에피토프에 대한 6B8 모노클로날 항체의 결합의 특이적 억제를 유도하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 6B8 모노클로날 항체
    (i)가 수탁번호 CCTCC C2018120하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되거나,
    (ii)가 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나,
    (iii)가 수탁 번호 CCTCC C2018120하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체의 CDR을 포함하거나,
    (iv)가 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 E2 단백질의 위치 14, 위치 22, 위치 24, 위치 24/25, 위치 10, 위치 41 및/또는 위치 64에서 아미노산 잔기에 의해 정의되는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 6B8 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 E2 단백질의 6B8 에피토프가 적어도 E2 단백질의 아미노산 잔기 S14, G22, E24, E24/G25, Y10, D41 및/또는 R64에 의해 정의되거나, 적어도 E2 단백질의 아미노산 잔기 S14, G22, G24, G24/G25, Y10, D41 및/또는 R64에 의해 정의되는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, E2 단백질의 아미노산 위치 24에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 24/25에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 14에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 10에서의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서의 치환을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, E2 단백질의 위치 24에 있는 아미노산이 R, D 또는 I로 치환되고, R이 바람직하고, E2 단백질의 위치 24 및 25에 있는 아미노산이 R, D 또는 I로 치환되고, R이 바람직하고, D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로 치환되고, D, K, L, N, R, T 및 V가 각각 바람직하며, E2 단백질의 위치 14에 있는 아미노산이 K, Q 또는 R로 치환되고, E2 단백질의 위치 22에 있는 아미노산이 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로 치환되고, A, Q, D, E, N 및 S가 바람직하고, E2 단백질의 위치 10에 있는 아미노산이 A 또는 P로 치환되고, E2 단백질의 위치 41에 있는 아미노산이 A, N 또는 E로 치환되고/되거나 E2 단백질의 위치 64에 있는 아미노산이 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로 치환되고, A, K 및 W가 바람직한, 재조합 CSFV E2 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, E2 단백질의 아미노산 위치 24에서 E 또는 G의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 24에서 E 또는 G의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함) 및 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K, 및 W가 바람직함)을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 CSFV E2 단백질이 C-균주 또는 필드 균주 QZ07 또는 GD18로부터 유래하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 CSFV E2 단백질이 필드 균주 QZ07로부터 유래하고, E2 단백질 아미노산 위치 24에서 E의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), 또는 E2 단백질의 아미노산 위치 24에서 E의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함) 및 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함)을 포함하고, 임의로 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, 또는 E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K, 및 W가 바람직함)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 CSFV E2 단백질이 필드 균주 GD18로부터 유래하고, E2 단백질 아미노산 위치 24에서 E의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), 또는 E2 단백질의 아미노산 위치 24에서 E의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함) 및 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함)을 포함하고, 임의로 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K, Q 또는 R로의 치환, 또는 E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K, 및 W가 바람직함)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 치환을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 CSFV E2 단백질이 C-균주로부터 유래하고, E2 단백질 아미노산 위치 24에서 G의 R, D 또는 I로의 치환(R이 바람직함), 및 E2 단백질의 아미노산 위치 25에서 G의 D, K, L, N, R, T, V, E 또는 P로의 치환(D, K, L, N, R, T 및 V가 바람직함)을 포함하고, 임의로 추가로 E2 단백질의 아미노산 위치 14에서 S의 K로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 22에서 G의 A, R, Q, E, D, N, K, L, P, T, V 또는 S로의 치환(A, Q, D, E, N 및 S가 바람직함), E2 단백질의 아미노산 위치 10에서 Y의 A 또는 P로의 치환, E2 단백질의 아미노산 위치 41에서 D의 A, N 또는 E로의 치환, 및/또는 E2 단백질의 아미노산 위치 64에서 R의 A, S, E, D, G, H, T, L, P, K 또는 W로의 치환(A, K, 및 W가 바람직함)을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 CSFV E2 단백질이 서열번호 15-20, 22-33, 35-40, 49-72 및 74-81로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 하나를 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지(swine) Fc 단편과 같은 Fc 단편이 재조합 CSFV E2 단백질에 연결되고; 바람직하게는 돼지 Fc 단편과 같은 Fc 단편이 바람직하게는 펩타이드 링커를 통해 E2 단백질의 C 말단에 연결되는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 암호화하는 재조합 핵산.
  16. 제15항의 핵산을 포함하는 벡터.
  17. 제15항의 핵산 또는 제16항의 벡터를 포함하고, CHO 세포와 같은 포유동물 세포인, 숙주 세포.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 제조하기 위한 방법으로서,
    (i) CSFV E2 단백질의 발현을 위해 적합한 조건하에서 제16항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    (ii) CSFV E2 단백질을 단리하고 임의로 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 재조합 E2 단백질을 포함하는 재조합 CSFV(고전적 돼지 열 바이러스).
  20. 제19항에 있어서, 상기 재조합 CSFV가 약독화된, 재조합 CSFV.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 CSFV E2 단백질, 제15항에 따른 재조합 핵산, 제16항에 따른 벡터 및/또는 제19항 또는 제20항의 재조합 CSFV를 포함하는 면역원성 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 백신, 예를 들어, 마커 백신 또는 DIVA(감염된 동물과 백신접종된 동물간의 구별) 백신인, 면역원성 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하는 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 방법이 제21항 또는 제22항에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물.
  24. 동물에서 CSFV와 관련된 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 제21항 또는 제22항에 따른 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제21항 또는 제22항의 면역원성 조성물로 백신접종된 동물과 CSF로 감염된 동물을 구별하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는, 방법:
    a) 샘플을 수득하는 단계 및
    b) 면역 시험에서 상기 샘플을 시험하는 단계.
  26. 제25항에 있어서, 상기 면역 시험이 CSFV E2 단백질 또는 이의 항원 결합 단편의 6B8 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체가 샘플에서 CSFV E2 단백질에 결합할 수 있는지의 여부를 시험함을 포함하는, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 면역 시험이 CSFV E2 단백질의 6B8 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체가 샘플에 존재하는지의 여부를 시험하고/하거나 재조합 CSFV E2 단백질의 돌연변이된 6B8 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체가 샘플에 존재하는지의 여부를 시험하는 것을 포함하는, 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 시험이 EIA(효소 면역검정) 또는 ELISA (효소 결합 면역흡착 검정), 바람직하게 이중 경쟁 ELISA인, 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 6B8 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체
    (i)가 수탁번호 CCTCC C2018120하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되거나,
    (ii)가 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나,
    (iii)가 수탁 번호 CCTCC C2018120하에 CCTCC에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체의 CDR을 포함하거나,
    (iv)가 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, 재조합 CSFV E2 단백질.
  30. CSFV E2 단백질 또는 이의 항원 결합 단편의 6B8 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체를 포함하는, 제21항 또는 제22항의 면역원성 조성물로 백신접종된 동물과 CSFV로 감염된 동물을 구별하기 위한 키트.
  31. 재조합 CSFV E2 단백질, 바람직하게 표 1 내지 7에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 CSFV E2 단백질 또는 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 CHO 세포에서 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는, 방법:
    a) CHO 세포를 배지에서 고밀도 현탁액 배양에 적응시키는 단계;
    b) 재조합 CSFV E2 단백질, 바람직하게는 표 1 내지 7에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 CSFV E2 단백질 또는 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 단계 a)로부터의 적응된 CHO 세포를 형질감염시키는 단계,
    c) 재조합 CSFV E2 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 단계 b)로부터 형질감염된 CHO 세포를 배양하는 단계;
    d) 재조합 CSFV E2 단백질을 수거하고 임의로 정제하는 단계.
  32. 재조합 CSFV E2 단백질, 바람직하게 표 1 내지 7에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 CSFV E2 단백질 또는 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 CHO 세포에서 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는, 방법:
    a) 배지에서 고밀도 현탁액 배양에 적응된 CHO 세포를 성장시키는 단계;
    b) 재조합 CSFV E2 단백질, 바람직하게는 표 1 내지 7에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 CSFV E2 단백질 또는 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 CSFV E2 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 단계 a)로부터의 CHO 세포를 형질감염시키는 단계,
    c) 재조합 CSFV E2 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 단계 b)로부터 형질감염된 CHO 세포를 배양하는 단계;
    d) 재조합 CSFV E2 단백질을 수거하고 임의로 정제하는 단계.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 단계 c)에서, 상기 형질감염된 CHO 세포가 약 32-37℃, 바람직하게는 약 32℃에서 배양되는, 방법.
  34. 제31항 또는 제32항에 있어서, 단계 c)에서, 상기 형질감염된 CHO 세포가 약 5-8% CO2의 습화된 대기와 함께 배양되는, 방법.
  35. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 CSFV E2 단백질이 형질감염 후 약 2-14일, 예를 들어 형질감염 후 약 4-12일 또는 형질감염 후 약 8-10일에 수거되는, 방법.
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