KR102470988B1 - 브루셀라 아보투스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트 - Google Patents

브루셀라 아보투스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 브루셀라 아보투스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 브루셀라 아보투스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트는 브루셀라 아보투스의 유전자형(sequence type)을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는바, 브루셀라 아보투스의 동정 및 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

브루셀라 아보투스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트{Single nucleotide polymorphism marker for identification of Brucella abortus and primer set for detection}
본 발명은 브루셀라 아보투스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.
브루셀라병은 브루셀라균(Brucella)에 의해 소, 돼지, 산양, 면양, 개 등 대부분의 동물에 감염되어 유산, 불임 등 주로 생식기 장애를 일으키는 전염병으로 전세계적으로 발생하면서 축산업에 막대한 경제적 손실을 초래한다. 이 질병은 사람에게도 감염되는 인수공통 전염병으로 주로 축주, 수의사, 도축장 종사자 등 가축과 관련된 직업 종사자들에게 많이 발생하는 직업병으로 알려져 있으며, 주기적인 발열, 두통, 식욕부진 등 감기와 같은 증상을 보이다가 만성으로 지속될수록 심내막염, 뇌척수염, 관절염 등 중증 질병으로 진행하게 되며 1-3% 미만의 치사율을 보이고 있다. 현재 국내에서도 동물뿐만 아니라 사람에서도 브루셀라병이 발생하고 있으며 감염된 동물으로부터 사람으로 브루셀라균이 전파되는 것을 막기 위한 대책이 시급한 실정이다. 감염된 동물은 뚜렷한 증상없이 균을 장기간 보균하면서 지속적으로 브루셀라균을 외부로 배출하면서 주변환경을 오염시킨다. 브루셀라병 치료를 위해서는 짧게는 수주에서 길게는 수년간의 항생제 치료가 필요하며, 다량의 항생제 복용으로 인한 후유증 때문에 치료방법에 대한 개선이 시급한 실정이며, 완치로 판단되었어도 수년 이내에 재발되는 경우가 많아 지속적 관찰이 요구되고 있다.
브루셀라균(Brucella)은 숙주특이성, 배양성, 생물·생화학적, 혈청학적 성상 차이에 따라 B. melitensis (sheep and goats), B. abortus (cattle and other Bovidae), B. canis (dogs), B. ovis (rams), B. suis (pigs, reindeer, hare, wild rodents), B. neotomae (desert wood rats), B. pinnipedialis (common seal), B. ceti (common dolphin), B. microti (soil), B. inopinata (human) 등 10종과 함께 2014년 개코원숭이(baboon)에서 분리된 B. papionis와 2016년 빨간여우(redfox)에서 분리된 B. velpis가 새롭게 추가되어 현재까지 총 12종이 알려져 있다. 이들 중 사람에게 감염되어 병원성을 일으키는 균종은 B. melitensis, B. suis, B. abortus, B.canis이며, 국내에서는 B. abortus와 B. canis만 분리 보고되고 있다. 브루셀라균의 분류는 생물학적 및 생화학적 특성을 기초로 하여 집락의 형태, oxidase 및 urease에 대한 반응성, phages에 대한 용해능에 따라 종(species)을 구분하고 더 나아가 CO2 요구도, H2S 산생능, 색소(thionin, basic fuchsin)에서의 배양성, 특이혈청과의 응집 여부에 따라 생물형(biovar)을 구분하고 있어 최종 야외에서 분리된 브루셀라균에 대하여 생물형까지 동정하기 위해서는 많은 시간이 소요되며 각 시험결과를 판독하기 위해서는 숙련된 전문가가 필요하며 살아 있는 균을 다루기 때문에 매우 위험하다. 최근 이와 같은 한계점을 극복하기 위해 유전자를 이용한 분자생물학적 기법으로 균을 보다 쉽게 감별 및 동정하려는 시도가 계속되고 있다. 하지만 브루셀라균은 유전학적 상동성(DNA homology)이 매우 높기 때문에 이들을 감별하는 연구가 90년대 중반부터 계속되었으며, 그 결과 AMOS PCR법, Bruce-ladder PCR법, differential multiplex PCR법 등이 개발되어 많은 브루셀라균을 감별동정할 수 있었다. 특히, 2012년에 개발된 differential multiplex PCR법은 10종의 브루셀라균에 대하여 단일튜브 내 동시에 감별할 수 있는 유전자 진단법이다. 그러나 이들은 균종 감별은 가능하지만 생물·생화학적 특성분석은 할 수 없기 때문에 이러한 특성 분석도 동시에 할 수 있는 진단법이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 브루셀라균 유전체를 분석하여 유전자형(sequence type, ST)을 감별하기 위한 특이 단일염기다형성을 확인하고, 이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 설계함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 단일염기다형성 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 키트 및 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 감별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는 브루셀라 아보투스 감별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단일염기다형성 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 마이크로어레이를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는, 브루셀라 아보투스 감별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 브루셀라 아보투스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트는 브루셀라 아보투스의 유전자형(sequence type)을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는바, 브루셀라 아보투스의 동정 및 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 draft WGS를 통해 브루셀라 아보투스 225주를 감별한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석을 통해 브루셀라 아보투스의 지역적 역학 특성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 제공한다.
상기 브루셀라 아보투스 감별용 조성물의 단일염기다형성 마커는 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상이다:
브루셀라 아보투스 1번 염색체(NC_007618)의 817476번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 817479번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 2번 염색체(NC_007624)의 360501번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 브루셀라 아보투스 1번 염색체 1099314번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 641898번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1219989번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1212540번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1138131번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1185177번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 304711번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 304792번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 2번 염색체의 665349번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 2번 염색체의 371261번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1083739번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472410번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472392번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472386번째 뉴클레오티드; 및
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 360543번째 뉴클레오티드.
본 발명에 있어서, 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G, C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미하며, DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태이다.
본 발명에 있어서, 다형성(polymorphism)은 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.
본 발명에 있어서, 대립유전자(allele)는 상동염색체의 동일한 유전자 좌 위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP은 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에 있어서, 마커(marker)는 유전적으로 불특정 연관된 유전자 좌(genetic locus)를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 마커의 유전자 지도 상의 위치는 유전자 좌로 표시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 감별은 유전학적·생물학적 성질의 차이를 이용하여 특정한 세균을 가려내는 것을 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 감별은 유전자형(sequence type, ST)을 감별하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 이용하여 브루셀라 아보투스의 유전자형을 도 1과 같이 감별할 수 있다. 예를 들어, 감별 대상 균을 분석한 결과, 브루셀라 아보투스 2번 염색체의 360501번째 염기가 G이고, 1번 염색체의 1212540번째 염기가 T인 경우 브루셀라 아보투스 ST13으로 감별할 수 있다.
본 발명에 따른 단일염기다형성 마커는 브루셀라 아보투스의 유전자형(sequence type, ST)을 감별할 수 있는바, 브루셀라 아보투스의 동정 및 감염병 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 브루셀라 아보투스 감별용 키트는 단일염기다형성 마커를 검출하여 브루셀라 아보투스의 유전자형을 감별할 수 있다. 상기 키트에는 단일염기다형성 마커를 검출하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 및 프로브 등을 포함할 수 있으며, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 키트는 다좌위 염기 분석(multilocus sequence analysis, MLSA) 키트인 것이 바람직하나, 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 분석법이라면 제한없이 적용 가능하다.
본 발명에 있어서, 다좌위 염기 분석은 필수 유전자들의 서열을 연결한 후 연결된 염기서열을 바탕으로 계통학적 분석을 수행하는 방법으로, 분석하고자 하는 종의 분절유전자(segmentation gene)의 염기서열 증폭으로 계통분석을 수행하므로 종에 대한 보다 광범위한 정보를 제공한다는 장점이 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 있어서, 마이크로어레이는 유전자 칩(gene chip)이라고도 불리며, 유전자, DNA 단편 또는 올리고뉴클레오티드를 일정한 패턴으로 고정시킨 작은 고형물을 의미한다.
본 발명의 브루셀라 아보투스 감별용 마이크로어레이는 상기 브루셀라 아보투스 감별용 조성물, 즉, 단일염기다형성 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는바, 브루셀라 아보투스의 감별 및 감염병의 진단에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 키트를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 키트는 대립유전자 특이 PCR 키트, RT-PCR 키트, 디지털 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명의 브루셀라 아보투스 감별용 키트는 PCR을 수행하기 위한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 필수 요소는 단일염기다형성 마커에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는, 브루셀라 아보투스 감별 방법을 제공한다.
상기 (b) 단계의 단일염기다형성 마커는 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이다:
브루셀라 아보투스 1번 염색체(NC_007618)의 817476번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 817479번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 2번 염색체(NC_007624)의 360501번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 브루셀라 아보투스 1번 염색체 1099314번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 641898번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1219989번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1212540번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1138131번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1185177번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 304711번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 304792번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 2번 염색체의 665349번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 2번 염색체의 371261번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1083739번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472410번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472392번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472386번째 뉴클레오티드; 및
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 360543번째 뉴클레오티드.
본 발명의 구체예에서, 상기 (b) 단계는 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 프라이머 세트를 이용하여, (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 (c) 단계는 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 브루셀라 아보투스( Brucella abortus ) 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작
브루셀라 아보투스 감별용 SNP를 선발하기 위하여, 표 1의 브루셀라　아보투스 43주를 활용하였다.
No. Species Biovar Strain Year Source Analysis Comment
1 B. abortus 1 544 1942 England draft WGS Reference
2 B. abortus 1 2308 1959 USA draft WGS Reference
3 B. abortus 2 86/8/59 1959 England draft WGS Reference
4 B. abortus 3 Tulya 1958 Uganda draft WGS Reference
5 B. abortus 4 292 1961 England draft WGS Reference
6 B. abortus 5 B3196 1986 England draft WGS Reference
7 B. abortus 6 870 1959 Africa draft WGS Reference
8 B. abortus 9 C68 1958 England draft WGS Reference
9 B. abortus 1 RB51 USA draft WGS Reference
10 B. abortus 1 S19 USA draft WGS Reference
11 B. abortus 1 A13315 2008 Korea draft WGS Isolate
12 B. abortus 1 A13405 2009 Korea draft WGS Isolate
13 B. abortus 1 A14234(S19) 2014 Mongol draft WGS Isolate
14 B. abortus 1 A14251 2014 Thailand draft WGS Isolate
15 B. abortus 3 A14270 2015 Thailand draft WGS Isolate
16 B. abortus 1 A13334 2008 Korea draft WGS Isolate
17 B. abortus 2 A13352 2008 Korea draft WGS Isolate
18 B. abortus 3 A13476 2012 Mongol draft WGS Isolate
19 B. abortus 3 A14164 2015 Mongol draft WGS Isolate
20 B. abortus 3 A14230 2015 Mongol draft WGS Isolate
21 B. abortus 1 A14305 2016 Korea draft WGS Isolate
22 B. abortus 1 A14307 2016 Korea draft WGS Isolate
23 B. abortus 7 A13452 2012 Mongol draft WGS Isolate
24 B. abortus 7 A13470 2012 Mongol draft WGS Isolate
25 B. abortus 7 A14141 2013 Mongol draft WGS Isolate
26 B. abortus 1 A14228(S19) 2014 Thailand draft WGS Isolate
27 B. abortus 1 A14227(S19) 2014 Thailand draft WGS Isolate
28 B. abortus 1 A11253 2004 Korea draft WGS Isolate
29 B. abortus 1 A11302 1996 Korea draft WGS Isolate
30 B. abortus 1 A11344 2002 Korea draft WGS Isolate
31 B. abortus 1 A11365 2000 Korea draft WGS Isolate
32 B. abortus 1 A12453 1998 Korea draft WGS Isolate
33 B. abortus 1 A13238 2007 Korea draft WGS Isolate
34 B. abortus 1 A13259 2007 Korea draft WGS Isolate
35 B. abortus 1 A13311 2007 Korea draft WGS Isolate
36 B. abortus 1 A13341 2008 Korea draft WGS Isolate
37 B. abortus 1 A12346 2005 Korea draft WGS Isolate
38 B. abortus 1 A11447 2005 Korea draft WGS Isolate
39 B. abortus 1 A12260 2005 Korea draft WGS Isolate
40 B. abortus 1 A11414 2005 Korea draft WGS Isolate
41 B. abortus 1 A14341 2017 Korea draft WGS Isolate
42 B. abortus 1 A14344 2017 Korea draft WGS Isolate
43 B. abortus 1 A14262 2015 Korea draft WGS Isolate
표 1의 브루셀라 아보투스 43주를 차세대염기서열분석법(Next generation sequencing, NGS)를 통해 draft WGS(whole genome sequence) 분석을 실시하였다. Illumina TruseqNano DNA HT Kit를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 라이브러리를 준비하였으며, Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)를 사용하여 생성된 DNA 라이브러리를 대상으로 quality control을 추가로 수행하였다. Miseq reagent kit v2를 사용하여 Illumina Miseq system으로 pairend sequencing을 수행하여 각 균주별 3GB정도의 데이터를 생성하였다. B. melitensis bv.1 16M reference genome(GCF_000740415.1) 기준으로 Bowtie2를 사용하여 맵핑하여 sequence alignment를 수행하였다.
총 43주 draft WGS를 대상으로 특이 SNP를 분석한 결과, B. abortus 특이 SNP 대상부위가 약 870개가 분석되었으며, 동일 유전자 내에서 약 500bp 크기 이내에서 2∼3개 이상의 SNP를 갖는 부위를 중심으로 선발하여 분자역학적 특성분석에 활용하였다. 특이 SNP가 포함된 유전자 부위를 중심으로 annealing temperature는 54℃로, 증폭산물의 크기는 180bp±60 범위로 프라이머를 합성하였으며, 특이 SNP가 포함된 감별부위에 대하여 수집된 표준균주와 분리균주들의 유전자정보와 이 부위를 직접 assemble sequencing한 염기서열정보와의 일치여부를 재차 확인하여 선발된 부위의 신뢰도를 확보하였다.
SNP 분석 결과, 브루셀라 아보투스에 대한 특이 SNP는 총 14개 유전자 부위에서 선발하였다. 보다 상세하게는, 선발된 6개의 유전자(BCSP31, fbaA, BAbRB51, clpxS9, rpsL, rpIV)의 SNP7개는 브루셀라균 특이 SNP를 활용하였고, 브루셀라 아보투스의 특성 분석을 위한 8개 유전자(DK63_RS15435, DK63_RS14910, DK63_RS08465, DK63_RS08685, DK63_RS14655, DK63_RS02320, DK63_RS03625, DK63_RS08240)의 특이 SNP 11개는 새롭게 선발하였다.
선발된 브루셀라 아보투스 특이 SNP에 대한 정보는 표 2에 나타내었다.
Gene name Amplified size(bp) Position SNP
(Ref*/Alt)		 Comments
BCSP31 224 121 G/G Gene and SNP for differential identification of B. abortus
124 A/A
fbaA 195 39 A/G
BAbRB51 210 143 A/C
clpxS9 208 130 G/C
rpsL 231 176 C/A
rpIV 390 48 G/T
DK63_RS15435 173 78 G/A Gene and SNP for molecular genetic and epidemiologic characteristics of B. abortus
96 G/T
102 T/C
DK63_RS14910 161 99 G/A
DK63_RS08465 213 47 C/T
DK63_RS08685 219 74 T/C
DK63_RS14655 316 92 G/A
176 C/T
DK63_RS02320 248 166 C/T
DK63_RS03625 160 68 C/T
DK63_RS08240 195 90 C/T
* B. melitensis 16M(NZ_CP007763, NZ_CP007762)
브루셀라 아보투스 특이 SNP를 선발하기 위해 사용한 유전자 및 프라이머 정보는 표 3에 정리하였다.
Gene Primer sequence(5` → 3`) 서열번호 Size
(bp)		 타겟 부위를 기준으로 한 SNP의 위치 브루셀라 아보투스의 whole genome을 기준으로 한 SNP의 위치 Comments
BCSP31 F TGG CTC GGT TGC CAA TAT CAA 1 224 121
124		 Ch. 1, 817476
Ch. 1, 817479		 Genus Brucella
R CGC GCT TGC CTT TCA GGT CTG 2
fbaA F CCA ATG ACA TCA TGC TCC 3 195 39 Ch. 2, 360501 B. abortus
R CGT TAT AGT CCC AGT CGG 4
clpxS9 F GAT ATC GAA CTG GCG AAG 5 208 130 Ch. 1, 1099314 B. abortus
R CGC GCT CCA CAT TAT AAT C 6
BabRB51 F GCC TAC AAG AAT TAC GAA CA 7 210 143 Ch. 1, 641898 B. abortus
R CCG CCC TTT TGA TAC CAT ATA 8
rpsL F TTG CCA AGG TTC GTC TGA 9 231 176 Ch. 1, 1219989 B. abortus
R TCC CCG GAA AAT CTT ACT TC 10
rpN F AAT CTT CTG ACC CAT TAT GC 11 202 62 Ch. 1, 1212540 B. abortus
R CAA ACG CTG AAA ACA ATC AC 12
DK63_RS08465 F TCG ATG GTG AAT TTT GAA GG 13 213 47 Ch. 1, 1138131 B. abortus point variation
R TGT TTT GTG GAC AAT GGC 14
DK63_RS08685 F ATG TCA CCC TTC AAT TCG 15 219 74 Ch. 1, 1185177 B. abortus point variation
R CAT CTA TAA CAT CAC CAA GG 16
DK63_RS14655 F CTC CGG ATC CCA TAT AAC A 17 316 92
176		 Ch. 1, 304711
Ch. 1, 304792		 B. abortus point variation
R CAA GCT CAA TCA GGA CAG 18
DK63_RS02320 F CAA TTT GGT TTA AGT GCG G 19 248 166 Ch. 2, 665349 B. abortus point variation
R GTC GGT CTT GTC GGT TTC 20
DK63_RS03625 F CTT CCG AGG TGG TGT AGA 21 160 68 Ch. 2, 371261 B. abortus point variation
R CAG AAA GTC GTA ATT GGC A 22
DK63_RS08240 F GAA TTT GGT GTT CAA GGC 23 195 90 Ch. 1, 1083739 B. abortus point variation
R ACC GAC CTT GAT TAC GAA 24
DK63_RS15435 F CTT TTG ATG GTG GCG TTG 25 173 78
96
102		 Ch. 1, 472410
Ch. 1, 472392
Ch. 1, 472386		 B. abortus point variation
R ATG GCA AAA ACC AGA AGT G 26
DK63_RS14910 F GAT GCG ATT GAA TAG GCG 27 161 99 Ch. 1, 360543 B. abortus point variation
R TTT AAT CAG GAA ACC GTC AC 28
14 genes 28 pairs 18 SNPs
상기 표 2의 브루셀라 아보투스 염색체 1 및 2번의 accession No.는 각각 NC_007618 및 NC_007624이다.
실시예 2. 선발된 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 브루셀라 아보투스 감별법
상기 표 2의 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 활용하여, 브루셀라 아보투스 225주를 감별할 수 있는지 확인하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 선발된 13종의 유전자(gene)에 위치한 브루셀라 아보투스 특이 SNP 16개를 이용할 경우 브루셀라 아보투스의 유전자형(Sequence type, ST)을 모두 감별할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 선발된 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석(multilocus sequence analysis, MLSA)
국내 분리주(187주)를 대상으로, 브루셀라균을 감별할 수 있는 6개 유전자(BCSP31, fbaA, BAbRB51, clpxS9, rpsL, rpIV)의 SNP 7개; 및 유전자형 분석을 위해 선발된 8개 유전자(DK63_RS15435, DK63_RS14910, DK63_RS08465, DK63_RS08685, DK63_RS14655, DK63_RS02320, DK63_RS03625, DK63_RS08240)의 브루셀라 아보투스 특이 SNP 11개;를 이용한 다좌위 염기 분석을 수행하였다. 다좌위 염기 분석 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 선발된 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용하는 경우 유전자형(sequence type, ST)을 감별할 수 있음을 확인하였다. 또한 국내 분리주(187주)만을 대상으로 적용하여 분석한 결과, 브루셀라 아보투스의 유전자형은 총 8개(즉, ST1 내지 8)임을 확인하였다.
실시예 4. 선발된 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 브루셀라 아보투스의 지역적 역학 특성 분석
선발된 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용하여 브루셀라 아보투스의 지역적 역학 특성을 분석하였다. 상기 지역적 역학 특성 분석은 국내 분리주(187주)를 대상으로 선발된 14개 유전자의 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석을 통해 수행하였다. 지역적 역학 특성 분석 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 지역적으로 강원(Kangwon), 경기(Gyeonggi) 및 충남(Chungnam) 지역은 브루셀라 아보투스 ST 1, 2 및 4;
경북(Gyeongbuk) 지역은 브루셀라 아보투스 ST 1, 2, 3, 5, 7 및 8;
경남(Gyeongnam) 지역은 브루셀라 아보투스 ST 1, 2 및 3;
전북(Jeonbuk) 지역은 브루셀라 아보투스 ST 1, 2, 3, 4 및 6;
전남(Jeonnam) 지역은 브루셀라 아보투스 ST 1, 3 및 5;
충북(Chungbuk) 지역은 브루셀라 아보투스 ST 1, 3, 4, 6 및 7;
제주(Jeju)지역은 브루셀라 아보투스 ST 1 및 4;가 분포해있는 것을 확인하였다.
특히, 대구(Daegu) 지역은 경북지역에서 다양한 유전자형의 브루셀라 아보투스가 분포된 것을 알 수 있다. 또한 브루셀라 아보투스 ST 1은 경기, 충남 등 9개 지역(49.2%)에 다양하게 분포해 있는 것을 확인하였다. 상기 결과는 브루셀라 아보투스의 숙주인 소의 이동 이력 및 인근 전파 등의 사유로 지역별 역학적 연관성이 나타나는 것으로 보인다.
종합적으로 본 발명자들은 브루셀라 아보투스의 sequencing 및 alignment를 통해 유전자형(sequence type, ST)을 감별하기 위한 특이 SNP를 확인하였고, 이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 설계하였다. 본 발명에 따른 브루셀라 아보투스 감별용 특이 SNP 및 프라이머 세트는 브루셀라 아보투스의 유전자형을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는바, 브루셀라 아보투스의 동정 및 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Single nucleotide polymorphism marker for identification of Brucella abortus and primer set for detection <130> 114 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCSP31_forward primer <400> 1 tggctcggtt gccaatatca a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCSP31_reverse primer <400> 2 cgcgcttgcc tttcaggtct g 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fbaA_forward primer <400> 3 ccaatgacat catgctcc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fbaA_reverse primer <400> 4 cgttatagtc ccagtcgg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clpxS9_forward primer <400> 5 gatatcgaac tggcgaag 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clpxS9_reverse primer <400> 6 cgcgctccac attataatc 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BabRB51_forward primer <400> 7 gcctacaaga attacgaaca 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BabRB51_reverse primer <400> 8 ccgccctttt gataccatat a 21 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL_forward primer <400> 9 ttgccaaggt tcgtctga 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL_reverse primer <400> 10 tccccggaaa atcttacttc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpN_forward primer <400> 11 aatcttctga cccattatgc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpN_reverse primer <400> 12 caaacgctga aaacaatcac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08465_forward primer <400> 13 tcgatggtga attttgaagg 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08465_reverse primer <400> 14 tgttttgtgg acaatggc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08685_forward primer <400> 15 atgtcaccct tcaattcg 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08685_reverse primer <400> 16 catctataac atcaccaagg 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS14655_forward primer <400> 17 ctccggatcc catataaca 19 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS14655_reverse primer <400> 18 caagctcaat caggacag 18 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS02320_forward primer <400> 19 caatttggtt taagtgcgg 19 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS02320_reverse primer <400> 20 gtcggtcttg tcggtttc 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS03625_forward primer <400> 21 cttccgaggt ggtgtaga 18 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS03625_reverse primer <400> 22 cagaaagtcg taattggca 19 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08240_forward primer <400> 23 gaatttggtg ttcaaggc 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08240_reverse primer <400> 24 accgaccttg attacgaa 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS15435_forward primer <400> 25 cttttgatgg tggcgttg 18 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS15435_reverse primer <400> 26 atggcaaaaa ccagaagtg 19 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS14910_forward primer <400> 27 gatgcgattg aataggcg 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS14910_reverse primer <400> 28 tttaatcagg aaaccgtcac 20

Claims (10)

  1. 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는,
    브루셀라 아보투스 ST1, 브루셀라 아보투스 ST2, 브루셀라 아보투스 ST3, 브루셀라 아보투스 ST4, 브루셀라 아보투스 ST5, 브루셀라 아보투스 ST6, 브루셀라 아보투스 ST7, 브루셀라 아보투스 ST8, 브루셀라 아보투스 ST9, 브루셀라 아보투스 ST10, 브루셀라 아보투스 ST11, 브루셀라 아보투스 ST12, 브루셀라 아보투스 ST13 및 브루셀라 아보투스 ST14로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 브루셀라 아보투스 감별용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 감별은 유전자형(sequence type, ST)을 감별하는 것인, 브루셀라 아보투스 감별용 조성물.
  3. 제1항의 조성물을 포함하는,
    브루셀라 아보투스 ST1, 브루셀라 아보투스 ST2, 브루셀라 아보투스 ST3, 브루셀라 아보투스 ST4, 브루셀라 아보투스 ST5, 브루셀라 아보투스 ST6, 브루셀라 아보투스 ST7, 브루셀라 아보투스 ST8, 브루셀라 아보투스 ST9, 브루셀라 아보투스 ST10, 브루셀라 아보투스 ST11, 브루셀라 아보투스 ST12, 브루셀라 아보투스 ST13 및 브루셀라 아보투스 ST14로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 브루셀라 아보투스 감별용 키트.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제3항에 있어서,
    상기 키트는 대립유전자 특이 PCR 키트, RT-PCR 키트, 디지털 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인, 브루셀라 아보투스 감별용 키트.
  9. (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계;
    (b) 제1항의 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 이용하여, 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는,
    브루셀라 아보투스 ST1, 브루셀라 아보투스 ST2, 브루셀라 아보투스 ST3, 브루셀라 아보투스 ST4, 브루셀라 아보투스 ST5, 브루셀라 아보투스 ST6, 브루셀라 아보투스 ST7, 브루셀라 아보투스 ST8, 브루셀라 아보투스 ST9, 브루셀라 아보투스 ST10, 브루셀라 아보투스 ST11, 브루셀라 아보투스 ST12, 브루셀라 아보투스 ST13 및 브루셀라 아보투스 ST14로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 브루셀라 아보투스 감별 방법.
  10. 삭제
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차세대염기서열분석법을 이용한 브루셀라균 신속 감별동정 및 분자유전학적 특성분석, 세균질병과 브루셀라병 OIE 표준실험실, 농림축산검역본부, 연구과제 최종보고, 2016.*

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