KR20090015020A

KR20090015020A - 항-선충 항체에 의해 인식되는 폴리펩타이드 및 그 용도

Info

Publication number: KR20090015020A
Application number: KR1020087021865A
Authority: KR
Inventors: 빠스깔 부아로; 밍구안 리우; 바오콴 푸우; 다니엘르 르 렁; 셀린느 바우옹; 이자벨르 발레; 프랑끄 르 궤이에; 로멜 헤르난데스 벨로; 지우핑 우
Original assignee: 엥스티튀 나시오날 드 라 르세르쉬 아그로노미끄; 질린 유니벌시티; 에이젠스 프란카이세 드 세큐리트 세니테레 데스 앨리멘츠
Priority date: 2006-02-07
Filing date: 2007-02-07
Publication date: 2009-02-11
Also published as: ES2356394T3; DE602007009803D1; FR2897063B1; EP1987357B1; CA2641499A1; WO2007090960A1; CN101589306A; PL1987357T3; PT1987357E; US20100098717A1; JP2009525740A; EP1987357A1; US7993860B2; ATE484749T1; EP1987357B8; DK1987357T3; FR2897063A1

Abstract

본 발명의 목적은 항 선충에 의해 인식되는 항원 폴리펩티드의 생물학적 샘플에서 항-선충 항체를 탐지하는 시약으로서의 용도로서, a)항원결정기가 PSSGSRPTYP (서열번호 5)로 정의되는 NBL1 항원의 면역우세의 항원결정기로 구성되는 폴리펩티드. b) 411 항원으로도 불리는 서열번호 4의 아미노산 25-175 서열로 구성되거나(411 단백질의 성숙한 형태를 나타냄), 서열번호 4의 아미노산 25-175 서열과 적어도 80% 및 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는(증가될수록 바람직함), 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 생물학적 샘플에서 항 선충 항체의 존재를 탐지하는 방법으로서, 상기 샘플에 존재할 수 있는 항 선충 항체와 항원/항체 결합을 형성하는 것이 가능한 조건 하에서, 상기 1개 이상의 폴리펩티드 a) 및/또는 1개 이상의 폴리펩티드 b)와 상기 생물학적 샘플을 결합시키는 방법;및 어떤 적당한 수단으로든, 형성 가능한 항원/항체 복합체(complex)를 탐지하는 방법을 목적으로 한다. 또 다른 목적으로는 항 선충 항체에 의해 인식되는 항원성 폴리펩티드 및 상기 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 항체를 탐지하는 방법 및 키트, 면역학적 조성물, 백신을 포함한다. 이러한 항원으로서의 폴리펩티드 및 백신 등은 선충의 조기 진단 및 ELISA 분석의 민감성을 향상시킨다.

항-선충(anti-Trichinella)항체, 항원결정기(epitope), 항원/항체복합체(complex), 재조합 벡터, E/S antigen, 면역학적 조성물,

Description

항-선충 항체에 의해 인식되는 폴리펩타이드 및 그 용도{Polypepties recognized by anti-Trichinella antibodies, and uses thereof}

본 발명은 선모충증(trichinellosis)의 예방과 진단에 있어, 기생 선충 (Trichinella)에서 동정된 새로운 항원의 용도에 관한 것이다.

선모충증은 기생 선충에 의해 감염된 육류의 섭취와 관련된 동물원성 감염 질병이다(MURRELL et al., 2000).

Adenophorea류의 이 선충류는 8개의 종과 계통발생학적으로 다른 그룹이지만 연관된 3개의 유전자형(genotype)을 포함하는 Trichinellidae과에 속한다: 한편으로, 포유류를 감염시키는 캡슐형 선충(T. spiralis ; T. nativa ; T. britovi ; T.murrelli; T. nelsoni), 다른 한편으로, 포유류, 조류, 파충류를 감염시키는 비캡슐형 선충( T. pseudospiralis ; T. papuae ; T. zimbabwensis) (GASSER et al ., 2004)이 있다. 이 모든 종은 인간을 감염시킬 수 있다.

상기 기생충의 생활사는 자가 이질적(autoheteroxenous)이다: 동일한 숙주에서 전적으로 일어나며, 이는 연속적으로 최종적인 숙주(성체 기생충을 운반) 및 매개 숙주(감염된 유충을 운반)가 된다(BOIREAU et al., 2002). 감염된 유충을 숙주에서 다른 곳으로 옮기는 것은 새로운 생활사가 시작되기 위해 필수적이다. 이러 한 과정은 유충에 의해 감염된 날고기나 덜 조리된 고기의 섭취로 인해 발생한다. 소화하는 동안, 후자는 방출되고, 내장 상피를 통과하며, 거기서 생식 가능한(sexual) 성체(Ad) 기생충으로 성숙하게 될 것이다. 수정된 암컷이 뒤이어 신생 L1 유충(larvae)를 방출하고 이것은 림프 순환과 혈류를 통해 횡문근에 도달하게 된다. 이러한 L1NN 유충은 근육세포를 관통하는데,(감염 발달 단계 L1M: L1 근육 유충), 그들은 근육세포가 캡슐형 선충의 경우 두껍고, 비캡슐형 선충의 경우 매우 얇은 보호성 콜라겐 캡슐에 의해 둘러싸인 feeder cell로의 탈분화를 초래한다.

선모충증이 동물에게 있어는 증상이 없으나, 인간의 감염은 초기 내장 단계동안 메스꺼움을 동반한 설사,구토 및 심한 복통으로 나타나는 반면, 근육 침입 단계와 관련된 증상은 발열, 얼굴 부종 및 근육통의 결합에 특징이 있다(CAPO & DESPOMMIER, 1996). 또한 이러한 선모충증의 임상적 증상에 시각, 폐, 위장, 심장, 신경으로의 침입이 있을 수 있으며, 더 발전되는 경우 치명적일 수 있다. 감염의 만성적 특성은 feeder cell에서의 기생충의 생존과 관련이 있다.

모든 기생충 단계에 대한 조치가 가능하도록 특히, L1M 유충 주위에 보호성 캡슐의 형성 전에 감염 여부가 일찍 진단된다면, 인간 선모충증에 대해 anthelminthics의 특별한 치료가 훨씬 효과적이다(FOURESTIE et al., 1988).

전염병학적 데이터는 주로 돼지에 의해 나타나는 domestic 감염 사이클 또한 보유하는 많은 종의 야생형 동물상과 관련된 전이방법과 관련하여, 기생충이 전세계 모든 지역에 지리적 분포를 나타내고 있음을 보여준다(DUPOUTY-CAMET,2000).

최근 나타나거나, 재출현하는 동물원성 감염증인 인간 선모충증의 전염은 항 상 효과적이지는 않을 수 있는 식습관과 위생 관리로 인해, 전세계를 통해 진정한 건강문제를 위협한다(MURRELL & POZIO, 2000). 이러한 전염은 본질적으로 돼지와 야생 멧돼지 및 말고기와도 관련이 있다(BOIREAU et al.,2000).

따라서, 인간 감염의 예방은 고기를 올바르게 조리하는 것과 사육 조건을 개선하는 것 및/또는 동물 선충의 관리 조건과 연관이 있다(돼지, 말, 야생 멧돼지, 기타 선충에 민감한 야생종)(BOIREAU et al., 2002).

선충 검진 기술은 2가지 범주로 나누어질 수 있다: 1) trichinoscopy(고기 단편의 현미경 관찰)에 의하거나 또는 근육샘플의 인공적 소화 후 L1M 유충의 직접적인 탐지. 2) 선충 항원에 대한 항체의 감지를 위한 다양한 면역학적 방법에 의한 간접적인 탐지.

기생충의 각각의 발달단계: 성체(Ad), 신생 유충(L1NN) 및 근육 유충(L1M)은 각각 대응하는 특정의 항원 프로파일을 가진다.

이는 현재 면역진단을 위해 사용되는 L1M-단계 유충 유래의 항원 준비이다. 이것은 초기 단계의 Ad와 L1NN의 항원 단편이 정제하기 어렵고, 현재까지, 이들 2단계 중 하나 및/또는 다른 것과 관련된 면역우세한(immunodominant) 항원을 찾아내기가 어려웠기 때문이다.

원칙적으로 유충의 세포용해(lysis), 용해물(lysate)의 원심분리(centrifu-gation), 상층액(supernatant)의 recovery에 의해 얻어진 전체 가용성 항원 (soluble antigen)이나, 보다 흔하게는 배출/분비 항원(E/S 항원)의 준비가 사용된다.

배출/분비 항원은 L1M 유충이 배지에서 survival condition하에 있었을 때 만들어진다; 그들은 염주체(stichosome)라는 특정 조직으로부터 유래하며, 이는 약 50개의 원반모양의 세포, 염주세포(stichocytes)로 구성된다. 염주세포는 미립 (granule)을 포함하며, 그 내용물은 세관(canaliculus)에 의해 기생충 식도의 장강(lumen)으로 비워진다(evacuate). 이러한 내용물은 매우 높은 항원적인 것으로, 배출/분비 항원의 일부를 구성한다. 이러한 항원들은 선충에서만 알려져 있으며, 이 기생충의 모든 종에 존재하는 특정 탄수화물 분자인 beta-tyvelose를 함유하는 glycoproteins 그룹(TSL1 항원이라 불림)을 특히 포함하는 단백질 복합체를 형성한다.

선충의 면역진단의 관점에서 현재 대조군(reference)으로 사용되는 배출/분비 항원의 준비는 Trichinella spiralis L1M 유충의 배지로부터 얻어진다. 18-20시간 배양 후, 배지는 여과에 의해 복구되고, 다시 농축된다.(GAMBLE et al., 1983; GAMBLE et al.,1988)

전체 가용 항원 준비가 어려운 주된 이유는 특이성의 부족이다. 다른 기생충감염(parasitoses)과 항원 교차반응(cross reaction)이 흔히 관찰된다. 상기 배출/분비 항원은 그것이 더 나은 특이성을 갖도록 해준다. 그러나, 두 경우 모두에 있어서, 표준화된 항원의 batches를 많은 양으로 생산하는 것이 어렵다.

E/S 항원 준비의 면역우세한 항원결정기(epitope)을 나타내는 beta-tyvelose를 포함하는 당 구조(REASON et al., 1994; 미국 특허 5,541,075 및 5,707,817)는 화학적으로 합성되어 왔으며, 선충 면역진단을 위한 사용이 제시되어왔다.

이 시약은 훌륭한 특이성을 가지나, 그 민감성은 E/S항원용보다 적은 것으로 보인다. 또한, 이 구조의 화학 합성은 비싸며, 수행하기 어렵다.

선충의 혈청학적 진단의 관점에서 직면하게 되는 또 다른 문제는 감염 초기단계에 대응하는 탐지의 "blind window"의 존재로서, 이것은 잘못된 부정적 결과에 의해 나타나는 것이다. 또한, 말에서는 감염 후 25주에 항체의 점차적인 소실이 관찰되었다.

발명자는 동물과 인간 모두에게 있어, 선충 감염의 탐지를 초기에 특이적이며, 민감하게 탐지하기 위한 수단을 제공하기 위해, 선충의 감염 초기단계와 관련되고, 선충의 혈청학적 진단에 사용될 수 있는 면역우세한 항원을 찾는 것을 수행해왔다. 이러한 목적으로, L1NN 단계 및/또는 Ad 단계에서 선충에 의해 발현되는 유전자의 산물과 바람직한 항원 특성을 가진 단백질 중에서, 그것들이 존재하는지를 조사해 왔다.

이러한 관점에서, 이 유기체의 L1NN 단계에서 특별히 발현되는 단백질의 한 부분인 Trichinella spiralis 단백질이 면역 우세한 항원을 구성하며, 선충에 대한 체액 반응의 초기 탐지를 가능하게 한다는 것을 발견하였으며, 그것이 또한 다양한 선충 종류 사이에서도 보존된다는 것을 발견하였다.

이하, 이 단백질은 NBL1으로 명명한다. 이 단백질과 그로부터 유도되는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 완전한 cDNA 서열은 각각 Genbank 번호 AF331160 및 AAK16520(Swissprot Q9BJL7 로도 알려짐)에서 각각 접근가능하다; 이러한 서열은 "신생 유충에 특이적인 serine protease SS2" 로 명명된다. 이러한 서열은 또한 서열번호 1 및 서열번호 2하에 열거된 첨부 서열에서 각각 복제된다. 이 단백질과 그로부터 유도되는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 부분적인 cDNA서열은 각각 Genbank 번호 AY491941 및 AAR36900(Swissprot Q6RUJ3로도 알려짐)에서 접근가능하다.

발명자는 또한 NBL1에 대한 체액 반응과 관련된 면역반응성이 이 단백질의 C-말단에 위치한다는 것을 보여주었으며, 이러한 반응의 원인인 면역 우세한 항원결정기를 밝혀내었다.

더욱이, 발명자는 T.　 spiralis의 혼합된 최초의 Ad+L1NN 단계의 cDNA library를 사용하여 이하 411로 불리는 새로운 유전자를 밝혀내었다.

이 유전자의 서열은 서열번호 3, 그 번역 산물인 서열번호 4에 열거된 첨부 서열에 나타난다. 이 유전자의 번역 산물은 Tp21-3 단백질로 알려진 E/S 항원과 관련이 있으며(78.7% 동일성), T.　 pseudospiralis에서 동정되었고 (AAF79206; NAGANO et al., 2001), 또한 T.　 spiralis의 가정적인(hypothetical) ORF　17.20 (AAB48489)의 번역 산물과 관련이 있으며, 86.65%의 동일성을 갖는다.

411 유전자 번역 산물은 또한 초기 단계에서 다양한 선충 종에 대한 체액 반응을 탐지하는 것을 가능하게 한다.

또한, NBL1 및 411 항원 각각은 수행되는 분석(assay)에서 적어도 감염 후(Pi) D15-D30 기간동안 E/S 항원으로도, 다른 항원으로도 탐지되지 않는 선충으로 감염된 동물을 탐지하는 것을 가능하게 한다.

따라서, 411항원과 NBL1항원(또는 그 면역우세의 항원 결정기)의 결합은 특히 감염 초기단계(감염 후 15-20일)에서 진단의 민감성을 향상시키는 것이 가능하다.

결과적으로, 본 발명의 목적은 생물학적 샘플에서 항 선충 항체를 탐지하는 시약으로서, 항 선충에 의해 인식되는 항원 폴리펩티드의 용도로서, 상기 폴리펩티드는 다음으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다:

a) 항원결정기가 PSSGSRPTYP (서열번호 5)로 정의되는 NBL1 항원의 면역우세의 항원결정기를 포함하는 폴리펩티드.

b) 이하 411 항원으로도 불리는 서열번호 4의 아미노산 25-175 서열로 구성되거나(411 단백질의 성숙한 형태를 나타냄), 서열번호 4의 아미노산 25-175 서열과 적어도 80% 및 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는(증가될수록 바람직함), 서열을 포함하는 폴리펩티드.

본 발명의 목적은 특히, 생물학적 샘플에서 항 선충 항체의 존재여부를 탐지하는 방법으로서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 한다.

- 상기 샘플에 존재할 수 있는 항 선충 항체와 항원/항체 결합을 형성하는 것이 가능한 조건 하에서, 상기 1개 이상의 폴리펩티드 a) 및/또는 1개 이상의 폴리펩티드 b)와 상기 생물학적 샘플을 결합시키는 방법.

- 어떤 적당한 수단으로든, 형성 가능한 항원/항체 복합체(complex)를 탐지하는 방법.

일반적으로, 상기 생물학적 샘플은 혈청(serum) 샘플이다. 이는 선충에 의해 감염될 수 있는 종에 속하는 어떠한 개체(포유류, 조류 또는 파충류)로부터도 얻을 수 있으며, 여기에서 이 기생충의 존재 여부를 탐지하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 포유류, 가령, 축산동물이나 환자로부터 얻은 샘플이다.

바람직하게는 상기에서 정의된 1개 이상의 폴리펩티드 a) 및/또는 1개 이상의 폴리펩티드 b)을 포함하는 혼합물이 사용된다.

이러한 조합은 특히 개별적으로 사용되는 각각의 폴리펩티드에 비해, 반응 스펙트럼을 넓히는 것이 가능하다.

상기에서 정의된 폴리펩티드 a) 또한 Genbank 접근번호 AAK16520에 나타나는 전체 NBL1항원 및 Genbank 접근번호 AAR36900에 나타난 그 단편을 배제하고, 본 발명의 목적의 일부이다.

본 발명에 따른 이러한 폴리펩티드 중에서, 특히 다음의 서열 1개 이상을 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 것이 언급될 것이다: 서열:PSSGSRPTYPSSGSR (서열번호　6); 서열 PSSGSRPTYPYTGSR (서열번호7); 서열 RPTSPSSGSRPTYPS (서열번호　8).

예를 들어, 이것은 NBL1항원의 C-말단 단편을 포함한다: 부분적으로, 다음의 서열을 포함하는 서열이 언급될 것이다:

ENSPEGTVKWASKEDSPVDLSTASRPTNPYTGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTYPSSGSRPTYPYTGSRPTPQKPVFPSYQKYPPAVQKYIDSLPSGTQGTLEYTVTQNGVTTTT(서열번호　11),

이는 서열번호 2의 아미노산 326-459 서열 및 서열번호 11의 단편의 일부에 대응하며, 특히 다음의 서열을 포함한다:

PSSGSRPTYPSSGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTYPSSGSRPTYP (서열번호 9),

이는 서열번호 2의 아미노산 363-409 서열에 대응하며, 특히 다음의 서열을포함한다:

SRPTNPYTGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTYPSSGSRPTYPYTGSRPT (서열번호　10),

이는 서열번호 2의 아미노산 349-415 서열에 대응한다.

상기에 정의된 폴리펩티드 b)는 Genbank 접근번호 AAF79206 및 AAB48489에 나타난 것을 제외하고, 본 발명의 목적의 일부이다. 선호되는 폴리펩티드는 특히 서열번호 4의 폴리펩티드 또는 서열번호 4의 아미노산 25-175에 대응하는 폴리펩티드 및 서열번호 4 또는 서열번호 4의 아미노산 25-175 서열과 적어도 90% 또는 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드.

본 발명은 특히 서열 PSSGSRPTYP (서열번호 5)의 1개 이상의 카피 또는 이러한 서열을 포함하는 NBL1 항원 단편의 1개 이상의 카피 및 /또는 상기 정의된 폴리펩티드 b)의 1개 이상의 카피로 구성을 포함하거나, 선택적으로 1개 이상의 다른 이종 서열과 융합된 키메릭 폴리펩티드 (chimeric polypeptide)를 포함한다.

본 발명의 목적은 또한 상기 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터 및 상기 벡터로 형질 전환된 숙주세포이다.

본 발명의 목적은 또한 상기 정의된 바에 따라, 1개 이상의 폴리펩티드a) 및 1개 이상의 폴리펩티드 b)이며, 또한 상기 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이다.

상기 정의된 폴리펩티드 a) 및 b)는 이미 알려진 항체를 탐지하는 다양한 관점에서 사용될 수 있다. 실시예로서, 특히 ELISA 형태의 방법(직접, 간접 또는 sandwich) 및 micoagglutination on beads 방법 및 면역탐침(immunolabeling)과 결합된 전기영동 블롯팅(electrophoretic blotting) 방법을 들 수 있다.

본 발명의 목적은 또한 생물학적 샘플에서 항 선충 항체의 존재를 탐지하는 키트로서, 상기 정의된 바에 따라 1개 이상의 폴리펩티드 a) 및/또는 1개 이상의 폴리펩티드 b)를 포함하는 것을 특징으로 하며, 항원/항체 복합체를 형성하도록 하는 반응 배지를 구성하기에 적합한 버퍼와 적합한 시약, 선택적으로 상기 항원/항체 복합체를 탐지하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 상기 키트는 상기 정의된 바에 따라, 고체 지지체에 고정된 폴리펩티드 a) 및/또는 폴리펩티드 b)를 포함한다. 사용될 수 있는 고체 지지체의 실시예로서, 한정하지 않고 microtitration plates, beads, microbeads 또는 microparticles, strips 등을 들 수 있다.

상기 키트는 또한, 1개 이상의 음성적 혈청 또는 1개 이상의 양성적 혈청과 같은 대조 샘플을 포함한다.

본 발명의 목적은 또한 상기 폴리펩티드에 대해 특이적으로 유도되는 항체를 준비하기 위한 상기 정의된 바에 따른, 폴리펩티드 a) 및/또는 폴리펩티드 b)의 용도이다.

이러한 폴리펩티드는 항체를 준비하는 이미 알려진 다양한 방법의 관점에서 사용될 수 있다. 가령, 이들은 (선택적으로 적합한 adjuvant의 첨가 후에) 동물의 면역에 사용될 수 있다. 또한 이들은 생물학적 체액으로부터 관련 폴리펩티드에 대한 특이적 항체를 정제할 수 있도록, 친화 크로마토그래피 지지체에 심어질(grafted) 수 있다. 가령, 생물학적 체액은 관련된 폴리펩티드 또는 융합세표(hybridoma) 상층액으로서, 사전에 면역된 동물의 혈청일 수 있다; 그것은 선충에 감염된 동물의 혈청일 수 있으며, 그로부터 관련 폴리펩티드에 대해 특이적으로 유도된 항체 집단을 분리해 내는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바에 따라, 폴리펩티드 a) 또는 폴리펩티드 b)에 대해 특이적으로 유도되는 모든 항체를 포함한다. 이들은 polyclonal 또는 monoclonal 항체이다. 선호되는 항체는 PSSGSRPTYP epitope(항원결정기)(서열번호 5)를 인식하는 것들이다.

폴리펩티드에 대해 특이적으로 유도된 항체는 이미 알려진 다양한 방법, 특히, 관련 폴리펩티드(선택적으로 적합한 adjuvant가 첨가될 수 있음)에 의한 동물의 면역화를 포함하는 전통적인 방식 또는 그 혈청(polyclonal 항체의 생산을 위해)또는 림프 세포(monoclonal 항체 생산을 위해)의 복구(recovery)에 의해 얻어질 수 있다.

상기 정의된 폴리펩티드 a)및 b) 또한, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 면역학적 조성물 특히 항 선충 백신으로 사용될 수 있다.

본 발명의 목적은 또한 상기 정의된 바에 따라, 면역반응을 강화하기 위한 1개 이상의 adjuvant와 결합된 1개 이상의 폴리펩티드 a) 및/또는 1개 이상의 폴리펩티드 b)또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역학적 조성물이다.

본 발명에 따른 면역조성물의 바람직한 실시예에 따라, 그것은 백신이다.

폴리펩티드의 면역성을 증가시키기 위한 매우 다양한 adjuvant는 이미 당업자에게 잘 알려져 있다. adjuvant의 예로서, alum (aluminum hydroxide), complete Freund's adjuvant 또는 incomplete Freund's adjuvant (IFA), 리포좀(liposomes) 및 virosomes(재구성된 viral envelopes), muramic acid 의 펩티드 유도체 등이 있다. 백신의 경우, 물론 약학적으로 가능한 adjuvant를 선택할 수 있다; 선호되는 adjuvants로 예로써, 가령 SEPPIC회사에 의해 MONTANIDE ISA　70 및 MONTANIDE ISA　775로 판매되는 adjuvant인 "water-in -oil" 에멀젼 타입의 adjuvants를 들 수 있으며, 유럽특허 EP 480 982, EP 825 875 및 미국 특허 5,422,109 및 6,251,407 및 6,610,309에 기술되어 있다.

특히 짧은 폴리펩티드(≤ 30 아미노산)의 경우에 적당하며, 상기 폴리펩티드는 carrier protein과 커플이 될 수 있다.

Carrier protein의 예로서, 특히 KLH (keyhole limpet hemocyanin), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, tetanus toxoid 또는 diphtheria toxoid를 들 수 있다. 동일한 펩티드의 다양한 카피를 서로 다른 것과 결합시킴으로써, 다양한 항원결정기 조성물(multiepitope composition)을 형성하는 것도 가능하며, 선택적으로 키메릭(chimeric) 폴리펩티드의 형태로나 폴리리신과 같은 중합체 사슬(polymeric chain)에 의해 다른 epitope와 결합함으로써, multiepitope composition)을 형성하는 것도 가능하다.

만일 폴리뉴클레오티드가 면역원으로 사용된다면, 면역성 조성물은 상기 투여된 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 벡터의 형태일 것이다. 가령, poxviruses, andenoviruses, retroviruses, lentiviruses, herpesviru-ses 및 AAVs(adeno-associated viruses)와 같은 바이러스성 벡터를 이용할 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1개 이상의 발현 벡터로 형질전환된 비병원성 박테리아의 형태일 수도 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 직접적으로 naked DNA 형태로 투여될 수도 있고 또는 리포좀으로 통합될 수도 있다. 백신의 경우, 바람직하게는 비병원성 박테리아 (예를 들어 lactobacillus 또는 Escherichia coli 나 Samonella suis의 비병원성 변종) 또는 백신의 바이러스 변종으로부터 유도된 벡터를 이용할 수 있다; 가령, pseudorabies (Aujeszky's disease) virus의 백신 변종으로부터 유도된 벡터.

본 발명은 선모충증의 초기의 면역 진단 동안 NBL1 및 411 항원의 사용을 나타내는 실시예를 언급하는 다음의 설명에 의해 더 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 THX-NBL1(Cterm) 단백질의 서열로서, NBL1로부터 유래하는 서열은 볼드체로 나타내었고, 플라스미드 pET102로부터 유래한 서열은 이탤릭체로 나타내었다.

도 2는 THX-NBL1(Cterm) 단백질의 면역성을 나타내었다.

M: 분자량 표시; 1: 음성적 돼지 체액; 2: T.　 spiralis의 20 000 L1M으로 실 험적으로 감염된 돼지로부터의 체액.

도 3은 T.　 spiralis 로 감염된 돼지 체액에 THX-NBL1(Cterm) ELISA 또는 E/S Ag ELISA에 의해 탐지되는 항 선충 항체의 출현의 반응속도 비교이다.

A: THX-NBL1(Cterm) ELISA에 의한 탐지; B: E/S Ag ELISA에 의한 탐지

x-축: 감염 후 일수; y-축: 반응 퍼센트; ELISAs의 임계치 탐지는 검은 선으로 나타내었다(THX-NBL1(Cterm) ELISA 44% 및 the E/S Ag ELISA 14%). 샘플/ 양성 조절 비율의 평균 및 표준 편차는 각각의 감염된 돼지 그룹에 대한 것을 나타낸다.

도 4는 NBL1(Cterm) ELISA의 면역성을 나타낸다.

x-축: 축산 농장의 돼지나 넓은 범위의 돼지로부터 유래하는 230 음성 샘플집단. 5개의 샘플은 실험상으로 감염된 돼지의 체액으로부터 유래한다. 임계치는 음성 샘플의 평균치의 2배와 같다. y-축: 반응 퍼센트.

도 5는 THX-411 단백질의 서열로서, 411로부터 유래하는 서열은 볼드체로 나타내었다. 플라스미드로부터 유래하는 서열은 이탤릭체로 나타내었다.

도 6은 THX-411 단백질의 면역반응을 나타낸다.

1:양성 체액 50d pi; 2: 양성 체액 30d pi; 3: 음성 체액 -5d; 4:복합 조절. M: 분자량 표시.

도 7은 T.　 spiralis 로 감염된 돼지 체액에서THX-411 ELISA 또는 E/S Ag ELISA에 의해 탐지되는 항 선충 항체의 출현의 반응속도 비교를 나타낸다.

A:　THX-411 ELISA에 의한 탐지; B:　E/S Ag ELISA에 의한 탐지

x-축: 감염 후 일수; y-축: 반응 퍼센트. ELISAs의 탐지 임계치는 검은선으 로 표시되었다(THX-411 ELISA 52%: E/S Ag ELISA 14%). 샘플/ 양성 조절 비율의 평균 및 표준 편차는 각각의 감염된 돼지 그룹에 대한 것을 나타낸다.

실시예 1: NBL1 의 C-말단 부분을 포함하는 재조합 THX - NBL1 ( CTERM ) 단백질의 제조.

Trichinella spiralis L1NN cDNA library의 면역검사가 10　000 T.　 spiralis L1M로 실험적 감염 후 35일에 얻은 돼지 혈청으로 수행되었다. 이 혈청에 의해 인식되는 클론의 sequencing은 동일한 단백질을 코딩하는 그들의 대부분을 결정할 수 있도록 한다.

이 단백질은 serine protease로 추정되고, 그 cDNA sequence 및 상기의 유도된 아미노산 서열은 각각 Genbank 번호 AF331160 및 AAK16520에서 이용가능하며, 또한 서열번호 1 및 서열번호 2하에서 여기에도 복제된다. 여기에서는 NBL1로 나타낸다.

상기 단백질의 C-말단 부분의 일부는 oligonucleotides NBL1CtermF (5'-CACCGAAAATTCTCCTGAAGGA-3')(서열번호 12) 및 NBL1CtermR (5'-TGTTGTTGTAGTAACTCC-3') (서열번호　13) 및 the AccuPrime Pfx DNA polymerase (Invitrogen)를 사용하여 증폭되었고, 제조업체(Invitrogen)의 추천에 따른 "Champion pET102 Directional TOPO" expression kit를 사용하여 plasmid pET102D/topo로 클론되었다.

pET102-NBL1(Cterm)라 불리는 획득된 재조합 플라스미드는 C-말단에 poly-histidine tag를 가진 thioredoxin-NBL1(Cterm)융합 단백질을 코딩한다. 이 융합 단백질의 서열은 도 1에 나타나있다.

THX-NBL1(Cterm)융합 단백질은 plasmid pET102-NBL1(Cterm)로 형질전환된 E.　coli BL21 Star (DE3) 및 BL21 (DE3)pLys bacteria (Invitrogen)로 발현되었고, 공급자(Qiagen)의 추천 protocol을 사용하여, Ni-NTA column (Ni-NTA spin columns kit; Ni-NTA beads)에서 변성 조건하에 친화 크로마토그래피에 의해 정제되었다.

정제된 THX-NBL1(Cterm) 융합 단백질은 변성조건하의 전기 영동(SDS-PAGE) 후에 31.1　kDa의 예상 크기의 밴드 형태로 나타났다.

선모충증이 없는 돼지 체액 및 감염 후 60일 후 20　000 T.　 spiralis L1M larvae로 감염된 돼지 혈청으로부터의 THX-NBL1(Cterm) protein의 면역반응은 Western blotting으로 분석되었다.

변성 조건하의 전기 영동(SDS-PAGE) 후, 상기 단백질은 공급자(Amersham)의 지시에 따라 Hybond　P(PVDF)membrane에서 전기영동(electro-blotted)되었다. Membranes는 TBS-T (20　mM Tris-HCl, pH　7.5, 150　mM NaCl, 0.1% Tween 20) 및 5% of skimmed milk에서 미리 혼성화되었다(pre-hybridized).

TBS-T에서 1분 동안 2번 세척하고 나서, TBS-T에서 5분 동안 3번 세척한 후에, membranes는 TBS에서 1/200으로 희석된 돼지 혈청으로 1시간 동안 배양되었다.

세척 후, membranes은 1/30　000 로 희석된 alkaline phosphatase (A1192, Sigma)로 라벨된 토끼의 항-돼지 IgG 2차 항체로 20분간 배양되고 나서, 라벨을 밝히기 위해, 30분간 pure NBT/BCIP substrate (E116, Interchim)로 배양되었다.

결과는 도 2에 도시되었다.

THX-NBL1(Cterm)의 매우 강한 면역반응이 T.　 spiralis 에 감염된 돼지의 혈청으로 관찰되었다.

실시예2 : 선충( TRICHINELLA) 에 대한 체액반응을 탐지하기 위한 THX -NBL1(CTERM)의 사용

상기 실시예 1에 기술된 대로, THX-NBL1(Cterm) 단백질은 T.　 spiralis 배출/분비(E/S) 항원과 비교하여, T.　 spiralis 로 감염된 돼지로부터 유래하는 혈청에 대한 간접적인 ELISA에 의해 평가된다.

대조군 E/S항원은 GAMBLE et al., (1988)에 기술된 protocol에 따라 준비되었다. 이는 pyruvate 1%, fetal calf serum (FCS) 15%, L-glutamine 1%, penicillin 100　μg/ml 및 100　μg/ml streptomycin을 포함하는 RPMI 1640에서 24시간 동안 survival condition하에 유지되는 L1M 유충의 배양 상층액으로부터 얻어질 수 있다.

ELISA assays 동안, E/S antigen에 대해 1.25　μg/ml 및 THX-NBL1(Cterm)에 대해 2　μg/ml의 비율로, 1X PBS buffer에서 희석된 항원은 96-well plates (MediSorp plates, NUNC), 4℃에서 밤새 배양되었다. 3번의 세척(1X PBS, 0.05%의Tween 20)후에, 플레이트는 세척용액에서 2%로 희석된 탈지우유 용액으로 1시간 동안 상온에서 포화되었다.

1X PBS buffer에서 1/20으로 희석되고 0.05%의 Tween 20 이 보충된 돼지 혈청 100　μl을 각 well에 넣었다. 37℃에서 30분간 배양 후, 뒤이어, 3번의 세척(1X PBS, 0.05%의 Tween 20) 후, 1X PBS buffer에서 1/32 000으로 희석되고 Tween 20 이 0.05% 보충된 복합(conjugate) 용액 100　μl (protein G-peroxi-dase (P-8170, Sigma))을 각 well에 넣었다. 37℃에서 30분간 더 배양 후, 뒤이어, 3번의 세척(1X PBS, 0.05%의 Tween 20) 후, 기질 용액 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine-hydrogen peroxide: TMB3) 100　μl을 각 well에 넣었다. 상온의 어두운 곳에서 20분간 배양한 후, 0.5M H₂SO₄를 100　μl/well 넣음으로써, 반응을 시킨다.

ELISA plate readings결과는 양성 대조 혈청에 대한 샘플 체액의 반응 퍼센트 형태로 제공된다.

양성 임계치(대조 음성 샘플의 평균치 2배)는 E/S Ag ELISA 14% 및 THX-NBL1(Cterm) ELISA 44%이다.

200, 1000 나 20　000 T.　 spiralis L1M larvae에 의해 실험적으로 감염된 통상의 돼지의 혈청에서, THX-NBL1(Cterm) ELISA 나 E/S Ag ELISA 에 의해 탐지된 항 선충 항체의 출현 반응속도(kinetics)를 비교하었다.

결과는 도 3에 나타내었다.

THX-NBL1(Cterm) antigen은 T.　 spiralis에 대한 체액반응의 용량에 따른(dose-dependent) 탐지를 가능하게 한다. Western blotting 에 의한 선형 epitopes의 탐지와 결합된 이 ELISA assay에 의한 conformational epitopes의 탐지는 게다가 Trichinella NBL1 단백질의 면역 우세한 특성을 나타낸다.

THX-NBL1(Cterm) ELISA는 감염 후 25일째 혈청전환(seroconversion)을 탐지 하는 반면, E/S Ag ELISA는 단지 10일 후에 혈청전환(seroconversion)을 탐지하였다.

T.　 spiralis 및 유럽에서 발견된 다른 3종의 Trichinella (T.　 nativa , T.　britovi 및 T.　 pseudospiralis )에 의해 유도된 체액 반응을 E/S Ag ELISA 및 THX-NBL1(Cterm) ELISA로 탐지한 것이 또한 비교되었다.

결과는 아래 표 1에 요약되었다.

이러한 모든 결과는 THX-NBL1(Cterm) ELISA가 특히 많이 감염된 동물에 대한 체액 반응의 감염 후 15일째부터의 초기 탐지 및 1000 L1M 매개 로드로 감염된 동물에 대한 약간 지연된 탐지(감염 후 25일째)를 할 수 있음을 보여준다. 동일한 protocol에 따라 감염된 holoxenic 돼지에게도 유사한 결과가 얻어졌다. E/S Ag ELISA에 의해 탐지된 가장 빠른 혈청 전환(seroconversion)은 감염 후 25일째였다. T.　spiralis 진단의 초기 탐지의 관점에서, 2가지 ELISA assays로 얻어진 결과를 비교하면 THX-NBL1(Cterm) ELISA(표 I)를 사용함으로써, 5-20일을 확보함을 보여준다. 더욱이, E/S Ag ELISA 및 THX-NBL1(Cterm) ELISA로 진단되는 T.　 spiralis 로 감염된 동물들은 모두 THX-NBL1(Cterm) ELISA로 감소된 혈청학적 탐지의 윈도우(window of serological detection)를 나타내었다.

THX-NBL1(Cterm) ELISA의 민감성은 이 동물실험 동안, 7/9 일반적인 돼지의 스크리닝 효과 즉, T.　 spiralis 20 000 L1M으로 감염된 돼지 3/3, 1000 L1M 로 감염된 돼지 3/3 및 단지 200 L1M으로 감염된 돼지 1/3의 스크리닝 효과로 나타난다. 상기 탐지는 이러한 동물에서의 T.　 spiralis 근육 기생충 로드와 관련되며, 이는 평균적으로 200 L1M으로 실험적으로 감염된 돼지 3 g당 larvae(LgG)에서부터, 1000 L1M으로 실험적으로 감염된 돼지 43(LgG) 및 20 000 L1M으로 실험적으로 감염된 돼지 538(LgG)까지 다양하다.

유럽에서 발견된 다른 3종의 선충인 T.　 nativa , T.　 britovi 및 T.　pseudospiralis에 의해 유도되는 체액반응은 또한 자체적으로 THX-NBL1(Cterm) ELISA에 의해 용량 의존적(dose-dependent)인 방식으로 탐지되고, 이는 Trichinella 속(면역우세)에서 NBL1의 유전자 및 항원의 보존을 증명하며, 결과적으로, 선모충증 진단의 넓은 스펙트럼에 대한 이점을 나타낸다. 진단의 민감성 및 초기성(감염 후 15일)이 확인되었다. 혈청전환 창(seroconversion window)는 THX-NBL1(Cterm) ELISA로 5-45일까지 감소되었으며, T.　 spiralis 감염과 마찬가지로, E/S Ag ELISA 및 THX-NBL1(Cterm) ELISA 모두에 의해 진단되는 모든 동물들은 THX-NBL1(Cterm) ELISA로 serological detection window가 감소됨을 보여주었다. 더욱이, T.　 nativa 종의 감염 분석은 THX-NBL1(Cterm) ELISA의 높은 민감성을 나타내며, 이는 E/S Ag ELISA 스크리닝으로 밝혀지지 않는 2마리의 돼지를 포함하여 6/9 동물(E/S Ag ELISA로 5/9 동물에 대해)을 진단하였으며, 반면, 근육 기생충 로드는 평균 단지 0.1 LpG에서만, 7×10^-4뿐이었다.

THX-NBL1(Cterm) ELISA 의 특이성은 각 실험적 감염 전 및 감염 후 10일까지의 모든 동물에서 취한 혈청에 의해 나타났다. 다양한 범위의 돼지로부터 200 혈청이상이 상기 분자의 특이성을 보여주기 위해 사용되었다. Trichinella에 대해 음성인 돼지는 어떤 것도 THX-NBL1(Cterm) ELISA와 반응하지 않았다.

이러한 결과는 도 4에 나타나있다.

실시예 3: NBL1 의 면역우세한 항원결정기의 동정

가장 항원성이 있는 구역을 예측하기 위해, NBL1의 C-말단 부분의 유도된 아미노산 서열의 in silico 분석(가상 실험 분석)이 수행되었다.

상기 in silico 분석의 결과, NBL1의 C-말단 부분(AA 327~AA 440)의 113AA 를 커버하는 11의 overlapping peptides를 선택하였다. 이하, 이러한 펩티드의 서열을 표시하였다.

N5EM1: NH2- NSPEGTVKWASKEDS -COHN2 (서열번호 14)

N5EM2: NH2- ASKEDSPVDLSTASR -COHN2 (서열번호 15)

N5EM3: NH2- LSTASRPTNPYTGSR -COHN2 (서열번호 16)

N5EM4: NH2- PYTGSRPTSPSSGSR -COHN2 (서열번호 17)

N5EM5: NH2- PSSGSRPTYPSSGSR -COHN2 (서열번호 6)

N5EM6: NH2- PSSGSRPTSPSSGSR -COHN2 (서열번호 18)

N5EM7: NH2- PSSGSRPTYPYTGSR -COHN2 (서열번호 7)

N5EM8: NH2- PYTGSRPTPQKPVFP -COHN2 (서열번호 9)

N5EM9: NH2- QKPVFPSYQKYPPAV -COHN2 (서열번호 20)

N5EM10: NH2- KYPPAVQKYIDSLPS -COHN2 (서열번호 21)

N5EM11: NH2- RPTSPSSGSRPTYPS -COHN2 (서열번호 8)

감염 후 60일에 수집된 20　000 T.　 spiralis L1M larvae로 감염된 돼지로부터의 혈청에 대한 N5EM peptides의 항원성은 실험예 2에서 나타난 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 간접 ELISA에 의해 측정되었으며, 상기 펩티드를 제외하고, 스트렙타비딘으로 선처리된 플레이트에서 배양된다(2　μg/ml in 1X PBS; 100　μl/well).

3가지 면역반응성있는 펩티드(N5EM5, 7 및 11)가 탐지되었다. 면역반응 펩티드의 1차 서열 분석은 10개의 아미노산의 공통적인 모티브(PSSGSRPTYP)(서열번호 　5)가 존재함을 보여준다. 또한, 이 모티브는 NBL1 단백질의 전체서열의 4배 이상을 나타낸다. 더욱이, 6AA overlappping 펩티드를 통한 항원결정기의 mapping은 펩티드 내에 선형 항원결정기의 면역 반응성에 대한 단일 아미노산인 티로신의 중요성을 증명할 수 있도록 한다.

추가적인 실험은 마지막으로 민감성과 초기성의 측면에서, N5EM5 및 N5EM7에 비해 가장 반응성이 좋은 펩티드임을 나타낸다.

이 펩티드는 THX-NBL1(Cterm)에 대한 실시예 2에서 기술된 바와 같이, T.　spiralis의 E/S antigen과 비교되었다.

상기 결과는 아래 표 2에 요약하였다.

이러한 결과는 N5EM11 ELISA 가 moderate T.　 spiralis 의 감염을 탐지하는 것이 가능하다는 것을 보여준다. 뿐만 아니라, 감염 후, 20일째로부터 즉, E/S Ag ELISA로 가능했던 것보다 5-10일 빠른, 초기 탐지가 가능해졌다.

감염 피크 후에 항 N5EM11 항체 적정농도(titier)에 있어서의 감소가 또한 관찰되었으며, 이는 이러한 초기 특성을 확인해주고, 이는 최근의 감염 날짜를 알려주는 데 유용하다. T.　 spiralis 로 감염되고, N5EM11 항원 ELISA 로 진단된 모든 돼지는 seroconversion window가 부분적으로 유사하나, 대부분의 경우, E/S Ag ELISA로 관찰된 것보다 적게 나타난다.

더욱이, T.　 spiralis 는 선충의 L1NN단계에서 이 항원의 면역우세를 나타내면서, T. nativa , T. britov 및 T. pseudospiralis 로 감염된 돼지 혈청과 항원 교차 반응을 보여준다. 이러한 항원 교차 반응으로 인해 E/S Ag ELISA보다 5-30일 빠른 탐지가 가능하다.

그럼에도 불구하고, T. pseudospiralis 로 감염되고 2가지 분석을 사용하여 함께 탐지된 동물의 지연된 탐지의 관점에서, 민감성의 감소는 E/S Ag ELISA와 비교에 있어 주목된다. 그와 반대로, N5EM11 ELISA는 또한 근육 기생충 로드가 남아있음에도 불구하고, T. nativa 로 감염되고, E/S Ag ELISA 로 스크리닝한 것에 의해 탐지되지 않는 동물을 진단하는 것이 가능하다.

N5EM11 ELISA의 특이성은 실험적 감염 전 및 감염 후 10일까지의 동물 300마리로부터 얻어진 혈청을 사용하여 측정되었다. 이 특이성은 99%를 초과한다. (결과는 나타내지 않음)

실시예 4: 411 항원의 동정 및 분리

T.　 spiralis 의 초기 침입 Ad+L1NN 단계의 cDNA library로부터 411 cDNA 클론이 선택되었다.

이 cDNA 클론의 핵산 서열 및 그 유도된 폴리펩티드 서열도 결정되었고, 각각 서열번호 3 및 서열번호 4하에 열거된 서열로 나타나있다. 이러한 411의 Open reading frame은 20 kDa로 추정되는 단백질을 코딩한다. 신호 펩티드를 제외하고, 어떠한 단백질 도메인도 동정되지 않았다.

411의 완전한 ORF를 Genbank에서 얻을 수 있는 서열과 비교하면, T. pseudospiralis에서 동정된 Tp21-3 배출/분비 단백질과 78.7% 동일성을 가지며(AAF79206; NAGANO et al., 2001), Polvere and Despommier에 의해 제출된 T.　spiralis 의 가정적인 ORF 17.20 서열(AAB48489)과 86.6% 동일성을 가진다.

411의 완전한 ORF는 올리고 뉴클레오티드 411F (5'-CACCCGAGAAAACATGCAT-3') (서열번호 22) 및 411R (5'-TCCATTCAATTTTGCGTCAC-3') (서열번호 23) 및 AccuPrime Pfx DNA polymerase (Invitrogen)를 사용하여 증폭되었으며, 제조업체(Invitrogen)의 추천에 따라 "Champion pET102 Directional TOPO" 발현 키트를 사용하여 플라스미드 pET102D/topo로 클론되었다.

얻어진 재조합 플라스미드 pET102-411는 330 AA의 thioredoxin-411 융합 단백질(THX-411)을 코딩하고, 36.7kDa의 예상 분자량을 가지며, C-말단에 폴리히스티딘 tag를 가진다. 이 융합 단백질의 서열은 도 5에 나타나있다.

THX-411 융합 단백질은 plasmid pET102-411에 의해 형질전환된 E. BL21 Star (DE3), BL21 (DE3)pLys bacteria (Invitrogen)로 발현되었으며, 공급자(Qiagen)가 권고한 protocol에 따라, Nicolumn (Nispin columns kit; NiNTA beads)에서 변성조건하에서, 친화크로마토그래피에 의해 정제되었다.

정제된 THX-411 융합 단백질은 변성 조건하의 전기영동 (SDS-PAGE) 후에, 36.7kDa의 예상 크기의 밴드 형태로 나타났다.

THX-411 단백질의 선모충증이 없는 돼지의 혈청 및 20 000 T.　 spiralis L1M 유충으로 감염된 후 30일 및 50일의 동일한 돼지의 혈청에 대한 면역반응성을 E/S 대조군 항원과 비교하였다(상기 실험예 2에 기술됨). 상기 분석은 상기 실험예 1에 기술된 동일한 protocol을 사용하여 Western blotting에 의해 수행되었다.

그 결과는 도 6에 나타나있다.

T.　 spiralis 로 감염된 돼지의 혈청과 THX-411의 매우 강한 면역 반응성이 관찰되었으며, 항 411 항체의 초기 탐지(감염 후 30일)가 관찰되었다. 잔존하는 THX-411 표본에 남아있는 고분자량의 박테리아 단백질과 혈청에 존재하는 항 E. coli 항체 사이의 교차 반응으로 인해 약간의 배경잡음(background noise)이 관찰되었다.

실시예 5: Trichinella 에 대한 체액반응을 탐지하기 위한 THX -411의 사용

상기 실험예 4에서 기술된 바에 따라 제조된 단백질은 T.　 spiralis 의 E/S 항원과 비교하여, 선충으로 감염된 돼지로부터의 혈청에 대한 간접 ELISA에 의해 측정되었다.

200, 1000, 또는 20 000 T.　 spiralis L1M 유충으로 실험적으로 감염된 통 상의 돼지 혈청에서 THX-411 ELISA 또는 E/S Ag ELISA에 의해 탐지되는 항 선충 항체의 출현에 대한 kinetics(반응속도)를 비교하였다. 또한 T.　 spiralis 및 유럽에서 동정된 다른 3종의 선충, T. nativa , T. britov 및 T. pseudospiralis 에 의해 유도되는 체액반응의 E/S Ag ELISA 및 THX-411 ELISA에 의한 탐지를 비교하였다.

사용된 protocol은 실험예 2에서 기술된 것과 동일하다. THX-411 항원은 2g/μl 에서, 그리고 E/S antigen 은 1.25g/μl에서 사용되었다.

양성 임계치는 E/S Ag ELISA의 경우 14%이고, THX-411 ELISA의 경우 52%이 다.

그 결과는 도 7에 나타나 있으며, 또한 아래 표 3에 나타나있다.

이러한 모든 결과는 411 항원이 T. spiralis에 대한 체액반응의 용량의존적인(dose-dependent) 탐지를 가능하게 함을 보여준다. 더욱이, Western blotting으로 선형 항원결정기 탐지하는 것과 결합된 이러한 ELISA 분석을 사용하여 conformational 항원결정기를 탐지하는 것은 선충 411 단백질의 면역우세한 특성을 나타낸다.

재조합 THX-411 단백질은 특히 T. spiralis에 대한 항체의 초기 탐지(20 000 L1M으로 심하게 감염된 동물에서 감염 후 20일)를 가능하게 한다. 혈청전환(seroconversion)이 높은 적정농도(titer)를 가진 체액 반응의 프로파일을 동반하며, 약 감염 후 60일째까지 유지된다. 보통 및 낮은 로드의 기생충으로 감염된 상기 동물의 혈청전환은 각각, 감염 후 30일째, 감염 후 60일째 이후에 탐지된다. E/S Ag ELISA에 의해 탐지된 초기 혈청전환은 감염 후 25일째이다.

E/S Ag ELISA 및 THX-411 ELISA 모두에 의해 진단되는 T. spiralis로 감염된 동물의 5마리 중 2마리는 그 혈청학적 탐지의 윈도우가 THX-411 ELISA 보다 초기성의 관점에서 5-10일을 얻는 것과 함께, THX-411 ELISA에 있어 작아지는 것이 관찰되었다. THX-411 ELISA의 민감성은 이 동물 실험 동안, 통상 돼지의 5/9 즉, T. spiralis의 20 000 L1M으로 감염된 돼지 3/3, 1000 L1M로 감염된 돼지 1/3 및 200 L1M 만으로 감염된 돼지 1/3의 효과적인 스크리닝 효과로 증명되었다. 상기 탐지는 이러한 동물에서의 T. spiralis근육 기생충 로드와 관련이 있으며, 이것은 평균적으로 200L1M으로 실험적으로 감염된 돼지 3그램당 유충(LpG)에서부터 1000L1M으로 감염된 돼지에 대해 43LpG 및 20 000L1M으로 감염된 돼지에 대해 538 LpG까지 다양하다.

T. nativa , T. britov 및 T. pseudospiralis 에 의해 유도된 체액반응은 자체적으로 THX-411 ELISA로 탐지되었으며(20 000 L1M으로 탐지된 동물의 10/12), 이는 Trichinella 속에서 411의 유전자 및 항원의 보존되어 있으며 결과적으로 선모충증 진단의 넓은 스펙트럼에 대한 절대적 이점이 있음을 나타낸다. 진단의 초기성은 감염 후 20일로 확인되었다. seroconversion window는 411 ELISA에 있어 5-20 까지 감소되었으며, T.　 spiralis 감염과 마찬가지로, E/S Ag ELISA 및 THX-NBL1(Cterm) ELISA 모두에 의해 진단되는 동물의 50%-100%는 serological detection window 가 THX-411 ELISA로 인해 적어짐을 보여주었다. T.　 nativa 종의 감염 분석은 THX-411 ELISA의 높은 민감성을 나타내며, 근육 기생충 로드는 단지 0.1 LpG에서만, 평균 7×10^-4뿐임에도 불구하고, 6/9 동물(E/S Ag ELISA로 5/9 동물에 대해)을 진단하였다. 게다가, T. spiralis 및 T. nativa로 감염된 동물에 대해 유사한 체액 반응 profile이 얻어졌으며, 이는 T. nativa의 511 단백질이 특성상 매우 면역항원적임을 나타내며, freezing에 저항력있는 이러한 종의 탐지에 사용될 수 있음을 암시한다.

THX-411 ELISA의 특이성은 각 실험적 감염 전 및 감염 후 10일까지의 150 마리의 동물에서 취한 혈청을 사용하여 측정되었다. 이러한 민감성은 99%를 초과한다 (결과는 나타내지 않음).

결 론

NBL1과 411 항원은 Trichinella 속내에서 보존되어 있는 면역우세한 항원들을 구성한다. 이러한 항원(NBL1 C-말단 부분; NBL1의 N5EM11 펩티드 항원결정기; 411 antigen)을 이용한 ELISA assay는 선충에 대해 99% 이상의 특이성을 가지며, 유럽에서 동정된 4종에 의해 만들어진 돼지 선모충증의 조기 진단(감염 후 15-60일)을 가능하게 한다.

정제된 재조합 THX-NBL1(Cterm)를 이용하며, 상기 단백질의 C-말단 부분에 위치한 NBL1의 면역우세한 항원결정기를 포함하는 ELISA assay는 선충-특이적이고, 민감하며, E/S Ag ELISA보다 돼지 선충을 5-45일 조기에 진단할 수 있다. 더욱이, 이 분석은 E/S Ag ELISA 및 THX-NBL1(Cterm) 모두에 의해 진단되는 동물 100%에 있어서, E/S Ag ELISA로 진단한 것과 비교하여 감소된 serological detection window(혈청학적 탐지 윈도우)을 얻을 수 있다.

정제된 재조합 THX-411 단백질을 사용한 ELISA assay는 현재 약간 낮은 민감성(진단된 동물의 17/36)으로 E/S Ag ELISA로 탐지되는 체액반응의 kinetics를 재생산한다. 그러나, 이 새로운 ELISA의 민감성은 E/S Ag ELISA로 스크리닝함으로써 진단되지 않는 한마리의 돼지를 진단할 수 있도록 한다. THX-411 ELISA는 E/S Ag ELISA보다 돼지 선모충증을 5-20일 빨리 진단할 수 있다. 더욱이, E/S Ag ELISA 및 THX-411 ELISA 모두에 의해 진단되는 동물의 50%-100%는 그 혈청학적 탐지 윈도 우(serological detection window)가 THX-411 ELISA로 적어지는 것을 볼 수 있다.

이러한 모든 결과는 NBL1 및 411 항원이 선모충증의 초기 혈청학적 진단에 대한 E/S Ag ELISA의 대안 또는 그 보충으로 사용될 수 있음을 보여준다. 뿐만 아니라, 이러한 새로운 2가지 선충 항원의 조합은 추가적인 동물의 진단 덕분으로, ELISA의 민감성을 강화시킬 수 있다.

NBL1(Cterm)과 면역우세한 N5EM11 type의 펩티드 및 411과의 조합은 선충 진단의 민감성을 강화시킬 수 있다(탐지된 동물의 24/36).

411과 함께 NBL1의 부가적인 효과는 411로 유도된 한 동물의 탐지획득 및 411로 유도된 한 동물의 조기 탐지에 의해 나타난다. 그러나, 동물수의 관점에서 추가적인 획득 없이, 3가지의 조합(NBL1, 411, N5EM11)은 2 또는 3 항원이 의한 항체의 동시적 탐지 시간에 걸쳐 ELISA assay를 안정화시킨다.

반면에, 초기 진단(감염 후 30일 미만)은 NBL1 및 411 두 항원 덕분에 얻어졌다.

SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE AGENCE FRANCAISE DE SECURITE SANITAIRE DES ALIMENTS JILIN UNIVERSITY BOIREAU, Pascal LIU, Mingyuan FU, Baoquan LE RHUN, Danielle BAHUON, C?ine VALLEE, Isabelle LE GUERHIER, Franck HERNANDEZ BELLO, Romel <120> POLYPEPTIDES RECOGNIZED BY ANTI-TRICHINELLA ANTIBODIES, AND USES THEREOF. <130> MJP/mad-F539/130-PCT <150> FR 06/01058 <151> 2006-02-07 <160> 23 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1609 <212> DNA <213> Trichinella spiralis <220> <221> CDS <222> (90)..(1487) <400> 1 gaaaagtgcc gctttgtttc aaagacaaat agaaatgaaa caaaggatat tccatacgaa 60 cagtagccat taaaaggtgt gctgcatgc atg cat aaa att aca cac aaa agt 113 Met His Lys Ile Thr His Lys Ser 1 5 att gta tca cgt cat aca ttt gct gtt tat ttg tta gtt agt ggt cag 161 Ile Val Ser Arg His Thr Phe Ala Val Tyr Leu Leu Val Ser Gly Gln 10 15 20 aaa ctg caa tat ata tat ata ttt att tgc aaa atg att aga cgt ctt 209 Lys Leu Gln Tyr Ile Tyr Ile Phe Ile Cys Lys Met Ile Arg Arg Leu 25 30 35 40 ttt caa tat acc tca atg act ttt gct tgg att ctt ctc ttc tta tcc 257 Phe Gln Tyr Thr Ser Met Thr Phe Ala Trp Ile Leu Leu Phe Leu Ser 45 50 55 gca gct tct cca tca cta ggg gcg ttt gaa tgc ggt gtg cca cat ttt 305 Ala Ala Ser Pro Ser Leu Gly Ala Phe Glu Cys Gly Val Pro His Phe 60 65 70 aaa ccc tat ata tgg aaa tct ggt cga att gtt ggt gga act gac gta 353 Lys Pro Tyr Ile Trp Lys Ser Gly Arg Ile Val Gly Gly Thr Asp Val 75 80 85 cga cca cac tca cat cca tgg cag att caa ttg tta aag tca gaa acg 401 Arg Pro His Ser His Pro Trp Gln Ile Gln Leu Leu Lys Ser Glu Thr 90 95 100 gga ggc tac agc agc ttg tgc ggt ggt agt ctt gtt cat ttc ggt aaa 449 Gly Gly Tyr Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Leu Val His Phe Gly Lys 105 110 115 120 ccc tca aat ggt act cga ttt gta ctt acc gcc gcg cac tgt ata act 497 Pro Ser Asn Gly Thr Arg Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Thr 125 130 135 act agc aat atg tat cca aga acg tca aga ttt aca gtt gtg acc ggt 545 Thr Ser Asn Met Tyr Pro Arg Thr Ser Arg Phe Thr Val Val Thr Gly 140 145 150 gcc cac aac atc aaa atg cat gaa aaa gaa aaa aag cgc ata cca att 593 Ala His Asn Ile Lys Met His Glu Lys Glu Lys Lys Arg Ile Pro Ile 155 160 165 act tcc tat tat gtt cag cac tgg aac cct gtg atg aca aca aac gac 641 Thr Ser Tyr Tyr Val Gln His Trp Asn Pro Val Met Thr Thr Asn Asp 170 175 180 att gcg ttg ctt cgc ctg gca gaa act gtt tat tat aat gaa tat acc 689 Ile Ala Leu Leu Arg Leu Ala Glu Thr Val Tyr Tyr Asn Glu Tyr Thr 185 190 195 200 agg cct gtc tgt ttg cca gaa cca aat gaa gaa ttg act cct gga gat 737 Arg Pro Val Cys Leu Pro Glu Pro Asn Glu Glu Leu Thr Pro Gly Asp 205 210 215 att tgc gtt gtc acc gga tgg ggt gat acg act gaa aat gga act act 785 Ile Cys Val Val Thr Gly Trp Gly Asp Thr Thr Glu Asn Gly Thr Thr 220 225 230 tct aat act ttg aag caa gtt ggt gtc aaa att atg aag aaa gga act 833 Ser Asn Thr Leu Lys Gln Val Gly Val Lys Ile Met Lys Lys Gly Thr 235 240 245 tgt gca aat gtg aga agt gaa gtt att act ttt tgc gct gga gct atg 881 Cys Ala Asn Val Arg Ser Glu Val Ile Thr Phe Cys Ala Gly Ala Met 250 255 260 gag ggt ggt aaa gac agt tgt caa ggt gat tct ggt ggc cca ctg ata 929 Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile 265 270 275 280 tgc aag aaa aat ggg aaa agt gtt caa ttc ggt gtc gtt agt tat ggt 977 Cys Lys Lys Asn Gly Lys Ser Val Gln Phe Gly Val Val Ser Tyr Gly 285 290 295 act gga tgc gcc aga aaa ggt tat ccc gga gtg tat gcc aaa gtt cca 1025 Thr Gly Cys Ala Arg Lys Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ala Lys Val Pro 300 305 310 tca tat gtc aca tgg tta aat aaa gct gca aaa gaa ctt gaa aat tct 1073 Ser Tyr Val Thr Trp Leu Asn Lys Ala Ala Lys Glu Leu Glu Asn Ser 315 320 325 cct gaa gga act gta aaa tgg gct tca aaa gaa gat tcg cca gtc gat 1121 Pro Glu Gly Thr Val Lys Trp Ala Ser Lys Glu Asp Ser Pro Val Asp 330 335 340 tta tct act gca tca aga cca act aac cca tat act ggg tca aga ccg 1169 Leu Ser Thr Ala Ser Arg Pro Thr Asn Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro 345 350 355 360 aca tct cca tct agt gga tca aga ccc aca tat cca tct agt gga tca 1217 Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser 365 370 375 aga cca aca tct cca tct agt gga tca aga ccc aca tat cca tct agt 1265 Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser 380 385 390 gga tca aga ccc aca tat cca tct agt gga tca aga cca aca tat cca 1313 Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro 395 400 405 tat act gga tca aga cct act cct caa aag cca gta ttt cca tca tac 1361 Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Pro Gln Lys Pro Val Phe Pro Ser Tyr 410 415 420 caa aaa tat ccg cca gca gtt caa aaa tac att gat agt tta cca agc 1409 Gln Lys Tyr Pro Pro Ala Val Gln Lys Tyr Ile Asp Ser Leu Pro Ser 425 430 435 440 gga acg caa gga acg ctc gaa tac aca gtc aca cag aat gga gtt act 1457 Gly Thr Gln Gly Thr Leu Glu Tyr Thr Val Thr Gln Asn Gly Val Thr 445 450 455 aca aca aca tat tat cac ttt tct aag taa aaatattatg attaattcac 1507 Thr Thr Thr Tyr Tyr His Phe Ser Lys 460 465 tactgctctg aacgtaatta aaaaaggaat atttattaag cattttaata tgacacatta 1567 tatatattaa aacagtcaaa tttgaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1609 <210> 2 <211> 465 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 2 Met His Lys Ile Thr His Lys Ser Ile Val Ser Arg His Thr Phe Ala 1 5 10 15 Val Tyr Leu Leu Val Ser Gly Gln Lys Leu Gln Tyr Ile Tyr Ile Phe 20 25 30 Ile Cys Lys Met Ile Arg Arg Leu Phe Gln Tyr Thr Ser Met Thr Phe 35 40 45 Ala Trp Ile Leu Leu Phe Leu Ser Ala Ala Ser Pro Ser Leu Gly Ala 50 55 60 Phe Glu Cys Gly Val Pro His Phe Lys Pro Tyr Ile Trp Lys Ser Gly 65 70 75 80 Arg Ile Val Gly Gly Thr Asp Val Arg Pro His Ser His Pro Trp Gln 85 90 95 Ile Gln Leu Leu Lys Ser Glu Thr Gly Gly Tyr Ser Ser Leu Cys Gly 100 105 110 Gly Ser Leu Val His Phe Gly Lys Pro Ser Asn Gly Thr Arg Phe Val 115 120 125 Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Thr Thr Ser Asn Met Tyr Pro Arg Thr 130 135 140 Ser Arg Phe Thr Val Val Thr Gly Ala His Asn Ile Lys Met His Glu 145 150 155 160 Lys Glu Lys Lys Arg Ile Pro Ile Thr Ser Tyr Tyr Val Gln His Trp 165 170 175 Asn Pro Val Met Thr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu Ala Glu 180 185 190 Thr Val Tyr Tyr Asn Glu Tyr Thr Arg Pro Val Cys Leu Pro Glu Pro 195 200 205 Asn Glu Glu Leu Thr Pro Gly Asp Ile Cys Val Val Thr Gly Trp Gly 210 215 220 Asp Thr Thr Glu Asn Gly Thr Thr Ser Asn Thr Leu Lys Gln Val Gly 225 230 235 240 Val Lys Ile Met Lys Lys Gly Thr Cys Ala Asn Val Arg Ser Glu Val 245 250 255 Ile Thr Phe Cys Ala Gly Ala Met Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln 260 265 270 Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Lys Lys Asn Gly Lys Ser Val 275 280 285 Gln Phe Gly Val Val Ser Tyr Gly Thr Gly Cys Ala Arg Lys Gly Tyr 290 295 300 Pro Gly Val Tyr Ala Lys Val Pro Ser Tyr Val Thr Trp Leu Asn Lys 305 310 315 320 Ala Ala Lys Glu Leu Glu Asn Ser Pro Glu Gly Thr Val Lys Trp Ala 325 330 335 Ser Lys Glu Asp Ser Pro Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Arg Pro Thr 340 345 350 Asn Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg 355 360 365 Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly 370 375 380 Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser 385 390 395 400 Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Pro 405 410 415 Gln Lys Pro Val Phe Pro Ser Tyr Gln Lys Tyr Pro Pro Ala Val Gln 420 425 430 Lys Tyr Ile Asp Ser Leu Pro Ser Gly Thr Gln Gly Thr Leu Glu Tyr 435 440 445 Thr Val Thr Gln Asn Gly Val Thr Thr Thr Thr Tyr Tyr His Phe Ser 450 455 460 Lys 465 <210> 3 <211> 700 <212> DNA <213> Trichinella spiralis <220> <221> CDS <222> (1)..(528) <400> 3 cga gaa aac atg cat tgc caa ttc att ctc tct ttg ctc ctt ttc tct 48 Arg Glu Asn Met His Cys Gln Phe Ile Leu Ser Leu Leu Leu Phe Ser 1 5 10 15 ttg aac gtc gta ttc ttc gaa gcc gcg aaa tca ctg gat gcc gta gac 96 Leu Asn Val Val Phe Phe Glu Ala Ala Lys Ser Leu Asp Ala Val Asp 20 25 30 gat gaa tta aaa aga tgt act gag aag caa act gaa att tgt gct caa 144 Asp Glu Leu Lys Arg Cys Thr Glu Lys Gln Thr Glu Ile Cys Ala Gln 35 40 45 aca gaa tgc aaa gca gaa gat gca att atg aca gat ctg ctt ctc gag 192 Thr Glu Cys Lys Ala Glu Asp Ala Ile Met Thr Asp Leu Leu Leu Glu 50 55 60 gga gaa agc gac att act gat cat cct gac ttc ctt tta tac gca act 240 Gly Glu Ser Asp Ile Thr Asp His Pro Asp Phe Leu Leu Tyr Ala Thr 65 70 75 80 tgc atg caa cgt tgc tgt gca aga ctg aac ggc gct caa gta gct cca 288 Cys Met Gln Arg Cys Cys Ala Arg Leu Asn Gly Ala Gln Val Ala Pro 85 90 95 ttg aaa gaa gaa gaa aaa cga aga gga cct tca aaa tta ccg ttc caa 336 Leu Lys Glu Glu Glu Lys Arg Arg Gly Pro Ser Lys Leu Pro Phe Gln 100 105 110 agc att ttt gaa gtt gct gat caa aaa aca gtt gaa aga tgt gat gaa 384 Ser Ile Phe Glu Val Ala Asp Gln Lys Thr Val Glu Arg Cys Asp Glu 115 120 125 aca atg tgc aag agt tat aga aag aaa tat gaa aat ttg gta gca ttg 432 Thr Met Cys Lys Ser Tyr Arg Lys Lys Tyr Glu Asn Leu Val Ala Leu 130 135 140 act tca agc tac aaa aag cta cga tca agc caa gaa ttg aaa gac tac 480 Thr Ser Ser Tyr Lys Lys Leu Arg Ser Ser Gln Glu Leu Lys Asp Tyr 145 150 155 160 aaa caa tgc atc gaa aga tgt gac gca aaa ttg aat gga tta cag taa 528 Lys Gln Cys Ile Glu Arg Cys Asp Ala Lys Leu Asn Gly Leu Gln 165 170 175 agccagatat gaagaatgga gatatgcatt acaaagaaaa attttaactg aaataatttt 588 tgttttataa aatctataaa tatcatttct aactgcatta gaattttttt gaagaaaaat 648 aaaataaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa actcgagggg gggcccggtc cc 700 <210> 4 <211> 175 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 4 Arg Glu Asn Met His Cys Gln Phe Ile Leu Ser Leu Leu Leu Phe Ser 1 5 10 15 Leu Asn Val Val Phe Phe Glu Ala Ala Lys Ser Leu Asp Ala Val Asp 20 25 30 Asp Glu Leu Lys Arg Cys Thr Glu Lys Gln Thr Glu Ile Cys Ala Gln 35 40 45 Thr Glu Cys Lys Ala Glu Asp Ala Ile Met Thr Asp Leu Leu Leu Glu 50 55 60 Gly Glu Ser Asp Ile Thr Asp His Pro Asp Phe Leu Leu Tyr Ala Thr 65 70 75 80 Cys Met Gln Arg Cys Cys Ala Arg Leu Asn Gly Ala Gln Val Ala Pro 85 90 95 Leu Lys Glu Glu Glu Lys Arg Arg Gly Pro Ser Lys Leu Pro Phe Gln 100 105 110 Ser Ile Phe Glu Val Ala Asp Gln Lys Thr Val Glu Arg Cys Asp Glu 115 120 125 Thr Met Cys Lys Ser Tyr Arg Lys Lys Tyr Glu Asn Leu Val Ala Leu 130 135 140 Thr Ser Ser Tyr Lys Lys Leu Arg Ser Ser Gln Glu Leu Lys Asp Tyr 145 150 155 160 Lys Gln Cys Ile Glu Arg Cys Asp Ala Lys Leu Asn Gly Leu Gln 165 170 175 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 5 Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 6 Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 7 Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Tyr Thr Gly Ser Arg 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 8 Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 46 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 9 Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro 1 5 10 15 Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser 20 25 30 Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro 35 40 45 <210> 10 <211> 67 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 10 Ser Arg Pro Thr Asn Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser 1 5 10 15 Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Ser 20 25 30 Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro 35 40 45 Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Tyr Thr Gly Ser 50 55 60 Arg Pro Thr 65 <210> 11 <211> 134 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 11 Glu Asn Ser Pro Glu Gly Thr Val Lys Trp Ala Ser Lys Glu Asp Ser 1 5 10 15 Pro Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Arg Pro Thr Asn Pro Tyr Thr Gly 20 25 30 Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser 35 40 45 Ser Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr 50 55 60 Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro 65 70 75 80 Thr Tyr Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Pro Gln Lys Pro Val Phe 85 90 95 Pro Ser Tyr Gln Lys Tyr Pro Pro Ala Val Gln Lys Tyr Ile Asp Ser 100 105 110 Leu Pro Ser Gly Thr Gln Gly Thr Leu Glu Tyr Thr Val Thr Gln Asn 115 120 125 Gly Val Thr Thr Thr Thr 130 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NBL1CtermF <400> 12 caccgaaaat tctcctgaag ga 22 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NBL1CtermR <400> 13 tgttgttgta gtaactcc 18 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 14 Asn Ser Pro Glu Gly Thr Val Lys Trp Ala Ser Lys Glu Asp Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 15 Ala Ser Lys Glu Asp Ser Pro Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Arg 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 16 Leu Ser Thr Ala Ser Arg Pro Thr Asn Pro Tyr Thr Gly Ser Arg 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 17 Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 18 Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 19 Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Pro Gln Lys Pro Val Phe Pro 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 20 Gln Lys Pro Val Phe Pro Ser Tyr Gln Lys Tyr Pro Pro Ala Val 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 21 Lys Tyr Pro Pro Ala Val Gln Lys Tyr Ile Asp Ser Leu Pro Ser 1 5 10 15 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 411F <400> 22 cacccgagaa aacatgcat 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 411R <400> 23 tccattcaat tttgcgtcac 20

Claims

NBL1 항원의 면역 우세한 항원결정기(epitope)를 포함하며, 상기 항원결정기는 PSSGSRPTYP(서열번호 5)에 의해 정의되는 폴리펩티드의, 항 선충 항체에 의해 인식되는 항원성 폴리펩티드의 생물학적 샘플로부터 항 선충 항체를 감지하는 시약으로서의 용도.
제 1항에 있어서, 상기 용도는 제 1항에 정의된 폴리펩티드 1개 이상을 포함하는 혼합물, 선택적으로 서열번호 4의 아미노산 25-175 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 25-175의 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 1개 이상의 폴리펩티드의 조합되는 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항 선충 항체에 의해 인식되는 항원성 폴리펩티드의 생물학적 샘플에서 항 선충 항체를 감지하는 시약으로서의 용도.
제 1항에 정의된 항 선충 항체에 의해 인식되는 항원성 폴리펩티드로서, GenBank 접근 번호가 AAK16520인 폴리펩티드 및 GenBank 접근 번호가 AAR36900인 폴리펩티드를 배제하는 것을 특징으로 하는 항 선충 항체에 의해 인식되는 항원성 폴리펩티드.
제 3항에 있어서, 1개 이상의 다음의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항원성 폴리펩티드: 서열 PSSGSRPTYPSSGSR (서열번호 6); 서열 PSSGSRPTYPYTGSR (서열번호 7); 서열 RPTSPSSGSRPTYPS (서열번호 8).
제 4항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 363-409 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항원성 폴리펩티드.
제 3항에 있어서, 제1항에 정의된 1개 이상의 폴리펩티드 카피, 선택적으로 제2항에 정의된 1개 이상의 폴리펩티드 카피를 함께 포함하며, 선택적으로, 다른 이종의 서열 1개 이상과 융합된 키메릭 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원성 폴리펩티드.
제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제 7항에 있어서, 1개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
제 8항에 있어서, 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제 1항에 정의된 폴리펩티드의 항체 생산에 사용될 수 있는 조성물을 얻기 위한 용도.
제 1항에 정의된 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체.
제 11항에 있어서, PSSGSRPTYP 항원결정기 (서열번호 5)를 인식하는 것을 특징으로 하는 항체.
생물학적 샘플에 존재할 수 있는 항 선충 항체와 항원/항체 복합체(complex)를 형성할 수 있는 조건하에서, 생물학적 샘플을 제1항에 정의된 1개 이상의 폴리펩티드, 선택적으로 제 2항에 정의된 1개 이상의 폴리펩티드와 조합하여 결합시키는 방법;및 적합한 수단에 의해, 형성될 수 있는 항원/항체 복합체(complex)를 탐지하는 방법;을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플에서 항 선충 항체의 존재 여부를 탐지하는 방법.
제 1항에 정의된 1개 이상의 폴리펩티드, 선택적으로 제 2항에 정의된 1개 이상의 폴리펩티드;와 항원/항체 복합체의 형성을 가능하게 하는 반응 배지를 구성하기에 적합한 버퍼와 시약, 선택적으로 상기 항원/항체 복합체를 탐지하는 수단;을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플에서 항 선충 항체의 존재 여부를 탐지하는 키트.
제 14항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 고체 지지체에 고정되는 것을 특징으 로 하는 생물학적 샘플에서 항 선충 항체의 존재 여부를 탐지하는 키트.
제 1항에 정의된 1개 이상의 폴리펩티드, 선택적으로 제 2항에 정의된 폴리펩티드와 조합되거나 또는 제1항에 정의된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 선택적으로 제2항에 정의된 상기 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드와 조합되고, 면역 반응을 강화시키는 1개 이상의 애주번트(adjuvant)와 결합되는 것을 포함하는 면역학적 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 조성물이 백신인 것을 특징으로 하는 면역학적 조성물.