KR101270870B1 - 고체상 올리고사카리드 태깅: 고정화 탄수화물의 조작 기법 - Google Patents

고체상 올리고사카리드 태깅: 고정화 탄수화물의 조작 기법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유도체화에 의해 고정화된 탄수화물 조작 방법에 관한 것이다. 유도체와의 성질에 따라, 탄수화물은 더욱 쉽게 검출되고/되거나 확인 또는 취급될 수 있다. 특히, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 반응성 당 제조 방법에 관한 것이다: i) 환원 당을 포함하는 시료를 제공함, ii) -NH2 기를 포함하는 포착기를 포함하는 링커에 공유 결합된 고체 지지체를 제공함 (여기서 상기 링커는 스페이서를 통해 고체 지지체에 부착된다), iii) 상기 환원 당을 상기 -NH2 당과 반응시켜 고정화된 당을 제공함, iv) 유리 -NH2 기를 캡핑제와 반응시킴 (여기서 캡핑제는 -NH2 기와 반응할 수 있는 반응기를 포함함), v) 환원제로 C=N 결합을 환원시켜, 링커 및 임의의 스페이서를 통해 고체 지지체에 연결된 당CHn-NH- 구조의 반응성 당을 수득함 (여기서 n 은 1 또는 2 임).
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Description

고체상 올리고사카리드 태깅: 고정화 탄수화물의 조작 기법 {SOLID-PHASE OLIGOSACCHARIDE TAGGlNG: A TECHNIQUE FOR MANIPULATION OF IMMOBILIZED CARBOHYDRATES}
여기에 인용된 모든 특허 및 비특허 문헌은 참조로서 포함된다.
발명의 기술분야
본 발명은 탄수화물 조작 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유도체화에 의한 고정화 탄수화물 조작 방법에 관한 것이다. 유도체화의 성질에 따라, 탄수화물은 그에 의해 더욱 쉽게 검출되고/되거나 확인되거나 취급될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 탄수화물 검출 및 확인 분야에 관한 것이다.
발명의 배경기술
탄수화물은 자연에서 여러 형태로 존재한다. 인간을 포함한 동물에서, 예는 용액 중 자유 환원 당 (예컨대 혈청 중 모노사카리드 글루코스), 용액 중 자유 올리고사카리드 (예컨대 우유 중 디사카리드 락토스) 를 포함하며, 이들은 다양한 아미노산 (예컨대 아스파라긴, 세린, 트레오닌 및 기타) 으로의 공유 결합을 통해 펩티드 또는 단백질에 결합, (강글리오시드에서와 같은) 세라미드와 같은 지질에 공유 결합 또는 포스파티딜이노시톨을 통해 멤브레인 앵커 (membrane anchor) 에 결합될 수 있다. 당은 또한 글루쿠로니드와 같은 소분자 (대사에 관계되는 임의의 것들 포함) 에 결합되는 것으로 발견되었다. 상기 예에서, 당 사슬의 길이는 1 내지 100 개 이상의 당 잔기 내에서 변화할 수 있다.
박테리아 및 식물을 포함하는 하등 생물에서는, 보다 다량의 구조물이 존재한다. 박테리아 세포의 표면은 수천개 길이의 잔기의 당 중합체로 덮여있을 수 있으며, 이는 박테리아의 검출에서 항원 및 백신으로 작용할 수 있다. 당은 박테리아 세포벽에 없어서는 안 되는 부분이다. 당은 그 자체가 항생제 (예컨대 아미노글리코시드 항생제, 예를 들어 스트렙토마이신) 일 수 있거나, 항생제의 필수 성분 (예컨대 에리트로마이신 및 반코마이신), 효소 억제제 (예컨대 Acarbose) 또는 항암제 (예컨대 예를 들어 칼리케아마이신) 로 발견될 수 있다.
특정 관심사의 한 분야는 글리코단백 및 글리코지질에 부착되어 발견되는 탄수화물 사슬 (글라이칸) 의 구조이다. 글리코단백의 글리코실화 패턴은 그의 생체이용률, 그의 표적화를 포함하는 그의 생물학적 기능에 중요한 것으로 나타났으며, 종양 세포의 전이 가능성과 직접적으로 관련되었다. 인간 혈청 트랜스페린의 글리코실화 패턴은 예를 들어 타수화물 결핍 글리코실화 증후군이라 칭하는 유전 질환의 일련을 위한 진단 검사로 사용된다. 특정 글리코지질 서열은 신경 발달 및 세포 표면 신호, 당뇨에 연관되는 것으로 나타났으며, 테이-삭스 (Tay-Sachs) 와 같은 임의의 특이적 대사 질환에서 축적되며, 상기는 이들을 암시한다.
상기된 올리고사카리드 및 폴리사카리드에서 당 잔기 간의 결합은 알파 또는 베타 배열을 가질 수 있으며, 글라이칸은 다중 분지형인 수 있다. 따라서, 글 라이칸 사슬에 가능한 구조의 다양성은 거대하며 따라서 그의 구조적 특성은 본래부터 복잡하다. 따라서, 탄수화물 및 글라이칸 구조의 검출, 구조 특성화, 동정, 정량화, 및 화학적/효소적 조작을 위한 방법, 연구, 진단학, 재조합 글리코단백의 글리코실화 모니터링 및 새로운 약제의 개발에 대한 많은 관심이 있다.
탄수화물 구조에 대한 분석을 위해 몇 가지 방법이 현재 사용되고 있으며, 이들은 최근에 재검토되었다. 유도체화된 올리고사카리드 및 글리코지질은 NMR-분광법, 질량 분광측정법 및 크로마토그래피에 의해 분석될 수 있다. 보다 훨씬 큰 글리코단백에 대해, 질량 분광측정법은 더욱 제한된 정보를 제공하지만, 그의 단백질가수분해성 소화물 (digest), 즉 글리코펩티드의 분석은 광범위하게 사용되어 왔다. 비(非)-유도체화 올리고사카리드에 대한 간접적 구조 정보는 또한 렉틴, 항체 또는 효소와 같은 탄수화물-결합 단백질과 상호작용하는 그의 능력으로부터 추론될 수 있다.
탄수화물 그 자체는 특징적인 발색단을 갖지 않으며, 단지 N-아세틸기만을 가져 광학적 또는 분광학적 검출에 의한 그의 분리의 모니터링은 흔히 사용되지 않는다. 그러나 폴리올의 펄스 전류법 검출은 크로마토그래피에서의 검출을 위한 중요한 기법이다.
탄수화물의 고감도 검출을 위해 가장 널리 사용되는 방법은 환원 말단 (락톨, 히드록시케톤 및 히드록시알데하이드의 호변이성체) 을, 방사성 또는 형광성 TAG 로 표지화하는 것이었다. 글리코단백 및 글리코지질로부터 탄수화물을 절단하여, 글리코단백, 글리코지질 및 기타 글리코접합체로부터 필요한 환원 당의 생 성을 허용하는 화학적 및 효소적 방법 모두가 기술되었다. 더욱 흔히, 상기 환원 당은 환원 아민화의 조건 하에서 형광 분자의 아미노-함유 유도체와 반응한다: 즉, 여기서 처음 형성된 이민 (C=N) 은 아민 (CH-NH) 로 환원되어 안정적 결합을 생성한다. 대부분의 경우, 표지 반응은 많은 과량의 표지물질을 사용하여 용액 중 수행되었다. 이는 분석 전 또는 분석 중 과량의 표지 물질 및 그의 부산물의 분리를 필요로 한다. 질량 분광측정법에서의 효용의 기타 TAG 는 아민화 또는 환원 아민화에 의해, 동일한 방식으로 첨가되었고, 이후 검출은 질량 분광측정법에 의해 수행되었다.
표지가 첨가되어 특정 검출을 허용하면, 이후, 상술된 탄수화물에 분리 및 검출/정량화가 수행될 수 있다. 추가의 구조적 정보는 글리코시다제와 같은 효소에 태깅된 탄수화물을 노출시켜 수득될 수 있다. 특정 글리코시다제가 태깅된 탄수화물에 작용할 경우, 이는 하나 이상의 당 잔기를 절단하여, 예를 들어 CE, HPLC 에서 형광 검출기에 의해, 또는 SDS-PAGE 에서 그의 이동성의 변화에 의해 검출되는 크로마토그래피성 또는 전기영동성 이동성의 변화, 또는 질량 분광측정기에서 m/z 값의 변화에 의해 검출되는 그의 질량 변화를 초래할 수 있다. 다수의 효소가 사용되어 보다 높은 처리량 분석을 제공하였다.
하기에 종래기술의 간결한 개요가 제공된다:
[Gao et al. 2003] 은 용액 중 탄수화물의 유도체화에 대한 적합한 기법을 재검토한다. 용액 중 탄수화물은 환원 아민화에 의해 유도체화될 수 있다. 일반적으로, 아민의 -NH2 기는 환원 당의 알데하이드 또는 케톤기와 반응하여 -C=N 구조의 화합물을 생성할 수 있다. 상기 화합물은 예를 들어 NaCNBH3 에 의해 추가적으로 환원될 수 있다. [Gao et al., 2003] 은 고정화 탄수화물의 조작을 개시하지 않는다.
US5,100,778 은 올리고사카리드의 환원 말단 잔기 상에 확인 표지를 위치시키고, 다수의 개별 부분으로 나누고, 각 부분을, 예를 들어 특정 글리코시다제로 처리하고, 생성물을 풀링 (pooling) 하고, 수득된 풀을 분석하는 것을 포함하는 올리고사카리드 서열분석에 대한 방법을 기술한다. 문헌은 고정화된 올리고사카리드를 기술하지 않는다.
US4,419,444 은 탄수화물 잔기를 포함하는 유기 화합물을, 반응성 -NH2 기를 지니는 지지체에 화학적으로 결합하는 방법을 기술한다. 이 방법은 탄수화물에서 C-C 결합의 절단에 의해 반응성 알데하이드를 생성하기 위한 탄수화물 디올의 페리오데이트 산화 또는 -CH2OH 기의 -CHO 기로의 효소적 산화를 포함한다. 둘 모두의 산화는 탄수화물의 구조의 변화를 초래할 것이다. 반응성 알데하이드는 -NH2 기와의 반응에 의해 고정화될 수 있다. 화합물을 포함하는 탄수화물의 고정화 후, (예를 들어 NaBH4 를 사용한) 환원 단계를 수행하여 안정성을 증가시킬 수 있다. 문헌은 환원 당의, 그의 환원 말단을 통한 고정화 또는 환원된 아민 결합을 통한 고정화된 변경 탄수화물 포함 화합물의 조작 중 어느 하나도 기술하지 않는다. 또한, 탄수화물의 화학적 성질이 개질되었고 이러한 변경은 글리코시다제에 의한 특정 효소적 절단과 같은 추가의 개질을 손상시킬 수 있다. 문헌은 또한 고정화된 올리고사카리드로의 임의의 화학적 시약의 첨가 (그에 분자 구조의 첨가를 초래함) 를 기술하지 않는다.
WO 92/719974 는 올리고사카리드 서열분석 방법을 기술한다. 방법은 고체 지지체 상에 올리고사카리드를 고정화시키고, 이후 다양한 글리코시다제로 처리하는 것을 포함한다. 고정화 전, 올리고사카리드는 접합체에 연결될 수 있다. 문헌은 글리코시다제 처리 외의 고정화된 올리고사카리드의 개질을 기술하지 않는다.
상기는 글라이칸의 생물학적 중요성 및 복잡성을 기술하며, 모노사카리드와 같은 환원 당, 및 올리고사카리드의 환원 당 말단에 TAG 를 결합시키는 일부 이득을 요약한다. 지금까지, 상기 부착은 태깅 물질 (및 흔히 추가의 화학 제제 예컨대 환원제) 의 많은 과량을 사용하여 용액 중 수행되어 왔으며, 따라서 검출 또는 추가의 조작 전, 시간 소모적이며 빈번하게는 어려운 분리 기법을 적용하는 것을 필요로 한다. 상기 분리 기법은 변함없이 물질의 손실 및 희석을 초래하며, 이에 따라 분석을 상당히 복잡하게 하고 한쪽으로 치우치게 한다. 따라서, 반응 출발 물질, 시약, 부산물 및 목적하는 생성물의 분리를 위한 복잡하고 한쪽으로 치우친 방법의 필요 없이, 탄수화물 구조 상에 TAG 를 부착시키고 추가로 구조를 조작할 수 있는 간단한 방법에 대한 큰 필요가 있다. 여기서 상기 간단한 방법을 기술한다.
발명의 요약
본 발명은 -NH2 관능기를 포함하는 포착기를 포함하는 링커 (링커) (절단가능함) 및 임의의 스페이서 (spacer) (즉, 스페이서와 또는 스페이서 없이) 로 이루어진 고정화 분자와의 반응을 통해 환원 당 (본원 하기에 "환원 당" 섹션에 언급된 임의의 환원 당일 수 있음) 과 고체 지지체 (본원 하기에 "고체 지지체" 부분에 기술된 임의의 고체 지지체일 수 있음) 의 공유 결합 방법에 관한 것이다. 수득되는 고정화 당은 C=N 결합과 비환형 형태를 가지며, 이는 그의 환형 글리코실아민 호변이성체와 평형에 있을 수 있다.
고정화 후 고체 지지체 상의 자유 -NH2 기는 캡핑 (capping) 될 수 있으며 C=N 결합은 환원될 수 있다. 상기 방법은 도 1 A+B→E 에 나타나 있다. 도는 비유도체화 피리노스를 나타내지만, 이는 임의의 환원 당을 나타내려는 의도이다.
이형에서, 본 발명의 방법은 자유 -NH2 기의 캡핑전, C=N 결합을 포함하는 고정화 당 (도 1, 구조 C 에 의해 예시됨) 을 CH-NH 로 환원시켜, 구조 Cred 의 화합물 (도 1) 을 제조하는 것을 포함할 수 있다. 이후, Cred 의 NH2 기는 이 단계에서 캡핑되어, 상술되고 도 1 에 나타난 C 에서 D 에서 E 까지의 순서에 의해 제조된 바와 같은 동일한 구조 E 의 화합물을 생성할 수 있다.
따라서, 구조 E 는 A+B 에서 C 에서 D 에서 E, 또는 A+B 에서 C 에서 Cred 에 서 E 의 순서로 생성될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 반응성 당 제조 방법을 제공하는 것이며, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하며:
i. 환원 당을 포함하는 시료를 제공함 (예컨대 도 1 의 A),
ii. -NH2 기를 포함하는 포착기를 포함하는 링커에 공유 결합된 고체 지지체 (예를 들어 도 1 의 고체) 를 제공함 (여기서 상기 링커는 스페이서를 통해 고체 지지체에 부착된다 (예컨대 도 1 에서의 B)),
iii. 상기 환원 당을 상기 -NH2 기와 반응시켜 고정화된 당을 제공함 (예컨대 도 1 에서의 C),
iv. 자유 -NH2 기를 캡핑제와 반응시킴 (여기서 캡핑제는 -NH2 기와 반응할 수 있는 반응기를 포함함),
v. 환원제로 C=N 결합을 환원시킴,
vi. 이에 따라 링커 및 임의로 스페이서를 통해 고체 지지체에 연결된 당CHn-NH- 구조를 포함하는 반응성 당을 수득함 (여기서 n 은 1 또는 2 임; 예컨대 도 1 의 화합물 E),
여기서 단계 iv 및 v 는 임의의 순서로 수행될 수 있다.
단계 iv 가 단계 v 전에 수행되는 본 발명의 구현예에서, 단계 iv 에서 -NH2 기의 캡핑은 예를 들어 도 1 의 화합물 D 를 생성하는 반면, 단계 v 에서 수행된 환원은 예를 들어 도 1 의 화합물 E 를 생성할 것이다;
단계 v 가 단계 iv 전에 수행되는 본 발명의 구현예에서, (예를 들어 도 1 의 화합물 C 의) C=N 결합의 환원은 예를 들어 도 1 의 화합물 Cred 를 생성할 것이다. 단계 iv 에서 -NH2 기의 캡핑은 예를 들어 도 1 의 구조 E 의 화합물을 제조할 것이다. 환원 당을 포함하는 시료가 고체 지지체 및 환원제와 동시에 인큐베이션될 수 있음 본 발명에 포함된다. 따라서, C=N 결합의 환원 (단계 v) 은 고체 지지체의 -NH2 기와 환원 당의 반응 (단계 iii) 직후 수행될 것이다.
단계 iii) 에서, 바람직하게는, 상기 환원 당의 환원 말단은 상기 -NH2 기와 반응한다. 따라서, 바람직하게 환원 당의 헤미아세탈 또는 알데하이드기는 -NH2 기와 반응한다.
방법이 하기 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다:
vii. 질소 반응성 관능기 (X) 를 포함하는 유도체화제와 반응성 당 (예를 들어 도 1 의 화합물 E) 의 -NH- 기를 반응시켜, 상기 유도체화제에 공유 결합된 당을 수득함. 상기 유도체화제에 공유 결합된 상기 당은 예를 들어 도 1 의 화합물 F (유도체화제가 TAG 인 경우) 또는 유도체화제가 관능기에 연결된 테터 (tether) 인 경우, 도 1 의 화합물 H 일 수 있다.
본 문맥 및 도 1 (하기 참조) 에서 "TAG" 란 용어는 다른 분자에 공유 결합될 수 있는 임의의 원자, 분자 또는 실체물로서, 상기 다른 분자를, 공유 결합이 수행된 것으로 표지화시키는 것을 나타내려는 의미이다.
도면의 설명
도 1 은 본 발명에 따른 방법의 예를 나타낸다. 도 1: A-E 는 고체 지지체 상에 환원 당의 포착 및 조작이 반응성 당 E 를 제공하는 것을 예시한다. 도 1: E-G 및 J 는 고체 지지체 상에서 반응성 당 E 의 조작, 및 태깅된 당의 절단을 예시한다. 본 발명의 방법은 도 1 에 예시된 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 도 1 에서, 환원 당은 피라노스로 예시되지만, 그 방법으로 임의의 환원 당이 사용될 수 있다. 도는 링커가 스페이서를 통해 고체 지지체에 연결된 예를 나타내지만, 링커는 또한 고체 지지체에 직접 연결될 수 있다. 고체 지지체는 도에서 "고체" 로 나타내지만, 여기서 하기에 언급된 임의의 고체 지지체일 수 있다.
도 2. 본 발명의 실시예에서 사용된 환원 당의 구조 1 - 10, 및 그의 혼합물.
도 3. 링커 (14) 의 합성 및 스페이서 (15) 의 구조.
도 4. TMR-태깅된 D-갈락토스 유도체, GalCH2-N(R)-TMR (21) 의 용액상 합성, 및 모노사카리드 표준에 사용된 명칭의 설명.
도 5. 일반 구조 당CH2-N(R)-TMR 의 8가지의 흔한 포유류 모노사카리드의 합성 태깅된 유도체의 구조 21 - 28.
도 6. 4 가지의 고체 지지체 Bp, B0, B1 및 B2 의 구조.
도 7. 캡핑제의 구조.
도 8. 일반 구조 TAG-X 의, 사용된 임의의 질소-반응성 태깅제의 구조.
도 9. 일반 구조 X-테더-Yp 의 보호된 질소-반응제 29 를 사용한 E 에서 J (30) 의 예.
도 10. 도 5 에 나타난 8 가지 TMR-표지화된 모노사카리드 표준의 CE 에 의한 분리. 용출의 순서는 GalNAc (27), Xyl (24), Man (23), Glc (22), GlcNAc (26), Fuc (25), Gal (21), 및 GlcA (28) 이다. 상단의 트레이스는 확장이다.
도 11. Gp3 의 CE (LacNAc 를, TRITC 를 사용하여 태깅된 환원 당으로 하여, 섹션 4.2.1).
도 12. Gp5 의 음성 이온 모드에서 전기분무 질량 스펙트럼 (락토-N-테트라오스를, 4-브로모페닐이소티오시아네이트를 사용하여 태깅된 환원 당으로 하여, 섹션 4.2.2). 삽입은 Br 의 주요 동위원소에 상응하는 2 개의 피크를 나타내는 확장이다.
도 13. Gp6a 의 CE (TRITC 를 사용하여 태깅된 모노사카리드 혼합물 6, 섹션 4.2.3). X 는 미확인된 피크를 나타낸다. 용출의 순서는 GalNAc (27), Man (23) 및 Fuc (25) 이다. 하위 트레이스는 확장이다.
도 14. Gp7a 의 CE (TRITC 를 사용하여 태깅된 올리고사카리드 혼합물 7, 섹 션 4.2.4). X 는 미확인된 피크를 나타낸다. 용출의 순서는 GalNAc (27), Man (23) 및 Fuc (25) 이다. 하위 트레이스는 확장이다.
도 15. Gp9 의 CE (FITC 를 사용하여 태깅된 올리고사카리드 혼합물 9, 섹션 4.2.5). 용출의 순서는 G7 에서 G2 이다 (도 2).
도 16. Gp10 의 CE (FITC 를 사용하여 태깅된 리보뉴클리아제 B 올리고사카리드 10, 섹션 4.2.6).
도 17. G12 의 CE (Gal 2 를, TRITC 를 사용하여 태깅된 환원 당으로 하여, 섹션 4.3.1).
도 18. G15 의 CE (LNT 5 를, TRITC 를 사용하여 태깅된 환원 당으로 하여, 섹션 4.3.2).
도 19. G18 의 CE (8 을, TRITC 를 사용하여 태깅된 환원 당으로 하여, 섹션 4.3.3). 용출의 순서는 LNT 후 Gal 이다.
도 20. 고정화 LNT (5) 의 베타-갈락토시다제 소화 후, 분해된 생성물 G 0 5 (A), G 1 5 (B) 및 G 2 5 (C) 의 CE (섹션 5.1.1). TRITC-표지 LNT 테트라사카리드는 36 분 부근에서 처음 용출된다. 갈락토스의 손실은 38 분 후에 용출되는 트리사카리드 생성물을 수득한다.
도 21. 글루코아밀라제와 F 2 4 의 인큐베이션 전 (트레이스 A) 및 후 (트레이스 B) 의 절단된 생성물의 CE (TRITC 를 사용하여 태깅된 환원 당으로서 말토트리오스 (G3), 섹션 5.1.2). 태깅된 Glc (22, 도 5) 의 참조 시료는 트레이스 A 기록 전에 시료에 첨가되었다.
도 22. (LNT 및 유리 NH2 기를 지니는) C25 의 베타-갈락토시다제 처리 후, 유리된 갈락토스, 환원 및 TRITC 를 사용하여 태깅 후, 수득된 절단 생성물의 CE, 섹션 5.2. 용리의 순서는 LNT, 갈락토스의 손실로부터 생성되는 트리사카리드 및 갈락토스 (21) 이다.
도 23. 다양한 작용제로 캡핑, 환원 및 TRITC 를 사용하여 태깅 후, C22 로부터 유도된 절단 생성물 (고정화 갈락토스) 의 CE 분석, 섹션 6.1. 캡핑제는 A (무수 아세트산), B (무수 벤조산), C (무수 트리클로로아세트산) 및 D (디브로모자일렌) 이었다. 태깅된 갈락토스 (21) 은 모든 트레이스에서 17 분 부근에 용출된다.
도 24. 갈락토스를 C→Cred→→G 순서를 통해 갈락토스 처리로부터 수득된 절단 생성물의 CE, 섹션 6.2. 갈락토스 21 은 17 분에 용출된다.
본 발명의 상세한 설명
환원 당의 조작 방법
본 발명은 환원 당을 조작하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법의 예는 도 1 에 나타낸다. 본 발명의 방법은 도 1 에 예시된 단계 모두를 반드시 포함하지는 않는 것을 유의해야 한다. 따라서, 방법은 도 1 에 나타난 단계의 일부만을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 방법은 적어도 단계 A+B→C, C→D 및 D→E 또는 단계 A+B→C, C→Cred 및 Cred→E 를 포함할 것이다. 도 1 에서 환원 당은 피라노스에 의해 예시되지만, 임의의 환원 당, 특히 본원 하기 "환원 당" 섹션에 기술된 임의의 환원 당이 본 발명에서 사용될 수 있다. 도 1 에서 피라노스 고리를 절개하는 -OH 기는 그에 결합된 하나 이상의 히드록실기를 지니는 환원 당을 나타내는 것을 의미한다.
본 발명의 방법의 각 단계는 본원 하기에 더욱 상세하게 기술되며, 여기서 대문자 A 내지 J 및 Cred 는 도 1 을 나타낸다.
본 발명의 화합물 또는 중간체, 예를 들어 화합물 A, B, C, Cred, D, E, F, G, H, I 또는 J 각각의 정체는 당업자에게 공지된 표준 기법, 예컨대 NMR 에 의해 확인될 수 있다.
A. 환원 당
여기서 사용된 용어 "환원 당" 은 Cu2 + 에서 Cu+ 로 환원될 수 있는 당의 전형적인 정의를 포함한다. 당의 환원 여부는 예를 들어 펠링 시약 (Fehlings reagent) 을 사용하여 검사될 수 있다. 보다 현대적인 용어에서, 환원 당은 알데하이드기 또는 화학식 R2C(OH)OR' 의 헤미아세탈을 포함하는 당이며, 여기서 R' 은 H 가 아니다. 바람직하게는, 환원 당은 알데하이드를 포함하는 탄수화물 구조이며, 이는 헤미아세탈로 칭하는 환형화 형태와 평형을 이룬다. D-글루코스는 상기와 같은 환원 당의 비제한적인 예이다. 가장 많은 환형 형태는 푸라노스로 칭하는 5-원 고리, 및 피라노스로 칭하는 6-원 고리를 포함한다 (명명법의 규칙 참조).
여기서 사용된 용어 "당" 은 모노사카리드, 올리고사카리드, 폴리사카리드, 및 모노사카리드, 올리고사카리드 또는 폴리사카리드를 포함하는 화합물을 포함한다. 여기서 사용된 "탄수화물" 및 "당" 이란 용어는 호환적으로 사용된다.
올리고사카리드 및 폴리사카리드는 글리코시드적으로 연결된 모노사카리드로 이루어진 화합물이다. 일반적으로 폴리사카리드는 10 개 이상의 모노사카리드 잔기를 포함하는 반면, 올리고사카리드는 일반적으로 2 내지 10 개 범위의 모노사카리드를 포함한다. 올리고사카리드 및 폴리사카리드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 모노사카리드는 폴리히드록시 알데하이드 H-(CHOH)n-CHO 또는 폴리히드록시케톤 H-(CHOH)n-CO-(CHOH)m-H 로 정의되며, 여기서 m 및 n 은 정수이다. 바람직한 모노사카리드는 4 내지 9 개 범위의 탄소를 포함함에 따라, 바람직하게 폴리히드록시 알데하이드에 대해 n 은 3 내지 8 의 범위의 정수이며, 폴리히드록시케토에 대해 n+m 은 3 내지 8 범위의 정수이다. 모노사카리드는 알도스 및 케톤과 같은 화합물 및 매우 다양한 그의 유도체이다. 유도체화는 산화, 탈산화, 하나 이상의 히드록실기의, 바람직하게 수소 원자, 아미노기 또는 티올기에 의한 대체, 및 히드록시기 또는 아미노기의 알킬화, 아실화, 황산화 또는 인산화에 의해 수득된 것을 포함한다. IUPAC 명명법에 따라, 탄수화물은 화학양론식 Cn(H2O)n 의 화합물, 예컨대 알도스 및 케토스, 및 카르보닐기의 환원 (알디톨), 하나 이상의 말단기의 카르복실산으로의 산화, 또는 수소 원자, 아미노기, 티올기 또는 유사한 기에 의한 하나 이상의 히드록실 기(들) 의 대체에 의해 모노사카리드로부터 유도된 물질 또는 이들 화합물의 유도체이다.
바람직한 구현예에서, 환원 당은 자연 발생 환원 당 또는 탄수화물을 포함하는 자연 발생 또는 재조합적으로 제조된 화합물로부터, 유리되는 환원 당 (바람직하게는 유리 후 추가의 개질이 수행되지 않음) 이다. 특히, 환원 당이 자연 발생 환원 당 또는 자연 발생 또는 재조합적으로 제조된 화합물로부터 유리된 환원 당인 것이 바람직하며, 여기서 상기 자연 발생 당 또는 상기 유리 당의 알코올 기 중 어느 것도 올리고사카리드의 수준에서 산화에 의해 알데하이드 또는 케톤으로 효소적으로 전환되지 않는다. 또한, 환원 당이 자연 발생 환원 당 또는 자연 발생 또는 재조합적으로 제조된 화합물로부터 유리된 환원 당인 것이 바람직하며, 상기 자연 발생 당 또는 상기 유리 당은 페리오데이트 처리를 거치지 않는다. 따라서, 상기 자연 발생 당 또는 상기 유리 당이 알데하이드 또는 케톤으로 전환되지 않는 것이 일반적으로 바람직하다. 상기 문맥에서 재조합적으로 제조된 화합물은 재조합 기법, 예를 들어 이종 글리코단백의 도움으로 생물체에 의해 제조되는 화합물이다.
환원 당은 여러 원천으로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 환원 당은 생물체 또는 생물체의 부분, 예컨대 동물 또는 식물로부터, 또는 하나 이상의 특정 동물 또는 식물 조직으로부터, 원핵 또는 진핵 세포와 같은 생물로부터, 바이러스로부터, 시험관 내 배양된 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 곰팡이, 박테이아 세포, 효모 또는 파지 (phage) 로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 환원 당은 임의의 상술된 세포, 미생물 또는 생물체의 추출물로부터 단리될 수 있다. 상기 추출물은 자유 탄수화물과 같은 환원 당을 포함할 수 있다. 추출물은 또한 모노사카리드, 올리고사카리드, 폴리사카리드 또는 탄수화물 부분, 그 중에서도 글리코단백 또는 글리코지질 또는 탄수화물이 결합된 작은 유기 분자를 포함하는 화합물 (이는 일반적으로 글리코시드라 칭함) 을 포함할 수 있다. 글리코단백은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 성분에 탄수화물 성분이 연결된 화합물이다. 따라서, 여기서 사용된 용어 글리코단백은 또한 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸을 포함한다. 글리코지질은 아실글리세롤, 스핑고이드, 세라미드 (N-아실스핑고이드) 또는 페닐 포스페이트와 같은 소수성 부분으로의 글리코시드성 연결에 의해 결합된 하나 이상의 모노사카리드, 올리고사카리드, 폴리사카리드 또는 탄수화물 부분을 포함하는 화합물이다. 글리코시드는 O, N 또는 S 를 통해 하나 이상의 당에 글리코시드적으로 연결된 작은 (MWt 100-5000) 유기 분자를 기술하려는 의도이다.
환원 당은 또한 화학적 합성, 또는 화학적/효소적 합성의 생성물, 예컨대 용액 중 또는 고체상에서 화학적 합성에 의해 시험관 내에서 제조된 올리고사카리드 일 수 있다. 상기 동일한 합성 올리고사카리드는, 예를 들어 황산화, 인산화 또는 글리코실화와 같은 효소적 반응에 의해 추가적으로 개질될 수 있다. 따라서, 여기에 기술된 방법은 또한 합성 또는 반-합성 올리고사카리드 또는 올리고사카리드 라이브러리 (library) 의 조작에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 모노사카리드, 올리고사카리드, 폴리사카리드 또는 탄수화물 부분은, 본 발명의 방법을 수행하기 전에 글리코단백으로부터 유리된다. 이는 당업자에게 공지된 표준 방법에 의해 수행될 수 있다. N-연결 모노사카리드, 올리고사카리드, 폴리사카리드 또는 탄수화물은 화학적 또는 효소적 방법에 의해 글리코단백으로부터 절단될 수 있다. 효소적 방법은, 예를 들어 엔도글리코시다제 H 와 같은 글리코시다제 또는 PNGase-F 와 같은 N-글리카나제의 사용을 수반할 수 있다. O-연결된 모노사카리드, 올리고사카리드, 폴리사카리드 또는 탄수화물은 히드라진분해 또는 알칼리성 β-제거를 포함하는 화학적 방법에 의해, 또는 O-글리코시다제와 같은 효소를 사용하여 효소적으로 글리코단백으로부터 절단될 수 있다. N-연결 및 O-연결 모두의 유리에 유용한 화학적 방법은 강한 친핵체 및/또는 강한 염기 예컨대 히드라진과의 반응을 포함한다. 탄수화물은 산성 또는 염기성 반응을 사용하여, 또는 글리코시다제의 작용에 의해 작은 유기 분자로부터 절단될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 참조 표준의 소정량이 환원 당을 포함하는 시료에 첨가된다. 이는 링커가 절단가능한 본 발명의 구현예에서 고정화 후 또는 고정화 및 유리 후에 상기 환원 당의 정량을 용이하게 할 수 있다.
참조 표준은 -NH2 와 반응할 수 있는 임의의 화합물, 예를 들어 본원 하기 섹션 "E→F. TAG 첨가" 에 기술된 질소 반응성 관능기 중 하나를 포함하는 임의의 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 참조 표준은 알데하이드 또는 케톤, 더욱 바람직하게는 당이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 동일 또는 상이한 참조 표준은 용액 중 포함되는 첨가된 참조 표준과 함께 또는 그의 부재 하, 환원 당을 포함하는 용액과 접촉 전에 고체 지지체에 첨가된다 (본원 하기 섹션 "B. 고체 지지체" 참조). 따라서, 둘 이상의 참조 표준이 사용될 수 있으며, 하나 (또는 그 이상) 가 환원 당을 포함하는 용액과 고체 지지체의 접촉 전, 고체 지지체에 첨가되고, 하나 이상이 환원 당을 포함하는 용액에 첨가된다.
하나 이상의 참조 표준이 또한 환원 당과의 접촉 후, 그러나 바람직하게는 캡핑 전에 고체 지지체에 첨가될 수 있다. 따라서, 예를 들어 참조 표준은, 바람직하게는 세척 단계 후, 도 1 의 화합물 C 또는 Cred 에 첨가될 수 있다.
고체 지지체가 참조 표준에 커플링된 본 발명의 구현예 (본원 하기 섹션 "B. 고체 지지체" 참조) 에서, 상이한 참조 표준이 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에서 방법은, 방법과 함게 하용될 시료의 전처리 단계를 포함한다. 특히, 글리코단백, 글리코지질 또는 글리코시드와 같은 글리코시드적으로 연결된 당을 포함하는 시료는 고체 지지체와 반응 전 스캐빈져 (scavenger) 수지로 전처리될 수 있다. 스캐빈져 수지는 바람직하게 환원 당을 포함하는, 알데하이드 및 케톤과 반응할 수 있는 친핵성기를 포함하는 수지, 바람직하게는 아 미노기 또는 히드라진을 포함하는 스캐빈져 수지이다. 스캐빈져와 시료의 인큐베이션은 이에 따라 추가의 알데하이드, 케톤 및 환원 당을 제거할 것이다. 전처리 후, 상기 방법은 일반적으로 상기 글리코시드적으로 연결된 당으로부터 환원 당을 유리시키는 단계를 포함하며, 이에 따라 환원 당을 포함하는 시료를 수득할 것이다. 따라서, 상기 시료 중 대다수의 알데하이드 및 케톤은 글리코시드적으로 연결된 당으로부터 유리된 환원 당일 것이다. 상기 환원 당은 이 섹션에 본원에서 상술된 임의의 방법과 같은 화학적 또는 효소적 방법을 포함하는, 몇 가지 방법에 의해 유리될 수 있다. 예를 들어 PNGaseF 로 전처리된 시료의 처리는 본 발명의 방법에 따른 조작 및 포착을 위해 용액으로 환원성 올리고사카리드의 유리를 초래할 수 있다. 상기 유리된 올리고사카리드는 본질적으로 오염성 카르보닐 화합물이 없을 것이다. 환원성 탄수화물의 유리는 또한 기타 효소, 예컨대 글리코시다제에 의해, 또는 화학적 반응을 사용하여, 상술된 바와 같은 오염성 카르보닐 화합물의 스캐빈징 후에 달성될 수 있다.
B. 고체 지지체
본 발명에 따른 방법은 환원 당을 고체 지지체로 고정화시키는 것을 포함한다. 고체상 화학은 몇몇의 잇점, 예컨대 고정화 화합물의 용이한 취급, 정제 및 농축을 제공한다. 그러나, 용액 중 실행가능한 반응 모두가 고체 상에서 수행될 수 있지는 않다. 고체 지지체로의 부착은 각 분자성 실체에 무한한 크기를 실질적으로 부여한다.
이는 분자가 2분자 반응에서, 동일 분자가 용액 중 반응하는 것보다 훨씬 더 천천히 반응하는 효과를 갖는다. 만족스러운 수율로 용액 중 수행될 수 있는 일부 반응은 고체 지지체 상에서 전혀 수행되지 않을 것이다.
본원에서 사용된 용어 "고체 지지체" 는 물리적 고체 및 불용성 중합체, 불용성 입자, 표면, 멤브레인 및 수지를 포함하며, 바람직하게는 고체 지지체가 불용성 중합체, 불용성 입자, 표면 또는 수지이다.
따라서, "고체 지지체" 는 불용성 무기 매트릭스 (예컨대 유리), 불용성 중합체 (예컨대 플라스틱, 예를 들어 폴리스티렌), 유기 및 무기 성분 모두의 부분으로 이루어진 불용성 매트릭스 (예를 들어, 일부 혼성 실리케이트, 예컨대 R-Si-O- 구조의 화합물), 고체상 합성에서의 흔한 용도의 유기 중합체 (폴리스티렌, PEGA 수지, PEG 수지, SPOCC 수지 및 그의 혼성체), 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (이는 임의의 유기 용매에 수용성이며 기타 용매의 첨가에 의해 불용성으로 만들어질 수 있음) 일 수 있다. 고체는 또한 금속 (예컨대 금), 합금, 또는 예를 들어 인듐-주석 옥시드 또는 마이카와 같은 복합체일 수 있다.
상기 열거된 임의의 고체 지지체는 탄수화물에 대한 친화도를 갖는 작용제, 예컨대 아릴 보로네이트 또는 그의 중합체 (그러나 이에 제한되지는 않음) 로 추가적으로 코팅될 수 있다. 상기 코팅은 고체 지지체의 표면에서 탄수화물의 농도를 증가시켜, 포착의 속도 및 수율을 향상시킬 수 있다.
고체상 합성에서 사용되는 유기 중합체는 예를 들어 하기를 포함한다:
TentaGel (Rapp polymere, Tubingen, Germany 에서 시판됨), ArgoGel (Argonaut Technologies Inc., San Carlos, CA 에서 시판됨), PEGA (Polymer Laboratories, Amherst, MA 에서 시판됨), POEPOP (Renil et al., 1996, Tetrahedron Lett, 37: 6185-88; Versamatrix, Copenhagen, Denmark 에서 시판됨) 및 SPOCC (Rademann et al, 1999, J. Am. Chem. Soc, 121 : 5459-66; Versamatrix, Copenhagen, Denmark 에서 시판됨).
본 발명의 일 구현예에서, 고체 지지체는 센서, 예컨대 표면 음파 센서 (예컨대 Samoyolov et al. 2002, J. Molec. Recognit. 15: 197-203 에 기술된 임의의 센서) 또는 표면 플라즈몬 공명 센서 (예컨대 Homola et al., 1999, Sensors 및 Actuators B, 54: 3-15 에 의해 재검토된 임의의 센서) 이다. 상기 고체 지지체는 유리와 같은 유기 물질, 금과 같은 금속, 유기 중합체성 물질 또는 그의 혼성체일 수 있으며, 여러 코팅 예컨대 단백질 또는 폴리사카리드, 올리고머 예컨대 덴드리머 또는 중합체 예컨대 폴리아크릴아미드 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서 고체 지지체는 유리 또는 PEGA 수지이다,
본 발명의 일 구현예세서 고체 지지체는 참조 표준에 커플링되며, 이는 고정화 환원 당의 정량을 용이하게 할 수 있다. 특히, 상기 참조 표준이 절단가능한 링커에 의해 고체 지지체에 (직접 또는 간접적으로) 결합되는 것이 바람직하며, 이는 고정화 및 유리된 환원 당의 정량을 용이하게 할 수 있다. 환원 당이 절단가능한 링커를 통해 고체 지지체에 고정화되는 본 발명의 구현예에서, 참조 표준이 동일 또는 유사한 절단가능한 링커를 통해 고체 지지체에 고정화되는 것이 바람직하다.
참조 표준은 임의의 검출가능한 화합물일 수 있으며, 예를 들어 참조 표준은 당이거나 당이 아닐 수 있으나 바람직하게는 탄수화물이다.
참조 표준의 양은 변화할 수 있으며, 일반적으로 고체 지지체는 참조 표준 당 20 내지 500 범위, 바람직하게는 50 내지 200 범위, 예컨대 90 내지 110 범위의 -NH2 기를 포함할 수 있다.
B. 스페이서
본 발명에 따라 고체 지지체는 임의로 스페이서를 통해 링커에 커플링된다. 그러나, 고체 지지체가 링커에 직접 커플링되는 것이 본 발명에 포함된다.
스페이서는 1 내지 1000 개 원자 길이의 범위이다. 바람직하게는, 상기 스페이서는 선형 또는 분지형 사슬 및/또는 고리 구조이다. 스페이서의 성질은 소수성 또는 친수성일 수 있거나 이들 둘의 특성의 혼합물을 가질 수 있다. 스페이서의 군은 고체 지지체에 스페이서를 통해 부착된 분자의 검출을 포함하는 비드-상, 웰-중 또는 슬라이드-상 검정 및 고체 상 합성에서 흔한 용도의 분자를 포함한다. 당업자는 주어진 고체 지지체에 대해 유용한 스페이서를 쉽게 확인할 수 있을 것이다.
스페이서는 바람직하게 알킬 사슬 (더욱 바람직하게 C1 내지 C1000 알킬 사슬) 이며, 이는 임의로 분지형일 수 있으며, 여기서 상기 알킬 사슬은 B, O, N, S, P, Si, F, Cl, Br 또는 I 중 하나 이상을 포함하는 군에 의해 하나 이상의 위치에서 임의 치환된다. 스페이서는 또한 동일한 방식으로 임의로 분지화 또는 치환될 수 있는 하나 이상의 아릴 잔기를 포함할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 스페이서는 아미드 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 스페이트는 본질적으로 하나 이상의 아미드 결합 (-CONH-), 하나 이상의 에틸렌 글리콜 단위 (-CH2-CH2-O-), 또는 이들 단위와 알킬 또는 아릴 사슬의 조합으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 스페이서는 바람직하게 1차 또는 2차 아민을 포함하지 않는다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 스페이서 내에 포함되는 임의의 아민이 캡핑된다.
B. 링커
본 발명은 포착기를 포함하는 링커에 공유 결합된 고체 지지체 상으로의 환원 당의 포착에 관한 것이다. 링커는 -NH2 로 종결되는 포착기를, 임의로 스페이서를 통해 고체 지지체에 연결하는데 이용된다. 링커는 고체상 유기 합성에서 흔한 용도의 것과 같은 매우 다양한 임의의 링커일 수 있다.
링커는 비(非)-절단가능 링커 또는 절단가능 링커일 수 있다.
비-절단가능 링커는 예를 들어, 알킬, 아릴, 에테르 또는 아미드일 수 있으며, 여기서 임의의 상술된 것은 임의로 치환될 수 있다. 예를 들어, 임의의 상술된 것은 헤테로원자로 치환되거나, 또는 분지로서 O-알킬, 알킬, 아릴 또는 헤테로원자를 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 링커는 PEG 및/또는 폴리아미드를 포함 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
링커는 스페이서 및 고체 지지체로부터 포착기 (이가 포착한 분자 포함 및 임의로 추가로 개질됨) 를 포함하는 부분을 절단하도록 발생하게 만들어질 수 있다. 상기 링커는 절단가능한 링커로 칭하며, 고체상 유기 합성에서 널리 사용된다. 절단가능 링커의 예는 친전자체, 친핵체, 산화제, 환원제, 자유 라디칼, 산, 염기, 광, 열 또는 효소에 의해 달성될 수 있다.
절단가능한 링커는 예를 들어 산-반응성 (예를 들어, Rink, 1987, Tetrahedrom Lett., 28: 387 에 기술된 바와 같은 Rink 아미드 및 Plunkett et al., 1995, J. Org. Chem., 60: 6006-7 에 기술된 바와 같은 트레이스 없는 실릴 링커), 염기-반응성 (예를 들어, Atherton et al. 1981 , J. Chem. Soc. Perkin Trans, 1 : 538 에 기술된 바와 같은 HMBA), 또는 광반응성 (예를 들어, Homles et al., 1995, J. Org. Chem., 60: 2318-2319 에 기술된 바와 같은 2-니트로벤질 타입) 일 수 있다. 링커는 더욱 실릴 링커 (예를 들어, Boehm et al., 1996, J. Org. Chem., 62: 6498-99 에 기술된 플루오리드로 절단된 것), 알릴 링커 (예를 들어, Kunz et al., 1988, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 27: 711-713), 및 안전 장치 (safety catch) 술폰아미드 링커 (예를 들어, Kenner et al., 1971, Chem. Commun., 12: 636-7 에 기술됨) 와 같이, 수행된 화학의 유형에 제한적 및 더욱 특이적일 수 있다. 효소 절단가능 링커는 예를 들어 [Reents et al., 2002, Drug Discov. Today, 7: 71-76] 에 기술된 임의의 효소 절단가능 링커, 또는 [Waldmann et al., 2001 , Chem. Rev. 101: 3367-3396] 에 의한 리뷰에서 기술된 효소-반응성 보호기의 임의의 관능성 유도체일 수 있다. 열민감성 링커는 예를 들어 [Meng et al., 2004, Angew. Chem. Int. Ed., 43: 1255-1260] 에 기술된 유형일 수 있다.
B. 포착기
본 발명에 따라, 링커는 포착기를 포함하며, 여기서 포착기는 하나 이상의 -NH2 기를 포함한다. 바람직한 형식에서, 포착기는 -NH2 기로 종결되며, 이는 임의의 R 기를 통해 링커에 부착된다. 따라서, 포착기는 바람직하게 R-NH2 의 구조이다. R 은 단순 알킬, 아릴 또는 치환된 알킬 또는 아릴기일 수 있다. 바람직하게는, R 은 링커-M-NH2 유형의 구조를 생성하기 위해, -NH2 기에 직접 부착된 헤테로원자를 포함해야하며, 여기서 M 은 헤테로원자 (즉, 탄소가 아님) 이며, 바람직하게 M 은 N, O 및 S 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 것은 M 이 헤테로원자, 예컨대 링커-O-NH2, 링커-NH-NH2, 링커-CO-NH-NH2, 링커-NH-CO-NH-NH2, 링커-S(O)2NH-NH2 및 링커-S-NH2 구조인 화합물이다.
A+B→C. 포착 방법
환원 당의 포착은 상기 환원 당의 환원 말단, 즉 알데하이드 또는 헤미아세탈기와 포착기의 -NH2 기를 반응시켜 수행된다. 반응은 임의의 pH 값에서 발생할 수 있지만 pH 2 - 9 범위에서 가장 유리하다. 방법은 하나 이상의 첨가체, 예컨대 환원 당의 열린 사슬 알데하이드 형태 및 환원 당의 헤미아세탈 형태 사이에 평형을 돕거나 유리하게 변경시킬 수 있는 첨가제 (예를 들어, 화합물 A, 도 1) 의 첨가를 포함할 수 있으며, 여기서 열린 사슬 알데하이드 형태가 바람직하다. 첨가제는 예를 들어 금속 이온, 보로네이트 또는 실리케이트일 수 있다. 포착 은 공유 2중 결합 (C=N 으로 나타남) 을 통해 고체 지지체에 결합되는 부류를 생성하며, 여기서 C 는 당 부분으로부터, 및 N 은 포착기로부터 유도된다. 상기 고정화 당은 또한 그의 환형 고리 형태와 평형일 수 있으며, 특히 환원 당이 피라노스인 경우, 고정화 당은 환형 6-원 고리 형태와 평형일 수 있지만 (예를 들어, 도 1 의 화합물 C 및 C' 참조), 이는 또한 당 상의 적절한 OH 기가 비치환되는 경우 그의 5-원 고리 형태와 평형상태일 수 있다.
포착 반응은 임의의 유용한 용매 중 수행될 수 있다. 당업자는 임의의 주어진 화합물 A 및 B 를 위한 유용한 용매를 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 용매는 예를 들어, 물, 수성 완충액, 유기 용매 및 혼합 수성 및 유기 용매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 용매는 또한 산, 염기, 염, 2가 금속 양이온, 세제, 착화제 (내포-착물-형성 분자 예컨대 시클로덱스트린 또는 칼릭사렌 포함), 킬레이트화제 (예를 들어 EDTA), 보레이트, 보로네이트 또는 실리케이트와 같은 하나 이상의 첨가제를 포함하는 상술된 임의의 것일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 반응에 첨가된 고체 지지체 (도 1 의 화합물 B) 의 양은 포착기의 과잉 몰 (바람직하게 이 과잉은 큼) 이 환원 당에 대해, 예컨대 2 배 이상, 바람직하게는 5 배 이상, 더욱 바람직하게는 10 배 이상, 예컨대 50 배 이상, 예를 들어 적어도 100 배 또는 그 이상으로 존재하도록 조절된다. 상기 과잉은 환원 당의 더욱 효과적인 포착을 보증한다.
포착 반응은 임의의 온도에서 수행될 수 있으나, 바람직하게는 0 내지 100℃ 범위의 온도이다.
C. 세척
환원 당이 포착기와의 반응을 통해 고체 지지체 상에 고정화되면 (도 1 의 A+B→C 단계) 고체 지지체는 비공유결합적으로 결합된 물질을 제거하기 위해 세척될 수 있다. 따라서, 환원 당이 기타 화합물, 특히 -NH2 반응기를 포함하지 않는 기타 화합물을 포함하는 용액 중 제공되는 경우, 환원 당은 상기 용액으로부터 정제될 수 있다. 따라서, 환원 당이 비-정제 형태, 예컨대 미정제 세포성 추출물 등의 형태로 제공되는 것이 본 발명에 포함된다. 환원 당이 화학 시약에 의한 글리코시드성 결합의 절단을 통해, 또는 아미다제 또는 글리코시다제와 같은 효소의 작용에 의해 정제 또는 부분적으로 정제된 글리코단백, 글리코지질 또는 글리코시드로부터 생성되는 것 또한 포함된다.
당업자는 주어진 고정화 당 (화합물 C, 도 1) 에 대한 적절한 세척 조건을 쉽게 알 수 있을 것이다. 세척은 예를 들어 세제 및 변성제 이외에 임의의 상술된 첨가제를 임의로 포함하는 임의의 상술된 용매로 수행될 수 있다. 세척은 임의의 온도에서 수행될 수 있으나, 바람직하게는 0 - 100℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다.
C→D. 캡핑
고정화 당에 커플링된 고체 지지체 (예컨대 도 1 의 화합물 C) 는 미반응 자유 -NH2 기를 여전히 포함하며 그의 효용의 범위를 증가시키는 독특한 조작이 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 환원 당의 고정화 후, 미반응 -NH2 기는 캡핑제, 예컨대 아실화제 (예를 들어 무수 아세트산) 또는 당업계에 널리 공지된 기타 질소-반응제에 의해, C 의 C=N 결합이 반응하지 않는 조건 하에서 캡핑된다. 캡핑 후, 고체 지지체는 더 이상 임의의 자유 아민기를 포함하지 않고, 친전자체에 대한 매우 낮은 반응성의 캡핑된 질소 원자 (N(H)CAP) 만을 포함할 것이다. 화합물 C 의 캡핑의 생성물은 예를 들어 -R-N(H)CAP 기를 포함하는 일반 구조 D (도 1 참조) 를 가지며, 여기서 (H) 는 CAP 기의 구조에 따라 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.
따라서, 당을 고체 지지체에 연결하는 C=N 결합이 -NH- 로 환원되는 경우, 이는 형식적으로 R-NH-CH2- 서열의 SP3-혼성화 질소 원자일 것이다. 따라서, 특이적 반응은 환원 당에서 특이적이며 화학양론전 반응을 허용하는 상기 기에 향하도록 할 수 있다.
바람직하게 캡핑제는 C=N 관능기와 실질적으로 반응하지 않으며 나머지 -NH2 기와 특이적으로 반응한다. 상기 시약은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 아미드 결합 형성에 사용되는 흔한 아실화제, 예를 들어, 무수 아세트산, 기타 무수 알카노산, 방향족 무수물 (예를 들어, 무수 벤조산), 환형 무수물 (예를 들어, 무수 숙신산, 무수 프탈산), 기타 활성 에스테르 예컨대 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르 및 펩티드 결합의 고체상 합성을 포함하는 아미드 결합 형성에서의 흔한 용도의 다양한 활성 에스테르를 포함한다. -NH2 기는 대안적으로, 펩티드-결합 형성에서 흔한 용도의, 상응하는 유리산 및 제자리 활성화제 예컨대 DCC 를 첨가함에 따라 활성 에스테르를 제자리에서 생성하여 캡핑될 수 있다. -NH2 기에 반응성인 것으로 알려진 기타 시약, 예컨대 알킬 이소티오시아네이트 (R-NCS), 아릴 이소티오시아네이트 (Ar-NCS), 알킬화제 R-L (여기서 L 은 전형적으로 Cl, Br, I, OS(O)2R' (여기서 R' 은 알킬 또는 아릴일 수 있음) 일련으로부터의 이탈기임), 마이클 수용체 (Michael acceptor) 예컨대 알파-베타 불포화 카르보닐 화합물 (CHR=CH-CO- 여기서 R 은 H, 알킬 또는 아릴 또는 치환된 알킬 또는 아릴일 수 있음) 또는 알파-베타 불포화 술폰 (CHR=CHS(O)2R' 또는 Ar 여기서 R 은 H, 알킬 또는 아릴 또는 치환된 알킬 또는 아릴일 수 있음), 술폰화제 (예컨대 RSO2Cl) 및 그의 유도체가 사용될 수 있다. 유사한 방식으로, -NH2 기는 화학식 RO-C(O)L 의 카르보네이트의 활성 에스테르와의 반응에 의해 캡핑될 수 있으며, 여기서 L 은 상술된 바와 같다.
D→E. 환원
본 발명의 바람직한 구현예에서, 당을 링커 (예를 들어 도 1 의 화합물 D) 에 연결하는 C=N 결합은 환원제를 사용하여 환원된다. C=N 결합은 널리 공지된 다양한 환원제에 의해 환원될 수 있으며, 바람직하게 환원제는 N 상에 수소 원자를 위치시키는 동안 2중 결합을 포화시킬 수 있다.
BH 결합을 포함하는 보란 또는 보로히드리드는 특별한 가치가 있으며, 예를 들어 NaBH4, NaCNBH3 및 BH3 착물 예컨대 BH3-피리딘, BH3-디메틸술피드 등을 포함한다. R3SiH 구조를 가진 실란, 예컨대 SiH 결합을 포함하는 실란도 사용될 수 있으며, 또한 수소 전달제 예컨대 디이미드 또는 균질성 수소화 촉매 또는 금속-H 결합을 포함하는 수소화 촉매도 사용될 수 있다.
환원은 바람직하게, 링커 및 임의로 스페이서를 통해 고체 지지체에 연결된 당CH-NH- 구조를 포함하는 반응성 당을 생성한다. 일반적으로, 환원제가 알데하이드이면, 환원은 당CH2-NH- 구조의 화합물을 생성할 것이다. 환원 당이 케톤이면, 환원은 당CH-NH- 구조의 화합물을 생성할 것이다.
환원의 생성물은, 예를 들어, 형식적으로 SP3 혼성화된 N 원자를 포함하는 구조 E (도 1) 이다.
C→ C red →E
방법의 또 다른 바람직한 실행에서, 캡핑 및 환원 단계의 순서는 반대가 된다. 화합물 C (도 1) 의 C=N 결합의 환원은 상기 D→E 에 기술된 임의의 시약에 의해 수행되어, Cred 구조의 화합물 (도 1) 을 제조할 수 있다. 환원은 또한 제자리에서 수행될 수 있으며, 이는 환원제 (예컨대 NaCNBH3) 가 고체 지지체 (예를 들어, 화합물 B) 에 환원 당과 동시에 첨가되어 C=N 결합이 환원되며 (그가 형성되 는 동안) 또한 Cred 를 생성할 수 있다. 따라서, 환원 당을 포함하는 시료는 고체 지지체 및 환원제와 동시에 인큐베이션될 수 있음이 본 발명에 포함된다. 따라서, C=N 결합의 환원 (단계 v) 는 고체 지지체의 -NH2 기와 환원 당의 반응 직후에 수행될 것이다 (단계 iii). Cred 의 자유 -NH2 기는 이후 당CH-NH-부분과의 반응을 초래하지 않는 조건 하에서 상기 C→D 에 기술된 임의의 시약을 사용하여 캡핑될 수 있다. 특히, 본 발명의 이 구현예에서, 캡핑제가 2차 아미노기보다 우선적으로 1차 아미노기와 반응하는 것이 바람직하다. 또한 반응 온도 및 시간이 조절되어 2차 아미노기보다 우선적으로 1차 아미노기와의 반응을 수득하는 것이 바람직하다. 아미노기와 반응하는 사실상 모든 화합물은 더 치환된 아미노기보다 1차 아미노기와 더욱 빨리 반응하지만, 이는 특히 상기 화합물이 입체적으로 큰 경우, 예컨대 예를 들어 활성 벤조일 에스테르, 이소프로판산 활성-에스테르, 피발로일 활성 에스테르, Boc 무수물 또는 Boc-아지드 등인 경우 특히 그러하다. 2차 아미노기보다 우선적인 1차 아미노기와의 반응에 유용한 화합물 및 조건은 [Greene et al. 1999, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd. Ed., Chaper 7, pp. 503-653] 에 기술되어 있다. 기타 바람직한 캡핑제는 NHS-에스테르 또는 입체적 장애 (hindered) 펜타플루오로페닐 (PFP) 에스테르 또는 테트라플루오로페닐 (TFP) 에스테르이다.
E→F. TAG 첨가
도 1, 화합물 E 는 상기 경로 중 어느 하나에 의해 수득될 수 있으며, 당 CH2-NH-R 서열의 형식적 SP3-혼성화 질소 원자 및 친전자체에 대해 매우 낮은 반응성의 캡핑된 질소 원자 (N(H)CAP) 에 연결된 고체를 포함한다. 따라서, 적절한 질소-반응성 관능기 (바람직하게는 질소-반응성 관능기는 약한 친전자체임) 와 E 와의 반응은 여기서 "TAG" 로 기술되는, 분자 구조를 효과적으로 첨가하는 SP3 질소 원자에 친전자체, 또는 당이 결합된 질소에 또 다른 유도체화제의 독점적 또는 거의 독점적인 첨가를 초래한다. TAG 의 첨가의 생성물은 도 1 에서 F 로 나타난다.
설명 전반에 걸쳐 "질소-반응기" 라는 용어는 R-NH-R' 구조의 화합물, 예를 들어 아민에서와 같이 형식적으로 SP3-혼성화된 질소에 대한 반응성을 기술하기 위해 사용되며, 여기서 R 및 R' 은 독립적으로 알킬 또는 (임의로 치환된) 아릴 또는 R' 이 히드록실아민 유도체 (R-NH-OR') 또는 히드라진 유도체 (R-NH-NH-R') 에서와 같이 -NH- 에 결합된 O 또는 N 과 같은 헤테로원자를 갖는 화합물이다.
유도체화제 (예를 들어 TAG) 의 실체, 즉 유도체화제의 특정 화학 구조는 사용자에 의해 선택될 수 있다. E 에서 SP3 질소로의 첨가를 위해, 유도체화제 (예를 들어 TAG) 는 그 자체가 도 1 에서 "X" 로 칭하는 질소 반응성 관능기를 포함해야 한다. 바람직하게는 TAG 는 친전자체를 포함하거나 질소-반응성 관능기 X 에 결합되어야 한다. 바람직하게 유도체화제는 구조식 TAG-X (도 1 참조) 이며, 여기서 X 는 질소-반응성 관능기이다. 바람직하게 X 는 SP3 질소 원자와 반 응성인 임의의 약한 친전자체이나, 바람직하게는 당에 존재하는 -OH 기와 불완전하게 반응하는 약한 친전자체이다. 상기 약한 친전자체는 이소티오시아네이트 (TAG-NCS), 활성 에스테르 (TAG-C(O)-L) 를 (여기서 L 은 펩티드 결합의 합성에서와 같은 아미드 결합 형성에서 흔히 사용되는 이탈기임), 펩티드 결합의 합성에서와 같이 아미드 결합 형성에서 흔히 사용되는 방법에 의해 제자리에서 활성 에스테르로 활성화될 수 있는 카르복실산 (TAG-COOH), 알킬화제 (TAG-L) (여기서 L 은 바람직하게, 그러나 비독점적으로 Cl, Br, I, OS(O)2R (여기서 R 은 알킬 또는 아릴일 수 있음) 일련으로부터의 이탈기임), 알파-베타 불포화 술폰 (-CR=CH-S(O)2-) 또는 마이클 수용체 (전형적으로 -CR=CH-C(O)- 서열을 포함함) 을 포함하는 TAG 및 임의의 상술된 것의 유도체, 환원성 아민화에 의해 당CH2-NH-아미노기와 반응할 수 있는 케톤 또는 알데하이드, 또는 방향족 고리가 Sanger 시약 1-플루오로-2,4-디니트로벤젠 또는 4-할로-7-니트로-2-옥사-1,3-디아졸 (NBD) 시약 (여기서 할로겐은 바람직하게 F 또는 Cl 임) 에서와 같이, 니트로기와 같은 음전기성 기를 지니는 치환된 할로방향족 기를 포함한다.
TAG 는 예를 들어 형광 부분, 질량 분광측정법 TAG, 제 2 의 결합 파트너와 결합할 수 있는 제 1 의 결합 파트너, 핵산일 수 있으며, 여기서 임의의 상술된 TAG 는 바람직하게 질소-반응성 관능기를 포함 또는 그에 결합된다. 특히, TAG 는 본원 하기에 더욱 상세하게 시술된 임의의 TAG 일 수 있으며, 여기서 임의의 상기 TAG 는 임의의 상술된 질소-반응성 관능기에 결합될 수 있다.
TAG 를 화합물 E 에 첨가하여 수득될 수 있는 화합물의 예는 도 1 에 나타나 있다.
F. 세척
일 구현예에서, 태깅된 당 (예를 들어, 화합물 F, 도 1) 은 임의의 추가의 조작 전에 세척된다. 따라서, 비결합 TAG 의 임의의 양이 제거된다. 세척은 태깅된 당이 고체 지지체 상에 고정화되기 때문에 쉽게 수행될 수 있다.
세척 후, 공유결합된 TAG 만이 존재할 것이다. 따라서 TAG 의 양은 고정화된 당의 양과 연관지을 수 있을 것이다. 따라서, TAG 의 존재를 결정하여, 고정화된 당의 양을 측정할 수 있다. 주어진 시료 중 본질적으로 모든 환원 당이 고정화된다면, 이에 따라 방법은 한 측면에서 시료 중 존재하는 환원 당의 양의 측정을 허용한다.
당업자는 주어진 태깅된, 고정화 당 (예를 들어, 화합물 F, 도 1) 에 대한 적합한 세척 조건을 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 세척은 예를 들어 물, 수성 완충액, 유기 용매 및 혼합 수성 및 유기 용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 수행될 수 있다. 용매는 또한 염, 2가 금속 양이온, 세제, 착화제 (내포-착물-형성 분자 예컨대 시클로덱스트린 또는 칼릭사렌 포함), 킬레이트화제 (예를 들어 EDTA), 보레이트, 보로네이트 또는 실리케이트와 같은 하나 이상의 첨가제를 포함하는 상술된 임의의 것일 수 있다. 추가적으로, 용매는 임의로 세제 및 변성제를 포함할 수 있다. 세척은 임의의 온도에서 수행될 수 있으나, 바람직하게는 0 - 100℃ 범위의 온도에서 수행된다.
H. 절단가능한 링커의 절단
사용된 링커가 절단가능한 링커인 경우, 본 발명의 방법은 상기 절단가능 링커의 절단에 따라 포착당이 유리되는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 절단은 유도체화제, 예컨대 고정화된 당의 NH-기로의 테더-Y (X-테더-Y 를 사용하여 첨가됨) 또는 TAG (TAG-X 를 사용하여 첨가됨) 의 첨가 후에 수행된다. 따라서, 태깅된 당 (도 1 에서 화합물 G 또는 화합물 J) 은 각각 F 또는 I 로부터 용액으로 유리될 수 있다. G 는 절단 후 남아있는 링커의 잔기 (존재한다면) 에 결합되는, 질소 원자 상에 TAG 를 지니는 당 부분으로 이루어지며, 간소함을 위해 당-TAG 로 칭한다. J 는 절단 후 잔기 (존재한다면) 에 결합되는, 질소 원자 상에 테터를 지니는 당 부분으로 이루어진다. 테더는 임의로 TAG 에 연결될 수 있다.
그러나, 절단가능한 링커는 방법 내에서 임의의 바람직한 시간에 절단될 수 있다.
화합물 E 에 첨가된 TAG 가 형광 특성과 같은 유익한 분광 특성을 가지면, 당-TAG (화합물 G, 도 1) 의 양은 용액 중 정량될 수 있다. 추가적으로, 당-TAG (화합물 G, 도 1) 에 HPLC 또는 CE 와 같은 분석 분리 기법을 수행할 수 있고, 하나 이상의 당이 존재하는 경우, 개별 성분이 분리될 수 있으며, 이의 상대 비율이 측정되며, 이는 진정한 표준이 사용가능한 경우 확인될 수 있으며, 이는 정량될 수 있다. 상기는 또한 탄수화물-인지 단백질에 결합할 수 있는 리간드로도 사용될 수 있으며, 이에 따라 탄수화물 또는 단백질의 구조에 대한 정보를 제공한다.
TAG 이 증가된 감도, 스펙트럼 판독의 간편화, 또는 동위원소 엔코딩을 사용한 시차열법분석의 수행의 허용에 기인하여 질량-분광측정법의 수행에 유익한 당-TAG 특성을 제공하는 구조인 경우, 용액에 유리된 당-TAG 는 질량-분광측정법에 의해 유리하게 분석될 수 있다.
F. 분광 특성을 갖는 TAG
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 예를 들어 화합물 E 또는 화합물 H 에 첨가된 TAG 는 유익한 분광 특성을 갖는다. 바람직하게는, X-TAG (여기서 X 는 질소 반응성 관능기, 예컨대 본원 상기에서 "E→F TAG 첨가" 섹션에 기술된 질소 반응기임) 구조의 유도체를 사용하여, 유익한 분광 특성을 갖는 TAG 가 예를 들어 화합물 E 에 첨가된다. 유익한 분광 특성은 TAG 가 예를 들어 분광측정법에 의해 쉽게 시각화될 수 있음을 의미한다. 따라서, TAG 는 예를 들어 분광학적으로 검출가능할 수 있다. 바람직한 구현예에서 TAG 는 형광 TAG 이다. 상기 태깅의 예는 이소티오시아네이트 (예를 들어, FITC, TRITC), 활성 에스테르, 마이클 수용체, 알파-베타 불포화 술포닐 (특히 비닐 술폰) 및 알킬화제 예컨대 알킬 할리드 및 토실레이트, 할로-아릴 화합물 예컨대 예를 들어 Sanger 시약을 포함한다.
상기 TAG (예를 들어 도 1 의 화합물 F) 의 첨가의 생성물은 빛을 흡수 및 재방출시킬 수 있으며 이는 검출될 수 있다. F 상에 존재하는 상기 TAG 의 수는 B 에 첨가되고 포착되어 C 를 생성하는 당 분자 A 의 수를 반영할 것이다. 따라서, 시료 중 원래 존재하는 환원 당 분자 (A) 의 수는, 고체 지지체 (화합물 B) 가 과잉의 포착기를 포함한다면, 화합물 F 의 형광 발광에 의해 추정될 수 있다. 형광 분자 이외의 TAG 또한 사용될 수 있다. 이들은 방사성 TAG, 인광 TAG, 화학발광 TAG, UV-흡수 TAG, 나노입자, 양자점, 착색 화합물, 전기화학적-활성 TAG, 적외선-활성 TAG, 라만 (Raman) 분광법 또는 라만 산란에서 활성인 TAG, 원자간력 현미경에 의해 검출가능한 TAG 또는 금속 원자 또는 그의 무리 (cluster) 를 포함하는 TAG 를 포함할 수 있다.
화합물 F 의 고체 지지체가 표면 음파 센서 또는 표면 플라즈몬 공명 센서와 같은 센서이면, TAG 에 특이적으로 결합하는 상기 부류의 첨가는 TAG 및 이에 따라 당 분자의 수에 비례하는 신호의 생성을 초래할 수 있다. 일례로 TAG 가 바이오틴의 활성 에스테르와의 반응에 의해 흔히 도입되는 바이오틴 잔기인 경우이다. TAG 가 바이오틴 잔기인 경우, 화합물 E 로의 아비딘-단백질의 첨가는 센서에 의해 쉽게 검출되고 보고되는 신호를 초래할 수 있다. 고정화된 TAG 로의 제 2 의 결합 파트너의 결합을 검출하는데 사용될 수 있는 센서의 기타 예는 압전 센서, 전류법 센서, 표면 플라즈몬 형광 분광측정법 센서, 이중 편광 간섭계 (DPI) 센서, 파장-신호 광학 센서 (WIOS), 임피던스 센서, 광학 도파관 회절 커플러 센서, 음파 센서 및 열량계 센서를 포함하나 그에 제한되지는 않는다.
당이 분광학적 특성을 갖는 TAG 에 결합되면 상기 분광학적 특성이 결정될 수 있다. 광학 특성은 고체 지지체에 여전히 고정화된 당에 대해 (예컨대 도 1 의 화합물 F 또는 I 에 대해) 또는 용액에 방출된 당에 대해 (예를 들어 도 1 의 화합물 G 또는 J 에 대해) 결정될 수 있다. 후자는 링커가 절단가능한 링커임 을 필요로 한다. 분광학적 특성을 갖는 TAG 의 성질에 따라, 상기 특성은 분광측정법과 같은 통상적인 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 분광측정법에 의해 당에 결합된 TAG 를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
F. 질량-분광측정법 TAG
본 발명의 일 구현예에서, TAG 는 질량 분광측정법 TAG 이다. 상기 질량 분광측정법 TAG 는 바람직하게 X-TAG 구조의 시약에 의해 첨가되며, 여기서 X 는 질소-반응성 관능기, 예컨대 본원 상기 섹션 "TAG 첨가" 에 언급된 임의의 질소-반응성 관능기이다. 본원에서 사용된 "질량 분광측정법 TAG" 라는 용어는 바람직하게는 고체 지지체로부터의 절단 (본원 상기 "절단가능 링커의 절단" 섹션에 기술된 바와 같음) 후, 질량 분광측정법에 의해 생성물의 구조적 특성화 및 검출을 개선하는 분자를 칭한다. 예는 질량 스펙트럼에서 특징적인 동위원소 패턴을 부여하는 브롬 라벨의 도입을 포함한다. 상기 브롬 라벨은 예를 들어 화합물 E 에 p-브로모페닐 이소티오시아네이트를 첨가하여 TAG 가 브롬 원자를 포함하는 구조 F 의 화합물을 생성하여 첨가될 수 있다. 탄수화물의 질량-분광측정법에서 브롬-함유 라벨의 유용성은 예를 들어 [Li et al., 2003, Rapid. Commun. Mass Spectr., 17: 1462-1466] 에서 기술되었다. 또 다른 예는 질량/전하 분리의 양이온 모드 또는 음이온 모드에서 향상된 검출을 위해 양전하 또는 음전하를 부여하는 분자를 도입하는 것을 포함한다. 또 다른 예는 전기분무, MALDI 또는 질량 분광측정의 실행에서 흔한 이온화의 기타 기법에서 감도 또는 성능을 개선할 수 있는 분자의 도입을 포함한다. 또 다른 예는 질량-분광측정에 의해 표지화된 종 류의 정량을 허용하는 안정성 동위원소-표지화 분자의 도입을 포함한다. 동위원소 표지화의 유용한 방법은, 예를 들어 [Tao et al., 2003, Current Opinion in Biotechnology, 14:110-118] 에서 재검토된다.
당이 질량 분광측정법 TAG 에 결합되면, 태깅된 당 (F 또는 G 또는 I 또는 J, 도 1) 이 질량 분광측정법에 의해 검출될 수 있다. 질량 분광측정법은 (예컨대 도 1 의 화합물 F 또는 I 에 대해) 고체 지지체 상에 여전히 고정화된 당에서 수행될 수 있지만, 바람직하게는 용액으로 방출된 당에서, 예를 들어 (예를 들어 도 1 의 화합물 G 또는 J 에 대한) 절단가능 링커의 절단에 의해 수행된다. 따라서, 링커가 절단가능 링커인 것이 바람직하다. 당업자는 질량 분광측정법 TAG 의 성질에 따라 적합한 질량 분광측정법을 수행할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 질량 분광측정법에 의해 질량 분광측정법 TAG 에 결합된 당을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
F. 결합 파트너 TAG
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서 TAG 는 제 2 의 결합 파트너와 특이적 상호작용을 할 수 있는 제 1 의 결합 파트너이며, 여기서 상기 제 1 결합 파트너는 X-TAG 구조의 시약과의 반응을 통해, 예를 들어 화합물 E (또는 화합물 H) 에 첨가되며, 여기서 X 는 질소-반응성 관능기 (예를 들어 "유도체화제") 이다. 제 2 의 결합 파트너는 바람직하게 검출가능한 라벨, 예컨대 염료, 형광 라벨, 방사성 동위원소, 중금속 또는 효소로 표지화된다. 제 1 의 결합 파트너는 예를 들어 화학량적으로 또는 증폭 후, 생성되는 고정화된 리간드의 검출에 유용한 단백 질에 대한 리간드인 분자일 수 있다. 제 1 의 결합 파트너는 또한 단백질일 수 있으며, 제 2 의 결합 파트너는 상기 단백질에 대한 리간드일 수 있다.
결합 파트너의 예는 ELISA 검정에서의 흔한 용도의 리간드-단백질 쌍을 포함한다. 예를 들어, 화합물 E 는 바이오티닐화 시약과 반응시키고, 세척 후, 검출가능한 라벨, 예컨대 형광 TAG, 방사성 동위원소 또는 중금속으로 직접 표지화된 스트렙트아비딘 (또는 기타 아비딘), 또는 분광측정법에 의해 검출될 수 있는 신호의 생성을 초래하는 화학 반응을 촉매화할 수 있는 호스래디쉬 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase) 와 같은 효소에 접합되는 스트렙트아비딘 (또는 기타 아비딘) 으로 지금 고정화된 바이오틴을 검출할 수 있다.
결합 파트너의 기타 예는 항체-에피토프 (epitope) 쌍이다. 따라서, 하나의 결합 파트너는 에피토프를 포함하고 다른 결합 파트너는 높은 친화도로 상기 에피토프를 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 상기 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
F. 핵산 TAG
본 발명의 또 다른 구현예에서 TAG 는 핵산이다. 본 발명에 따른 핵산은 임의의 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA, 또는 그의 유사체 얘컨대 LNA, PNA, HNA 등일 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 DNA, 바람직하게 DNA 올리고머이다. 바람직하게는, 상기 DNA 는 질소 반응성 관응기, 예컨대 본원 상기 "TAG 첨가" 섹션에 언급된 임의의 질소-반응성 관능기이다. 상기 핵산 TAG 의 서열은 공지되거나 적어도 부분적으로 공지된 것이 바람직하며, 이는 당업자가 표준 방법을 사용하여 상기 TAG 를 쉽게 검출할 수 있게 한다.
핵산 TAG 는 임의의 바람직한 길이일 수 있으며, 바람직하게는 적어도 특이적 검출을 허용할 길이이다. 따라서, 바람직하게 핵산은 6 개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 10 개 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 10 내지 5000 개 범위의 뉴클레오티드 길이이다.
질소-반응성 핵산 TAG 의 당으로의 첨가 후, DNA 올리고머와 같은 핵산은 그의 상보성 핵산 또는 본질적으로 상보성 핵산으로의 혼성화에 의해 고체 지지체 상에서 직접 검출될 수 있다. 본질적으로 상보성인 핵산은 예를 들어 [Sambrook et al., 1989, in "Molecular Cloning/A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor] 에 기술된 엄격한 조건 하에서 주어진 핵산과 혼성화할 수 있는 핵산을 의미한다. 바람직하게는, 상기 상보성 핵산은 검출가능한 라벨에 결합할 수 있다. 상기 검출가능한 라벨은 형광 라벨 또는 동위원소 또는 효소, 바람직하게는 형광 라벨일 수 있다. 따라서, 핵산 TAG 는 예를 들어 그의 상보성 형광-표지화된 DNA 와의 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 핵산 TAG 는 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 또는 연결효소 (ligase) 사슬 반응과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 증폭될 수 있다. 따라서, 고정화된 핵산 TAG 에 PCR 반응을 수행하여 고정화 DNA 올리고머를 증폭시킬 수 있으며, 이는 PCR 에서의 정량을 위한 널리 공지된 다양한 기법에 의해 용액 중 측정될 수 있다. 상기 방법은 고체 지지체 상에 존재하는 당CH-NH-링커-스페이서-고체의 매우 소량의 간접적 검출 및 정량화에서 특히 가치가 있다. 대안적으로, DNA 에 결합된 당은 링커의 절단에 의해 용액으로 유리될 수 있으며, 이후, 예를 들어 PCR 에 의해 용액 중 증폭되거나, 본질적으로 상보성인 핵산과의 특이적 혼성화에 의해 용액 중 검출될 수 있다.
E→F 테더
본 발명에 따른 유도체화제는 또한 2 개 이상의 관능기에 커플링된 테터일 수 있다. 상기 2관능성 시약은 일반적으로 X-테더-Y 또는 X-테더-YP 구조일 수 있으며, 여기서 X 는 질소-반응성 관능기이며 Y 는 제 2 의 반응성 관능기이며, YP 는 잠재적 반응성 관능기 또는 보호된 반응기 Y 이다. 화합물 E 와 X-테더-Y (또는 X-테더-Yp) 의 반응 생성물은 예를 들어 도 1 의 화합물 H 의 일반 구조를 가질 수 있다. 제 2 의 반응성 관능기 Y 는 고체상 합성에서의 용도의 임의의 유형의 시약에 반응성일 수 있다. 예를 들어, 당CH-NH-링커-스페이서-고체에서 N 은 2관응성 시약 (X-테더-Y) 와 반응할 수 있으며, 여기서 하나의 관능기는 고정화된 질소 (질소 반응성 관응기 X) 와 결합을 형성하여 반응하며, 다른 관능기는 제 2 의 반응성 관능기 Y 이거나, 또는 (예를 들어, 탈차폐 (unmasking), 탈보호 또는 추가의 반응에 의해) 제 2 의 반응성 관능기 Y 로 전환 될 수 있다.
테더는 임의의 유용한 테더, 예를 들어 알킬, 알케닐 또는 알키닐 (이는 선형, 분지형 또는 환형일 수 있음), 아릴 또는 헤테로원자로 치환되거나 에틸렌글리콜기 (-CH2CH2-O-) 또는 아미드 결합 (NC(O)R) 을 포함하는 임의의 상술된 것 및 그의 유도체일 수 있다.
제 2 의 관능성 반응기 Y 는 예를 들어 티올, 카르복실기, 활성화 카르복실 기, 디술피드, 활성화 디술피드, 알킬화제, 알켄, 알킨, 알데하이드, 케톤 및 아지드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 알킬화제는 예를 들어 알킬 할리드 또는 알파-할로 카르보닐기일 수 있다. YP 는 예를 들어 임의의 상술된 Y 기의 보호된 유도체 또는 보호된 아민일 수 있다. 따라서, YP 는 예를 들어 보호된 아민, 보호된 티올, 보호된 카르복실기, 보호된 알데하이드 및 보호된 케톤으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보호된 반응기는 본원에서 YP 로 칭하며, 여기서 YP 는 탈보호되어 관응성 반응기 Y 를 수득할 수 있다. 유용한 보호기는 특히 카르보닐기 (Chanpter 4, pp. 293 - 368), 카르복실기 (chapter 5, pp. 369 453-), 티올 (chapter 6, pp. 454 - 493) 및 아미노기 (chapter 7, pp. 494 - 653) 에 대해, [Greene et al., 1999, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3rd. Ed., John Wiley and Sons, New York] 에서 찾을 수 있다. 보호된 아민의 예는 Fmoc, Boc, Alloc, p-니트로벤질옥시카르보닐, 트리틸 및 치환된 트리틸, o-니트로벤질옥시카르보닐, N-술페닐 또는 아지도와 같은 고체상 펩티드 합성에서 흔한 용도의 것을 포함하나 그에 제한되지는 않는다. 그러나, 제 2 의 반응성 관능기는 고체상에서 반응하도록 만들어진 임의의 관능기 Y, 또는 보호된 관능기 (YP), 얘컨대 고체상 합성 및 고체 지지체 및 표면으로의 소분자의 커플링 분야에서 널리 공지된 예일 수 있다. 이후, 상기 관능화된 기는 직접 또는 반응성 부류로의 탈보호 후, 제 2 의 관능기 Y 와 반응할 수 있는 관능기 (Z) 를 포함하는 제 2 의 유도체화제를 포착할 수 있다.
화합물 H 의 Y 가 NH2 기를 포함하거나, 탈보호 후 NH2 기를 포함할 수 있도록 만들어질 수 있으면, E-에서-F 에 기술된 임의의 아민 반응성 시약 (예를 들어, 이소티오시아네이트) 이 사용되어 TAG 를 첨가하여 일반 구조 I 의 화합물 (도 1) 을 생성할 수 있다.
화합물 H (도 1) 에서의 임의의 관능기 Y 과 반응하도록 된 제 2 의 유도체화제는 예를 들어 분광성 TAG 또는 상기 E→F 섹션에 언급된 임의의 TAG 일 수 있으며, 질소 반응기 대신 상기 TAG 는 Y 와 반응할 수 있는 관능기 (Z) 으로 유도체화될 수 있거나 이를 포함한다. 상기는 소분자 예컨대 약물, 이미지화제, 펩티드, 단백질, 효소 및 생물학적 활성을 나타내는 기타 분자, DNA 또는 RNA 와 같은 핵산일 수 있다.
상기 소분자, 이미지화제, 펩티드 또는 핵산은 바람직하게 주어진 제 2 의 관능성 반응기 Y 와 반응할 수 있는 관능기 Z 을 포함하거나 이에 결합된다. 당업자는 유용한 관능기 Y 및 Z 을 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 제 2 의 유도체화제는 또한 상기에 "분광학적 특성을 갖는 TAG", "질량 분광측정법 TAG", "결합 파트너 TAG" 및 "핵산 TAG" 섹션에 기술된 임의의 상술된 TAG 일 수 있으며, 여기서 질소 반응성 관능기 대신의 상기 TAG 는 관능기 Y 와 반응할 수 있는 관능기 Z 을 포함한다. H (도 1) 에서 테더에 결합된 관능기는 화학적 또는 효소적 반응에 의해 Y 로 전환된 후, 상술된 바와 같이 추가적으로 반응할 수 있는, 잠재 또는 보호기 (YP) 일 수 있다. 상기 잠재기가 1차 또는 2차 아민 (즉, Y 는 -NH2 또는 -NH- 구조를 포함할 것임) 으로 전환될 수 있으면, 상기 E→F 에 기술된 임의의 아민-반응성 부류가 첨가되어 일반 구조 I 의 태깅된 화합물을 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
vii. 반응성 당의 -NH- 기를, X-테더-Y 또는 X-테더-YP 구조 (여기서 X 는 질소-반응성 관능기이며 Y 는 제 2 의 반응성 관능기이며 YP 는 반응성 관능기 Y 로 탈보호되거나 전환될 수 있는 잠재 관능기임) 의 2관능성 시약과 반응시켜, 상기 테더-Y 또는 상기 테더-YP 에 공유결합된 당을 수득함.
상기 단계는 바람직하게 출발 물질로서 도 1 의 화합물 E 를 사용하여 수행된다. 따라서, 상기 단계를 예를 들어 도 1 의 일반 구조 H 의 화합물을 생성할 수 있다.
2관응성 시약이 X-테더-YP 구조인 본 발명의 구현예에서, 바람직하게는, 방법은 추가로 YP 를 전환 또는 탈보호시켜 반응성 관능기 Y 를 수득하는 단계를 포함한다. 상기 단계는 X 를 -NH- 와 반응시키기 전 또는 후에 수행될 수 있으며, 바람직하게는 X 를 -NH- 와 반응시킨 후에 수행된다.
추가적으로, 본 발명의 방법은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다.
vii. Y 와 반응할 수 있는 관능기 (Z) 을 포함하는 제 2 의 유도체화제를 제공함,
ix. 관능기 Z 및 Y 을 반응시켜, 테더 및 제 1 의 유도체화제를 통해 당에 제 2 의 유도체화제를 공유결합시킴.
대안적으로, 본 발명의 방법은 추가적으로 하기 단계를 포함할 수 있다:
viii. 진핵 세포, 원핵 세포, 미생물, 마이셀, 파지, 비라 (vira) 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 입자를 제공함 (여기서 입자는 Y 와 반응할 수 있는 관응기 (Z) 을 포함함).
ix. 관능기 Z 및 Y 를 반응시켜, 테터 및 유도체화제를 통해 당에 입자를 공유결합시킴.
따라서, 단계 ix 는 TAG 이 입자인 도 1 에 나타난 일반 구조 I 의 화합물을 생성할 수 있다. 링커가 절단가능한 링커이면, 방법은 링커를 절단하여, 예를 들어 도 1 의 일반 구조 J 의 화합물을 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
당CH-NH-링커-스페이서-고체 (예를 들어, 도 1 의 화합물 E) 와 2관능성 시약 X-테더-Y 의 반응 생성물은, 예를 들어 일반 구조 H 를 가지며, 분자보다 큰 조립체에 공유 결합을 형성할 수 있는 추가의 반응기를 포함하거나 포함하게 할 수 있다: 예를 들어, 박테리아, 파지, 효모, 마이셀, 바이러스, 나노입자 또는 진핵 또는 원핵 세포. 이후, 링커의 절단은 화학식 당CH-N(조립체)-링커의 부류를 생성하여, 조립체에 당을 효과적으로 추가한다. 따라서, 당은 원칙적으로 고체 지지체에서 조립체로 이동할 수 있다.
효소 처리
고체 지지체가 생물친화성인 경우, 즉, 효소와 같은 생물학적 마크로분자와 의 접촉을, 그의 활성을 현저히 변화시키지 않고 허용하는 경우, 고정화 당 분자는 그의 구조를 변화시킬 효소에 의해 작용할 수 있다. 고정화 당 분자는 예를 들어 임의의 도 1 의 일반 구조 C, Cred, D, E, F, H 또는 I 의 화합물일 수 있다.
생물친화성 고체 지지체의 비제한적인 예는 유리, PEGA, SPOCC 또는 폴리사카리드 젤을 포함한다. 본 구현예 내에서 링커는 비교적 긴 것이 바람직하며, 이에 따라 링커는 2 개 이상의 원자, 바람직하게는 6 개 이상을 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 6 개 이상의 원자의 사슬을 포함하며, 예를 들어 링커 내의 가장 긴 원자의 사슬은 6 개 이상의 원자 길이, 예컨대 6 내지 1000 개 범위의 원자 길이이다. 링커가 친수성인 것 또한 바람직하다.
도 1 의 화합물 G 또는 J 와 같은, 절단가능 링커의 절단에 의해 용액으로 방출된 당을, 효소와 같은 생물학적 마크로분자와 접촉시키는 것 또한 가능하다.
효소는 탄수화물에 작용할 수 있는 임의의 부류, 예를 들어 글리코시다제, 글리코실트랜스퍼라제, 및 아실화, 인산화, 황산화 또는 산화에 의해 알코올기를 개질시킬 수 있는 효소에 속할 수 있다. 대안적으로, 당이 이미 -OH 기에 치환된 경우 (예컨대 아실화, 인산화 또는 황산화), 디아실라제, 포스파타제 및 술파타제는 그의 구조를 변경시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 추가로 당 (예를 들어 도 1 의 임의의 화합물 C, Cred, D, E, F, G, H, I 또는 J) 을, 글리코실트랜스퍼라제, 술파타제, 포스포릴라제, 술포트랜스퍼라제, 포스포트랜스퍼라제, 글리코신타제 및 트랜스글리코시다제의 부류로부터 선택되는 하나 이상의 효소와 접 촉시켜, 상기 당을 새로운 구조로 전환시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 방법은 추가로 당 (예를 들어 도 1 의 임의의 화합물 C, Cred, D, E, F, G, H, I 또는 J) 을, 하나 이상의 글리코시다제와 접촉시켜, 새로운 환원 당을 생성하는 단계를 포함한다 (단, 제 1 의 당이 상기 글리코시다제(들) 에 대한 기질임).
예는 당의 길이를, 하나의 모노사카리드 잔기만큼 감소시키는, 여전히 자유 -NH2 기를 포함하는 비-캡핑 당-C=N-링커-스페이서-고체 (예를 들어, 도 1 의 화합물 C) 와 엑소글리코시다제의 인큐베이션을 포함할 것이다. 이러한 모노사카리드 잔기의 절단은 1개의 당 단위가 짧은 고체 지지체에 결합되는 올리고사카리드를 남기며, 도 1 의 일반 구조 B 이고체 지지체와 같은, 동일 또는 상이한 고체 지지체에 의해 포착될 수 있는 환원 당을 생성하며, 이후 이에 상기 B 내지 J 에 기술된 임의의 조작이 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다:
a) 탄수화물에 작용할 수 있는 하나 이상의 효소를 제공함
b) 상기 하나 이상의 효소와 당을 접촉시킴.
상기 단계는 방법 동안 임의의 주어진 시간에 수행될 수 있다. 효소는 본 섹션에 기술된 임의의 효소일 수 있다.
특정 구현예에서 효소는 글리코시다제이며, 본원 상기 요약 섹션에 기술된 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
iii.a) 탄수화물에 작용할 수 있는 하나 이상의 글리코시드를 제공함.
iii.b) 상기 하나 이상의 글리코시다제를 당과 접촉시켜, 새로운 환원 당을 생성함 (단, 제 1 의 당은 상기 글리코시다제(들)에 대한 기질임).
iii.c) 고체 지지체 상에 새로 생성된 환원 당(들)을 고정화시킴.
단계 iii.a-iii.c 는 본원 상기의 "본 발명의 요약" 섹션에 약술된 방법의 단계 iii 에 따라 수행될 수 있다. 그러나, 단계 iii.a 내지 iii.c 는 또한 상기 방법의 임의의 iv, v, vi 또는 vii 단계에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 단계 iii.a-iii.c 는 도 1 의 C, Cred, D, E, F, H 또는 I 구조에 의해 예시된 임의의 고정화 당에서 수행될 수 있다.
특히, 상기 새로 생성된 환원 당은 동일 고체 지지체 또는 다른 고체 지지체 상의 자유 NH2 기에 고정화될 수 있다. 상기 기타 고체 지지체는 예를 들어 비치환 또는 고정화된 참조 표준을 지닐 수 있다. 상기 기타 고체 지지체가 본원 상기에 기술된 고체 지지체이며, 고체 지지체는 (임의로 스페이서를 통해) 링커에 결합되고, 여기서 상기 링커는 포착기를 포함하는 것이 바람직하다 (본원 상기의 링커, 포착기 및 스페이서의 상세한 설명 참조).
특별한 가치는 구조적 자료 수득의 목적을 위한, 글리코시다제 생성물의 환원 및 형광 표지화 및 동일 또는 상이한 고체 지지체 상에 유리된 모노사카리드이다. 특정 예는 B 구조의 NH2-링커-스페이서-고체 (도 1) 상의 Gal-GlcNAc-Gal-Glc (락토-N-테트라오스, LNT) 의 포착, 포착 및 고정화 LNT (예를 들어, 도 1 의 구조 C 의 화합물의 예) 와 베타-갈락토시다제의 배양 후, 동일 고체 지지체 (C) 상에 유리된 갈락토스의 포착이 미반응 Gal-GlcNAc-Gal-GlcC=N-링커-스페이서-고체 및 GlcNAc-Gal-GlcC=N-링커-스페이서-고체 및 Gal-C=N-링커-스페이서-고체의 반응 생성물을 수득하는 것을 포함한다. 캡핑, 환원, TRITC 로의 형광 태깅 및 절단은 상기 단계 F→G 에서 기술된 고체를 형성한 후, 공지된 표준과 트리사카리드 및 모노사카리드 생성물의 공동-이동에 의해, 고정화 NLT 가 말단 베타-갈락토스 잔기를 갖는 것을 확인하도록 한다.
다수의 유용한 글리코시다제가 당업계에 기술되며, 예를 들어 US5,100,778 또는 WO92/19974 에 기술된 임의의 글리코시다제가 본 발명에 사용될 수 있다.
고체 지지체가 생물친화성인 경우, 당-C=N-링커-스페이서-고체 (예를 들어 도 1 의 화합물 C) 에서 미반응된 -NH2 기는 (예를 들어, 상기 C→D 에서 기술된 무수 아세트산으로) 캡핑된 후, 탄수화물-활성 효소에 노출되거나, 추가로 (상기 D→E 섹션에 기술된 바와 같은) 당CH-NH-링커-스페이서-고체로 환원된 후, 탄수화물-활성 효소에 노출될 수 있다. 대안적으로, 도 1 의 화합물 C 는 Cred 로 환원된 후, 탄수화물 활성 효소에 노출될 수 있다. 당CH-NH-링커-스페이서-고체 (예를 들어, 화합물 E, 도 1) 은 추가로 (본원 상기의 E→F 섹션에 기술된 바와 같이) 태깅되어 당CH-N(TAG)-링커-스페이서-고체 (예를 들어, 화합물 F, 도 1) 을 생성한 후, 탄수화물-활성 효소에 노출될 수 있다. 임의의 상기 방법에서, 고체 지지체게 결합된 채로 있는 효소 반응의 생성물은 추가의 분석을 위해, 본 발명의 방법 에 따라 추가로 조작되거나 링커에서 반응에 의해 절단될 수 있다. 고정화 당의 절편의 절단을 초래하는 효소 반응의 임의의 생성물은 용액 중 나타날 것이며, 여기서 이는 분석 화학의 확립된 기법을 사용하여 추가적으로 조사되거나, 그 자체가 환원 당인 경우, 도 1 에서 일반 당에 대해 기술된 조작이 수행될 수 있다.
개개의 당은 모세관식 기체 크로마토그래피 (GC), 마이크로컬럼 인공 유체 크로마토그래피 (SFC), 마이크로컬럼 액체 크로마토그래피 (LC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 고성능 모세관 전기영동 (HPCE), 이온-교환 크로마토그래피 또는 질량-분광측정법에 의해 검출될 수 있다. 개개의 당의 검출은 용액 중 또는 고체 상에서 유도체화제로 표지화 전 또는 후에 수행될 수 있다.
검출제
본 발명의 일 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
viii. 당을, 상기 당과 회합될 수 있는 검출제와 접촉시킴
ix. 검출제의 검출
바람직하게는, 상기 당은 본원 상기에 기술된 고체 지지체 상에 고정화되며, 이에 따라, 예를 들어 도 1 의 일반 구조 C, Cred, D, E, F, H 또는 I 의 화합물이 상기 검출제와 접촉시켜질 수 있다. 또한 상기 당이 절단가능 링커의 절단에 의해 고체 지지체로부터 유리되는 것이 가능하며, 이에 따라 일반 구조 G 또는 J 의 화합물 또한 상기 검출제와 접촉시켜질 수 있다.
검출제는 상기 당과 회합될 수 있는 임의의 작용제일 수 있다. 바람직한 검출제는 임의의 기타 화합물보다 훨씬 높은 친화도를 갖는 당과 회합할 수 있는 화합물, 예컨대 임의의 기타 화합물보다 2-배 이상, 예컨대 5-배 이상 높은 당에 대한 친화도를 갖는 화합물이다.
추가로, 상기 검출제가 당업자에게 공지된 방법에 의해 직접 또는 간접적으로 검출가능한 것이 바람직하다. 예를 들어, 검출제는 그 자체가 예를 들어 형광 또는 착색 화합물일 수 있다. 검출제는 또한 용이한 검출 방법이 이용가능한 화합물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 검출제는 아릴 보로네이트 또는 헤테로아릴 보로네이트를 포함하며, 여기서 아릴 부분은 분광학적 활성 기 예컨대 형광 TAG 또는 본원 상기에서 "F. 분광학적 특성을 갖는 TAG" 섹션에 기술된 임의의 기타 검출가능한 TAG 로 치환된다.
또 다른 구현예에서, 검출제는 폴리펩티드, 바람직하게는 렉틴, 셀렉틴 및 기타 탄수화물 결합 단백질, 독소, 수용체, 항체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드이다. 검출제가 폴리펩티드인 경우, 상기 폴리펩티드는 검출가능한 라벨, 예컨대 효소 또는 형광 화합물에 결합될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 항체 또는 유사한 고(高)-친화도 화합물의 도움으로 검출될 수 있다.
하기는 본 발명의 예시적인 실시예이며, 본 발명을 제한하는 것으로 여겨지지 않아야 한다. 문백으로부터 달리 명시되지 않는 한, 대문자, A, B, C, Cred, D, E, F, G, H, I 및 J 는 도 1 에 나타난 일반 구조를 칭한다.
실험예
1. A 의 실시예 : 본 작업에서 사용된 환원 당
고체 지지체 B 에 의해 포착된 환원 당의 구조는 도 2 에 나타나 있다. 상기는 모노사카리드 D-GLC (1) 및 D-Gal (2), 디사카리드 N-아세틸락토사민 (LacNAc, 3), 트리사카리드 말토트리오스 (말토트리오스 G3, 4) 및 테트라사카리드 락토-N-테트라오스 (LNT, 5) 를 포함하였다. 시료 6 및 7 은 Fuc:Man:GalNAc 모노사카리드의 혼합물을 각각 2:3:1 및 1:3:2 의 비율로 포함하였다. 시료 8 은 Gal (2) 및 LNT (5) 의 1:1 혼합물을 포함하였다. 시료 9 는 말토비오스 (G2), 말토트리오스 (G3), 말토테트라오스 (G4), 말토펜토스 (G5), 말토헥사오스 (G6) 및 말토헵타오스 (G7) 의 대략의 등몰 혼합물을 포함하였다. 시료 10 은 PNGase F (제품 번호 1365177, Boehringer Mannheim GmbH, Germany) 의 작용에 의해 리보뉴클레아제 B (Sigma) 로부터 유리된 N-결합 올리고사카리드로 이루어졌다.
2. 링커, 스페이서 및 태깅된-당 참조 표준
2.1 링커 및 스페이서
절단가능 링커의 합성 및 스페이서의 구조는 도 3 에 나타나 있으며 하기에 기술된다.
12: N- Fmoc -4- 아미노옥시메틸 -벤조산
4-아미노옥시메틸-벤조산, 디옥산 (20 mL) 중 히드로클로리드 11 1 (2.0 g, 0.010 mol) 및 반-포화된 Na2CO3 용액 (20 mL) 에 Fmoc-Cl (2.8 g, 0.011 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 2 h 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 (100 mL) 를 첨가하고 수성상의 pH 를 HCl(농축) 의 조심스러운 첨가에 의해 1-3 으로 조절하였다. 혼합물을 분리 깔때기에 붓고 유기상을 단리하고, 물 (100 mL) 로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 용매를 로타뱁 (rotavap) 상에서 제거하여, 방치 시 고형화되는 오일을 수득하였다. 미정제 생성물은 속성 컬럼 크로마토그래피 (페트롤륨 에테르, 에틸 아세테이트, AcOH 60:40:1) 로 정제하였다. 수율: 3.5 g (92%)
Figure 112007058255747-pct00001
13: t-부틸 브로모아세테이트와 N- Fmoc -4- 아미노옥시메틸 -벤조산 (12) 과의 반응
N-Fmoc-4-아미노옥시메틸-벤조산 (12) (1.0 g, 2.57 mmol) 을 DMF (15 mL) 에 용해시킨 후, 및 Cs2CO3 (0.42 g, 1.28 mmol, Aldrich) 에 첨가한 후, rt 에서 5 min 동안 교반하였다. tert-부틸 브로모아세테이트 (0.55 g, 2.28 mmol, Fluka) 를 첨가하고 혼합물을 30 min 동안 50℃ 로 가열한 후, 다시 rt 로 냉각시켰다. CH2Cl2 (70 mL) 를 첨가하고 혼합물을 분리 깔때기에 붓고 반-포화 NaHCO3 용액 (3 x 50 mL) 으로 세척한 후, 물 (2 x 50 mL) 로 세척하고, MgSO4 상에서 건조하였다. 용매를 감압 하에서 제거하여 미정제 생성물을 오일로 수득하였다. 속성 컬럼 크로마토그래피 (페트롤륨 에테르 중 20-40% 에틸 아세테이트) 후, 백색 고체를 1.15 g (89%) 의 수율로 수득하였다.
Figure 112007058255747-pct00002
1물질은 이전에 기술된 바와 같이 제조하였다: Deles,J. et al.; PJCHDQ; Pol. J. Chem.; EN; 53; 1979; 1025-1032
14: 링커의 제조
이전의 실험에서 수득된 백색 고체 13 (1.15 g) 을, CH2Cl2 중 CF3CO2H 의 50% 용액 (30 mL) 에서 3 h 동안 교반하고 건조될 때까지 증발시켰다. 유성 잔기는 소량의 에틸 아세테이트에 녹이고, 생성물은 용액에 헥산을 서서히 첨가하여 미세한 백색 분말로 침전시켰다. 생성물을 여과하고 헥산으로 수회 세척하고 진공 하에서 건조하여 목적 생성물을 거의 정량적 수율 (1.0 g, 98%) 로 수득하였다.
Figure 112007058255747-pct00003
2.2 일반 구조 G 의 테트라메틸로다민 ( TMR )-태깅된 모노사카리드 표준의 합성
8 개의 모노사카리드 D-Glc, D-Gal, D-Man, D-Xyl, D-GlcNAc, D-GalNAc, L-Fuc 및 D-GlcA 를 사용하였다. 일반적인 합성 도식은 D-Gal 에 대해 도 4 에 나타나 있으며, 생성물 21 의 구조는 도 4 에 나타나 있으며, 나타난 바와 같이 GalCH2-N(R)-TMR 로 약칭한다. 8 개 모두의 당CH2-N(R)-TMR 모노사카리드 유도체의 구조는 도 5 에 나타난 바와 같이 제조하였다.
16: 벤질브로미드와 N- Fmoc -4- 아미노옥시메틸 -벤조산 (12) 과의 반응
N-Fmoc-4-아미노옥시메틸-벤조산 (12, 2.0 g, 5.14 mmol) 을 DMF (30 mL) 에 용해시키고, Cs2CO3 (0.84 g, 2.57 mmol) 을 첨가한 후, 5 min 동안 rt 에서 교반하였다. 벤질 브로미드 (1.05 g, 6.17 mmol) 를 첨가하고 혼합물을 다시 30 min 동안 rt 에서 교반하도록 하였다. 물 (200 mL) 첨가하고 혼합물을 CH2Cl2 (2 x 100 ml) 로 추출하였다. 혼합된 유기상을 물 (3 x 50 mL) 로 세척하고 MgSO4 상에서 건조하고, 건조되지까지 증발시켜 다음 실험에서 추가의 특성화 없이 사용된 오일을 수득하였다.
17: 벤질-(N- Fmoc -4- 아미노옥시메틸 )- 벤조에이트로부터 Fmoc -기의 제거
이전의 실험에서 수득된 미정제 생성물 (16) 을 DMF (20 mL) 중 20% 피페리딘과 함께 1 min 동안 교반하고 실리카 겔의 층을 통과시켜 흡입에 의해 대부분의 DMF 및 피페리딘을 제거하였다. 생성물을 에틸 아세테이트 및 페트롤륨 에테르 (1:1) 의 혼합물로 실리카 겔의 층으로부터 용출시키고 로타뱁 상에서 농축시켰다. 추가의 정제는 속성 컬럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트, 페트롤륨 에테르 1:1) 로 달성하여 1.16 g (88%, 2 단계) 의 수율의 투명 오일을 수득하였다.
Figure 112007058255747-pct00004
갈락토스 표준의 제조에 의해 예시되는 TMR 표지화된 모노사카리드 표준의 제조를 위한 일반적인 방법
18: 갈락토스 및 벤질-(4- 아미노옥시메틸 )- 벤조에이트 사이의 옥심 형성
갈락토스 (90 mg, 0.50 mmol) 를 DMSO 및 AcOH (7:3, 3 mL) 의 혼합물에 용해시키고 (17, 128 mg, 0.50 mmol) 를 첨가하였다. 혼합물을 55℃ 에서 3 h 동 안 가열하고 물 (30 mL) 에 붓고 빙냉조에서 냉각시켜 생성물의 미세한 백색 결정으로의 결정화를 초래하였다. 생성물을 여과로 단리하고, 물 (2 x 10 mL) 로 세척하고 진공 하에서 건조하여 170 mg (83%) 의 생성물을 단일의 이성질체로 수득하였다.
Figure 112007058255747-pct00005
19: BH 3 -피리딘으로의 "갈락토스- 옥심 " (18) 의 환원
이전의 실험에서 수득된 옥심 (18, 150 mg, 0.36 mmol) 을 메탄올 (10 mL) 에 용해시켰다. BH3-피리딘 (225 μL, 피리딘 중 8 M 용액, 1.80 mmol, Fluka) 및 CCl3CO2H (0.50 mL, 50% 수용액) 을 첨가하고 혼합물을 rt 에서 1 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 Na2CO3 (20 mL) 의 반-포화 용액에 조심스럽게 붓고, 에테르 및 헥산 (2 x 10 ml) 의 1:1 혼합물로 추출하여 과잉의 보란 시약을 제거하였다. pH 는 이제 HCl(농축) 의 조심스러운 첨가에 의해 2-3 으로 조절하고 부피는 로토뱁 상에서 원래의 절반으로 감소시켰다. 증발 동안 생성물은 양호한 백색의 결정성 고체로 분리되었고, 이는 물 (2 x 10 mL), 에테르 (2 x 10 mL) 로 세척 하고, 마지막으로 생성물을 진공 하에서 건조하여 112 mg (75%) 의 순수한 생성물을 수득하였다.
Figure 112007058255747-pct00006
20: TRITC 를 사용한 환원 생성물 (19) 의 표지화
이전의 실험에서 제조된 소량의 생성물 (19, 4.2 mg, 10 μmol) 을 DMF (1 mL) 에 용해시키고 TRITC (4.4 mg, 10 μmol) 를 첨가하였다. 1 h 동안 교반 후, 물 (10 mL) 을 첨가하고 침전된 생성물은 HCl(농축) 의 첨가에 의해 재용해시키고, 투명한 적색 용액을 작은 C-18 Sep-Pak 컬럼에 적용하여 생성물을 결합시켰다. 컬럼을 물 (총 부피 30 mL) 로 수회 흘려낸 후, 메탄올 (5 mL) 로 생성물을 방출시켰다. 부피는 약 0.5 mL 로 감소하였고, 물질은 CH2Cl2, 메탄올, 물, AcOH (70:20:9:1) 의 혼합물로 실리카 겔 상에서 속성 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 화합물의 실체는 MS 에 의해 확인하였고 다음 실험에서 직접 사용하였다. MS (MALDI-TOF) m/z = 865 (MH+).
21. 최종 표준을 수득하기 위한 에스테르 보호기의 가수분해
이전의 실험에서 수득된 모든 물질 (20) 을, 1 M LiOH (1 mL) 에서 용해시키고 30 min 동안 교반한 후, 물 (10 mL) 의 첨가 및 HCl(농축) 은 투명한 적색 용액을 제공하였다. 생성물은 작은 C-18 Sep-Pak 컬럼 상에서 물 (총 부피 30 mL) 로의 반복적 세척에 의해 탈염시킨 후, 메탄올 (5 mL) 로 생성물을 방출시켰다. 부피는 약 0.5 mL 로 감소하였고 생성물은 클로로포름, 메탄올, 물 (120:85:20) 의 혼합물로 실리카 겔 상에서 속성 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 화합물의 실체는 고해상도 MS 로 확인하였고, 그의 순도는 CE 를 사용하여 분석하였다. HRMS (ES) 계산치 (C39H43N4O11S): 775.2649 실측치: 775.2700
나머지 모노사카리드 (글루코스, 만노스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 자일로스, 푸코스 및 글루쿠론산) 의 표준은 유사한 수율 및 순도로, 갈락토스에 대해 기술된 동일한 프로토콜을 사용하여 제조하였다. 화합물의 실체는 마찬가지로 고해상도 질량 분광측정법에 의해 확인하였다 (하기 표 참조). 각 화합물은 CE 에서 단일 피크를 제공하였고, 8 개 모두의 화합물 (21-28) 은 CE 에서 분석될 수 있다 (도 10).
Figure 112007058255747-pct00007
3. B 의 실시예 : 고체 지지체의 제조 및 명명법
일반 구조 B (도 1) 의 고체 지지체는 PEGA 수지 (PEGA 1900, Versamatrix A/S) 및 제어된-기공 유리 (CPG) 를 사용하여 제조하였다. B p 는 링커가 스페이서 없이 시판되는 수지 상의 아미노기에 직접 결함되는 PEGA 수지를 나타낸다. B 0 , B 1 및 B 2 는 링커가 각각 0, 1 및 2 스페이서를 통해 아미노프로필화 유리 (AMP-CPG, CPG-Biotech) 에 결합된 CPG 를 나타낸다. 4 개의 고체 지지체의 구조는 도 6 에 나타나 있다.
3.1 B p (일반 구조 B 의 PEGA 수지)
메탄올 중 팽창된 1 g 의 시판되는 PEGA 1900 수지 (아미노기: 0.23 mmol/g) 를 DMF 로 반복하여 세척하여 메탄올의 완전한 제거를 확실히 하였다. 링커 (14) (308 mg, 0.69 mmol), TBTU (207 mg, 644 mmol) 및 DIPEA (119 mg, 0.92 mmol) 를 DMF (10 mL) 에 혼합하고, 사전-활성화하도록 5 min 동안 방치한 후, 수지에 혼합물을 첨가하였다. 3 h 후, 시약을 흡입으로 제거하고, 수지를 CH2Cl2 (5 x 20 mL) 로 세척하였다.
Kaiser 시험을 위해 소량의 수지를 취하여 링커의 수지로의 성공적인 커플링을 확인하였다. 마찬가지로, 수지 상의 링커의 로딩은 실시예 3.3 에 시술된 바와 같이 측정하였고 표준 커브와 비교하여 약 0.20 mmol/g 인 것으로 밝혀졌다. 히드록실아민 보호기 (Fmoc) 은 이제 DMF (2 min 동안 15 mL 및 18 min 동안 15 mL) 중 20% 피페리딘으로 처리하여 나머지 수지로부터 제거한 후, DMF (5 x 20 mL) 및 CH2Cl2 (7 x 20 mL) 로 철저히 세척하였다. 수지는 고진공 하에서 24 h 동안 건조하여 최종적인 PEGA 수지 (B p ) 를 제공하였으며, 이는 이후 모든 실험에서 사용하였다.
3.2. B 0 , B 1 및 B 2 (제어된 기공 유리, CPG )
B 0 : CPG-NH 2 와 링커 14 의 커플링
AMP CPG (250 mg, 로딩 = 50.1 μmol/g, 0.0125 mmol. Millipore, 제품 번호 AMP1400B) 을 DMF (3 x 2 mL), DMF (3 x 2 mL) 중 50% DIPEA , 및 DMF (3 x 2 mL) 로 세척하였다. 비드는 14 (17 mg, 0.038 mmol), TBTU (12 mg, 0.037 mmol), 및 DMF 중 DIPEA (8.6 μL, 0.05 mmol) 의 혼합물로 밤새 rt 에서 처리하였다. 비드는 DMF (3 x 2 mL), CH2Cl2 (3 x 2 mL) 로 세척하고, 피리딘 중 50% 의 Ac2O 로 15 min 동안 rt 에서 처리하고, CH2Cl2 (3 x 2 mL), DMF (3 x 2 mL), CH2Cl2 (3 x 2 mL) 로 세척하고 건조하였다. 로딩은 B 1 에 대해 기술된 바와 같이 14.2 μmol/g 로 측정하였다. Fmoc 기는 DMF 중 20% 피페리딘을 사용하여 2 x 10 min 동안 rt 에서 제거하고, DMF (3 x 2 mL), CH2Cl2 (3 x 2 mL), 및 에탄올 (3 x 2 mL), 및 CH2Cl2 (3 x 2 mL) 로 세척하였다. 수지를 진공 하에서 건조하였다.
B 1 : 하나의 스페이서 15 및 링커 14 와 CPG - NH 2 의 커플링
AMP CPG (2.26 g, 로딩 = 50.1 μmol/g, 0.11 mmol. Millipore, 제품 번호 AMP1400B) 를 DMF (3x2 mL), DMF (3x2 mL) 중 50% DIPEA, 및 DMF (3x2 mL) 로 세척하였다. 비드를 15 (168 mg, 0.34 mmol), TBTU (105 mg, 0.33 mmol), 및 DMF 중 DIPEA (78 μL, 0.45 mmol) 의 혼합물로 3 h 동안 rt 에서 처리하였다. 수지를 DMF (3 x 5 mL), CH2Cl2 (3 x 5 mL) 로 세척하고, 피리딘 중 50% Ac2O 로 rt 에서 15 min 동안 처리하였다. 비드를 CH2Cl2 (3 x 5 mL), DMF (3 x 5 mL), CH2Cl2 (3 x 5 mL) 로 세척하고, CH2Cl2 중 50% TFA 에서 2 h 동안 rt 에서 처리하였다. CH2Cl2 (3 x 5 mL), DMF (3 x 5 mL), 및 CH2Cl2 (3 x 5 mL) 로 세척하였다. 비드의 1/3 (2.5 mL, ~0.70 g, ~35 μmol) 은 DMF (3 x 5 mL) 로 세척하였다. 14 (47 mg, 0.11 mmol), TBTU (33 mg, 0.10 mmol), 및 DMF 중 DIPEA (34 μL, 0.20 mmol) 로 밤새 rt 에서 처리하였다. 비드는 DMF (3 x 5 mL), CH2Cl2 (3 x 5 mL) 에서 세척하고, 피리딘 중 50% Ac2O 로 rt 에서 15 min 동안 처리하고, CH2Cl2 (3 x 5 mL), DMF (3 x 5 mL), CH2Cl2 (3 x 5 mL) 로 세척하고 건조하였다. 로딩을 측정하고 (29 μmol/g) 비드는 DMF 중 20% 피페리딘으로 2 x 10 min 동안 rt 에서 처리하였다. 비드는 DMF (3x2 mL), CH2Cl2 (3x2 mL), 및 에탄올 (3x2 mL), CH2Cl2 (3x2 mL) 로 세척하고 건조하였다.
B 2 : 2 개의 스페이서 15 및 링커 14 와 CPG - NH 2 의 커플링
B 1 (5.5 mL, ~1.54 g, -77 μmol) 로부터 하나의 스페이서와 수지 2/3 을 DMF (3 x 5 mL) 로 세척하였다. 비드는 DMF 중, 15 (114 mg, 0.23 mmol), TBTU (72 mg, 0.22 mmol), 및 DIPEA (53 μL, 0.31 mmol) 의 혼합물로 밤새 rt 에서 처리하였다. 비드를 DMF (3 x 5 mL), CH2Cl2 (3 x 5 mL) 로 세척하고 피리딘 중 50% Ac2O 로 15 min 동안 rt 에서 처리하고, CH2Cl2 (3 x 5 mL), DMF (3 x 5 mL), CH2Cl2 (3 x 5 mL) 로 세척하고, CH2Cl2 중 50% CF3CO2H 로 rt 에서 2 h 동안 처리하고, CH2Cl2 (3 x 5 mL), DMF (3 x 5 mL), 및 CH2Cl2 (3 x 5 mL) 로 세척하였다. 비드의 양의 절단 (~ 42 μmol) 을 DMF (3 x 5 mL) 로 세척하고 14 (56 mg, 0.13 mmol), TBTU (39 mg, 0.12 mmol), 및 DIPEA (29 μL, 0.17 mmol) 로 밤새 rt 에서 처리하였다. 비드를 DMF (3 x 5 mL), CH2Cl2 (3 x 5 mL) 로 세척하고, 피리딘 중 50% Ac2O 로 rt 에서 15 min 동안 처리하고, CH2Cl2 (3 x 5 mL), DMF (3 x 5 mL), CH2Cl2 (3 x 5 mL) 로 세척하고 건조하였다. 로딩은 B 1 에 대해 기술된 바와 같이 36 μmol/g 로 측정되었다. 수지는 rt 에서 2 x 10 min 동안 DMF 중 20% 피페리딘으로 덮고, DMF (3 x 5 mL), CH2Cl2 (3 x 5 mL), 에탄올 (3 x 5 mL) 3 x CH2Cl2 (3 x 5 mL) 로 세척하고 진공 하에서 건조하였다.
3.3 일반 구조 B 의 고체 지지체 ( 도1 ) 의 포착기의 로딩 평가의 예
DMF 중 20% 피페리딘 중 Fmoc-Gly-OH 의 7 가지 농도 (0.0 mM, 0.1 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1.0 mM, 1.5 mM, 2.0 mM) 를 제조하였다. 방출된 풀벤의 UV 흡광도는 나노드롭 기법 (Saveen Werner Nanodrop, Model: ND-1000, Serial No: 0911) 을 사용하여 290 nm 에서 측정하였다. 흡광도는 0.581 mM- 1 의 기울기를 갖는 선형 커브를 부여하는 농도에 대해 플롯팅하였다.
Fmoc 보호된 B 1 비드 (4.8 mg) 를 MF (200 μL) 중 20% 피페리딘으로 10 min 동안 처리하였다. 290 nm 에서의 UV 흡광도는 0.410 로 측정하고 유리된 풀벤 농도를 계산하였다.
Figure 112007058255747-pct00008
이후, 로딩은 하기를 사용하여 계산하였다:
Figure 112007058255747-pct00009
4. A+B→ C 의 실시예 및 C 의 처리의 예.
4.1 환원 당으로서 글루코스 및 고체 지지체로서 B 2 를 사용하는 포착 조건의 변화
일반 구조 B 의 고체 지지체 상의 환원 당의 포착을 위한 바람직한 조건을 찾기 위해, 다양한 용매, 온도 및 첨가제를 조사하여, C 를 제조하였다. 용액 중 포착되지 않은 Glc 의 양은 Molecular Probes 로부터의 Amplex Red 검정을 사용하여 고감도로 쉽게 평가될 수 있기때문에 D-Glc 을 모델 화합물로 사용하였다. 따라서, 포착된 Glc 의 양은 첨가된 양에서 인큐베이션 후 용액에 남아있는 양을 감한 것을 계산하였다.
15-20 mg 의 비드 (B 2 ) 를 서로 다른 조건 하에서 글루코스의 용액으로 처리하였다. 말단 반응 시간 후 상청액을 제거하고 미반응 글루코스의 양을 Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit (A-22189, Molecular Probes) 를 사용하여 평가하였다.
서로 다른 용매, 농도, 온도 및 반응 시간을 사용한 글루코스의 포착
Figure 112007058255747-pct00010
* 0.1 M 시트레이트/포스페이트 완충액, pH 5.0.
4.2 B p 상의 대표적인 환원 당의 포착, 처리 및 분석
하기 명칭은 일반 구조 C, C red , D, E, F, G, H, I 및 J (도 1) 의 화합물을 기술하기 위해 하기에 사용되었다. 토의 하의 특정 구조를 기술하는 특정 문자를 첫째로 제공하였다 (예를 들어 C 또는 E). 다음의 위첨자 수는 도 6 에 나타낸 4 개의 고체 지지체의 어느 것이 사용되었는지를 나타낸다. 따라서, 예를 들어, B p (도 6) 이 당을 포착하기 위해 사용된 경우, 생성물은 일반 구조 C 를 가질 것이며, 이는 추가적으로 C p 로 표시된다. 다음의 수는 도 2 에 나타낸 환원 당의 10 개의 시료 중 어느 것이 포착되었는지를 나타낸다. 따라서, C p 2 는 갈 락토스를 포착한 PEGA 수지 B p 의 생성물을 나타낸다 (도 2 의 화합물 2). 같은 식으로, D 2 5 는 고체 지지체 B 2 가 테트라사카리드 LNT (5, 도 2) 를 포착하여 C 2 5 를 제공한 후, 추가로 D 2 5 로 캡핑된 경우 수득된 생성물을 나타낸다.
4.2.1 환원 당 3 의 포착 및 처리
C p 3 : B p 상에 LacNAc (3) 의 포착
첫째로 LacNAc (3) (38 mg, 0.10 mmol) 을 물 (1.0 mL) 에 용해시킨 후, 시료 DMSO 및 AcOH (7:3, 9 mL) 의 혼합물에 10 배 희석시켜, 10 mM 의 LacNAc (3) 의 스탁 용액을 수득하였다. 이후, 40 μL (0.40 μmol) 을 스탁 용액으로부터 취하여 DMSO 및 AcOH (7:3, 150 μL) 의 혼합물로 추가로 희석하고, 전체를 B p (10 mg, 2 μmol) 에 첨가하고, 밤새 60℃ 에서 인큐베이션시켰다. 수지를 수회 세척하고: DMF (5 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL), 다음 실험에서 직접 사용하였다.
D p 3 : 무수 아세트산으로의 C p 3 의 캡핑
실험에서 수득된 모든 수지 C p 3 를 Ac2O 및 메탄올 1:1 혼합물 (0.4 mL) 로 1 h 동안 처리한 후, DMF (5 x 0.5 mL), 물 (2 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL) 로 세척하고, 다음 실험에서 직접 사용하였다.
E p 3 : BH 3 -피리딘으로의 D p 3 의 환원
실험에서 수득된 수지 D p 3 를 메탄올 (0.1 mL) 로 덮고 BH3-피리딘 (20 μL, 피리딘 중 8 M) 을 첨가한 후, 물 (40 μL) 중 50% CCl3CO2H 를 첨가하였다. 반응이 rt 에서 2 h 동안 진행되로록 방치한 후, DMF (5 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL) 및 CH2Cl2 (5 x 0.5 mL) 로 세척하였다. 수지는 다음 단계에서 직접 사용하였다.
F P 3 : TRITC 를 사용한 E p 3 의 태깅
TRITC (0.89 mg, 2 μmol) 를 DMF (0.2 mL) 에 용해시키고, 용액을 수지 (E p 3) 에 첨가하고 2 h 동안 방치한 후, DMF (5 x 0.5 mL), CH2Cl2 (5 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL) 및 마지막으로 물 (5 x 0.5 mL) 로 철저히 세척하여 여분의 염료를 제거하였다. 수지는 다음 단계에서 직접 사용하였다.
G P 3 : 지지체로부터 TMR 태깅된 LacNAc 의 절단
이전의 실험에서 수득된 수지 F p 3 는 LiOH 의 1M 용액 (0.2 mL) 으로 덮고 2h 동안 방치하였다. 액체는 흡인에 의해 비드로부터 수집한 후, 물 (3 x 0.5 mL) 로 비드를 세척하였다. 수집된 액체 세척물을 풀링하고, pH 는 10% AcOH 로 중성으로 조절하였다. 진한 적색 용액은 Sep-Pak 컬럼 (50 mg) 상에 흡착시키고, 물 (2 mL) 로 세척하고 메탄올 (0.5 mL) 로 용출시켰다. 생성물의 실체 는 MS (ES) m/z = 978 (MH+) 로 확인하고, 프로파일은 CE 로 기록하였다 (도 11).
4.2.2 환원 당 5 의 포착 및 처리
C p 5 : B p 상의 락토 -N- 테트라오스 (5) 의 포획
5 (5.0 mg, 7.1 μmol) 을 DMSO 및 AcOH 7:3 (3 mL) 의 혼합물에 용해시켜 용액을 제조하였다. 혼합물을 PEGA 수지 B p (175 mg, 35 μmol) 에 첨가하고 밤새 60℃ 에서 인큐베이션하였다. 수지를 수회 세척하고: DMF (5 x 5 mL), 메탄올 (5 x 5 mL), 다음 실험에서 직접 사용하였다.
D P 5 : 무수 아세트산으로의 C p 5 캡핑
실험에서 수득된 수지 C p 5 모두를, Ac2O 및 메탄올 1:1 (5 mL) 의 혼합물로 1 h 동안 처리한 후, DMF (5 x 5 mL), 물 (2 x 5 mL), 메탄올 (5 x 5 mL) 로 세척하고, 다음 실험에서 직접 사용하였다.
E P 5 : BH 3 -피리딘으로의 D p 5 의 환원
실험에서 수득된 수지 D 5 P 를 메탄올 (2 mL) 로 팽창시키고 BH3-피리딘 (200 μL, 피리딘 중 8 M) 을 첨가한 후, 물 (400 μL) 중 50% CCl3CO2H 산을 첨가하였다. 반응이 rt 에서 2 h 동안 수행되도록한 후, DMF (5 x 5 mL), 메탄올 (5 x 5 mL) 및 CH2Cl2 (5 x 5 mL) 로 세척하였다. 마지막으로, 수지는 진공 하에서 밤새 건조하고, 이후의 사용을 위해 rt 에서 보관하였다.
F P 5 : MS -태그를 포함하는 브롬으로의 E 5 P 의 태깅
건조 수지 E P 5 의 소량 (10 mg, 0.4 μmol) 은 수지를 팽창시키기 위해 CH2Cl2 (3 x 0.5 mL) 로 세척하였다. 용액은 DMF (0.2 mL) 중 4-브로모페닐 이소티오시아네이트 (0.85 mg, 4 μmol) 를 용해시켜 제조하였고, 혼합물을 수지에 첨가하고 2 h 동안 rt 에서 반응하도록 방치한 후, 수지를 DMF (5 x 0.5 mL), CH2Cl2 (5 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL), 및 마지막으로 물 (5 x 0.5 mL) 로 세척하였다. 수지는 다음 단계에서 직접 사용하였다.
G p 5 : 지지체로부터 브롬 태깅된 락토 -N- 테트라오스의 절단
이전의 실험에서 수득된 수지 F P 5 를 LiOH (0.2 mL) 의 1M 용액으로 덮고 2 h 동안 방치하였다. 액체는 흡입에 의해 비드로부터 수집한 후, 비드를 물 (3 x 0.5 mL) 로 세척하였다. 수득된 액체 및 세척물을 풀링하고, 10% AcOH 으로 pH 를 약산성 (pH 3-4) 으로 조절하였다. 목적 생성물을 포함하는 용액을 Sep-Pak 컬럼 (50 mg) 상에 흡착시키고, 물 (2 mL) 로 세척하고, 메탄올 (0.5 mL) 로 용출시켰다. 생성물의 실체는 MS (ES) m/z = 1072 (98%, MH+), 1074 (100%, MH+), m/z = 1070 (98%, M-H+), 1072 (100%, M-H+) 로 확인하였다. 도 12 는 브롬의 2 개의 동위원소가 명백히 구별될 수 있는 삽입 팽창을 갖는 질량-스펙트럼을 나타낸다.
4.2.3 환원 당 혼합물 6 의 포착 및 처리
C p 6 : B p 상으로의 모노사카리드 혼합물 6 ( Fuc : Man : GalNAc , 2:3:1) 의 포착
3 개의 스탁 용액의 일련은, 물 (3 x 1.0 mL) 에 3 개의 개별적인 모노사카리드 (Fuc: 16 mg, 0.10 mmol, Man: 18 mg, 0.10 mol, GalNAc: 22 mg, 0.10 mmol) 를 용해시킨 후, 시료를 DMSO 및 AcOH (7:3, 3 x 9 mL) 의 혼합물로 10 배 희석하여 3 개의 모노사카리드의 10 mM 스탁 용액을 수득하였다. 혼합물은 이제 3 개 의 스탁 용액의 하기 양을 취하여 제조한다: Fuc (20 μL, 0.2 μmol), Man (30 μL, 0.3 μmol) 및 GalNAc(IO μL, 0.1 μmol). 상기 모노사카리드 용액은 DMSO 및 AcOH (7:3, 150 μL) 의 혼합물의 첨가에 의해 추가로 희석하고, 전체를 PEGA 수지 B p (10 mg, 2 μmol) 에 첨가하고, 밤새 60℃ 에서 인큐베이션하였다. 수지를 수회 세척하고: DMF (5 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL), 다음 실험에서 직접 사용하였다.
D P 6 : 무수 아세트산으로의 C P 6 의 캡핑
실험에서 수득된 모든 수지 C P 6 는 Ac2O 및 메탄올 (0.4 mL) 의 1:1 혼합물로 1h 동안 처리한 후, DMF (5 x 0.5 mL), 물 (2 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL) 로 세척하고, 다음 실험에서 직접 사용하였다.
E P 6 : BH 3 -피리딘으로의 D p 6 의 환원
실험에서 수득된 수지 D P 6 를 메탄올 (0.1 mL) 로 덮고, BH3-피리딘 (20 μL, 피리딘 중 8 M) 을 첨가한 후, 물 (40 μL) 중 50% CCl3CO2H 을 첨가하였다. 반응은 2 h 시간 동안 rt 에서 진행되로록 방치한 후, DMF (5 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL) 및 CH2Cl2 (5 x 0.5 mL) 로 세척하였다. 수지를 2 개의 개별적인 용기 (E p 6a 및 Ep 6 b, 각각 약 5 mg) 로 나누고, 다음 실험에서 직접 사용하였다.
F p 6 a : TRITC 를 사용한 E p 6 a 의 태깅
TRITC (0.5 mg, 1.2 μmol) 를 DMF (0.2 mL) 에 용해시키고, 용액을 수지 (Ep6a) 에 첨가하고 2 h 동안 rt 에서 방치한 후, DMF (5 x 0.5 mL), CH2Cl2 (5 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL) 및 마지막으로 물 (5 x 0.5 mL) 철저히 세척하여 여분의 염료를 제거하였다. 수지는 다음 단계에서 직접 사용하였다.
G p 6 a : 지지체로부터의 TMR 태깅된 모노사카리드 혼합물의 절단
이전의 실험에서 수득된 수지 (F p 6 a ) 를 LiOH (0.1 mL) 의 1M 용액으로 덮고 2h 동안 방치하였다. 액체는 흡입에 의해 비드로부터 수집한 후, 비드를 물 (3 x 0.5 mL) 로 세척하였다. 수집된 액체 및 세척물을 풀링하고, 10% AcOH 로 pH 를 중성으로 조절하였다. 진한 적색 용액을 Sep-Pak 컬럼 (50 mg) 상에 흡착시키고, 물 (2 mL) 로 세척하고 메탄올 (0.5 mL) 로 용출하였다. 3 개의 태깅된 생성물은 (ES) m/z = 759 (Fuc, MH+), 775 (Man, MH+) 816 (GalNAc, MH+) 로 확인하고 그의 프로파일을 CE 에 의해 기록하였다 (도 13).
F p 6 b : 무수 아세트산으로의 E p 6 b 의 태깅
A: Ac2O 및 메탄올 (0.2 mL) 의 1:1 혼합물을 수지 (E p 6 b ) 에 첨가하고 16 h 동안 rt 에서 방치한 후, DMF (5 x 0.5 mL), CH2Cl2 (5 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL) 및 마지막으로 물 (5 x 0.5 mL) 로 철저히 세척하였다. 수지는 다음 단계에서 직접 사용하였다.
G p 6 b : 지지체로부터의 아세트산 태깅된 모노사카리드 혼합물의 절단
이전의 실험에서 수득된 수지 (F p 6 b ) 를 NH4OH (0.1 mL) 의 10% 용액으로 덮고 2 h 동안 방치하였다. 액체는 흡입에 의해 비드로부터 수집한 후, 비드를 물 (3 x 0.5 mL) 로 세척하였다. 수집된 액체 및 세척물을 풀링하고, 로타뱁에서의 건조될때까지 증발시키고, 물 (1 mL) 에 재용해시키고 동결 건조시켰다. 3 가지의 태깅된 생성물의 실체는 MS (ES) m/z = 356 (Fuc, M-H+), 372 (Man, M-H+), 413 (GalNAc, M-H+) 에 의해 확인하였다. 3 가지 신호의 강도의 비율은 대 략 1.3:2:1 이었다.
4.2.4 환원 당 혼합물 7 의 포착 및 처리
C p 7 : B p 상으로의 모노사카리드 혼합물 7 ( Fuc : Man : GalNAc , 1:3:2) 의 포착
C p 6 실험에서 사용된 동일한 3 가지의 모노사카리드 스탁 용액 (각 10 mM) 을 다음 실험에서 사용하였다. 혼합물은 3 가지 용액으로부터 하기 양을 취하여 제조하였다: Fuc (10 μL, 0.1 μmol), Man (30 μL, 0.3 μmol) 및 GalNAc (20 μL, 0.2 μmol). 상기 모노사카리드 용액을 DMSO 및 AcOH (7:3, 150 μL) 의 혼합물의 첨가에 의해 추가로 희석하고, 전체를 PEGA 수지 B p (10 mg, 2 μmol) 에 첨가하고 방치하여 60℃ 에서 밤새 교반하였다. 수지를 수회 세척하고: DMF (5 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL), 다음 실험에서 직접 사용하였다.
D p 7 : 무수 아세트산으로의 C p 7 의 캡핑
실험에서 수득된 모든 수지 C p 7 를 Ac2O 및 메탄올 (0.4 mL) 의 1:1 혼합물 및 메탄올 (0.4 mL) 로 1 h 동안 처리한 후, DMF (5 x 0.5 mL), 물 (2 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL) 로 세척하고, 다음 실험에서 직접 사용하였다.
E p 7 : BH 3 - 피리딘로의 D p 7 의 환원
실험에서 수득된 수지 D p 7 는 메탄올 (0.1 mL) 로 덮고 BH3-피리딘 (20 μL, 피리딘 중 8 M) 을 첨가한 후, 물 (40 μL) 중 50% CCl3CO2H 를 첨가하였다. 반응은 2h 동안 rt 에서 수행되도록 방치한 후, DMF (5 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL) 및 CH2Cl2 (5 x 0.5 mL) 로 세척하였다. 수지는 2 개의 개별적인 용기 (E p 7 a 및 E p 7 b , 각각 대략 5 mg) 로 나누고 다음 단계에서 직접 사용하였다.
F P 7 a : TRITC 를 사용한 E p 7 a 의 태깅
TRITC (0.5 mg, 1.2 μmol) 를 DMF (0.2 mL) 에 용해하고, 용액을 수지 (E p 7 a ) 에 첨가하고 2 h 동안 방치한 후, DMF (5 x 0.5 mL), CH2Cl2 (5 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL) 및 마지막으로 물 (5 x 0.5 mL) 로 철저히 세척하여 여분의 염료를 제거하였다. 수지는 다음 단계에서 직접 사용하였다.
G p 7 a : 지지체로부터의 TMR 태깅된 모노사카리드 혼합물의 절단
이전의 실험에서 수득된 수지 (F p 7 a ) 를 LiOH (0.1 mL) 의 1M 용액으로 덮고 2h 동안 방치하였다. 액체는 흡입에 의해 비드로부터 수집한 후, 물 (3 x 0.5 mL) 로 비드를 세척하였다. 수집된 액체 및 세척물을 풀링하고, 10% AcOH 로 pH 를 중성으로 조절하였다. 진한 적색 용액은 Sep-Pak 컬럼 (50 mg) 상에 흡착시키고 물 (2 mL) 로 세척하고, 메탄올 (0.5 mL) 로 용출시켰다. 3 가지 생 성물의 실체는 MS (ES) m/z = 759 (Fuc, MH+), 775 (Man, MH+) 816 (GalNAc, MH+) 로 확인하고, 그의 프로파일은 CE 에 의해 기록하였다 (도 14).
F p 7 b : 무수 듀테로아세트산 ( deuteroacetic anhydride ) 으로의 E p 7 b 의 태깅
무수 듀테로아세트산 및 메탄올 (0.2 mL) 의 1:1 혼합물을 수지 (E p 7 b ) 에 첨가하고 16 h 동안 rt 에서 방치한 후, DMF (5 x 0.5 mL), CH2Cl2 (5 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL) 및 마지막으로 물 (5 x 0.5 mL) 로 철저히 세척하였다. 수지는 다음 단계에서 직접 사용하였다.
G p 7 b : 지지체로부터의 중수소 태깅된 모노사카리드의 절단
이전의 실험에서 수득된 수지 (F p 7 b ) 를 NH4OH (0.1 mL) 의 10% 용액으로 덮고 2 h 동안 방치하였다. 액체는 흡입에 의해 비드로부터 수집하고, 물 (3 x 0.5 mL) 로 비드를 세척하였다. 수집된 액체 및 세척물을 풀링하고, 로타뱁 상에서 건조될 때까지 증발시키고, 물 (1 mL) 에서 재용해시키고 동결 건조시켰다. 3 개의 중수소 태깅된 생성물의 실체는 MS (ES) m/z = 359 (Fuc, M-H+), 375 (Man, M-H+), 416 (GalNAc, M-H+) 로 확인하였다. 3 가지 신호의 강도의 비율은 대략 1:4:4 였다.
4.2.5. 환원성 올리고사카리드 혼합물 9 의 포착 및 처리
C p 9 : B p 상의 올리고사카리드 혼합물 9 ( G2 - G7 ) 의 포착
용액은 물 (1 mL) 에 순수 올리고사카리드 G2 - G7 의 당량 (각 10 μmol) 을 용해시켜 제조하였다. 올리고사카리드 함유 용액 100 μL 를, MSO 및 AcOH 의 혼합물 (7:3, 0.9 mL) 에 첨가하고, 전체를 PEGA 수지 B p (60 mg, 12 μmol) 에 첨가하고, 밤새 50℃ 에서 인큐베이션시켰다. 수지를 수회 세척하고: DMF (5 x 2 mL), 메탄올 (5 x 2 mL), 다음 실험에서 직접 사용하였다.
D p 9 : 무수 아세트산으로의 C p 9 의 캡핑
실험에서 수득된 모든 수지 C p 9 를 Ac2O 및 메탄올 (2 mL) 의 1:1 혼합물로 1 h 동안 처리하고, DMF (5 x 2 mL), 물 (2 x 2 mL), 메탄올 (5 x 2 mL) 로 세척하고, 다음 실험에서 직접 사용하였다.
E p 9 : BH 3 -피리딘으로의 D p 9 의 환원
실험에서 수득된 수지 D p 9 는 메탄올 (1 mL) 로 덮고 BH3-피리딘 (150 μL, 피리딘 중 8 M) 을 첨가한 후, 물 (300 μL) 중 50% CCl3CO2H 를 첨가하였다. 반응은 rt 에서 2 h 동안 수행되도록 한 후, DMF (5 x 2 mL), 메탄올 (5 x 2 mL) 및 CH2Cl2 (5 x 2 mL) 로 세척하였다. 수지는 다음 단계에서 직접 사용하였다.
F p 9 : FITC 를 사용한 E p 9 의 태깅
FITC (12 mg, 30 μmol)를, DMF 및 메탄올 (1 mL) 의 1:1 혼합물에 용해시키고, 용액을 수지 (E p 9) 에 첨가하고 2 h 동안 rt에 방치한 후, DMF (5 x 2 mL), CH2Cl2 (5 x 2 mL), 메탄올 (5 x 2 mL) 및 마지막으로 물 (5 x 2 mL) 로 철저히 세척하여 여분의 염료를 제거하였다. 수지는 다음 단계에서 직접 사용하였다.
G p 9 : 지지체로부터의 FITC 를 사용하여 태깅된 올리고사카리드 혼합물의 절단
이전의 실험에서 수득된 수지 (F p 9) 는 LiOH (1 mL) 의 1M 용액으로 덮고 2 h 동안 방치하였다. 액체는 흡입에 의해 비드로부터 수집한 후, 비드를 물 (3 x 3 mL) 로 세척하였다. 수집된 액체 및 세척물을 풀링하고, 10% AcOH 로 pH 를 중성으로 조절하였다. 강한 황색 용액을 Sep-Pak 컬럼 (350 mg) 상에 흡착시키고, 물 (10 mL) 로 세척하고, 메탄올 (3 mL) 로 용출시켰다. 6 개의 태깅된 올리고사카리드의 존재는 MS (ES) m/z = 881 (G2, MH+), 1043 (G3, MH+), 1205 (G4, MH+), 1367 (G5, MH+), 1529 (G6, MH+), 1691 (G7, MH+) 에 의해 확인하고, 혼합물의 프로파일은 CE 에 의해 기록하였다 (도 15).
4.2.6 리보뉴클레아제 B 로부터 유리된 올리고사카리드의 포착 및 처리
C p 10 : B p 상으로의 RNAse B (10) 로부터의 올리고사카리드의 포착 및 처리
Centricon-10 농축기 (Millipore) 상에서의 단백질 제거 후, Carbograph SPE 컬럼 (150 mg 층 중량; Scantec Lab) 상에서 탄수화물 정제 후에 RNAse B (Sigma, R-7884) 의 PNGase F 소화로부터의 미정제 올리고사카리드를 사용하였다. 용액은 0.9 M 시트르산을 포함하는 DMSO 및 THF 2:1 (100 μL) 의 혼합물 중 RNAse B (1O)2 (300 μg, 약 0.2 μmol) 로부터의 미정제 올리고사카리드에 용해시켜 제조하였다. 혼합물은 PEGA 수지 Bp (5 mg, 1.0 μmol) 에 첨가하고 밤새 60℃ 에서 인큐베이션하였다. 수지를 수회 세척하고: DMF (5 x 0.3 mL), 메탄올 (5 x 0.3 mL), 다음 실험에서 직접 사용하였다.
D p 10 : 무수 아세트산으로의 C p 10 캡핑
실험에서 수득된 모든 수지 C p 10 는 Ac2O 및 메탄올 (0.2 mL) 의 1:1 혼합물로 1 h 동안 처리한 후, DMF (5 x 0.3 mL), 물 (2 x 0.3 mL), 메탄올 (5 x 0.3 mL) 로 세척하고, 다음 실험에서 직접 사용하였다.
E p 10 : BH 3 -피리딘으로의 D p 10 의 환원
실험에서 수득된 수지 D p 10 는 (0.2 mL) 로 덮고, BH3-피리딘 (10 μL, 피리딘 중 8 M) 을 첨가한 후, 물 (20 μL) 중 50% CCl3CO2H 을 첨가하였다. 반응이 2 h 동안 rt 에서 수행되도록 한 후, DMF (5 x 0.3 mL), 메탄올 (5 x 0.3 mL) 및 CH2Cl2 (5 x 0.3 mL) 로 세척하였다. 수지는 다음 단계에서 직접 사용하였다.
F p 10 : FITC 를 사용한 E p 10 의 태깅
FITC (1.9 mg, 5 μmol) 는 DMF 및 메탄올 (1:1 , 0.2 mL) 의 혼합물에 용해시키고, 용액은 수지 (E p 10) 에 첨가하고 2 h 동안 60℃ 에 방치한 후, DMF (5 x 0.3 mL), CH2Cl2 (5 x 0.3 mL), 메탄올 (5 x 0.3 mL) 및 마지막으로 물 (5 x 0.3 mL) 로 철저히 세척하여 여분의 염료를 제거하였다. 수지는 다음 단계에서 직접 사용하였다.
G p 10 : 지지체로부터의 FITC 를 사용하여 태깅된 RNAase 로부터의 올리고사카리드의 절단
이전의 실험에서 수득된 수지 (F p 10) 는 LiOH (0.2 mL) 의 1M 용액으로 덮고 2 h 동안 방치하였다. 액체는 흡입에 의해 비드로부터 수집하고, 물 (3 x 0.5 mL) 로 비드를 세척하였다. 수집된 액체 및 세척물을 풀링하고, 10% AcOH 로 pH 를 중성으로 조절하였다. 목적 생성물을 포함하는 황색 용액은 Sep-Pak 컬럼 (50 mg) 상에 흡착시키고, 물 (2 mL) 로 세척하고 메탄올 (0.5 mL) 로 용출시켰다. 표지화된 올리고사카리드의 프로파일은 CE 로 분석하였다. CE (도 16) 는 몇몇의 올리고사카리드 및 일부 확인되지 않은 오염물의 존재를 나타낸다. 하나 이상의 알려진 성분의 실체는 MS (ES) m/z = 1775 (Man5GlcNAcGlcNAcCH2-N-(R)-TAG, MH+) 에 의해 확인하였다.
4.3 CPG 지지체 상으로의 대표적인 환원 당의 포착 및 처리
4.3.1 B 1 상으로의 2 의 포착 및 처리
C 1 2 : B 1 상으로의 갈락토스 (2) 의 포착
B 1 (20 mg, 0.6 μmol) 은 시트레이트-포스페이트 완충액 (113 μL) 중 2 (6.6 μL, 1 mg/mL 물, 0.03 μmol) 로 처리하고, 55℃ 에서 밤새 방치하였다. 비드를 주사기로 이동하고 물 (3 x 0.5 mL) 및 에탄올 (3 x 0.5 mL) 로 세척하여 C 1 2 를 제공하였다.
D 1 2 : 무수 아세트산으로의 C 1 2 의 포착
C 1 2 (0.6 μmol) 를, 15 min 동안 rt 에서 에탄올 중 50% Ac2O 로 캡핑하고, 에탄올 (3 x 0.5 mL) 로 세척하여 D 1 2 를 수득하였다.
E 1 2 : BH 3 -피리딘으로의 D 1 2 의 환원
D 1 2 (0.6 μmol) 는 BH3-피리딘 (25 μL) 의 100 μL 용액, 에탄올 (500 μL) 중 CCl3CO2H (50 μL) 로 처리하였다. 혼합물은 rt 에서 2 h 동안 방치하였다. 비드는 에탄올 (3 x 0.5 mL) 로 세척하여 E 1 2 를 수득하였다.
F 1 2: TRITC 로의 E 1 2 의 표지화
E 1 2 (0.6 μmol) 는 TRITC (300 μL NMP 중 100 μL 의 1.0 mg 및 300 μL CH2Cl2) 로 처리하고 rt 에서 2 h 동안 방치하였다. 비드를 CH2Cl22 (3 x 0.5 mL), 에탄올 (3 x 0.5mL), 및 물 (3 x 0.5 mL) 로 세척하여 F 1 2 (적색 비드) 를 수득하였다.
G 1 2 : F 1 2 의 염기 처리
F 1 2' (0.6 μmol) 는 LiOH (100 μL) 의 1M 용액으로 rt 에서 1 h 동안 처리하고 적색 용액을 단리시키고 물 중 50% AcOH 로 중성화시켜 G 1 2 (적색 용액) 를 수득하고, 이를 Sep-Pak 컬럼 (물 중 30% CH3CN) 으로 통과시키고 MS (775.3, MH+) 및 CE 로 분석하였다 (도 17).
4.3.2 B 1 상으로의 5 의 포착 및 처리
C 1 5 : B 1 상으로의 LNT (5) 의 포착
B1 (20 mg, 0.6 μmol) 은 시트레이트-포스페이트 완충액 (113 μL) 중 5 (25 μL, 2 mg/mL 물, 0.03 μmol) 로 처리하고, 55℃ 에서 밤새 방치하였다. 비드를 주사기로 이동하고 물 (3 x 0.5 mL) 및 에탄올 (3 x 0.5mL) 로 세척하여 C 1 5 를 수득하였다.
D 1 5 : 무수 아세트산으로의 C 1 5 의 캡핑
C 1 5 (0.6 μmol) 은 rt 에서 15 min 동안 에탄올 중 50% Ac2O 로 처리하고, (3 x 0.5 mL) 로 세척하여 D 1 5 를 수득하였다.
E 1 5 : BH 3 -피리딘으로의 D 1 5 의 환원
D 1 5 (0.6 μmol) 는 BH3-피리딘 (25 μL), 에탄올 (500 μL) 중 50% CCl3CO2H (50 μL) 의 용액 100 μL 로 처리하였다. 혼합물을 rt 에서 2 h 동안 방치하였다. 비드는 에탄올 (3 x 0.5mL) 로 세척하여 E 1 5 를 수득하였다.
F 1 5: TRITC 로의 E 1 5 의 표지화
E 1 5 (0.6 μmol) 는 TRITC (300 μL NMP 중 100 μL 의 1.0 mg 및 300 μL CH2Cl2) 로 처리하고 rt 에서 2 h 동안 방치하였다. 비드는 CH2Cl2 (3 x 0.5 mL), 에탄올 (3 x 0.5 mL), 및 물 (3 x 0.5 mL) 로 세척하여 F 1 5 (적색 비드) 를 수득하였다.
G 1 5 : F 1 5 의 염기 처리
수지는 LiOH (100 μL) 의 1M 용액으로 rt 에서 1 h 동안 처리하고 적색 용액은 여과로 단리하고, 비드를 물 (3 x 75 μL) 로 세척하고, 물 중 50% AcOH 로 중성화시켜 G 1 5 (적색 용액) 을 수득하고, 이를 Sep-Pak 컬럼 (물 중 30% CH3CN) 에 통과시켜 MS (ES) m/z = 1300.6 (M-H+), 1302.4 (MH+) 및 CE 에 의해 분석하였다 (도 18).
대안적으로, E 1 5 는 하기와 같이 1-플루오로-2,4-니트로벤젠 (Sanger's reagent) (도 8) 으로 표지화시킬 수 있다. 수지는 55℃ 에서 2 h 동안 Sanger 시약 (20 eq, 0.4 μL, Sigma) 및 에탄올 (70 μL) 중 TEA (10 eq, 0.2 μL) 로 처리하였다. 비드를 에탄올 (3 x 0.5mL), CH2Cl2 (3 x 0.5mL), 에탄올 (3 x 0.5mL), 및 물 (3 x 0.5 mL) (황색 비드) 로 세척한 후, 1 h 동안 rt 에서 LiOH 의 1M 용액 (70 μL) 으로 처리하였다 (갈색 용액). 용액을 여과로 수집하고 비드를 물 (3 x 50 μL) 로 세척하였다. 혼합물을 50% AcOH (황색 용액) 로 중성화시켰다. 혼합물을 물 중 30% CH3CN 으로 Sep-Pak 컬럼에 통과시켰다. MS (ES) m/z = 1023.1 (M-H+).
4.3.3 B 1 상으로의 혼합물 8 의 포착 및 처리
C 1 8 : B 1 상으로의 갈락토스 (2) 및 LNT (5) 의 포착
B 1 (20 mg, 0.6 μmol) 은 2 (6.6 μL, 1 mg/mL 물, 0.03 μmol), 5 (25 μL, 2 mg/mL 물, 0.03 μmol), 시트레이트-포스페이트 완충액 (100 μL) 으로 처리하고, 55℃ 에서 밤새 방치하였다. 비드를 물 (3 x 0.5mL) 및 에탄올 (3 x 0.5mL) 로 세척하여 C 1 8 를 수득하였다.
D 1 8 : 무수 아세트산으로의 C 1 8 의 캡핑
C 1 8 (0.6 μmol) 중 나머지 히드록실아민을, 15 min 동안 에탄올 중 50% Ac2O 으로 캡핑하고 에탄올 (3 x 0.5mL) 로 세척하여 D 1 8 을 수득하였다.
E 1 8 : BH 3 -피리딘으로의 D 1 8 의 환원
D 1 8 (0.6 μmol) 은 BH3-피리딘 (Fluka, 25 μL) 의 용액 100 μL, 에탄올 (500 μL) 중 50% CCl3CO2H (50 μL) 로 처리하였다. 혼합물은 rt 에서 2 h 동안 방치하였다. 비드를 에탄올 (3 x 0.5 mL) 로 세척하여 E 1 8 를 수득하였다.
F 1 8: TRITC 을 사용한 E 1 8 의 표지화
E 1 8 (0.6 μmol) 는 TRITC (300 μL NMP 중 100 μL 의 1.0 mg 및 300 μL CH2Cl2) 로 처리하고 rt 에서 2 h 동안 방치하여 F 1 8 를 수득하였다. 비드를 CH2Cl2 (3 x 0.5mL), 에탄올 (3 x 0.5mL), 및 물 (3 x 0.5mL) 로 세척하였다 (적색 비드).
G 1 8 : F 1 8 의 염기 처리
F 1 8 은 1 h 동안 rt 에서 LiOH (100 μL) 의 1M 용액으로 처리하고, 적색 용액을 단리하고 50% AcOH 로 중성화시켜 G 1 8 (적색 용액) 를 수득하고, 이를 Sep-Pak 컬럼 (물 중 30% CH3CN) 에 통과시키고 CE 에 의해 분석하였다 (도 19).
5. 고정화 올리고사카리드와 효소의 반응
5.1 고정화 태깅된 올리고사카리드와 글리코시다제의 반응
5.1.1 (F 0 5) 가 없고, 1 개의 (F 1 5) 및 2 개의 (F 2 5) 스페이서를 가진 CPG 지지체 상에서의 F 구조 (cap = 아세틸, TAG = TMR) 의 고정화 락토-N-테트라오스 (LNT, 5) 와 베타-갈락토시다제 (소 고환, SIGMA 제품 G-4142, 1 U/mL) 의 반응. 3 가지 모두의 고정화된 올리고사카리드를 본질적으로 F 1 5 에 기술된 바와 같이 제조하였다 (섹션 4.3.2).
고체 지지체 (5 mg) 는 0.2% BSA 함유 0.1 M 시트레이트/포스페이트 완충액 pH 5.0 중 베타-갈락토시다제 (100 μL 의 0.2 U/mL) 용액과 37℃ 에서 23 h 동안 인큐베이션시키고, 수지를 3 x 물, 3 x 에탄올, 3 x CH2Cl2, 3 x Et 에탄올 OH, 및 3 x 물로 세척하였다. 비드는 1 h 동안 rt 에서 LiOH 의 1M 용액 (60 μL) 으로 처리하여, 용액 중 일반 구조 G 0 5, G 1 5 및 G 2 5 의 생성물을 수득하였다. 각 적색 용액을 여과로 수집하였다. 여액은 50% AcOH 로 중성화시키고 CE 를 사용하여 분석하였다.
도 20 은 F 0 5 에 대해 LNT 로부터 갈락코스의 검출가능한 절단이 없었고, F 1 5 에 대해 39% 의 전환 (즉, 39% 의 테트라사카리드가 말단 Gal 잔기를 손실했고 트리사카리드로 전환되었음) 및 F 2 5 에 대해 83% 의 전환이 있었음을 나타낸다. 따라서, 스페이서의 특성은 효소 반응의 과정에 중요한 것으로 밝혀졌다.
5.1.2 두개의 지지체를 갖는 CPG 지지체 상의 아스퍼질러스 나이저 (Aspergillus niger; Dr. Birte Svensson, Carlsberg Laboratories 로부터 기증됨) 로부터의 글루오아밀라제 2와 고정화 말토트리오스 F 2 4 (cap = 아세틸, TAG = TMR) 의 반응. F 2 4 는 본질적으로 F 1 5 (섹션 4.3.2.) 에 대해 기술된 바와 같이 제조되지만, 환원 당으로서 말토트리오스 (G3, 도 2) 및 고체 지지체로서 B 2 를 사용하였다. F 2 4 (약 5 mg) 는 37℃ 에서 23 h 동안, 0.2% BSA 를 포함하는 0.1 M 소듐 아세테이트 완충액 pH 5.5 중 0.1 mg/mL 의 효소 50 μL 와 인큐베이션시켰다. 상술된 바와 같이 세척 및 절단 후, 생성물은 CE 로 분석하였고 (도 21), 이는 고정화 표지화된 말토트리오스에서 표지화된 말토트리오스 및 글루코스 사이에 용출되는 새로운 피크 (이에 따라 말토비오스 (G2) TMR 생성물로 정함) 로의 완전한 전환을 나타내었다.
5.2 고정화 비(非)-태깅된 올리고사카리드와 글리코시다제의 반응 및 동일한 지지체 상에서의 유리된 환원성 모노사카리드의 포착
(비-환원, 비-캡핑, 비-태깅된) C 2 5 구조의 고정화 NLT 와 베타-갈락토시다제 (소 고환) 의 반응은 2 개의 스페이서를 갖는 CPG 고체 지지체 상에서 수행하였다. C 2 5 는 C 1 5 에 대해 기술된 바와 본질적으로 동일하게 제조하였다 (섹션 4.3.2). 사용 전, 효소 용액은 Microcon YM-3 원심 필터 장치 (Millipore) 를 사용하여 반복적 원심분리에 의해 소분자 오염물질로부터 제거시켰다. C 2 5 (5 mg) 은 0.2% BSA 를 포함하는 0.1 M 시트레이트/포스페이트, pH 5.0 중 0.9 U/mL 의 효소 55 μL 로 37℃ 에서 23 h 동안, 및 이후 55℃ 에서 추가의 20 h 동안 인큐베이션시켜, 유리된 갈락토스의 포착을 허용하였다. C 1 5 에서 G 1 5 로의 전환을 위해, 상술된 바와 같이, 고체를 세척, 환원, 무수 아세트산으로 캡핑, TRITC 를 사용하여 태깅 및 LiOH 로 절단하였다. 절단된 생성물의 CE 는 도 22 에 나타나 있고, 이는 미반응 LNT (32%) 의 존재 및 TMR-표지화 생성물 트리사카리드 및 절단된 갈락토스 모두의 유사한 양을 나타낸다. 본 실험은 절단된 당이 절단된, 동일한 비캡핑된 지지체 상에서의 그의 포착을 확인한다.
6. 캡핑제의 변화
6.1 D 를 제조하는 C 의 캡핑
C 에서 D (도 1) 로의 전환을 달성하기 위해 다양한 캡핑제를 사용하였다. C 2 2 는 기질로 사용하였다 (여기서 고체는 2 개의 스페이서를 가진 고체였고 캡핑된 당은 갈락토스였다). 이후, C 상의 아미노기는 특히 무수 아세트산, 무수 벤조산, 무수 트리클로로아세트산 및 디브로모자일렌 (도 6) 으로 캡핑하였다. 캡핑은 에탄올 중 캡핑제 50% 용액으로, rt 에서 15-120 min 동안 수행하였다. 이후, 시료는 기술된 바와 같이 C 1 2 에서 G 1 2 (섹션 4.3.1) 로의 전환을 위해 처리하였다 (즉, 환원, TRITC 를 사용한 표지화, 염기-절단 및 CE 에 의한 분석). 결과는 도 23 에 나타나 있으며, 이는 모든 조건이 전기영동도에서 화합물 21 전에 나타나는 다양한 양의 기타 불순물과 함께 TMR-표지화 갈락토스 (화합물 21, 도 5) 을 제공하는 것을 나타낸다.
6.2. E 를 제공하는 C red 의 캡핑의 예
상기 섹션 6.1 로부터의 C 2 2 는 상기 D 1 2 에서 E 1 2 로의 전환에 대해 기술된 바와 같이 (섹션 4.3.1) BH3-피리딘으로 환원되었다. 생성물 C red 2 2 는, 비-캡핑된 NH2 기를 포함하기때문에 E 1 2 와 상이하다. C red 2 2 (5 mg) 는 벤조산 NHS-에스테르 (0.4 mg, 1.75 μmol) 및 DMF (50 μL) 중 TEA (1.0 μL) 와 60℃ 에서 밤새 교반하였다. 이후, 일반 구조 E 2 2 (여기서 캡은 벤조에이트임) 를 갖는 반응의 생성물은 TRITC 를 사용하여 태깅, 절단 및 CE 에 의해 분석하여 보통과 같이 세척 및 처리하였다. 도 24 는 생성물이 C 에서 D 에서 E 등에서 G 순서에 의해 형성된 바와 실질적으로 동일한 것으로 나타낸다. 생성물의 실체는 MS (ES) m/z = 775.0 (MH+) 에 의해 확인하였다.
7. 테더의 사용의 예: E 에서 H 에서 I 에서 J (도 1)
X- 테더 - Yp 의 예로서 29 의 합성
29: 4- 이소티오시아나토 -벤질- 카르밤산 9H- 플루오렌 -9- 일메틸 에스테르
무수 CH2Cl2 (20 mL) 중 4-아미노벤질아민의 용액 (0.93 mL, 8.20 mmol) 에, TEA (1.15 mL, 8.27 mmol) 후, 건조 CH2Cl2 (10 mL) 중 F-moc-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (2.48 g, 7.35 mmol) 의 용액을 첨가하였다. 30 min 의 교반 후, CH2Cl2 (100 mL) 를 첨가하고 혼합물은 포화 수성 NaHCO3 (2 x 50 mL) 및 염수 (50 mL) 로 순차적으로 세척하고, 건조하였다 (Na2SO4). 용매를 감압 하에서 제거하여 및 잔류물을 건조 컬럼 진공 크로마토그래피 (n-헵탄 중 0-60% EtOAc) 로 정제하여 Fmoc-보호된 물질 (4-아미노-벤질)-카르밤산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르 (2.30 g, 91 %) 를 수득하였다.
Figure 112007058255747-pct00011
CH2Cl2 (30 mL) 중 (4-아미노-벤질)-카르밤산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르 (718 mg, 2.09 mmol) 의 용액을, CH2Cl2-물 혼합물 (40 mL, 1:1, v/v) 중 티오포스 겐의 용액 (199 μL, 2.61 mmol) 에 적가하였다. 혼합물을 밤새 교반한 후, 유기상을 단리 및 건조 (Na2SO4) 하였다. 용매를 감암 하에서 제거하고 잔류물을 건조 컬럼 진공 크로마토그래피 (n-헵탄 중 0-100% CH2Cl2) 로 정제하여 29 (643 mg, 80%) 을 수득하였다.
Figure 112007058255747-pct00012
H P 5 : 29 (도 9) 를 사용한, Fmoc -보호된 아미노 테더와 E P 5 의 결합
건조 수지 (E P 5) (0.2 μmol) 5 mg 을 CH2Cl2 로 수회 세척하여 수지의 적절한 팽창을 확보하였다. Fmoc-보호된 테더 (29) (0.8 mg, 2 μmol) 를 DMF (0.2 mL) 에 용해시키고 수지에 첨가하고 2 h 동안 반응하도록 방치하였다. 수지를 DMF (5 x 0.5 mL), CH2Cl2 (5 x 0.5 mL) 로 세척하고, Fmoc 보호기는 표준 조건 (DMF 중 20 % 피페리딘, 0.5 ml 2 x 10 min) 하에서 제거하였다. 수지는 다음 단계에서 DMF (5 x 0.5 mL) 로의 세척 후, 직접 사용하였다.
I P 5 : TRITC 를 사용한 H p 5 의 태깅
이제 자유 1차 아미노기를 포함하는 실험에서 수득된 수지 H P 5 는 rt 에서 2 h 동안 DMF (0.2 mL) 중 TRITC (0.9 mg, 2 μmol) 로 인큐베이션한 후, DMF (5 x 0.5 mL), CH2Cl2 (5 x 0.5 mL), 메탄올 (5 x 0.5 mL) 및 마지막으로 물 (5 x 0.5 mL) 로 철저히 세척하여 여분의 염료를 제거하였다. 수지는 다음 단계에서 직접 사용하였다.
J P 5 : 아미노 테더를 통해 TRITC 를 사용하여 태깅된 락토 -N- 테트라오스의 절단
이전의 실험에서 수득된 수지 (I P 5) 는 LiOH 의 1M 용액 (0.2 mL) 으로 덮고 2 h 동안 방치하였다. 액체는 흡입에 의해 비드로부터 수집한 후, 물 (3 x 0.5 mL) 로 비드를 세척하였다. 수집된 액체 및 세척물을 풀링하고, 10% AcOH 로 pH 를 약산성 (pH 3-4) 로 조절하였다. 목적 생성물을 포함하는 진한 적색 용액은 Sep-Pak 컬럼 (50 mg) 상에 흡착시키고, 물 (2 mL) 로 세척하고 메탄올 (0.5 mL) 로 용출시켰다. 생성물의 실체는 (ES) m/z = 1465 (MH+) 로 확인하였다.
표지화된 탄수화물의 모세관 전기영동 분석
모세관 전기영도 (CE) 는 자동화 PrinCE 2-lift, 모델 560 CE 시스템 (Prince Technologies, The Netherlands) 을 사용하여 수행하였다. 분리는 25℃ 로 항온 조절되며 75 μm ID 의 코팅되지 않은 융합-실리카 모세관에서 50-75 cm (검출 윈도우에서 아웃렛까지의 가외의 길이 + 30 cm) 범위의 유효 길이로 수행된다. CE 지지 전해질 (BGE) 는 (A) 150 mM SDS 를 포함하는 50 mM 보레이트 완충액 pH 9.3 또는 (B) 0.8% (w/v) γ-CD (Sigma, C-4892) 를 포함하는 0.2 M 보레이트 완충액 pH 9.3 이었다. 조건 A 는 도 11 및 15-22 에 나타낸 분석을 위해 사용하였다. 조건 B 는 도 10, 13, 14, 23 및 24 에 나타낸 분석을 위해 사용하였다.
모세관은 사용전에 2000 mbar 에서 1 M NaOH 로 30 min, 물로 10 min, 및 BGE 로 10 min 동안 세정하여 실온에서 컨디셔닝하였다. 가동 사이에, 모세관을 1 M NaOH 로 3 min, 물로 3 min, 및 BGE 로 3 min 동안 2000 mbar 에서 세척하였다. 시료는 50 mbar 에서 6 sec 동안 수력학적으로 주입시키고 25 kV 의 전위차로 전기영동하였다. 모든 실험은 정상적인 극성 (즉, 양극 인렛) 에서 수행하였다. 검출은 적절한 필터가 장착된 형광 검출기 (Argos 250B, Flux Instruments, Switzerland)를 사용하여 수행하였다. TRITC 를 사용하여 표지화된 시료에 대해, 여기 및 방출 필터는 각각 546.1/10 및 570 nm 였다. FITC 를 사용하여 표지화된 시료에 대해, 여기 및 방출 필터는 각각 UG11 (200-400 nm) 및 495 nm 였다.
약자
본 출원에 전체에 걸쳐 하기 약자를 사용하였다:
AMP CPG 아미노프로필 제어된 기공 유리
BGE 지지 전해질
BSA 소혈청 알부민
CE 모세관 전기영동
CPG 제어된 기공 유리
DIPEA N,N-디이소프로필에틸아민
DMF N,N-디메틸포름아미드
ES 전기분무
FITC 플루오레신 이소티오시아네이트
Fmoc 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐
HRMS 고해상도 질량 분광측정법
LNT 락토-N-테트라오스
MS 질량 분광측정법
NHS N-히드록시숙신이미드
NMP 1-메틸-2-피롤리돈
PEGA 폴리에틸렌글리콜 아크릴아미드 중합체
RNAse B 리보뉴클레아제 B
rt 실온
TBTU N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1일)유로늄테트라플루오로보레이트
TEA 트리에틸아민
TMR 테트라메틸로다민
TRITC 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트

Claims (50)

  1. 하기 단계를 포함하는 반응성 당의 제조 방법으로서:
    i. 환원 당을 포함하는 시료를 제공하는 단계,
    ii. -NH2 기를 포함하는 포착기를 포함하는 링커에 공유 결합된 고체 지지체를 제공하는 단계,
    iii. 상기 환원 당을 상기 -NH2 기와 반응시켜 고정화된 당을 수득하는 단계,
    iv. 자유 -NH2 기를 캡핑제와 반응시키는 단계, 여기서 캡핑제는 -NH2 기와 반응할 수 있는 반응기를 포함함,
    v. 환원제로 C=N 결합을 환원시키는 단계,
    vi. 이에 따라 링커를 통해 고체 지지체에 연결된 당CHn-NH- 구조의 반응성 당을 수득하는 단계, 여기서 n 은 1 또는 2 임,
    단계 iv 가 단계 v 전에 수행되는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    vii. 질소 반응성 관능기 (X) 를 포함하는 유도체화제와 반응성 당의 -NH- 기를 반응시켜, 상기 유도체화제에 공유 결합된 당을 수득하는 단계.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 질소-반응성 관능기가 이소티오시아네이트, 활성 에스테르, 카르복실산, 마이클 수용체, 알파-베타 불포화 술폰, 알킬화제, 알데하이드, 케톤 및 음전기성 기를 지니는 치환된 할로방향족 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 유도체화제가 질소-반응성 관능기로 유도체화된 분광학적으로 검출가능한 화합물인 방법.
  5. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 유도체화제가 질소-반응성 관능기로 유도체화된 형광 화합물인 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    viii. 분광측정법에 의해 당에 결합된 상기 유도체화제를 검출하는 단계.
  7. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 유도체화제가 질소-반응성 관응기로 유도체화된 질량 분광측정법 TAG 이며, 질량 분광측정법 TAG 는 당의 검출 및/또는 구조적 특성화를 개선시킬 수 있는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 질량 분광측정법 TAG 는 브롬을 포함하는 분자인 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 질량 분광측정법 TAG 가 대전 분자인 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 질량 분광측정법 TAG 가 동위원소 표지화된 분자인 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    viii. 상기 당에 결합된 질량 분광측정법 TAG 을 질량 분광측정법으로 검출하는 단계.
  12. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 유도체화제가 제 2 의 결합 파트너와 특이적 상호작용을 할 수 있는 제 1 의 결합 파트너이며, 상기 제 1 의 결합 파트너는 질소-반응성 관능기로 유도체화되는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 하나의 결합 파트너는 단백질이며, 다른 결합 파트너는 상기 단백질의 리간드인 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 하나의 결합 파트너는 에피토프를 포함하며, 다른 결합 파트너는 상기 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체인 방법.
  15. 제 12 항에 있어서, 하나의 결합 파트너는 바이오틴이며, 다른 결합 파트너는 아비딘인 방법.
  16. 제 12 항에 있어서, 제 2 의 결합 파트너가 검출가능한 수준으로 접합되는 방법.
  17. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 유도체화제가 질소-반응성 관능기 또는 보호된 질소 반응성 관능기로 유도체화된 핵산인 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 핵산이 DNA 인 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    viii. 상기 당에 결합된 상기 핵산을 검출하는 단계.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 핵산은 검출가능한 수준으로 접합된 본질적으로 상보성인 핵산에 의해 검출되는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 핵산의 검출은 핵산의 증폭을 포함하는 방법.
  22. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 유도체화제가 X-테더-Y 또는 X-테터- Yp 구조의 2관능성 시약이며, 여기서 X 는 질소-반응성 관능기이며, Y 는 제 2 의 반응성 관능기이며, Yp 는 보호된 반응기 Y 인 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 제 2 의 반응성 관능기 Y 가 티올, 카르복실기, 활성화 카르복실기, 디술피드, 활성화 디술피드, 알킬화제, 알켄, 알킨, 알데하이드, 케톤 및 아지드로 이루어진 군으로부터 선택되거나, Yp 가 상술된 Y 기의 보호된 유도체 및 보호된 아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:
    viii. Y 와 반응할 수 있는 관응기 (Z) 를 포함하는 제 2 의 유도체화제를 제공하는 단계,
    ix. 관능기 Z 및 Y 를 반응시켜, 테더 및 제 1 의 유도체화제를 통해 제 2 의 유도체화제를 당에 공유 결합시키는 단계.
  25. 제 24 항에 있어서, 제 2 의 유도체화제가 약물, 이미지화제, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 핵산, 분광학적으로 검출가능한 화합물, 질량 분광측정법 TAG 및 제 2 의 결합 파트너와 특이적인 상호작용이 가능한 제 1 의 결합 파트너로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  26. 제 22 항에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:
    viii. 미생물, 마이셀, 파지, 비라 (vira) 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 입자를 제공하는 단계, 여기서 입자는 Y 와 반응할 수 있는 관능기 (Z) 을 포함함,
    ix. 관능기 Z 및 Y 를 반응시켜, 테더 및 유도체화제를 통해 입자를 당에 공유 결합시키는 단계.
  27. 제 2 항에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:
    viii. 당과 회합될 수 있는 검출제와 상기 당을 접촉시키는 단계,
    ix. 검출제를 검출하는 단계.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 검출제가 아릴 보로네이트 또는 헤테로아릴보로네이트를 포함하는 방법.
  29. 제 27 항에 있어서, 검출제가 폴리펩티드인 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 렉틴, 셀렉틴, 독소, 수용체, 항체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  31. 제 1 항 내지 제 3 항, 제 27 항 내지 제 29 항 또는 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 포착기가 M-NH2 구조를 포함하거나 M-NH2 구조로 이루어지며, M 은 헤테로원자인 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 3 항, 제 27 항 내지 제 29 항 또는 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 알킬, 아릴, 에테르 및 아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-절단가능 링커인 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 3 항, 제 27 항 내지 제 29 항 또는 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 절단가능 링커인 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 링커가 산, 염기, 친핵체, 친전자체, 산화, 환원, 자유 라디칼, 광, 열 또는 효소와의 반응에 의해 절단가능한 방법.
  35. 제 33 항에 있어서, 상기 절단가능 링커를 절단하여 당을 유리시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계는 v, vi, vii, viii 또는 ix 단계 후에 수행될 수 있는 방법.
  36. 제 1 항 내지 제 3 항, 제 27 항 내지 제 29 항 또는 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 스페이서를 통해 상기 고체 지지체에 결합되는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 스페이서가 0 내지 1000 개 원자 길이 범위인 방법.
  38. 제 1 항 내지 제 3 항, 제 27 항 내지 제 29 항 또는 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 중합체, 고체, 불용성 입자 및 표면으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  39. 제 1 항 내지 제 3 항, 제 27 항 내지 제 29 항 또는 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 센서인 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 3 항, 제 27 항 내지 제 29 항 또는 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 당을 하나 이상의 글리코시다제와 접촉시켜, 새로운 환원 당을 생성하며, 단, 첫번째 당이 상기 글리코시다제(들) 에 대한 기질인 단계를 추가로 포함하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 고체 지지체 상에 새로 생성된 환원 당을 고정화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  42. 제 1 항 내지 제 3 항, 제 27 항 내지 제 29 항 또는 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코실트랜스퍼라제, 술파타제, 포스포릴라제, 술포트랜스퍼라제, 포스포트랜스퍼라제, 글리코신타제 및 트랜스글리코시다제의 부류로부터 선택되는 하나 이상의 효소와 당을 접촉시켜 상기 당을 새로운 구조로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  43. 제 40 항에 있어서, 새로 생성된 당 또는 구조를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  44. 제 1 항 내지 제 3 항, 제 27 항 내지 제 29 항 또는 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제는 BH 결합을 포함하는 보로히드리드 또는 보란이거나 SiH 결합을 포함하는 실란인 방법.
  45. 제 1 항 내지 제 3 항, 제 27 항 내지 제 29 항 또는 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 환원 당을 포함하는 시료, 고체 지지체 및 환원제의 동시 인큐베이션을 포함하는 방법.
  46. 제 5 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    viii. 분광측정법에 의해 당에 결합된 상기 유도체화제를 검출하는 단계.
  47. 제 1 항에 있어서, 단계 ii 에서 상기 링커는 스페이서를 통해 상기 고체 지지체에 결합되는 방법.
  48. 제 1 항에 있어서, 단계 vi 에서 추가로 스페이서를 통해 고체 지지체에 연결된 당CHn-NH- 구조의 반응성 당을 수득하는 방법.
  49. 제 32 항에 있어서, 알킬, 아릴, 에테르 및 아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-절단가능 링커가 치환될 수 있는 방법.
  50. 제 37 항에 있어서, 스페이서가 분지형인 방법.
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