KR101256181B1 - 톡소포자충 항원을 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 진단 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 의 SAG1(surface antigen 1) 및 GST(glutathione-S-transferase)가 링커를 통하여 융합된 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 포함하는 톡소포자충 감염의 진단용 조성물 및 진단 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 및 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

톡소포자충 항원을 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 진단 키트 {Fusion protein comprising antigen of Toxoplasma gondii and diagnosing kit comprising the same}
본 발명은 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 의 항원 SAG1(surface antigen 1) 및 GST(glutathione-S-transferase)가 링커를 통하여 융합된 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 포함하는 톡소포자충 감염의 진단용 조성물 및 진단 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 및 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
톡소포자충(Toxoplasma gondii)은 대식세포에 침투하여 중추신경계를 감염시키는 기회감염성 원충기생충이다. 톡소포자충은 고양이를 종숙주로 하여 고양이 분변에 나온 우씨스트(oocyst)를 통해 사람을 비롯한 각종 온혈 동물에 감염되며, 감염된 동물의 조직에 씨스트(cyst)로 존재하다가 사람이 섭식할 때 감염된다. 또한, 산모가 톡소포자충에 감염된 경우 이의 영양형(trophozoite)이 태반을 거쳐 태아에게 감염된다. 선천성 감염의 경우 초기 태아는 유사산이 일어나며, 중후기 태아의 경우에는 정상적 분만이 이루어지더라도 이후 시력손상, 수두증, 정신박약 등의 증상이 나타난다. 후천적 감염의 경우 대부분의 개체에서 무증상이지만, 면역성이 손상된 환자, 예컨대 HIV 감염에 따른 AIDS 환자 또는 의학적 처치에 의하여 면역부전이 일어난 환자에서는 망막맥락막, 뇌수막염 등의 심각한 증상이 나타난다. 현재 전세계 인구의 약 1/3이 톡소포자충 항체를 가진 것으로 조사되고 있다.
톡소포자충 감염의 진단 방법으로, 혈액 또는 체액 중에서 상기 기생충을 단리하거나, 조직 중에서 상기 기생충을 확인하거나, PCR에 의해 특정한 뉴클레오타이드 서열을 검출하거나, 또는 상기 감염에 반응하여 숙주에 의해 생산된 특정한 항-톡소포자충 면역글로불린을 검출하는 방법 등이 있다(Beaman et al., 1995 Principles and Practice of Infectious Diseases 4th Ed., Churchill Livingstone Inc., New York, 2455-75; Remington JS et al., 1995, Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant, W.B. Saunders, Philadelphia, PA, 140-267). 또한, 임신 중 태아의 선천성 감염을 진단하는 방법으로, 다양한 부류의 항-톡소포자충 면역글로불린(IgG, IgM, IgA, IgG의 결합력)의 존재를 검출하고 엄마 대 아이의 면역학적 프로파일을 비교하는 방법 등이 있다.
또한, 톡소포자충 감염의 진단과 관련하여 국제공개특허 제2003/080839호는 톡소포자충 단백질의 항원 단편을 동정하기 위한 파지-디스플레이 기술을 기본으로 하는 방법 및 진단 및 면역제로서의 그의 용도를 개시하고 있고, 국제공개특허 제2006/09665호는 톡소포자충의 3개 이상의 상이한 항원 부위들을 융합한 키메릭 재조합 항원을 톡소포자충 감염의 진단제 및 면역제로 제공하고 있다.
그러나, 이러한 톡소포자충 감염의 진단은 모든 환자에서 정확하고 신속히 진단할 수 있는 충분한 감도 및 특이성을 제공하지 못하는 실정이다. 따라서, 보다 특이적이고 민감하며 신속한 확인이 가능한 진단제의 제공이 요구되고 있다.
본 발명자들은 이전의 연구에서 톡소포자충의 주요 막 항원(major surface antigen)의 하나인 SAG1(또는 P30)을 GST 단백질과 융합 발현시켜 그 항원성을 검증하였으며, 톡소포자충의 SAG1 단백질 중에서도 N-말단 부위(SAG1A)에 항원성이 결집되어 있는 것을 확인한 바 있다 (The Korean Journal of Parasitology, 34(2):135-141, 1996). 그러나, 상기 항원 또는 이의 융합 단백질을 재조합 발현시키기 위하여 대장균과 같은 원핵생물을 이용할 때, 단백질이 응집체(inclusion body) 형태로 세포질 내에 축적되어 분리 및 정제가 어려운 문제가 존재하였다. 또한, 상기 항원을 GST 와 바로 연결시켜 발현시킬 경우 GST 에 의하여 항원 단백질의 3차 구조가 변형되거나 그 활성이 약화되는 문제가 있음을 알게 되었다.
이에, 본 발명자들은 재조합 발현시 분리 및 정제가 용이하여 대량 공급이 가능하고, 항원의 구조와 활성이 잘 유지되어, 특이적이고 민감하게 톡소포자충 감염을 진단할 수 있는 톡소포자충 진단용 항원을 제공하기 위한 연구를 계속한 결과, 특정한 링커를 도입함으로써 톡소포자충 항원의 수용성 및 항원성이 크게 개선된 융합 단백질을 고안하게 되었다.
구체적으로, 본 발명자들은 톡소포자충의 SAG1 항원과 분리 및 정제 수단으로 GST 를 융합시킬 때, SAG1A 및 GST 사이에 특정한 링커를 삽입할 경우 수용성이 크게 증가하고 항원성이 개선되는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 링커의 삽입은 융합 단백질의 수용성을 크게 증가시켜 재조합 항원의 수득을 쉽게 할 뿐 아니라, 이후 ELISA나 신속진단키트에 점적할 때 기질에 부착된 융합 단백질에 유연성(flexibility)을 부여함으로써 부착된 항원의 삼차구조를 잘 유지하게 하여 항원-항체 반응에서 특이성과 민감도를 높이게 됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 의 SAG1(surface antigen 1) 및 GST(glutathione-S-transferase)가 링커를 통하여 융합된 융합 단백질을 제공하는 것이다. 바람직하게, 상기 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 링커이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 융합 단백질을 포함하는 톡소포자충 감염 진단용 조성물 및 진단 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 의 SAG1(surface antigen 1) 및 GST(glutathione-S-transferase)가 링커를 통하여 융합된 융합 단백질에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 링커이다.
본 발명에서 용어, "융합 단백질" 은 두 개 이상의 단백질이 인위적으로 연결된 형태의 단백질을 말하며, 본 발명에서는 톡소포자충의 SAG1 및 GST 가 링커를 통하여 연결된 형태의 단백질을 의미한다. 이러한 융합 단백질은 각각의 파트너가 결정된 후 화학적으로 합성하거나 또는 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 수득할 수 있다. 바람직하게는, SAG1를 코딩하는 핵산, 링커를 코딩하는 핵산, 및 GST 를 코딩하는 핵산을 연결한 융합 유전자를 세포 발현 시스템에서 발현시켜 수득할 수 있다. 바람직한 일 양태로서, 본 발명의 융합 단백질을 구성하는 아미노산을 서열번호 1의 아미노산 서열로 나타내었다.
본 발명에서 용어, "SAG1(surface antigen 1)" 은 톡소포자충의 막 표면에 존재하는 주요 면역원성 단백질을 말하며 숙주 세포의 침입에 기능하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 SAG1 은 그 전체 단백질뿐만 아니라 항원성을 보유하고 있는 이의 기능성 단편을 포함하는 의미로 사용된다. 바람직하게, 본 명세서 내에서 SAG1 은 신호서열을 제외한 N-말단의 171 아미노산을 의미할 수 있으며, 이를 SAG1 또는 SAG1A 로 대체하여 표현할 수 있다. 구체적인 일예로, 상기 SAG1A 의 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타내었다.
본 발명에서 용어, "GST(glutathione-S-transferase)" 는 생체 내에서 다양한 유해독성 물질의 해독작용 및 신진대사에 관여하는 효소를 말하며, 본 발명에서 GST 는 목적 단백질을 수용성으로 발현시키고 분리 및 정제를 용이하게 하기 위한 수단으로서 사용되었다. GST 는 융합 단백질의 발현율 및 수용성을 증가시키며, 고정화된 글루타치온(예를 들면, 글루타치온 친화 크로마토그래피) 또는 상업적으로 가용한 GST 항체를 이용하여 정제 및 검출이 용이한 장점을 가지고 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 GST 는 상용화된 GST 발현 벡터인 pGEX-4T-1 벡터를 사용하여 발현시켰으며, GST 의 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타내었다.
본 발명에서 용어, "링커" 는 SAG1 및 GST 를 연결하여 융합 단백질을 제조하는 경우 구조적 유연성을 증가시켜 활성이 증진될 수 있도록, 단백질과 단백질 사이에 삽입하는 펩티드를 말한다. 바람직하게, 본 발명에서는 링커 단백질로 톡소포자충의 밀집 과립(dense granule) 단백질인 GRA2의 N-말단의 40개 아미노산으로 구성된 단백질을 사용한 데 특징이 있다. 본 발명에서는 진단의 표적의 특이도의 훼손을 막기 위하여 톡소포자충 자체에서 유래한 단백질인 GRA2 를 선택하였으며, GRA2 단백질 중에 가장 비정형 확률이 높은 N-말단의 아미노산 서열을 링커로 선택하여 GST 및 SAG1A 사이에 삽입하였다. 바람직하게, 상기 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진다.
이러한 링커의 사용으로 인하여, GST 및 SAG1A 사이를 물리적으로 분리시켜 SAG1A 본래의 특성 및 단백질 3차 구조에의 영향을 최소화할 수 있었으며, 그 결과 링커를 사용하지 않은 경우와 비교하여 본 발명의 융합 단백질의 수용성을 크게 개선되고(도 2 참조), 톡소포자충 감염 환자의 혈청과 반응시켰을 때 강한 항원-항체 반응을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 이 때, 융합된 GST 는 SAG1A의 항원-항체 반응에 영향을 주지 않음을 또한 확인 할 수 있었다(도 3 참조). 또한, 상기 링커의 사용으로 인하여, 상기 융합 단백질을 진단 키트의 ELISA 용기 바닥이나 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 부착시킬 때 용기 바닥이나 나이트로셀룰로오스 멤브레인으로부터 SAG1A가 공간적으로 삼차원적 구조를 유지하고 유동성을 확보할 수 있으므로 항원-항체 반응에서 특이성과 민감도를 높일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 이의 정상형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 융합 단백질의 변이체를 포함한다. 융합 단백질의 변이체란 정상 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 이러한 변이체는 동등한 활성을 담보하는 한, 서열번호 1의 아미노산 서열과 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지는 단백질을 포함할 수 있다.
또한, 상기 융합 단백질은 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification) 될 수도 있다. 상기 변이체 또는 수식체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이지만, 필요에 따라서는 이의 단백질의 특성을 변형시킨 변이체 또는 수식체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 것이다.
본 발명의 융합 단백질은 화학적으로 합성하거나 유전자 재조합 방법을 통해 생산할 수 있으며, 바람직하게는 재조합 벡터를 이용하여 이를 숙주세포에 형질전환시켜 이로부터 발현된 단백질을 분리, 정제하여 생산할 수 있다.
따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 숙주세포 및 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
유전자 재조합 방법으로 본 발명의 융합 단백질을 생산하는 과정은 다음 단계를 포함한다.
먼저, 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계이다.
SAG1A 및 링커를 코딩하는 DNA 서열은 각각 화학적 합성법, RT-PCR 등 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 목적 단백질의 DNA를 주형으로 하고 상기 목적 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하는 PCR을 통하여 제조할 수 있다. 상기 수득한 SAG1A 및 링커 핵산은 GST를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터에 작동가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조할 수 있다. 본 발명에서는 당업계에 일반적으로 사용되는 GST 유전자를 포함하는 발현 벡터라면 모두 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 대장균을 숙주 세포로 사용하는 경우에는 pGEX 벡터(예, pGEX-2T, pGEX-4T, pGEX-KG 등) 또는 pET 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명의 목적상 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 인트론, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 더 포함할 수 있다.
다음으로, 상기 재조합 벡터를 사용해서 숙주세포를 형질전환시키는 단계이다.
본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주세포는 원핵 세포와 진핵 세포 모두를 포함하며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 세균, 예를 들어 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 대장균이 사용될 수 있다.
재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 전기천공법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
다음으로, 상기 형질전환체를 적절한 배지 및 조건하에서 배양하여 융합 단백질을 수득하는 단계이다.
배지와 배양조건은 숙주세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양 시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 발현된 융합 단백질은 세포의 여액(lysate)으로부터 분리할 수 있다. 구체적으로, 원심분리 또는 여과에 의해 세포 펠렛(cell pellet)을 수득하고, 파열된 세포벽 또는 세포막이 포함된 배지 성분들을 제거함으로써 세포 여액(cell lysate)을 포함하는 용리액을 얻을 수 있다. 구체적으로, 세포 펠렛은 당업계에 잘 알려진 방법, 예컨대 알칼리, 계면활성제 (CHAPS 및 SDS 등), 유기 용매 및 효소 (라이소자임 등)의 사용, 초음파처리(sonication) 및 고압분쇄기(French Press)의 사용, 주기적인 고온, 압력, 냉동 및 해동 사이클의 적용 등에 의하여 파쇄(lysis)할 수 있다. 상기에서 얻은 세포 여액은 세포분획(fractionation)을 통해 세포 여액 내의 바이오매스의 최소 영역을 제거함으로써 깨끗한 용리액을 얻을 수 있는데, 예컨대 원심분리를 통해 세포의 파쇄되지 않은 부분 또는 불용성 세포 파편이 없는 상층액을 취함으로써 깨끗한 용리액을 얻을 수 있으며, 필요하다면 기타 당업계에 알려진 추가적인 정제과정을 거칠 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 발현된 융합 단백질은 GST를 함유하고 있기 때문에 용이하게 분리 및 정제할 수 있다. 이때 사용될 수 있는 분리 및 정제 방법으로는 상기 GST와 특이적으로 결합할 수 있는 물질, 예컨대 GST에 대한 항체 또는 글루타치온(GSH) 를 이용한 친화 크로마토그래피가 포함되며, 글루타치온 친화 크로마토그래피를 이용하는 것이 가장 바람직하다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기한 GST-링커-SAG1A 융합 단백질을 포함하는 톡소포자충 감염의 진단용 조성물 및 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명의 융합 단백질은 톡소포자충 감염 의심 개체의 검체에 존재하는 항체에 대하여 항원-항체 복합체 반응을 통해 면역 복합체를 형성 및 검출함으로써 톡소포자충 감염을 진단하는 용도로 사용될 수 있다. 상기 검체는 사람 또는 동물로부터 수득한 생체시료, 예컨대 체액 (침, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 정액, 양수 등), 조직 또는 세포일 수 있다.
본 발명의 진단 키트에서 융합 단백질은 고체 기질 또는 지지체에 결합된 형태로 사용될 수 있다. 사용가능한 고체 지지체의 예로는 나이트로셀룰로오스(예를 들어 멤브레인 또는 미세적정 웰 형태), 폴리비닐클로라이드(예를 들어 시트 또는 미세적정 웰 형태), 폴리스타이렌 라텍스(예를 들어 비드 또는 미세적정 플레이트), 폴리비닐리덴 플루오라이드, 다이아조화된 페이퍼, 나일론 멤브레인, 활성화된 비드, 및 단백질 A 비드 등을 들 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
이러한 진단 키트에는 본 발명의 당 분야에서 면역학적 분석에 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등을 더욱 포함할 수 있다. 이러한 도구 또는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등으로 확인할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+ , [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게, 본 발명의 진단 키트는 체액 등을 이용하여 현장 검사가 가능하도록 소형화되고 경제성이 향상된 신속 진단 키트로 사용될 수 있다. 이러한 신속 진단 키트는 스트립형 구조를 포함할 수 있으며, 시료 중의 분석 대상물이 이동경로 중에 위치된 신호 밴드에서 항원-항체 반응을 일으키고 그 반응의 결과를 화학발색 등을 통하여 육안으로 확인함으로써 톡소포자충 감염 여부를 신속하고 간편하게 진단할 수 있다.
본 발명의 GST-링커-SAG1A 융합 단백질은 수용성이 크게 증가하여 발현 및 분리 정제를 통해 재조합 항원을 대량으로 확보할 수 있으며, 항원성이 크게 개선되어 톡소포자충 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질을 진단 키트의 고체 지지체에 부착될 때, 비정형부위(링커)를 통하여 유연성(flexibility)을 가지게 되고 항원의 삼차 구조를 잘 보존하게 되므로 항원-항체 반응에서 특이성과 민감도를 높일 수 있다.
도 1은 본 발명의 융합 단백질의 구조를 도식화한 것이다.
도 2는 GST-SAG1A 융합 단백질 및 GST-링커-SAG1A 융합 단백질의 발현을 쿠마시 블루 염색(a) 및 웨스턴 블롯(b)을 통해 확인한 결과를 나타낸다. T는 전체 세포 용리액, S는 13,000 rpm에서 10분간 원심침전한 상층 분획, P는 원심침전에서 침전 분획을 나타낸다.
도 3은 톡소플라스마병 환자의 혈청(혈청번호 7-81과 4-10)을 각각 GST 단백질, GST-SAG1A 융합 단백질 및 GST-링커-SAG1A 융합 단백질과 반응시킨 후 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 융합 단백질의 제조
1-1. 톡소포자충 SAG1A 핵산의 준비
마우스에서 복강 계대로 보존한 톡소포자충(RH주)을 인산완충액(phosphate buffered saline) 내 40% 퍼콜(Pharmacia Biotech, 스웨덴) 에서 원심분리(1800g, 30분)하여 분리하였다. 5 x 108 의 타키조이트(tachyzoite)를 PBS 로 세 번 세척하고 1ml K 버퍼 (0.1 M Tris-Cl, pH7.5, 12.5 mM EDTA, 0.15M NaCl)로 58℃ 에서 1시간 및 37℃ 에서 16시간 전처리하였다. 다음으로, DNA 를 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고 70% 알코올로 세척하였다.
SAG1의 신호서열(signal sequence)을 제외한 N-말단 171 아미노산을 코딩하는 핵산을 증폭하기 위하여, 센스 프라이머(5'-GTTGAATTCGATCCCCCTCCTTGTTGCC-3', 서열번호 5) 및 안티센스 프라이머(5'-GTGGAATTCGACTCCATCTTTCCCGCA-3', 서열번호 6)를 준비하고, 반응혼합물로서 10 mM Tris-Cl, pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01% 젤라틴, 0.2mM dNTPs, 0.2mM 프라이머, 및 0.5U Taq DNA 중합효소(Boehringer Mannheim Biochemica, Germany) 을 구성하고, Thermal cycler (M/J, USA) 로 PCR 을 수행하였다. PCR 은 94℃ 에서 1분, 58℃ 에서 1-2분 및 72℃ 에서 1-2분으로 32사이클 시행 후 마지막으로 전체 신장을 위해 72℃ 에서 5분 수행하였다. 증폭한 DNA 는 1.2% 아가로스에서 전기영동하였다.
1-2. 링커 핵산의 준비
실시예 1-1에서 추출한 톡소포자충의 DNA로부터, GRA2의 신호서열(signal sequence)을 제외한 N-말단 40 아미노산을 코딩하는 핵산을 증폭하기 위하여 센스프라이머(5'-CGG GAT CC C AGG GAC CAG TCG AC-3', 서열번호 7) 및 안티센스 프라이머(5'-CGG GAT CCA ACC GGT TCT TCT GGC T-3, 서열번호 8)를 사용하였고, 상기 실시에 1-1에 기재한 반응 혼합물 및 반응 조건을 사용하여 PCR 을 수행하여 링커 핵산을 증폭하였다.
1-3. 융합 단백질의 제조
GST(glutathione-S-transferase)를 발현하는 pGEX-4T-1 벡터(Pharmacia Biotech, 스웨덴)의 BamHI 제한효소 부위에 실시예 1-2에서 준비한 GRA2의 N-말단 40 아미노산을 코딩하는 핵산을 삽입하고, EcoRI 부위에 실시예 1-1에서 준비한 SAG1A 를 코딩하는 핵산을 삽입한 후, 대장균 DH5a에 형질전환하여 GST-링커-SAG1A 벡터를 클로닝하였다. 다음으로, 분리한 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시킨 후, 30℃에서 3시간 동안 0.5 mM IPTG를 첨가하여 GST-링커-SAG1A 융합 단백질의 발현을 유도하였다.
한편, 대조군으로 GST(glutathione-S-transferase)를 발현하는 pGEX-4T-1 벡터(Pharmacia Biotech, 스웨덴)의 EcoRI 부위에 실시예 1-1에서 준비한 SAG1A 를 코딩하는 핵산을 삽입하여 상기와 동일한 방법으로 GST-SAG1A 융합 단백질의 발현을 유도하였다.
실시예 2. 융합 단백질의 수용성 발현의 확인
상기 실시예 1-3에서 IPTG로 발현 유도한 BL21 세포를 생리식염수에서 초음파로 마쇄 (10%의 강도로 10초간 5번)하여 얻은 세포 용리액을 11% SDS-PAGE로 분석하고, 상기 단백질 성분을 확인하기 위하여 쿠마시(Coomassie) 블루로 염색하여 그 결과를 도 2(a)에 나타내었다. 또한, 상기 세포 용리액을 항-GST 항체로 웨스턴 블롯하여 그 결과를 도 2(b)에 나타내었다.
도 2에서 T는 전체 세포 용리액, S는 13,000 rpm에서 10분간 원심침전한 상층 분획, P는 원심침전에서 침전 분획에서의 융합 단백질 발현 결과를 나타낸다. 도 2(a) 에 나타난 바와 같이, GST-SAG1A 융합 단백질 및 GST-링커-SAG1A 융합 단백질 모두 발현이 잘 일어났으나, 링커가 없는 GST-SAG1A 융합 단백질의 경우 침전 분획(P)에서도 밴드가 나타나(화살표) 융합 단백질의 일부가 응집체(inclusion body)를 형성하였음을 알 수 있었다. 반면, 본 발명의 GST-링커-SAG1A 융합 단백질의 경우 침전 분획에서 밴드가 거의 나타나지 않고(화살표) 주로 상층 분획(S)에서 밴드가 나타났으므로 대부분 수용성으로 발현되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2(b)의 웨스턴 블롯 결과에서도 GST-SAG1A 융합 단백질과는 달리 GST-링커-SAG1A 융합 단백질의 경우 대부분 수용성으로 발현되었음을 재확인할 수 있었다.
실시예 3. 환자 혈청에 대한 항원성 확인
카톨릭대학교 의과대학 기생충학교실에서 보유하고 있는 톡소플라스마병(toxoplasmosis) 환자들의 혈청(혈청번호 7-81과 4-10)에 GST 단백질, 및 상기에서 제조한 GST-SAG1A 융합 단백질 및 GST-링커-SAG1A 융합 단백질을 반응시킨 후, 일차 항체로 항-GST 항체(1:100) 및 이차 항체로 퍼옥시다아제가 결합된 항-인간 IgG 항체(1:1000)(Cappel Co., USA) 를 처리하고 발색 기질로 H2O2 및 4-클로로-1-나프톨(4C1N, Sigma Chem. Co., USA)을 사용하여 웨스턴 블롯을 실시한 후 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 톡소플라스마병 환자의 혈청이 GST 와 반응을 일으키지는 않았으며, GST-SAG1A 융합 단백질 및 GST-링커-SAG1A 융합 단백질과 모두 반응하였으나(화살표), GST-SAG1A 융합 단백질에 비하여 링커를 포함한 GST-링커-SAG1A 융합 단백질과 더욱 강하게 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Fusion protein comprising antigen of Toxoplasma gondii and diagnosing kit comprising the same <130> DPP20114271KR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-linker-SAG1A fusion protein <400> 1 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Gly Ser Pro Glu Phe Pro Gly Arg Leu Glu Arg Pro His Arg Asp Gly 225 230 235 240 Lys Pro Leu Asp Glu Arg Ala Val Gly Gly Lys Gly Glu His Thr Pro 245 250 255 Pro Leu Pro Asp Glu Arg Gln Gln Glu Pro Glu Glu Pro Tyr Ser Gln 260 265 270 Arg Ala Ser Arg Val Ala Glu Pro Pro Leu Val Ala Asn Gln Val Val 275 280 285 Thr Cys Pro Asp Lys Lys Ser Thr Ala Ala Val Ile Leu Thr Pro Thr 290 295 300 Glu Asn His Phe Thr Leu Lys Cys Pro Lys Thr Ala Leu Thr Glu Pro 305 310 315 320 Pro Thr Leu Ala Tyr Ser Pro Asn Arg Gln Ile Cys Pro Ala Gly Thr 325 330 335 Thr Ser Ser Cys Thr Ser Lys Ala Val Thr Leu Ser Ser Leu Ile Pro 340 345 350 Glu Ala Glu Asp Ser Trp Trp Thr Gly Asp Ser Ala Ser Leu Asp Thr 355 360 365 Ala Gly Ile Lys Leu Thr Val Pro Ile Glu Lys Phe Pro Val Thr Thr 370 375 380 Gln Thr Phe Val Val Gly Cys Ile Lys Gly Asp Asp Ala Gln Ser Cys 385 390 395 400 Met Val Thr Val Thr Val Gln Ala Arg Ala Ser Ser Val Val Asn Asn 405 410 415 Val Ala Arg Cys Ser Tyr Gly Ala Asn Ser Thr Leu Gly Pro Val Lys 420 425 430 Leu Ser Ala Glu Gly Pro Thr Thr Met Thr Leu Val Cys Gly Lys Asp 435 440 445 Gly Val 450 <210> 2 <211> 171 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(171) <223> SAG1A <400> 2 Pro Pro Leu Val Ala Asn Gln Val Val Thr Cys Pro Asp Lys Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ala Ala Val Ile Leu Thr Pro Thr Glu Asn His Phe Thr Leu Lys 20 25 30 Cys Pro Lys Thr Ala Leu Thr Glu Pro Pro Thr Leu Ala Tyr Ser Pro 35 40 45 Asn Arg Gln Ile Cys Pro Ala Gly Thr Thr Ser Ser Cys Thr Ser Lys 50 55 60 Ala Val Thr Leu Ser Ser Leu Ile Pro Glu Ala Glu Asp Ser Trp Trp 65 70 75 80 Thr Gly Asp Ser Ala Ser Leu Asp Thr Ala Gly Ile Lys Leu Thr Val 85 90 95 Pro Ile Glu Lys Phe Pro Val Thr Thr Gln Thr Phe Val Val Gly Cys 100 105 110 Ile Lys Gly Asp Asp Ala Gln Ser Cys Met Val Thr Val Thr Val Gln 115 120 125 Ala Arg Ala Ser Ser Val Val Asn Asn Val Ala Arg Cys Ser Tyr Gly 130 135 140 Ala Asn Ser Thr Leu Gly Pro Val Lys Leu Ser Ala Glu Gly Pro Thr 145 150 155 160 Thr Met Thr Leu Val Cys Gly Lys Asp Gly Val 165 170 <210> 3 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 3 Gly Lys Pro Leu Asp Glu Arg Ala Val Gly Gly Lys Gly Glu His Thr 1 5 10 15 Pro Pro Leu Pro Asp Glu Arg Gln Gln Glu Pro Glu Glu Pro Tyr Ser 20 25 30 Gln Arg Ala Ser Arg Val Ala Glu 35 40 <210> 4 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> glutathione S-transferase from pGEX-4T-1 vector <400> 4 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Gly Ser Pro Glu Phe Pro Gly Arg Leu Glu Arg Pro His Arg Asp 225 230 235 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for SAG1A <400> 5 gttgaattcg atccccctcc ttgttgcc 28 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for SAG1A <400> 6 gtggaattcg actccatctt tcccgca 27 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for linker <400> 7 cgggatccca gggaccagtc gac 23 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for linker <400> 8 cgggatccaa ccggttcttc tggct 25

Claims (10)

  1. 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 의 SAG1(surface antigen 1) 및 GST(glutathione-S-transferase)가 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 링커를 통하여 융합된 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 수용성으로 발현되는 것인 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 SAG1(surface antigen 1) 이 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것인 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것인 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 유전자.
  6. 제5항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 제6항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체.
  8. 제7항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는,
    톡소포자충(Toxoplasma gondii) 의 SAG1(surface antigen 1) 및 GST(glutathione-S-transferase)가 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 링커를 통하여 융합된 융합 단백질을 제조하는 방법.
  9. 제1항의 융합 단백질을 포함하는 톡소포자충 감염 진단용 조성물.
  10. 제1항의 융합 단백질을 포함하는 톡소포자충 감염 진단 키트.
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