KR101258614B1 - 개 파보바이러스 유전자형 감별진단용 ｐｎａ 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 감별진단법 - Google Patents
개 파보바이러스 유전자형 감별진단용 ｐｎａ 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 감별진단법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 개 파보바이러스 유전자형 감별진단을 위한 PNA 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 감별진단법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정 PNA(Peptide nucleic acid) 프로브 및 프라이머를 이용한 하이브리드화(hybridization)를 통해 정확하게 개 파보바이러스 타입 2의 4종류 유전형, 즉 CPV-2, -2a, -2b 및 -2c를 신속하고 정확하게 감별진단할 수 있는 개 파보바이러스 유전자형 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 감별진단법에 관한 것이다.
PNA 마이크로어레이, 어레이 칩, 개 파보바이러스, 유전형 감별진단법
Description
본 발명은 개 파보바이러스 유전자형 감별진단을 위한 PNA 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 감별진단법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정 PNA(Peptide nucleic acid) 프로브 및 프라이머를 이용한 하이브리드화(hybridization)를 통해 정확하게 개 파보바이러스 타입 2의 4종류 유전형, 즉 CPV-2, -2a, -2b 및 -2c를 신속하고 정확하게 감별진단할 수 있는 개 파보바이러스 유전자형 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 감별진단법에 관한 것이다.
개 파보바이러스(CPV: Canine parvovirus)는 고양이 파보바이러스에서 유래되었고, 1978년 이전까지는 CPV-2가 유행하였으나 이후 CPV-2a가 출현하였으며, 개에 병원성이 강해 장염으로 피해가 크고 특히 어린강아지에서는 폐사율이 매우 높았다. 1984년부터는 CPV-2b가 유행하였으며, 오늘날에는 CPV-2c가 출현하여 항원들 의 변형으로 인한 병원성의 차이들을 보이고 있다.
기존에 개 파보바이러스로 인해 국내 반려견 등에서 개 파보바이러스로 인한 피해가 많이 보고되고 있으나 기존백신과의 유전적 타입이 맞지 않고 또한 1980년대 이후 개 파보바이러스에 대한 항원적변이가 캡시드유전자에서 발생하여 병원성이 더욱 강해지고 있다. 현재 국내는 타입 2a, 변형된 2a 및 2b가 최근에 조사되었는데 이탈리아 등에서는 병원성이 강한 타입 2c가 출현한 상태이고, 이 항원은 계속 변이가 진행되고 있는 상황이라 새로운 타입의 바이러스가 출현할 가능성도 매우 높다.
국내에서는 CPV-2 백신 9품목이 허가되어 시판되고 있으나, 야외항원검사에서는 CPV-2a가 주를 이루고 있고 간혹 CPV-2b가 출현하고 있어 제품화된 백신주들이 실질적인 야외 활동 주들과는 차이가 있어 백신의 교체뿐만 아니라 보다 정밀한 SNP를 이용한 PNA 마이크로어레이 칩 개발의 필요성이 대두되고 있다.
이에 본 발명자들은 기존에 PCR법에서 다루지 못한 개 파보바이러스의 유전형별 감별시스템 개발을 통하여 지속적인 야외주들의 항원변이 양상을 측정하고자 노력한 결과, 개 파보바이러스 타입 2의 4종류의 유전형(CPV-2, -2a, -2b 및 -2c) 감별을 위한 6개의 PNA 프로브 및 프라이머 등을 이용한 하이브리드화를 통해 신속하고 정확하게 개 파보바이러스 유전형을 감별진단할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 신속하고 정확하게 개 파보바이러스 유전형을 감별진단할 수 있는 PNA 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 개 파보바이러스 유전형 감별진단법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 1 내지 6의 펩타이드 핵산을 포함하는 개 파보바이러스 유전형 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한 본 발명에서는 상기 PNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 개 파보바이러스 유전형을 감별진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 PNA 마이크로어레이 칩은 기존에 DNA 마이크로어레이 칩보다 훨씬 감도가 높고 SNP(single nucleotide polymorphim)를 이용한 진단이 가능하여 염기서열 1개 또는 2개의 차이만 갖고도 유전형을 구별할 수 있는 고감도 진단법을 제공할 수 있었다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 표 1에 기재된 서열번호 1 내지 6의 펩타이드 핵산(PNA)을 포함하는 개 파보바이러스 유전형 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩에 관한 것이다:
| 프로브 | PNA 서열(N→C) | VP2 유전자의 뉴클레오타이드염기서열위치(잠재적불일치 아미노산 서열 위치) | 유전형 | 서열 번호 |
| CP1 |
 |
923-907(305) | CPV-2 | 1 |
| CP2 |
 |
924-906(305) | CPV-2a, -2b 또는 2c | 2 |
| CP3 |
 |
1287-1268(426) | CPV-2 또는 -2a | 3 |
| CP4 |
 |
1287-1268(426) | CPV-2 | 4 |
| CP5 |
 |
1289-1269(426) | CPV-2b | 5 |
| CP6 |
 |
1284-1267(426) | CPV-2c | 6 |
상기 PNA 서열 중 굵게 표시된 서열은 잠재적 불일치(potential mismatch) 서열이고, 박스 안의 서열들은 305 또는 426 위치의 아미노산 서열이다.
본 발명에 의한 펩타이드 핵산(PNA)법은 일반 DNA 마이크로어레이법과 유사하게 하이브리드화 과정을 거쳐 수행되는 방법으로서, 기존의 DNA 프로브 대신 PNA 프로브를 사용함으로써 1∼2개의 염기 서열 차이만으로도 유전형을 감별할 수 있는 고감도 진단법이다.
또한 본 발명은 상기 PNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 개 파보바이러스 유전형을 감별진단하는 방법에 관한 것으로, 하기 단계들을 포함한다:
1) 샘플에서 DNA를 추출하는 단계;
2) 표적 DNA를 PCR로 증폭시키는 단계;
3) 서열번호 1 내지 6의 PNA 프로브와 상기 2)에서 증폭시킨 표적 DNA를 하이브리드화시키는 단계;
4) 상기 3)의 결과물을 스캐닝하는 단계; 및
5) 상기 4)의 스캐닝 결과를 판독하여 유전형을 결정하는 단계.
도 1에서는 개 파보바이러스 유전자타입 감별진단을 위한 PNA 마이크로어레이 칩과 표적 DNA가 하이브리드화되는 반응 과정을 보여준다. 즉, 기판 위에 PNA 프로브를 개 파보바이러스 유전자형별로 6-아미노헥실 링커(6-aminohexyl linker)를 달아 유리기판 위에 심어 놓고 PCR로 증폭시킨 바이오틴 라벨-PCR 산물을 첨가하면 PNA와 바이오틴 라벨-PCR 산물이 하이브리드를 형성하게 된다.
도 2는 PNA 어레이 화학반응 모식도이다. PNA 프로브와 표적 DNA가 하이브리드에 의해 결합하는 모양과 바이오틴, 스트렙타비딘(streptavidin) 및 알칼라인포스파타제에 의해 발색되는 과정을 보여준다.
도 3은 본 발명에 의한 PNA 마이크로어레이 칩을 사용하여 개 파보바이러스 유전형을 감별진단하는 과정을 전반적으로 보여주는 모식도로서, 처음 토탈 DNA 추출에서부터 PCR에 의한 표적 DNA 증폭 및 하이브리드화 이후 장비에 의한 스캔 및 판독 등의 일련의 과정을 보여준다.
도 4a 및 4b는 본 발명에 의한 PNA 마이크로어레이 판독 매뉴얼로서, 개 파보바이러스 음성일 경우 무반응이고, CPV-2인 경우에는 프로브 CP1과 CP4; 또는 CP1과 CP3 반응 시 나타나며, CPV-2a인 경우에는 프로브 CP2와 CP3 반응 시, CPV-2b인 경우에는 프로브 CP2와 CP5 반응 시 나타나고, 또한 CPV-2c인 경우에는 프로브 CP6와 반응하여 나타난다.
본 발명에 의하나 개 파보바이러스 유전자형 감별진단은 SNP가 가능하므로 민감도 및 특이도가 매우 낮은 기존의 DNA 마이크로어레이법으로는 감별되지 않았던 개 파보바이러스의 유전자형을 신속하고 정확하게 감별진단할 수 있는 것이 특징이다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[실시예 1] PNA 프로브 제작
VP2 단백질의 305 아미노산과 406 아미노산 자리는 검출감도 조사에서 10에서 100 카피(copies) 정도의 감도를 보였으며, 절단 시그널(Cut off signal)은 2500으로 정하였다. 또한 116개의 야외샘플들에 대한 적용시험에서 개 파보바이러스 타입 2a와 2b가 단독감염으로 나타났으며, 타입 2a 및 2b가 동시에 검출된 것은 1개의 샘플에서 나타나 민감성과 특이성이 매우 우수한 것으로 판명되었다.
따라서, 개 파보바이러스 4가지 유전자형(CPV-2, -2a, -2b 및 -2c)을 감별하기 위한 PNA 프로브 합성 부위를 VP2 유전자 내에 913 부터 915 bp 위치의 GTA(CPV-2)와 TAT(CPV-2a, -2b 및 -2c)로 선정하고, 또한 VP2 유전자 내에 핵산 1,276 부터 1,278 bp 위치의 AAT(CPV-2 및 CPV-2a), GAT(CPV-2b) 및 GAA(CPV-2c)를 추가로 선정한 후 서열번호 1 내지 6의 PNA 프로브를 다음과 같이 합성하였다.
PNA 프로브 합성은 15-20 mer로 벤조티아졸-2-설포닐(Bts: benzothiazole-2-sulfonyl)을 사용하였으며, 아질런트(Agilent) 1100 액체크로마토그라피 기기를 사용하여 순도를 측정하였고, 정성검사는 MALDI-TOF를 이용하였다. 또한 농도는 나노드롭(NanoDrop ND-1000) 기기를 이용하여 측정하였으며, PNA 프로브는 슬라이드 글라스 표면 위에 50 μM/10 ㎕ 씩 부착하였다. 부착기기는 aQu 솔리드 핀(aQu solid pins: PNA 프로브를 유리글래스 위에 심는 방식으로서 위로 바르게 선방향으로 로딩하는 방법) 방식이 부착된 정밀 PNA 배열기(Qarray mini Microarrayer)를 사용하였으며, 습도는 75-85%를 유지하였다.
[실시예 2] 개 파보바이러스 유전형 감별진단
상기 실시예 1에서 제조한 PNA 프로브들을 도 4a에 도시된 바와 같이 배열한 PNA 마이크로어레이 칩을 제조하였다.
야외 샘플에서 채취한 개 파보바이러스 4개 유전자(CPV-2, -2a, -2b 및 -2c)의 DNA를 추출하여 플라스미드에 클로닝하였고, PCR 증폭을 위하여 하기 표 2에 기재된 바이오틴 라벨된 프라이머 2쌍을 제작하였다. 이때, PCR 증폭조건은 95℃에 5분간 예비변성(predenature)을 수행하고, 이어서 95℃ 30초간 변성, 50℃에서 60초간 어닐링, 및 72℃에서 60초간 확장(elongation)하는 사이클을 45회 수행한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 확장하였다.
| 명칭 | 서열 | 서열번호 |
| CPV 305 정방향 프라이머 | 5'-ACAAATAGAGCATTGGGCTT-3' | 7 |
| CPV 305 역방향 프라이머 | 5'- CTCATAATAGTAGCTTCAG-3' | 8 |
| CPV 426 정방향 프라이머 | 5'-CAACAGGAGAAACACCTG-3' | 9 |
| CPV 426 역방향 프라이머 | 5'- AATATATTAGTATAGTTAATT-3' | 10 |
하이브리드화 과정은 토탈 하이브리다이제이션 용량은 80 ㎕로 PCR 산물인 바이오틴 라벨된 표적 DNA 10 ㎕와 3 ㎕ Cy5-스트렙타비딘이 포함된 PNA 하이브리드화 완충액(5ⅹSSC, 0.5% SD) 70 ㎕를 혼합한 다음 상기 PNA 마이크로어레이 칩에 40℃로 2시간동안 반응시켰다.
상기 하이브리드화 반응이 완료되면 5분씩 2회 세척 완충액(3x SSPE 완충액(0.005% 트리톤 X-100 함유))으로 세척하고 건조한 후 비공초점 형광 스캐너(non-confocal fluorescent scanner GenePix 4000B)로 반응물을 스캔하였다. 형광 시그날은 프로브 표적 듀플렉스(probe-target duplexes)의 하이브리드화 시그날로 계산하여 유전자형을 판정하였다. 최적의 컷-오프(cut-off) 형광시그날 값은 2500 이상으로 고정하였다.
상기 과정을 거쳐 CPV-2, -2a, -2b 및 -2c의 연속계대희석에 따른 시그날 감도를 관측한 결과를 도 5에 나타내었다[A: CPV-2, B: CPV-2a, C: CPV-2b, D: CPV-2c]. 각 커브는 3번 반복한 값의 평균이고, 에라바는 시그날 감도의 평균차를 의미한다.
상기 도 5의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명에 의한 개 파보바이러스 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩은 기존에 개발된 개 파보바이러스 진단용 PCR법 및 실시간 유전자검출법보다 재현성 및 정확성이 탁월하였으며, 116개 야외샘플에 대하여 특이도와 민감도가 100%인 결과를 보였다.
본 발명에 의한 개 파보바이러스 유전형 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩은 기존의 DNA 마이크로어레이 칩을 사용할 때 보다 개 파보바이러스 유전형에 따른 질병을 정확하고 신속하게 진단할 수 있으며, 일선 대학동물병원 및 민간병성감정기관 등에서 이를 이용한 정확한 진단 및 치료가 가능하므로 복합감염에 따른 치사율을 감소시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 의한 개 파보바이러스 유전형 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩은 차세대 진단체계에 도입이 가능하며, 동물 질병, 축산물 및 식중독 분야 등에서 다양하게 응용이 가능하고, 동물복지 차원에서 반려견의 귀중한 생명을 보장할 수 있을 것으로 사료된다.
도 1은 개 파보바이러스 유전자타입 감별진단을 위한 PNA 마이크로어레이 칩과 표적 DNA의 반응 모식도이다.
도 2는 PNA 어레이 화학반응 모식도이다.
도 3은 본 발명에 의한 PNA 마이크로어레이 칩을 사용하여 개 파보바이러스 유전형을 감별진단하는 과정을 전반적으로 보여주는 모식도이다.
도 4a 및 4b는 본 발명에 의한 PNA 마이크로어레이 판독 매뉴얼이다.
도 5는 CPV-2, -2a, -2b 및 -2c의 연속계대희석에 따른 시그날 감도를 보여준다[A: CPV-2, B: CPV-2a, C: CPV-2b, D: CPV-2c].
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management: Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS))
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canine parvovirus and the method for diagnosing using the same
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Claims (3)
- 서열번호 1 내지 6의 펩타이드 핵산을 포함하는 CPV-2, CPV-2a, CPV-2b 및 CPV-2c 중 1종 이상의 개 파보바이러스 유전형 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩.
- 제 1항에 의한 PNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 개 파보바이러스의 유전형을 감별진단하는 방법.
- 제 2항에 있어서,1) 샘플에서 DNA를 추출하는 단계;2) 표적 DNA를 PCR로 증폭시키는 단계;3) 서열번호 1 내지 6의 PNA 프로브와 상기 2)에서 증폭시킨 표적 DNA를 하이브리드화시키는 단계;4) 상기 3)의 결과물을 스캐닝하는 단계; 및5) 상기 4)의 스캐닝 결과를 판독하여 유전형을 결정하는 단계;를 포함하여 개 파보바이러스의 유전형을 감별진단하는 방법.
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| J Clin Microbiol, Vol. 47, No. 6, pp1785-1790 (2009.08.15 온라인 공개) * |
| J Clin Microbiol, Vol. 47, No. 6, pp1785-1790 (2009.08.15 온라인 공개)* |
| J Vet Med Sci, Vol. 70, No. 8, pp769-775 (2008.08) * |
| J Vet Med Sci, Vol. 70, No. 8, pp769-775 (2008.08)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20110072039A (ko) | 2011-06-29 |
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